Informatie

Kunt u een ATP-assaymonster invriezen voor later gebruik?


Ik ga volwassen Drosophila gebruiken om een ​​ATP-assay uit te voeren (ATP-bepalingskit A22066). Het handigst voor mij is om de monsters te bevriezen en het experiment later uit te voeren.

Het protocol van de fabrikant van de kit blijft echter zeggen dat de test extreem gevoelig is, dus ik weet niet zeker of het goed is om de gehomogeniseerde monsters gedurende een korte periode onder -80°C te houden.


Pure ATP kan stabiel zijn als het bevroren wordt bewaard, maar ik zou me, misschien ten onrechte, zorgen maken over het bewaren van een gehomogeniseerd monster. U moet proberen een gehomogeniseerd monster in tweeën te delen en de ene helft meteen en de andere helft na het invriezen te testen om te zien hoe de signalen zich verhouden.


Adenosine 5′-trifosfaat-Agarose

Indien beschikbaar voor een bepaald product, kan de aanbevolen hertestdatum of de vervaldatum worden gevonden op het analysecertificaat.

Hoe krijg ik partijspecifieke informatie of een analysecertificaat?

Het lotspecifieke COA-document is te vinden door het lotnummer hierboven in te voeren onder het gedeelte "Documenten".

Hoe vind ik prijs en beschikbaarheid?

Er zijn verschillende manieren om prijzen en beschikbaarheid van onze producten te vinden. Zodra u inlogt op onze website, vindt u de prijs en beschikbaarheid weergegeven op de productdetailpagina. U kunt contact opnemen met een van onze verkoop- en servicekantoren voor klanten om een ​​offerte te ontvangen. Klanten in de VS: 1-800-325-3010 of bekijk lokale kantoornummers.

Wat is de verzendinformatie van het Department of Transportation voor dit product?

Transportinformatie is te vinden in sectie 14 van het (M)SDS van het product. Gebruik de link op de productdetailpagina van het product om toegang te krijgen tot de verzendinformatie voor dit materiaal.

Hoe kan ik Product A2767, Adenosine 5´-trifosfaat-Agarose hydrateren?

De hars kan worden gehydrateerd door deze gedurende ten minste 30 minuten in overtollig water, ongeveer 50 ml per g hars, te plaatsen. Verwijder de lactosestabilisator door de hars te wassen op een Buchner-trechter met zacht vacuüm, met ongeveer 100 ml water per g hars. Laat de hars niet drogen. Resuspendeer de hars in overtollig water of startbuffer om het kolombed te vullen.

Hoe kan ik mijn eiwitten uit Product A2767, Adenosine 5´-trifosfaat-Agarose elueren?

Specifiek gebonden eiwitten kunnen worden geëlueerd met 10-100 mM ATP of ADP. Niet-specifiek gebonden eiwitten kunnen worden geëlueerd met 2 M NaCl of KCl in water of 7 M ureum.

Hoe kan ik Product A2767, Adenosine 5´-trifosfaat-Agarose regenereren?

Aangezien N6-[N-(6-aminohexyl)-carbamyl]-ADP een substraat is voor acetaatkinase en pyruvaatkinase, kunnen deze enzymen worden gebruikt om ATP uit ADP op de hars te regenereren onder omstandigheden die de omgekeerde reactie bevorderen. Was de hars met 20 volumes van 50 mM Tris HCl-buffer (pH 8,2), met 0,2 mM EDTA en 100 mM KCl. Incubeer de hars 's nachts bij 2-8 ° C in een ATP-regenererend mengsel met 0,2 mM fosfoenolpyruvaat, pyruvaatkinase (10 eenheden per ml hars), 5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA en 100 mM KCl in 50 mM Tris HCl-buffer (pH 8,2). Was de hars met 25 kolomvolumes van 2 mM ATP in 2 M KCl en breng de hars opnieuw in evenwicht met 25 kolomvolumes monsterbuffer. Als alternatief kan het ATP-regenererende mengsel 20 mM acetylfosfaat, acetaatkinase (6,8 eenheden per ml hars) en 3 mM MgCl2 in 100 mM Tris HCl (pH 7,6) bevatten. Als acetaatkinase wordt gebruikt, wast u de hars voor met 25 kolomvolumes van 100 mM Tris HCl (pH 7,6), maar gebruikt u dezelfde laatste was- en her-evenwichtsstappen als gegeven voor pyruvaatkinase.

Kan ik Product A2767, Adenosine 5´-trifosfaat-Agarose, bewaren nadat ik het heb gehydrateerd?

