Informatie

Waarom is het x-snijpunt = -1/Km in de Lineweaver-Burk-plot?


Het nemen van de reciproke van beide zijden van de Michaelis-Menten-vergelijking levert de Lineweaver-Burk-vergelijking op:

$ dfrac{1}{V} = dfrac{K_m}{V_{max}}dfrac{1}{[S]}+ dfrac{1}{V_{max}} $

Als ik een $ dfrac{1}{V}$ vs. $dfrac{1}{[S]}$ grafiek plot, krijg ik te horen dat:

y-int $= dfrac{1}{V_{max}}$ en

x-int $= -dfrac{1}{K_m}$

Hoe zijn deze relaties afgeleid van de lineweaver-burk plot? Ik kan zien hoe het y-snijpunt gelijk kan zijn aan $dfrac{1}{V_{max}}$ als $dfrac{1}{[S]} = 0$, maar ik zie niet hoe x- int $= -dfrac{1}{K_m}$ door $dfrac{1}{V} = 0$ in te stellen? Kan iemand aantonen hoe deze relaties zijn afgeleid?


Stel $ dfrac{1}{V} = 0$ in en los op voor $dfrac{1}{[S]}$:

$ 0 = dfrac{K_m}{V_{max}}dfrac{1}{[S]}+ dfrac{1}{V_{max}} $

$ -dfrac{1}{V_{max}} = dfrac{K_m}{V_{max}}dfrac{1}{[S]}$

$ -1 = {K_m}dfrac{1}{[S]}$

$ -dfrac{1}{K_m} = dfrac{1}{[S]} = $ x-intercept


10.5: Enzymremming

Enzymen kunnen worden gereguleerd op manieren die hun activiteit bevorderen of verminderen. Er zijn veel verschillende soorten moleculen die de enzymfunctie remmen of bevorderen, en er bestaan ​​verschillende mechanismen om dit te doen. In sommige gevallen van enzymremming, bijvoorbeeld, is een remmermolecuul vergelijkbaar genoeg met een substraat dat het aan de actieve plaats kan binden en eenvoudig de binding van het substraat kan blokkeren. Wanneer dit gebeurt, wordt het enzym geremd door competitieve remming, omdat een remmermolecuul concurreert met het substraat voor binding aan de actieve plaats. Aan de andere kant, bij niet-competitieve remming, bindt een remmermolecuul aan het enzym op een andere locatie dan een allosterische plaats en slaagt het er nog steeds in om substraatbinding aan de actieve plaats te blokkeren.


Biochemie: enzymkinetiek en remming

De Michaelis-constante, , komt voor bij welke waarde op een enzymkinetiekgrafiek?

Er wordt niet genoeg informatie gegeven om te voorspellen

De Michaelis-constante, , is een veelgebruikte waarde in enzymkinetiek die wordt gebruikt om in wezen te beschrijven hoeveel substraat nodig is om een ​​reactie te versnellen. Meer specifiek is het de substraatconcentratie die nodig is om een ​​reactie te krijgen tot de helft ervan (het juiste antwoord is ). Het zelf wordt gegeven als een specifieke substraatconcentratie en om het te vinden, zou men een rechte lijn over een enzymkinetiekgrafiek trekken tot het bereiken van de curve. De substraatconcentratie die op dat punt wordt gevonden, is de .

Voorbeeldvraag #1 : Vmax en Km

Welke van deze zijn representaties van?

III. Y-snijpunt op een Lineweaver-Burk plot

Op een Lineweaver-Burk-plot vertegenwoordigt het Y-snijpunt echter . Het is het X-snijpunt dat kan worden afgeleid. Het X-snijpunt is gelijk aan .

Voorbeeldvraag #1 : Vmax en Km

Wanneer een enzym aanwezig is in de aanwezigheid van een competitieve remmer, welk van de volgende dingen gebeurt er dan met het enzym?

Competitieve remmers zullen de actieve plaats van het enzym blokkeren. De aanwezigheid van de competitieve remmer verhoogt de hoeveelheid substraat die nodig is om het enzym tot de helft van zijn maximale snelheid te krijgen. Hierdoor zal de van het enzym toenemen. Merk op dat een competitieve remmer de maximale snelheid van het enzym niet zal beïnvloeden.

Voorbeeldvraag #1: Snelheidsbeperkende stap

Wat is volgens Michaelis-Menton-kinetiek een kenmerk van de snelheidsbeperkende stap in de enzymkinetiek?

Het dissocieert het enzym-substraatcomplex in enzym + substraat

Het enzym-substraatcomplex wordt gevormd

Het is afhankelijk van activeringsenergie uit katalyse

Betreft geen katalysator

Het is afhankelijk van activeringsenergie van katalyse

Het enzym-substraatcomplex valt uiteen in enzym + product. De snelheidsbeperkende stap is het leveren van de activeringsenergie om in de overgangstoestand te komen, die sterk wordt verminderd door een enzym.

Voorbeeldvraag #2: Snelheidsbeperkende stap

Welke van de volgende beschrijft het beste de snelheidsbeperkende stap in een chemische reactie?

Het is de stap die de meeste energie vrijmaakt in de totale reactie

Het is de stap die de meeste energie verbruikt in de totale reactie

Het is de snelste stap in de algemene reactie

Het is altijd een anabole reactie

Het is de langzaamste stap van de algemene reactie

Het is de langzaamste stap van de algemene reactie

Hoewel chemische reacties meestal worden weergegeven in de vorm van een vergelijking, met reactanten aan de linkerkant en producten aan de rechterkant, zijn deze reacties geen eenvoudige conversie in één stap. Vaak zijn er verschillende individuele stappen die de reactanten doorlopen op hun weg om producten te worden. Dit wordt aangetoond door het mechanisme voor die specifieke reactie.

Bovendien is het bij het spreken over chemische reacties erg belangrijk om onderscheid te maken tussen twee concepten die soms met elkaar worden verward. De eerste betreft de kinetiek van de reactie, terwijl de tweede de thermodynamica betreft.

Chemische kinetiek houdt zich bezig met tijd. Als er een chemische reactie plaatsvindt, beantwoordt kinetiek de vraag hoe snel de reactie gaat. Thermodynamica daarentegen houdt zich niet bezig met tijd. Het maakt niet uit hoe snel of hoe langzaam een ​​reactie gaat. Het enige waar het om gaat is of een chemische reactie spontaan of niet-spontaan is. Om dit te beantwoorden, beschouwt de thermodynamica de energetische eigenschappen van een reactie.

Als we naar de antwoordkeuzes kijken, kunnen we er op basis van deze informatie meteen drie elimineren. De snelheidsbeperkende stap van een chemische reactie houdt zich niet bezig met hoeveel energie wordt vrijgemaakt of verbruikt. In plaats daarvan wordt de snelheidsbeperkende stap gedefinieerd als de langzaamste stap uit alle stappen die optreden voor een bepaalde chemische reactie. Met andere woorden, een reactie kan maar zo snel verlopen als de langzaamste stap, net zoals een ketting zo sterk is als zijn zwakste schakel. Verder kan de snelheidsbeperkende stap in een reactie anabool of katabool zijn.

Het is echter belangrijk op te merken dat er één component van energie is die de snelheid van een reactie beïnvloedt. Deze energie wordt de activeringsenergie, en het geeft weer hoeveel energie er in een reactie moet worden geïnvesteerd om die reactie te laten plaatsvinden. De reden waarom dit verschilt van thermodynamica, is echter omdat thermodynamica zich alleen bekommert om initiële en uiteindelijke energietoestanden, het maakt niet uit hoe een reactie van begin naar eind gaat, terwijl kinetiek dat wel doet. Hoewel de activeringsenergie voor een reactie kan veranderen (bijvoorbeeld via enzymen), heeft dit geen invloed op het begin- en eindenergieniveau.


DMCA-klacht

Als u van mening bent dat inhoud die beschikbaar is via de Website (zoals gedefinieerd in onze Servicevoorwaarden) een of meer van uw auteursrechten schendt, dient u ons hiervan op de hoogte te stellen door middel van een schriftelijke kennisgeving (“Inbreukmelding”) met de hieronder beschreven informatie aan de aangewezen onderstaande makelaar. Als Varsity Tutors actie onderneemt als reactie op een Kennisgeving van Inbreuk, zal het te goeder trouw proberen contact op te nemen met de partij die dergelijke inhoud beschikbaar heeft gesteld door middel van het meest recente e-mailadres, indien aanwezig, dat door een dergelijke partij aan Varsity Tutors is verstrekt.

Uw kennisgeving van inbreuk kan worden doorgestuurd naar de partij die de inhoud beschikbaar heeft gesteld of naar derden zoals ChillingEffects.org.

Houd er rekening mee dat u aansprakelijk bent voor schade (inclusief kosten en advocatenhonoraria) als u materieel een verkeerde voorstelling geeft van het feit dat een product of activiteit inbreuk maakt op uw auteursrechten. Als u er dus niet zeker van bent dat inhoud die zich op de Website bevindt of waarnaar wordt gelinkt door uw auteursrecht schendt, moet u overwegen eerst contact op te nemen met een advocaat.

Volg deze stappen om een ​​melding in te dienen:

U moet het volgende opnemen:

Een fysieke of elektronische handtekening van de eigenaar van het auteursrecht of een persoon die gemachtigd is om namens hen op te treden Een identificatie van het auteursrecht waarvan wordt beweerd dat het is geschonden Een beschrijving van de aard en exacte locatie van de inhoud waarvan u beweert dat het inbreuk maakt op uw auteursrecht, in voldoende detail om Varsity Tutors in staat te stellen die inhoud te vinden en positief te identificeren, we hebben bijvoorbeeld een link nodig naar de specifieke vraag (niet alleen de naam van de vraag) die de inhoud bevat en een beschrijving van welk specifiek deel van de vraag - een afbeelding, een link, de tekst, enz. - uw klacht verwijst naar uw naam, adres, telefoonnummer en e-mailadres en een verklaring van u: (a) dat u te goeder trouw gelooft dat het gebruik van de inhoud waarvan u beweert dat deze inbreuk maakt op uw auteursrecht, is niet door de wet is geautoriseerd, of door de eigenaar van het auteursrecht of diens vertegenwoordiger (b) dat alle informatie in uw Inbreukmelding juist is, en (c) op straffe van meineed, dat u ofwel de eigenaar van het auteursrecht of een persoon die gemachtigd is om namens hen op te treden.

Stuur uw klacht naar onze aangewezen agent op:

Charles Cohn Varsity Tutors LLC
101 S. Hanley Rd, Suite 300
St. Louis, MO 63105


Heterogene reacties

13.9 Echte kinetische parameters evalueren

De intrinsieke kinetiek van nulde-orde-, eerste-orde- en Michaelis-Menten-reacties wordt weergegeven door de parameters k0, k1, en vmax en Km. In het algemeen kan niet worden aangenomen dat de waarden van deze parameters voor en na immobilisatie van cellen of enzymen hetzelfde zullen zijn: tijdens het immobilisatieproces kunnen significante veranderingen worden aangebracht. Als voorbeeld toont figuur 13.20 Lineweaver –Burk plots ( Paragraaf 12.4.2 ) gratis en geïmmobiliseerd β-galactosidase-enzym. Volgens vgl. (12.43) , de hellingen en snijpunten van de lijnen in figuur 13.20 geven de waarden van . aan Km/vmax en 1/vmax, respectievelijk. Vergeleken met de resultaten die zijn getoond voor vrij enzym, geven de steilere hellingen en hogere intercepts die zijn verkregen voor het geïmmobiliseerde enzym aan dat immobilisatie de vmax dit is een veelvoorkomend resultaat. De waarde van Km kan ook worden beïnvloed [9] .

Afbeelding 13.20 . Lineweaver-Burk plot gratis en geïmmobiliseerd β-galactosidase. Enzymconcentraties in de gel zijn: 0,10 mg ml −1 (●) 0,17 mg ml −1 (□) en 0,50 mg ml 1 (■).

Gegevens van P.S. Bunting en K.J. Laidler, 1972, Kinetische studies over -galactosidase op vaste drager. Biochemie 11, 4477–4483.

Zoals beschreven in Paragraaf 12.3 en 12.4 Paragraaf 12.3 Paragraaf 12.4, kunnen kinetische parameters voor homogene reacties direct worden bepaald uit experimentele snelheidsgegevens. Het evalueren van de ware kinetische parameters van geïmmobiliseerde cellen en enzymen is echter iets moeilijker. De waargenomen reactiesnelheid is niet op alle punten in de massaoverdrachtsprocessen van de katalysator de werkelijke snelheid waarmee het werkelijke kinetische gedrag wordt 'gemaskeerd'. Overeenkomstig, vmax en Km voor geïmmobiliseerde katalysatoren kan niet worden geschat met behulp van de klassieke grafieken beschreven in paragraaf 12.4. Onder invloed van massaoverdracht geven deze plots geen rechte lijnen meer over het gehele bereik van substraatconcentratie [40, 41].

Zoals geïllustreerd in Afbeelding 13.20 voor β-galactosidase, Lineweaver-Burk-grafieken voor geïmmobiliseerde enzymen zijn niet-lineair. Vaak wordt in dergelijke plots de afwijking van lineariteit echter verdoezeld door de spreiding in echte experimentele gegevens en de vervorming van fouten als gevolg van de Lineweaver-Burk-linearisatie (paragraaf 12.4.2 en 3.3.4 paragraaf 12.4.2 paragraaf 3.3.4) . Bij lage substraatconcentraties (d.w.z. grote waarden van 1/s), lijkt de Lineweaver-Burk-plot lineair omdat de reactie bij benadering eerste-ordekinetiek vertoont. Bijgevolg kan de schijnbare lineariteit van Lineweaver-Burk of soortgelijke plots niet worden beschouwd als voldoende bewijs voor de afwezigheid van beperkingen voor massaoverdracht. Zelfs als we een van de geïmmobiliseerde enzymcurves in figuur 13.20 ten onrechte interpreteren als een rechte lijn en de schijnbare waarden van vmax en Km, kunnen we controleren of we de echte kinetische parameters hebben gevonden door de deeltjesstraal en substraatconcentratie over een breed scala aan waarden te veranderen. Echte kinetische parameters van het enzym variëren niet met deze omstandigheden die de massaoverdracht naar de katalysator beïnvloeden. Daarom, als de helling en/of interceptie verandert met de Thiele-modulus, zoals aangegeven in figuur 13.20, is het snel duidelijk dat het systeem onderhevig is aan diffusiebeperkingen. Studies hebben aangetoond dat de effecten van diffusie meer uitgesproken zijn in Eadie-Hofstee-plots dan in Lineweaver-Burk- of Langmuir-plots, maar alle drie voor geïmmobiliseerde enzymen kunnen worden benaderd door rechte lijnen over bepaalde intervallen.

Hoewel de Lineweaver-Burk plots voor geïmmobiliseerde β-galactosidase niet-lineair zijn in figuur 13.20, mogen we niet concluderen dat het geïmmobiliseerde enzym niet voldoet aan de Michaelis-Menten-kinetiek. De kinetische vorm van reacties blijft over het algemeen behouden na immobilisatie van cellen en enzymen [9]. De niet-lineariteit van de Lineweaver-Burk-plots is in plaats daarvan te wijten aan het effect van massaoverdracht op de gemeten reactiesnelheid.

Er zijn verschillende methoden voorgesteld om te bepalen: vmax en Km in heterogene katalysatoren [40-43]. De meest rechttoe rechtaan benadering is experimenteel: het omvat het verminderen van de deeltjesgrootte en katalysatorbelading en het verhogen van de externe vloeistofsnelheid om alle weerstanden tegen massaoverdracht te elimineren. De gemeten snelheidsgegevens kunnen vervolgens worden geanalyseerd op kinetische parameters alsof de reactie homogeen was. Omdat het echter meestal erg moeilijk of onmogelijk is om massaoverdrachtseffecten binnen de deeltjes volledig te verwijderen, zijn er ook procedures voorgesteld die een reeks experimenten omvatten in combinatie met theoretische analyse. Bij deze methoden worden snelheidsgegevens verzameld bij hoge en lage substraatconcentraties met verschillende deeltjesgroottes. Bij hoge substraatniveaus wordt aangenomen dat de reactie nulde orde is met ηl=1 bij lage substraatconcentraties wordt uitgegaan van eerste-orde kinetiek. Deze veronderstellingen vereenvoudigen de analyse, maar zijn mogelijk niet altijd geldig.

