Informatie

Is neurogenese essentieel voor leren?


Dus ik las dat onze hersenen elke dag 700 nieuwe neuronen in de hippocampus produceren en dat als we cognitieve veeleisende taken uitvoeren, omega-3 eten of sporten (andere dingen?) het nog meer neuronen kan produceren.

Wat gebeurt er met deze nieuwe neuronen? Stel dat ik nieuwe vaardigheden leer, welke rol spelen die nieuwe neuronen in het proces? Is het mogelijk om te leren zonder neurogenese?

Bewerking: Ik ben geïnteresseerd in dit onderwerp (bijvoorbeeld: hersenen, hippocampus, leren). Waar kan ik dit in de basis leren? Welke klassen leren dit op de universiteit?


Nee, neurogenese is niet nodig om te leren (ervan uitgaande dat je het hebt over neurogenese bij volwassenen: je moet natuurlijk ergens in ontwikkeling neuronen genereren om zelfs maar een zenuwstelsel te hebben).

Gemakkelijk de meest geaccepteerde theorie voor leren en geheugen is dat leren gebeurt door: veranderingen in de sterkte van synapsen, de verbindingen tussen cellen. De sterke punten van deze verbindingen worden ook vaak "synaptische gewichten" genoemd. De primaire mechanismen voor dit leren zijn potentiëring op de lange termijn en de gerelateerde plasticiteit van de piektijd, evenals het leidende principe van Hebbian-leren dat vaak wordt genoemd als "cellen die samen vuren, samen verbinden".

Kort gezegd beschrijft langetermijnpotentiëring of LTP de toename van postsynaptische receptoren die optreedt onder bepaalde omstandigheden: dit is wat de werkzaamheid of sterkte van bepaalde synapsen verhoogt. Een van de belangrijkste voorwaarden is dat LTP de neiging heeft om op te treden bij synapsen die oorzakelijk bijdragen aan het maken van de postsynaptische celvuur.

Neurogenese bij volwassenen komt voornamelijk voor in enkele gelokaliseerde hersengebieden (Zhao et al., 2008). Hoewel het mogelijk is dat er sprake is van neurogenese buiten deze gebieden, is dit niet afdoende aangetoond en zeker niet voldoende om nodig te zijn voor leren in een normaal, ongedeerd volwassen brein.

Neuronen geboren in de subventriculaire zone vervangen voortdurend reukreceptoren, die een relatief korte levensduur hebben, waarschijnlijk geëvolueerd door hun constante blootstelling aan allerlei potentieel schadelijke externe verbindingen die de neus binnenkomen. Deze cellen moeten wel een aantal "leer"-processen ondergaan om te integreren in bestaande netwerken, maar dat is niet wat je in de volksmond zou beschouwen als leren in het algemeen.

De beste kandidaten voor cellen die het leren tot op zekere hoogte beïnvloeden, zijn de nieuwe neuronen die worden geboren in de subgranulaire zone van de dentate gyrus in de hippocampus. De hippocampus is inderdaad een belangrijke structuur voor bepaalde vormen van leren, maar voor dit leren zijn geen nieuwe neuronen nodig. Hoewel het nog steeds enigszins onduidelijk is wat de rollen zijn van de nieuwe neuronen in de dentate gyrus, wordt aangenomen dat ze bijdragen aan de primaire rollen van de dentate gyrus, die moeten helpen onderscheid te maken tussen vergelijkbare activiteitspatronen (Deng et al., 2010), ook wel "patroonscheiding" genoemd.

Twee andere hypothesen zijn dat neurogenese bij volwassenen helpt om timinginformatie in herinneringen te coderen omdat de nieuwe neuronen alleen deelnemen aan nieuwe herinneringen, of dat ze de opname van nieuwe stimuli mogelijk maken zodra de oudere neuronen zijn geconditioneerd en alleen zijn afgestemd op stimuli die eerder zijn ervaren (Aimone, et al., 2013). Er is bewijs voor al deze hypothesen, maar geen ervan is overtuigend, en ze kunnen allemaal tot op zekere hoogte waar zijn.

Er zijn veel verschillende soorten leren en deze verschillende soorten leren kunnen voorkomen in verschillende hersengebieden, waarvan de meeste geen substantiële volwassen neurogenese vertonen. Vaak denken mensen aan associatief leren met operante of klassieke conditionering. Er is ook episodisch leren: het onthouden van gebeurtenissen die zijn gebeurd (dit is het type dat het meest geassocieerd is met de hippocampus, waar misschien neurogenese een rol speelt). Er is ook motorisch leren en verschillende soorten leren in sensorische systemen zoals gewenning of sensibilisatie. Daarom is het belangrijk om te begrijpen dat leren niet slechts één ding is, en hoewel de mechanismen met elkaar in verband kunnen worden gebracht, zijn ze niet altijd hetzelfde.

Hoe meer te leren: Ik kan je vertellen over cursussen bij instellingen waar ik aan verbonden ben geweest, maar deze kunnen natuurlijk per school verschillen. Leren en geheugen maken meestal op zijn minst deel uit van een niet-gegradueerde neurowetenschappencursus op systeemniveau, die vaak de tweede is van twee overzichtscursussen in de neurowetenschappen. De meest gebruikelijke tijd voor studenten om zo'n cursus te volgen, is als een tweede-semester-junior of een tweede-semester eerstejaars afgestudeerde student, omdat er vereiste kennis is op het gebied van natuurkunde, scheikunde, moleculaire biologie en fysiologie. Er zijn ook cursussen op graduaatniveau in de moleculaire mechanismen van leren en geheugen, en theoretische neurowetenschappelijke cursussen die de computationele overwegingen van leren en geheugen behandelen in plaats van alleen de biologische mechanismen. Dit soort cursussen is mogelijk ook beschikbaar voor een niet-gegradueerde op hoger niveau.

Natuurlijk kun je ook enkele van de review papers lezen die ik hier heb opgenomen en de referenties volgen die ze citeren voor origineel onderzoek. De Aimone-recensie is bijzonder leesbaar en heeft een aantal zeer uitstekende illustraties voor een beginner, en behandelt ook uitgebreid de regulatie van neurogenese door gedrag en omgeving.

Referenties

Aimone, J.B., Li, Y., Lee, S.W., Clemenson, G.D., Deng, W., & Gage, F.H. (2014). Regulatie en functie van neurogenese bij volwassenen: van genen tot cognitie. Fysiologische beoordelingen, 94 (4), 991-1026.

Deng, W., Aimone, JB, & Gage, FH (2010). Nieuwe neuronen en nieuwe herinneringen: hoe beïnvloedt neurogenese van de hippocampus bij volwassenen het leren en geheugen?. Nature Reviews Neuroscience, 11 (5), 339-350.

Zhao, C., Deng, W., & Gage, FH (2008). Mechanismen en functionele implicaties van neurogenese bij volwassenen. Cel, 132(4), 645-660.


Tal van AI- en machine learning-frameworks kunnen ongelooflijk snel leren, maar ze hebben geen neuronen en sommige doen geen poging om neurale netwerken na te bootsen.

Als uit het hoofd leren (de eenvoudigste en grofste vorm van leren) wordt beschouwd als leren, dan zou je zelfs kunnen beweren dat een computer "leert" wanneer je er een nieuw programma op installeert.

Het antwoord op je vraag is dus nee.

Zelfs als je computerleren niet als voorbeeld accepteert, kan elk half-fatsoenlijk immuunsysteem eerder aangetroffen ziekteverwekkers "herinneren" en dit lijkt niet op neuronen te vertrouwen.


Stamcelvoortplanting en neurogenese kunnen nu worden bestudeerd in celcultuur

Onderzoekers zijn nu in staat om stamcellen uit de hersenen van volwassen muizen en hun neurogenese te bestuderen in langdurige celculturen. Harish Babu en Dr. Gerd Kempermann (beiden van het Max Delbrück Center for Molecular Medicine, MDC, Berlin-Buch, de Volkswagenstiftung Research Group aan de Charité &ndash Universitätsmedizin Berlin, Duitsland) hebben een nieuwe methode ontwikkeld waarmee ze precies die neuronen kunnen genereren van stamcellen in celcultuur als die welke zich in de levende hersenen zouden ontwikkelen.

Ze isoleerden de stamcellen uit een gebied van de hippocampus, de dentate gyrus, een eiland voor neurogenese in de volwassen hersenen. Ten eerste toonden ze aan dat de hippocampus van volwassen muizen inderdaad cellen heeft met stamceleigenschappen waarover eerder werd gedebatteerd en bovendien dat deze stamcellen zich onder bepaalde omstandigheden ontwikkelen tot neuronen van de hippocampus.

Deze stamcelculturen waaruit neuronen kunnen worden gegenereerd, zijn een krachtig hulpmiddel om stamcellen en hun regulerende mechanismen in de hippocampus, de regio voor leren en geheugen, te bestuderen.

Enkele jaren eerder konden Dr. Kempermann en andere onderzoekers aantonen dat zelfs de volwassen hersenen nieuwe neuronen kunnen bouwen. De onderzoekers gaan ervan uit dat de nieuwe neuronen in de hippocampus de hersenen helpen zich aan te passen aan nieuwe uitdagingen in het leven. Of en hoe deze nieuwe cellen of hun voorlopercellen, de stamcellen, kunnen worden gebruikt om therapieën tegen dementie te ontwikkelen, valt nog te bezien.


Menselijke volwassen neurogenese onthuld

Dan Cossins
7 juni 2013

CEL/SPALDING ET AL Bovengrondse atoombomtests die meer dan 50 jaar geleden werden uitgevoerd, resulteerden in verhoogde atmosferische niveaus van de radioactieve koolstof-14-isotoop (14 C), die in de loop van de tijd gestaag afnam. In een onderzoek dat gisteren (7 juni) is gepubliceerd in Cel, gebruikten onderzoekers metingen van de 14 C-concentratie in het DNA van hersencellen van overleden patiënten om de leeftijd van de neuronen te bepalen, en toonden aan dat er aanzienlijke neurogenese bij volwassenen is in de menselijke hippocampus.

"We geven grondige informatie over de omvang van neurogenese en we laten zien dat er een verrassend grote hoeveelheid is", zei onderzoeksauteur Jonas Frisé van het Karolinksa Instituut in Stockholm, Zweden.

"Het is een zeer indrukwekkende prestatie", zegt Gerd Kempermann van het Duitse Centrum voor Neurodegeneratieve Ziekten in Dresden, die niet bij het onderzoek betrokken was. "Het is welkom in het veld als een lang gezochte bevestiging, maar het is ook meer, omdat ze de dynamiek van volwassenen modelleren.

Het eerste directe bewijs voor volwassen neurogenese bij mensen kwam in 1998, maar de gebruikte methode - het injecteren van een chemisch label dat permanent integreert in het DNA van delende hersencellen - is niet langer beschikbaar voor onderzoekers vanwege veiligheidsproblemen, dus de resultaten zijn nooit gerepliceerd . Bovendien kon de techniek geen informatie geven over het aantal nieuwe gegenereerde neuronen, dus het was onmogelijk om te zien of neurogenese bij mensen in dezelfde mate voorkomt als bij knaagdieren, waarvan bekend is dat nieuwe neuronen de hersenfunctie beïnvloeden.

Om neuronale omzetting bij mensen te bestuderen, ontwikkelden Frisén en collega's een strategie om achteraf cellen in postmortale hersenen te dateren door de niveaus van 14 C te meten. Aangezien 14 C wordt opgenomen door planten en door dieren die planten eten, nemen mensen ook 14 C op. C op atmosferische niveaus - die in een bekend tempo zijn afgenomen sinds het verdrag voor een beperkt testverbod van 1963 een einde maakte aan het testen van atoombommen boven het oppervlak.

De 14C vindt zijn weg naar het DNA van prolifererende cellen, waar het wordt geïntegreerd in chromosomen, aangezien ze worden gedupliceerd vóór deling. De verhouding van 14 C in vergelijking met de stabiele en veel overvloediger koolstof-12 isotoop (12 C), waarvan de niveaus constant blijven in de tijd, geeft een geboortedatum voor individuele cellen. "Kortom, 14 C geeft een tijdstempel in elke pasgeboren hersencel," zei Frisén, "en we hebben de leeftijd van hersencellen gemeten door die tijdstempel te lezen."

De onderzoekers onderzochten de hersenen van 55 personen van verschillende leeftijden, van 19 tot 92. Gebaseerd op de verhouding van 14 C tot 12 C in het DNA van neuronen in de dentate gyrus - een deel van de hippocampus waarvan bekend is dat het belangrijk is voor leren en geheugen, waar neurogenese wordt verondersteld plaats te vinden - het team creëerde een wiskundig model om de snelheid van de omloopsnelheid van neuronen te schatten. Ze berekenden dat een derde van de neuronen in de hippocampus gedurende het hele leven regelmatig wordt vernieuwd, wat neerkomt op de toevoeging van ongeveer 1.400 nieuwe neuronen per dag, waarbij de snelheid bescheiden afneemt met de leeftijd.

In het voorgestelde model vernieuwt een subpopulatie van neuronen continu, terwijl een andere populatie helemaal niet vernieuwt. De vernieuwende cellen leven veel korter dan andere, maar worden continu omgedraaid.

Bij muizen hebben hippocampale neuronen gedurende een beperkte tijd na differentiatie een verbeterde synaptische plasticiteit, wat betekent dat ze de sterkte van verbindingen gemakkelijker aanpassen als reactie op nieuwe stimuli. "Deze [jonge cellen] zijn nodig om soortgelijke ervaringen te scheiden als afzonderlijke herinneringen", zei Frisén. "Voor ons betekent dat dat we de Beatles en de Rolling Stones uit elkaar moeten houden, in plaats van ze op één hoop te gooien als rock-'n-rollmuziek."

Als nieuwe neuronen ook meer plastisch zijn bij mensen, suggereert hij, kan neurogenese een sleutelrol spelen in de hersenfunctie door een constante aanvoer van jongere cellen te behouden, ook al is er een algemeen verlies van hippocampale neuronen naarmate we ouder worden.

"Door 'voor altijd jong' te blijven, zou de dentate gyrus unieke oplossingen kunnen bieden voor computerproblemen die alleen te vinden zijn in het hersengebied dat centraal staat in leren, geheugen en vele hogere cognitieve functies die als essentieel worden beschouwd voor mensen", schreef Kempermann in een perspectief op het papier in Wetenschap.

