Informatie

8.14: Post-translationele regulatie - Biologie


Eiwitten kunnen worden gemodificeerd na hun synthese, vouwing en assemblage - dit proces staat bekend als post-translationele modificatie. Ze kunnen ook de interacties van een eiwit met andere eiwitten, de lokalisatie van het eiwit in de cel of de stabiliteit ervan wijzigen.


16.6 Eukaryotische translationele en post-translationele genregulatie

In deze sectie onderzoek je de volgende vraag:

  • Wat zijn verschillende manieren waarop translationele en post-translationele controle van genexpressie plaatsvindt?

Aansluiting voor AP ® Cursussen

Het veranderen van de status van het RNA of het eiwit zelf kan invloed hebben op de hoeveelheid geproduceerd eiwit, de functie van het eiwit of hoe lang het eiwit in de cel blijft. Modificaties zoals fosforylering en omgevingsstimuli kunnen de stabiliteit en functie van het eiwit beïnvloeden.

De gepresenteerde informatie en de voorbeelden die worden benadrukt in de sectie ondersteunen concepten die zijn beschreven in Big Idea 4 van het AP ® Biology Curriculum Framework. De leerdoelen die in het leerplankader worden vermeld, bieden een transparante basis voor de AP ® Biologie-cursus, een op onderzoek gebaseerde laboratoriumervaring, educatieve activiteiten en AP ® -examenvragen. Een leerdoel voegt vereiste inhoud samen met een of meer van de zeven wetenschapspraktijken.

Groot idee 4 Biologische systemen interageren, en deze systemen en hun interacties bezitten complexe eigenschappen.
Blijvend begrip 4.A Interacties binnen biologische systemen leiden tot complexe eigenschappen.
Essentiële kennis 4.A.3 Interacties tussen externe prikkels en gereguleerde genexpressie leiden tot specialisatie van cellen, weefsels en organen.
wetenschap praktijk 1.3 De student kan representaties en modellen van natuurlijke of kunstmatige fenomenen en systemen in het domein verfijnen.
Leerdoel 4.7 De student kan representaties verfijnen om te illustreren hoe interacties tussen externe stimuli en genexpressie leiden tot specialisatie van cellen, weefsels en organen.

Ondersteuning voor docenten

Introduceer het onderwerp van genregulatie na vertaling met behulp van visuals zoals deze video.

Nadat het RNA naar het cytoplasma is getransporteerd, wordt het vertaald in eiwit. Controle van dit proces is grotendeels afhankelijk van het RNA-molecuul. Zoals eerder besproken, zal de stabiliteit van het RNA een grote invloed hebben op de translatie ervan in een eiwit. Naarmate de stabiliteit verandert, verandert ook de hoeveelheid tijd die beschikbaar is voor vertaling.

Het initiatiecomplex en de vertaalsnelheid

Net als transcriptie wordt de translatie gecontroleerd door eiwitten die binden en het proces initiëren. In vertaling wordt het complex dat samenkomt om het proces te starten, het initiatiecomplex genoemd. Het eerste eiwit dat aan het RNA bindt om translatie te initiëren, is de eukaryote initiatiefactor-2 (eIF-2). Het eIF-2-eiwit is actief wanneer het bindt aan het hoogenergetische molecuul guanosinetrifosfaat (GTP). GTP levert de energie om de reactie te starten door een fosfaat op te geven en guanosinedifosfaat (GDP) te worden. Het aan GTP gebonden eIF-2-eiwit bindt aan de kleine 40S-ribosomale subeenheid. Wanneer gebonden, associeert het methionine-initiator-tRNA zich met het eIF-2/40S-ribosoomcomplex, waardoor het te vertalen mRNA wordt meegebracht. Op dit punt, wanneer het initiatorcomplex is samengesteld, wordt de GTP omgezet in GDP en komt er energie vrij. Het fosfaat en het eIF-2-eiwit worden vrijgemaakt uit het complex en de grote 60S-ribosomale subeenheid bindt om het RNA te vertalen. De binding van eIF-2 aan het RNA wordt gecontroleerd door fosforylering. Als eIF-2 gefosforyleerd is, ondergaat het een conformationele verandering en kan het niet binden aan GTP. Daarom kan het initiatiecomplex zich niet goed vormen en wordt de translatie belemmerd (Figuur 16.14). Wanneer eIF-2 ongefosforyleerd blijft, bindt het het RNA en vertaalt het actief het eiwit.

Visuele verbinding

  1. Het zal de vertaalsnelheid verhogen.
  2. Het heeft geen invloed op het vertaalproces.
  3. Het blokkeert de translatie van bepaalde eiwitten.
  4. Het zal meerdere fragmenten van polypeptiden produceren.

Chemische modificaties, eiwitactiviteit en levensduur

Eiwitten kunnen chemisch worden gemodificeerd door toevoeging van groepen, waaronder methyl-, fosfaat-, acetyl- en ubiquitinegroepen. De toevoeging of verwijdering van deze groepen aan eiwitten regelt hun activiteit of de tijdsduur dat ze in de cel bestaan. Soms kunnen deze modificaties regelen waar een eiwit in de cel wordt gevonden, bijvoorbeeld in de kern, het cytoplasma of gehecht aan het plasmamembraan.

Chemische modificaties treden op als reactie op externe stimuli zoals stress, het gebrek aan voedingsstoffen, hitte of blootstelling aan ultraviolet licht. Deze veranderingen kunnen de epigenetische toegankelijkheid, transcriptie, mRNA-stabiliteit of translatie veranderen, wat allemaal resulteert in veranderingen in de expressie van verschillende genen. Dit is een efficiënte manier voor de cel om de niveaus van specifieke eiwitten snel te veranderen als reactie op de omgeving. Omdat eiwitten betrokken zijn bij elk stadium van genregulatie, kan de fosforylering van een eiwit (afhankelijk van het eiwit dat wordt gemodificeerd) de toegankelijkheid tot het chromosoom veranderen, de translatie veranderen (door de binding of functie van de transcriptiefactor te veranderen), kan de nucleaire shuttle veranderen ( door modificaties aan het kernporiecomplex te beïnvloeden), kan de RNA-stabiliteit veranderen (door al dan niet te binden aan het RNA om de stabiliteit ervan te reguleren), kan de translatie wijzigen (verhogen of verlagen), of kan post-translationele modificaties veranderen (toevoegen of verwijderen van fosfaten of andere chemische modificaties).

De toevoeging van een ubiquitinegroep aan een eiwit markeert dat eiwit voor afbraak. Ubiquitine werkt als een vlag die aangeeft dat de eiwitlevensduur compleet is. Deze eiwitten worden verplaatst naar het proteasoom, een organel dat dient om eiwitten te verwijderen, om te worden afgebroken (Figuur 16.15). Een manier om genexpressie te beheersen, is daarom om de levensduur van het eiwit te veranderen.

Science Practice Connection voor AP®-cursussen

Denk er over na

Hoe kunnen omgevingsstimuli zoals blootstelling aan ultraviolet licht of een tekort aan voedingsstoffen de genexpressie wijzigen?

Ondersteuning voor docenten

Deze vraag is een toepassing van Leerdoel 4.7 en Wetenschapspraktijk 1.3 omdat de student, gebaseerd op de kennis van de student over transcriptie en vertaling, de middelen beschrijft voor translationele controle van genexpressie.

Antwoord geven:

Als Amazon Associate verdienen we aan in aanmerking komende aankopen.

Wilt u dit boek citeren, delen of wijzigen? Dit boek is Creative Commons Attribution License 4.0 en je moet OpenStax toeschrijven.

    Als u dit boek geheel of gedeeltelijk in gedrukte vorm opnieuw distribueert, moet u op elke fysieke pagina de volgende bronvermelding opnemen:

  • Gebruik de onderstaande informatie om een ​​citaat te genereren. We raden aan om een ​​citatietool zoals deze te gebruiken.
    • Auteurs: Julianne Zedalis, John Eggebrecht
    • Uitgever/website: OpenStax
    • Titel van het boek: Biologie voor AP®-cursussen
    • Publicatiedatum: 8 maart 2018
    • Locatie: Houston, Texas
    • Boek-URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/1-introduction
    • Sectie-URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/16-6-eukaryotic-translational-and-post-translational-gene-regulation

    © 12 januari 2021 OpenStax. Tekstboekinhoud geproduceerd door OpenStax is gelicentieerd onder een Creative Commons Attribution License 4.0-licentie. De OpenStax-naam, het OpenStax-logo, de OpenStax-boekomslagen, de OpenStax CNX-naam en het OpenStax CNX-logo zijn niet onderworpen aan de Creative Commons-licentie en mogen niet worden gereproduceerd zonder de voorafgaande en uitdrukkelijke schriftelijke toestemming van Rice University.


    Lab foto's:







    Glycosylering

    Een van de meest voorkomende post-translationele modificaties van eiwitten is glycosylering, de covalente aanhechting van oligosachariden. Koolhydraten in de vorm van asparagine-gekoppelde (N-gekoppelde) of serine/threonine-gekoppelde (O-gekoppelde) oligosachariden zijn belangrijke structurele componenten van veel celoppervlakte en uitgescheiden eiwitten. Glycoproteïnen spelen een cruciale rol in cellulaire processen zoals eiwitsortering, immuunherkenning, receptorbinding, ontsteking en pathogeniteit.