Als er voldoende computerfaciliteiten beschikbaar zijn, kunnen echte waarden van vmax en Km kan worden geëxtraheerd uit diffusiegelimiteerde gegevens met behulp van iteratieve berekeningen op basis van numerieke integratie en niet-lineaire regressie [7, 9]. Er kunnen veel iteratielussen nodig zijn voordat convergentie naar de uiteindelijke parameterwaarden plaatsvindt.


Waarom is het x-snijpunt = -1/Km in de Lineweaver-Burk-plot? - Biologie

Vraag : 21) Gemengde type remmers zullen de ________ van een : 2008157 . beïnvloeden

21) Gemengde remmers zullen de ________ van een enzymatische reactie beïnvloeden.

22) Het type remmer dat bindt aan het enzym (E) maar niet aan het enzym-substraat (ES)-complex is een (n) ________ remmer.

23) Welke van de volgende is? niet geldt voor de enzym-substraat interactie?

A) Veel enzymen zijn extreem specifiek met betrekking tot een substraat.

B) Veel enzymen kunnen een stereo-isomeer van hun substraat niet herkennen.

C) Sommige enzymen accepteren elk van een hele groep substraten.

D) Carboxypeptidase herkent elk van de aminozuren van het carboxyluiteinde van een polypeptide.

E) Cellen zijn vaak in staat om metabolische activiteit uit te voeren met slechts een handvol enzymen.

A) werd voorgesteld door Hans Buchner.

B) omvat een conformationele verandering in de vorm van het enzym.

C) wordt ook wel het lock-and-key-model genoemd.

D) stelt dat enzym-substraat interacties rigide zijn.

E) stelt voor dat zeer sterke covalente bindingen worden gevormd bij substraatbinding.

25) Waarom is de Lineweaver'8212Burk-plot belangrijk in de enzymkinetiek?

A) Het is een single-reciproke plot.

B) Het illustreert de enzymspecificiteit.

C) Het onthult de aanwezigheid van prothetische groepen in enzymen.

D) Het maakt het gemakkelijker om te bepalen: V maximaal

26) De Michaelis-constante

A) kan worden bepaald met behulp van de Lineweaver'8212Burk-plot.

B) is gelijk aan tweemaal de V maximaal

C) is gelijk aan de substraatconcentratie bij V maximaal /2.

27) Welke van de volgende beschrijft de Lineweaver's8212Burk-plot nauwkeurig?

A) Het is een dubbel-reciproke plot.

B) De ja onderscheppen is gelijk aan 1/ V maximaal

C) De x onderscheppen is -1/ K m .

E) De helling is hetzelfde als het perceel van Eadie'8212Hofstee.

28) Welke van de volgende variabelen maakt deel uit van de Michaelis'8212Menten-vergelijking?

29) Verzadiging kan worden gedefinieerd als:

A) denaturatie van een enzym.

B) het onvermogen om de reactiesnelheid te verhogen tot voorbij een eindige bovengrens.

C) remming van de enzymfunctie door de actieve plaats te blokkeren.

D) de substraatconcentratie waarbij de snelheid de halve maximale snelheid bereikt.


Waarom is het x-snijpunt = -1/Km in de Lineweaver-Burk-plot? - Biologie

Ons huidige hoofdstuk richtte zich op de manier waarop cellen in staat zijn om de voor het leven noodzakelijke reacties uit te voeren. We begonnen met een bespreking van de soorten enzymen die u waarschijnlijk zult tegenkomen op de testdag voordat we de thermodynamica en kinetiek bekijken in relatie tot enzymen, die biologische katalysatoren zijn. We gingen verder met het bespreken van de analyse van kinetische gegevens met twee verschillende soorten grafieken en spraken over coöperativiteit. Omdat katalysatoren over het algemeen het meest actief zijn in hun natuurlijke omgeving, hebben we gekeken naar de invloed van temperatuur, pH en zoutgehalte op hun activiteit. Al deze zullen waarschijnlijk op Test Day verschijnen.

Enzymen moeten worden gereguleerd. We hebben de basisprincipes van feedbackmechanismen geanalyseerd. We hadden het over remmers van enzymen, die omkeerbaar of onomkeerbaar kunnen zijn. Het verschil tussen de soorten omkeerbare remming is een belangrijk Test Day-concept. Ten slotte bespraken we veranderingen in enzymactiviteit die allosterische activering, covalente modificatie of splitsing van inactieve zymogenen kunnen omvatten. Laten we nu verder gaan om de niet-enzymatische functies van eiwitten te bespreken. Je zult veel parallellen zien tussen het nieuwe materiaal en de concepten die in dit hoofdstuk worden beschreven, zoals bindingsaffiniteit. Aan het einde van het volgende hoofdstuk ben je klaar om elke eiwitvraag te beantwoorden die de MCAT je kan stellen!

Conceptsamenvatting

Enzymen als biologische katalysatoren

·&emspEnzymen zijn biologische katalysatoren die onveranderd blijven door de reacties die ze katalyseren en herbruikbaar zijn.

·&emspElk enzym katalyseert een enkele reactie of type reactie met hoge specificiteit.

O Oxidoreductasen katalyseren oxidatie-reductiereacties waarbij elektronen worden overgedragen.

O Overdrachten een functionele groep van het ene molecuul naar het andere molecuul verplaatsen.

O Hydrolasen katalyseren splitsing door toevoeging van water.

O Lyases splitsing katalyseren zonder toevoeging van water en zonder de overdracht van elektronen. De omgekeerde reactie (synthese) is biologisch vaak belangrijker.

O Isomerasen katalyseren de onderlinge omzetting van isomeren, waaronder zowel constitutionele isomeren als stereo-isomeren.

O ligasen zijn verantwoordelijk voor het verbinden van twee grote biomoleculen, vaak van hetzelfde type.

·&emspExergonische reacties energie vrijmaken &DeltaG is negatief.

·&emspEnzymen verlagen de activeringsenergie die nodig is voor biologische reacties.

·&emspEnzymen veranderen de vrije energie niet (&DeltaG) of enthalpie (&DeltaH) verandering die de reactie vergezelt, noch de uiteindelijke evenwichtspositie, ze veranderen de snelheid (kinetiek) waarmee het evenwicht wordt bereikt.

Mechanismen van enzymactiviteit

·&emspEnzymen werken door de overgangstoestand te stabiliseren, een gunstige micro-omgeving te bieden of door binding met de substraatmoleculen.

·&emspEnzymen hebben een actieve site, dat is de plaats van katalyse.

·&emspDe binding aan de actieve site wordt verklaard door de slot en sleutel theorie of de geïnduceerd fit model.

o De slot- en sleuteltheorie veronderstelt dat het enzym en het substraat precies complementair zijn.

o Het model met geïnduceerde fit veronderstelt dat het enzym en het substraat conformationele veranderingen ondergaan om volledig te interageren.

·&emspSommige enzymen hebben metaalkationen nodig cofactoren of kleine biologische co-enzymen aktief zijn.

Enzymkinetiek

·&emspEnzymen-ervaring verzadigingskinetiek: naarmate de substraatconcentratie toeneemt, doet de reactiesnelheid dat ook totdat een maximale waarde is bereikt.

·&emspMichaelis–Menten en Lineweaver–Burk grafieken stellen deze relatie voor als respectievelijk een hyperbool en lijn.

·&emspEnzymen kunnen worden vergeleken op basis van hun Km en vmax waarden.

·&emspCoöperatieve enzymen vertonen een sigmoïdale curve vanwege de verandering in activiteit met substraatbinding.

Effecten van lokale omstandigheden op enzymactiviteit

·&emspTemperatuur en pH beïnvloeden de activiteit van een enzym in vivo veranderingen in temperatuur en pH kunnen leiden tot denaturering van het enzym en verlies van activiteit als gevolg van verlies van secundaire, tertiaire of, indien aanwezig, quaternaire structuur.

·&emspIn vitrokan het zoutgehalte de werking van enzymen beïnvloeden.

Regulering van enzymactiviteit

·&emspEnzymroutes zijn sterk gereguleerd en onderhevig aan remming en activering.

·&emspFeedbackremming is een regulerend mechanisme waarbij de katalytische activiteit van een enzym wordt geremd door de aanwezigheid van hoge niveaus van een product later in dezelfde route.

·&emspOmkeerbare remming wordt gekenmerkt door het vermogen om de remmer te vervangen door een verbinding met een grotere affiniteit of deze te verwijderen met behulp van een milde laboratoriumbehandeling.

O Competitieve remming resultaten wanneer de remmer vergelijkbaar is met het substraat en bindt op de actieve plaats. Competitieve remming kan worden overwonnen door meer substraat toe te voegen. vmax is onveranderd, Km neemt toe.

O Niet-competitieve remming ontstaat wanneer de remmer met gelijke affiniteit bindt aan het enzym en het enzym-substraatcomplex. vmax is afgenomen, Km onveranderd is.

O Gemengde remming ontstaat wanneer de remmer met ongelijke affiniteit bindt aan het enzym en het enzym-substraatcomplex. vmax is afgenomen, Km wordt verhoogd of verlaagd, afhankelijk van of de remmer een hogere affiniteit heeft voor het enzym of het enzym-substraatcomplex.

O Niet-competitieve remming ontstaat wanneer de remmer alleen bindt met het enzym-substraatcomplex. Km en vmax beide afnemen.

·&emspOnomkeerbare remming verandert het enzym zodanig dat de actieve plaats voor langere tijd niet beschikbaar is of permanent nieuwe enzymmoleculen moeten worden gesynthetiseerd om de reactie opnieuw te laten plaatsvinden.

·&emspRegulerende enzymen kunnen zowel activering als remming ervaren.

O allosterisch plaatsen kunnen worden ingenomen door activatoren die ofwel de affiniteit ofwel de enzymatische omzet verhogen.

O Fosforylering (covalente modificatie met fosfaat) of glycosylering (covalente modificatie met koolhydraten) kan de activiteit of selectiviteit van enzymen veranderen.

O Zymogenen worden uitgescheiden in een inactieve vorm en worden geactiveerd door splitsing.

Antwoorden op conceptchecks

1. Katalysatoren worden gekenmerkt door twee hoofdeigenschappen: ze verminderen de activeringsenergie van een reactie, waardoor de reactie wordt versneld, en ze worden niet verbruikt tijdens de reactie. Enzymen verbeteren de omgeving waarin een bepaalde reactie plaatsvindt, waardoor de activeringsenergie wordt verlaagd. Ze worden ook geregenereerd aan het einde van de reactie tot hun oorspronkelijke vorm.

2. Enzymspecificiteit verwijst naar het idee dat een bepaald enzym alleen een bepaalde reactie of type reactie zal katalyseren. Bijvoorbeeld, serine/threonine-specifieke proteïnekinasen zal alleen een fosfaatgroep op de hydroxylgroep van een serine- of threonineresidu plaatsen.

Additie- of synthesereacties, meestal tussen grote moleculen, vereisen vaak ATP

Herschikking van bindingen binnen een verbinding

Splitsing van een enkel molecuul in twee producten, of synthese van kleine organische moleculen

Breken van een verbinding in twee moleculen door toevoeging van water

oxidoreductase

Oxidatie-reductiereacties (overdracht van elektronen)

Transferase

Verplaatsing van een functionele groep van het ene molecuul naar het andere

4. Enzymen hebben geen effect op de algemene thermodynamica van de reactie, ze hebben geen effect op de &DeltaG of &DeltaH van de reactie, hoewel ze wel de energie van de overgangstoestand verlagen, waardoor de activeringsenergie wordt verlaagd. Enzymen hebben echter een diepgaand effect op de kinetiek van een reactie. Door de activeringsenergie te verlagen, kan er sneller een evenwicht worden bereikt (hoewel de evenwichtspositie niet verandert).

Slot en sleutel

Geïnduceerde Fit

·&emspActieve plaats van enzym past precies rond substraat

·&emspGeen wijzigingen in de tertiaire of quaternaire structuur van het enzym

·&emspActieve plaats van enzym vormt zich alleen rond substraat als er substraat aanwezig is

·&emspTertiaire en quaternaire structuur is aangepast om het enzym te laten functioneren

2. Cofactoren en co-enzymen werken beide als activatoren van enzymen. Cofactoren zijn meestal anorganisch (mineralen), terwijl co-enzymen meestal kleine organische verbindingen (vitamines) zijn. In beide gevallen induceren deze regulatoren een conformationele verandering in het enzym die de activiteit ervan bevordert. Nauw gebonden cofactoren of co-enzymen die nodig zijn voor de enzymfunctie, worden prosthetische groepen genoemd.

1. Het verhogen van [S] heeft verschillende effecten, afhankelijk van hoeveel substraat er om te beginnen aanwezig is. Wanneer de substraatconcentratie laag is, veroorzaakt een toename van [S] een evenredige toename van de enzymactiviteit. Bij hoge [S] echter, wanneer het enzym verzadigd is, heeft het verhogen van [S] geen effect op de activiteit omdat vmax is al bereikt.
Verhogen [E] zal altijd toenemen vmax, ongeacht de beginconcentratie van het enzym.

2. Zowel de Michaelis-Menten- als de Lineweaver-Burk-relaties verklaren de waarden van Km en vmax onder verschillende omstandigheden. Ze bieden beide een eenvoudige grafische interpretatie van deze twee variabelen en zijn afgeleid van de Michaelis-Menten-vergelijking. De assen van deze grafieken en de visuele weergave van deze informatie verschillen echter tussen de twee. Het Michaelis-Menten-plot is: v vs. [S], die een hyperbolische curve creëert voor monomere enzymen. De Lineweaver-Burk plot, aan de andere kant, is vs. , waardoor een rechte lijn ontstaat.

3. Km is een maat voor de affiniteit van een enzym voor zijn substraat en wordt gedefinieerd als de substraatconcentratie wanneer een enzym op de helft van zijn maximale snelheid functioneert. Als Km neemt toe, neemt de affiniteit van een enzym voor zijn substraat af.

4. De x-onderscheppen vertegenwoordigt de ja-onderscheppen vertegenwoordigt .

5. Coöperativiteit verwijst naar de interacties tussen subeenheden in een enzym of eiwit met meerdere subeenheden. De binding van substraat aan één subeenheid induceert een verandering in de andere subeenheden van de T (gespannen) toestand naar de R (ontspannen) toestand, wat de binding van substraat aan de andere subeenheden bevordert. In de omgekeerde richting induceert het loskoppelen van substraat van één subeenheid een verandering van R naar T in de resterende subeenheden, waardoor de binding van substraat van de resterende subeenheden wordt bevorderd.

1. Naarmate de temperatuur stijgt, neemt de enzymactiviteit in het algemeen toe (ongeveer elke 10°C een verdubbeling). Boven lichaamstemperatuur neemt de enzymactiviteit echter snel af naarmate het enzym denatureert.
Enzymen zijn maximaal actief binnen een klein pH-bereik buiten dit bereik, de activiteit neemt snel af bij veranderingen in pH als de ionisatie van de actieve plaats verandert en het eiwit wordt gedenatureerd.
Veranderingen in het zoutgehalte kunnen bindingen binnen een enzym verstoren, waardoor de tertiaire en quaternaire structuur wordt verstoord, wat leidt tot verlies van de enzymfunctie.

2. Ideale temperatuur: 37°C = 98,6°F = 310 K

De ideale pH voor de meeste enzymen is 7,4 voor maagenzymen, ongeveer 2 voor pancreasenzymen, ongeveer 8,5.

1. Feedbackremming verwijst naar het product van een enzymatisch pad dat enzymen verder terug in datzelfde pad uitschakelt. Dit helpt de homeostase in stand te houden: naarmate de productniveaus stijgen, wordt het pad dat dat product creëert op de juiste manier gedownreguleerd.

2. De vier soorten remmers zijn: competitief, niet-competitief, gemengd en niet-competitief.

3. Onomkeerbare remming verwijst naar de langdurige of permanente inactivatie van een enzym, zodat het niet gemakkelijk kan worden gerenatureerd om weer in functie te komen.

