Informatie

7.4.4: Effecten van medicijncombinaties - Biologie


Antimicrobiële geneesmiddelen kunnen op schadelijke manieren interageren met andere geneesmiddelen of kunnen in combinatie worden gebruikt om microbiële infecties te bestrijden.

leerdoelen

  • Geef voorbeelden van interacties die een antimicrobieel middel ineffectief kunnen maken

Belangrijkste punten

  • De interactie tussen het ene antimicrobiële middel en het andere is zeer complex, evenals de manier waarop ze zich richten op microben en het organisme.
  • Hoewel het niet zeker is dat een medicijn een wisselwerking kan hebben met antibiotica, wordt het als verstandig beschouwd om de fout te maken dat er mogelijk onbekende en schadelijke interacties zijn door het mengen van medicijnen.
  • Het gebruik van meer dan één antimicrobieel middel is een effectieve en veel gebruikte praktijk om de kans te verkleinen dat microben een behandeling weerstaan.

Sleutelbegrippen

  • contra-indicatie: In de geneeskunde is een contra-indicatie een aandoening of factor die als reden dient om een ​​bepaalde medische behandeling achterwege te laten.
  • tuberculose: Een infectieziekte bij mens en dier, veroorzaakt door een mycobacteriesoort die voornamelijk de longen infecteert waar ze knobbeltjes veroorzaakt die worden gekenmerkt door het ophoesten van slijm en sputum, koorts, gewichtsverlies en pijn op de borst, en overgedragen via inademing of inname van bacteriën.
  • combinatietherapie: Combinatietherapie is het gebruik van meer dan één medicijn of andere therapie. Meestal verwijzen deze termen naar de gelijktijdige toediening van twee of meer medicijnen om een ​​enkele ziekte te behandelen.

Farmacodynamiek is het veld dat probeert de onbedoelde effecten van het gebruik van twee of meer geneesmiddelen te begrijpen. Farmacodynamiek is de studie van de biochemische en fysiologische effecten van geneesmiddelen op het lichaam of op micro-organismen of parasieten in of op het lichaam. Het kijkt ook naar de mechanismen van medicijnwerking en de relatie tussen medicijnconcentratie en effect. Deze veranderingen zijn buitengewoon moeilijk te classificeren gezien de grote verscheidenheid aan werkingsmechanismen die er bestaan ​​en het feit dat veel medicijnen hun effect kunnen veroorzaken via een aantal verschillende mechanismen. Deze grote diversiteit betekent ook dat het in alle, behalve de meest voor de hand liggende gevallen, belangrijk is om deze mechanismen te onderzoeken en te begrijpen. Het gegronde vermoeden bestaat dat er meer onbekende interacties zijn dan bekende.

Twee goed beschreven interacties tussen antimicrobiële geneesmiddelen en andere geneesmiddelen zijn die tussen antibiotica en alcohol en antibiotica en de anticonceptiepil. Interacties tussen alcohol en bepaalde antibacteriële middelen kunnen optreden, bijwerkingen veroorzaken en de effectiviteit van antibacteriële therapie verminderen. Potentiële risico's op bijwerkingen en effectiviteit hangen af ​​van het type antibacteriële dat wordt toegediend. Ondanks het ontbreken van een categorische contra-indicatie, is de overtuiging dat alcohol en antibacteriële middelen nooit mogen worden gemengd, wijdverbreid. Sommige antibacteriële middelen kunnen de afbraak van alcohol remmen, wat kan leiden tot door alcohol veroorzaakt braken, misselijkheid en kortademigheid. Andere effecten van alcohol op de antibacteriële activiteit zijn onder meer een veranderde activiteit van de leverenzymen die de antibacteriële verbinding afbreken. Bovendien kunnen bacteriostatische antibacteriële serumspiegels worden verlaagd door alcoholgebruik, wat resulteert in verminderde werkzaamheid en verminderd farmacotherapeutisch effect.

Een andere goed bestudeerde interactie is tussen antibiotica en de anticonceptiepil. De meeste onderzoeken geven aan dat antibiotica geen invloed hebben op anticonceptiepillen. In gevallen waarin is gesuggereerd dat antibacteriële middelen de werkzaamheid van anticonceptiepillen beïnvloeden, kan dit te wijten zijn aan een toename van de activiteit van leverenzymen in de lever, waardoor een verhoogde afbraak van de actieve ingrediënten van de pil wordt veroorzaakt. Er zijn ook effecten op de darmflora gesuggereerd, die zouden kunnen resulteren in een verminderde opname van oestrogenen in de dikke darm, maar dergelijke suggesties waren niet overtuigend en controversieel. Artsen hebben aanbevolen extra anticonceptiemaatregelen te nemen tijdens therapieën met antibacteriële middelen waarvan wordt vermoed dat ze een wisselwerking hebben met orale anticonceptiva.

Bovendien kan bij het omgaan met een microbiële infectie soms het gebruik van twee of meer antibiotica de infectie effectief bestrijden, terwijl elk medicijn afzonderlijk weinig of geen effect heeft. Deze methode wordt combinatietherapie genoemd en wordt gebruikt wanneer de aard van een microbiële infectie onbekend is, zoals getypeerd door de combinatie van de antibiotica ampicilline en sulbactam. Het gebruik van twee antibiotica met verschillende vormen van microbiële remming vergroot de kans dat de behandeling de microbiële infectie zal bestrijden. Verder wordt tuberculose al meer dan vijftig jaar met combinatietherapie behandeld. Dit komt door het fenomeen resistentie, waarbij een micro-organisme het vermogen verkrijgt om weerstand te bieden aan een antimicrobieel geneesmiddel, terwijl het geneesmiddel aanvankelijk de groei van het beoogde micro-organisme effectief vertraagde of zelfs doodde. Het behandelen van tuberculose of andere pathogene microben met meer dan één antibioticum verkleint de kans dat de microbe zich zal aanpassen en de behandeling zal overleven, vooral als de twee geneesmiddelen verschillende methoden hebben om de normale functies van de microbe te verminderen.


AI voorspelt effectieve medicijncombinaties om complexe ziekten sneller te bestrijden

Het vinden van nieuwe manieren om bestaande medicijnen opnieuw te gebruiken of te combineren, is een krachtig hulpmiddel gebleken om complexe ziekten te behandelen. Geneesmiddelen die bijvoorbeeld worden gebruikt om één type kanker te behandelen, hebben de behandelingen voor andere kankercellen effectief versterkt. Complexe kwaadaardige tumoren vereisen vaak een combinatie van medicijnen, of 'drugscocktails', om een ​​gezamenlijke aanval op meerdere celtypen te formuleren. Drugscocktails kunnen niet alleen helpen om resistentie tegen geneesmiddelen te voorkomen, maar ook om schadelijke bijwerkingen te minimaliseren.

Maar het vinden van een effectieve combinatie van bestaande medicijnen in de juiste dosis is een enorme uitdaging, deels omdat er bijna oneindige mogelijkheden zijn.

Vandaag introduceren Facebook AI en het Helmholtz Zentrum München een nieuwe methode die de ontdekking van effectieve nieuwe medicijncombinaties zal helpen versnellen. We hebben het eerste enkelvoudige AI-model gebouwd dat de effecten voorspelt van medicijncombinaties, doseringen, timing en zelfs andere soorten interventies, zoals het uitschakelen of verwijderen van genen. We gebruiken dit model open source, genaamd Compositional Perturbation Autoencoder (CPA), inclusief een gebruiksvriendelijke API en Python-pakket. We hebben het werk gedetailleerd beschreven in een paper dat nu beschikbaar is voor de onderzoeksgemeenschap als een preprint op bioRxiv. Het werk zal ook worden voorgelegd aan een peer-reviewed tijdschrift.

Computationele methoden voor het verkennen van nieuwe combinaties zijn tot nu toe beperkt tot geneesmiddelinteracties die zijn opgenomen in de trainingsgegevensset en worden afgebroken bij het omgaan met hoogdimensionale veranderingen op moleculair niveau, zoals verschillende doses en timing. CPA gebruikt een nieuwe zelf-supervisietechniek om cellen te observeren die zijn behandeld met een eindig aantal medicijncombinaties en voorspelt het effect van onzichtbare combinaties. Laten we voor een vereenvoudigd voorbeeld zeggen dat gegevens informatie bevatten over hoe medicijnen verschillende soorten cellen A, B, C en A+B beïnvloeden. Nu kan het model de individuele impact van elk medicijn op een celtype-specifieke manier leren (dwz op verschillende soorten cellen) en ze vervolgens recombineren om combinaties van A+C, B+C, of ​​zelfs hoe A+ B interageert met C+D.