Bovendien is er bewijs uit diermodellen dat verminderde neurogenese betrokken is bij psychiatrische aandoeningen, wat Frisén en collega's ertoe brengt te suggereren dat jonge neuronen in de dentate gyrus ook een sleutelrol kunnen spelen bij stemmingsregulatie. "Wat we nu willen doen, is terugkijken op de medische geschiedenis van deze [en andere] onderwerpen. . . om te zien of depressie of andere psychiatrische aandoeningen verband lijken te houden met neurogenese, "zei hij.

KL Spalding et al., "Dynamiek van hippocampale neurogenese bij volwassen mensen", Cel, 153:1219-27, 2013.


Neurogenese bij volwassenen essentieel voor door slaap geïnduceerde geheugenconsolidatie bij muizen

Neurogenese bij volwassenen, waarbij nieuwe neuronen worden gegenereerd in de hippocampus in het volledig ontwikkelde volwassen brein, vindt plaats bij muizen, maar hoe nieuwe neuronen functioneel worden geïntegreerd in bestaande hersencircuits is grotendeels onbekend gebleven. Een studie die op 4 juni in het tijdschrift wordt gepubliceerd neuron toont een belangrijke nieuwe rol voor neuronen die tijdens de volwassenheid worden gegenereerd bij het consolideren van herinneringen tijdens de slaap bij muizen.

Eerdere studies hebben de aanwezigheid van volwassen geboren neuronen (ABN's) gekoppeld aan herinneringen en synaptische plasticiteit, waardoor ze logische kandidaten zijn om deel te nemen aan geheugenconsolidatie tijdens de slaap, wanneer hippocampale neuronen vaak activiteitspatronen herhalen die aanwezig zijn wanneer het dier een nieuwe taak leert. Maar de functie van ABN's tijdens de slaap is onbekend.

Nu heeft hoofdauteur Masanori Sakaguchi, universitair hoofddocent aan het International Institute for Integrative Sleep Medicine aan de Universiteit van Tsukuba, Japan, ontdekt dat ABN's essentieel zijn voor synaptische structurele remodellering en geheugenconsolidatie tijdens REM-slaap (REM) bij muizen.

"Onze studie is de eerste die ABN-activiteit en -functie tijdens de slaap bij dieren aantoont", zegt hij. "Onze resultaten effenen de weg naar het onthullen van mechanistische inzichten in hoe ABN's tijdens de slaap aansluiten bij bekende geheugenfuncties."

De onderzoekers konden ABN-activiteit detecteren door nieuwe technieken te gebruiken om neuronale activiteit gedurende vier uur in natuurlijk slapende muizen te visualiseren. Omdat een enkele REM-episode bij muizen meestal minder dan een minuut duurt, hebben de onderzoekers de ABN-activiteit tijdens deze episodes nauwkeurig gemanipuleerd door middel van optogenetica: het genetisch manipuleren van neuronen zodat wetenschappers ze met licht kunnen stimuleren.

Sakaguchi en collega's waren aanvankelijk verrast om te zien dat jonge ABN's weinig activiteit vertoonden tijdens de slaap. Ze zagen toen dat een kleine populatie ABN's geactiveerd werd terwijl de muizen een angstgeheugen leerden - een milde voetschok kregen - en opnieuw werden geactiveerd in de daaropvolgende REM-slaap.

"Hoewel de ABN-activiteitsniveaus tijdens de REM-slaap afnamen zodra de dieren het geheugen met succes hadden geleerd, reactiveerde een proces van geheugenconsolidatie tijdens de REM-slaap de ABN's die waren geactiveerd toen de muizen aan het leren waren", zegt Sakaguchi. Daarom, toen de ABN-activiteit tot zwijgen werd gebracht, werd de algehele geheugenconsolidatie van de dieren aangetast. Optogenetische manipulatie die zowel verhoogde als verminderde ABN-activiteit tijdens de REM-slaap resulteerde in geheugenverlies, wat suggereert dat er sterk gecoördineerde ABN-activiteiten zijn die een cruciale rol spelen voor geheugenconsolidatie tijdens de REM-slaap.

De volgende stappen omvatten het onderzoeken hoe de reactivering van ABN's tijdens de REM-slaap het geheugen consolideert. Vertegenwoordigt de heractivering geheugenherhaling? Wat coördineert de ABN-activiteit tijdens de REM-slaap? Hoe dwingen ABN's geheugenconsolidatie stroomafwaarts af?

"Wij zijn van mening dat deze mechanismen van cruciaal belang zijn voor nieuwe neuronen om functioneel te integreren in bestaande neuronale circuits", zegt Sakaguchi. Hij hoopt dat "gezamenlijk deze studies zullen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om de beschadigde hersenen te regenereren."


Je zintuigen regenereren: meerdere rollen voor neurogenese in het volwassen brein

Het volwassen muizenbrein levert continu nieuwe neuronen aan de bulbus olfactorius en de hippocampus. Een nieuwe studie in dit nummer toont aan dat voortdurende neurogenese essentieel is voor het onderhoud van de bulbus olfactorius en voor ruimtelijk geheugen.

Imayoshi et al. 3 trokken deze conclusies op basis van een elegante transgene strategie die ze gebruikten om door stamcellen gegenereerde nakomelingen permanent te labelen en vervolgens uit te putten in de volwassen hersenen. In het bijzonder genereerden de auteurs muizen waarin een door tamoxifen induceerbaar Cre-recombinase (CreER T2) tot expressie werd gebracht onder de promotor voor de neurale voorlopermarker nestin. Met behulp van deze muizen vroegen ze eerst hoeveel nieuwe stamcel-afgeleide neuronen aan het volwassen brein waren toegevoegd. Om dit te doen kruisten ze hun muizen met verschillende reporterlijnen en induceerden recombinase-activiteit bij volwassenen met tamoxifen, waarbij ze de reporters efficiënt (tot 87%) tot expressie brachten in neurale stamcellen (NSC's) en hun nageslacht. Aanvankelijk volgden de auteurs de differentiatie, migratie en rijping van nieuwe neuronen in de bulbus olfactorius. Eerder werk heeft aangetoond dat neuronen worden gegenereerd uit NSC's in de subventriculaire zone van de laterale ventrikels en dat deze neuronen migreren naar de bulbus olfactorius, waar ze rijpen en na ongeveer 1 maand de kenmerken van volwassen granule-neuronen verwerven 4,5 . De nieuwe induceerbare transgene benadering van de auteurs bevestigde dit eerdere werk en leidde tot de conclusie dat bijna de gehele granulecelpopulatie werd vervangen door nieuwe neuronen gedurende een periode van 12 maanden. De snelheid van neuronale vervanging was bijna lineair gedurende de eerste 6 maanden, met een afname van het tempo van toevoeging van 6-12 maanden, mogelijk als gevolg van een afname in olfactorische neurogenese op middelbare leeftijd en daarna. De uitzondering op deze bijna volledige vervanging was in de oppervlakkige lagen, waar slechts de helft van de neuronen was gelabeld, wat suggereert dat er ten minste één subpopulatie van persistente korrelcellen in de bulbus olfactorius is.


Luchtvervuiling in verband met gewelddadige misdaad in Chicago

Naarmate de luchtvervuiling toeneemt, neemt ook de gewelddadige misdaad toe.

  • Een nieuw rapport suggereert dat luchtvervuiling door snelwegen de gewelddadige misdaad in Chicago met twee procent heeft doen toenemen.
  • Het effect was consistent in verschillende delen van de stad en onafhankelijk van andere factoren.
  • Het onderzoek suggereert dat een belasting tegelijkertijd luchtvervuiling en misdaad zou kunnen verminderen.

Luchtvervuiling is niet alleen schadelijk voor de longen. Een toenemend aantal studies suggereert dat het ook geassocieerd is met lagere productiviteit, verminderde korte termijn cognitieen een toename van psychologische angst en zelfs zelfmoord.

Nu, een nieuwe studie binnenkort te verschijnen in de Amerikaans economisch tijdschrift voegt een ander potentieel neveneffect toe aan vervuilde lucht: verhoogde tarieven van gewelddadige misdaad.


Discussie

Circadiane klokken in dentate gyrus neurosferen

Bioluminescentie-beeldvorming onthulde circadiane mPer1 activiteit in neurosferen gehandhaafd in serummedium. Daarentegen waren bollen in SCM aritmisch. Verder produceerden serummedium en B27M de temporele sequentie van stamcelmarkers, neuron-specifieke eiwitten en morfologische veranderingen voorspeld uit eerdere studies van DG-neurospheres die differentiatie en ontwikkeling in vitro ondergaan. Deze resultaten wijzen op een sterke afhankelijkheid van de circadiane timing van de afgifte van DG-stamcellen uit moleculaire processen die de stamceltoestand in stand houden.

Het ontbreken van neurosfeerritmes in de ongedifferentieerde toestand lijkt op het falen van embryonale stamcellen om circadiane ritmen in genexpressie te vertonen totdat ze worden geïnduceerd om te differentiëren [31]. Hoewel het mogelijk is dat een klein aantal cellen in SCM-neurospheres ritmisch was maar niet gedetecteerd, werd de werking van de circadiane klok in het algemeen onderdrukt, misschien door genen die de celstamheid behouden, zoals gesuggereerd voor SVZ-neurospheres [35]. Als alternatief kunnen groeifactoren in SCM het klokmechanisme remmen door overmatig stimuleren van signaaltransductieroutes die worden gebruikt bij het meeslepen van de circadiane klok naar externe 24-uurs cycli, zoals voorgesteld in een onderzoek naar kankerstamceltumoren [40]. Deze glioomtumorsferen bleven niettemin ritmisch in SCM, terwijl circadiane ritmes afwezig waren in DG-neurospheres, wat wijst op een grotere onderdrukking van timingprocessen.

Circadiane ritmes waren duidelijk terwijl DG-neurospheres differentieerden in SM, zoals blijkt uit immunocytochemie die de stamcelmarkers SOX2, Msi1, Nestin en GFAP identificeerde. 42 ± 6,40% van de neurosfeercellen was bijvoorbeeld positief voor SOX2 na dag 4 in SM. Er waren echter geen volwassen neuronale cellen aanwezig terwijl circadiane ritmes werden gedetecteerd, wat suggereert dat ritmes naar voren kwamen in de NSPC's. Dit resultaat werd ondersteund door mPER1-immunokleuring, wat aangeeft dat bioluminescentie zijn oorsprong vond in de stamcelrijke kern van neurosferen. Deze resultaten ondersteunen de opvatting dat NSPC-subpopulaties in neurosferen circadiane klokcellen zijn, in tegenstelling tot eerdere studies die beweerden dat circadiane klokken eerst beginnen in volwassen cellen en niet operationeel zijn in onrijpe, differentiërende cellen [41, 42]. Aanvullende ondersteuning dat differentiërende stamcellen circadiane zijn, wordt echter gevonden in studies van hematopoëtische stamcellen, embryonale cellen van de hypothalamische suprachiasmatische kern (SCN) en vroege embryonale stamcellen die circadiane ritmes tot expressie brengen [43–45].

Hoogfrequente oscillaties in mPer1::luc expressie werden gerapporteerd in SVZ-neurospheres die werden gehandhaafd in SCM [35] maar werden slechts één keer waargenomen in de huidige studie. Samen suggereren deze twee studies dat ten minste één van de belangrijkste circadiane klokgenen kan worden gemoduleerd op hogere frequenties, net zoals de ritmische expressie van genen die vroege ontwikkelingsgebeurtenissen reguleren [46, 47]. Een alternatieve mogelijkheid is dat de ultradiane oscillaties worden gevormd uit de output van twee circadiane celpopulaties die ongeveer 12 uur uit elkaar blijven in een faserelatie, vergelijkbaar met beschrijvingen van andere ultradiane oscillaties [48, 49].

Circadiane ritmes waren al op de tweede dag na overdracht naar SM aanwezig, waardoor er voldoende tijd was om hun eigenschappen te evalueren. De gemiddelde periode van DG-neurospheres in SM was korter dan 24 uur, vergelijkbaar met die van het vrijlopende circadiane locomotorische ritme van de inteelt C57BL/6-muislijn die in dit onderzoek werd gebruikt (23.84 uur) [50]. Aan de andere kant vertonen hippocampale explantaatculturen van transgene muizen die een fusie-eiwit van mPER2 en vuurvliegluciferase tot expressie brengen een circadiaans ritme in bioluminescentie van 25.08 uur [14]. De fase van het circadiane ritme van de neurosfeer werd bepaald vanaf het moment van de piek mPer1 uitdrukking. In SM vond deze fase plaats zoals voorspeld na de forskolin-behandeling die werd gebruikt om NSPC's te synchroniseren [51]. De gemiddelde piekbioluminescentie trad op met tussenpozen van ongeveer 24 uur nadat de forskolin-puls eindigde, wat wijst op een ensembleritme van meerdere oscillerende cellen [40].

Eén model ondersteund door de DG-resultaten hier en eerder werk aan SVZ-neurospheres [35] komt voort uit NSPC-heterogeniteit en zou de aanwezigheid van ritmes tijdens vroege differentiatiegebeurtenissen kunnen verklaren: er worden ten minste twee celpopulaties beschouwd, een die niet-circadiaan maar substantieel is, en een tweede veel kleinere populatie die circadiaans is en meesleept naar de forskolin-puls. Tijdens differentiatie prolifereert de kleine populatie, waardoor een detecteerbaar ensemble circadiaans ritme wordt geproduceerd, terwijl de niet-circadiane cellen worden verminderd of uitgeput door asymmetrische celdeling. Een mogelijkheid is dat de oorspronkelijke niet-circadiane cellen geactiveerde radiale gliacellen zijn die verloren gaan als ze differentiëren tot NSPC's die naar de circadiane celpopulatie worden meegevoerd naarmate de proliferatie vordert. Dit model met twee cellen beschrijft het ontstaan ​​van circadiaanse ritmes in mPer1 expressie tijdens neurale differentiatie en verdient verder testen. Het voorspelt dat circadiane NSPC's met elkaar in contact kunnen komen via celcontacten of paracriene factoren, een uitgangspunt dat wordt ondersteund door celinteracties gerapporteerd in tumorsferen [40].