4. Voorbeelden van tijdelijke modificaties zijn onder meer allosterische activering of remming. Voorbeelden van covalente modificaties omvatten fosforylering en glycosylering.

5. Zymogenen zijn voorlopers van een actief enzym. Het is van cruciaal belang dat bepaalde enzymen (zoals de spijsverteringsenzymen van de pancreas) inactief blijven totdat ze op hun doellocatie zijn aangekomen.

Vergelijkingen om te onthouden

(2.1) Michaelis–Menten tarieven:

(2.2) Michaelis-Menten vergelijking:

Gedeelde concepten

·&emspBiochemie Hoofdstuk 1

o Aminozuren, peptiden en eiwitten

·&emspBiochemie Hoofdstuk 12

o Bio-energetica en regulatie van het metabolisme

·&emspBiologie Hoofdstuk 9

·&emspAlgemene scheikunde Hoofdstuk 5

·&emspAlgemene scheikunde Hoofdstuk 7

·&emspAlgemene scheikunde Hoofdstuk 11

o Oxidatie-reductiereacties

Als u de auteursrechthebbende bent van materiaal op onze site en van plan bent dit te verwijderen, neem dan contact op met onze sitebeheerder voor goedkeuring.


Waarom is het x-snijpunt = -1/Km in de Lineweaver-Burk-plot? - Biologie

Welke van deze wordt verwacht als de gemiddelde temperatuur op aarde stijgt?

Beantwoord de vraag in de afbeelding.

scharnier produceert gevlagde sporen Antwoord 1 Kiezen. onderdeel van schimmelcelwand Antwoord 2 Kies. partnerschap tussen een schimmel en fotosynthetische cellen Antwoord 3 Kies. filament van mycelium Antwoord 4 Kies. eencellige schimmel Antwoord 5 Kies. broodvorm is een voorbeeld Antwoord 6 Kies. schimmel-wortel partnerschap Antwoord 7 Kies. veel vormen paddenstoelen

Matching levert gevlagde sporen op. Antwoord 1 Kiezen. onderdeel van schimmelcelwand Antwoord 2 Kies. partnerschap tussen een schimmel en fotosynthetische cellen Antwoord 3 Kies. filament van mycelium Antwoord 4 Kies. eencellige schimmel Antwoord 5 Kies. broodvorm is een voorbeeld Antwoord 6 Kies. schimmel-wortel partnerschap Antwoord 7 Kies. veel vormen paddenstoelen

https://watermarkonline.com/advert/live-man-city-vs-psg-live-stream-uefa-champions-league-semi-final-watch-online-tv-channel/ https://www.ghanaembassy. ru/advert/stream-paris-saint-germain-vs-man-city-live-stream-free-acf/ https://legalaffairs.ucr.edu/sites/g/files/rcwecm1466/files/2021-04/ Man%20City%20vs%20Paris%20Saint-Germain%20Live%20Stream.pdf https://legalaffairs.ucr.edu/sites/g/files/rcwecm1466/files/2021-04/PSG%20vs%20Man%20City%20Live %20Stream.pdf

https://legalaffairs.ucr.edu/sites/g/files/rcwecm1466/files/2021-04/Mortal-Kombat-2021-Movie-Online-Full.pdf https://www.ghanaembassy.ru/advert/watchfree -psg-vs-man-city-live-stream-uefa-champions-league-semi-finals-2021-watch-online-on-tv/ https://legalaffairs.ucr.edu/sites/g/files/rcwecm1466 /files/2021-04/Mortal-Kombat-2021-Movie-Online-Full.pdf https://www.ghanaembassy.ru/advert/watchfree-psg-vs-man-city-live-stream-uefa-champions- competitie-halve finales-2021-watch-online-on-tv/ https://legalaffairs.ucr.edu/sites/g/files/rcwecm1466/files/2021-04/Mortal-Kombat-2021-Movie-Online- Full.pdf https://www.ghanaembassy.ru/advert/watchfree-psg-vs-man-city-live-stream-uefa-champions-league-semi-finals-2021-watch-online-on-tv/

Mortal Kombat 2021 volledige film bekijk nu: https://putlockershd.org/en/movie/460465/mortal-kombat Gewassen MMA-vechter Cole Young, zich niet bewust van zijn afkomst, en opgejaagd door de beste krijger van keizer Shang Tsung, Sub -Nul, zoekt en traint met de grootste kampioenen van de aarde terwijl hij zich voorbereidt om het op te nemen tegen de vijanden van Outworld in een strijd met hoge inzet om het universum. Uitgebracht: 2021-04-07 Looptijd: 110 minuten Genre: Fantasie, Actie, Avontuur, Science Fiction, Thriller Sterren: Lewis Tan, Jessica McNamee, Josh Lawson, Tadanobu Asano, Mehcad Brooks Regisseur: James Wan, Benjamin Wallfisch, Dan Lebental, Todd Garner, Naäman Marshall

filmupdate mei 2021 mei 2021 Films: Wrath of Man • Here Today • Spiral: From the Book of Saw • A Quiet Place Part II • Cruella • The Human Factor • Profiel, films komen in mei. Het volgende is een one-stop-locatie voor alle films om naar uit te kijken in 2021 en wanneer ze te verwachten. Natuurlijk, zoals we nu allemaal gewend zouden moeten zijn, zijn data onderhevig aan verandering, dus kom zeker terug voor verschuivingen in het schema. Genieten van! aanbevolen site: https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=6c2c59de-3648-4063-a034-e8cff4bbdf1f https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=16bb8ec2- a192-43cc-81a2-1ed377c2b649 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=1151c99f-2f95-46a8-bdd8-0410d6862cc3 https://connect.informs.org/network/members/profile? UserKey=912d4929-73b6-4c38-a151-45ed3703bd32 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=210346ea-1569-42c6-a085-bd4484bd0543 https://connect.informs.org/network/ leden/profile?UserKey=2b731e2d-6bff-429a-a244-4d4d0f85a618 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=f8ada4d3-cfbb-4551-a00d-4231a50cde4d https://connect.informs. org/network/members/profile?UserKey=822e0277-7aac-4646-849f-fcbf0cd667b6 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=e0429956-f03a-4e0d-9c38-94dcc92f476b https:// connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=89fc15a2-63dd-4b3a-bb0a-b362acec59e3 https://conn ect.informs.org/network/members/profile?UserKey=dcf3dcac-9188-4adb-ada9-f0b63c87fa12 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=a4178d4e-3975-4777-a938-b8976bf2c15e https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=6cb9a3e8-1c92-4730-9337-e5a3d4f56b71 https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=b4500502-207d-4fcc -82cd-2a5f00b8fddd https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=2fb2227c-62cc-47de-917d-02db5508293d https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=e29dc7e2 -c81a-4796-af2a-1e2767bed12a https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=e05b2e64-05b2-4c76-94ee-ca4698755a88 https://connect.informs.org/network/members/profile ?UserKey=0ee0e91e-3fc1-4c25-8c27-feafc9f467db https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=a7718e4e-807a-4d90-ad7f-b883c6bfdcd7 https://connect.informs.org/network/members.org/ /members/profile?UserKey=8a292769-6347-41be-b483-eb64919b8ca8 https://volunteer.alz.org/network/members/ profiel?UserKey=35cd0e7d-c38f-416c-931a-41224d55f72c https://vrip.unmsm.edu.pe/foro-vrip/profile/hvsdghds/ https://community.afpglobal.org/network/members/profile?UserKey =23a184ef-8bc7-4ef9-8c1e-73c80d467e65 https://community.afpglobal.org/network/members/profile?UserKey=96b868c3-999f-4e78-b7eb-6aafc567093d https://community.afpglobal.org/network/members /profile?UserKey=db7ac908-f911-47a4-bd10-ce0a595890fa https://community.afpglobal.org/network/members/profile?UserKey=7df33d7b-d8b1-46c2-a0bf-29d323c4fd9d https://connect.informs.orgconnect.informs. /network/members/profile?UserKey=b6baee9e-37a0-455b-9a9f-370f605f777b https://connect.informs.org/network/members/profile?UserKey=d891d4b4-ae89-40f1-9664-d40c95594c1a http://paste .jp/9bc0426d/ https://slexy.org/view/s21WvhFTV5 https://pastebin.com/iKX5BN9C https://pasteio.com/xlb9MOCQr7Cr https://paste.in/ei93EI https://jsfiddle.net /berlinm821/ojt20f7u/2/ https://pastelink.net/2ucpm https://paiza.io/projects/hB6o7e_Q6dMCcjYDZcUiww http://www.mpaste.com/p/sAa FRuS https://telegra.ph/movie-update-may-2021-04-27 https://p.ip.fi/M4fO https://penzu.com/p/c67089c1 https://onlinegdb.com/ rJ5Ook8Pu https://justpaste.it/8drs7 https://dpaste.com/CRZMPUWJ4 https://paste.feed-the-beast.com/view/7313cf08 https://paste.ubuntu.com/p/GrYWgDhyxc/ https://paste.firnsy.com/paste/0sMc4O2HcWW https://0paste.com/245320 https://rentry.co/emthk https://friendpaste.com/7Tl1x5y76wYuFsnWDlnA9h https://paste.rs/dPc https ://paste.laravel.io/8981a0c9-c46c-49c5-b1e8-d97b434c8204 https://www.mydigoo.com/forums-topicdetail-266611.html https://authors.curseforge.com/paste/ddbe8302 http: //network-marketing.ning.com/profiles/blogs/movie-update-may-2021 https://www.unphp.net/decode/2e3e95933979537628df815efc68e2cf/ http://paste4btc.com/0nKEicI6 https://paste. artemix.org/-/9taQ4

https://personaljournal.ca/delonse/movie-update-may-2021 https://paste.tbee-clan.de/cqkjf# https://peatix.com/group/10597464 https://read.cash/ @sfsdfsdfdfdf/movie-update-may-2021-21234259 https://www.mychemicalromance.com/news/movie-update-may-2021-3720041 https://newsgfheyy.cookpad-blog.jp/articles/592503 https: //note.com/vffdeefef/n/n9a3be1d3bea6 https://teletype.in/@gfdgfgfdgfd/Jvr-kEozw https://dferfsds.sellfy.store/p/movie-update-may-2021/ https://www .furaffinity.net/journal/9856346/ https://lu.ma/28y2kqs9 https://www.tunwalai.com/v2/story/543226?wt=1 Het lijkt erop dat Hollywood het erg druk gaat krijgen met 2021 films die naar de bioscoop komen. Met een ongoddelijke hoeveelheid stripboekfilms van zowel Marvel als DC tot de nieuwe Fast and Furious-film, zit het volgende kalenderjaar boordevol enkele van de langverwachte releases die ooit zullen worden aangekondigd. Dat is gedeeltelijk te wijten aan het feit dat veel van deze films oorspronkelijk gepland waren voor een eerdere release, of maanden geleden uit hadden moeten komen.

https://www.bigmarker.com/watchuefa/Live-PSG-vs-Man-City-Live-Stream-Free-UEFA-Reddit-Online-TV https://www.bigmarker.com/watchuefa/PSG-vs -Man-City-Live-Stream-Free-UEFA-Reddit-Online-TV https://www.bigmarker.com/watchuefa/PSG-vs-Manchester-City-Live-Stream-Free-UEFA-Reddit-Online- TV https://www.bigmarker.com/watchuefa/How-to-Stream-Manchester-City-vs-PSG-Live-Free-Stream-UEFA-Reddit-Online

. Een enkel geel mannetje paarde met verschillende wildtype (agouti) vrouwtjes. In totaal leverde de paring 40 nakomelingen op, 22 met agouti-vacht en 18 met gele vacht. De agouti F1-muizen werden met elkaar gekruist en produceerden alle agouti-muizen in de F2. Evenzo werden de gele F1-dieren met elkaar gekruist, maar hun F2-nakomelingen scheidden zich in twee klassen: 30 waren agouti en 54 waren geel. Wat is het overervingspatroon van vachtkleur bij deze muizen? Gebruik ?2 om te testen of de fenotypes in de F2 passen in de verwachte Mendeliaanse ratio.


Waarom is het x-snijpunt = -1/Km in de Lineweaver-Burk-plot? - Biologie

Peter J. Kennelly, PhD & Victor W. Rodwell, PhD

Na bestudering van dit hoofdstuk zou je in staat moeten zijn om:

Beschrijf de reikwijdte en het algemene doel van de studie van enzymkinetiek.

Geef aan of &DeltaG, de algehele verandering in vrije energie voor een reactie, is afhankelijk van het reactiemechanisme.

Geef aan of &DeltaG is een functie van de tarieven van reacties.

Leg de relatie uit tussen Kgelijk aan, concentraties van substraten en producten in evenwicht, en de verhouding van de snelheidsconstanten k1/k–1.

Geef aan hoe temperatuur en de concentratie van waterstofionen, enzym en substraat de snelheid van een door enzym gekatalyseerde reactie beïnvloeden.

Geef aan waarom laboratoriummetingen van de snelheid van een enzym-gekatalyseerde reactie typisch gebruik maken van initiële snelheidsvoorwaarden.

Beschrijf de toepassing van lineaire vormen van de Michaelis-Menten-vergelijking voor de bepaling van Km en Vmax.

Geef één reden waarom een ​​lineaire vorm van de Hill-vergelijking wordt gebruikt om de substraatbindende kinetiek van sommige multimere enzymen te evalueren.

Vergelijk de effecten van een toenemende concentratie van substraat op de kinetiek van eenvoudige competitieve en niet-competitieve remming.

Beschrijf de manieren waarop substraten bijdragen aan en producten afwijken van een enzym dat een pingpongmechanisme volgt en hetzelfde doen voor een enzym dat een snel-evenwichtsmechanisme volgt.

Illustreer het nut van enzymkinetiek bij het vaststellen van het werkingsmechanisme van geneesmiddelen.

BIOMEDISCH BELANG

Enzymkinetiek is het gebied van de biochemie dat zich bezighoudt met de kwantitatieve meting van de snelheden van door enzymen gekatalyseerde reacties en de systematische studie van factoren die deze snelheden beïnvloeden. Kinetische analyse kan het aantal en de volgorde van de afzonderlijke stappen onthullen waarmee enzymen substraten in producten omzetten. Samen met plaatsgerichte mutagenese en andere technieken die de eiwitstructuur onderzoeken, kunnen kinetische analyses details onthullen van het katalytische mechanisme van een bepaald enzym.

Een complete, uitgebalanceerde set van enzymactiviteiten is van fundamenteel belang voor het handhaven van de homeostase. Een goed begrip van de enzymkinetiek is dus belangrijk om te begrijpen hoe fysiologische spanningen zoals anoxie, metabole acidose of alkalose, toxines en farmacologische middelen dat evenwicht beïnvloeden. De betrokkenheid van enzymen bij vrijwel alle fysiologische processen maakt ze het doelwit bij uitstek voor geneesmiddelen die ziekten bij de mens genezen of verlichten. Toegepaste enzymkinetiek is het belangrijkste instrument waarmee wetenschappers therapeutische middelen identificeren en karakteriseren die selectief de snelheid van specifieke door enzymen gekatalyseerde processen remmen. Enzymkinetiek speelt dus een centrale en cruciale rol bij het ontdekken van geneesmiddelen en vergelijkende farmacodynamiek, evenals bij het ophelderen van het werkingsmechanisme van geneesmiddelen.