Farmaceutische onderzoekers kunnen CPA gebruiken om hypothesen te genereren, hun experimenteel ontwerpproces te begeleiden en miljarden keuzes te helpen beperken om experimenten in het laboratorium uit te voeren. Vroeger kostte het bijvoorbeeld jaren en veel cellijnexperimenten om verschillende combinaties van 100 medicijnen en doses te testen - onderzoekers kunnen nu alle mogelijke combinaties in silico (in simulatie) binnen slechts een paar uur screenen en topresultaten selecteren als hypothesen voor validatie en follow-up. Meer in het algemeen bevordert dit werk AI die compositorisch kan redeneren, wat implicaties heeft die verder gaan dan biomedisch en zou kunnen leiden tot AI die bijvoorbeeld taal beter kan begrijpen. Compositioneel redeneren geeft betekenis aan taal en maakt representaties van genuanceerde ideeën over de wereld.

Het leren van miljarden interacties tussen geneesmiddelen met zelftoezicht

In de biologie is RNA-sequencing met één cel de afgelopen jaren snel geëvolueerd, waardoor enorme hoeveelheden gegevens worden geproduceerd met meer granulariteit dan ooit tevoren. Onderzoekers en wetenschappers gebruiken tegenwoordig single-cell RNA-sequencing als een manier om RNA-genexpressies van individuele cellen op moleculair niveau te meten en de effecten van verschillende verstoringen, zoals medicijncombinaties of gendeletie, op de biologische systemen te bestuderen. Academische onderzoekers en wetenschappers hebben openbare eencellige RNA-sequencing-datasets gebouwd en vrijgegeven - bestaande uit duizenden tot miljoenen cellen met maar liefst 20.000 uitlezingen per cel - om biomedisch onderzoek te vergemakkelijken.

Dergelijke hoogdimensionale gegevens bieden een sterk testbed voor machine learning (ML) om de grenzen van combinatorische voorspellingen te verleggen. Tot nu toe is er geen effectieve benadering geweest om de effecten van ongeziene medicijncombinaties en andere verstoringen te voorspellen. Voorspellingen doen op basis van dit soort gegevens is een uitdaging omdat AI-modellen moeten leren hoe ze interessante aspecten van de structuur van gegevens kunnen generaliseren of zelfs extrapoleren - zonder te vertrouwen op gelabelde trainingsgegevens - om voorspellingen te doen over nieuwe omstandigheden.

Om dit op te lossen, gebruikten we een zelf-gecontroleerde leertechniek genaamd auto-encoding, waarin we gegevens "comprimeren" en "decomprimeren", waardoor de machine gedwongen wordt de gegevens in essentie samen te vatten in bruikbare patronen voor voorspelling. In ons geval leert de auto-encoder van niet-gelabelde genexpressievectoren uit verschillende omstandigheden.

Ons model werkt door eerst belangrijke kenmerken in een cel te scheiden en te leren, zoals effecten van een bepaald medicijn, combinatie, dosering, tijd, gendeletie of celtype. Vervolgens recombineert het onafhankelijk de attributen om hun effecten op de genexpressies van de cel te voorspellen. Ter analogie: een manier om na te denken over hoe CPA werkt, is om de verschillende celkenmerken, zoals effecten van medicijnen, combinaties, dosering en timing, voor te stellen als kledingstukken die een "outfit" vormen die de cel draagt, zoals hoeden , sjaals, brillen en mutsen. Tijdens de training ziet CPA de aangeklede cel, verwijdert kledingstukken en kleedt de cel om meer te weten te komen over alle kleding en de onderliggende cel. Tijdens het testen kan CPA vervolgens de beste outfits voorspellen (of optimale effecten van combinaties) - hoe een hoed er bijvoorbeeld uit zou zien met een bepaalde sjaal.

Ten eerste transformeert een encodernetwerk de genexpressie die is gekoppeld aan één cel in de gegevensset in een 'celrepresentatie'. Een inbeddingsnetwerk vertaalt de behandeling die op deze cel wordt toegepast in een 'behandelingsrepresentatie'. Samen zorgt een discriminatornetwerk ervoor dat cel- en behandelingsrepresentaties geen informatie over elkaar bevatten.

Ten tweede construeren we een "knelpuntrepresentatie" door de cel- en behandelingsrepresentaties te combineren.

Ten derde vertaalt een decodernetwerk de bottleneckrepresentatie terug naar een genexpressievector. Het hele model is zodanig getraind dat de uitvoer van de decoder overeenkomt met de genexpressie die aanvankelijk beschikbaar was in de dataset.

In stap 1 van het vorige trainingsproces schatten we hoe we het effect van een behandeling van een cel ongedaan kunnen maken, en in stap 2 en 3 schatten we hoe we diezelfde behandeling opnieuw kunnen toepassen op dezelfde cel). Hoewel de ongedaan gemaakte en toegepaste behandelingen tijdens de training hetzelfde zijn, grijpen we in dit proces in en gebruiken we ons CPA-model om contrafeitelijke vragen te beantwoorden, zoals: "Wat zou de genexpressie van deze cel zijn geweest als deze was behandeld met behandeling B in plaats van behandeling A?”

Om deze vragen te beantwoorden, maken we behandeling A in stap 1 ongedaan en passen we behandeling B toe in stap 2 en 3.

CPA is niet afhankelijk van of beperkt tot enkelvoudige cel-RNA-sequencing alleen. Het kan bijvoorbeeld ook gemakkelijk worden toegepast in de meer traditionele bulk-RNAseq-gegevens en gemakkelijk worden uitgebreid tot multimodale genomics-uitlezingen.

Betrouwbare voorspellingen van nieuwe medicijncombinaties bereiken

Om CPA te testen, hebben we het toegepast op vijf openbaar beschikbare RNA-sequentiegegevenssets die metingen en resultaten van verschillende medicijnen, doses en andere verstoringen op kankercellen bevatten. We splitsen elke dataset op in training, testen en out-of-distributie (OOD). We hebben de prestaties van ons model gemeten in termen van de R2-metriek, die aangeeft hoe goed we de expressie van individuele genen voorspellen.

Op alle datasets bleven de R2-scores consistent tussen de training en het testen, en de R2-statistieken voor OOD waren ook hoog. Dit betekent dat CPA's voorspellingen van de effecten van belangrijke medicijncombinaties en doses op kankercellen betrouwbaar overeenkwamen met die in de testgegevensset. Om de limieten van het model verder te testen, hebben we de hoeveelheid trainingsgegevens verminderd en de hoeveelheid OOD-gegevens vergroot. Hoewel de prestaties aanzienlijk daalden, waren de voorspellingen nog steeds aanzienlijk boven willekeurig. Het model is niet bedoeld om in dergelijke extreme scenario's te gebruiken, hoewel het interessant is om de leermogelijkheden ervan te begrijpen.


Onderzoeksrapport over marihuana Hoe produceert marihuana zijn effecten?

De chemische structuur van THC is vergelijkbaar met de chemische stof in de hersenen anandamide. Gelijkaardige structuur stelt het lichaam in staat THC te herkennen en de normale hersencommunicatie te veranderen.

Endogene cannabinoïden zoals anandamide (zie figuur) functioneren als neurotransmitters omdat ze chemische berichten sturen tussen zenuwcellen (neuronen) in het hele zenuwstelsel. Ze beïnvloeden hersengebieden die plezier, geheugen, denken, concentratie, beweging, coördinatie en zintuiglijke en tijdperceptie beïnvloeden. Vanwege deze gelijkenis kan THC zich hechten aan moleculen genaamd cannabinoïde receptoren op neuronen in deze hersengebieden en activeert ze, waardoor verschillende mentale en fysieke functies worden verstoord en de eerder beschreven effecten worden veroorzaakt. Het neurale communicatienetwerk dat deze cannabinoïde neurotransmitters gebruikt, bekend als de endocannabinoïde systeem, speelt een cruciale rol in het normale functioneren van het zenuwstelsel, dus het verstoren ervan kan ingrijpende gevolgen hebben.