Hoewel zeer weinig studies de circadiane ritmen in de hippocampus hebben onderzocht die in vitro worden gehandhaafd, geeft het bewijs aan dat deze een perifere circadiane oscillator bevat die verschilt van die van de SCN [14]. Een ander in vitro onderzoek van klokgenen in geïsoleerde hippocampusculturen detecteerde echter geen circadiane ritmes [15, 52]. De meeste onderzoeken naar circadiane ritmes van de hippocampus hebben ritmes geanalyseerd in DG-weefsel dat met tussenpozen is geoogst van dieren die zijn gehuisvest in standaardcycli van 12 uur licht en 12 uur donker (LD) [15, 23, 53]. In één geval waren muizen ten minste 2 dagen in DD vóór dissectie, waardoor directe effecten van meeslepende lichtsignalen op genexpressie werden vermeden [1]. Desalniettemin kunnen indirecte effecten van circadiane locomotorische activiteit of circadiane oscillatoren elders in de hersenen verantwoordelijk zijn geweest voor veel van de ritmische hippocampale activiteit die in eerdere onderzoeken werd waargenomen. Circadiane ritmes in neurale inputs voor de hippocampus of ritmes in metabole substraten en cortisol in de hersenen zijn enkele manieren waarop circadiane ritmes kunnen worden aangestuurd [54]. Door deze externe invloeden te vermijden, laten de DG-neurosfeerritmes zien dat hippocampuscellen inderdaad in staat zijn tot endogene circadiane timing. Bovendien zijn celfenotypes die aanwezig zijn in ritmische neurosferen identificeerbaar door immunofluorescentie, waardoor wordt gesuggereerd welke cellen het BLI-ritme genereren, zoals de mPER1-positieve cellen gelokaliseerd in de kern.

Van fluorescentiebeeldvorming van gefixeerde hippocampussecties van transgene muizen die een DsRED- en PER2-fusie-eiwit tot expressie brengen, wordt gerapporteerd dat ze circadiane ritmes vertonen in DG-cellen die rustende NSPC's lijken te zijn (Type 1-cellen, Sox2 + /GFAP +) [1]. Het bewijs dat de ritmische cellen Type 1-cellen waren, was indirect: hoge DsRED-PER2-fluorescentie was omgekeerd gecorreleerd met de intensiteit van kleuring voor Ki-67, een mitotische activiteitsmarker, wat suggereert dat het circadiane ritme zijn oorsprong vond in rustende cellen. DCX+-cellen werden echter ook geïdentificeerd als Ki-67-negatief, wat een extra mogelijke bron van het ritme opleverde [1]. Neuroblasten zijn DCX+-cellen en ondergaan asymmetrische celdeling om neuronen te worden, maar verschillen van Type 1-cellen, die multipotent en minder gedifferentieerd zijn [55]. Een extra zorg is dat DsRED-PER2-ritmes die werden opgenomen, het gevolg kunnen zijn van een ritme in celovervloed in de DG, zoals beweerd, of van een circadiane modulatie van mPer2 promotor activiteit.

Circadiane klokeiwitten en groei en vorming van neurosfeer

Gebruik makend van Bmal1 -/- en huilen 1 -/- , 2 -/- aritmische muizen, vonden we dat de circadiane klok nodig is voor normale groei en differentiatie van de neurosfeer. Langzamere groeisnelheden werden waargenomen in secundaire neurosfeerculturen afgeleid van DG of huilen 1 -/- , 2 -/- muizen in vergelijking met op leeftijd gematchte Huilen1 -/- muizen of WT nestgenoten. De Huilen1 -/- controlemuizen zijn ritmisch, maar de periode van hun circadiane bewegingsritme is 1 uur korter dan WT [34]. Neurosferen gegenereerd uit huilen 1 -/- , 2 -/- muizen waren significant kleiner en minder in vergelijking met controles, wat aangeeft dat het ontbreken van circadiane timingproductie of afwezigheid van andere functies voor cryptochrome eiwitten de groeisnelheid kan onderdrukken of verhoogde apoptose kan induceren.

Tekorten werden ook waargenomen in Bmal1 -/- DG neurosferen na kweek in SCM gedurende 15-20 dagen: Lacunes waren overvloedig aanwezig in Bmal1 -/- DG neurosferen maar waren niet aanwezig in DG neurosferen van WT nestgenoten. evenzo, Bmal1 -/- SVZ-neurospheres misten lacunes, wat suggereert dat DG NSPC's mogelijk gevoeliger zijn dan SVZ-sferen voor metabole stress of andere uitdagingen voor overleving in cultuur die worden opgelegd door een verlies van circadiane timing. In vergelijking met WT-controles, Bmal1 -/- DG neurosferen hadden een verhoogd aantal PI-positieve cellen, indicatief voor beschadigde cellen, vooral in de buurt van de lacunes.

Verhoogde niveaus van ROS zijn gemeld in Bmal1 -/- muizen [56]. Het is mogelijk dat Bmal1 -/- DG-neurospheres genereren ook meer ROS dan WT-sferen of zijn gevoeliger voor ROS-stress, wat leidt tot apoptose. Deze mogelijkheden worden ondersteund door de hogere algehele immunofluorescentie-intensiteit voor de apoptotische marker caspase-3 die we hebben waargenomen in Bmal1 -/- KO bollen. Het percentage cellen dat positief was voor caspase-3 was ook significant verhoogd ten opzichte van de controle op het dekglaasje-niveau van confocale beeldvormingssecties, onder aangehechte neurosferen. Toegang tot kweekmedium zou op deze locatie laag zijn, wat opnieuw suggereert dat verlies van Bmal1 leidt tot grotere gevoeligheid voor stressoren en verhoogde celdood wanneer celoverleving wordt uitgedaagd [39, 57].

Een eerdere studie van de circadiane oscillator in embryonale fibroblasten van muizen vond dat verlies van Huilen1, 2 veroorzaakte verhoogde celproliferatie, maar alleen onder hypoxische omstandigheden [58]. Aan de andere kant waren er geen veranderingen in celproliferatie van cryptochrome knock-outcellen in normale kweekomstandigheden [59]. Verrassend genoeg zagen we verminderde neurosfeerexpansie, een mogelijke indicator van celproliferatie, in huilen 1 -/- , 2 -/- neurosferen, die verschillen tussen celculturen en neurosfeercultuuromstandigheden of tussen fibroblasten en NSPC's kunnen weerspiegelen. Niettemin zouden studies celproliferatie specifiek in de kern van huilen 1 -/- , 2 -/- neurosferen omdat dit gebied doorgaans meer hypoxisch is.

Er is een gebrek aan informatie over Bmal1 -/- cellen in cultuur. Recente onderzoeken met behulp van Bmal1- gemodificeerde cellen suggereren dat de circadiane klok de mitotische snelheid op verschillende manieren verandert, afhankelijk van het celtype: Hepatocyten gekweekt uit Bmal1 -/- dieren vertonen een vertraging in de G1-S-fase van de celcyclus [4], terwijl overexpressie van dit eiwit in NIH3T3-cellen de celproliferatiesnelheid verhoogt [29]. Eén studie toonde een toename van de proliferatie in de subgranulaire zone van Bmal1 -/- dieren [1], terwijl een ander normale proliferatie en verbeterde celoverleving in de SGZ in vivo rapporteerde [2]. We hebben geen verhoogde proliferatiesnelheid waargenomen in Bmal1 -/- DG of SVZ neurosferen. Bolgroottes waren niet significant verschillend van die van WT-dieren.

Circadiane klokken en neurale differentiatie

Recente studies identificeerden verbanden tussen de belangrijkste circadiane klokgenen en factoren die de neurogenese bij volwassenen reguleren. Een rapport toonde aan dat Rev-erbα reguleert neurogenese via Fabp7 modulatie [60]. Van NeuroD1, een neurogene transcriptiefactor, is aangetoond dat het wordt gereguleerd door het BMAL1/Clock-complex. De auteurs rapporteerden ook een afname van het percentage cellen dat positief was voor de neuronale marker MAP2 na celtransfectie met BMAL1-siRNA [41]. Dit interessante resultaat komt overeen met de huidige studie waarin: Bmal1 -/- neurosfeercellen konden geen neuronen genereren in B27M, een medium voor neuronale differentiatie. We bevestigden onze resultaten met behulp van onrijpe (BetaIII-tubuline+ en DCX+) en rijpe (NeuN+) neuronale markers en registreerden zeer weinig cellen van beide fenotypes.

Daarentegen waren er verhoogde aantallen GFAP + -cellen wanneer Bmal1 -/- neurosferen werden gekweekt in B27M. Onze resultaten komen ook overeen met een recente studie waarin verhoogde aantallen astrocyten werden waargenomen in de hersenschors en hippocampus van 6 maanden oude Bmal1 -/- muizen. Verstoring van de circadiane klok in de hersenen door deletie van Bmal1 bleek ook oxidatieve stress, astrogliose, degeneratie van axonuiteinden en verlies van neuronen te induceren [28].

Enkele van de kenmerken die specifiek zijn waargenomen in Bmal1 -/- neurosferen, waaronder lacunes, kunnen worden toegeschreven aan verlies van een niet-circadiane functie van het eiwit in plaats van verlies van circadiane timing. Als deze verschijnselen werden veroorzaakt door verlies van klokafhankelijke processen, hadden ze moeten verschijnen in Bmal1 -/- en huilen 1 -/- , 2 -/- sferen omdat beide geen functionerende klok hebben, maar ze werden alleen geassocieerd met Bmal1 -/- . Als alternatief, zoals hieronder beschreven, kunnen de verschillen tussen de twee knockout-boltypen zijn geweest omdat hun circadiane klokken op twee verschillende manieren werden gestopt, waardoor ze in afzonderlijke fasen van de circadiane cyclus werkten en waardoor niveaus van de vele klokgestuurde eiwitten ook verschilden. . Interessant is dat het effect op de groei van de neurosfeer door verlies van Huilen1 en Huilen2 kan ook afhankelijk zijn van een niet-klokfunctie van CRY1 omdat, zoals DG en SVZ huilen 1 -/- , 2 -/- bollen, SVZ huilen 1 -/- sferen waren significant kleiner na 35 dagen differentiatie, hoewel de circadiane ritmen niet hadden moeten worden geëlimineerd. Deze resultaten suggereren verschillende maar overlappende rollen voor CRY1 in DG- en SVZ-neurospheres.

Of het nu werd veroorzaakt door tijdverlies of niet, het lage aantal BetaIII-tubuline+-, DCX+- en NeuN+-cellen samen met het verhoogde aantal GFAP+-cellen in onze culturen bevestigden dat Bmal1 is essentieel voor normale neurogenese. Samen met de eerder genoemde rapporten die in situ neurogenese onderzoeken, concluderen we dat de bepaling van het lot in differentiërende neurosferen afhangt van BMAL1.

Onze resultaten, zoals weergegeven in tabel 2, komen niet overeen met een onderzoek van Bouchard-Cannon et al. dat meldt verhoogde celproliferatie bij 40 dagen oud Bmal1 -/- dieren, gebaseerd op expressie van de mitotische marker Ki67 en NeuN + [1]. Het waargenomen verschil met onze studie kan te wijten zijn aan de jongere leeftijd van de dieren die ze gebruikten. Een andere studie rapporteerde geen effect op de proliferatie bij 60 dagen oud Bmal1 -/- dieren [2]. Er zijn veel mogelijke routes waardoor de klok neurogenese zou kunnen reguleren. De circadiane klok zou differentiatie direct kunnen beïnvloeden door zijn controle over een E-box-element in het promotorgebied van neurogene transcriptiefactoren zoals NeruoD1, Pax6, enz. [41]. Het promotorgebied van het NeuroD1-gen bevat negen E-boxen [61, 62]. Circadiaanse klokken kunnen ook de inzet van het lot reguleren door miRNA's te moduleren. Het Clock/BMAL1-heterodimeer reguleert bijvoorbeeld miRNA 219 [63] dat de differentiatie van oligodendrocyten bevordert [64]. Onze resultaten geven aan dat verlies van BMAL1 in NSPC's de neuronale lotsverbintenis onderdrukt en de NSPC's naar een astrogliale afstamming kan leiden.

Inzichten van DG neurospheres

De effecten op de groei van neurosferen die we hebben waargenomen als reactie op beide circadiane klok-knockouts, geven aan dat de eiwitten die dienen in het timingmechanisme van de oscillator ook belangrijk zijn bij neurogenese. Als daarentegen alleen effecten werden gevonden in bollen van de ene knock-out en niet van de andere, zou het duidelijk zijn dat de klok niet nodig is om de normale neurogenese te laten verlopen. Desalniettemin suggereren de verschillende effecten op NSPC's die zijn waargenomen in de twee soorten knock-out neurosferen dat ze kunnen worden veroorzaakt door tekorten die uniek zijn voor de ontbrekende eiwitten. Het lijkt even waarschijnlijk dat deze verschillen te wijten zijn aan de verschillende rollen die de eiwitten spelen in het timingmechanisme. De eiwitten dienen in verschillende fasen van de circadiane cyclus, vele uren na elkaar [65], en de eiwitexpressiepatronen die ze induceren zijn ook verschillend. De fenotypes die de knock-out-bollen vertonen, lijken te zijn vanwege de ontbrekende circadiane timing en de unieke staat van klokeiwitten die elke knock-out genereert. Bijvoorbeeld, mPER2 eiwitniveaus zijn verhoogd en BMAL1 is op lage niveaus in Huilen1 -/- , 2 -/- muizen [66]. Hoe de vele stroomafwaartse, klokgestuurde genen die onder Bmal1 timingcontrole [67] reageert anders op onderdrukt in plaats van afwezig Bmal1 zou kunnen verklaren waarom neurosfeerkenmerken die door de twee knockouts worden geproduceerd, verschillen: sommige van deze effectorgenen kunnen onder de ene voorwaarde worden geïnduceerd, maar niet onder de andere.