CHEMISCHE REACTIES WORDEN BESCHREVEN MET BEHULP VAN EVENWICHTIGE VERGELIJKINGEN

EEN evenwichtige chemische vergelijking somt de aanvankelijk aanwezige chemische soorten (substraten) en de nieuwe chemische soorten (producten) op die voor een bepaalde chemische reactie zijn gevormd, allemaal in de juiste verhoudingen of stoïchiometrie. Bijvoorbeeld gebalanceerde vergelijking (1) beschrijft de reactie van één molecuul elk van substraten A en B om één molecuul elk van producten P en Q te vormen:

De dubbele pijlen geven omkeerbaarheid aan, een intrinsieke eigenschap van alle chemische reacties. Dus voor reactie (1), als A en B P en Q kunnen vormen, dan kunnen P en Q ook A en B vormen. De aanduiding van een bepaalde reactant als een "substraat" of "product" is daarom enigszins willekeurig omdat de producten voor een reactie in één richting zijn de substraten voor de omgekeerde reactie. De term "producten" wordt echter vaak gebruikt om de reactanten aan te duiden waarvan de vorming thermodynamisch de voorkeur heeft. Reacties waarvoor thermodynamische factoren sterk de vorming van de producten bevorderen waarbij de pijlpunten vaak worden weergegeven met een enkele pijl alsof ze "onomkeerbaar" zijn:

Unidirectionele pijlen worden ook gebruikt om reacties in levende cellen te beschrijven waar de reactieproducten (2) worden onmiddellijk verbruikt door een daaropvolgende enzym-gekatalyseerde reactie. De snelle verwijdering van product P of Q sluit daarom effectief het optreden van de omgekeerde reactie uit, waardoor vergelijking (2) functioneel onomkeerbaar onder fysiologische omstandigheden.

VERANDERINGEN IN VRIJE ENERGIE BEPALEN DE RICHTING & EVENTUELE STAAT VAN CHEMISCHE REACTIES

De Gibbs gratis energieverandering &DeltaG (ook wel vrije energie of Gibbs-energie genoemd) beschrijft zowel de richting waarin een chemische reactie zal plaatsvinden en de concentraties van reactanten en producten die bij evenwicht aanwezig zullen zijn. &DeltaG voor een chemische reactie is gelijk aan de som van de vrije vormingsenergieën van de reactieproducten &DeltaGP minus de som van de vrije vormingsenergieën van de substraten &DeltaGs. &DeltaG 0 geeft de verandering in vrije energie aan die gepaard gaat met de overgang van de standaardtoestand, één-molaire concentraties van substraten en producten, naar evenwicht. Een meer bruikbare biochemische term is &DeltaG 0 ’, die &Delta . definieertG 0 bij een standaardtoestand van 10 –7 M protonen, pH 7,0 (Hoofdstuk 11). Als de vrije vormingsenergie van de producten lager is dan die van de substraten, zijn de tekenen van &DeltaG 0 en &DeltaG 0’ zal negatief zijn, wat aangeeft dat de reactie zoals geschreven de voorkeur heeft in de richting van links naar rechts. Dergelijke reacties worden aangeduid als: spontaan. De teken en de grootte van de vrije energieverandering bepalen hoe ver de reactie zal verlopen. Vergelijking (3) illustreert de relatie tussen de evenwichtsconstante Kgelijk aan en &DeltaG 0 :

waar R is de gasconstante (1,98 cal/mol°K of 8,31 J/mol°K) en t is de absolute temperatuur in graden Kelvin. Kgelijk aan is gelijk aan het product van de concentraties van de reactieproducten, elk verhoogd tot de macht van hun stoichiometrie, gedeeld door het product van de substraten, elk verhoogd tot de macht van hun stoichiometrie:

Voor de reactie

&DeltaG 0 kan worden berekend uit vergelijking (3) als de molaire concentraties van substraten en producten die bij evenwicht aanwezig zijn bekend zijn. Als &DeltaG 0 is een negatief getal, Kgelijk aan zal groter zijn dan één, en de concentratie van producten bij evenwicht zal die van de substraten overschrijden. Als &DeltaG 0 is positief, Kgelijk aan zal minder dan één zijn en de vorming van substraten zal worden bevorderd.

Merk op dat, aangezien &DeltaG 0 is uitsluitend een functie van de begin- en eindtoestand van de reagerende soort, het kan alleen informatie geven over de richting en evenwichtstoestand: van de reactie. &DeltaG 0 is onafhankelijk van de mechanisme van de reactie en geeft daarom geen informatie over tarieven van reacties. Dientengevolge&mdashand zoals hieronder uitgelegd&mdasalalhoewel een reactie een grote negatieve &Delta . kan hebbenG 0 of &DeltaG 0 ’, kan het toch in een verwaarloosbaar tempo plaatsvinden.

DE REACTIES WORDEN BEPAALD DOOR HUN ACTIVERINGS-ENERGIE

Reacties gaan via overgangsstaten

Het concept van de overgangstoestand: is fundamenteel voor het begrijpen van de chemische en thermodynamische basis van katalyse. Vergelijking (7) geeft een groepsoverdrachtsreactie weer waarbij een binnenkomende groep E een vertrekkende groep L verdringt, aanvankelijk gehecht aan R:

Het netto resultaat van dit proces is dat groep R van L naar E wordt overgedragen. Halverwege de verplaatsing is de binding tussen R en L verzwakt maar nog niet volledig verbroken, en de nieuwe binding tussen E en R is nog onvolledig gevormd. Dit tijdelijke tussenproduct en mdashin, waarin geen vrij substraat of product bestaat, wordt het genoemd overgangstoestand, E···R···L. Stippellijnen vertegenwoordigen de "gedeeltelijke" bindingen die worden gevormd en verbroken. Afbeelding 8-1 geeft een meer gedetailleerde illustratie van de overgangstoestand tussenproduct gevormd tijdens de overdracht van een fosforylgroep.

AFBEELDING 8–1 Vorming van een overgangstoestandtussenproduct tijdens een eenvoudige chemische reactie, Getoond worden drie stadia van een chemische reactie waarbij een fosforylgroep wordt overgebracht van vertrekkende groep L naar binnenkomende groep E. Boven: binnenkomende groep E (A) benadert de andere reactant, L-fosfaat (B). Merk op hoe de drie zuurstofatomen verbonden door de driehoekige lijnen en het fosforatoom van de fosforylgroep een piramide vormen. Midden: als E L-fosfaat nadert, begint de nieuwe binding tussen E en de fosfaatgroep zich te vormen (stippellijn) naarmate die die L met de fosfaatgroep verbindt, verzwakt. Deze gedeeltelijk gevormde bindingen zijn aangegeven met stippellijnen. Bodem: vorming van het nieuwe product, E-fosfaat (P), is nu voltooid als de vertrekkende groep L (Q) verlaat. Merk op hoe de geometrie van de fosforylgroep verschilt tussen de overgangstoestand en het substraat of product. Merk op hoe de fosfor- en drie zuurstofatomen die de vier hoeken van een piramide in het substraat en het product innemen, coplanair worden, zoals benadrukt door de driehoek, in de overgangstoestand.

Reactie (7) kan worden gezien als bestaande uit twee "deelreacties", de eerste die overeenkomt met de vorming (F) en de tweede met het daaropvolgende verval (D) van het tussenproduct van de overgangstoestand. Zoals voor alle reacties, karakteristieke veranderingen in vrije energie, &DeltaGF en &DeltaGNS zijn geassocieerd met elke gedeeltelijke reactie:

Voor de algemene reactie (10), &DeltaG is de som van &DeltaGF en &DeltaGNS. Zoals voor elke vergelijking van twee termen, is het niet mogelijk om af te leiden uit &DeltaG ofwel het teken of de grootte van &DeltaGF of &DeltaGNS.

Veel reacties omvatten meerdere overgangstoestanden, elk met een bijbehorende verandering in vrije energie. Voor deze reacties is de algemene &DeltaG vertegenwoordigt de som van alle van de vrije energieveranderingen die gepaard gaan met de vorming en het verval van alle van de overgangsstaten. Daarom is het niet mogelijk om uit de algemene &DeltaG het aantal of type overgangstoestanden waardoor de reactie verloopt. Anders gezegd, algemene thermodynamica vertelt ons niets over kinetiek.

&Delta GF Definieert de activeringsenergie

Ongeacht het teken of de grootte van &DeltaG, &DeltaGF want de overgrote meerderheid van chemische reacties heeft een positief teken. De vorming van tussenvormen van overgangstoestanden vereist daarom het overwinnen van energiebarrières. Om deze reden, &DeltaGF voor het bereiken van een overgangstoestand wordt vaak de activeringsenergie, Ehandeling. Het gemak en de snelheid waarmee deze barrière wordt overwonnen, is omgekeerd evenredig met: Ehandeling. De thermodynamische parameters die bepalen hoe snel een reactie verloopt dus de &DeltaGF waarden voor de vorming van de overgangstoestanden waardoor de reactie verloopt. Voor een eenvoudige reactie, waarbij &prop "evenredig aan" betekent,

De activeringsenergie voor de reactie die in de tegenovergestelde richting verloopt is gelijk aan –&DeltaGNS.

TALRIJKE FACTOREN BENVLOEDEN DE REACTIEGRAAD

De kinetische theorie&mdashook wel de . genoemd botsingstheorie&mdashof chemische kinetiek stelt dat voor twee moleculen om te reageren ze (1) moeten elkaar binnen bindingsvormende afstand van elkaar naderen, of "botsen" en (2) moet voldoende kinetische energie hebben om de energiebarrière te overwinnen om de overgangstoestand te bereiken. Hieruit volgt dat alles wat de verhoogt frequentie of energie botsingen tussen substraten zal de snelheid van de reactie waaraan ze deelnemen verhogen.

Temperatuur

Het verhogen van de temperatuur verhoogt de kinetische energie van moleculen. Zoals geïllustreerd in Afbeelding 8–2, het totale aantal moleculen waarvan de kinetische energie de energiebarrière overschrijdt Ehandeling (verticale balk) voor de vorming van producten neemt toe van lage (A) via tussenliggende (B) tot hoge (C) temperaturen. Het verhogen van de kinetische energie van moleculen verhoogt ook hun bewegingssnelheid en dus de frequentie waarmee ze botsen. Deze combinatie van frequentere en meer energetische en dus productieve botsingen verhoogt de reactiesnelheid.

AFBEELDING 8–2 De energiebarrière voor chemische reacties. (Zie tekst voor discussie.)

Reactantconcentratie

De frequentie waarmee moleculen botsen is recht evenredig met hun concentraties. Voor twee verschillende moleculen A en B zal de frequentie waarmee ze botsen verdubbelen als de concentratie van A of B wordt verdubbeld. Als de concentraties van zowel A als B worden verdubbeld, wordt de kans op een aanvaring verviervoudigd.

Voor een chemische reactie die verloopt bij constante temperatuur waarbij één molecuul van A en B betrokken is,

het aantal moleculen dat voldoende kinetische energie bezit om de activeringsenergiebarrière te overwinnen, zal een constante zijn. Het aantal botsingen met voldoende energie om product P te produceren zal daarom recht evenredig zijn met het aantal botsingen tussen A en B, en dus met hun molaire concentraties, aangegeven door de vierkante haken:

Evenzo voor de reactie weergegeven door

die ook kan worden geschreven als

De bijbehorende tariefuitdrukking is

Voor het algemene geval, wanneer? N moleculen van A reageren met m moleculen van B,

Het evenredigheidsteken vervangen door een gelijkteken door a . in te voeren snelheidsconstante k kenmerkend voor de onderzochte reactie geeft vergelijkingen (20) en (21), waarin de subscripts 1 en –1 verwijzen naar respectievelijk de voorwaartse en achterwaartse reacties:

De som van de molaire verhoudingen van de reactanten definieert de kinetische volgorde van de reactie. Overweeg reactie (5). De stoichiometrische coëfficiënt voor de enige reactant, A, is 2. Daarom is de productiesnelheid van P evenredig met het kwadraat van [A] en wordt gezegd dat de reactie tweede bestelling met betrekking tot reactant A. In dit geval is de algehele reactie ook: tweede bestelling. Daarom, k1 wordt aangeduid als een tweede-orde tariefconstante.

Reactie (12) beschrijft een eenvoudige tweede-orde reactie tussen twee verschillende reactanten, A en B. De stoichiometrische coëfficiënt voor elke reactant is 1. Daarom, terwijl de algemene volgorde van de reactie 2 is, wordt gezegd dat het eerste bestelling met betrekking tot A en eerste bestelling met betrekking tot B. In het laboratorium kan de kinetische volgorde van een reactie met betrekking tot een bepaalde reactant, de variabele reactant of het substraat genoemd, worden bepaald door de concentratie van de andere reactanten op een constante of vaste concentratie te houden in grote overmaat ten opzichte van de variabele reactant. onder deze pseudo-eerste-orde voorwaarden, de concentratie van de vaste reactant(en) blijft nagenoeg constant. De reactiesnelheid zal dus uitsluitend afhangen van de concentratie van de variabele reactant, soms ook de beperkende reactant genoemd. De concepten van reactievolgorde en pseudo-eerste-orde voorwaarden zijn niet alleen van toepassing op eenvoudige chemische reacties, maar ook op door enzymen gekatalyseerde reacties.

Kgelijk aan Is een verhouding van snelheidsconstanten

Hoewel alle chemische reacties tot op zekere hoogte omkeerbaar zijn, is bij evenwicht de algemeen concentraties van reactanten en producten blijven constant. Bij evenwicht is de omzettingssnelheid van substraten in producten dus gelijk aan de snelheid waarmee producten worden omgezet in substraten:

De verhouding van k1 tot k–1 wordt de evenwichtsconstante genoemd, Kgelijk aan. De volgende belangrijke eigenschappen van een systeem in evenwicht moeten in gedachten worden gehouden.

1. De evenwichtsconstante is een verhouding van de reactie snelheidsconstanten (niet de reactie) tarieven).

2. Bij evenwicht is de reactie tarieven (niet de snelheidsconstanten) van de voorwaartse en achterwaartse reacties zijn gelijk.

3. Evenwicht is een dynamisch staat. Hoewel er geen is netto- verandering in de concentratie van substraten of producten, individuele substraat- en productmoleculen worden voortdurend in elkaar omgezet.

4. De numerieke waarde van de evenwichtsconstante Kgelijk aan kan worden berekend uit de concentraties van substraten en producten in evenwicht of uit de verhouding k1/k–1.

DE KINETICA VAN ENZYMATISCHE KATALYSE

Enzymen verlagen de activeringsenergiebarrière voor een reactie

Alle enzymen versnellen de reactiesnelheid door &Delta . te verlagenGF voor de vorming van overgangstoestanden. Ze kunnen echter verschillen in de manier waarop dit wordt bereikt. Wanneer het mechanisme of de volgorde van chemische stappen op de actieve plaats in wezen gelijk is aan die voor dezelfde reactie die plaatsvindt in afwezigheid van een katalysator, de omgeving van de actieve site verlaagt &DeltaGF door de overgangstoestand tussenproducten te stabiliseren. Anders gezegd, het enzym kan worden gezien als een binding aan het tussenproduct in de overgangstoestand (Afbeelding 8-1) strakker dan op substraten of producten. Zoals besproken in hoofdstuk 7, stabilisatie kan inhouden (1) zuur-base groepen die geschikt zijn gepositioneerd om protonen over te dragen van of naar het zich ontwikkelende overgangstoestandtussenproduct, (2) geschikt gepositioneerde geladen groepen of metaalionen die zich ontwikkelende ladingen stabiliseren, of (3) het opleggen van sterische spanning op substraten zodat hun geometrie die van de overgangstoestand benadert. HIV-protease (zie Afbeelding 7–6) illustreert katalyse door een enzym dat de activeringsbarrière verlaagt door een tussenproduct in de overgangstoestand te stabiliseren.

Katalyse door enzymen die verloopt via a uniek reactiemechanisme treedt meestal op wanneer het tussenproduct in de overgangstoestand een covalente binding vormt met het enzym (covalente katalyse). Het katalytische mechanisme van het serineprotease chy-motrypsine (zie: Afbeelding 7–7) illustreert hoe een enzym covalente katalyse gebruikt om een ​​unieke reactieroute te verschaffen.

ENZYMEN HEBBEN GEEN INVLOEDKgelijk aan

Terwijl enzymen tijdelijke wijzigingen ondergaan tijdens het katalyseproces, komen ze altijd onveranderd tevoorschijn aan het einde van de reactie. De aanwezigheid van een enzym heeft dus geen effect op &DeltaG 0 voor de algemeenreactie, die uitsluitend een functie is van de begin- en eindtoestanden van de reactanten. Vergelijking (25) toont de relatie tussen de evenwichtsconstante voor een reactie en de standaard vrije energieverandering voor die reactie:

Dit principe wordt misschien het gemakkelijkst geïllustreerd door de aanwezigheid van het enzym (Enz) op te nemen in de berekening van de evenwichtsconstante voor een enzymgekatalyseerde reactie:

Aangezien het enzym aan beide zijden van de dubbele pijlen in gelijke hoeveelheid en identieke vorm aanwezig is, is de uitdrukking voor de evenwichtsconstante,

reduceert tot één identiek aan die voor de reactie in afwezigheid van het enzym:

Enzymen hebben dus geen effect op Kgelijk aan.