THC kan bijvoorbeeld de werking van de hippocampus (zie "Marihuana, geheugen en de Hippocampus") en de orbitofrontale cortex veranderen, hersengebieden die een persoon in staat stellen nieuwe herinneringen te vormen en zijn of haar aandachtsfocus te verschuiven. Als gevolg hiervan veroorzaakt het gebruik van marihuana een verminderd denkvermogen en interfereert het met het vermogen van een persoon om te leren en gecompliceerde taken uit te voeren. THC verstoort ook de werking van het cerebellum en de basale ganglia, hersengebieden die het evenwicht, de houding, de coördinatie en de reactietijd reguleren. Dit is de reden waarom mensen die marihuana hebben gebruikt mogelijk niet veilig kunnen autorijden (zie "Heeft het gebruik van marihuana invloed op het autorijden?") en problemen kunnen hebben met sporten of andere fysieke activiteiten.

THC, dat werkt via cannabinoïde-receptoren, activeert ook het beloningssysteem van de hersenen, waaronder regio's die de reactie op gezond plezierig gedrag zoals seks en eten bepalen. Net als de meeste andere medicijnen die mensen misbruiken, stimuleert THC neuronen in het beloningssysteem om de signaalstof vrij te maken dopamine op niveaus die hoger zijn dan gewoonlijk waargenomen als reactie op natuurlijke belonende stimuli. De golf van dopamine "leert" de hersenen om het belonende gedrag te herhalen, wat helpt om de verslavende eigenschappen van marihuana te verklaren.


Hoewel de meeste conventionele DMARD's vergelijkbare bijwerkingen hebben, zijn er verschillende bijwerkingen die uniek zijn voor elk middel.

Hydroxychloroquine is in dit opzicht uniek omdat het het beste veiligheidsprofiel heeft van alle conventionele DMARD's. In vergelijking met andere conventionele DMARD's verhoogt hydroxychloroquine het risico op ernstige infecties niet en veroorzaakt het ook geen hepatotoxiciteit of nierdisfunctie. Vaak voorkomende bijwerkingen van hydroxychloroquine zijn huiduitslag, diarree. Een zeldzame maar significante bijwerking van hydroxychloroquine is retinopathie/maculopathie die wordt gezien bij een hogere cumulatieve dosis. Risicofactoren voor hydroxychloroquine maculopathie zijn onder meer een dosis van meer dan 5 mg/kg/dag, meer dan 5 jaar therapie, toenemende leeftijd en chronische nierziekte. Patiënten die hydroxychloroquine gebruiken, wordt aanbevolen om regelmatig oogheelkundig onderzoek te ondergaan met oculaire coherentietomografie, wat een zeer gevoelige test is voor maculopathie en deze kan diagnosticeren ruim voordat gezichtsvelddefecten optreden. Andere zeldzame bijwerkingen van hydroxychloroquine zijn bloedarmoede, leukopenie, myopathie en cardiomyopathie.

Methotrexaat, leflunomide en sulfasalazine zijn vergelijkbaar in hun bijwerkingenprofiel. Gastro-intestinale klachten (misselijkheid, buikpijn, diarree), huiduitslag/allergische reactie, beenmergsuppressie, hepatotoxiciteit en een hogere incidentie van vaak voorkomende en soms ernstige infecties zijn vaak voorkomende bijwerkingen van al deze middelen. Zowel methotrexaat als leflunomide kunnen alopecia veroorzaken. Andere bijwerkingen die uniek zijn voor methotrexaat zijn interstitiële longziekte, foliumzuurdeficiëntie en levercirrose. Leflunomide kan hypertensie, perifere neuropathie en gewichtsverlies veroorzaken. Sulfasalazine heeft een zeer hoog risico op gastro-intestinale klachten. Het kan ook zelden het DRESS-syndroom veroorzaken.[6]

De meest zorgwekkende bijwerking van alle biologische DMARD's is een verhoogd risico op veelvoorkomende en ernstige infecties, waaronder bacteriële, schimmel- en virale infecties. Reactivering van tuberculose, herpes zoster en hepatitis B/C kan ook optreden. Zelden zijn beenmergsuppressie en hepatotoxiciteit gemeld bij biologische DMARD's. Anti-TNF-middelen kunnen verergering van ernstig congestief hartfalen, door geneesmiddelen geïnduceerde lupus en demyeliniserende ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS) veroorzaken. Lymfomen en niet-melanoom huidkankers kunnen ook in verband worden gebracht met anti-TNF-middelen. Hyperlipidemie, verhoogde leverfunctietest en pancytopenie kunnen worden veroorzaakt door IL-6-remmers en JAK-remmers. Verergering van chronische obstructieve luchtwegaandoeningen is gemeld als secundair aan abatacept. IL-17-remmers kunnen inflammatoire darmaandoeningen veroorzaken/verergeren. Progressieve multifocale leuko-encefalopathie is gemeld bij patiënten die werden behandeld met rituximab. 

Verschillende medicijnen, zoals niet-steroïde anti-inflammatoire middelen (NSAID's), protonpompremmers, sulfasalazine en amoxicilline kunnen de renale excretie van methotrexaat verstoren, waardoor de werkzaamheid toeneemt en ook het risico op bijwerkingen toeneemt.

Hoewel de combinatie van een biologische DMARD met een conventionele DMARD en het gebruik van meerdere conventionele DMARD's als veilig wordt beschouwd, wordt het gebruik van een combinatie van verschillende biologische DMARD's niet aanbevolen vanwege een verhoogd risico op ernstige immunosuppressie die leidt tot ernstige en mogelijk levensbedreigende infecties.


OVERGANG NAAR VERSLAVING

Zoals we hebben gezien, bevordert het plezier dat wordt verkregen door de activering van opioïden van het natuurlijke beloningssysteem van de hersenen, voortgezet drugsgebruik tijdens de beginfase van opioïdenverslaving. Vervolgens induceert herhaalde blootstelling aan opioïde drugs de hersenmechanismen van afhankelijkheid, wat leidt tot dagelijks drugsgebruik om de onaangename symptomen van ontwenning van drugs te voorkomen. Verder langdurig gebruik veroorzaakt meer langdurige veranderingen in de hersenen die ten grondslag kunnen liggen aan het dwangmatige drugszoekgedrag en de daarmee samenhangende nadelige gevolgen die kenmerkend zijn voor verslaving. Recent wetenschappelijk onderzoek heeft verschillende modellen opgeleverd om te verklaren hoe gewoon drugsgebruik veranderingen in de hersenen teweegbrengt die tot drugsverslaving kunnen leiden. In werkelijkheid omvat het verslavingsproces waarschijnlijk componenten van elk van deze modellen, evenals andere kenmerken.

Definities van belangrijke termen

Dopamine (DA): Een neurotransmitter die aanwezig is in hersengebieden die beweging, emotie, motivatie en het gevoel van plezier reguleren.

GABA (gamma-aminoboterzuur): Een neurotransmitter in de hersenen waarvan de primaire functie is om het afvuren van neuronen te remmen.

locus ceruleus (LC): Een hersengebied dat sensorische signalen ontvangt en verwerkt van alle delen van het lichaam die betrokken zijn bij opwinding en waakzaamheid.

noradrenaline (NA): Een neurotransmitter die wordt geproduceerd in de hersenen en het perifere zenuwstelsel en die betrokken is bij het opwekken en reguleren van bloeddruk, slaap en stemming, ook wel noradrenaline genoemd.

nucleus accumbens (NAc): Een structuur in de voorhersenen die een belangrijke rol speelt bij de afgifte van dopamine en stimulerende werking, een van de belangrijkste pleziercentra van de hersenen.

prefrontale cortex (PFC): Het voorste deel van de hersenen dat betrokken is bij hogere cognitieve functies, waaronder vooruitziendheid en planning.

ventrale tegmentale gebied (VTA): De groep van dopamine-bevattende neuronen die een belangrijk onderdeel vormen van het beloningssysteem van de hersenen. De belangrijkste doelen van deze neuronen zijn de nucleus accumbens en de prefrontale cortex