    De diversiteit van oligosacharidestructuren resulteert vaak in heterogeniteit in de massa en lading van glycoproteïnen. Deze complexe aard van glycosylering levert problemen op voor proteomische analyse. We vereenvoudigen de analyse van glycoproteïnen door deglycosyleringskits, een aantal individuele glycosidasen en verschillende glycosyleringsremmers aan te bieden. Glycoproteïnekleuringen, gelabelde lectines en lectineharsen zijn ook beschikbaar voor de detectie of zuivering van glycoproteïnen.


    Abstract

    α-Synucleïne (α-syn), een klein, sterk geconserveerd presynaptisch eiwit dat 140 aminozuren bevat, wordt beschouwd als het belangrijkste pathologische kenmerk van verwante neurodegeneratieve aandoeningen. Hoewel de normale functie van α-syn nauw betrokken is bij de regulatie van vesiculaire neurotransmissie bij deze ziekten, zijn de onderliggende mechanismen van post-translationele modificaties (PTM's) van α-syn in de pathogenese van de ziekte van Parkinson (PD) niet volledig gekarakteriseerd . De pathologische accumulatie van verkeerd gevouwen α-syn speelt een cruciale rol in de pathogenese van PD. Recente studies van factoren die bijdragen aan α-syn-geassocieerde aggregatie en verkeerde vouwing hebben ons begrip van het ziekteproces van de ziekte van Parkinson vergroot. In deze Review vatten we de structuur en fysiologische functie van α-syn samen, en we belichten verder de belangrijkste PTM's (namelijk fosforylering, ubiquitinatie, nitratie, acetylering, truncatie, SUMOylation en O-GlcNAcylation) van α-syn en de effecten van deze wijzigingen op α-syn-aggregatie, die mechanismen voor de pathogenese van PD kunnen ophelderen en een theoretische basis kunnen leggen voor klinische behandeling van PD.


    Post-translationele modificaties van G-eiwit-gekoppelde receptoren regelen cellulaire signaleringsdynamiek in ruimte en tijd

    G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's) vormen een grote familie die >800-signaalreceptoren omvat die talrijke cellulaire en fysiologische reacties reguleren. GPCR's zijn betrokken bij tal van ziekten en vertegenwoordigen de grootste klasse van doelwitten voor geneesmiddelen. Hoewel vooruitgang in de GPCR-structuur en farmacologie de ontdekking van geneesmiddelen heeft verbeterd, heeft de regulatie van de GPCR-functie door diverse post-translationele modificaties (PTM's) minimale aandacht gekregen. Van meer dan 200 PTM's is bekend dat ze in zoogdiercellen voorkomen, maar er zijn er maar een paar gerapporteerd voor GPCR's. Vroege studies onthulden fosforylering als een belangrijke regulator van GPCR-signalering, terwijl latere rapporten een functie voor ubiquitinatie, glycosylering en palmitoylering in GPCR-biologie impliceerden. Hoewel onze kennis van GPCR-fosforylering uitgebreid is, is onze kennis van de modificerende enzymen, regulatie en functie van andere GPCR PTM's beperkt. In deze review bieden we een uitgebreid overzicht van GPCR post-translationele modificaties met een grotere focus op nieuwe ontdekkingen. We bespreken de subcellulaire locatie en regulerende mechanismen die post-translationele modificaties van GPCR's regelen. De functionele implicaties van nieuw ontdekte GPCR PTM's op receptorvouwing, biosynthese, endocytische handel, dimerisatie, gecompartimenteerde signalering en bevooroordeelde signalering worden ook gegeven. Methoden voor het detecteren en bestuderen van GPCR PTM's en PTM-overspraak worden verder belicht. Ten slotte sluiten we af met een bespreking van de implicaties van GPCR PTM's voor ziekten bij de mens en hun belang voor de ontdekking van geneesmiddelen.

    Betekenisverklaring Post-translationele modificatie van G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) regelt alle aspecten van de receptorfunctie, maar de detectie en studie van diverse soorten GPCR-modificaties zijn beperkt. Een grondig begrip van de rol en mechanismen waarmee diverse post-translationele modificaties GPCR-signalering en -handel reguleren, is essentieel voor het begrijpen van ontregelde mechanismen bij ziekte en voor het verbeteren en verfijnen van de ontwikkeling van geneesmiddelen voor GPCR's.


    Chemische modificaties, eiwitactiviteit en levensduur

    Eiwitten kunnen chemisch worden gemodificeerd door toevoeging van groepen, waaronder methyl-, fosfaat-, acetyl- en ubiquitinegroepen. De toevoeging of verwijdering van deze groepen aan eiwitten regelt hun activiteit of de tijdsduur dat ze in de cel bestaan. Soms kunnen deze modificaties regelen waar een eiwit in de cel wordt gevonden, bijvoorbeeld in de kern, in het cytoplasma of gehecht aan het plasmamembraan.

    Chemische modificaties treden op als reactie op externe stimuli zoals stress, het gebrek aan voedingsstoffen, hitte of blootstelling aan ultraviolet licht. Deze veranderingen kunnen de epigenetische toegankelijkheid, transcriptie, mRNA-stabiliteit of translatie veranderen, wat allemaal resulteert in veranderingen in de expressie van verschillende genen. Dit is een efficiënte manier voor de cel om de niveaus van specifieke eiwitten snel te veranderen als reactie op de omgeving. Omdat eiwitten betrokken zijn bij elk stadium van genregulatie, kan de fosforylering van een eiwit (afhankelijk van het eiwit dat wordt gemodificeerd) de toegankelijkheid tot het chromosoom veranderen, de translatie veranderen (door de binding of functie van de transcriptiefactor te veranderen), kan de nucleaire shuttle veranderen ( door modificaties aan het kernporiecomplex te beïnvloeden), kan de RNA-stabiliteit veranderen (door al dan niet te binden aan het RNA om de stabiliteit ervan te reguleren), kan de translatie wijzigen (verhogen of verlagen), of kan post-translationele modificaties veranderen (toevoegen of verwijderen van fosfaten of andere chemische modificaties).

    De toevoeging van een ubiquitinegroep aan een eiwit markeert dat eiwit voor afbraak. Ubiquitine werkt als een vlag die aangeeft dat de eiwitlevensduur compleet is. Deze eiwitten worden verplaatst naar het proteasoom, een organel dat functioneert om eiwitten te verwijderen, om te worden afgebroken (Figuur). Een manier om genexpressie te beheersen, is daarom om de levensduur van het eiwit te veranderen.

    Eiwitten met ubiquitine-tags zijn gemarkeerd voor afbraak in het proteasoom.


    Resultaten

    Expressie van het protease SLVPE3 neemt gestaag toe tijdens het rijpen van fruit

    Het tomatengenoom codeert voor meer dan 900 voorspelde proteasen van verschillende katalytische klassen, gebaseerd op de MEROPS-proteasedatabase [26], maar in deze studie hebben we ons gericht op cysteïneproteasen, een klasse waarvan is aangetoond dat deze deelneemt aan een verscheidenheid aan biologische processen [ 27]. Een totaal van 167 niet-redundante cysteïneproteasen, behorend tot 19 families, werden geïdentificeerd uit het tomatengenoom met behulp van de MEROPS-database (aanvullend bestand 1: tabel S1). Expressie-analyse van de overeenkomstige genen met behulp van kwantitatieve reverse transcriptase PCR (RT-PCR) (aanvullend bestand 2: tabel S2) en hiërarchische clusteranalyse [31] onthulde verschillende genen waarvan de transcriptniveaus toenamen tijdens het rijpen van fruit (Fig. 1a). Degenen waarvan de expressie meer dan tien keer toenam, worden getoond in Fig. 1a, b. Hiervan codeerden er twee voor VPE's, een klasse van eiwitten die oorspronkelijk werden geïdentificeerd als cysteïneproteasen die verantwoordelijk zijn voor de rijping van zaadopslageiwitten [32]. Later werd gemeld dat ze de plant-functionele orthologen zijn van dierlijke caspases, die essentieel zijn voor de initiatie en uitvoering van PCD [29, 33, 34]. Bovendien zijn de transcriptniveaus van a VPE gen van Citrus sinensis Er is waargenomen dat ze toenemen tijdens het rijpen van fruit [35], wat, samen met onze resultaten, suggereert dat VPE-eiwitten kunnen bijdragen aan de rijping in een reeks soorten.