MEERDERE FACTOREN BENVLOEDEN DE TARIEVEN VAN ENZYM-GEKATALYSEERDE REACTIES

Temperatuur

Het verhogen van de temperatuur verhoogt de snelheid van zowel niet-gekatalyseerde als enzym-gekatalyseerde reacties door de kinetische energie en de botsingsfrequentie van de reagerende moleculen te verhogen. Warmte-energie kan echter ook de kinetische energie van het enzym verhogen tot een punt dat de energiebarrière overschrijdt voor het verstoren van de niet-covalente interacties die de driedimensionale structuur behouden. De polypeptideketen begint dan te ontvouwen, of denatureren, met een bijbehorend verlies van de katalytische activiteit. Het temperatuurbereik waarbinnen een enzym een ​​stabiele, katalytisch competente conformatie handhaaft, hangt af van en meestal overschrijdt de normale temperatuur van de cellen waarin het zich bevindt matig. Enzymen van mensen vertonen over het algemeen stabiliteit bij temperaturen tot 45-55°C. Daarentegen kunnen enzymen van de thermofiele micro-organismen die zich in vulkanische warmwaterbronnen of onderzeese hydrothermale bronnen bevinden, stabiel zijn bij temperaturen tot of zelfs boven 100°C.

De temperatuurcoëfficiënt (Q10) is de factor waarmee de snelheid van een biologisch proces toeneemt bij een temperatuurstijging van 10°C. Voor de temperaturen waarboven enzymen stabiel zijn, verdubbelen de snelheden van de meeste biologische processen typisch voor een temperatuurstijging van 10°C . Veranderingen in de snelheid van door enzym gekatalyseerde reacties die gepaard gaan met een stijging of daling van de lichaamstemperatuur, vormen een prominent overlevingskenmerk voor "koelbloedige" levensvormen zoals hagedissen of vissen, waarvan de lichaamstemperatuur wordt bepaald door de externe omgeving. Voor zoogdieren en andere homeotherme organismen zijn veranderingen in enzymreactiesnelheden met temperatuur echter alleen van fysiologisch belang in omstandigheden zoals koorts of hypothermie.

Waterstofionenconcentratie

De snelheid van bijna alle enzym-gekatalyseerde reacties vertoont een significante afhankelijkheid van de waterstofionenconcentratie. De meeste intracellulaire enzymen vertonen een optimale activiteit bij pH-waarden tussen 5 en 9. De relatie tussen activiteit en waterstofionconcentratie (Afbeelding 8-3) weerspiegelt de balans tussen enzymdenaturatie bij hoge of lage pH en effecten op de geladen toestand van het enzym, de substraten of beide. Voor enzymen waarvan het mechanisme zuur-base-katalyse omvat, moeten de betrokken residuen in de juiste staat van protonering zijn om de reactie te laten verlopen. De binding en herkenning van substraatmoleculen met dissocieerbare groepen omvat typisch ook de vorming van zoutbruggen met het enzym. De meest voorkomende geladen groepen zijn carboxylaatgroepen (negatief) en geprotoneerde aminen (positief). Toename of verlies van kritische geladen groepen heeft een nadelige invloed op substraatbinding en zal dus katalyse vertragen of beëindigen.

AFBEELDING 8-3 Effect van pH op enzymactiviteit. Denk bijvoorbeeld aan een negatief geladen enzym (E – ) dat een positief geladen substraat (SH+) bindt. Getoond wordt het aandeel (%) van SH+ [] en van E – [///] als functie van de pH. Alleen in het gearceerde gebied hebben zowel het enzym als het substraat een geschikte lading.

ASSAYS VAN ENZYM-GEKATALYSEERDE REACTIES METEN TYPISCH DE AANVANKELIJKE SNELHEID

De meeste metingen van de snelheden van enzym-gekatalyseerde reacties maken gebruik van relatief korte tijdsperioden, omstandigheden die ongeveer voorwaarden voor aanvangstarief. Onder deze omstandigheden hopen zich alleen sporen van het product op, waardoor de snelheid van de omgekeerde reactie verwaarloosbaar is. De beginsnelheid (vl) van de reactie is dus in wezen die van de snelheid van de voorwaartse reactie. Bij testen van enzymactiviteit wordt bijna altijd een grote (10 3 – 107 ) molaire overmaat substraat ten opzichte van enzym gebruikt. Onder deze voorwaarden, v 1 . evenredig is met de concentratie van het enzym. Het meten van de beginsnelheid maakt het daarom mogelijk om de hoeveelheid enzym in een biologisch monster te schatten.

SUBSTRAATCONCENTRATIE BENVLOEDT DE REACTIEGRAAD

In wat volgt worden enzymreacties behandeld alsof ze slechts een enkel substraat en een enkel product hebben. Voor enzymen met meerdere substraten gelden de hieronder besproken principes met gelijke geldigheid. Bovendien kunnen wetenschappers door gebruik te maken van pseudo-eerste-orde-omstandigheden (zie hierboven), de afhankelijkheid van de reactiesnelheid van een individuele reactant bestuderen door de juiste keuze van vaste en variabele substraten. Met andere woorden, onder pseudo-eerste-orde-omstandigheden zal het gedrag van een multisubstraat-enzym een ​​enzym met een enkel substraat imiteren. In dit geval zal de waargenomen snelheidsconstante echter een functie zijn van de snelheidsconstante k1 voor zowel de reactie als de concentratie van het (de) vaste substraat(en).

Voor een typisch enzym, als de substraatconcentratie wordt verhoogd, vl. neemt toe totdat het een maximale waarde bereikt Vmax (Afbeelding 8-4). Wanneer verdere verhogingen van de substraatconcentratie niet verder toenemen vl, wordt gezegd dat het enzym "verzadigd" is met het substraat. Merk op dat de vorm van de curve die activiteit relateert aan substraatconcentratie (Afbeelding 8-4) is hyperbolisch. Op elk willekeurig moment kunnen alleen substraatmoleculen die zijn gecombineerd met het enzym als een enzym-substraat (ES) complex worden omgezet in een product. Aangezien de evenwichtsconstante voor de vorming van het enzym-substraatcomplex niet oneindig groot is, kan slechts een fractie van het enzym als ES-complex aanwezig zijn, zelfs wanneer het substraat in overmaat aanwezig is (punten A en B van Afbeelding 8–5). Op punten A of B zal het verhogen of verlagen van [S] daarom het aantal ES-complexen verhogen of verlagen met een overeenkomstige verandering in vl. Op punt C (Afbeelding 8–5), is echter in wezen al het enzym aanwezig als het ES-complex. Aangezien er geen vrij enzym beschikbaar blijft voor het vormen van ES, kunnen verdere verhogingen van [S] de reactiesnelheid niet verhogen. Onder deze verzadigende omstandigheden, vl. hangt uitsluitend af van en wordt dus beperkt door de snelheid waarmee het product van het enzym dissocieert, zodat het zich kan combineren met meer substraat.

AFBEELDING 8–4 Effect van substraatconcentratie op de beginsnelheid van een door enzym gekatalyseerde reactie.

AFBEELDING 8–5 Weergave van een enzym in aanwezigheid van een substraatconcentratie die lager is dan Km (A), bij een concentratie gelijk aan Km (B), en bij een concentratie ruim boven Km(C). Punten A, B en C komen overeen met die punten in Afbeelding 8-4.

DE MICHAELIS–MENTEN & HILL VERGELIJKINGEN MODEL DE EFFECTEN VAN SUBSTRAATCONCENTRATIE

De Michaelis-Menten-vergelijking

De Michaelis-Menten-vergelijking (29) illustreert in wiskundige termen de relatie tussen initiële reactiesnelheid vl en substraatconcentratie [S], grafisch weergegeven in Afbeelding 8-4:

De Michaelis-constante Km is de substraatconcentratie waarbij vl is de helft van de maximale snelheid (Vmax/2) haalbaar bij een bepaalde concentratie van het enzym. Km heeft dus de afmetingen van substraatconcentratie. De afhankelijkheid van de initiële reactiesnelheid van [S] en Km kan worden geïllustreerd door de Michaelis-Menten-vergelijking onder drie voorwaarden te evalueren.

1. Wanneer [S] veel kleiner is dan Km (punt A in Figuren 8-4 en 8-5), de voorwaarde Km + [S] is in wezen gelijk aan Km. vervangen Km + [S] met Km reduceert vergelijking (29) tot

waarbij ≈ betekent "ongeveer gelijk aan". Sinds Vmax en Km zijn beide constanten, hun verhouding is een constante. Met andere woorden, wanneer [S] aanzienlijk lager is Km, vl staat in verhouding tot k[S]. De initiële reactiesnelheid is daarom recht evenredig met [S].

2. Wanneer [S] veel groter is dan Km (punt C in Figuren 8-4 en 8–5), de voorwaarde Km + [S] is in wezen gelijk aan [S]. vervangen Km + [S] met [S] reduceert vergelijking (29) tot

Dus, wanneer [S] veel groter is dan Km, de reactiesnelheid is maximaal (Vmax) en onaangetast door verdere verhogingen van de substraatconcentratie.

3. Wanneer (punt B in Figuren 8-4 en 8–5):

Vergelijking (32) stelt dat wanneer [S] gelijk is aan Km, de beginsnelheid is half maximaal. Vergelijking (32) onthult ook dat Km Deze waarde kan experimenteel worden bepaald uit de substraatconcentratie waarbij de beginsnelheid halfmaximaal is.

Een lineaire vorm van de Michaelis-Menten-vergelijking wordt gebruikt om te bepalen: Km & Vmax

De directe meting van de numerieke waarde van Vmax, en dus de berekening van Km, vereist vaak onpraktisch hoge concentraties substraat om verzadigende omstandigheden te bereiken. Een lineaire vorm van de Michaelis-Menten-vergelijking omzeilt deze moeilijkheid en staat toe: Vmax en Km te extrapoleren uit initiële snelheidsgegevens die zijn verkregen bij minder dan verzadigende concentraties van het substraat. Begin met vergelijking (29),

Vergelijking (35) is de vergelijking voor een rechte lijn, , waar en . Een perceel van 1/vl. als ja als functie van 1/[S] als x geeft daarom een ​​rechte lijn waarvan ja onderscheppen is 1/Vmax en wiens helling is Km/Vmax. Zo'n plot heet a dubbel wederkerig of Lineweaver-Burk plot (Afbeelding 8–6). De . instellen ja term van vergelijking (36) gelijk aan nul en oplossen voor x onthult dat de x onderscheppen is –1/Km:

AFBEELDING 8–6 Dubbel-reciproke of Lineweaver-Burk-plot van 1/v1 versus 1/[S] gebruikt om te evalueren Km en Vmax.

Km wordt dus het gemakkelijkst berekend uit de negatieve x onderscheppen.

De grootste deugd van de Lineweaver-Burk-plot ligt in de faciliteit waarmee het kan worden gebruikt om de kinetische mechanismen van enzymremmers te bepalen (zie hieronder). Bij het gebruik van een dubbel-reciproke plot om kinetische constanten te bepalen, is het echter belangrijk om de introductie van vertekening door de clustering van gegevens bij lage waarden van 1/[S] te voorkomen. Om deze bias te voorkomen, bereidt u een oplossing van substraat voor waarvan de verdunning in een test de maximale gewenste concentratie van het substraat zal produceren. Gebruik nu hetzelfde volume aan oplossingen die zijn bereid door de voorraadoplossing te verdunnen met een factor 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, enz. De gegevens vallen dan op de 1/[S]-as met tussenpozen van 1, 2, 3, 4, 5, enz. Als alternatief kan een enkelvoudig wederkerig perceel zoals de Eadie-Hofstee (vl versus vl/[S]) of Hanes–Woolf ([S]/vl versus [S]) plot kan worden gebruikt om clustering te minimaliseren.

De katalytische constante, kkat

Er kunnen verschillende parameters worden gebruikt om de relatieve activiteit van verschillende enzymen of van verschillende preparaten van hetzelfde enzym te vergelijken. De activiteit van onzuivere enzympreparaten wordt meestal uitgedrukt als a specifieke activiteit (Vmaxgedeeld door de eiwitconcentratie). Voor een homogeen enzym kan men zijn berekenen omzet aantal (Vmax gedeeld door het aantal aanwezige mol enzym). Maar als het aantal aanwezige actieve plaatsen bekend is, kan de katalytische activiteit van een homogeen enzym het best worden uitgedrukt als zijn katalytische constante, kkat (Vmax gedeeld door het aantal actieve sites, St):

Omdat de eenheden van concentratie elkaar opheffen, zijn de eenheden van kkat zijn wederzijdse tijd.

Met welke maatstaf moet de efficiëntie van verschillende enzymen, verschillende substraten voor een bepaald enzym en de efficiëntie waarmee een enzym een ​​reactie katalyseert in voorwaartse en achterwaartse richtingen worden gekwantificeerd en vergeleken? Hoewel de maximale capaciteit van een bepaald enzym om substraat in product om te zetten belangrijk is, zijn de voordelen van een hoge kkat kan alleen worden gerealiseerd als Km voldoende laag is. Dus, katalytische efficiëntie: van enzymen wordt het best uitgedrukt in termen van de verhouding van deze twee kinetische constanten, kkat/Km.

Voor bepaalde enzymen wordt het substraat, zodra het bindt aan de actieve plaats, omgezet in product en zo snel afgegeven dat deze gebeurtenissen effectief onmiddellijk plaatsvinden. Voor deze uitzonderlijk efficiënte katalysatoren is de snelheidsbeperkende stap in katalyse de vorming van het ES-complex. Van dergelijke enzymen wordt gezegd dat ze diffusie-beperkt, of katalytisch perfect, aangezien de snelst mogelijke katalysesnelheid wordt bepaald door de snelheid waarmee moleculen door de oplossing bewegen of diffunderen. Voorbeelden van enzymen waarvoor: kkat/Km de diffusielimiet van 108 –109 M –1 s –1 benadert, omvatten triosefosfaatisomerase, koolzuuranhydrase, acetylcholinesterase en adenosinedeaminase.

In levende cellen kan de assemblage van enzymen die opeenvolgende reacties katalyseren tot multimere complexen de beperkingen omzeilen die door diffusie worden opgelegd. De geometrische relaties van de enzymen in deze complexen zijn zodanig dat de substraten en producten niet in de bulkoplossing diffunderen totdat de laatste stap in de reeks van katalytische stappen is voltooid. Vetzuursynthetase breidt dit concept nog een stap verder uit door de vetzuurketen van het groeiende substraat covalent te hechten aan een biotineketting die van de actieve plaats naar de actieve plaats binnen het complex roteert totdat de synthese van een palmitinezuurmolecuul is voltooid (Hoofdstuk 23).

Km Kan een bindingsconstante benaderen

De affiniteit van een enzym voor zijn substraat is het omgekeerde van de dissociatieconstante KNS voor dissociatie van het enzym-substraatcomplex ES:

Anders gezegd, de kleiner de neiging van het enzym en zijn substraat om dissociëren, de groter de affiniteit van het enzym voor zijn substraat. Terwijl de Michaelis-constante Km benadert vaak de dissociatieconstante KNS, dit is lang niet altijd het geval. Voor een typische enzym-gekatalyseerde reactie:

De waarde van [S] die geeft is

Wanneer , dan

Vandaar, 1/Km benadert slechts 1/KNS onder omstandigheden waarbij de associatie en dissociatie van het ES-complex snel zijn ten opzichte van katalyse. Voor de vele door enzymen gekatalyseerde reacties waarvoor: k–1 + k2 is niet ongeveer gelijk aan k–1, 1/Km zal 1 . onderschatten /KNS.