Het “Gewijzigde instelpunt'x0201d Model

Het 'veranderde setpoint'-model van drugsverslaving heeft verschillende varianten op basis van de veranderde neurobiologie van de DA-neuronen in de VTA en van de NA-neuronen van de LC tijdens de vroege fasen van ontwenning en onthouding. Het basisidee is dat drugsmisbruik een biologische of fysiologische setting of baseline verandert. Een variant, door Koob en LeMoal (2001), is gebaseerd op het idee dat neuronen van de mesolimbische beloningsroutes van nature zijn “set” om genoeg DA in het NAc af te geven om een ​​normaal niveau van plezier te produceren. Koob en LeMoal suggereren dat opioïden verslaving veroorzaken door een vicieuze cirkel van het veranderen van dit instelpunt op gang te brengen, zodat de afgifte van DA wordt verminderd wanneer normaal plezierige activiteiten plaatsvinden en opioïden niet aanwezig zijn. Evenzo vindt een verandering in het instelpunt plaats in de LC, maar in de tegenovergestelde richting, zodat de NA-afgifte tijdens het onttrekken wordt verhoogd, zoals hierboven beschreven. In dit model wordt rekening gehouden met zowel de positieve (drugsgezindheid) als de negatieve (drugsontwenning) aspecten van drugsverslaving.

Een specifieke manier waarop de DA-neuronen disfunctioneel kunnen worden, houdt verband met een verandering in hun baseline (“resting”) niveaus van elektrische activiteit en DA-afgifte (Grace, 2000). In deze tweede variant van het gewijzigde instelpuntmodel is dit rustniveau het resultaat van twee factoren die de hoeveelheid DA-afgifte in rust in het NAc beïnvloeden: corticale exciterende (glutamaat) neuronen die de VTA DA-neuronen aansturen om DA af te geven, en autoreceptoren (𠇋rakes”) die verdere afgifte stopzetten wanneer de DA-concentraties te hoog worden. Activering van opioïde receptoren door heroïne en heroïne-achtige drugs omzeilt deze remmen aanvankelijk en leidt tot een grote afgifte van DA in het NAc. Bij herhaald heroïnegebruik reageren de hersenen echter op deze opeenvolgende grote DA-releases door het aantal en de kracht van de remmen op de VTA DA-neuronen te vergroten. Uiteindelijk remmen deze verbeterde 'remmende' autoreceptoren de afgifte van DA door de neuronen in rust. Wanneer dit gebeurt, zal de verslaafde verslaafde nog meer heroïne nemen om de vermindering van de normale afgifte van DA in rust te compenseren. Wanneer hij of zij stopt met het gebruik van heroïne, zal een staat van DA-deprivatie het gevolg zijn, wat zich manifesteert in dysforie (pijn, opwinding, malaise) en andere ontwenningsverschijnselen, die kunnen leiden tot een cyclus van terugval naar drugsgebruik.

Een derde variatie op de verandering van het setpoint benadrukt de gevoeligheid voor signalen uit de omgeving die leiden tot het verlangen naar of hunkeren naar medicijnen in plaats van alleen versterking en terugtrekking (Breiter et al., 1997 Robinson en Berridge, 2000). Tijdens perioden waarin het medicijn niet beschikbaar is voor verslaafden, kunnen hun hersenen het medicijn onthouden, en het verlangen naar of het verlangen naar het medicijn kan een belangrijke factor zijn die leidt tot terugval in het drugsgebruik. Dit verlangen kan een verhoogde activiteit vertegenwoordigen van de corticale excitatoire (glutamaat) neurotransmitters, die de rustactiviteit van de DA-bevattende VTA-neuronen aansturen, zoals vermeld, en ook de LC NA-neuronen aansturen. Naarmate de glutamaatactiviteit toeneemt, zal DA vrijkomen uit de VTA, wat leidt tot het verlangen naar of hunkeren naar drugs, en NA zal vrijkomen uit de LC, wat leidt tot verhoogde ontwenningsverschijnselen van opioïden. Deze theorie suggereert dat deze corticale prikkelende hersenbanen overactief zijn bij heroïneverslaving en dat het verminderen van hun activiteit therapeutisch zou zijn. Wetenschappers onderzoeken momenteel een medicijn genaamd lamotrigene en verwante verbindingen die exciterende aminozuurantagonisten worden genoemd om te zien of deze mogelijke behandelingsstrategie echt kan werken.

Verschillende mechanismen in de LC- en VTA-NAc-hersenroutes kunnen dus werken tijdens verslaving en terugval. De excitatoire corticale paden kunnen tijdens de rusttoestand weinig respons in de VTA produceren, wat leidt tot verlagingen van DA. Wanneer het verslaafde individu echter wordt blootgesteld aan signalen die hunkering veroorzaken, kunnen de glutamaatroutes voldoende actief worden om DA te verhogen en het verlangen naar een grotere high te stimuleren. Deze zelfde toename in glutamaatactiviteit zal de NA-afgifte van de LC verhogen om een ​​dysfore toestand te produceren die vatbaar is voor terugval en voortdurende verslaving.

Cognitieve tekortenmodel

Het model met cognitieve tekorten van drugsverslaving stelt voor dat personen die verslavende aandoeningen ontwikkelen afwijkingen hebben in een gebied van de hersenen dat de prefrontale cortex (PFC) wordt genoemd. De PFC is belangrijk voor de regulering van oordeelsvermogen, planning en andere uitvoerende functies. Om ons te helpen sommige van onze impulsen voor onmiddellijke bevrediging te overwinnen ten gunste van belangrijkere of uiteindelijk meer lonende langetermijndoelen, stuurt de PFC remmende signalen naar de VTA DA-neuronen van het mesolimbische beloningssysteem.

Het model met cognitieve tekorten stelt voor dat PFC-signalering naar het mesolimbische beloningssysteem wordt aangetast bij personen met verslavende stoornissen, en als gevolg daarvan hebben ze een verminderd vermogen om oordeel te gebruiken om hun impulsen te bedwingen en vatbaar zijn voor dwangmatig drugsgebruik. In overeenstemming met dit model lijken stimulerende middelen zoals methamfetamine het specifieke hersencircuit, de frontostriatale lus, dat remmende signalen van de PFC naar het mesolimbische beloningssysteem transporteert, te beschadigen. Bovendien toonde een recent onderzoek met magnetische resonantiespectroscopie aan dat chronische alcoholmisbruikers abnormaal lage niveaus van gamma-aminoboterzuur (GABA) hebben, de neurochemische stof die de PFC gebruikt om het beloningssysteem te signaleren om minder DA af te geven (Behar et al., 1999). Ook zou het cognitieve tekortenmodel van drugsverslaving de klinische observatie kunnen verklaren dat heroïneverslaving ernstiger is bij personen met een antisociale persoonlijkheidsstoornis, een aandoening die onafhankelijk wordt geassocieerd met PFC-tekorten (Raine et al., 2000).

In tegenstelling tot stimulerende middelen beschadigt heroïne blijkbaar de PFC, maar niet de frontostriatale lus. Daarom kunnen personen die heroïneverslaafd raken enige PFC-schade hebben die onafhankelijk is van hun opioïdenmisbruik, hetzij genetisch overgeërfd of veroorzaakt door een andere factor of gebeurtenis in hun leven. Deze reeds bestaande PFC-schade maakt deze personen vatbaar voor impulsiviteit en gebrek aan controle, en de extra PFC-schade door chronisch herhaald heroïnemisbruik verhoogt de ernst van deze problemen (Kosten, 1998).


Methoden:

Bacteriestammen

Escherichia coli K-12 MG1655 stam werd gebruikt als een wildtype (WT) stam. Indien nodig werd de selectie op kanamycine uitgevoerd bij 25 g ml -1 (voor post-recombinerende selectie, zie hieronder) of bij 50 g ml -1 (voor P1-transductie en plasmideselectie). Voor ampicilline (pCP20, resistentiecassetteresolutie) en spectinomycine (pSIM19, recombinatie) werd een concentratie van 100 g ml -1 gebruikt. De selectie voor overexpressieplasmiden werd gedaan bij 35 g ml -1 chlooramfenicol.