Neurosfeerculturen zijn ook behoorlijk informatief omdat ze endogene vermogens en gedragingen van NSPC's vertonen die onafhankelijk kunnen verlopen van de neurale regulatie die de proliferatie en differentiatie van stamcellen in de hersenen regelt. Net als de zich ontwikkelende embryonale hersenen, onthullen volwassen neurosfeerculturen mechanismen waardoor neurale cellen uitsluitend ontstaan ​​uit gliale celoorsprongen [68]. De volgorde van voorloperceltypen in bolculturen kan in een ander tempo voorkomen dan in situ, maar uiteindelijk verschijnen de directe voorlopers van volwassen neuronen en glia. Of volledig functionele neuronen worden geproduceerd uit de neurosferen die hier worden gebruikt, moet nog worden bepaald.Desalniettemin is het duidelijk dat de verminderde proliferatie, verhoogde apoptose en veranderd cellot waargenomen in de knock-out-sferen niet kunnen worden toegeschreven aan controle of gebrek aan controle door neurale signalering. De neiging om cellen te produceren met astrocyt-achtige in plaats van neuronale kenmerken is vrij gelijkaardig aan de buitensporige gliosis waargenomen in de Bmal1 -/- muizenbrein [28]. Dit resultaat geeft aan dat een kritische beslissing van voorlopercellen bij het bepalen van de neurogene opbrengst afhangt van ofwel een circadiane timinggebeurtenis die intrinsiek is aan NSPC's of alleen van de aanwezigheid van dit sleuteleiwit in deze cellen.

Klok, neurogenese en geheugenvorming

Verhoogde hippocampale neurogenese is gecorreleerd met hogere cognitieve prestaties bij dieren. Neurogenese-gerelateerde verbeteringen zijn gemeld bij het verwerven en behouden van geheugen in ruimtelijke geheugenconsolidatie (Morris-waterdoolhof, radiale armtest), angstgeconditioneerd geheugen, contextueel angstgeheugen, olfactorisch perceptueel geheugen en patroonscheiding [69-72]. Van selectieve ablatie van neurale stamcellen bij transgene dieren of uitputting van de stamcelpool door anti-mitotische behandelingen is aangetoond dat het de plaats- en objectherkenningsherinneringen verandert [73–75]. Van neurogenese in de bulbus olfactorius is aangetoond dat het van cruciaal belang is voor geuronderscheidingstaken, geurgeheugen en leren [76, 77]. Over het algemeen is neurogenese bij volwassenen belangrijk vanwege de adaptieve betekenis ervan, bijvoorbeeld bij het vermijden van roofdieren, het zoeken naar een doel, het lokaliseren van voedsel of het identificeren van partners [77].

Evenzo biedt het circadiane timingsysteem dieren de mogelijkheid om te anticiperen op voorspelbare dagelijkse gebeurtenissen die van invloed zijn op hun overleving of fitheid. De belangrijkste circadiane klokeiwitten die dienen in het timingmechanisme worden overal in de hippocampus aangetroffen [23], en het aantasten van hun normale expressie veroorzaakt tekorten in gewenning, verkennend gedrag en leren [24]. huilen 1 -/- , 2 -/- muizen vertonen een verminderd herkenningsgeheugen, verhoogde angst [78] en gebrek aan tijd-plaatsassociaties [22], hoewel er geen tekorten in werk- of langetermijngeheugenvorming werden gemeld. In tegenstelling tot, Bmal1 -/- muizen vertonen een verminderd leervermogen en er is eerder gerapporteerd dat ze fenotypes vertonen die geassocieerd zijn met versnelde veroudering [1, 39]. Per2 -/- muizen vertoonden een verminderd spoor-angstgeheugen, onderdrukte langetermijnpotentiëring (LTP) en verminderde CREB-fosforylering [14]. Gelijkwaardige effecten werden waargenomen in mPer1 -/- muizen waarin ruimtelijk geheugen, CREB-activering en LTP afnamen [23, 79], wat verder suggereert dat: Per genen hebben extra effecten op functies van de hippocampus, misschien onafhankelijk van hun rol in circadiane timing.

Het gespecialiseerde vermogen van de hippocampus om zijn interneuronen te vervangen, verhoogt de mogelijkheid dat een aantal van de beschreven klokgerelateerde tekortkomingen zich manifesteren door veranderingen in neurogenese. De aanwezigheid van circadiane klokactiviteit die in deze studie tijdens neurosfeerdifferentiatie wordt waargenomen, stimuleert verder onderzoek van circadiane eiwitinvloeden op celbepaling en proliferatie. Circadiane eigenschappen van de NSPC's kunnen worden benut bij het wijzigen van deze cellen om behandelingen aan de hersenen te leveren voor het corrigeren van neurodegeneratieve ziekten of hersentrauma. Als differentiatie in neuronen en glia bijvoorbeeld wordt gepoort door de klok, dan kan de relatieve opbrengst van de celtypen worden gemanipuleerd door middel van expressie van klokgeneiwit. Door de fase van NSPC-ritmes in situ te kennen, kan het bovendien mogelijk zijn om te bepalen wanneer de cellen het minst gevoelig zijn voor schadelijke effecten van medicijnen. Bovendien zou de afgifte van kankerchemotherapieën kunnen worden getimed naar een specifieke fase van het NSPC-ritme om stamceltoxiciteit en verminderde neurogenese bij volwassenen te minimaliseren.


Invoering

Recente studies suggereren dat cellulaire circadiane klokken de neurogenese bij volwassenen en de overleving van nieuw gevormde neuronen kunnen reguleren [1, 2], hoewel circadiane studies van neurogenese in vitro ontbreken. Tijdens volwassen neurogenese vernieuwen multipotente neurale stamcellen zichzelf en differentiëren ze om neuronen te genereren. De dentate gyrus (DG) en de subventriculaire zone (SVZ) zijn twee goed begrepen gebieden van de hersenen van zoogdieren die neurale stamcellen (NSC's) bevatten, die in een unieke cellulaire omgeving worden gehouden. Deze niche voor NSC's wordt in vitro nagebootst in neurosferen die culturen zijn die zijn afgeleid van de DG en SVZ.

Circadiane ritmes zijn endogene, bijna 24-uurs oscillaties in genexpressie, fysiologie of gedrag die in dierlijke cellen worden gegenereerd door twee op elkaar inwerkende transcriptioneel-translationele feedbackloops waarin kernklokgenen (bijv. Punt uit, cryptochroom, en Bmal1) ritmisch geactiveerd [3]. De circadiane klok kan koppelen met de celcyclus [4] en celproliferatie moduleren [5]. De circadiane oscillator stuurt het G2/M-controlepunt van de celcyclus via klokgen wee1 [6] en de G1/S-overgang via klokgestuurde genen p20 en p21 [4, 7]. Celcycluscontrole over de circadiane klok is ook aangetoond, maar wordt minder goed begrepen dan celcyclusregulering door de klok [8, 9].

Modulatie van neurogenese en NSC-proliferatie door een endogene klok in de DG blijft grotendeels onontgonnen. Cortisol, melatonine en verschillende neurotransmitters onder controle van de circadiane klok lijken de dagelijkse neurogenese in het centrale zenuwstelsel te reguleren [10�]. Circadiane ritmes in mPer2 expressie zijn gerapporteerd in hippocampale explantculturen [14], hoewel een afzonderlijke studie geen ritmes in de DG in vivo heeft gedetecteerd [15]. Neurale voorlopercellen van de hippocampus van muizen delen zich vaker 's nachts [1, 16]. Er is ook aangetoond dat verstoorde slaap of veranderingen in de circadiane klokfase de neurogenese onderdrukken, zoals blijkt uit verminderde expressie van doublecortine (DCX), een marker van onrijpe neuronen [17].

Circadiane ritmes beïnvloeden leren, cognitieve prestaties en geheugenvorming bij verschillende soorten [18�]. Studies beschrijven verstoring van circadiane ritmes die leer- en geheugenprestaties, ruimtelijk leren, intra- en intersessiegewenning, plaatsleren, langetermijnpotentiëring en het traceren van angstgeheugen veranderen [14, 21�]. Cryptochrome genen zijn ook nodig voor tijd-plaats leren [22]. Deze studies leveren veel bewijs dat een functionele circadiane klok nodig is voor optimale geheugenvorming en persistentie [25].

Tijdens volwassen neurogenese vormen nieuw gemaakte granulecellen geproduceerd binnen de DG functionele hippocampale synapsen die lijken te zorgen voor verbeterde prestaties van ruimtelijke geheugentaken, verbeterde stemming en neuraal herstel [26, 27]. Omdat verhoogde neurogenese geassocieerd is met verbeterde cognitieve vaardigheden bij knaagdieren, kan optimale circadiane controle van celdeling die nieuwe neuronen in de hippocampale circuits introduceert ook de prestaties verbeteren. In één onderzoek werden bijvoorbeeld hogere niveaus van celproliferatie in het DG van knock-outmuizen zonder BMAL1 aangetoond [1], terwijl een ander onderzoek normale proliferatie beschreef in het DG van Bmal1 -/- knock-out muizen [2]. Knock-out van BMAL1 met behulp van lentivirus-shRNA in primaire neuronale culturen van muizen veroorzaakte verhoogde celdood en siRNA-gemedieerde knock-down van Bmal1 vergelijkbare effecten vertoonden [28]. Overexpressie van Bmal1 in NIH3T3-cellen veroorzaakte een toename in celproliferatie [29]. Daarentegen verhoogde het verlies van mPER2-functioneren de DG NSPC-proliferatie [15]

Circadiane ritmes in klokgenexpressie zijn meestal afwezig in embryonale of multi-potente somatische stamcellen, maar komen wel voor in voorlopercellen en meer gedifferentieerde weefsels [30, 31]. Een belangrijke vraag is of volwassen neurale stamvoorlopercellen (NSPC's) circadiane klokcellen zijn die in staat zijn tot endogene, aanhoudende circadiane ritmen. Onze studie identificeert circadiane ritmes in DG-neurosfeerculturen, onafhankelijk van ritmische invloeden en timingsignalen van het dier of zijn omgeving. We beschrijven ook eigenschappen van neurosfeerculturen van het DG van Bmal1 -/- en huilen 1 -/- , 2 -/- dubbele knock-out muizen die circadiane ritmes missen. Onze resultaten geven aan dat deze circadiane klokgenen niet vereist zijn voor de vorming van neurosfeer in vitro, maar hun afwezigheid vertraagt ​​de groei van de neurosfeer, onderdrukt de binding van het neuronale lot en verhoogt de apoptose.


Resultaten

Mll1 wordt tot expressie gebracht in alle neuronale lagen van het netvlies van de muis

Om ruimtelijke en temporele patronen van Mll1 expressie in het netvlies van de muis, analyseerden we Mll1 transcriptniveaus en distributie tijdens de ontwikkeling. Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)-assays met Mll1-specifieke "Primer Set 1" (Fig. 1A, Aanvullende Tabel S1) toonde aan dat: Mll1 expressie was constant van postnatale dag 0 (P0) tot P5, maar nam significant toe in de tweede postnatale week (Fig. 1B), de cruciale periode voor terminale differentiatie van retinale neuronen. ter plaatse hybridisatie (ISH) met a Mll1 sonde (Fig. 1A) toonde: Mll1 transcripten die al op embryonale dag 12 (E12) detecteerbaar zijn, uniform verdeeld over de gehele neuroblastlaag (NBL, Fig. 1C) waar neurogenese plaatsvindt. Bij E16, Mll1 werd tot expressie gebracht in zowel de NBL- als de ganglioncellaag (GCL, Fig. 1D). Mll1 expressie werd continu gedetecteerd in alle lagen van postnatale zich ontwikkelende en volwassen muis netvliezen van P0 tot P21 (Fig. 1E-I). In overeenstemming met qRT-PCR-resultaten (Fig. 1B), was de ISH-signaalintensiteit veel hoger op P14 in vergelijking met P7 en eerder, met name in de binnenste nucleaire laag (INL) en GCL (Fig. 1H,G). Op P14, Mll1 expressie werd ook gezien in de buitenste kernlaag (ONL) waar gedifferentieerde fotoreceptorkernen zich bevinden, hoewel het signaal schaars was en veel zwakker dan INL en GCL (Fig. 1H). Dit patroon van Mll1 expressie bleef op P21 (Fig. 1I) en gedurende de volwassenheid. Algemeen, Mll1 komt algemeen tot uiting in neurale voorlopers, zich ontwikkelende en gedifferentieerde neuronen, met name in de binnenste retina.

Mll1 expressie in het netvlies van de muis en zijn voorwaardelijke knock-out. (EEN) Diagram van muis Mll1 coderende sequentie die de posities van het katalytische SET-domein en de LoxP sites die de nucleaire lokalisatiesignalen flankeren die zijn gecodeerd in exons 3-4 29 . De bindingsplaatsen voor de ter plaatse sonde (rode ononderbroken lijn) en twee paren RT-PCR-primers (pijlensequenties gegeven in aanvullende tabel S1) zijn aangegeven. (B) Kwantitatieve RT-PCR-analyses van Mll1 mRNA van de aangegeven postnatale leeftijden met behulp van Primer Set 1, gepresenteerd als vouwexpressie ten opzichte van P0-monsters, met foutbalken die de standaardfout van het gemiddelde vertegenwoordigen (SEM, n = 3). *P < 0,05 gebaseerd op eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingen van Tukey. (C–I) ter plaatse hybridisatie van Mll1 (rood) met DAPI nucleaire vlek (blauw) in retinale dwarsdoorsneden van wildtype (C57BL/6 J) muizen op de aangegeven ontwikkelingstijdstippen. Merk op dat de signaalintensiteit toeneemt in twee binnenste retinale lagen op P14 in vergelijking met eerdere leeftijden. NBL-neuroblastlaag GCL-ganglioncellaag ONL-buitenste kernlaag INL-binnenste kernlaag. Schaalbalk = 25um voor panelen C, D en E-I. (J) Kwantitatieve RT-PCR-analyses van Mll1 mRNA-expressie met behulp van Primer Set 2. De resultaten worden weergegeven als vouwexpressie ten opzichte van CreNeg nestgenootmonsters, met foutbalken die SEM vertegenwoordigen (n 3). *P < 0,05 vergeleken met CreNeg door eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingen van Tukey. (K,L) ter plaatse hybridisatie met Mll1 sonde op retinale dwarsdoorsneden van 1 maand oud CreNeg en Mll1KO muizen.