De Hill-vergelijking beschrijft het gedrag van enzymen die coöperatieve binding van substraat vertonen

Terwijl de meeste enzymen de simpele verzadigingskinetiek afgebeeld in Afbeelding 8-4 en adequaat worden beschreven door de Michaelis-Menten-expressie, binden sommige enzymen hun substraten in a coöperatief manier analoog aan de binding van zuurstof door hemoglobine (Hoofdstuk 6). Coöperatief gedrag is een exclusieve eigenschap van multimere enzymen die substraat op meerdere plaatsen binden.

Voor enzymen die positieve coöperativiteit vertonen bij het binden van het substraat, is de vorm van de curve die betrekking heeft op veranderingen in vl aan veranderingen in [S] is sigmoïdaal (Afbeelding 8–7). Noch de Michaelis-Menten-expressie, noch de afgeleide plots kunnen worden gebruikt om coöperatieve kinetiek te evalueren. Enzymologen gebruiken daarom een ​​grafische weergave van de Hill vergelijking oorspronkelijk afgeleid om de coöperatieve binding van O . te beschrijven2 door hemoglobine. Vergelijking (44) stelt de Hill-vergelijking voor, gerangschikt in een vorm die een rechte lijn voorspelt, waarbij k' is een complexe constante:

AFBEELDING 8–7 Weergave van de verzadigingskinetiek van het sigmoïde substraat.

Vergelijking (44) stelt dat wanneer [S] laag is ten opzichte van k', de initiële reactiesnelheid neemt toe naarmate de Nde macht van [S].

Een grafiek van log vl/(Vmaxvl) versus log[S] geeft een rechte lijn (Afbeelding 8–8), waar de helling van de lijn N is de Heuvelcoëfficiënt, een empirische parameter waarvan de waarde een functie is van het aantal, de soort en de sterkte van de interacties van de meerdere substraatbindingsplaatsen op het enzym. Wanneer , alle bindingsplaatsen gedragen zich onafhankelijk en eenvoudig Michaelis-Menten kinetisch gedrag wordt waargenomen. Indien N groter is dan 1, wordt gezegd dat het enzym positieve coöperativiteit vertoont. Binding van substraat aan één plaats verhoogt dan de affiniteit van de overblijvende plaatsen om extra substraat te binden. Hoe groter de waarde voor N, hoe hoger de mate van coöperativiteit en hoe meer uitgesproken sigmoïdaal de plot zal zijn van vl. tegen [S]. Een loodlijn viel vanaf het punt waar de ja term log vl/(Vmaxvl) is nul snijdt de x-as bij een substraatconcentratie genaamd S50, de substraatconcentratie die resulteert in half-maximale snelheid. S50 dus is analoog aan de P50 voor zuurstofbinding aan hemoglobine (Hoofdstuk 6).

AFBEELDING 8–8 Een grafische weergave van een lineaire vorm van de Hill-vergelijking wordt gebruikt om S . te evalueren50, de substraatconcentratie die de half-maximale snelheid produceert, en de mate van coöperativiteit N.

KINETISCHE ANALYSE ONDERSCHEIDT COMPETITIEVE VAN NIET-COMPETITIEVE REMMING

Remmers van de katalytische activiteiten van enzymen bieden zowel farmacologische middelen als onderzoeksinstrumenten voor de studie van het mechanisme van enzymwerking. De sterkte van de interactie tussen een remmer en een enzym hangt af van krachten die belangrijk zijn in de eiwitstructuur en ligandbinding (waterstofbindingen, elektrostatische interacties, hydrofobe interacties en Van der Waals-krachten zie hoofdstuk 5). Remmers kunnen worden ingedeeld op basis van hun werkingsplaats op het enzym, of ze het enzym chemisch modificeren, of op basis van de kinetische parameters die ze beïnvloeden. Verbindingen die de overgangstoestand van een door een enzym gekatalyseerde reactie nabootsen (analogen van de overgangstoestand) of die profiteren van de katalytische machinerie van een enzym (op mechanisme gebaseerde remmers) kunnen bijzonder krachtige remmers zijn. Kinetisch onderscheiden we twee klassen remmers op basis van het feit of het verhogen van de substraatconcentratie de remming al dan niet opheft.

Competitieve remmers lijken typisch op substraten

De effecten van competitieve remmers kunnen worden ondervangen door de substraatconcentratie te verhogen. Meestal, bij competitieve remming, de remmer (L) bindt aan het substraatbindende deel van de actieve plaats, waardoor de toegang door het substraat wordt geblokkeerd. De structuren van de meeste klassieke competitieve remmers hebben daarom de neiging om op de structuren van een substraat te lijken, en worden daarom genoemd substraat analogen. Remming van het enzym succinaatdehydrogenase door malonaat illustreert competitieve remming door een substraatanalogon. Succinaatdehydrogenase katalyseert de verwijdering van één waterstofatoom uit elk van de twee-methyleenkoolstofatomen van succinaat (Afbeelding 8–9). Zowel succinaat als zijn structurele analoge malonaat (- OOC&mdashCH2&mdashCOO – ) kan binden aan de actieve plaats van succinaatdehydrogenase, waarbij respectievelijk een ES- of een EI-complex wordt gevormd. Omdat malonaat echter slechts één methyleenkoolstof bevat, kan het niet worden gedehydrogeneerd.

AFBEELDING 8–9 De succinaatdehydrogenasereactie.

De vorming en dissociatie van het EI-complex is een dynamisch proces dat wordt beschreven door

waarvoor de evenwichtsconstante Kl is

In werkelijkheid, een competitieve remmer werkt door het aantal vrije enzymmoleculen te verminderen dat beschikbaar is om substraat te binden, dwz om ES te vormen, en dus uiteindelijk om product te vormen, zoals hieronder beschreven.

Een competitieve remmer en substraat oefenen wederzijdse effecten uit op de concentratie van de EI- en ES-complexen. Aangezien de vorming van ES-complexen het vrije enzym verwijdert dat beschikbaar is om te combineren met de remmer, verlaagt het verhogen van [S] de concentratie van het EI-complex en verhoogt het de reactiesnelheid. De mate waarin [S] moet worden verhoogd om de remming volledig te overwinnen, hangt af van de concentratie van de aanwezige remmer, zijn affiniteit voor het enzym, Kl, en de affiniteit, Km, van het enzym voor zijn substraat.

Dubbel-wederkerige plots vergemakkelijken de evaluatie van remmers

Dubbel-reciproke plots maken onderscheid tussen competitieve en niet-competitieve remmers en vereenvoudigen de evaluatie van remmingsconstanten. vl wordt bepaald bij verschillende substraatconcentraties, zowel in aanwezigheid als in afwezigheid van de remmer. Voor klassieke competitieve remming convergeren de lijnen die de experimentele datapunten verbinden op de y-as (Afbeelding 8–10). sinds de ja onderscheppen is gelijk aan 1/Vmax, dit patroon geeft aan dat: wanneer 1/[S] 0 nadert, vlis onafhankelijk van de aanwezigheid van een remmer. Merk echter op dat het onderscheppen op de x-as varieert met remmer concentratie en laat zien dat sinds –1/Km is kleiner dan 1/Km, Km (de “schijnbare” Km”) groter wordt bij toenemende concentraties van de remmer. Dus, een competitieve remmer heeft geen effect op Vmax maar verhoogt Km, de schijnbare Km voor de ondergrond. Voor een eenvoudige competitieve remming, het intercept op de x-as is

FIGUUR 8-10 Lineweaver-Burk-plot van eenvoudige competitieve remming. Let op de volledige verlichting van remming bij hoge [S] (dwz lage 1/[S]).

Een keer Km is bepaald in afwezigheid van een remmer, Kl kan worden berekend uit vergelijking (47). Kl waarden worden gebruikt om verschillende remmers van hetzelfde enzym te vergelijken. Hoe lager de waarde voor Kl, hoe effectiever de remmer. Bijvoorbeeld de statinegeneesmiddelen die werken als competitieve remmers van HMG-CoA-reductase (Hoofdstuk 26) hebben Kl waarden enkele ordes van grootte lager dan de Km voor het substraat HMG-CoA.

Eenvoudige niet-competitieve remmers lager Vmax Maar niet beïnvloeden Km

Bij strikte niet-competitieve remming heeft binding van de remmer geen invloed op de binding van het substraat. Vorming van zowel EI- als EIS-complexen is daarom mogelijk. Hoewel het enzym-remmercomplex nog steeds het substraat kan binden, wordt de efficiëntie ervan bij het transformeren van substraat naar product, weerspiegeld door Vmax, wordt verlaagd. Niet-competitieve remmers binden enzymen op andere plaatsen dan de substraatbindingsplaats en vertonen in het algemeen weinig of geen structurele gelijkenis met het substraat.

Voor eenvoudige niet-competitieve remming bezitten E en EI identieke affiniteit voor het substraat en genereert het EIS-complex product met een verwaarloosbare snelheid (Afbeelding 8–11). Meer complexe niet-competitieve remming treedt op wanneer binding van de remmer doet beïnvloeden de schijnbare affiniteit van het enzym voor het substraat, waardoor de lijnen in het derde of vierde kwadrant van een dubbel-reciproke grafiek (niet getoond) onderscheppen. Hoewel bepaalde remmers kenmerken vertonen van een mengsel van competitieve en niet-competitieve remming, gaat de evaluatie van deze remmers het bestek van dit hoofdstuk te buiten.

FIGUUR 8-11 Lineweaver-Burk-plot voor eenvoudige niet-competitieve remming.

Een Dixon-plot wordt soms gebruikt als alternatief voor de Lineweaver-Burk-plot voor het bepalen van remmingsconstanten. De beginsnelheid (vl) wordt gemeten bij verschillende concentraties remmer, maar bij een vaste concentratie van het substraat (S). Voor een eenvoudige competitieve of niet-competitieve remmer, een plot van 1/vl versus remmerconcentratie [I] levert een rechte lijn op. Het experiment wordt herhaald bij verschillende vaste concentraties van het substraat. De resulterende reeks lijnen snijdt links van de ja-as. Voor competitief remming, een loodlijn gedaald tot de x-as vanaf het snijpunt van de lijnen geeft -Kl (Afbeelding 8–12, bovenkant). Voor niet competitief remming het onderscheppen op de x-as is -Kl (Afbeelding 8–12, onderkant). Farmaceutische publicaties gebruiken vaak Dixon-plots om de vergelijkende potentie van competitieve remmers te illustreren.

AFBEELDING 8–12 Toepassingen van Dixon-plots. Boven: competitieve remming, schatting van Kl. Onder: niet-competitieve remming, schatting van Kl.

Een minder rigoureus alternatief voor Kl als maat voor de remmende potentie is de concentratie van de remmer die 50% remming produceert, IC50. In tegenstelling tot de evenwichtsdissociatieconstante Kl, de numerieke waarde van IC50 varieert als een functie van de specifieke omstandigheden van substraatconcentratie, enz., waaronder het wordt bepaald.

Strak gebonden remmers

Sommige remmers binden aan enzymen met zo'n hoge affiniteit, M, dat de concentratie van de remmer die nodig is om te meten Kl daalt tot onder de concentratie van het enzym dat typisch aanwezig is in een test. Onder deze omstandigheden kan een significante fractie van de totale remmer aanwezig zijn als een EI-complex. Als dat zo is, schendt dit de aanname, impliciet in de klassieke steady-state kinetiek, dat de concentratie van de vrije remmer onafhankelijk is van de concentratie van het enzym. De kinetische analyse van deze strak gebonden remmers vereist gespecialiseerde kinetische vergelijkingen die de concentratie van het enzym bevatten om te schatten Kl of IC50 en om competitieve van niet-competitieve strak gebonden remmers te onderscheiden.

Onomkeerbare remmers "gif" enzymen

In de bovenstaande voorbeelden vormen de remmers een dissocieerbaar, dynamisch complex met het enzym. Volledig actief enzym kan daarom eenvoudig worden teruggewonnen door de remmer uit het omringende medium te verwijderen. Een verscheidenheid aan andere remmers werken echter onomkeerbaar door het enzym chemisch te modificeren. Deze modificaties omvatten in het algemeen het maken of verbreken van covalente bindingen met aminoacylresiduen die essentieel zijn voor substraatbinding, katalyse of instandhouding van de functionele conformatie van het enzym. Aangezien deze covalente veranderingen relatief stabiel zijn, blijft een enzym dat is "vergiftigd" door een onomkeerbare remmer zoals een zwaar metaalatoom of een acyleringsreagens, geremd, zelfs nadat de resterende remmer uit het omringende medium is verwijderd.

Op mechanisme gebaseerde remming

"Mechanisme-gebaseerde" of "zelfmoord"-remmers zijn gespecialiseerde substraatanalogen die een chemische groep bevatten die kan worden getransformeerd door de katalytische machinerie van het doelenzym. Na binding aan de actieve plaats, genereert katalyse door het enzym een ​​zeer reactieve groep die een covalente binding vormt met, en blokkeert de functie van een katalytisch essentieel residu. De specificiteit en persistentie van zelfmoordremmers, die zowel enzymspecifiek als niet-reactief zijn buiten de grenzen van de actieve plaats van het enzym, maken ze veelbelovende aanknopingspunten voor de ontwikkeling van enzymspecifieke geneesmiddelen. De kinetische analyse van zelfmoordremmers valt buiten het bestek van dit hoofdstuk. Noch de Lineweaver-Burk-, noch de Dixon-benadering is van toepassing, aangezien zelfmoordremmers een belangrijke randvoorwaarde schenden die beide benaderingen gemeen hebben, namelijk dat de activiteit van het enzym niet afneemt in de loop van de test.

DE MEESTE ENZYM-GEKATALYSEERDE REACTIES BETREFFEN TWEE OF MEER SUBSTRATEN

Terwijl verschillende enzymen een enkel substraat hebben, hebben vele anderen twee&mdashand soms meer&mdashsubstraten en producten. De hierboven besproken fundamentele principes zijn, hoewel geïllustreerd voor enzymen met één substraat, ook van toepassing op enzymen met meerdere substraten. De wiskundige uitdrukkingen die worden gebruikt om multisubstraatreacties te evalueren, zijn echter complex. Hoewel een gedetailleerde analyse van het volledige scala van multisubstraatreacties het bestek van dit hoofdstuk te buiten gaat, worden hieronder enkele veelvoorkomende soorten kinetisch gedrag voor reacties met twee substraten en twee producten (genaamd "BiBi"-reacties) beschouwd.

Sequentiële of enkele verplaatsingsreacties

In opeenvolgende reacties, moeten beide substraten met het enzym combineren om een ​​ternair complex te vormen voordat katalyse kan plaatsvinden (Afbeelding 8–13, bovenkant). Opeenvolgende reacties worden soms enkelvoudige verplaatsingsreacties genoemd omdat de groep die de overdracht ondergaat gewoonlijk direct, in een enkele stap, van het ene substraat naar het andere wordt geleid. Sequentiële Bi-Bi-reacties kunnen verder worden onderscheiden op basis van het feit of de twee substraten a . toevoegen willekeurig of in een verplicht volgorde. Voor reacties in willekeurige volgorde kan substraat A of substraat B eerst met het enzym worden gecombineerd om een ​​EA- of een EB-complex te vormen (Afbeelding 8–13, centrum). Voor dwangvolgordereacties moet A eerst combineren met E voordat B kan combineren met het EA-complex. Een verklaring voor waarom sommige enzymen mechanismen van verplichte volgorde gebruiken, is te vinden in Koshland's geïnduceerde fit-hypothese: de toevoeging van A induceert een conformationele verandering in het enzym dat residuen die B herkennen en binden op één lijn brengt.

AFBEELDING 8–13 Voorstellingen van drie klassen van Bi–Bi-reactiemechanismen. Horizontale lijnen stellen het enzym voor. Pijlen geven de toevoeging van substraten en het vertrek van producten aan. Boven: een geordende Bi-Bi-reactie, kenmerkend voor veel NAD(P)H-afhankelijke oxidoreductasen. Centrum: een willekeurige Bi-Bi-reactie, kenmerkend voor veel kinasen en sommige dehydrogenasen. Onder: een pingpongreactie, kenmerkend voor aminotransferasen en serineproteasen.