Om de bioluminescentie-tijdsporen te meten, pCS-λ het dragen van de bacterie luxCDABE operon aangedreven door de constitutieve λ-PR promotor werd getransformeerd in de stammen van belang 16 . Selectie voor het luminescentieplasmide werd gebruikt tijdens de bereiding van glycerolvoorraden (kanamycine 50 g ml −1) maar werd weggelaten tijdens de metingen om onbekende interacties tussen de gebruikte antibiotica te voorkomen. Het plasmide werd stabiel gehandhaafd omdat we geen significant fitnessdefect als gevolg van pCS-λ en geen duidelijk spontaan verlies van het plasmide waarnamen, zoals geverifieerd door uitplaten op selectieve en niet-selectieve platen (aanvullend Fig. 7). Daartoe volgden we de groei van bacterieculturen in kolven, schuddend in een waterbad onder vier omstandigheden. We hebben ofwel actief geselecteerd op plasmide-onderhoud en/of antibioticumstress toegepast door 2 μg ml −1 CHL toe te voegen, wat leidde tot ≈50% remming. We hebben de optische dichtheid gemeten met standaardmethoden (met behulp van de Hitachi U-5100 cuvette-spectrofotometer) na elke meting, we hebben 1 ml verwijderd medium aangevuld met vers, voorverwarmd medium en de metingen van de optische dichtheid dienovereenkomstig gecorrigeerd. Na het bereiken van de late exponentiële fase, hebben we de kweek onmiddellijk serieel verdund en gelijke volumes uitgeplaat op zowel selectieve als niet-selectieve platen.

Het translatiefactortitratieplatform werd opgericht in stam HG105 (MG1655 ΔlacIZYA) 50 . In het kort, endogene genen die coderen voor translatiefactoren werden eerst gesubkloneerd in de pKD13-vector onder de controle van PLlacO−1 promotor met FRT-geflankeerde kanamycineresistentiecassette (kan R ) en TrrnB terminator stroomopwaarts en stroomafwaarts van het gen, respectievelijk 13,27,36,51. De tandem van kan R en een gen met alle regulerende elementen werd geïntegreerd in het chromosoom (galK locus) met behulp van λ-rood-recombinering (plasmide pSIM1952). De kanamycineresistentiecassettes hier en in de volgende stappen werden gescheiden met behulp van FLP-resolvase van gist dat tot expressie werd gebracht vanaf pCP2053. Verlies van de resistentiecassette en uitharding van het pCP20-plasmide werden gecontroleerd door uitstrijken op selectie-agarplaten met antibiotica en door junctie-PCR (voor resolutie). Na de resolutie van kanR werd de endogene factor geïnactiveerd door in-frame deletie: kanR werd geïntegreerd in de genlocus en vervolgens gescheiden, waardoor een peptide 51 van 34 residuen achterbleef. We waren niet in staat om kan R rechtstreeks in de stam te introduceren met PLlacO−1 gedreven fr daarom hebben we eerst de deletie uitgevoerd in een hulpstam MG1655 die het ASKA-plasmide draagt ​​met fr 54 [JW0167(-GFP)], die de chromosomale deletie aanvulde toen IPTG werd toegevoegd. De deletie was mogelijk in de hulpstam, wat MG1655 opleverdeFrr::kanR. Vervolgens hebben we de deletie verplaatst door gegeneraliseerde P1-transductie 55 . Voor tufAB, we hebben de deleties P1-getransduceerd (Δtufsteen::kan R entufB::kan R ) achtereenvolgens uit de respectieve gendeletiestammen uit de KEIO-collectie 56 . Alle andere deleties werden rechtstreeks in de betreffende stammen uitgevoerd met behulp van λ-red recombineren met pKD13 als sjabloon voor de cassetteamplificatie 51 . In de laatste stap, lacI gedreven door de PLlacO−1 promotor (die groeisnelheid-onafhankelijke negatieve autoregulatie 13,36 oplevert) samen met de FRT-geflankeerde kan R werd geïntegreerd in de intS locus en de weerstandscassette was opgelost. Het allelintS::kan R -PLlacO−1-lacI-TrrnB werd in de stammen gebracht door gegeneraliseerde P1-transductie. Alle chromosomale modificaties werden gevalideerd door PCR. The factor titration platform and the repressor operon were Sanger-sequenced at the integration junctions using PCR primers or a primer binding into the kan R promoter region (which is upstream of the PLlacO−1 promoter prior the resolution). The final genotype for the strains bearing the factor titration platforms is HG105 ΔgalK::frt-PLlacO−1-x Δx::frt ΔintS::frt-PLlacO−1-lacI, waar x denotes the chosen factor. These strains contained no plasmids and no antibiotic resistance cassettes but had a single copy of a translation factor under inducible control.

To generate the strain with independently regulated initiation and translocation factors, we started with a strain carrying a single infB copy driven by PLlacO−1. Then, the negatively autoregulated tetR repressor was integrated into the chromosome, followed by FLP resolvase-mediated resolution of the selection marker. This enabled the integration of PLtetO-1-driven fusA in de intS locus the resolution was followed by the disruption of the endogenous copy of fusA. Furthermore, we introduced a negatively autoregulated lacI in de xylB plaats. This yielded a marker-less strain with the two essential genes infB en fusA under inducible, negatively autoregulated, and independent control. The final genotype is: HG105 ΔgalK::frt-PLlacO−1-infB ΔinfB::frt ΔycaCD::frt-PLtetO−1-tetR ΔintS::frt-PLtetO−1-fusA ΔfusA::frt ΔxylB::frt-PLlacO−1-lacI. Oligonucleotide sequences, targeted template, restrictions sites (when used), and a brief description of use are listed in Supplementary Data 1. All DNA modifying enzymes and Q5 polymerase used in PCR were from New England Biolabs.

We constructed overexpression strains by transforming HG105 with pCS-λ and plasmids from the ASKA library 54 and its derivatives. We used ASKA plasmids in which GFP has been excised from the reading frame we had to repeat the excision of GFP from the infB-bearing plasmid by NotI digestion and subsequent ligation as per ref. 54 . All plasmids were Sanger-sequenced. For controls we used (i) plasmid pAA31 (gift from A. Angermayr), in which the open reading frame is cleanly deleted, as transcription-only control, and (ii) the ASKA plasmid bearing lacZ as a neutral protein overexpression control. We note that the overexpression of proteins leads to growth inhibition 13,57 hence, we actively selected for plasmid maintenance by adding 35 μg mL −1 of chloramphenicol into the growth medium.

Growth rate assay and two-dimensional concentration matrices

Rich lysogeny broth (LB) medium, which at 37 °C supports a growth rate of 2.0 ± 0.1 h −1 , was used. LB medium was prepared from Sigma Aldrich LB broth powder (L3022), pH-adjusted to 7.0 by adding NaOH or HCl, and autoclaved. Antibiotic stock solutions were prepared from powder stocks (for catalog numbers, see Supplementary Table 1), dissolved either in ethanol (CHL, ERM, and TET), DMSO (LAM and TMP) or water (KAN, CRY, LCY, KSG, FUS, and STR), 0.22 μm filter-sterilized and kept at −20 °C in the dark until used. Antibiotics were purchased from Sigma Aldrich or AvaChem. Some of the antibiotics (e.g., ERM, FUS, and LCY) are not used in the clinic against certain Gram-negative bacteria due to generally poor efficacy however, at higher concentrations (yet still well below the solubility limit) inhibition of growth is observed.

A previously established growth-rate assay based on photon counting was used to precisely quantify the absolute growth rates for 5–9 generations 16 . Cultures were grown in 150 μL of media in opaque white 96-well microtiter plates (Nunc 236105), which were tightly sealed by transparent adhesive foils (Perkin-Elmer 6050185 TopSeal-A PLUS) to prevent contamination and evaporation. We prepared glycerol stocks of WT and factor-titration platform strains from saturated overnight cultures. We inoculated the cultures with

10 2 cells per well (1:10 6 dilution) from either thawed glycerol stocks (for the drug interaction network) or from liquid cultures in which we first incubated the bacteria containing the factor titration-platform for 1 h in the absence of IPTG (inoculated by 1:2000 dilution of the glycerol stock) to partially dilute out the remaining factor molecules before additional 1:1000 dilution into measurement plates. Between 10 and 20 plates were cycled through a plate reader using a stacking system (Tecan M1000, controlled by Tecan i-control software, v1.10.4). We built a custom incubator box around the stacker towers to facilitate ventilation and fix the temperature to 37 °C (Supplementary Fig. 7). This incubator was designed and troubleshot by B.K. and Andreas Angermayr (IST Austria and University of Cologne) and built by IST Miba Machine Shop. Each plate was read every 20–40 min and was shaken (orbital 10 s, 582 rpm) immediately before reading (settle time 10 ms, integration time 1 s). Plates were manually pipetted and concentration gradients of antibiotics and inducers (IPTG, aTc) were prepared by serial dilution (0.70-fold).