Voor de korte termijn is het mogelijk om de gehydrateerde hars op te slaan in 20% ethanol en verdunde buffer bij 2-8 ° C. Over het algemeen kan de gehydrateerde hars gekoeld worden bewaard in water of buffer met een bacteriostaat, zoals 0,02% natrium azide of thimerosal. Autoclaveer of bevries de gehydrateerde hars niet. De hars kan meerdere keren worden gebruikt zonder verlies van effectiviteit. Het ATP zal echter in de loop van de tijd langzaam hydrolyseren tot ADP en onder bepaalde omstandigheden kan dit proces tijdens het gebruik worden versneld. De hars kan worden geregenereerd, zie de veelgestelde vragen over regeneratie voor dit product.


Recensie-artikel

Olivier Braissant 1* , Monika Astasov-Frauenhoffer 2 , Tuomas Waltimo 2 en Gernot Bonkat 3
  • 1 Afdeling Biomedische Technologie, Faculteit Geneeskunde, Universiteit van Basel, Allschwil, Zwitserland
  • 2 Afdeling Onderzoek, Universitair Centrum voor Tandheelkunde, Universiteit van Basel, Basel, Zwitserland
  • 3 Alta-Uro AG, Bazel, Zwitserland

Levensvatbaarheid en metabole testen worden vaak gebruikt als proxy's om het algehele metabolisme van micro-organismen te beoordelen. De verscheidenheid van deze testen in combinatie met de weinige informatie die door sommige testkits of online protocollen wordt verstrekt, leidt vaak tot fouten of een slechte interpretatie van de resultaten. Bovendien is het gebruik van sommige van deze testen beperkt tot eenvoudige systemen (meestal zuivere culturen), en moet voorzichtigheid worden betracht bij hun toepassing op milieumonsters. In deze review worden de nodige gegevens verzameld om de reacties of metingen te begrijpen die zijn uitgevoerd in veel van de testen die gewoonlijk worden gebruikt in verschillende aspecten van de microbiologie. Ook hun onderlinge relaties, aangezien metabolisme veel van deze testen verbindt, wat resulteert in correlaties tussen gemeten waarden en parameters, wordt besproken. Ten slotte worden de beperkingen van deze testen besproken.


Abstract

Aangezien mica een vervanging is voor glas in de in vitro actine motiliteitstest, onderzocht ik de structuur van zware meromyosine (HMM) kruisbruggen die actinefilamenten ondersteunen door middel van quick-freeze deep-etch replica-elektronenmicroscopie. Deze methode was in staat om de interdomeinspleet van het monomere actinemolecuul op te lossen. HMM-koppen die niet aan actine zijn gebonden, waren, wanneer waargenomen door deze techniek, recht en langwerpig in afwezigheid van ATP, maar sterk geknikt na toevoeging van ATP of ADP-anorganisch vanadaat om de vermeende langlevende analoog van HMM-ADP-anorganisch te produceren fosfaat. Het beeld met lage vergroting van het ATP-bevattende acto-HMM-preparaat vertoonde kenmerken die kenmerkend zijn voor glijdende actinefilamenten op glazen dekglaasjes. Bij hoge vergroting bleken alle HMM-moleculen door één kop aan actine te zijn bevestigd, waarbij de meerderheid loodrecht op de filamentas uitsteekt, terwijl bij afwezigheid van ATP HMM binding met twee koppen vertoonde met een overwicht van moleculen gekanteld op 45 °. Gedetailleerd onderzoek van de vorm van HMM-koppen die betrokken zijn bij glijden, toonde een afgerond en plat uiterlijk van de punt en een relatief dun nekgedeelte alsof de koppen actinefilament vastgrijpen, in tegenstelling tot strikte kruisbruggen die een peervormige configuratie hebben met een meer geleidelijke tapsheid . Dergelijke configuraties van HMM-koppen waren in wezen hetzelfde als ik eerder heb waargenomen op actomyosine subfragment-1 (S1) met dezelfde techniek, behalve de aanwezigheid van een extra nekgedeelte van HMM dat de interpretatie van de afbeeldingen vergemakkelijkt. Interessant is dat onder actief glijdende omstandigheden zeer weinig koppen werden gekanteld in de strikte configuratie. Op het eerste gezicht gaf de toevoeging van ADP aan het rigor-complex beelden die veel leken op die verkregen met ATP, maar ze bleken anders te zijn. De bijdrage van de structurele verandering van dwarsbruggen aan de krachtontwikkeling wordt besproken.