Pingpongreacties

De voorwaarde "pingpong" is van toepassing op mechanismen waarbij een of meer producten uit het enzym worden vrijgemaakt voordat alle substraten zijn toegevoegd. Bij pingpongreacties gaat het om covalente katalyse en een voorbijgaande, gemodificeerde vorm van het enzym (zie: Afbeelding 7-4). Ping-pong Bi-Bi-reacties worden vaak aangeduid als: dubbele verplaatsingsreacties. De groep die overdracht ondergaat, wordt eerst door het enzym van substraat A verdrongen om product P en een gemodificeerde vorm van het enzym (F) te vormen. De daaropvolgende groepsoverdracht van F naar het tweede substraat B, waarbij product Q wordt gevormd en E wordt geregenereerd, vormt de tweede verplaatsing (Afbeelding 8–13, onderkant).

De meeste bi-bi-reacties zijn in overeenstemming met de kinetiek van Michaelis-Menten

De meeste Bi-Bi-reacties voldoen aan een wat complexere vorm van Michaelis-Menten-kinetiek waarin: Vmax verwijst naar de reactiesnelheid die wordt bereikt wanneer beide substraten in verzadigende niveaus aanwezig zijn. Elk substraat heeft zijn eigen kenmerk Km waarde, die overeenkomt met de concentratie die de halve maximale snelheid oplevert wanneer het tweede substraat aanwezig is op verzadigende niveaus. Wat betreft enkel-substraatreacties, kunnen dubbel-reciproke plots worden gebruikt om te bepalen: Vmax en Km. vl wordt gemeten als functie van de concentratie van het ene substraat (het variabele substraat) terwijl de concentratie van het andere substraat (het vaste substraat) constant wordt gehouden. Als de lijnen die zijn verkregen voor verschillende vaste-substraatconcentraties in dezelfde grafiek worden uitgezet, is het mogelijk om een ​​pingpongmechanisme te onderscheiden, dat parallelle lijnen oplevert (Afbeelding 8–14), van een sequentieel mechanisme, dat een patroon van kruisende lijnen oplevert (niet getoond).

AFBEELDING 8–14 Lineweaver-Burk-plot voor een pingpongreactie met twee substraten. Een verhoging van de concentratie van één substraat (S1) terwijl die van het andere substraat (S2) wordt constant gehouden voor wijzigingen zowel de x en jaonderschept, maar niet de helling.

Onderzoek naar productremming worden gebruikt als aanvulling op kinetische analyses en om onderscheid te maken tussen geordende en willekeurige Bi-Bi-reacties. In een Bi-Bi-reactie van willekeurige volgorde zal elk product bijvoorbeeld werken als een competitieve remmer in de afwezigheid van zijn bijproducten, ongeacht welk substraat het variabele substraat wordt genoemd. Voor een sequentieel mechanisme (Afbeelding 8–13, top), zal alleen product Q het patroon geven dat indicatief is voor competitieve remming wanneer A het variabele substraat is, terwijl alleen product P dit patroon zal produceren met B als het variabele substraat. De andere combinaties van productremmer en variabel substraat zullen vormen van complexe niet-competitieve remming produceren.

KENNIS VAN ENZYMKINETICA, MECHANISME EN REMMINGSHULPMIDDELEN DRUGSONTWIKKELING

Veel medicijnen werken als enzymremmers

Het doel van farmacologie is om middelen te identificeren die

1. Vernietig of belemmer de groei, invasiviteit of ontwikkeling van binnendringende pathogenen.

2. Stimuleer endogene afweermechanismen.

3. Stop of belemmer afwijkende moleculaire processen die worden geactiveerd door genetische, omgevings- of biologische stimuli met minimale verstoring van de normale cellulaire functies van de gastheer.

Op grond van hun diverse fysiologische rollen en hoge mate van substraatselectiviteit, vormen enzymen natuurlijke doelen voor de ontwikkeling van farmacologische middelen die zowel krachtig als specifiek zijn. Statinegeneesmiddelen verlagen bijvoorbeeld de cholesterolproductie door remming van 3-hydroxy-3-methylglutaryl-co-enzym A-reductase (Hoofdstuk 26), terwijl emtricitabine en tenofovirdisoproxilfumaraat de replicatie van het humaan immunodeficiëntievirus blokkeren door de virale reverse transcriptase te remmen (Hoofdstuk 34). Farmacologische behandeling van hypertensie omvat vaak de toediening van een remmer van het angiotensine-converterende enzym, waardoor het niveau van angiotensine II, een vasoconstrictor (Hoofdstuk 42).

Enzyme Kinetics definieert geschikte screeningvoorwaarden

Enzymkinetiek speelt een cruciale rol bij het ontdekken van geneesmiddelen. Kennis van het kinetische gedrag van het enzym van belang is in de eerste plaats noodzakelijk om geschikte testomstandigheden te selecteren voor het detecteren van de aanwezigheid van een remmer. De substraatconcentratie moet bijvoorbeeld zodanig worden aangepast dat er voldoende product wordt gegenereerd om de activiteit van het enzym gemakkelijk te kunnen detecteren zonder zo hoog te zijn dat de aanwezigheid van een remmer wordt gemaskeerd. Ten tweede biedt de enzymkinetiek de middelen voor het kwantificeren en vergelijken van de potentie van verschillende remmers en het definiëren van hun werkingsmechanisme. Niet-competitieve remmers zijn bijzonder wenselijk, omdat hun effecten, in tegenstelling tot concurrerende remmers, nooit volledig kunnen worden overwonnen door een verhoging van de substraatconcentratie.

De meeste geneesmiddelen worden in vivo gemetaboliseerd

Geneesmiddelontwikkeling omvat vaak meer dan de kinetische evaluatie van de interactie van remmers met het doelenzym. Geneesmiddelen kunnen worden beïnvloed door enzymen die aanwezig zijn in de patiënt of pathogeen, een proces dat metabolisme van geneesmiddelen.Penicilline en andere &bèta-lactam-antibiotica blokkeren bijvoorbeeld de celwandsynthese in bacteriën door het enzym alanyl-alaninecarboxypeptidase-transpeptidase onomkeerbaar te vergiftigen. Veel bacteriën produceren echter &bèta-lactamasen die de kritische &bètalactamfunctie in penicilline en verwante geneesmiddelen hydrolyseren. Een strategie om de resulterende antibioticaresistentie te overwinnen is het gelijktijdig toedienen van een &bètalactamaseremmer met een &bètalactamantibioticum.

Metabolische transformatie is soms nodig om een ​​inactieve drugprecursor om te zetten, of prodrug, in zijn biologisch actieve vorm (Hoofdstuk 53). 2&prime-Deoxy-5-fluorouridylzuur, een krachtige remmer van thymidylaatsynthase, een veelvoorkomend doelwit van kankerchemotherapie, wordt geproduceerd uit 5-fluorouracil via een reeks enzymatische transformaties die worden gekatalyseerd door een fosfo-ribosyltransferase en de enzymen van de deoxyribonucleo-kant bergingsroute (Hoofdstuk 33).Het effectieve ontwerp en de toediening van prodrugs vereist kennis van de kinetiek en mechanismen van de enzymen die verantwoordelijk zijn voor het omzetten ervan in hun biologisch actieve vormen.

De studie van enzymkinetiek en de factoren die de snelheid van door enzym gekatalyseerde reacties beïnvloeden, onthult de afzonderlijke stappen waarmee enzymen substraten in producten omzetten.

&DeltaG, de algehele verandering in vrije energie voor een reactie, is onafhankelijk van het reactiemechanisme en geeft geen informatie over: tarieven van reacties.

Kgelijk aan, een verhouding van reactie snelheidsconstanten, kan worden berekend uit de concentraties van substraten en producten bij evenwicht of uit de verhouding k1/k–1. Enzymen hebben geen invloed op Kgelijk aan.

Reacties verlopen via overgangstoestanden waarvoor &DeltaGF is de activeringsenergie. Temperatuur, waterstofionenconcentratie, enzymconcentratie, substraatconcentratie en remmers hebben allemaal invloed op de snelheid van door enzym gekatalyseerde reacties.

Meting van de snelheid van een door enzym gekatalyseerde reactie maakt in het algemeen gebruik van initiële snelheidsomstandigheden, waarvoor de vrijwel afwezigheid van product de omgekeerde reactie uitsluit.

Lineaire vormen van de Michaelis-Menten-vergelijking vereenvoudigen de bepaling van Km en Vmax.

Een lineaire vorm van de Hill-vergelijking wordt gebruikt om de coöperatieve substraatbindende kinetiek te evalueren die wordt vertoond door sommige multimere enzymen. De helling N, de Hill-coëfficiënt, weerspiegelt het aantal, de aard en de sterkte van de interacties van de substraatbindingsplaatsen. een waarde van N groter dan 1 duidt op positieve coöperatie.

De effecten van eenvoudige competitieve remmers, die typisch lijken op substraten, worden overwonnen door de concentratie van het substraat te verhogen. Eenvoudige niet-competitieve remmers lager Vmax maar heb geen invloed Km.

Voor eenvoudige competitieve en niet-competitieve remmers, de remmende constante Kl gelijk is aan de evenwichtsdissociatieconstante voor het relevante enzym-remmercomplex. Een eenvoudigere en minder rigoureuze term voor het evalueren van de effectiviteit van een remmer is IC50, de concentratie van remmer die 50% remming produceert onder de specifieke omstandigheden van het experiment.

Substraten kunnen in willekeurige volgorde worden toegevoegd (ofwel het substraat kan eerst met het enzym worden gecombineerd) of in een verplichte volgorde (substraat A moet eerder binden dan substraat B).

Bij pingpongreacties komen een of meer producten vrij van het enzym voordat alle substraten zijn toegevoegd.

Toegepaste enzymkinetiek vergemakkelijkt de identificatie en karakterisering van geneesmiddelen die selectief specifieke enzymen remmen. Enzymkinetiek speelt dus een centrale en cruciale rol bij het ontdekken van geneesmiddelen, bij vergelijkende farmacodynamiek en bij het bepalen van het werkingsmechanisme van geneesmiddelen.

Cook PF, Cleland WW: Enzymkinetiek en mechanisme. Garlandwetenschap, 2007.

Copeland RA: Evaluatie van enzymremmers bij het ontdekken van geneesmiddelen. John Wiley & Sons, 2005.

Cornish-Bowden A: Grondbeginselen van enzymkinetiek. Portland Press Ltd, 2004.

Dixon M: De bepaling van enzymremmerconstanten. Biochem J 195355:170.

Dixon M: De grafische bepaling van Km en Kl. Biochem J 1972129:197.

Fersht A: Structuur en mechanisme in eiwitwetenschap: een gids voor enzymkatalyse en eiwitvouwing. Vrijman, 1999.

Fraser CM, Rappuoli R: Toepassing van microbiële genomische wetenschap op geavanceerde therapieën. Jaarverslag Med 200556:459.

Henderson PJF: een lineaire vergelijking die de steady-state kinetiek beschrijft van enzymen en subcellulaire deeltjes die interageren met sterk gebonden remmers. Biochem J 1972127:321.

Schramm, VL: Enzymatische overgangstoestandtheorie en analoog ontwerp van overgangstoestanden. J Biol Chem 2007282:28297.

Schultz AR: Enzymkinetiek: van diastase tot multi-enzymsystemen. Cambridge University Press, 1994.

Segel IH: Enzymkinetiek. Wiley Interscience, 1975.

Wlodawer A: Rationele benadering van het ontwerp van aidsmedicijnen door middel van structurele biologie. Jaarverslag Med 200253:595.

Als u de auteursrechthebbende bent van materiaal op onze site en van plan bent dit te verwijderen, neem dan contact op met onze sitebeheerder voor goedkeuring.


Resultaten en discussie

Uit de initiële snelheidsmetingen blijkt dat waterstofperoxide een omkeerbare niet-competitieve remmer is van de door CsOxOx gekatalyseerde oxidatie van oxalaat

Productremming is een speciaal geval van remming waarbij de remmer ook een product is van de door enzym gekatalyseerde reactie. Gewoonlijk worden kinetische studies van enzymatische activiteit uitgevoerd onder omstandigheden waarbij de hoeveelheid product die tijdens de reactie aanwezig is in feite nul is. Dit verwijdert de effecten van de omgekeerde reactievormende reactanten en de effecten die worden waargenomen door de binding van het product aan het enzym, waardoor de snelheidsvergelijking drastisch wordt vereenvoudigd en, in het geval van een eenvoudig unireactantsysteem, de bekende Michaelis-Menten-vergelijking wordt geproduceerd (Vgl. 1). De introductie van niet-nul initiële productconcentraties herintroduceert de productafhankelijke termen van de snelheidsvergelijking en maakt het vaak mogelijk om onderscheid te maken tussen twee vergelijkbare potentiële kinetische modellen. De Michaelis-Menton- en Lineweaver-Burk-grafieken voor verschillende concentraties waterstofperoxide worden respectievelijk getoond in Fig 1A en 1B. Het percentage van de ongeremde specifieke activiteit en Km waarden voor de door CsOxOx gekatalyseerde oxidatie van oxalaat in aanwezigheid en afwezigheid van waterstofperoxide gemeten door MIMS worden weergegeven in Tabel 1. Beginconcentraties van waterstofperoxide verminderen de schijnbare maximale snelheid van katalyse met slechts milde verstoringen (een toename van 60%) van de waargenomen Km app waarden. Deze gegevens suggereren dat waterstofperoxide zich gedraagt ​​als een niet-competitieve remmer van CsOxOx. Niet-competitieve remmers kunnen binden aan de enzymvorm die het substraat bindt en een andere enzymsoort [44, 45]. In het klassieke niet-competitieve geval zijn de evenwichtsconstanten voor de binding van remmer met alleen enzym (Kl) en remmer met een andere enzymsoort (αKl, hieronder beschreven) zijn gelijk. Wanneer de twee evenwichtsconstanten verschillend zijn, wordt de traditionele remmingsnomenclatuur dubbelzinnig, waarbij dit geval vaak wordt gedefinieerd als een "gemengde" remmer en niet als een niet-competitieve remmer. Cleland stelt echter dat aangezien er geen a priori Omdat de evenwichtsconstanten gelijk moeten zijn, moet gemengde inhibitie worden aangeduid als niet-competitieve inhibitie [44]. Volgens deze definitie zal een niet-competitieve remmer de schijnbare maximale snelheid verminderen, maar kan deze de schijnbare maximale snelheid verminderen, verhogen of geen effect hebben op de schijnbare maximale snelheid. Km waarde. Alle modellen die consistent zijn met deze waarneming hebben waterstofperoxide dat reversibel zowel CsOxOx alleen als een ander CsOxOx-complex bindt.

Michaelis-Menten (A) en Lineweaver-Burk (B) grafieken van de initiële snelheden van oxalaatoxidatie door CsOxOx die de effecten aantonen van variërende initiële waterstofperoxideconcentraties: zwart, geen H2O2 rood, 2 mM H2O2 blauw, 4 mM H2O2 groen, 10 mM H2O2.

Toewijzen Kik app enKik app waarden voor de niet-competitieve remming waargenomen in Fig 1A en 1B, werden experimenten bij substraatconcentraties die resulteerden in Lineweaver-Burk-grafieken van gelijke afstand en gelijke gewichtspunten uitgevoerd in een groter bereik van waterstofperoxideconcentraties. De resulterende grafieken van wederzijdse initiële oxalaatoxidase-activiteit versus wederzijdse oxalaatconcentratie voor CsOxOx worden getoond in Fig. 2A. Fig. 2B toont de secundaire grafieken van de hellingen en intercepts van de reciproke lineaire best passende lijnen versus waterstofperoxideconcentratie. deKik app en Kik app waarden worden geschat op 7,91 ± 1,12 en 2,84 ± 1,06 uit de x-onderschepte secundaire plots [44]. De helling en de secundaire grafieken zijn lineair (R2-waarden groter dan 0,99), wat suggereert dat de remming van waterstofperoxide van CsOxOx volledig is (er komt geen product vrij uit de remmer en de verschillende enzymsoorten) en niet gedeeltelijk (tot 40 mM waterstof peroxide). Op basis van deze gegevens werd α geschat op 2,79 ± 1,12. Een manier om deze waarde wiskundig te controleren, is door de regressielijnen van de reciproke grafieken te gebruiken (Fig 2B) [44]. De lijnen snijden elkaar in het punt -0,207±0,011 op de x-as en 0,195±0,042 op de y-as, wat overeenkomt met een α-waarde van 2,25 ± 0,59. De waarden voor de α-constante bepaald met behulp van twee verschillende methoden komen goed overeen.