Growth rates were determined as a best-fit slope of a linear function fitted to the (mathrm,) -transformed photon counts per second. The fitting procedure and examples of growth curves are shown in Supplementary Fig. 1. In rare cases of occurrence of mutants (as evidenced by sudden growth) we manually removed the measurement (only in the case of tufA titration). We verified that the luminescence-based technique leads to the same results as a classical optical density-based one (Supplementary Fig. 7).

Normalization of dose–response surfaces

All growth rates were normalized relative to the average growth rate in the drug-free medium [for factor-titration strains at the highest inducer concentration (5 mM)]. Small differences between individual dose–response curves were inevitable due to known challenges of preparing identical concentrations gradients on different days. To correct for such day-to-day variability, we rescaled the concentration units to the IC50 for each drug. de IC50 was obtained from fitting the Hill function (y(x)=1/left[1+>>_<50> ight)>^ ight]) to the individual dose–response curves. The dose–response curve of each drug was measured seven times and averaged. de IC50 and corresponding errors reported in Table 1 are extracted from such average dose–response curves (Supplementary Fig. 1g). Induction curves were normalized slightly differently, using a shifted and increasing Hill function in the form (g(b)=[(b+_<0>)/<< m>>_<50>]^/left<1+_<0>)/<< m>>_<50> ight]>^ ight>) , where B0 is a concentration offset. The latter parameter was required as the complete cessation of growth was not achievable in some cases even in the absence of inducer as the promoter PLlacO−1 is leaky. Inducer concentrations were thus rescaled via B → (B + B0)/IC50.

Smoothing of dose–response surfaces

To reduce noise when plotting response surfaces, we smoothed the data using a custom Mathematica script that implements locally weighted regression (LOESS) 58 . This approach only smoothed the contours and did not alter the character of dose–response surfaces. Smoothing was only used for plotting and not for the analysis in which only interpolation between adjacent points was used (Mathematica function Interpolation).

Statistics and reproducibility

We measured the dose–response surfaces for all 28 drug interactions in duplicate. As the dose–response surface was measured over a 12 × 16 grid, the duplicates swap the drug axes (12 × 16 → 16 × 12 across two 96-well plates) on different days to check for effects coming from spreading the measurements over different plates. The experimental and analysis procedure led to reproducible measurements of growth rates between days (Supplementary Fig. 1, ρ ≈ 0.86). For the double factor titration experiment, the inducer gradients were set up across 6 plates to form a 24 × 24 grid. Each response surface is thus based on multiple measurements and the impact of individual points is assessed by bootstrapping. In total, we measured over 20,000 growth curves. We automatized the collection and analysis of the data to allow for unbiased interpretation of the data.

We characterized the type of drug interaction by calculation of the Loewe interaction score [Supplementary Equation (1)]. The effects of bottlenecks on the efficacy of antibiotics were quantified by calculating the bottleneck dependency score [Supplementary Equation (2)]. To classify the interactions between antibiotics and antibiotic-bottleneck pairs, we estimated the null distributions by bootstrapping (Supplementary Information).

We assessed the accuracy of our predictions by “isobole sliding,” which measures the average deviation of measured isoboles from predicted ones (Supplementary Information). We performed bootstrapping to statistically determine the significances of predictions.

A biophysical model for a pair of antibiotics

We constructed a minimal mathematical model describing the combined antibiotic action based on growth laws 13 and kinetics of antibiotic transport and binding 14 . The corresponding system of coupled ordinary differential equations (ODEs) and additional analysis are specified in the Supplementary Information. Differential equations describe the time-evolution of unbound, individually-bound and double-bound ribosomes, as well as the intracellular concentrations of antibiotics. Growth laws convert the concentration of unbound ribosomes into the growth rate, which determines the total abundance of ribosomes 13,14 . Steady-state solutions were found numerically. A more detailed analysis of model extensions is reported in ref. 23 .

TASEP model of translation

We developed a mean-field mathematical model of factor-mediated translation which recovers the suppression between inhibitions of initiation and translocation. We took into account that ribosomes can perform a specific step only when bound by a corresponding translation factor. The mathematical framework is detailed in Supplementary Methods followed by a Supplementary Discussion of the effect of mRNA growth-rate dependence, rescue mechanisms, and inefficiency of a direct response to translocation inhibition.

Materials availability

Strains described in this study can be obtained from the corresponding author upon reasonable request.

Rapportageoverzicht

Meer informatie over onderzoeksopzet is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary die aan dit artikel is gekoppeld.


Ondersteunende informatie

S1 Fig. Effect of antibiotics on virulence factor production in P. aeruginosa PAO1 populations.

We exposed PAO1 to all four antibiotics in two the experimental media: CAA+Tf (iron-limited CAA with transferrin) and CAS. After 48 hours of exposure, we measured virulence factor production: pyoverdine in CAA+Tf and proteases in CAS. The inhibition of virulence factors followed the same pattern as for growth inhibition, except for ciprofloxacin and meropenem, where pyoverdine production slightly increased at intermediate antibiotic concentrations and only dropped at higher antibiotic levels. Dots show means ± standard error across six replicates. All data are scaled relative to the drug-free treatment. Data stem from the same two independent experiments as shown in Fig 1. The red dots indicate the highest concentration used for each experiment, from which 7 serial dilution steps were tested. Curves were fitted with log-logistic functions. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. CAA, casamino acid medium CAS, casein medium Tf, human apo-transferrin.

S2 Fig. Statistical significance maps for antibiotic-antivirulence drug interactions.

For each drug concentration combination, we tested whether the degree of synergy is significantly different from zero (i.e., independent drug interaction). Heatmaps depict P-values ranging from white (no significant drug interaction) to blue (significant antagonism) to red (significant synergy). P-Values are shown for gallium-antibiotic combinations (ADVERTENTIE for growth E-H for pyoverdine production) and furanone-antibiotic combinations (I-L for growth M-P for protease production). To account for multiple comparisons, we corrected the P-values for each drug combination using the “false discovery rate” method. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364.

S3 Fig. Assessing the relationship between the degrees of synergy for growth and virulence factor inhibition.

We found that the degrees of synergy for the two measured traits across the 9×9 antibiotic-antivirulence combination matrix correlated in 6 out of 8 cases (Pearson correlation coefficient: ciprofloxacin-gallium: R = 0.09, t79 = 0.85, P = 0.394 colistin-gallium: R = 0.69, t79 = 8.51, P < 0.001 meropenem-gallium: R = 0.17, t79 = 1.52, P = 0.130 tobramycin-gallium: R = 0.58, t79 = 6.39, P < 0.001 ciprofloxacin-furanone: R = 0.34, t79 = 3.22, P = 0.002 colistin-furanone: R = 0.96, t79 = 32.50, P < 0.001 meropenem-furanone: R = 0.87, t79 = 15.48, P < 0.001 tobramycin-furanone: R = 0.75, t79 = 10.16, P < 0,001). Solid lines show association trend lines between the two levels of interactions. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364.

S4 Fig. Clones evolved under antibiotic treatments show altered dose-response curves.