    Expressie-analyses van cysteïne-proteasen van tomaten onthullen de betrokkenheid van SLVPE3 bij fruitrijping. een Expressieprofielen van tomatencysteïneprotease-genen tijdens het rijpen van fruit, zoals bepaald met kwantitatieve RT-PCR. De ACTIN gen werd gebruikt als de interne controle. De geanalyseerde stadia van fruitontwikkeling waren volwassen groen (MG), breker (Br), Oranje (Of), en rood rijp (RR). Expressieverhoudingen werden berekend met behulp van de vroegste fase (MG) als de noemer en uitgezet in een hittekaart op een log2 schaal. Elke rij in de kleurenhittekaart vertegenwoordigt een enkel cysteïneproteasegen. De groente en rode kleuren geven respectievelijk neerwaartse en opwaartse regulatie aan bij een aangegeven rijpingsstadium ten opzichte van het MG-stadium. zwart geeft aan dat er geen significante verandering in expressie is. Gegevens van biologisch herhaalde monsters worden gemiddeld en de gedetailleerde informatie wordt vermeld in Aanvullend bestand 2: Tabel S2. De genen waarvan de mRNA-niveaus meer dan vertienvoudigd zijn, worden getoond. B Genidentificaties (Solyc-nummers) en functionele annotaties van de cysteïneproteasegenen waarvan de mRNA-niveaus meer dan tien keer stegen tijdens het rijpen van tomatenfruit, zoals onthuld door kwantitatieve RT-PCR. C Fylogenetische analyse van vacuolaire proteasen van planten. De fylogenetische boom werd geproduceerd met MEGA-versie 5.2. Bootstrap-waarden van 1000 replicaties voor elke vertakking worden weergegeven. Tomateneiwitten zijn aangegeven in rood. Soortnamen worden als volgt afgekort: St, Solanum tuberosum sl, S. lycopersicum nee, Nicotiana tabacum Ca, Capsicum annuum Gm, Glycine max Cs, Citrus sinensis Zm, Zea mays Bij, Arabidopsis thaliana vv, Vitis vinifera os, Oryza sativa. De toetredingsnummers zijn aangegeven in haakjes. NS genexpressie van SLVPE3 in vegetatieve en reproductieve tomatenorganen zoals bepaald door kwantitatieve RT-PCR. De ACTIN gen werd gebruikt als een interne controle. Waarden zijn gemiddelden ± standaarddeviatie van drie onafhankelijke experimenten

    Volgens de MEROPS-proteasedatabase heeft het tomatengenoom 14 VPE genen, waarvan er vijf eerder zijn geïdentificeerd en benoemd SLVPE1 tot SlVPE5 [36]. We noemden de andere negen VPE genen SlVPE6 tot SLVPE14 op basis van hun chromosomale locatie (Aanvullend bestand 3: Tabel S3). Van al deze VPE-eiwitten wordt voorspeld dat ze twee geconserveerde cysteïne-residuen op de actieve plaatsen bevatten (aanvullend bestand 4: figuur S1). Fylogenetische analyse onthulde dat VPE-eiwitten van tomaten kunnen worden onderverdeeld in verschillende subgroepen, met >50% bootstrap-ondersteuning (Fig. 1c), en er werd een hoge sequentieovereenkomst tussen de eiwitten waargenomen (Aanvullend bestand 5: Tabel S4), wat duidt op genduplicaties. Wij selecteerden SLVPE3 voor functionele analyse omdat de expressie ervan niet alleen hoger was in fruit dan in andere organen, zoals wortel, stengel en blad, maar ook geleidelijk toenam tijdens het rijpen van fruit (figuur 1d). SLVPE3 is aangetoond dat het betrokken is bij het beheersen van suikeraccumulatie [36], maar de functie ervan bij het rijpen van fruit en de onderliggende moleculaire mechanismen zijn onduidelijk.

    SLVPE3 is vereist voor het rijpen van tomatenfruit

    Om inzicht te krijgen in de functie van SLVPE3, we hebben een gegenereerd SLVPE3 RNAi-construct onder de controle van een 35S-promoter van het bloemkoolmozaïekvirus en transformeerde het in de wildtype tomatencultivar Ailsa Craig. Drie onafhankelijke transgene lijnen (3-4, 3-12 en 3-15) met bevestigde transgenintegratie vertoonden verschillende en vergelijkbare aan rijping gerelateerde fenotypen (Fig. 2a). De verschillen in fruitrijping tussen de SLVPE3 RNAi-lijnen en wildtype werden 38 dagen na anthesis (dpa) duidelijk. In dit stadium kon een zichtbare kleurverandering worden waargenomen in het wildtype fruit, terwijl: SLVPE3 RNAi-tomaten waren nog groen. Bij 41 dpa had het wildtype fruit een homogene oranje kleur, terwijl fruit uit de SLVPE3 RNAi-lijnen begonnen nog maar net van kleur te veranderen. Om de specifieke onderdrukking van SLVPE3 in de RNAi-lijnen werd totaal RNA geëxtraheerd uit fruit en bladeren van wildtype en transgene lijnen en onderworpen aan kwantitatieve RT-PCR-analyse. De transcriptniveaus van SLVPE3 bleken sterk verminderd te zijn in beide organen van transgene lijnen in vergelijking met het wildtype (Fig. 2b, c). Zestien potentiële off-targets voor het RNAi-construct werden geïdentificeerd (aanvullend bestand 4: figuur S2) met behulp van de rekentool pssRNAit [37]. Kwantitatieve RT-PCR-analyse gaf echter aan dat geen van deze verminderde expressie vertoonde in bladeren van de SLVPE3 RNAi-lijnen (aanvullend bestand 4: figuur S2). Dit resultaat gaf aan dat het RNAi-construct specifiek was voor het doelgen. We hebben ook de uitdrukking van gemeten SlVPE5 omdat het het meest verwante tomatengen is aan SLVPE3 (Fig. 1c). de niveaus van SlVPE5 mRNA in alle drie de RNAi-lijnen (3-4, 3-12 en 3-15) was niet significant verschillend van wildtype (Fig. 2b, c), wat de specificiteit van de SLVPE3 RNAi-construct voor het doelgen. De drie lijnen (3-4, 3-12 en 3-15) werden geselecteerd voor verdere analyse.

    SLVPE3 is noodzakelijk voor de normale rijping van tomatenfruit. een Rijpingsfenotype van SLVPE3 RNAi-lijnen. Fruit op 35, 38, 41 en 44 dagen na de bloei (dpa) van wildtype (WT) en SLVPE3 RNAi-lijnen (3-4, 3-12 en 3-15) worden getoond. B Uitdrukking van SLVPE3 en SlVPE5 in vrucht van WT en SLVPE3 RNAi-lijnen zoals bepaald met kwantitatieve RT-PCR. C Uitdrukking van SLVPE3 en SlVPE5 in bladeren van WT en SLVPE3 RNAi-lijnen. In B en C, werden de gentranscriptniveaus genormaliseerd tegen de ACTIN gen, gevolgd door normalisatie tegen WT-expressie. Waarden worden weergegeven als de gemiddelden ± standaarddeviatie (SD). sterretjes wijzen op P waarde <0.05 (t-test) bij het vergelijken van waarden voor elke meting tussen de SLVPE3 RNAi-lijnen en WT-planten. NS Lycopeenaccumulatie in WT en SLVPE3 RNAi fruit tijdens het rijpen. e Ethyleengeneratie in WT en SLVPE3 RNAi-fruit bij 38 en 41 dpa. In NS en e, waarden worden weergegeven als de gemiddelden ± SD. sterretjes significante verschillen aangeven (P < 0,05 t-test) tussen WT en SLVPE3 RNAi-fruit in een aangegeven rijpingsstadium. F Uitdrukking van SLVPE3 in WT-fruit (35 dpa) 6 of 12 uur na onbehandeld of behandeld met ethefon, zoals bepaald met kwantitatieve RT-PCR. Gentranscriptniveaus werden genormaliseerd tegen expressie van de ACTIN gen, gevolgd door normalisatie tegen expressie in de WT zonder behandeling met ethefon. Waarden worden weergegeven als de gemiddelden ± SD. sterretjes significante verschillen aangeven (P < 0,05 t-test) op een aangegeven tijdstip na de behandeling

    De kleurverandering van rijpende tomaten van groen naar rood is grotendeels te wijten aan de afbraak van chlorofyl en de ophoping van lycopeen, dat 70-90% van de totale carotenoïden in de meeste tomatenvariëteiten uitmaakt [38, 39]. Vaststellen van de onderliggende oorzaken van de waargenomen kleurverschillen tussen wildtype en SLVPE3 RNAi rijp fruit hebben we de niveaus van lycopeen gemeten. Zoals getoond in Fig. 2d, niveaus van lycopeen in fruit uit de SLVPE3 RNAi-lijnen waren <10% van wildtype-niveaus bij 38 dpa, wat suggereert dat: SLVPE3 expressie beïnvloedt de accumulatie van lycopeen tijdens het rijpen van fruit.

    Zoals met alle climacterische vruchten, hebben die van tomaat een toename van de ethyleenbiosynthese nodig om te rijpen [4]. We onderzochten of de vertraging in fruitrijping in de SLVPE3 RNAi-lijnen correleerden met de productie van ethyleen. Er werd waargenomen dat fruit van de onderdrukte lijnen (3-4, 3-12 en 3-15) minder ethyleen produceerde dan wildtype fruit in dezelfde rijpingsstadia (figuur 2e). Ethyleen reguleert de expressie van veel genen die verband houden met fruitrijping [40] en we hebben waargenomen dat de expressie van SLVPE3 verhoogd tijdens het rijpen van tomatenfruit (Fig. 1d). Om te bepalen of de verhoogde expressie van SLVPE3 was ethyleenafhankelijk, wildtype fruit bij 35 dpa werd behandeld met de ethyleenprecursor ethefon, wat resulteerde in een aanzienlijke toename in expressie (figuur 2f). Alles bij elkaar genomen suggereren deze resultaten dat ethyleen de expressie van induceert SLVPE3, die op zijn beurt de ethyleensynthese in tomatenfruit reguleert door een positieve feedbacklus.