(A) Lineweaver-Burk-grafieken van initiële oxalaatoxidase-activiteit versus oxalaatconcentratie voor CsOxOx in variërende H2O2 concentraties: cirkels, geen H2O2 vierkanten, 10 mM H2O2 diamanten, 20 mM H2O2 driehoeken, 40 mM H2O2. (B) Secundaire plots van de hellingen en intercepts van de reciproke lineaire best passende lijnen (Fig 2A) versus waterstofperoxideconcentratiecirkels, hellingenvierkanten, intercepts.

Omkeerbare niet-competitieve remming en onomkeerbare remming kunnen worden onderscheiden door plotten Vmax app gegevens als functie van [E]t, waar [E]t vertegenwoordigt de totale eenheden enzymactiviteit die aan de test zijn toegevoegd [41]. Deze gegevens voor de remming van waterstofperoxide van de door CsOxOx gekatalyseerde oxidatie van oxalaat zijn weergegeven in figuur 3. De snelheid van productvorming is gelijk aan het product van de enzymconcentratie en een kinetische factor die een functie is van alle substraat, productactivator en remmerconcentraties. De reactiesnelheid van een door een enzym gekatalyseerde reactie is daarom een ​​lineaire functie van de enzymconcentratie met a ja-snijpunt van 0 en een helling van f([S], [P], [EEN], [L]) [42]. Een niet-nul x-onderscheppen houdt in dat de concentratie van het enzym is veranderd met het verschil van de x-onderschepping van nul die de concentratie van het verwijderde of toegevoegde actieve enzym definieert. Omkeerbare remmers inactiveren het enzym per definitie niet permanent en kunnen daarom alleen de helling van de lijn beïnvloeden, maar niet de x-onderscheppen. In figuur 3 lijken de curven met en zonder initiële concentraties waterstofperoxide niet verschillend te hebben x-onderschept. Het x-snijpunt voor de plot zonder aanwezige remmer was 7 nM ± 8 nM en het x-snijpunt voor de plot met aanwezige remmer was 8 nM ± 9 nM. Deze x-onderscheppingen van beide lineaire passingen zijn niet significant verschillend van elkaar en ze zijn niet significant verschillend van nul (één standaarddeviatie van het x-snijpunt voor beide lijnen omvat nul), wat suggereert dat CsOxOx niet wordt geïnactiveerd na toevoeging van waterstofperoxide binnen het tijdsbestek van de kinetische test. Aangezien de curve met aanwezig waterstofperoxide een kleinere helling heeft en bij benadering door de oorsprong gaat, zijn deze gegevens consistent met het feit dat waterstofperoxide een reversibele niet-competitieve remmer is van de door CsOxOx gekatalyseerde oxidatie van oxalaat. In het geval van een onomkeerbare remmer zou de helling van de lijn met de aanwezige remmer dezelfde helling hebben en de x-as op een positie die gelijk is aan de hoeveelheid enzym die onomkeerbaar is geïnactiveerd [41, 42]. Het is belangrijk op te merken dat deze gegevens (Fig. 3) aantonen dat de concentratie van onomkeerbaar geïnactiveerd enzym verwaarloosbaar is onder initiële snelheidsomstandigheden.

Elk punt staat voor a Vmax app bepaling bij vijf concentraties oxalaat (0,2, 0,5, 1,0, 5,0 en 10,0 mM).

Omzet gegenereerd waterstofperoxide leidt tot inactivering van CsOxOx

HPLC-chromatogrammen die de hoeveelheden waterstofperoxide en oxalaat op discrete tijdstippen volgen, worden getoond in Fig. 4A (geen catalase aanwezig) en 4B (catalase aanwezig). Waterstofperoxide-, oxalaat- en succinaatstandaarden elueerden respectievelijk na 6,3 minuten, 6,9 minuten en 12,4 minuten en informeerden de getoonde piektoewijzingen. Bij afwezigheid van katalase was de hoeveelheid oxalaat die na 24 uur achterbleef ongeveer 85% van de aanvankelijke hoeveelheid (10 mM) en het verschijnen van een ophoping van waterstofperoxide was zichtbaar in het chromatogram. De nabijheid van de waterstofperoxidepiek en de oxalaatpiek verstoorde de nauwkeurige integratie van hun respectieve gebieden. Na 24 uur had een aliquot van het monster zonder katalase geen detecteerbare activiteit in de MIMS-assay, wat suggereert dat de aanwezige CsOxOx geïnactiveerd was door de opbouw van door omzet gegenereerd waterstofperoxide. Verder levert de toevoeging van katalase aan het geïnactiveerde enzym geen actieve CsOxOx op van de waargenomen inactivatie. Deze resultaten suggereren dat waterstofperoxide ten minste twee afzonderlijke effecten op CsOxOx heeft. Ten eerste gedraagt ​​waterstofperoxide zich als een reversibele niet-competitieve remmer van de initiële reactiesnelheid zoals hierboven beschreven. Afzonderlijk lijkt waterstofperoxide ook betrokken te zijn bij de langzame inactivatie van het CsOxOx-enzym, waarneembaar minuten tot uren na de initiële enzymomzetting.

Een aliquot van de incubatiereactie zonder (A) of met (B) recombinant rundercatalase werd geanalyseerd bij aanvang, 20 minuten, 1 uur, 2 uur en 24 uur.

Om de effecten van omzet op CsOxOx waar te nemen, wordt een grafiek van reactiesnelheden na 0 en 2 uur omzet getoond in figuur 5. Net als de gegevens in figuur 3, wordt de helling van de omzet "behandeld" (twee uur omzet in aanwezigheid van 10 mM oxalaat) is de initiële snelheidscurve kleiner dan die van de "onbehandelde" (geen eerdere omzet) controle. Dit suggereert dat een verstoring van de kinetische functie ten minste gedeeltelijk te wijten is aan de opbouw van het waterstofperoxideproduct tijdens de twee uur omzet. In figuur 5 verschilt het x-snijpunt van de met omzet behandelde curve echter van de controlecurve. Deze waarneming komt overeen met inactivering van CsOxOx gedurende de periode van twee uur [41, 42]. De inactivatie van het enzym wordt alleen gezien wanneer het enzym vooraf wordt geïncubeerd met oxalaat. Pre-incubatie in buffer of buffer en waterstofperoxide vertoonde geen inactivatie. In het bijzonder resulteerde CsOxOx, voorgeïncubeerd met 10 mM waterstofperoxide gedurende twee uur en vervolgens getest bij eindconcentraties van 1 mM en 10 mM waterstofperoxide, in gemeten initiële snelheden die overeenkwamen met die verwacht van de hierboven beschreven remmingsonderzoeken (91,4% en 44,3% van de ongeremde specifieke activiteit, respectievelijk). Enzym dat vooraf was geïncubeerd met 10 mM kaliumoxalaat bezat minder dan 20 procent van de oorspronkelijke enzymactiviteit na twee uur (gegevens niet getoond) en na 24 uur was geen activiteit detecteerbaar. Tabel 2 toont de resultaten van MIMS-metingen van monsters zonder voorafgaande omzet, omzet in afwezigheid en in aanwezigheid van 1,0 mg/mL rundercatalase zoals beschreven in de sectie Materialen en methoden. Het enzym was redelijk stabiel onder de omstandigheden van het experiment waarbij 73 procent van de oorspronkelijke enzymactiviteit overbleef na incubatie bij 25°C gedurende 24 uur. Wanneer catalase aanwezig is, blijft echter ongeveer 80 procent van de enzymactiviteit over na 24 uur. Deze gegevens suggereren dat waterstofperoxide of een derivaat daarvan een sleutelrol speelt bij de omzetafhankelijke inactivatie van CsOxOx.

Het is niet meteen duidelijk hoe de aanwezigheid van door omzet gegenereerd waterstofperoxide CsOxOx inactiveert. Een voorgesteld mechanisme voor katalyse van gerstoxalaatoxidase identificeert de enzymfractie die Mn3+ bevat als de actieve vorm van het enzym [28]. In dit voorstel wordt de omzetting gestart nadat oxalaat bindt aan het metaalcentrum en een elektron wordt overgedragen van het oxalaatligand naar een Mn2+-ion. Het verlies van een elektron vergemakkelijkt de decarboxylering van het oxalaatligand, waardoor een mangaangebonden koolstofdioxideradicaalanion achterblijft waarvan wordt voorgesteld dat het reageert met diatomische zuurstof om koolstofdioxide en een hydroperoxylradicaal te produceren. Spectroscopische studies die consistent zijn met de persistentie van de hydroperoxylradicaalsoort die cruciaal is voor de enzymomzetting, ondersteunen dit voorstel. Whitaker et al hebben de hypothese geopperd dat de hydroperoxylradicaal het Mn2+-ion direct opnieuw oxideert, waardoor het enzym opnieuw wordt geactiveerd tot de Mn3+-vorm voor verdere omzetting. Verlies van het hydroperoxylradicaal zou dus de reoxidatie van het metaalcentrum verhinderen, waardoor het inactief zou worden [28]. Een soortgelijk mechanisme van inactivering van OxDC werd naar voren gebracht om de EPR-waarneming te beschrijven van een spin-gevangen koolstofdioxideradicaalsoort die een "lekkende" actieve plaats suggereert van waaruit het koolstofdioxideradicaal kan dissociëren en in bulkoplossing terecht kan komen. Wederom werd voorgesteld dat bij afwezigheid van een elektronenput op de actieve plaats, de inactivering van het enzym zou plaatsvinden na dissociatie van kooldioxideradicaal [33]. Het is belangrijk op te merken dat de Whitaker et al mechanisme en waarnemingen voor monocupine-gerstoxalaatoxidase zijn mogelijk niet nauwkeurig voor CsOxOx. Een significant verschil is dat het gerst-enzym onder anaërobe omstandigheden in aanwezigheid van oxalaat wordt geïnactiveerd en dat ook na de herintroductie van zuurstof blijft. Daarentegen CsOxOx, hoewel inactief onder anaërobe omstandigheden in aanwezigheid van oxalaat, herwint activiteit bij herintroductie van zuurstof (gegevens niet getoond). Een ander significant verschil is dat de aanwezigheid van catalase de enzyminactivatie van het gerstenzym versnelt, terwijl catalase beschermt tegen inactivatie in CsOxOx. Deze waarnemingen zijn niet consistent met een mechanisme voor CsOxOx waarbij alleen een hydroperoxylradicaal wordt gebruikt voor de regeneratie van katalytisch competent enzym, en ondersteunen de rol van het Mn(II) bij de reductieve activering van diatomische zuurstof. Onze resultaten suggereren een geheel andere methode van inactivering. We zien dat enzyminactivatie optreedt tijdens CsOxOx-turnover en alleen in aanwezigheid van waterstofperoxide. Dit suggereert dat waterstofperoxide onomkeerbaar reageert met een omzettussenproduct waardoor het enzym inactief wordt en doet denken aan de waterstofperoxide-inactivatie van katalase [46].

MIMS-metingen onthullen ongeveer 1,3 mol CO2 wordt geproduceerd per één mol O2 verbruikt. Wanneer deze verhouding wordt uitgezet als een functie van oxalaat (van 0,5 tot 10 mM) in het reactiemengsel (Figuur C in S1-bestand), is het resultaat in wezen een horizontale lijn die aangeeft dat de verhouding onafhankelijk is van de initiële oxalaatconcentratie. Verder is de verhouding van CO2 geproduceerd per één mol O2 verbruikt is onafhankelijk van de waterstofperoxideconcentratie (in zowel initiële snelheidsmetingen als in het geval van door omzet veroorzaakte inactivatie). Ondanks de toepassing van talrijke testtechnieken en veel belangstelling voor de stoichiometrie van deze reactie, is dit voor zover ons bekend het eerste rapport van de waargenomen stoichiometrische verhouding van mol CO2 geproduceerd per mol O2 verbruikt van oxalaatoxidase. Er is gemeld dat voor sorghum OxOx de consumptie van oxalaat direct gerelateerd was aan de vorming van waterstofperoxide [6].De toepassing van Warburg-manometrische technieken op peroxisomale preparaten uit de bladeren van het spinaziebiet-enzym kon de stoichiometrie niet vaststellen vanwege de kleine hoeveelheid verbruikte zuurstof en gevormde kooldioxide [10]. Manometrische metingen van de snelheid van het enzym van de parasitaire schimmel Tilletia controversa werden vertroebeld door onzuivere enzympreparaten [47]. Vloeistofscintillatieprocedures werden gebruikt om 14 CO . te relateren2 vorming tot 14C-oxalaatverdwijning, maar het zuurstofverbruik werd in die experimenten niet gemeten [48]. Interessant is dat oxalaatdecarboxylase van Bacillus subtilis (BsOxDC) is gemuteerd (SENS161-4DASN) om de oxidatiereactie uit te voeren en een verhouding van 1,3 mol geproduceerd waterstofperoxide tot 1 mol van de ene elektronoxidatie van de kleurstof ABTS is gerapporteerd [27]. Recente MIMS-metingen van deze mutant BsOxDC gingen uit van een verhouding van 2 mol CO2 wordt geproduceerd per één mol O2 verbruikt bij lage oxalaatconcentraties [29]. Deze aanname droeg bij tot de conclusie dat slechts 9% van het totale aantal actieve plaatsen van de SENS161-4DASN-mutant BsOxDC de oxidatiereactie uitvoert, waarbij de overige plaatsen oxalaat niet-oxidatief decarboxyleren.

Eerder voorgestelde mechanistische schema's gaan allemaal uit van een 2 op één molaire relatie tussen CO2 productie en O2 consumptie. Dat in alle geteste omstandigheden een verhouding van 1,3 tot één wordt waargenomen, verhoogt de mogelijkheid dat er een extra oxidatie kan plaatsvinden. Een mogelijke verklaring zou kunnen liggen in het lot van het kooldioxideradicaal-anion gevormd na de eerste decarboxylering. Zoals hierboven vermeld, suggereert de spin-trapping van deze soort in zowel CsOxOx als OxDC [25, 32-34] dat het uit de actieve plaats lekt. Dit radicaal kan reageren met opgeloste zuurstof uit bulkoplossing om een ​​superoxideradicaal te vormen. Superoxideradicalen zijn gevangen in het geval van de OxDC-gekatalyseerde redoxneutrale decarboxylering van oxalaat [33]. Aangezien superoxideradicalen (pKa van 4,88) voornamelijk bestaan ​​als hydroperoxylradicalen onder onze experimentele omstandigheden, zou ontsnapping van deze soort uit de actieve plaats en daaropvolgende oxidatie van exogene soorten resulteren in het waargenomen verhoogde verbruik van zuurstof [28].

Circulair dichroïsme (CD) studies van CsOxOx tonen geen globale structurele veranderingen in de aanwezigheid van waterstofperoxide

Er werden CD-experimenten uitgevoerd om de secundaire structuur te volgen als functie van de waterstofperoxideconcentratie en temperatuur. Fig. 6A laat zien dat het CD-spectrum voor CsOxOx niet wordt verstoord door waterstofperoxideconcentraties tot 20 mM. Deze gegevens geven aan dat waterstofperoxide de algehele globale eiwitstructuur van het enzym niet beïnvloedt. Daarentegen wordt het effect van temperatuur op het CD-spectrum van CsOxOx getoond in figuur 6B. Spectra genomen bij hogere temperaturen vertonen een dieper minimum en een verschuiving naar het nabije UV-gebied. Typisch tonen voorbeelden in de literatuur van het effect van temperatuur op het CD-spectrum van eiwitten een lagere mate van molaire ellipticiteit bij toenemende temperatuur [49]. Er zijn echter voorbeelden waarbij de CD-spectra een grotere mate van molaire ellipticiteit vertonen, net als CsOxOx [50].


Bekijk de video: Top, nulpunt en snijpunt HAVO wiskunde B (December 2021).