To confirm that the evolved clones are resistant to the antibiotic in the two experimental media (iron-limited [CAA+Tf] and CAS media), we measured for each antibiotic the dose-response curves for the ancestral WT and one randomly selected clone either in CAA+Tf or CAS. For each antibiotic and medium, we tested 11 concentrations within these ranges: ciprofloxacin: 0–1 μg/mL (CAA+Tf), 0–4 μg/mL (CAS) colistin: 0–1.2 μg/mL (CAA+Tf), 0–3.33 μg/mL (CAS) meropenem: 0–1.6 μg/mL (CAA+Tf), 0–7 μg/mL (CAS) tobramycin: 0–2.4 μg/mL (CAA+Tf), 0–24 μg/mL (CAS). All evolved clones showed an attenuated dose-response curve, were able to grow at higher drug concentrations than the ancestral WT and had significantly higher IC50 waarden. Measurements of OD600 were taken after 48 hours incubation time at 37°C under static conditions. Growth values are scaled relative to the untreated control for each strain. Data are shown as means ± standard errors across four replicates. Curves were fitted with four parameters log-logistic functions. In the lower left corner of each panel we show the mean IC50 values of the WT and AtbR clones ± standard errors (μg/mL) and the respective statistical analysis comparing the ratio of the means. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. AtbR clones, antibiotic resistant clones CAA, casamino acid medium CAS, casein medium IC50, half maximal inhibitory concentration OD600, optical density at 600 nm Tf, human apo-transferrin WT, wild-type.

S5 Fig. Antivirulence dose-response curves for AtbR clones of P. aeruginosa PAO1.

To check whether resistance to antibiotics influenced the susceptibility to antivirulence compounds, we exposed our selected AtbR clones to a range of concentrations of both gallium (0–50 μM) and furanone (0–390 μM). Under gallium treatment, only the colistin resistant clone showed increased sensitivity to the antivirulence drug. Under furanone treatment, the clones resistant to ciprofloxacin and colistin showed a certain level of cross-resistance to this antivirulence compound, while we found collateral sensitivity between tobramycin and furanone. All values are scaled relative to the untreated control for each strain, and data points show the mean across four replicates. We used either log-logistic functions (in CAA+Tf) or three-parameter Weibull functions (in CAS) to fit the curves and extract mean IC50 values ± standard error, which are reported in the left bottom corner of each panel together with the respective statistical analysis comparing the ratio of the means. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. AtbR clones, antibiotic resistant clones CAA, casamino acid medium CAS, casein medium IC50, half maximal inhibitory concentration OD600, optical density at 600 nm Tf, human apo-transferrin WT, wild-type.

S6 Fig. Testing for correlations between the degree of synergy for growth inhibition and the outcome of competitions.

We tested whether the degree of synergy for growth inhibition is a predictor of the competition outcome between the AtbR clones and the susceptible WT under combination treatment. We compared the degrees of synergy of each drug combination for the AtbR clones (EEN) or the WT (B) to their relative fitness values in competition. Positive or negative y-values indicate that the clones increased or decreased in frequency during the competition, respectively. Positive or negative values on the x-axis indicate synergy or antagonism, respectively. There were no significant associations between the relative fitness and the degree of synergy for growth inhibition neither for the AtbR clones nor for the WT (ANOVA, for AtbR: F1,65 = 0.88, P = 0.353 for WT: F1,65 = 1.85, P = 0.179). Instead, relative fitness was significantly affected by the type of antivirulence drug (ANOVA, for AtbR clones: F1,65 = 106.36, P < 0.001 for WT: F1,65 = 44.58, P < 0.001) and the specific antibiotic-antivirulence combination applied (ANOVA, for AtbR clones: F3,65 = 37.45, P < 0.001 for WT: F3,65 = 14.50, P < 0,001). The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. AtbR clones, antibiotic resistant clones WT, wild-type.

S7 Fig. Validation of mCherry fluorescence as a proxy for growth measurements.

The CAS media has a very high turbidity due to the poor solubility of casein, which interferes with OD600, which is typically used as a measure of growth. We therefore used mCherry fluorescence, constitutively expressed from a single-copy chromosomal insertion, as a proxy for bacterial growth in CAS. To validate this method, we grew PAO1-mCherry (able to digest CAS) and PAO1 ΔlasR-mCherry (unable to digest CAS) in CAS medium for 48 hours at 37°C in a Tecan plate reader tracking OD600 and mCherry fluorescence every 15 minutes. (EEN) Blank corrected OD600 trajectories for PAO1-mCherry and PAO1 ΔlasR-mCherry. PAO1 ΔlasR-mCherry grew poorly but showed a standard sigmoid growth pattern by digesting the supplemented CAA. In stark contrast, the OD600 of PAO1-mCherry first increased sharply, then declined dramatically, followed by a slow linear increase over time. This trajectory is explained by the simultaneous growth of bacteria (increasing OD600) and clearance of the turbidity due to protein digestion (decreasing OD600), thus demonstrating that OD600 is an unsuitable measure for growth. (B) Blank corrected mCherry trajectories for PAO1-mCherry and PAO1 ΔlasR-mCherry. As for OD600, PAO1 ΔlasR-mCherry grew only poorly (according to the mCherry signal) and only within the first 7 hours of the assay, digesting the supplemented CAA. Unlike for OD600, the mCherry signal yielded a much more sensible growth trajectory for PAO1-mCherry, characterized by an initial increase (CAA consumption), followed by a lag phase (protease secretion and switch to CAS) and growth resumption (CAS digestion). (C) To further validate that mCherry fluorescence is a good proxy for growth in CAS media, we compared the endpoint measurements of mCherry fluorescence with CFU/mL values, determined by plating the cultures on LB-agar plates. All values are scaled relative to PAO1-mCherry. The two methods yielded similar results and show that the growth of PAO1ΔlasR-mCherry is approximately 25% of the one of PAO1-mCherry. Data are shown as means ± standard errors across eight replicates for the growth curves and eight (PAO1-mCherry) or four (PAO1ΔlasR-mCherry) replicates for the CFU/mL data. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. CAA, casamino acid medium CAS, casein medium CFU, colony forming units LB, Lysogeny broth OD600, optical density at 600 nm.

S8 Fig. Correlation between endpoint measurements and area under the growth curve (integral) for single drug treatments.

To verify that a single OD600 or mCherry measurement after growth is a good proxy for growth inhibition, we tested the correlation between the area under the growth curve (integral) and endpoint measurements, under single drug treatments in CAA+Tf (EEN) or CAS (B) media. For each antibiotic and antivirulence compound, we picked 9 concentrations that cover the entire drug active range and that were used for the combination assay, shown in Figs 3 and 4. Each concentration was tested in 5-fold replication. Cultures were grown for 48 hours in a Tecan Infinite M-200 plate reader (Tecan Group, Switzerland) and growth was recorded by reading OD600 (in CAA+Tf) or mCherry fluorescence (in CAS) every 15 minutes, after a short shaking event. Growth trajectories were established with a spline fit, and the two parameters (endpoint yield and integral) were extracted using the grofit package in RStudio. In both media, the two growth parameters showed strong linear association patterns (blue lines and R 2 values). For several drugs, growth integral measurements were more sensitive to discover growth inhibitions at low drug concentrations (light gray circles), and that is why cubic data fits (red lines and R 2 values) often explained an even higher proportion of the variance. Nonetheless, these control analyses show that endpoint growth values are reliable proxies for measuring growth inhibition under drug treatment. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. CAA, casamino acid medium CAS, casein medium OD600, optical density at 600 nm Tf, human apo-transferrin.

S9 Fig. Fluorescence correction for mCherry and pyoverdine measurements in the presence of furanone C-30 and gallium.

The two metals bromine (in furanone C-30) and gallium interfere with the fluorescence measurements of mCherry and pyoverdine in a concentration-dependent manner. To account for this bias, we established calibration curves and used them to correct fluorescent values in all experiments. (EEN) Furanone C-30 is autofluorescent in the mCherry channel (excitation 582 nm, emission 620 nm). We quantified the autofluorescence in function of the concentration of furanone both in CAS and CAA media. Briefly, we incubated each media supplemented with a range of furanone C-30 concentrations (0–390 μM, as used in Fig 2, in 6-fold replication) for 48 hours under static conditions and then measured mCherry fluorescence. The relationship between concentration and fluorescence was explained by a four-parameter logistic function in CAS or by a three-parameter Gompertz function in CAA. In all experiments, we used this calibration curve to subtract, for each furanone concentration, the autofluorescence component from the mCherry measurements. (B) The fluorescent signal of pyoverdine becomes inflated when gallium binds to the siderophore [27,38]. We used the supplementary data from Ross-Gillespie and colleagues [27] to quantify this bias in fluorescence as a function of gallium concentration. They incubated 200 μM pyoverdine in iron-limited CAA+Tf medium, supplemented with gallium concentrations ranging from 0 to 1 mM, and measured pyoverdine-associated fluorescence. When supplemented with more than 50 μM gallium, pyoverdine showed a nearly 2-fold higher fluorescence signal. This signal bias can be explained by a five-parameter log-logistic function. In all our experiments, for each gallium concentration used, we applied correction factors derived from this fitted curve to account for this potential bias. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. CAA, casamino acid medium CAS, casein medium Tf, human apo-transferrin.