    Ziekteresistentie is aangetast in SLVPE3 tot zwijgen gebracht fruit

    Fruitrijping omvat de regulatie van talrijke biochemische routes die verband houden met pigmentatie, celwandmetabolisme en de productie van aromatische en uit voedingsoogpunt belangrijke verbindingen [13]. Bovendien wordt rijping gekenmerkt door een grote toename van de gevoeligheid voor necrotrofe pathogenen [3, 30]. sinds repressie van SLVPE3 resulteerde in een vertraging in de fruitrijping, onderzochten we of fruit uit de SLVPE3 RNAi-lijnen waren ook minder vatbaar voor infectie met pathogenen. Fruit op 35 en 44 dpa werd ingeënt met B. cinerea, een commercieel belangrijke ziekteverwekker na de oogst van tomaten die grijze schimmelziekte veroorzaakt [30]. Zoals getoond in Fig. 3a, traden symptomen van zachtrot op op de derde dag na inoculatie in de vrucht van zowel wildtype als de SLVPE3 RNAi-lijnen (3-4, 3-12 en 3-15) bij 35 dpa. Een ongeveer tweevoudige toename van de ontwikkeling van laesies werd waargenomen in SLVPE3 RNAi-fruit vergeleken met het wildtype. Schimmelgroei, beoordeeld op basis van de kwantitatieve PCR-amplificatie van B. filmgebied ACTIN 2 (BC1G_08198), was significant groter in de SLVPE3 RNAi-fruit (figuur 3b). Daarentegen was weefselrot zichtbaar op de tweede dag na inoculatie in wildtype en SLVPE3 RNAi-fruit bij 44 dpa. Evenzo werd een significante toename van de ernst van de ziekte en schimmelgroei waargenomen in de SLVPE3 RNAi-fruit (Fig. 3c, d). Deze gegevens gaven aan dat silencing SLVPE3 expressie maakt de vrucht vatbaarder voor infectie met pathogenen, ook al was de rijping van het fruit vertraagd. Omdat deze bevinding contra-intuïtief was en in tegenspraak met eerdere waarnemingen dat onrijp fruit gewoonlijk minder vatbaar is voor infectie dan rijp fruit [3, 30], veronderstelden we dat SlVPE3 zich kan richten op stroomafwaartse eiwitten die geassocieerd zijn met pathogeenresistentie in tomatenfruit.

    Onderdrukken SLVPE3 verhoogt de gevoeligheid van tomatenfruit voor B. cinerea. een Ernst van de ziekte voor fruit ingeënt met B. cinerea op 35 dagen na de anthesis (dpa). Representatief fruit 3 dagen na inoculatie (dpi) voor wildtype (WT) en SLVPE3 RNAi-lijnen (3-4, 3-12 en 3-15) worden getoond. B Schimmelgroei tijdens infectie van tomatenfruit bij 35 dpa. Groei van B. cinerea bij 3 dpi in geïnfecteerd WT en SLVPE3 RNAi-fruit werd gemeten op basis van expressieniveaus van B. cinerea ACTIN 2 ten opzichte van tomaat ACTIN gen. C Ernst van de ziekte bij fruit dat is ingeënt met B. cinerea bij 44 dpa. Representatief fruit op 3 dpi voor WT en SLVPE3 RNAi-lijnen (3-4, 3-12 en 3-15) worden getoond. NS Schimmelgroei tijdens infectie van tomatenfruit bij 44 dpa. Groei van B. cinerea bij 3 dpi in geïnfecteerd WT en SLVPE3 RNAi-fruit werd gemeten op basis van kwantitatieve PCR-amplificatie van B. cinerea ACTIN 2 ten opzichte van tomaat ACTIN gen. Waarden worden weergegeven als de gemiddelden ± standaarddeviatie. sterretjes significante verschillen aangeven (P < 0,05 t-test) tussen WT en SLVPE3 RNAi-fruit op een bepaald tijdstip na inoculatie

    Kwantitatieve proteoomanalyse identificeert eiwitten die zich differentieel ophopen op SLVPE3 tot zwijgen brengen

    Protease-doelidentificatie is essentieel om het moleculaire mechanisme te begrijpen waarmee het biologische processen reguleert. Een op iTRAQ gebaseerde kwantitatieve proteomische benadering werd gebruikt om de eiwitten te identificeren die zich differentieel ophopen SLVPE3 tot zwijgen brengen. Het algemene ontwerp van het experiment en de experimentele workflow wordt getoond in figuur 4a. Eiwitten werden geïsoleerd uit SLVPE3 RNAi-fruit (T1-generatie) en wildtype fruit bij 41 en 44 dpa en gelabeld met 4-plex iTRAQ-reagentia. Het iTRAQ-experiment werd herhaald met een onafhankelijk biologisch replicaat. Voor elk replicaat werd vruchtwandweefsel van fruit van vijf planten samengevoegd om rekening te houden met variatie tussen individuen. De ... gebruiken S. lycopersicum eiwitdatabase ITAG2.4_proteins_full_desc.fasta werden in totaal 3802 en 3840 eiwitten geïdentificeerd in respectievelijk biologische replica's 1 en 2, met een globale false discovery rate (FDR) van <1% in beide. Een tweevoudige afkapwaarde werd vervolgens gebruikt als een determinant om te bepalen of de veranderingen in eiwitovervloed significant waren. De niveaus van 314 eiwitten waren significant verschillend in de SLVPE3 RNAi-fruit vergeleken met die van het wildtype in één rijpingsstadium of beide. Aanvullend bestand 6: Tabel S5 somt deze eiwitten op, samen met de bijbehorende identificatie-informatie en de verhouding van iTRAQ-reporterionintensiteiten. Om de eiwitten met vergelijkbare expressieprofielen te identificeren, werd hiërarchische clustering [31] toegepast en werden de 314 eiwitten verdeeld in twee hoofdclusters, die die met een hogere of lagere abundantie in de SLVPE3 RNAi-fruit dan in wildtype (Fig. 4b). De Blast2go [41] webgebaseerde bio-informatische tool, die eiwitten categoriseert op basis van hun Gene Ontology-annotaties, classificeerde de eiwitten in 15 functionele categorieën (Fig. 4c). De functionele klassen "celwandorganisatie of biogenese", "fotosynthese" en "pigmentmetabolisme" bevatten het grootste aantal eiwitten in beide rijpingsstadia (41 en 44 dpa).

    Kwantitatieve proteoomanalyse onthult de potentiële doelen van SlVPE3. een Workflow van de kwantitatieve proteoomanalyse. Eiwitten werden geïsoleerd uit wildtype (WT) en SLVPE3 RNAi-fruit op 41 of 44 dagen na de anthesis (dpa), en onderworpen aan isobare tags voor relatieve en absolute kwantificering (iTRAQ) labeling gekoppeld aan nanoLC-MS/MS. B In totaal 314 eiwitten die differentiële expressie vertonen in de SLVPE3 RNAi-vruchten in vergelijking met de WT werden geïdentificeerd. De expressiepatronen van de eiwitten werden hiërarchisch geclusterd op basis van de expressieverhouding als een log2 schaal. Elke rij in de kleurenhittekaart vertegenwoordigt een enkel eiwit. De groente en rode kleuren geven respectievelijk neerwaartse en opwaartse regulering aan in de SLVPE3 RNAi-fruit ten opzichte van de WT. zwart vertegenwoordigt geen significante expressieverandering. Waarden van biologische replica's werden gemiddeld en de gedetailleerde informatie die is gekoppeld aan de geïdentificeerde eiwitten wordt vermeld in aanvullend bestand 6: tabel S5. C Functionele categorieën van de eiwitten die de overvloed in de SLVPE3 RNAi-fruit bij 41 of 44 dpa vergeleken met WT

    SlVPE3 moduleert de accumulatie van eiwitten die verband houden met fruitrijping en ziekteresistentie

    De eiwitten geassocieerd met fruitrijping die significante verschillen in overvloed vertoonden in de SLVPE3 RNAi-fruit in vergelijking met wildtype omvatte enkele die betrokken zijn bij celwandafbraak, zoals polygalacturonase A (LePG, Solyc10g080210) ethyleensynthese, zoals 1-aminocyclopropaan-1-carboxylaatoxidase (ACO1, Solyc07g049530) aromavorming, zoals lipoxygenase (LoxC, Solyc01g006540) en carotenoïde biosynthese, zoals fytoeensynthase 1 (PSY1, Solyc03g031860) (Fig. 5a). De niveaus van de meeste van deze eiwitten waren lager in de SLVPE3 RNAi-fruit, consistent met het fenotype van vertraagde rijping. We identificeerden ook een reeks eiwitten die geassocieerd zijn met ziektereacties, zoals endochitinase (CHI9, Solyc10g055810), polygalacturonaseremmer-eiwit (PGIP, Solyc07g065090) en thaumatine (Solyc08g080650) (Fig. 5b), hoewel er onder de eiwitten voorbeelden waren met verlaagde of toegenomen overvloed in de SLVPE3 RNAi-vrucht. Opvallend is dat de lijst van differentieel overvloedige eiwitten de zure bèta-fructofuranosidase (AI, Solyc03g083910) omvatte, de tomatenortholoog van AtFruct4, dat een stroomafwaarts doelwit is van Arabidopsis thaliana VPEγ [29]. Dit benadrukte de waarde van kwantitatieve proteoomanalyse voor het identificeren van vermeende proteasedoelen. Opgemerkt moet worden dat we naast SlVPE3-targets ook andere eiwitten hebben geïdentificeerd die zich differentieel ophopen als gevolg van de vertraagde rijping.