Generatie van Mll1 voorwaardelijke knock-out bij het ontwikkelen van netvliezen

Om de rol van MLL1 in de ontwikkeling van het netvlies te onderzoeken, zijn we voorwaardelijk uitgeschakeld Mll1 bij het ontwikkelen van muis netvliezen met behulp van Cre-LoxP gemedieerde recombinatie. We kruisten muizen die droegen Mll1 flox allelen 29 (Fig. 1A) met a Chx10-Cre lijn die Cre-recombinase tot expressie brengt in voorlopercellen gedurende de ontwikkeling van het netvlies 37 . Om een ​​succesvolle recombinatie van de . te bevestigen Mll1 floxed-regio, hebben we qRT-PCR uitgevoerd voor niet-gerecombineerde Mll1 RNA met behulp van "Primer Set 2" gelegen in het CRE-uitgesneden gebied (Fig. 1A). Op P14, het netvlies van heterozygote (Mll1Het) en homozygoot (Mll1KO) knock-out muizen gaven 55% en 26% van de normale hoeveelheden Mll1 mRNA, respectievelijk (Fig. 1J). Om de omvang van te onthullen Mll1 knock-out (KO) op cellulair niveau hebben we gepresteerd ter plaatse hybridisatie (Fig. 1K, L) met een probe die specifiek is voor niet-gerecombineerde Mll1 RNA (Fig. 1A). In vergelijking tot CreNeg nestgenoten (Fig. 1K), de meerderheid van de retinale cellen in Mll1KO retina's bonden niet langer aan probe, hoewel enkele cellen positief bleven voor Mll1 transcriptie (Fig. 1L). We verwijzen dus naar de homozygote Mll1 f/f Chx10-Cre muizen als Mll1KO (of KO).

Mll1 deficiëntie veroorzaakt tekorten in de retinale functie

Om het gevolg van te bepalen Mll1 deficiëntie op de algehele retinale functie, voerden we elektroretinografie (ERG) uit op de leeftijd van 1 maand (1MO). Zowel aan het donker aangepaste als aan het licht aangepaste responsgolfvormen van Mll1KO muizen vertoonden A-golven, B-golven en oscillerende potentialen, met latenties vergelijkbaar met CreNeg nestgenootcontroles (Fig. 2A, D). Echter, Mll1KO amplitudes waren aanzienlijk verminderd (Fig. 2A-E) over het grootste deel van het bereik van lichtintensiteiten dat onder beide omstandigheden werd getest. Met name de aan het donker aangepaste amplitudereducties waren onevenredig groter voor B- dan A-golven (Fig. 2F), wat suggereert dat Mll1KO netvliezen hebben niet alleen een disfunctie van de staaf/kegel, maar ook gebreken in de visuele signaaloverdracht van fotoreceptoren naar innerlijke neuronen. Deze defecten verergerden niet met de leeftijd tot 6 maanden (gegevens niet getoond), wat pleit tegen progressieve degeneratie in dit model. Tot slot, beide heterozygote nestgenoten (Mll1Het) en Cre-tot expressie brengende muizen zonder floxed Mll1 allelen vertoonden slechts niet-significante kleine reducties in hun A- en B-golfamplitudes ten opzichte van CreNeg bedieningselementen (Fig. 2B, C, E), wat aangeeft dat: Mll1 tekort, niet Cre expressie zelf, is verantwoordelijk voor Mll1KO functionele tekorten.

Electroretinogram (ERG) analyses van Mll1KO muizen en nestgenootcontroles. Hele dier donker aangepast (A–C) en licht aangepast (NS,E) flash-ERG's werden uitgevoerd op 1MO-muizen. (EEN,NS) Voorbeeldgolfvormen als reactie op de geteste intensiteit van de helderste lichtflits. (B,C,E) De gemiddelde aan het donker aangepaste A en B en aan het licht aangepaste B-golfamplitudes werden in een grafiek uitgezet tegen de lichtintensiteit van de stimulus. Foutbalken vertegenwoordigen SEM *P < 0,05 ten opzichte van CreNeg controles door tweeweg herhaalde metingen ANOVA en Tukey's meervoudige vergelijkingen (n 4). (F) Aan het donker aangepast Mll1KO A- en B-golfamplitudes voor de vijf helderste geteste flitsintensiteiten werden genormaliseerd naar het respectieve gemiddelde CreNeg amplitudes en grafieken.

Mll1 deficiëntie produceert dunnere netvliezen, met name van invloed op de binnenste lagen

Om te bepalen of Mll1KO visuele functionele gebreken komen voort uit abnormale retinale architectuur, we onderzochten hematoxyline-en-eosine (H & ampE) gekleurde P24 retinale dwarsdoorsneden (Fig. 3). Mll1KO jongvolwassen netvliezen zagen er zeer normaal uit met goed gescheiden neuronale lagen, maar leken dunner dan CreNeg bedieningselementen (Fig. 3B,A). We maten de dikte van het hele netvlies en van individuele nucleaire lagen op verschillende afstanden van de oogzenuwkop (Fig. 3C-E). De totale dikte van het netvlies was significant verminderd aan zowel de superieure als de inferieure kant in vergelijking met CreNeg nestgenoten (Fig. 3C). Hoewel zowel ONL (Fig. 3D) als INL (Fig. 3E) dunner waren in Mll1KO netvlies, bereikten alleen de INL-veranderingen statistische significantie, wat suggereert dat diktevermindering van Mll1KO netvlies is grotendeels toe te schrijven aan afname van INL-cellen en hun processen/synapsen.

H&E kleuring van CreNeg (EEN) en Mll1KO (B) netvliesdoorsneden op P24. (C–E) Morfometrische kwantificering van de dikte van de retinale laag op de aangegeven posities vanaf de oogzenuwkop (ONH). SUP en INF geven metingen aan die 100um zijn genomen vanaf de superieure of inferieure rand van het netvlies. *P < 0,05 **P < 0,01 ***P < 0,001 ****P < 0,0001, gebaseerd op tweerichtings-ANOVA met herhaalde metingen en Sidak's meervoudige vergelijkingstest (n = 4). Histologische resultaten op andere leeftijden worden getoond in aanvullende figuur S1. Celdood bij het ontwikkelen van netvliezen beoordeeld door immunokleuring voor gesplitst caspase 3 wordt getoond in aanvullende figuur S2.

We onderzochten ook H & ampE-gekleurde retinale secties op verschillende postnatale leeftijden (aanvullende figuur S1). bij P0, Mll1KO netvliezen waren al iets dunner dan CreNeg bedieningselementen (aanvullende figuur S1A-D). Op P7, Mll1KO netvliezen vertoonden normale ONL- en INL-scheiding (aanvullende figuur S1F versus S1E), maar waren significant dunner dan CreNeg controles, met name de INL (aanvullende figuur S1G-I). Mll1KO Retina- en INL-dikteverminderingen hielden aan op P14 (aanvullende figuur S1J-N) en in de jonge volwassenheid (figuur 3). Morfometrische analyses uitgevoerd na 7 maanden vertoonden een soortgelijk patroon (aanvullende figuur S1O-S), consistent met de relatief constante ERG-amplitudereducties. Samen suggereren deze resultaten dat de functionele en morfologische afwijkingen die zich ontwikkelen in Mll1KO netvliezen tijdens neurogenese en terminale differentiatie veroorzaken geen retinale degeneratie.

Om de oorzaak van het dunner worden van het netvlies te onderzoeken Mll1KO muizen, hebben we immunologisch gekleurd voor geactiveerde Caspase-3 op vijf verschillende ontwikkelingsleeftijden, E16, P0, P3, P7 en P14. Het aantal apoptotische cellen was vergelijkbaar of verlaagd in vergelijking met controles op alle leeftijden (aanvullende figuur S2). Dus het dunner worden van Mll1KO netvlies is onwaarschijnlijk als gevolg van verhoogde celdood.

Mll1 deficiëntie vermindert progenitorcelproliferatie en celcyclusprogressie

Om te bepalen of verminderde celproliferatie heeft bijgedragen aan: Mll1KO verdunning van de retinale laag, we voerden Ki67-immunokleuring uit voor prolifererende cellen in retinale dwarsdoorsneden van Mll1KO en CreNeg muizen onder controle. Figuur 4A–C toont representatieve afbeeldingen die zijn genomen bij P0, toen veranderde netvliesdikte aanvankelijk werd gedetecteerd in Mll1KO netvliezen. Het aantal Ki67+ proliferatieve cellen was matig afgenomen in Mll1KO maar niet heterozygoot (Mll1Het) netvliezen, vergeleken met CreNeg nestgenoten (Fig. 4D). Verminderde Ki67+-cellen werden ook waargenomen in Mll1KO netvliezen op P3 en P5 (gegevens niet getoond) en bevestigd door 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) opname-experimenten (aanvullende figuur S3A). Dus, Mll1-deficiënte voorlopercellen verliezen voortijdig hun proliferatiepotentieel.

Verlies van Mll1 in retinale voorlopercellen resulteert in proliferatie en celcyclusdefecten. (A-C) Ki67-immunokleuring (groen) voor proliferatieve cellen met DAPI-nucleaire kleuring (blauw) van retinale dwarsdoorsneden in CreNeg (EEN), Mll1Het (B) en Mll1KO (C) muizen op P0. (NS) Kwantificering van Ki67+-cellen in drie 100 m2 regio's per dwarsdoorsnede, drie dwarsdoorsneden per monster en drie monsters per genotype. Resultaten worden weergegeven als gemiddelde + SEM (n = 3). (E–G) Fosfo-histon H3 (PH3) immunokleuring (groen) met DAPI (blauw) van dezelfde monsters voor cellen in de mitotische (M-) fase van de celcyclus. (H) Kwantificering van het aantal Ki67+-cellen positief voor PH3 per doorsnede, genormaliseerd naar het aantal in CreNeg secties. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde + SEM. (l) Om S-fasecellen in P0-netvliezen te bepalen, werd EdU IP geïnjecteerd in P0-muizenjongen en netvliezen werden 4 uur later geoogst. (J–L) EdU-gelabelde cellen (groen) met DAPI (blauw) in retinale dwarsdoorsneden van geoogste netvliezen. (m) Kwantificering van het aantal Ki67+-cellen die reactief zijn voor EdU in drie 100 μm 2 regio's per doorsnede, ten opzichte van het aantal in CreNeg secties. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde + SEM. *P < 0,05, n.v.t. = niet significant door tweerichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingen (n = 3). Antilichaaminformatie wordt gegeven in aanvullende tabel S2. Reducties in prolifererende cellen werden ook gedetecteerd in Mll1KO netvliezen op P3 en P5 met behulp van EdU-pulslabeling (aanvullende figuur S3A).

Om te bepalen welke fase van de celcyclus werd beïnvloed, hebben we eerst P0-retinale secties immunologisch gekleurd voor fosfo-histon H3 (PH3) om cellen in mitose (M-fase) te markeren. PH3 + -cellen werden gedetecteerd in de buitenste retinale neuroblastlaag (NBL) van alle genotypen (Fig. 4E-G). Toen ze werden geteld en aangepast voor het aantal met Ki67 gelabelde prolifererende cellen, waren de cellen in de M-fase licht maar significant toegenomen in Mll1KO netvliezen ten opzichte van CreNeg controles, terwijl Mll1Het M-fasecellen vertoonden geen significante veranderingen (Fig. 4H). Vervolgens hebben we het aantal S-fase-cellen beoordeeld door EdU-pulslabeling (Fig. 4I): na een puls van 4 uur werden gelabelde cellen meestal verdeeld in het binnenste deel van de NBL, en Mll1KO netvliezen hadden minder S-fase cellen dan CreNeg en Mll1Het netvliezen (Fig. 4J-L). Vanwege verschillen in Ki67+-celaantallen tussen genotypen, telden we het aantal cellen dat positief was voor zowel Ki67 als EdU om te bepalen of de verhoudingen van prolifererende cellen in de S-fase verschilden. Beide Mll1KO en Mll1Het prolifererende progenitorcelpopulaties hadden vergelijkbare percentages S-fase-cellen als CreNeg bedieningselementen (Fig. 4M). Deze onevenredige toename van M-fasecellen suggereert dat MLL1 de progressie van de M-fase in retinale voorlopers reguleert.

Van MLL1 is bekend dat het nodig is voor normale voortgang van de celcyclus in gekweekte cellen door het reguleren van cyclinen, cycline-afhankelijke kinasen (CDK's) of remmers 38 . Om te testen of cycline-gerelateerde genen normaal tot expressie worden gebracht in neonatale netvliezen van Mll1KO muizen, hebben we P0-retinas immunologisch gekleurd voor cycline D1 (CCND1) 39,40 en de CDK-remmer P27 Kip1 41,42 , die beide de juiste RPC-cyclus reguleren in zich ontwikkelende netvliezen. Het aantal CCND1-positieve cellen was vergelijkbaar in P0 Mll1KO tegen CreNeg controle netvliezen (aanvullende figuur S3B, C), wat suggereert dat Mll1KO netvliezen behouden het vermogen om zich uit te drukken CCND1 tijdens de celcyclus, althans in P0-netvliezen. Het aantal P27 Kip1-positieve cellen was echter significant lager in Mll1KO dan in CreNeg bedieningselementen (aanvullende figuur S3D, E). Aangezien P27 Kip1 zowel in cyclische cellen als tijdelijk tot expressie wordt gebracht in alle post-mitotische retinale lijnen42, weerspiegelt deze vermindering waarschijnlijk het verminderde aantal prolifererende cellen en hun nageslacht in Mll1-deficiënte netvliezen (Fig. 4D). Deze resultaten ondersteunen de redenering dat vroege postnatale Mll1KO netvliezen vertonen een defect in RPC-proliferatie en celcyclusprogressie die de expressie van cycline D1 niet direct schaadt.

Mll1 deficiëntie verandert de samenstelling van de retinale cellen en de verhouding tussen neuronen en glia

Om te bepalen of het verlies van retinale voorlopercellen de samenstelling van het celtype in volwassen beïnvloedt Mll1KO netvliezen, hebben we vroege versus laatgeboren celtypen gekwantificeerd in P24-retina-doorsneden nadat celdifferentiatie is voltooid. We hebben ons gericht op cellen van het binnenste netvlies, omdat deze laag aanzienlijk wordt aangetast in Mll1KO netvliezen (Fig. 3). Figuur 5A toont retinale secties gekleurd met markers voor ganglion (GC), horizontale (HC), starburst amacrine (AC) en staaf ON-bipolaire (BC) neuronen en Muller glia (MG). Elk neuronaal celtype was aanwezig maar nam af in Mll1KO in vergelijking tot CreNeg netvliezen, met HC- en AC-populaties die het meest werden getroffen (Fig. 5A, B). Daarentegen waren MG's in vergelijkbare aantallen aanwezig.