S10 Fig. Examples of flow cytometry scatterplots from competition experiments between the sensitive WT PAO1 and AtbR clones.

The WT strain PAO1, chromosomally tagged with a constitutively expressed GFP marker, was co-cultured with AtbR clones in a 90:10 ratio in the presence of five different drug treatments. Mono- and mixed cultures were measured with the flow cytometer at the beginning (time, 0 hours) and at the end (time, 24 hours) of the competition experiments. For data analysis, we plotted the size of the cells (forward scatter, FSC) against the GFP fluorescence to distinguish tagged from untagged cells. The shown plots depict an illustrative example, in which ciprofloxacin was used as an antibiotic. (EEN) A monoculture of the untagged AtbR clone does not show GFP fluorescence. This control allows quantifying the background fluorescence of the cells. (B) A monoculture of the tagged PAO1-GFP shows relatively strong GFP fluorescence, with 99.1% of all cells considered as GFP positive. (C) In a 90:10 volumetric mix of WT and AtbR clones, the cells of the two strains can be unambiguously distinguished and their actual ratio (88:12) can be determined. Frequencies of GFP-positive and GFP-negative cells were then quantified after a 24-hour incubation period at 37°C. (NS) The monoculture of the untagged AtbR strain shows that cells do not increase their GFP autofluorescence over time, and 100% of cells fall into the GFP-negative gate. (E) The monoculture of PAO1-GFP shows relatively strong fluorescence also at the end of the competition, with 99.3% of cells being classified as GFP positive. (F) The mix of WT and AtbR clones, when grown in absence of any drug treatment stays at the initial frequency (88.2:11.8). (G) When the mix was grown in the presence of the antibiotic, the fraction of untagged AtbR strain increases to 23.6%, demonstrating their selective advantage. AtbR clones, antibiotic resistant clones GFP, green fluorescent proteins WT, wild-type.

S1 Tafel. Statistical analyses (t test and ANOVA) performed on the data presented in Fig 6.

S2 Table. Concentrations of antibiotics and antivirulence drugs used for the combinatorial treatments and the competition assays.


Accelerating Antiretroviral Drug Development

Established in the early years of the HIV/AIDS pandemic, the NIAID-supported National Cooperative Drug Discovery Group Program for the Treatment of AIDS (NCDDG-AIDS) provided a framework for scientists from academia, industry, and government to collaborate on research related to the identification and development of new drugs. NIAID-supported researchers developed cell culture and biochemical test systems that allowed researchers to more easily screen drug candidates, and NIAID also played a key role in the development of animal models for preclinical testing.

In the early 1990s, additional NRTI drugs gained FDA approval. The development of AZT and other NRTIs showed that treating HIV was possible, and these drugs paved the way for discovery and development of new generations of antiretroviral drugs.

While the earliest antiretroviral agents were developed before many HIV diagnostics were available in the clinic, the development of laboratory tests to measure viral load and CD4+ cell count greatly accelerated progress in drug development. Viral load describes the amount of HIV in the blood. Typically, the higher the viral load, the faster the CD4+ cell count—an indicator of how well the immune system is working—will fall. These advances made it possible for researchers to use lab test results, viral load measurements in particular, to assess how well an investigational antiretroviral agent worked. This approach required drug trials to last roughly 6 months, whereas relying solely on clinical indicators, such as progression to AIDS or death, ordinarily required trials to last years before a result was available.


Doubling Down on Headache Pain: Effective Combo of Common Drugs

It’s not uncommon for people who experience a concussion to have moderate to severe headaches in the weeks after the injury. A new study has found a combination of two drugs, both common anti-nausea medications, given intravenously in the emergency room may relieve those headaches better than a placebo. The study is published in Neurology®, the medical journal of the American Academy of Neurology.

Metoclopramide is an anti-nausea medicine sometimes used to treat migraine. Diphenhydramine is a common antihistamine that when used in its injected form can treat motion sickness. Higher doses of metoclopramide given intravenously can cause restlessness, so this study combined diphenhydramine with metoclopramide to prevent those symptoms.

“The headaches you get after a trauma like a fall, an assault or car accident can linger for months or even years and lead to a reduced quality of life, so the results of our study are promising,” said study author Benjamin W. Friedman, M.D., of Albert Einstein College of Medicine, Bronx, N.Y.

The study involved 160 people who experienced a head trauma and then visited an emergency room because of a headache within 10 days. They were randomly assigned to two groups: 81 people were given 20 milligrams (mg) of metoclopramide and 25 mg of diphenhydramine intravenously. The remaining 79 people were given an injection of saline solution as a placebo.

Researchers asked people to rate the intensity of their pain on a scale of zero to 10 one hour after the medication was administered. On this scale, zero means no pain and 10 means the worst pain imaginable.

The study found that the drug combination reduced the average person’s pain level by more than five points one hour later. People in the group given the combination of metoclopramide and diphenhydramine said they improved, on average, by 5.2 points on the pain scale. People in the group given a placebo, on average, said their pain improved by 3.8 points on the pain scale.

In the group given the drug combination, 43% experienced side effects like drowsiness, restlessness, or diarrhea. In the group given the placebo, 28% of the people reported those kinds of side effects.

“More research is needed to determine the most effective dose of metoclopramide, and how long to administer it, to see if people can get longer-term relief after they leave the emergency room,” Friedman said. “Also, future work may be able to determine whether early treatment with this medication can target other disruptive symptoms you may get after a head injury, like depression, sleep disorders, and anxiety.”

A limitation of the study is that the study participants came from high poverty areas of the country, and may have had less access to care. Because successful headache treatment may be associated with access to care, these results may not apply to the general population.

Reference: “Randomized Study of Metoclopramide Plus Diphenhydramine for Acute Posttraumatic Headache” by Benjamin W. Friedman, Eddie Irizarry, Darnell Cain, Arianna Caradonna, Mia T. Minen, Clemencia Solorzano, Eleftheria Zias, David Zybert, Michael McGregor, Polly E. Bijur and E. John Gallagher, 24 March 2021, Neurologie.
DOI: 10.1212/WNL.0000000000011822

The study received support from the Harold and Muriel Block Institute for Clinical and Translational Research at Einstein and Montefiore.


The most common side effects of antidepressants are drowsiness and fatigue, gastrointestinal side effects such as nausea, sexual dysfunction, weight gain, and risk of suicide.

Drowsiness and Fatigue

Drowsiness and dizziness are more common with tricyclic antidepressants (TCAs) or monoamine oxidase inhibitors (MAOIs) than selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs). Most people become tolerant to this effect. Some antidepressants can cause insomnia.

Gastrointestinal side effects

Most people feel a bit nauseous when they first start taking an antidepressant, but this usually goes away after a few weeks. Constipation, diarrhea, and a dry mouth may also occur, usually temporarily.

Antidepressants may reduce your sex drive (libido) or your ability to obtain or keep an erection if you are a man or reach orgasm (both male and female).

Once your symptoms of depression have resolved, your appetite usually improves. This may be the reason behind weight gain with antidepressants, or it could be due to fluid retention. Some antidepressants are more likely to cause weight gain than others.

All antidepressants have been associated with an increased risk of suicidal thoughts and behaviors, particularly in children and adolescents under the age of 25 years. This is more common within the first few weeks of starting an antidepressant. You should tell your doctor if you feel like your mood has gotten worse or if you are having suicidal thoughts.

Antidepressants are used for several mood-related disorders, not only depression, usually in combination with other treatments, such as talk therapy.

They are thought to work by altering the balance of chemicals in the brain called neurotransmitters, such as serotonin, norepinephrine, and/or dopamine. While altering these chemicals relieves symptoms of depression such as low mood, irritability, feelings of worthlessness, anxiety, and difficulty in sleeping, it does mean they can cause a range of side effects.


Bekijk de video: Slik geen medicatiefouten (December 2021).