Detectie van Mycoplasma in celculturen

Mycoplasma is een prokaryotisch organisme dat een frequente en occulte verontreiniging van celculturen is. Dit organisme kan veel aspecten van de celfysiologie wijzigen, waardoor experimenten die worden uitgevoerd met besmette cellen waardeloos worden. Vanwege hun kleine formaat kunnen Mycoplasma's door filters gaan die worden gebruikt om bacteriële en schimmelbesmetting te voorkomen en zich mogelijk verspreiden naar alle culturen in een laboratorium. Het is essentieel dat alle nieuwe celculturen die een laboratorium binnenkomen en alle celbanken worden getest op de aanwezigheid van Mycoplasma. Het wordt aanbevolen om twee technieken te gebruiken, gekozen uit een op PCR gebaseerde methode, indirecte kleuring en een agar- en bouilloncultuur. Dit protocol beschrijft deze drie tests voor het detecteren van Mycoplasma, die 1 d tot 3-4 weken duren, en dergelijke tests zouden een verplicht onderdeel moeten zijn van kwaliteitscontrole in elk weefselkweeklaboratorium.


Diffusie, membranen en cryogenen: kunnen we cellen bevriezen?

Ik sneed een biet in gelijke gewichtsdelen (14 g) en deed ze vervolgens in potten met verschillende zoutconcentraties: 0%, 10%, 20%, 30%, 40% en 50%. Ik heb 3 sets hiervan opgesteld en 1 set in een vriezer geplaatst, 1 set in de koelkast en de laatste set op kamertemperatuur. Na 24 uur heb ik de celbeschadiging gemeten door de concentratie van bietenpigment in het water te meten. Het scheuren van cellen zou het pigment in het water vrijgeven. Ik gebruikte een spectrofotometer om het percentage lichttransmissie te meten als een maat voor de pigmentconcentratie in het water.

Er was weinig celbeschadiging in de koelkast en geen in de potten op kamertemperatuur, maar het bevriezen veroorzaakte aanzienlijke celschade. Wanneer cellen echter werden geconserveerd met een zoutconcentratie van meer dan 20%, was er aanzienlijk minder schade en weinig celbeschadiging bij een concentratie van 40%.

Het belang van deze bevindingen is dat er een manier is om cellen te redden en te bewaren. Dit geeft ook aan dat mensen op een dag dieren of mensen kunnen bevriezen en weer tot leven kunnen brengen.

Probleem

Wat gaat er door een celmembraan?

Wat gaat er door een membraan? In dit experiment worden zetmeel en suiker getest om te kijken of ze door een membraan gaan. Het zetmeelmolecuul is veel groter dan het suikermolecuul, aangezien de suiker die ik gebruikte een eenvoudige suiker (glucose) is. De suiker moet recht door het membraan kunnen, maar daar wordt het zetmeel te groot voor.

Ik hoop dat ik een "cel" kan maken en echt kan zien hoe een membraan de cel bewaakt. Een experiment met cellen vorig jaar op school leidde tot mijn onderzoek en wakkerde mijn nieuwsgierigheid naar scheikunde helemaal aan.

Is het mogelijk om cellen te bewaren tijdens het invriezen?

Omdat het bijna onmogelijk is om een ​​cel zonder bescherming te bevriezen en toch in leven te houden, kan dit project een manier tonen. Is het mogelijk? Het zal (gemakkelijk) mogelijk zijn om een ​​cel te bevriezen, te laten leven en goed te laten functioneren.

Ik hoop het behoud van cellen in vriesomstandigheden te bereiken. Een idee van mijn natuurkundeleraar leidde tot mijn onderzoek. Ik was erg benieuwd hoe ik cellen kon bewaren, zelfs nadat ik ze had ingevroren.

Achtergrond informatie

Wat gaat er door een membraan?

Een membraan is een dun laagje lipiden (vetten) en eiwitten rond een cel. Deze bepalen wat er in of uit een cel mag komen. Deze beweging van het in- of uitgaan van een cel wordt osmose genoemd. Van nature gaan deeltjes van een plaats met een hoge concentratie naar een plaats met een lage concentratie (diffusie). (De deeltjes doen dit mogelijk niet als ze gedwongen worden te bewegen.)

De twee groepen binnen koolhydraten worden zetmeel en suikers genoemd. De algemene formule voor koolhydraten is (CH2Op. ("n" is het aantal koolstoffen in de ruggengraat) Eén koolhydraat wordt een enkelvoudige suiker of een monosaccaride genoemd. Glucose is, net als galactose en fructose, een isomeer. Een isomeer is een verbinding die qua structuur verschilt, maar niet qua moleculaire samenstelling. Disachariden zijn twee monosachariden gecombineerd in een gecondenseerde reactie. Polysachariden zijn eenvoudige suikerbouwstenen die aan elkaar zijn gebonden om ketens te vormen.

Glycogeen, of dierlijk zetmeel, is een plaats om energie op te slaan in dieren. Glycogeen bestaat voor dieren uit glucosemoleculen die aan elkaar zijn geregen in een sterk vertakte keten. In planten wordt glucose in de vorm van een polysacharide en een monosacharide echter ook wel een zetmeel genoemd. Zetmelen zijn metabolische reserves die door groene planten worden geproduceerd door middel van fotosynthese. (Zetmeel komt voor in de vorm van granen.) Er zijn twee basisvormen van zetmeel, onvertakte ketens die oprollen en vertakte ketens die vergelijkbaar zijn met glycogeen.