    SLVPE3 RNAi-fruit vertoonde veranderde niveaus van eiwitten die verband houden met fruitrijping en ziekteresistentie. Eiwitten geïsoleerd uit wildtype (WT) en SLVPE3 RNAi-fruit werd onderworpen aan isobare tags voor relatieve en absolute kwantificering (iTRAQ) labeling gekoppeld aan nanoLC-MS/MS. De abundantieverhouding van eiwitten in de SLVPE3 RNAi-fruit versus WT op 41 dagen na anthesis (dpa) wordt getoond. Waarden vertegenwoordigen gemiddelden van twee biologische replica's, en foutbalken standaarddeviatie vertegenwoordigen. een Identificatie van eiwitten geassocieerd met fruitrijping in de iTRAQ-analyse. B Identificatie van eiwitten geassocieerd met ziekteresistentie in de iTRAQ-analyse. De gen-identifiers (Solyc-nummers) en de functionele annotaties zijn aangegeven. Gedetailleerde eiwitinformatie staat vermeld in Aanvullend bestand 6: Tabel S5

    SlVPE3 beïnvloedt indirect gentranscriptniveaus

    Een eerdere studie toonde aan dat SlVPE5 (voorheen LeCp genoemd), een paraloog van SlVPE3, kan fungeren als een transcriptiefactor [42]. Van LeCp werd gemeld dat het specifiek bindt aan de promotor van ACC-SYNTHASE 2 (ACS2), een sleutelgen in de biosynthese van ethyleen, en deze binding correleerde inductie van ACS2 in tomatenbladeren door de schimmelopwekker Ethyleen-inducerende xylanase (EIX) [42]. Om te bepalen of SLVPE3 als een transcriptiefactor fungeert, hebben we eerst onderzocht of de eiwitexpressiepatronen die werden waargenomen in de kwantitatieve proteomische analyse correleerden met verwante transcriptniveaus. Van de 15 genen die zijn geselecteerd voor kwantitatieve RT-PCR-analyse, was de expressie van 11, waaronder LoxC, ACO1, E 4, PSY1, CRTISO, en LePG, was consistent met de variaties in eiwitovervloed (Fig. 6). Next, we performed a chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay to investigate whether SlVPE3 could bind directly to the promoters of these genes. A search for the putative DNA binding site in the 2000-bp upstream regions starting from the translational start sites revealed that only five of the genes (LoxC, ACO3, PSY1, AI, en LePG) contained the putative TAAAATAT binding motif [42] (Additional file 7: Table S6). For the ChIP assay, the cross-linked DNA–protein complexes were immunoprecipitated using an affinity-purified polyclonal antibody raised against SlVPE3. Specific primers (Additional file 8: Table S7) were designed for the five genes (LoxC, ACO3, PSY1, AI, en LePG) to amplify promoter sequences surrounding the putative binding sites from the immunoprecipitated DNA. We were not able to detect any specific enrichment for the promoters of these genes (Fig. 7). We also did not observe an enrichment of the ACS2 promoter (Fig. 7), although it has been shown to be bound by LeCp [42]. These data suggest that SlVPE3 affects gene transcript levels indirectly and so SlVPE3 may function at the post-transcriptional level, rather than directly regulating gene expression as a transcription factor.

    Comparison of expression profiles at the protein and mRNA levels. The protein abundance in wild-type (WT) en SlVPE3 RNAi fruit at 41 and 44 days post-anthesis (dpa) was assessed by isobaric tags for relative and absolute quantification (iTRAQ)-based quantitative proteome analysis. Transcript abundance was evaluated by quantitative RT-PCR. The gene transcript levels are normalized against the ACTIN gene, followed by normalization against the expression in WT. Values are shown as the means ± standard deviation

    SlVPE3 does not bind to the promoters of genes with abnormal expression in SlVPE3 silenced fruit. For the ChIP assay, genomic DNA and proteins from pericarp of tomato fruit at 41 dpa were cross-linked, and the chromatin complexes were co-immunoprecipitated with anti-SlVPE3 antibodies. The promoter regions of the analyzed genes are indicated. Blue boxes represent the binding motifs and nummers indicate the position of these motifs relative to the translational start site. De green fragments with upper-case letters represent the regions used for ChIP-quantitative PCR. Values represent the percentage of DNA fragments that were co-immunoprecipitated with anti-SlVPE3 antibodies or preimmune serum (rabbit IgG) relative to the input DNA. Error bars represent the standard deviation of three independent experiments

    Screening for SlVPE3-interacting proteins

    To identify the direct targets of SlVPE3, we screened for SlVPE3-interacting proteins by analyzing proteins that were immunoprecipitated with affinity-purified anti-SlVPE3 polyclonal antibody or pre-immune serum IgG (non-specific antibody negative control) from 41-dpa wild-type fruit. The immunoprecipitated proteins were submitted to Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra (SWATH-MS) quantitative proteomic analysis [43], which measures quantitative changes in protein interactions [44]. This resulted in the identification of 355 proteins, of which 57 were also identified by the iTRAQ proteome analysis as showing significantly different abundance in SlVPE3 RNAi fruit compared with wild type (Additional file 9: Table S8). Most of the identified proteins had fold changes

    1 (Fig. 8a Additional file 9: Table S8), indicating proteins that were immunoprecipitated regardless of whether anti-SlVPE3 or IgG was used, and so these proteins were considered to be nonspecific contaminants. Proteins with significantly increased abundance (P < 0.01) by using anti-SlVPE3 compared with pre-immune serum IgG included a mitochondrial glycoprotein family protein (Solyc03g079930), a wound/stress protein (Solyc03g093360), and a Kunitz trypsin inhibitor 4 (Solyc11g022590) (Fig. 8a), and these were designated as SlVPE3-interacting proteins. The Kunitz trypsin inhibitor 4 (KTI4) exhibited a significant difference in protein expression levels in SlVPE3 RNAi fruit compared with wild type in the iTRAQ analysis (Fig. 8b), further suggesting that KTI4 might serve as a substrate of SlVPE3. Notably, SlVPE3 itself was not identified in the SWATH-MS analysis, which we hypothesized was due to the experimental conditions used for the elution of the immunoprecipitated proteins. Indeed, when we changed the conditions, SlVPE3 was identified as an immunoprecipitated protein (Additional file 4: Figure S3).

    Identification of endogenous SlVPE3-interacting proteins. een Proteins isolated from tomato fruit at 41 days post-anthesis (dpa) were immunoprecipitated with anti-SlVPE3 antibodies or pre-immune serum IgG (negative control). The enriched proteins were eluted and submitted to Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra (SWATH-MS) analysis. Elk circle represents a single protein. Most identified proteins showed no difference in abundance, indicating nonspecifically bound proteins. Three proteins (red circle) were identified as the SlVPE3-interacting proteins with significant increases in abundance (P < 0.01 t-test) by using anti-SlVPE3 antibodies compared with pre-immune serum IgG. Additional information related to protein identification is listed in Additional file 9: Table S8. B The changes in protein abundance in the SlVPE3 RNAi fruit revealed by isobaric tags for relative and absolute quantification (iTRAQ) analysis. The abundance ratios of selected proteins in the SlVPE3 RNAi fruit versus wild-type (WT) at 41 and 44 dpa are shown. Values represent means of two biological replicates, and error bars represent standard deviation. Asterisks indicate significant differences at a twofold cut-off between WT and SlVPE3 RNAi fruit

    We also performed a yeast two-hybrid (Y2H) screen to identify proteins that interact with SlVPE3 using the Matchmaker Library Construction and Screening Kits (Clontech). SlVPE3 was used as bait against a tomato cDNA library constructed from wild-type fruit at the breaker stage (38 dpa). A total of 179 positive colonies were analyzed, leading to the identification of 49 proteins (Additional file 10: Table S9) involved in various cellular processes. Notably, several proteins associated with proteolysis were identified, including KTI4, which was then targeted for further analysis.

    SlVPE3 protein interacts directly with KTI4 in vacuoles

    KTI4 belongs to the KTI family, members of which include serine protease inhibitors responsible for defense responses in leaves [45, 46]. However, little is known about the regulation of KTI genes and their functions in fruit disease resistance. To confirm the putative interaction between KTI4 and SlVPE3, we carried out a Y2H analysis. The open reading frame (ORF) of KTI4 and the cDNA fragment encoding the mature protein of SlVPE3 were cloned into the pGBKT7 (binding domain, BD) and pGADT7 (activation domain, AD) vectors, respectively. The resulting plasmids KTI4-BD and SlVPE3-AD were co-transformed into yeast, while yeast lines co-transformed with KTI4-BD and empty AD (KTI4-BD/AD) or SlVPE3-AD and empty BD (BD/SlVPE3-AD) were used as negative controls. KTI4-BD and SlVPE3-AD co-transformed yeast lines displayed normal growth and blue coloration when grown on the selective SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade (SD/-4) medium containing X-α-Gal, whereas the control lines did not grow (Fig. 9a), further indicating that KTI4 interacts with SlVPE3.