Mll1 deficiëntie verandert de samenstelling van het retinale celtype op P24 maar niet op P0. (EEN) Immunokleuring van retinale dwarsdoorsneden van P24 CreNeg en Mll1KO muizen met antilichamen tegen specifieke markers voor binnenste retinale celtypes (groen): Brn3a voor ganglioncellen (GC) Calbindin voor horizontale cellen (HC) Calretinine voor starburst Amacrine Cells (AC) Protein Kinase C-alpha (PKC-A) voor On- Bipolaire cellen (BC) Glutamine Synthetase (GS) voor Muller Glia (MG). Antilichaaminformatie wordt gegeven in aanvullende tabel S2. (B) Veranderingen in het celgetal van elk type binnenste retinale cel in Mll1KO netvliezen, weergegeven als gemiddeld aantal cellen ten opzichte van CreNeg, met foutbalken die de standaardfout van het gemiddelde vertegenwoordigen (SEM, n = 4). *P < 0,01, n.s. = niet significant door tweeweg-ANOVA. (C) Schematisch diagram dat laat zien wanneer voorlopers van elk celtype van het netvlies de celcyclus verlaten. Vroeggeboren celtypen omvatten GC, HC en Cone (lichtgrijze pijlen) laatgeboren celtypen omvatten Rod, BC en MG (zwarte balken). Verschillende subtypes van amacrine cellen (AC's) worden zowel vroeg als laat geboren (aangegeven door een donkergrijze balk). (NS) Immunokleuring van P0-retinale dwarsdoorsneden voor markers van vroeggeboren celtypen: Brn3a voor GC, Onecut1 (OC1) voor HC, AP-2 alfa (AP-2a) voor vroeggeboren AC en RXRγ voor Cone. (E) Het aantal cellen dat reactief was voor elke marker per retina-doorsnede werd geteld. Resultaten worden weergegeven als gemiddeld aantal cellen ten opzichte van CreNeg met foutbalken die SEM vertegenwoordigen. NS. = niet significant door tweerichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingen (n = 3).

Om de bron van deze veranderingen in celsamenstelling te bepalen, hebben we eerst onderzocht of retinale voorlopercellen (RPC's) de verwachte aantallen toegewijde neuronale voorlopers produceerden. Tijdens de ontwikkeling van de muis genereren RPC's elk van de zeven belangrijkste retinale celtypen binnen een gedefinieerde periode (Fig. 5C) 2,3. We begonnen met het kleuren van P0-netvliezen voor specifieke transcriptiefactoren in verschillende vroeggeboren celtypen, GC (Brn3a), HC (OC1), vroeggeboren AC (AP2α) en Cone (RXRγ) (Fig. 5D). Celtellingen toonden aan dat bij P0 de aantallen van elk vroeggeboren celtype vergelijkbaar zijn in Mll1KO tegen CreNeg controle netvliezen (Fig. 5E), wat suggereert dat vroege RPC-gemedieerde neurogenese grotendeels onaangetast is in Mll1-deficiënte netvliezen. Zo moeten onbekende post-neurogene mechanismen verantwoordelijk zijn voor het verlies van vroeggeboren cellen op latere leeftijd.

Vervolgens hebben we de celtypen onderzocht die zijn gegenereerd uit late RPC's met behulp van EdU-puls-chase. EdU-gelabelde P3-retinale voorlopers werden beoordeeld op hun lotkeuzes op P14, wanneer de specificatie van het retinale celtype compleet is 5 (Fig. 6A). P3-voorlopers geven aanleiding tot Rod, BC en enkele AC-neuronen en Muller glia 5 . Zoals verwacht, doorsneden van P14 CreNeg netvliezen vertoonden veel EdU + -cellen in zowel de ONL als INL met een periferie-naar-centraal gradiënt (Fig. 6B, B ', B"). In tegenstelling tot, Mll1KO netvliezen hadden minder EdU + -cellen, meestal te zien in de verre perifere regio's (Fig. 6C, C ', C"). Kwantificering onthulde ongeveer een derde van het aantal EdU+-cellen in Mll1KO als CreNeg netvliezen (Fig. 6D), consistent met de hierboven beschreven verminderde proliferatie.

Mll1 deficiëntie verandert de neurogene versus gliogene capaciteit van late voorlopercellen. (EEN) Schematisch diagram dat de experimentele strategie toont voor het labelen van laatgeboren cellen: P3-muisjongen werden IP-geïnjecteerd met EdU. Op P14 werden netvliezen verzameld om aantallen van vier laatgeboren celtypen te tellen. (B,C) Verdeling van EdU-positieve cellen (rood) in DAPI-gelabeld CreNeg (B) en Mll1KO (C) P14 netvliesdoorsneden. Inserts (B',B",C',C") tonen details bij een hogere vergroting van de aangegeven gebieden. (NS) Kwantificering van EdU-positieve cellen over gehele retinale dwarsdoorsneden, drie secties per monster en drie monsters per genotype. Resultaten worden weergegeven als gemiddelde + SEM. Tweerichtings-ANOVA, **P < 0,0001. (E) Retina-secties gelabeld voor EdU (rood) werden mede gekleurd met antilichamen voor markers voor het lot van cellen (groen) zoals aangegeven. (F) Celaantallen voor de verschillende celtypen afgeleid van P3 EdU-gelabelde voorlopercellen in Mll1KO netvliezen (rode balken), genormaliseerd naar tellingen vanaf CreNeg nestgenoten. Foutbalken vertegenwoordigen SEM van drie biologische replicaten (n = 3). *P < 0,05, n.v.t. = niet significant door tweerichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingen van Sidak.

Vervolgens hebben we retinale dwarsdoorsneden samen geïmmunoteerd voor vier laatgeboren celtypen die worden verwacht van de EdU-gelabelde cellen (Fig. 6E): MG (p27 Kip1), Rod (RHO), AC (PAX6) en Rod ON-BC ( PKC-A). Kwantificering van dubbel-positieve cellen (Fig. 6F) onthulde dat het aantal EdU-gelabelde MG per Mll1KO retinale sectie was bijna tweemaal het gemiddelde aantal in CreNeg secties, terwijl het aantal AC's met 20% werd verminderd. Het aandeel staafjes en BC's was ook licht maar niet significant verminderd in de mutante netvliezen. Dus P3-voorlopercellen in Mll1-deficiënte netvliezen produceerden overmatige gliacellen ten koste van neuronen, vooral AC, wat suggereert dat MLL1 een rol speelt bij het vaststellen van de juiste celsamenstelling en neuron-tot-glia-verhouding tijdens retinogenese.

RNAseq-analyse ondersteunt complexe veranderingen in de samenstelling van retinale cellen

Om te bepalen of de veranderde celsamenstelling correleerde met genexpressieveranderingen in specifieke retinale celtypen (subtypen), werd RNAseq-analyse uitgevoerd op drievoudige retinale monsters van Mll1KO (KO) en wildtype (WT) controlemuizen op P14. Spearman-correlatiecoëfficiënten van RNAseq-datasets (aanvullende figuur S4) toonden aan dat replica's binnen elke genotypegroep samen geclusterd waren, en de KO monsters waren duidelijk verschillend van de WT monsters, wat wijst op veranderde genexpressie in KO netvliezen. Genen die verschillende celtypen vertegenwoordigen, werden gegroepeerd volgens eerder gepubliceerde datasets gedefinieerd door retinale eencellige drop-seq 43 , en uitgezet volgens expressieverschillen tussen KO tegen WT. Figuur 7A toont trends op expressieniveau van genen die tot expressie worden gebracht in zes neuronale en Muller-gliale celtypen. Over het algemeen waren vier gengroepen die horizontale, ganglion-, amacrine- en bipolaire neuronen vertegenwoordigen afgenomen in Mll1KO, terwijl genen die werden getranscribeerd door staaf/kegel fotoreceptoren en Muller glia-cellen hoger tot expressie werden gebracht in Mll1KO dan WT. Verdere analyses voor AC- en BC-subtypen (aanvullende figuur S5A) toonden verminderde genexpressie in alle BC-subtypen in Mll1KO, terwijl genexpressieniveaus varieerden in verschillende AC-subtypen, waarbij laatgeboren AC-subtypen grotere reducties vertoonden dan eerder geboren subtypen (aanvullende figuur S5B) 43 . Over het algemeen ondersteunen RNAseq-resultaten veranderingen in de celsamenstelling en veranderde neuron-tot-glia-verhouding van de late RPC's in Mll1KO netvlies (Fig. 5 en 6).

MLL1 is vereist voor geschikte celtype-specifieke genexpressie. (EEN) RNAseq-analyse op P14 (uitgezet als de verhouding van transcripten in Mll1KO vs C57Bl/6J monsters) toont oververtegenwoordiging van Rod (R), Cone (C) en gliale (MG) genen en vermindering van inner-retina neuron genen in Mll1-deficiënte netvliezen. (B) Kwantitatieve (q)RT-PCR-verificatie van geselecteerde horizontale genexpressie op P14 in Mll1Het en Mll1KO netvliezen ten opzichte van CreNeg nestgenoten. Primersequenties worden gegeven in aanvullende tabel S3. (C) qRT-PCR-verificatie van geselecteerde staaf- en kegelgenexpressie op P14. Resultaten worden weergegeven als vouwexpressie ten opzichte van CreNeg monsters + SEM (n 3). *P < 0,05, **P < 0,0001 vergeleken met CreNeg door tweerichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingen van Tukey.

Om RNAseq-resultaten te valideren, hebben we qRT-PCR uitgevoerd op geselecteerde genen voor de ernstig verminderde HC-set (figuur 7B) en matig verhoogde staaf / kegel-sets (figuur 7C). In overeenstemming met RNAseq-resultaten, drie HC-specifieke genen, Cx57, Oc1 en Prox1, werden allemaal uitgedrukt op lagere niveaus in P14 Mll1KO netvliezen dan CreNeg bedieningselementen (Fig. 7B). Oc1 en Prox1, die coderen voor twee TF's die essentieel zijn voor HC-lotspecificatie 14,15,44 , werden met respectievelijk 80% en 50% verminderd in P14 Mll1KO. Daarentegen werden staaf-/kegelgenen over het algemeen op vergelijkbare of relatief hogere niveaus tot expressie gebracht in beide Mll1Het en Mll1KO vergeleken met de controles (Fig. 7C). Aangezien de ENIGE dikte van Mll1KO netvliezen relatief onaangetast was (aanvullende figuur S1M), weerspiegelt verhoogde staaf / kegel-genexpressie waarschijnlijk de afname van andere celtypen die bijdragen aan totaal retinaal RNA, als gevolg van preferentiële reducties van het binnenste neuron (aanvullende figuur S1N).

Histon-modificaties consistent met RNAseq-analyse

In de RNAseq-analyse en histologische onderzoeken waren we verrast om te zien dat de staaffotoreceptoren, die de meerderheid van de retinale cellen vormen, er relatief normaal uitzien. Omdat van MLL1 bekend is dat het celtype-specifieke genexpressie activeert door methylering van lysine 4 van histon H3 (H3K4), vroegen we ons af hoe de niveaus van deze histonmarkeringen worden beïnvloed in mutanten. Hele retinale extracten vertoonden geen verschillen in niveaus van H3K4me3 of het repressieve teken H3K27me3 in Mll1KO tegen CreNeg controlemuizen (aanvullende figuur S6A, B). Bovendien toonde immunokleuring voor verschillende gemodificeerde histonen, waaronder de actieve markeringen H3K4me2, H3K4me3 en H3 Pan-Ac en de repressieve markering H3K27me3, geen grote verschillen tussen celtypen binnen Mll1KO netvliezen of in vergelijking met CreNeg controlemonsters (aanvullende figuur S6C). Samen suggereren deze resultaten dat er andere mechanismen moeten zijn om het verlies van MLL1 te compenseren bij het begeleiden van de ontwikkeling en het onderhoud van fotoreceptoren en sommige andere retinale celtypen.

Mll1 deficiëntie verstoort de integriteit van horizontale cellen

Hoewel horizontale cellen (HC) een vroeggeboren celtype zijn, was hun genexpressieprofiel een van de zwaarst getroffen in Mll1KO netvliezen. Om te bepalen of deze verandering het gevolg was van veranderde specificatie van het lot van de cel of defect celonderhoud, voerden we immunokleuring uit op drie postnatale leeftijden voor OC1 (Fig. 8A-I), een transcriptiefactor die essentieel is voor HC-lotspecificatie en overleving 14,44. Bij P0, beide Mll1KO en CreNeg controle netvliezen vertoonden vergelijkbare aantallen en locaties van OC1 + HC's (Fig. 8A-C). De initiële HC-specificatie en migratie leken dus normaal in Mll1KO netvliezen. Op P7 werden OC1 + HC's grotendeels gehandhaafd in Mll1KO netvliezen (Fig. 8D-F). Echter, door P14, het aantal OC1 + HC's in Mll1KO netvliezen daalden significant tot minder dan 40% van de controles (Fig. 8G-I). De OC1-kleuringsintensiteit was ook dramatisch verminderd in de resterende HC's in vergelijking met die in de controle-retinas (Fig. 8H vs G), wat suggereert dat Mll1KO HC's verliezen hun integriteit en/of sterven tussen P7 en P14.

MLL1 is vereist voor horizontale celintegriteit. Retinale dwarsdoorsneden van CreNeg en Mll1KO muizen op P0 (EEN,B), P7 (NS,E) en P14 (G,H), immunologisch gekleurd voor OC1 (groen) om horizontale cellen (pijlpunten) te markeren. Kwantificering van OC1+-cellen per retina-doorsnede bij P0 (C), P7 (F) en P14 (l), gepresenteerd als gemiddelde OC1+-cellen per dwarsdoorsnede + SEM. *P < 0,05, n.v.t. = niet significant door tweerichtings-ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingen (n = 3). Om de horizontale celverdeling en connectiviteit in 1MO-netvliezen verder te beoordelen, werd immunokleuring uitgevoerd op retinale dwarsdoorsneden (J,K) voor Calbindin (rood), dat cellichamen van HC en AC labelt, en Neurofilament medium chain (groen), dat hun axonen labelt. (J,K) Retinale doorsneden tonen de duidelijke ruimtelijke verdeling van HC (pijlpunten) en AC (witte pijlen). Flatmounts van 1MO CreNeg (L) en Mll1KO netvliezen (m), afgebeeld met confocale microscopie op het niveau van de OPL en buitenste INL onthulde defecten in het HC-mozaïek en axondistributienetwerk, evenals onderbroken neurofilamenten (pijlen) en axonvaricositeiten (pijlpunten) in Mll1KO netvliezen. Antilichaaminformatie wordt gegeven in aanvullende tabel S2.