    SlVPE3 interacts with KTI4 in vacuoles. een Interactions between KTI4 and SlVPE3 in a Y2H analysis. The ORF of KTI4 and the cDNA fragment encoding the mature protein of SlVPE3 were cloned into the pGBKT7 (BD) and pGADT7 (AD) vectors, respectively, resulting in the KTI4-BD and SlVPE3-AD plasmids, which were co-transformed into yeast. As negative controls, KTI4-BD and AD or SlVPE3-AD and BD were co-transformed into yeast. The transformants were streaked on SD/-Leu/-Trp medium (SD/-2). Protein–protein interactions were assessed by examining growth on SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade medium (SD/-4) and further confirmed by monitoring β-galactosidase activity (blue coloration). B Subcellular localization of SlVPE3 and KTI4 visualized by monomeric rood fluorescent protein (mRFP) analysis. The constructs used for transformation are indicated (links): mRFP alone, control showing the signals throughout the cell except in the vacuolar lumen SlVPE3-mRFP, signals from the SlVPE3-mRFP fusion protein KTI4-mRFP, signals from the KTI4-mRFP fusion protein. Protoplasts of tobacco (Nicotiana benthamiana) leaves transiently expressing the mRFP-alone control, SlVPE3-mRFP, or KTI4-mRFP were isolated and observed under a Leica confocal microscope (Leica DMI600CS). C Subcellular colocalization of SlVPE3 and KTI4 determined using N. benthamiana leaf protoplasts co-expressing SlVPE3-mRFP and KTI4-PRpHluorin. The constructs used for transformation are indicated (links): mRFP + PRpHluorin, control showing the signals throughout the cell, except in the vacuolar lumen SlVPE3-mRFP + KTI4-PRpHluorin, signals from SlVPE3-mRFP and KTI4-PRpHluorin fusion proteins. Colocalization is shown by merging mRFP and PRpHluorin images (Merged). Scale bars, 25 μm

    To examine the intracellular localization of SlVPE3 and KTI4, their ORFs were separately introduced into a vector to generate a translational fusion with monomeric red fluorescent protein (mRFP) at the C-terminus. The constructs were separately introduced into Agrobacterium tumefaciens, which in turn was used to transform tobacco (Nicotiana benthamiana) leaves, from which mesophyll protoplasts were isolated. Protoplasts expressing mRFP alone served as a control. Confocal laser scanning microscopy showed that mRFP-tagged SlVPE3 (SlVPE3-mRFP) and KTI4 (KTI4-mRFP) both produced a strong signal in the vacuole, while the mRFP-only control displayed a fluorescent signal throughout the cell, but not from the vacuolar lumen (Fig. 9b). Notably, we were unable to detect the intracellular localization of SlVPE3 and KTI4 fused to green fluorescent protein (GFP) or mCherry, which might be due to degradation and/or protonation of GFP or mCherry under the acidic conditions that are found in vacuoles of higher plants [47].

    To confirm the colocalization of SlVPE3 and KTI4, their ORFs were fused to mRFP and PRpHluorin (plant-solubility-modified ratiometric pH-sensitive mutants of green fluorescent protein), respectively, and the fusion proteins were co-expressed in tobacco leaves. PRpHluorin, derived from GFP, is a fluorescent pH sensor that has been successfully used to characterize the localization of vacuolar proteins [48]. We observed that the fluorescent signals of mRFP co-localized with those of PRpHluorin, suggesting the subcelluar colocalization of SlVPE3 and KTI4 (Fig. 9c).

    SlVPE3 participates in the cleavage of KTI4

    Having demonstrated that SlVPE3 protein interacts and colocalizes with KTI4, we then raised polyclonal antibodies against KTI4 to test whether SlVPE3 participates in the processing of KTI4. Polyclonal antibodies were affinity-purified and immunoblot analysis indicated no immunoreactive bands in extracts from wild-type tomato fruit at 35 dpa when pre-immune serum was used (Additional file 4: Figure S4), but a signal was detected by the affinity purified anti-KTI4 antibodies corresponding to the size (25 kDa) of the predicted full-length KTI4 polypeptide (Fig. 10a, blue arrowhead). The affinity purified anti-KTI4 antibodies recognized two additional bands with lower molecular mass (Fig. 10a), suggesting that KTI4 undergoes cleavage to form smaller peptides. We observed that KTI4 protein levels were higher in fruit of the SlVPE3-silenced lines (3-4, 3-12, and 3-15) and in wild type when SlVPE3 levels were low, at 35 dpa (Fig. 10a). Conversely, the accumulation of KTI4 was reduced when SlVPE3 levels were high (Fig. 10a). These results are consistent with SlVPE3 being involved in KTI4 processing. Notably, the total abundance of KTI4 in SlVPE3 RNAi fruit appeared to be higher than in the wild type, which is consistent with the iTRAQ analysis showing that KTI4 abundance increased significantly after SlVPE3 was repressed. The changes in protein levels of KTI4 might reflect direct proteolytic processing of KTI4 by SlVPE3, or by the increase in KTI4 transcript levels (Fig. 6), or both.

    SlVPE3 is involved in KTI4 cleavage. een Immunoblot detection of KTI4 cleavage in tomato fruit. Total protein extracts from wild-type (WT) and SlVPE3 RNAi fruit (3-4, 3-12, and 3-15) at 35 and 38 days post-anthesis (dpa) were analyzed by immunoblot analysis using anti-KTI4 or anti-SlVPE3 antibodies. The predicted molecular mass of the full-length KTI4 is

    25 kDa, which is indicated by a blue arrowhead. B Determination of KTI4 cleavage in tobacco (N. benthamiana). Proteins were extracted from tobacco leaves expressing an empty vector (Vec), KTI4 alone (Vec + KTI4), SlVPE3 and KTI4 (SlVPE3 + KTI4), and mutated SlVPE3 and KTI4 (SlVPE3 C69G/C208G + KTI4) and subjected to immunoblot analysis with an anti-KTI4 antibody. The mutated form of SlVPE3 (SlVPE3 C69G/C208G ) was generated by site-directed mutagenesis. C Cell-free cleavage of His-tagged KTI4 proteins. His-KTI4 was expressed and purified from Escherichia coli and then incubated for 15 or 30 min at 20 °C with extracts of N. benthamiana expressing an empty vector (Vec), intact SlVPE3 (SlVPE3), or a mutated form of SlVPE3 (SlVPE3 C69G/C208G ). An incubation of His-KTI4 with extraction buffer served as the control. The VPE inhibitor (biotin-YVAD-fmk) was applied to determine whether the His-KTI4 was directly cleaved by SlVPE3. In eenC, equal loading was confirmed with an anti-actin antibody. Similar results were obtained from three independent experiments and results from a representative experiment are shown

    To verify that SlVPE3 cleaves KTI4, the SlVPE3 en KTI4 ORFs were transiently expressed in tobacco (N. benthamiana) leaves. As shown in Fig. 10b, a band of the predicted molecular mass of the full-length KTI4 (

    25 kDa) was generated by the anti-KTI4 antibodies, together with an additional faint band with a lower molecular mass. Wanneer SlVPE3 was co-expressed with KTI4 in tobacco, the abundance of the 25-kDa band decreased, concomitant with an increase in the intensity of the lower molecular mass band (Fig. 10b), suggesting that the 25-kDa band constitutes a precursor of the lower molecular mass band. Importantly, when KTI4 was co-expressed with a mutated form of SlVPE3 (SlVPE3 C69G/C208G ) in which conserved cysteine (C) residues (C69 and C208) from the active site were replaced by glycine (G), the changes in abundance of the two bands were abolished (Fig. 10b), indicating that SlVPE3 must be catalytically active for KTI4 to be cleaved.

    We subsequently examined the cleavage of KTI4 by SlVPE3 in vitro. The predicted mature SlVPE3 polypeptide and KTI4 without the signal peptide were independently expressed in Escherichia coli as fusion proteins with a His-tag. Substantial amounts of recombinant SlVPE3 protein were obtained but did not show VPE activity (data not shown). We also expressed SlVPE3 in Saccharomyces cerevisiae BY4741 and Pichia pastoris GS115 cells, but did not detect proteolytically active recombinant proteins (data not shown). We next investigated the cleavage of the His-tagged recombinant KTI4 proteins (His-KTI4) in cell-free extracts of tobacco expressing intact or mutated SlVPE3 (SlVPE3 C69G/C208G ). A 25-kDa band, in addition to a band with lower molecular mass, was detected by the anti-KTI4 antibodies when extracts of tobacco expressing the empty plasmid were incubated with His-KTI4 (Fig. 10c). Two additional bands were observed in extracts of tobacco expressing intact SlVPE3, suggesting the cleavage of KTI4 by SlVPE3 (Fig. 10c). Gradual processing of KTI4 was observed when the reaction time was prolonged. The processing could be blocked in extracts of tobacco expressing the mutated form of SlVPE3 (SlVPE3 C69G/C208G ), suggesting specific cleavage of KTI4 by SlVPE3. To determine whether KTI4 is directly cleaved by SlVPE3, biotin-YVAD-fmk [33], a VPE inhibitor that efficiently inhibits the activity of SlVPE3 (Additional file 4: Figure S5), was added to the reaction. Application of the inhibitor blocked KTI4 processing (Fig. 10c), further demonstrating that KTI4 is a direct target of SlVPE3.

    KTI4 does not inhibit the activity of SlVPE3

    As a protease inhibitor, KTI4 has the potential to block protease activity. KTIs are specific for serine proteases, and have specific inhibitory activity solely against trypsin proteases that cleave polypeptides after Lys or Arg [45]. Accordingly, it is unlikely that KTI4 inhibits the activity of VPE proteins, as they are cysteine proteases. However, to eliminate the possibility that KTI4 inhibits SlVPE3 activity, we transformed KTI4 en SlVPE3 into tobacco and measured VPE activity with a fluorescent substrate. A fluorescent signal (3.34 nmol min −1 mg −1 protein) representing VPE activity was detected in tobacco leaves transformed with an empty plasmid control (Fig. 11a), indicating that tobacco itself contains VPE activity. However, when tobacco was transformed with SlVPE3, higher VPE activity (4.7 times 15.6 nmol min −1 mg −1 protein) was detected, while tobacco expressing the mutated form of SlVPE3 (SlVPE3 C69G/C208G ) showed similar VPE activity to the empty vector control. The VPE activity was inhibited by the specific inhibitor biotin-YVAD-fmk. However, no significant differences in VPE activity were found in tobacco leaves co-expressing SlVPE3 en KTI4 compared with those expressing SlVPE3 alone (Fig. 11a), suggesting that KTI4 does not inhibit VPE activity.

    KTI4 does not inhibit SlVPE3 proteolytic activity. een Determination of vacuolar processing enzyme (VPE) activity in tobacco (N. benthamiana). Proteins were extracted from N. benthamiana leaves expressing an empty vector (Vec), SlVPE3 alone (SlVPE3 + Vec), SlVPE3 and KTI4 (SlVPE3 + KTI4), and mutated SlVPE3 (SlVPE3 C69G/C208G ) and subjected to a VPE activity assay with a VPE-specific fluorescent substrate. The mutated form of SlVPE3 (SlVPE3 C69G/C208G ) was generated by site-directed mutagenesis. The VPE inhibitor biotin-YVAD-fmk was added. Values are shown as the means ± standard deviation (SD). B The recombinant KTI4 protein from E coli showed inhibitory activity against trypsin. Soybean trypsin inhibitor was used as a positive control. Trypsin activity was measured with the Nα-benzoyl-L-arginine ethyl ester substrate. Error bars represent the SD of three independent experiments. C VPE activity assay with recombinant KTI4 protein (His-KTI4). Extracts from N. benthamiana expressing an empty vector (Vec), intact SlVPE3, or a mutated form of SlVPE3 (SlVPE3 C69G/C208G ) were incubated with recombinant KTI4 protein purified from E coli, and then subjected to a VPE activity assay. Values are shown as the means ± SD

    We also evaluated the effects of recombinant KTI4 proteins purified from E coli on VPE activity. The recombinant KTI4 proteins exhibited activity against trypsin (Fig. 11b), indicating that they were active serine protease inhibitors. The incubation of the KTI4 proteins with extracts from tobacco leaves expressing intact or mutated SlVPE3 (SlVPE3 C69G/C208G ) did not significantly affect VPE activity, although this activity was inhibited by the specific inhibitor biotin-YVAD-fmk (Fig. 11c).

    KTI4 contributes to resistance of fruit to pathogen infection

    To examine whether KTI4 provides fruit with resistance to pathogen infection, we performed a virus-induced gene silencing (VIGS) assay [49, 50]. EEN KTI4 cDNA fragment was inserted into the pTRV2 vector, which was subsequently infiltrated into tomato fruit at the immature green stage. Fruit infiltrated with pTRV2 alone (empty vector) were used as a control. Fourteen days after infiltration, the fruit were inoculated with B. cinerea and the symptoms were visually inspected daily. As shown in Fig. 12a, fruit infiltrated with pTRV2-KTI4 showed increased disease severity compared with fruit infiltrated with pTRV2 alone (control). Gene expression analysis indicated that the KTI4 mRNA levels were reduced by

    75% compared with the control (Fig. 12b).

    KTI4 influences disease resistance in tomato fruit. een Virus-induced gene silencing (VIGS) assay revealed that KTI4 affects disease resistance in tomato fruit. Immature green stage fruit were infiltrated with an empty vector control pTRV2 (EV) or pTRV2 containing a specific KTI4 sequence (pTRV2-KTI4). Fourteen days after infiltration, the fruit were inoculated with B. cinerea. Disease severity was observed daily after inoculation. B KTI4 gene expression after VIGS, as determined by quantitative RT-PCR. The gene transcript levels were normalized against expression of the ACTIN gene, followed by normalization against the control. Values are shown as the means ± standard deviation. Asterisks indicate significant differences (P < 0.05 t-test) between fruit infiltrated with pTRV2 (EV) and pTRV2-KTI4

    SlVPE3 is regulated by the RIN transcription factor

    The activity of proteases needs to be tightly regulated due to their critical roles in diverse of biological processes. VPEs have been shown to be self-catalytically activated by sequential removal of C-terminal and N-terminal propeptides [51–53]. SlVPE3 shows a similar expression pattern to the transcription factor RIPENING INHIBITOR (RIN), a global regulator of tomato fruit ripening [1, 9]. Quantitative RT-PCR analysis indicated that the expression of SlVPE3 was decreased in fruit of the rin mutant tomato compared with wild type (Fig. 13a). To investigate whether RIN regulates the expression of SlVPE3 by directly binding to its promoter in vivo, a ChIP assay was performed. Using PlantCARE [54], two CArG-box elements, which are typical binding sites for RIN [55], were identified in the promoter region of SlVPE3 (Additional file 11: Table S10). For the ChIP assay, cross-linked DNA–protein complexes were immunoprecipitated with affinity-purified anti-RIN polyclonal antisera. The promoter sequences surrounding the CArG-box binding sites were amplified from the immunoprecipitated DNA using specific primers designed for SlVPE3, indicating that RIN binds to the promoter of SlVPE3 in vivo (Fig. 13b). Binding of RIN to the promoter of ACS2 was used as a positive control.

    Regulation of SlVPE3 by the RIN transcription factor. een SlVPE3 expression in wild type (WT) and the rin mutant during fruit ripening, as determined by quantitative RT-PCR. The gene transcript levels were normalized against the ACTIN gene, followed by normalization against WT at 35 days post-anthesis (dpa). Values are shown as the means ± standard deviation (SD). Asterisks indicate significant differences (P < 0.05 t-test) between WT and the rin gemuteerd. B ChIP-quantitative PCR assays indicated that RIN directly binds to the promoter of SlVPE3. The promoter structure of SlVPE3 is shown. Blue boxes represent CArG box elements and nummers indicate the position of these motifs relative to the translational start site. Green fragments with upper-case letters represent the regions used for ChIP-quantitative PCR. Values are shown as the means ± SD. Asterisks indicate significant differences (P < 0.05 t-test) between samples co-immunoprecipitated with anti-RIN antibodies and pre-immune serum. C Gel mobility shift assays revealed the direct binding of RIN to the CArG box element in the promoter region of SlVPE3. The probe sequences corresponding to the SlVPE3 promoter are shown, with red letters representing the CArG box. The mutated bases in the probes are represented by blue letters. wt, probe with intact CArG box element mt, probe with mutated CArG box element. One thousand-fold excess amounts of unlabeled probes were added to the binding reaction as a competitor. The specific complexes formed are indicated by arrowheads

    We also performed an electrophoretic mobility shift assay (EMSA) with the purified recombinant RIN protein. A band shift was observed when the purified RIN protein was mixed with the biotin-labeled probe (26-mer oligonucleotide) containing the CArG-box element. Binding of the RIN protein to the promoter fragment was out-competed by addition of an excessive amount of the corresponding unlabeled probe (competitor) containing an intact CArG box element, but not by the probe with a mutated CArG box element (Fig. 13c). This confirmed direct binding of RIN to the SlVPE3 promoter.


    Achtergrond

    The subject for much discussion has been why Aspergillus niger produces organic acids in the amounts of which it is capable of. Indien A. niger is grown in an unbuffered medium, it will fairly quickly acidify the medium to a pH below 2. Production processes with cultivation of A. niger can convert as much as 95% of the available carbon to organic acids, making it a viable process for producing bulk chemicals [1]. The evolutionary strategy behind this trait remains obscure, but one of several hypotheses suggests that the secretion of acids helps degrade the plant cell walls on which the saprotrophic fungus thrives, that it slows the growth of competing organisms, and that the organic acids chelate sparse trace metals and make them available to the fungus [2].