Om reducties in HC's te bevestigen en veranderingen in de HC-mozaïek en neurietdistributie te onthullen, hebben we co-immunokleuring uitgevoerd voor Calbindin en Neurofilament (NF) op 1MO-retinasecties en flat-mounts. Terwijl antilichamen tegen NF HC-axonen labelen, markeert Calbindin HC- en AC-somata en dendrieten in dwarsdoorsneden van het netvlies45. In CreNeg netvliezen, intens gekleurde Calbindin-positieve HC-somata bevinden zich op de grens tussen INL en OPL, terwijl licht gekleurde Calbindin-positieve AC-somata zich in de binnenste INL en GCL bevinden (Fig. 8J). Vergeleken met de controles, Mll1KO netvliezen hadden minder en zwakkere Calbindin-positieve HC's (Fig. 8K, witte pijlpunten) en AC's (Fig. 8K, witte pijlen). Bovendien leek de mutant OPL dunner en de IPL-laminae meer ongeorganiseerd in Mll1KO retinale secties bij 1MO. Vervolgens hebben we confocale microkopie uitgevoerd om het HC-vlak te visualiseren op vlak gemonteerde netvliezen die samen zijn gekleurd voor Calbindin (rood) en NF (groen). In Mll1KO netvliezen, Calbindin + HC somata en dendrieten waren schaarser en zwakker dan in CreNeg controles (Fig. 8M vs L). Veel HC-axonen in Mll1KO netvlies waren kort en abnormaal van uiterlijk, sommige waren teruggetrokken in het cellichaam of axonale zwellingen (Fig. 8M, witte pijlpunten). Deze defecten kunnen leiden tot tekorten in het receptieve veld en een abnormale visuele functie. Gezamenlijk suggereren deze resultaten dat MLL1 niet vereist is voor initiële HC-lotspecificatie, maar onmisbaar is voor het handhaven van HC-integriteit, inclusief identiteit, genexpressie en axonnetwerk.

Mll1KO netvliezen ontwikkelen geen normale OPL-synapsen

Om te bepalen of de door ERG-analyse gedetecteerde visuele signaaltransmissiedefecten kunnen worden verklaard door veranderingen in de structurele integriteit van OPL, hebben we immunokleuring uitgevoerd voor twee presynaptische eiwitten die tot expressie worden gebracht in fotoreceptoren: VGLUT1 is een glutamaattransporter die nodig is voor het laden van glutamaat in synaptische blaasjes en voor synaptische transmissie van fotoreceptoren 46,47 . CtBP2 (Ribeye) is een essentieel structureel onderdeel van presynaptische linten 48 . Beide markers waren duidelijk zichtbaar in de OPL van 1MO CreNeg muizen, maar aanzienlijk afgenomen in op leeftijd afgestemde Mll1KO muizen (Fig. 9A-D), wat wijst op afwijkingen in de pre-synaptische terminals van de fotoreceptor. Vervolgens onderzochten we ultrastructurele veranderingen in OPL-synapsen met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Gerandomiseerde TEM-microfoto's van zowel controle- als mutantmonsters (Fig. 9E, F) werden geanalyseerd op staafbolletjes en kegelsteeltjes. Mll1KO netvliezen hadden minder staafbolletjes dan CreNeg nestgenootcontroles (Fig. 9G), en minder daarvan vertoonden normaal gevormde linten in Mll1KO dan bij controles (Fig. 9H). Er werd geen significant verschil in het aantal kegelpedikels gedetecteerd tussen mutanten en controles (Fig. 9I). Deze bevindingen suggereren dat MLL1 nodig is voor het tot stand brengen van normale fotoreceptorsynapsen voor visuele signaaloverdracht.

Mll1KO netvliezen hebben synaptische defecten. Immunokleuring van retina-doorsneden van 1 maand voor synaptische marker VGLUT1 (groen) en bipolaire marker PKC-A (rood) (EEN,B), of voor CtBP2 (Ribeye, groen) en pinda-agglutinine (PNA, rood) voor kegels (C,NS) onthullen duidelijk verminderde presynaptische terminals van de fotoreceptor in de Mll1KO buitenste plexiform laag (OPL). Antilichaaminformatie wordt gegeven in aanvullende tabel S2. In elektronenmicroscopie beelden van de OPL (E,F), zijn representatieve staafbolletjes gemarkeerd met stippellijnen en synaptische linten aangegeven met pijlpunten. Kwantificering van het totale aantal staafbolletjes (G) en het aantal bolletjes met normale linten (H), weergegeven als gemiddelde staafbolletjes per gebied van 10 m + SEM. Kwantificering van het aantal kegelstelen (l), weergegeven als gemiddelde kegelpedikels per 10 m + SEM. *P < 0,05, n.v.t. = niet significant volgens tweeweg-ANOVA (n 4).


Aanvullend materiaal

Alcantara Llaguno, S., Chen, J., Kwon, C.H., Jackson, E.L., Li, Y., Burns, D.K., et al. (2009). Maligne astrocytomen zijn afkomstig van neurale stamcellen/voorlopercellen in een somatisch tumorsuppressor-muismodel. kanker cel 15, 45�. doi: 10.1016/j.ccr.2008.12.006

Altmann, C., Keller, S., en Schmidt, M.H.H. (2019). De rol van SVZ-stamcellen bij glioblastoom. kankers 11:448. doi: 10.3390/cancers11040448

Alvarez-Buylla, A., en Garcia-Verdugo, J.M. (2002). Neurogenese in volwassen subventriculaire zone. J. Neurosci. 22, 629�. doi: 10.1523/JNEUROSCI.22-03-00629.2002

Andersen, L., Góx00FClich, A.F., Alteneder, M., Preglej, T., Orola, M.J., Dhele, N., et al. (2019). De transcriptiefactor MAZR/PATZ1 reguleert de ontwikkeling van FOXP3+ regulerende T-cellen. Cel vertegenwoordiger 29, 4447�.e6. doi: 10.1016/j.celrep.2019.11.089

Barral, A., Rollan, I., Sanchez-Iranzo, H., Jawaid, W., Badia-Careaga, C., Menchero, S., et al. (2019). Nanog regelt Pou3f1 expressie bij de uitgang van pluripotentie tijdens gastrulatie. Biol. Open 8:bio046367. doi: 10.1242/bio.046367

Belenguer, G., Duart-Abadia, P., Jordé1n-Pla, A., Domingo-Muelas, A., Blasco-Chamarro, L., Ferréx00F3n, S.R., et al. (2021). Volwassen neurale stamcellen worden gealarmeerd door systemische ontsteking via TNF-α-receptorsignalering. Cel Stamcel 28, 285�.e9. doi: 10.1016/j.stem.2020.10.016

Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., en Satija, R. (2018). Integratie van eencellige transcriptomische gegevens over verschillende omstandigheden, technologieën en soorten. nat. Biotech. 36, 411�. doi: 10.1038/nbt.4096

Caussinus, E., en Gonzale, C. (2005). Inductie van tumorgroei door gewijzigde asymmetrische stamceldeling in Drosophila melanogaster. nat. Genet. 37, 1125�. doi: 10.1038/ng1632

Chaker, Z., Codega, P., en Doetsch, F. (2016). Een mozaïekwereld: puzzels onthuld door heterogeniteit van volwassen neurale stamcellen. Wiley Interdiscipel. ds. Dev. Biol. 5, 640�. doi: 10.1002/wdev.248

Chiappetta, G., Valentino, T., Vitiello, M., Pasquinelli, R., Monaco, M., Palma, G., et al. (2015). PATZ1 werkt als een tumoronderdrukker bij schildklierkanker door zich te richten op p53-afhankelijke genen die betrokken zijn bij EMT en celmigratie. Oncotarget 6, 5310�. doi: 10.18632/oncotarget.2776

Cho, J.H., Kim, M.J., Kim, K.J. en Kim, J.R. (2012). POZ/BTB en AT-hook-bevattende zinkvingerproteïne 1 (PATZ1) remt de veroudering van endotheelcellen via een p53-afhankelijke route. Celdood verschilt. 19, 703�. doi: 10.1038/cdd.2011.142

Christian, K.M., Song, H., en Ming, G.L. (2014). Functies en disfuncties van volwassen hippocampale neurogenese. Ann. Rev. Neurosci. 37, 243�. doi: 10.1146/annurev-neuro-071013-014134

Cicalese, A., Bonizzi, G., Pasi, C.E., Faretta, M., Ronzoni, S., Giulini, B., et al. (2009). De tumorsuppressor p53 reguleert de polariteit van zelfvernieuwende delingen in borststamcellen. Cel 138, 1083�. doi: 10.1016/j.cell.2009.06.048

Coles-Takabe, B.L., Brain, I., Purpura, K.A., Karpowicz, P., Zandstra, P.W., Morshead, C.M., et al. (2008). Niet kijken: groeiende klonale versus niet-klonale neurale stamcelkolonies. Stamcellen 26, 2938�. doi: 10.1634/stemcells.2008-0558

Costoya, JA (2007). Functionele analyse van de rol van POK-transcriptierepressoren. Kort. Functie Genomische Proteomic 6, 8�. doi: 10.1093/bfgp/elm002

Ellmeier, W. (2015). Moleculaire controle van plasticiteit en integriteit van CD4(+) T-cellijnen. Int. Immunofarmacol. 28, 813�. doi: 10.1016/j.intimp.2015.03.050

EMBL-EBI Expression Atlas (2020). Muis RNA-Seq Time-Series van de ontwikkeling van Seven Major Organs Experiment. Online beschikbaar op: https://www.ebi.ac.uk/gxa/experiments/E-MTAB-6798/Downloads (toegankelijk op 10 september 2020).

Fedele, M., Benvenuto, G., Pero, R., Majello, B., Battista, S., Lembo, F., et al. (2000). Een nieuw lid van de BTB/POZ-familie, PATZ, associeert met het RNF4 RING-vingereiwit en werkt als een transcriptionele repressor. J. Biol. Chem. 275, 7894�. doi: 10.1074/jbc.275.11.7894

Fedele, M., Cerchia, L., Pegoraro, S., Sgarra, R., en Manfioletti, G. (2019). Proneurale-mesenchymale overgang: fenotypische plasticiteit om multitherapieresistentie bij glioblastoom te verwerven. Int. J. Mol. Wetenschap. 20:2746. doi: 10.3390/ijms20112746

Fedele, M., Crescenzi, E., en Cerchia, L. (2017). De POZ/BTB en AT-hook met zinkvinger 1 (PATZ1) transcriptieregulator: fysiologische functies en ziektebetrokkenheid. Int. J. Mol. Wetenschap. 18:2524. doi: 10.3390/ijms18122524

Fedele, M., Franco, R., Salvatore, G., Paronetto, M.P., Barbagallo, F., Pero, R., et al. (2008). Het PATZ1-gen speelt een cruciale rol in de spermatogenese en testiculaire tumoren. J. Patol. 215, 39�. doi: 10.1002/path.2323

Fedele, M., Pierantoni, G. M., Pallante, P., en Fusco, A. (2012). Groep A-interagerende eiwitten met hoge mobiliteit bij kanker: focus op chromobox-eiwithomoloog 7, homeodomein-interagerend eiwitkinase 2 en PATZ. J. Nucl. Zuren Inv. 3:e1. doi: 10.4081/jnai.2012.3988

Gaspard, N., Bouschet, T., Hourez, R., Dimidschstein, J., Naeije, G., van den Ameele, J., et al. (2008). Een intrinsiek mechanisme van corticogenese van embryonale stamcellen. Natuur 455, 351�. doi: 10.1038/natuur07287

Giorgio, E., Liguoro, A., D’Orsi, L., Mancinelli, S., Barbieri, A., Palma, G., et al. (2014). Cripto-haplo-insufficiëntie beïnvloedt in vivo de ontwikkeling van colontumoren. In. J. Oncol. 45, 31�. doi: 10.3892/ijo.2014.2412

Guadagno, E., Vitiello, M., Francesca, P., CalóEC, G., Caponnetto, F., Cesselli, D., et al. (2017). PATZ1 is een nieuwe prognostische marker van glioblastoom geassocieerd met het stengelachtige fenotype en verrijkt met het onderbuiksubtype. Oncotarget 8, 59282�. doi: 10.18632/oncotarget.19546

Hayes, N.L., en Nowakowski, R.S. (2002). Dynamiek van celproliferatie in de volwassen dentate gyrus van twee inteeltstammen van muizen. Hersenonderzoek. ontwikkelaar Hersenonderzoek. 134, 77�. doi: 10.1016/s0165-3806(01)00324-8

Hsieh, J., en Eisch, A.J. (2010). Epigenetica, hippocampale neurogenese en neuropsychiatrische stoornissen: het ontrafelen van het genoom om de geest te begrijpen. neurobiol. Dis. 39, 73�. doi: 10.1016/j.nbd.2010.01.008

Jabaudon, D. (2017). Lot en vrijheid bij het ontwikkelen van neocorticale circuits. nat. gemeenschappelijk 8:16042. doi: 10.1038/ncomms16042

Jessberger, S., Clark, R.E., Broadbent, N.J., Clemenson, G.D. Jr., Consiglio, A., Lie, D.C., et al. (2009). Dentate gyrus-specifieke knockdown van volwassen neurogenese schaadt het ruimtelijk en objectherkenningsgeheugen bij volwassen ratten. Leren. Mem. 16, 147�. doi: 10.1101/lm.1172609

Kelly, K.F., en Daniel, J.M. (2006). POZ voor effect'x2013POZ-ZF transcriptiefactoren bij kanker en ontwikkeling. Trends Cell Biol. 16, 578�. doi: 10.1016/j.tcb.2006.09.003

Keskin, N., Deniz, E., Eryilmaz, J., Un, M., Batur, T., Ersahin, T., et al. (2015). PATZ1 is een DNA-schade-responsieve transcriptiefactor die de p53-functie remt. Mol. Cel. Biol. 35, 1741�. doi: 10.1128/mcb.01475-14

Kuhn, H.G., Dickinson-Anson, H., en Gage, F.H. (1996). Neurogenese in de dentate gyrus van de volwassen rat: leeftijdsgerelateerde afname van neuronale progenitorproliferatie. J. Neurosci. 16, 2027�. doi: 10.1523/jneurosci.16-06-02027.1996

Lee, J.H., Lee, J.E., Kahng, J.Y., Kim, S.H., Park, J.S., Yoon, S.J., et al. (2018). Humaan glioblastoom ontstaat uit subventriculaire zonecellen met drivermutaties op een laag niveau. Natuur 560, 243�. doi: 10.1038/s41586-018-0389-3

Liguori, G.L., Echevarria, D., Bonilla, S., D'Andrea, D., Liguoro, A., Persico, M.G., et al. (2009). Karakterisering van de functionele eigenschappen van het neuroectoderm in Cripto(-/-)-embryo's van muizen die ernstige gastrulatiedefecten vertonen. Int. J. Dev. Biol. 53, 549�. doi: 10.1387/ijdb.082650gl

Livak, K.J., en Schmittgen, T.D. (2001). Analyse van relatieve genexpressiegegevens met behulp van real-time kwantitatieve PCR en de 2(-Delta Delta C(T)-methode. Methoden: 25, 402�. doi: 10.1006/meth.2001.1262

Ma, H., Ow, J.R., Tan, B.C., Goh, Z., Feng, B., Loh, Y.H., et al. (2014). De dosering van Patz1 moduleert het herprogrammeringsproces. Wetenschap. vertegenwoordiger 4:7519. doi: 10.1038/srep07519

Mancinelli, S., en Lodato, S. (2018). Decodering van neuronale diversiteit in de zich ontwikkelende hersenschors: van afzonderlijke cellen tot functionele netwerken. Curr. Opin. neurobiol. 53, 146�. doi: 10.1016/j.conb.2018.08.001

Monaco, M., Palma, G., Vitiello, M., Capiluongo, A., D𠆚ndrea, B., Vuttariello, E., et al. (2018). Verlies van één of twee PATZ1-allelen speelt een cruciale rol in de progressie van schildkliercarcinomen veroorzaakt door het RET/PTC1-oncogen. Kankers (Bazel) 10:92. doi: 10.3390/cancers10040092

Morshead, C.M., Garcia, A.D., Sofroniew, M.V., en van Der Kooy, D. (2003). De ablatie van gliale fibrillaire zure eiwit-positieve cellen van het volwassen centrale zenuwstelsel resulteert in het verlies van neurale stamcellen in de voorhersenen, maar niet in retinale stamcellen. EUR. J. Neurosci. 18, 76�. doi: 10.1046/j.1460-9568.2003.02727.x

Okamoto, M., Miyata, T., Konno, D., Ueda, H.R., Kasukawa, T., Hashimoto, M., et al. (2016). Celcyclus-onafhankelijke overgangen in temporele identiteit van neurale voorlopercellen van zoogdieren. nat. gemeenschappelijk 7:11349. doi: 10.1038/ncomms11349

Oliviero, G., Munawar, N., Watson, A., Streubel, G., Manning, G., Bardwell, V., et al. (2015). De variant polycomb-repressorcomplex 1-component PCGF1 interageert met een pluripotentie-subnetwerk dat DPPA4 omvat, een regulator van embryogenese. Wetenschap. vertegenwoordiger 5:18388. doi: 10.1038/srep18388

Orola, M.J., Tizian, C., Zhu, C., Andersen, L., Góx00FClich, A.F., Alteneder, M., et al. (2019). De zinkvingertranscriptiefactor MAZR reguleert de differentiatie van de iNKT-celsubset. Cel. Mol. Levenswetenschap. 76, 4391�. doi: 10.1007/s00018-019-03119-z

Ow, J.R., Ma, H., Jean, A., Goh, Z., Lee, Y.H., Chong, Y.M., et al. (2014). Patz1 reguleert de identiteit van embryonale stamcellen. Stamcellen Dev. 23, 1062�. doi: 10.1089/scd.2013.0430

Papatheodorou, I., Moreno, P., Manning, J., Fuentes, A.M., George, N., Fexova, S., et al. (2020). Expressie-atlas-update: van weefsels naar afzonderlijke cellen. nucl. Zuren Res. 48, D77�.

Passariello, A., Errico, M.E., Donofrio, V., Maestrini, M., Zerbato, A., Cerchia, L., et al. (2019). PATZ1 wordt tot overexpressie gebracht in gliale tumoren bij kinderen en correleert met slechtere event-free overleving bij hooggradige gliomen. Kankers (Bazel) 11:1537. doi: 10.3390/cancers11101537

Pisapia, L., Terreri, S., Barba, P., Mastroianni, M., Donnini, M., Mercadante, V., et al. (2020). De rol van PA2G4P4-pseudogen bij tumorigenese van blaaskanker. Biologie (Bazel) 9:66. doi: 10.3390/biology9040066

Puca, F., Tosti, N., Federico, A., Kuzay, Y., Pepe, A., Morlando, S., et al. (2019). HMGA1 reguleert negatief NUMB-expressie op transcriptioneel en post-transcriptieniveau in glioblastoma-stamcellen. Celcyclus 18, 1446�. doi: 10.1080/15384101.2019.1618541

Q4Lab (2016). Protocol – Fixatie en paraffine-inbedding van weefselmonsters. Online beschikbaar op: http://quality4lab.igb.cnr.it/en/protocols/histology/fixing-the-embryos-and-wax-embedding (toegankelijk op 10 augustus 2020).

Rueden, C.T., Schindelin, J., Hiner, M.C., DeZonia, B.E., Walter, A.E., Arena, E.T., et al. (2017). ImageJ2: imageJ voor de volgende generatie wetenschappelijke beeldgegevens. BMC Bio-informatica 18:529. doi: 10.1186/s12859-017-1934-z

Sahay, A., Scobie, K.N., Hill, A.S., O�rroll, C.M., Kheirbek, M.A., Burghardt, N.S., et al. (2011). Het verhogen van volwassen hippocampale neurogenese is voldoende om patroonscheiding te verbeteren. Natuur 472, 466�. doi: 10.1038/nature09817

Sakaguchi, S., Hombauer, M., Bilic, I., Naoe, Y., Schebesta, A., Taniuchi, I., et al. (2010). Het zinkvingereiwit MAZR maakt deel uit van het transcriptiefactornetwerk dat het lot van de CD4- versus CD8-afstamming van dubbel-positieve thymocyten regelt. nat. Immunol. 11, 442�. doi: 10.1038/ni.1860

Satija, R., Farrell, J.A., Gennert, D., Schier, A.F., en Regev, A. (2015). Ruimtelijke reconstructie van eencellige genexpressiegegevens. nat. Biotech. 33, 495�. doi: 10.1038/nbt.3192

Schilder, B.M., en Raj, T. (2020). Fine-mapping van de gevoeligheidsloci voor de ziekte van Parkinson identificeert vermoedelijke causale varianten. bioRxiv [Voordruk]. doi: 10.1101/2020.10.22.340158

Scopa, C., Marrocco, F., Latina, V., Ruggeri, F., Corvaglia, V., La Regina, F., et al. (2020). Verminderde neurogenese bij volwassenen is een vroege gebeurtenis in neurodegeneratie van de ziekte van Alzheimer, gemedieerd door intracellulaire Abeta-oligomeren. Celdood verschilt. 27, 934�. doi: 10.1038/s41418-019-0409-3

Stuart, T., Butler, A., Hoffman, P., Hafemeister, C., Papalexi, E., en Mauck, W.M. III, et al. (2019). Uitgebreide integratie van single-cell data. Cel 177, 1888�. doi: 10.1016/j.cell.2019.05.031

Sturm, D., Bender, S., Jones, D.T., Lichter, P., Grill, J., Becher, O., et al. (2014). Pediatrisch en volwassen glioblastoom: pluriforme (epi)genomische boosdoeners komen naar voren. nat. Rev. Kanker 14, 92�. doi: 10.1038/nrc3655

Telley, L., Agirman, G., Prados, J., Amberg, N., Fièvre, S., Oberst, P., et al. (2019). Temporele patronen van apicale voorlopers en hun dochterneuronen in de zich ontwikkelende neocortex. Wetenschap 364:eaav2522. doi: 10.1126/science.aav2522

Valentino, T., Palmieri, D., Vitiello, M., Pierantoni, G. M., Fusco, A., en Fedele, M. (2013a). PATZ1 interageert met p53 en reguleert de expressie van p53-doelwitgenen die apoptose of celoverleving verbeteren op basis van de cellulaire context. Celdood Dis. 4:e963. doi: 10.1038/cddis.2013.500

Valentino, T., Palmieri, D., Vitiello, M., Simeone, A., Palma, G., Arra, C., et al. (2013b). Embryonale defecten en groeiverandering bij muizen met homozygote verstoring van het Patz1-gen. J. cel. Fysiol. 228, 646�. doi: 10.1002/jcp.24174

Vitiello, M., Palma, G., Monaco, M., Bello, A.M., Camorani, S., Francesca, P., et al. (2019). Dubbele oncogene / anti-oncogene rol van PATZ1 in FRTL5-schildkliercellen van ratten getransformeerd door het Ha-Ras V12-oncogen. Genen (Bazel) 10:127. doi: 10.3390/genes10020127

Xu, F., Yang, J., Chen, J., Wu, Q., Gong, W., Zhang, J., et al. (2015). Differentiële co-expressie- en regulatieanalyses onthullen verschillende mechanismen die ten grondslag liggen aan depressieve stoornis en subsyndromale symptomatische depressie. BMC Bio-informatica 16:112. doi: 10.1186/s12859-015-0543-y

Xu, W., Yao, X., Zhao, F., Zhao, H., Cheng, Z., Yang, W., et al. (2020). Veranderingen in hippocampale plasticiteit bij depressie en therapeutische benaderingen die deze veranderingen beïnvloeden. neuraal. plastiek. 2020:8861903. doi: 10.1155/2020/8861903

Yao, B., Christian, K.M., He, C., Jin, P., Ming, G.L. en Song, H. (2016). Epigenetische mechanismen in neurogenese. nat. Rev. Neurosci. 17, 537�. doi: 10.1038/nrn.2016.70

Zhang, J., en Jiao, J. (2015). Moleculaire biomarkers voor embryonale en volwassen neurale stamcellen en neurogenese. biomed. Onderzoek Int. 2015:727542. doi: 10.1155/2015/727542

Sleutelwoorden: neurogenese, neurale stamcellen, PATZ1, knock-out muizen, neurosfeertest, subventriculaire zone

Visum: Mancinelli S, Vitiello M, Donnini M, Mantile F, Palma G, Luciano A, Arra C, Cerchia L, Liguori GL en Fedele M (2021) De transcriptieregulator Patz1 is essentieel voor het onderhoud en de proliferatie van neurale stamcellen. Voorkant. Cel ontwikkelaar Biol. 9:657149. doi: 10.3389/fcell.2021.657149

Ontvangen: 22 januari 2021 Geaccepteerd: 15 maart 2021
Gepubliceerd: 07 april 2021.

Elena Parmigiani, Universiteit van Basel, Zwitserland
Angela Fontan-Lozano, Universiteit van Sevilla, Spanje

Copyright © 2021 Mancinelli, Vitiello, Donnini, Mantile, Palma, Luciano, Arra, Cerchia, Liguori en Fedele. Dit is een open-access artikel dat wordt verspreid onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License (CC BY). Gebruik, verspreiding of reproductie in andere fora is toegestaan, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur(s) en de auteursrechthebbende(n) worden vermeld en dat de oorspronkelijke publicatie in dit tijdschrift wordt geciteerd, in overeenstemming met de aanvaarde academische praktijk. Geen enkel gebruik, verspreiding of reproductie is toegestaan ​​die niet in overeenstemming is met deze voorwaarden.


Materialen en methodes

Dieren- en geneesmiddelenadministratie.

Alle muizen werden gehuisvest in de Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) Animal and Plant Care Facility, en de HKUST Animal Ethics Committee keurde alle dierproeven goed. Voor details over het genereren van muizen en het toedienen van medicijnen, zie: SI-bijlage, Methoden:.

Immunohistochemie en FISH.

We gebruikten antilichamen van α2-chimaerine, Tbr2, DCX, Nestin, BrdU, GFAP, Ki67, NeuN, actieve caspase-3, GFP, Ttr, Klotho en MCM2 voor immunokleuring. Voor details, zie SI-bijlage, Methoden:.

De sjablonen voor de synthese van riboprobes voor Ttr en Kl waren van volledige lengte Ttr cDNA en de 810 bp van het N-uiteinde van Kl cDNA, respectievelijk (46). Voor details, zie SI-bijlage, Methoden:.

De 10 × Genomics scRNA-Seq en Pathway-analyse.

We hebben scRNA-seq uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant (10 × Chromium Single Cell 3′ Reagent Kit, versie 2 10 × Genomics). Details voor de pseudotijd-analyse, GO-analyse, STRING-analyse en GSEA-analyse vindt u in SI-bijlage, Methoden:.

Virusinjectie, elektrofysiologie en gedragstests.

GFP tot expressie brengende retrovirussen werden bilateraal geïnjecteerd in de DG van WT- en α2-KO-muizen en hersensecties werden geanalyseerd bij 30 dpi. Voor details, zie SI-bijlage, Methoden:.

LTP werd geïnduceerd bij de afferenten van de mediale perforatieroutes en de meting werd ingesteld op de moleculaire laag van de DG met behulp van theta-burst-stimulatie (TBS). We hebben de omvang van LTP 60 minuten na TBS gemeten (SI-bijlage, Methoden:).

Alle gedragstests werden uitgevoerd op muizen 3-4 weken na TAM-injectie vanaf een leeftijd van 2 tot 3 maanden (Fig. 6NS). Voor details van elk gedragsexperiment, zie: SI-bijlage, Methoden:.

Kwantificering en statistische analyses.

Details voor kwantificering en statistische analyses zijn te vinden in: SI-bijlage, Methoden:.


Bekijk de video: Effectief leren? Zo doe je dat! (December 2021).