    The production of organic acids by A. niger has been shown in several studies to be dependent on ambient pH. Oxalic acid production is most efficient at pH 5 to 8 and is completely absent below pH 3.0 [3]. Gluconic acid production is optimal at pH 5.5, but it is found at all levels of pH from 2 through 8 [4, 5]. Citric acid production begins at pH 3.0 and is optimal just below pH 2.0 [1, 6]. This suggests that an evolutionary process has selected for production of a given acid at different pH values. In this context, the work of Ruijter et al. [3] is interesting. They showed that a mutant strain of A. niger, deficient in producing gluconic acid and oxalic acid, produces citric acid at an optimum pH of 5 and without the demand for an Mn 2+ -deficient medium, which is normally essential for the production of citric acid. This suggests that the aforementioned evolution of acid production has resulted in a sophisticated system of preferred acids as a function of ambient pH, which even ensures that another acid is produced when conditions are unfavorable for production of the preferred acid. To improve our understanding of these systemic behaviors, we have adopted a genome-scale-based strategy founded on the integration of multiple types of genome-wide data ('omics'), particularly genome-scale modeling, functional genomics, and transcriptomics.

    This approach allowed us to formulate the hypothesis that A. niger strives to produce - at a given pH - the organic acid that most efficiently acidifies the medium. To test this hypothesis, the model of A. niger metabolism presented by Andersen et al. [7] was expanded with reactions describing the average number of protons released from one mole of a given acid at a given pH, based on acid disassociation constants (Figure 1). This allows the use of mathematical optimization principles coupled with the knowledge of metabolic pathways, and thereby computationally determining the most efficient way of producing protons to acidify the surrounding medium as a function of pH. If these computations are in agreement with the pH dependencies of the organic acids described earlier, it will be strong evidence that A. niger is evolutionally optimized for acidifying its environment.

    Protons per molecule of the original un-disassociated acid as a function of pH.

    The response to ambient pH is relevant not only in the context of organic acid production. Aspergillus niger is an expression system for both homologous and heterologous proteins, and the expression of yield-lowering proteases has been shown to be dependent on pH [8]. Additionally, whereas processes with A. niger have until now been considered safe for food-grade enzyme production, a recent analysis of the A. niger genome [9] suggested that it may be capable of producing the carcinogenic compound fumonisin B2, which was confirmed by Frisvad et al. [10]. The carcinogen ochratoxin A has also been known to be produced by A. niger under certain culturing conditions [11, 12]. Secondary metabolite production, such as penicillin from Aspergillus nidulans, has in some cases been shown to be dependent on pH [13]. Therefore, to expand on the results of the model-driven investigation of the organic acid response to pH, a physiological characterization and transcriptome analysis of triplicate cultivations at pH 2.5, 4.5, and 6.0 was made to provide a systems-wide insight into the transcriptional response to ambient pH. This allowed the identification of several genes involved in the production of organic acids reacting directly and in a coordinated manner to ambient pH.

    Gezien het feit dat A. niger can grow stably at pH values ranging from below 2 to above 8 [14], it is reasonable to expect sophisticated transcriptional regulation. To use this, putative pH-dependent cis-acting regulatory motifs were identified. With genetic engineering of promoter regions, this may be applied to induce the production of a given gene product at the pH of the process. Another analysis was on the production of organic acids as well as identification of secondary metabolite clusters responding to pH. Furthermore, the pacC/palABCFHI system, a conserved fungal signal-transduction and transcriptional-regulation system, described in detail for A. nidulans and partially conserved in Saccharomyces cerevisiae [15, 16], was examined, and likely orthologues were found and confirmed to have similar transcriptomic profiles in A. niger.


    Eukaryotic Translational and Post-translational Gene Regulation

    After the RNA has been transported to the cytoplasm, it is translated into protein. Controle van dit proces is grotendeels afhankelijk van het RNA-molecuul. Zoals eerder besproken, zal de stabiliteit van het RNA een grote invloed hebben op de translatie ervan in een eiwit. Naarmate de stabiliteit verandert, verandert ook de hoeveelheid tijd die beschikbaar is voor vertaling.

    The Initiation Complex and Translation Rate

    Like transcription, translation is controlled by proteins that bind and initiate the process. In translation, the complex that assembles to start the process is referred to as the initiation complex. The first protein to bind to the RNA to initiate translation is the eukaryotic initiation factor-2 (eIF-2). The eIF-2 protein is active when it binds to the high-energy molecule guanosine triphosphate (GTP). GTP provides the energy to start the reaction by giving up a phosphate and becoming guanosine diphosphate (GDP). The eIF-2 protein bound to GTP binds to the small 40S ribosomal subunit. When bound, the methionine initiator tRNA associates with the eIF-2/40S ribosome complex, bringing along with it the mRNA to be translated. At this point, when the initiator complex is assembled, the GTP is converted into GDP and energy is released. The phosphate and the eIF-2 protein are released from the complex and the large 60S ribosomal subunit binds to translate the RNA. The binding of eIF-2 to the RNA is controlled by phosphorylation. If eIF-2 is phosphorylated, it undergoes a conformational change and cannot bind to GTP. Therefore, the initiation complex cannot form properly and translation is impeded ([link]). When eIF-2 remains unphosphorylated, it binds the RNA and actively translates the protein.

    Een verhoging van de fosforylering van eIF-2 is waargenomen bij patiënten met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, Parkinson en Huntington. Welke impact denkt u dat dit kan hebben op de eiwitsynthese?

    Chemische modificaties, eiwitactiviteit en levensduur

    Proteins can be chemically modified with the addition of groups including methyl, phosphate, acetyl, and ubiquitin groups. The addition or removal of these groups from proteins regulates their activity or the length of time they exist in the cell. Soms kunnen deze modificaties regelen waar een eiwit in de cel wordt gevonden, bijvoorbeeld in de kern, het cytoplasma of gehecht aan het plasmamembraan.

    Chemical modifications occur in response to external stimuli such as stress, the lack of nutrients, heat, or ultraviolet light exposure. These changes can alter epigenetic accessibility, transcription, mRNA stability, or translation—all resulting in changes in expression of various genes. This is an efficient way for the cell to rapidly change the levels of specific proteins in response to the environment. Because proteins are involved in every stage of gene regulation, the phosphorylation of a protein (depending on the protein that is modified) can alter accessibility to the chromosome, can alter translation (by altering transcription factor binding or function), can change nuclear shuttling (by influencing modifications to the nuclear pore complex), can alter RNA stability (by binding or not binding to the RNA to regulate its stability), can modify translation (increase or decrease), or can change post-translational modifications (add or remove phosphates or other chemical modifications).

    The addition of an ubiquitin group to a protein marks that protein for degradation. Ubiquitin acts like a flag indicating that the protein lifespan is complete. These proteins are moved to the proteasome, an organelle that functions to remove proteins, to be degraded ([link]). One way to control gene expression, therefore, is to alter the longevity of the protein.

    Sectie Samenvatting

    Changing the status of the RNA or the protein itself can affect the amount of protein, the function of the protein, or how long it is found in the cell. To translate the protein, a protein initiator complex must assemble on the RNA. Modifications (such as phosphorylation) of proteins in this complex can prevent proper translation from occurring. Once a protein has been synthesized, it can be modified (phosphorylated, acetylated, methylated, or ubiquitinated). These post-translational modifications can greatly impact the stability, degradation, or function of the protein.

    Kunstverbindingen

    [link] An increase in phosphorylation levels of eIF-2 has been observed in patients with neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, and Huntington’s. Welke impact denkt u dat dit kan hebben op de eiwitsynthese?

    [link] Protein synthesis would be inhibited.

    Beoordelingsvragen

    Post-translational modifications of proteins can affect which of the following?

    1. protein function
    2. transcriptional regulation
    3. chromatin modification
    4. alle bovenstaande

    Gratis antwoord

    Protein modification can alter gene expression in many ways. Describe how phosphorylation of proteins can alter gene expression.

    Because proteins are involved in every stage of gene regulation, phosphorylation of a protein (depending on the protein that is modified) can alter accessibility to the chromosome, can alter translation (by altering the transcription factor binding or function), can change nuclear shuttling (by influencing modifications to the nuclear pore complex), can alter RNA stability (by binding or not binding to the RNA to regulate its stability), can modify translation (increase or decrease), or can change post-translational modifications (add or remove phosphates or other chemical modifications).

    Alternative forms of a protein can be beneficial or harmful to a cell. What do you think would happen if too much of an alternative protein bound to the 3’ UTR of an RNA and caused it to degrade?

    If the RNA degraded, then less of the protein that the RNA encodes would be translated. This could have dramatic implications for the cell.

    Changes in epigenetic modifications alter the accessibility and transcription of DNA. Describe how environmental stimuli, such as ultraviolet light exposure, could modify gene expression.

    Environmental stimuli, like ultraviolet light exposure, can alter the modifications to the histone proteins or DNA. Such stimuli may change an actively transcribed gene into a silenced gene by removing acetyl groups from histone proteins or by adding methyl groups to DNA.

    Woordenlijst


    Bekijk de video: Post-transcriptional regulation. Biomolecules. MCAT. Khan Academy (December 2021).