Feezing Cellen

Als de vloeistof in een cel niet wordt verminderd wanneer de cel bevriest, dan zal het membraan van de cel breken wanneer het water in de cel bevriest en uitzet. (Een celmembraan is het buitenste deel van de cel waardoor de voorwerpen door diffusie in of uit de cel kunnen komen.) De binnenkant van de cel zal dan naar buiten lekken en de cel sterft. (Er zijn enkele cellen in bepaalde dieren, zoals de boskikker, die worden beschermd tegen bevriezing door lichaamsvloeistoffen.)

Er kan wat water uit cellen worden gehaald die niet zijn beschermd, door middel van een hypertone oplossing. (Doordat er veel soorten hypertone oplossingen zijn, zou deze waarschijnlijk suiker of zout bevatten.) Deze hypertone oplossing zou waarschijnlijk ook de cel volledig moeten omringen zodat er diffusie plaatsvindt die de cel uitgaat. Diffusie is de beweging die in of uit een cel gaat van een plaats met een hoge concentratie naar een plaats met een lagere concentratie. Niet alle dingen kunnen echter in een cel diffunderen. Het object moet klein genoeg zijn om door het celmembraan te gaan. (Het celmembraan is gemaakt van voornamelijk lipiden met zeer kleine gaatjes erin.)

Hypothese

Wat gaat er door een membraan?

Ik verwacht dat de glucose door het membraan gaat en het zetmeel niet kan omdat een zetmeelmolecuul te groot is. Het glucosemolecuul is een eenvoudige suiker en een vrij klein molecuul. Het moet gemakkelijk door het membraan kunnen.

Cellen bevriezen

Ik verwacht dat het zout de bieten bewaart als ze bevroren zijn, omdat het zout het water in de bietencel (een deel ervan) zal helpen om naar buiten te diffunderen. Hierdoor blijft er genoeg ruimte over voor het water in de cel om uit te zetten en toch in de cel te passen.

Materialen

*Benedicts oplossing met druppelaar

*Jodium met druppelaar

*ongeveer 30 reageerbuisjes

*bekers (6 of 7)

*verwarmingsoppervlak

*elastiekjes en/of tape

*gegradueerde cilinder (10ml.)

*reageerbuisrek

*Bieten (1 of 2 kleine)

*scherp mes

*zout (grote bak)

*18 potjes babyvoeding (of in ieder geval potjes rond dat formaat)

*spectrofotometer (colorimeter)

*een weegschaal die gram weegt

Procedure

  1. Maak een schaal van verschillende kleuren gemaakt wanneer 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02% glucose wordt toegevoegd aan Benedict& #39s Oplossing en zet 5 minuten in een warmwaterbad.
  2. Label de potten (reageerbuisjes) en maak foto's.
  3. Plaats 5ml. van 0,1% glucose in twee reageerbuizen.
  4. Plaats 10ml. van 0,1% glucose in twee verschillende reageerbuizen.
  5. Plaats een stuk membraan over de bovenkant van elke reageerbuis en zorg ervoor dat de zijkanten van het membraan worden "afgedicht" met tape en/of elastiekjes.
  6. Plaats elk reageerbuisje in een bekerglas (ondersteboven) gevuld met 50 ml. van water.
  7. Plaats 5ml. van water in een reageerbuis met een eetlepel zetmeel. (Doe dit twee keer om de nauwkeurigheid te garanderen.)
  8. Plaats een stuk membraan over de bovenkant van elke reageerbuis en zorg ervoor dat de zijkanten van het membraan worden afgesloten met tape en/of elastiekjes.
  9. Plaats elk reageerbuisje in een bekerglas (ondersteboven) gevuld met 50 ml. van water.

10. Wacht een nacht en doe 5 druppels Benedict's Solution in elk reageerbuisje waar de glucose in zit.

11. Plaats elk in een warmwaterbad en vergelijk hoeveel extra water naar boven komt met de gemaakte foto's.

12. Doe 5 druppels jodium in elke zetmeelbeker en plaats ze vervolgens 5 minuten in een warmwaterbad. Als de kleur donkerder wordt, is het zetmeel door het membraan gegaan.

  1. Gebruik de liniaal om bietensecties van 12-1 cm 3 uit te snijden.
  2. Weeg de bieten en zorg ervoor dat ze allemaal even groot wegen. (14 gram.)
  3. Vul 3 potten met gewoon kraanwater.
  4. Vul nog drie potten met 10% zoutgehalte in 50 ml. van water.
  5. Vul nog drie potten met 20% zoutgehalte in 50 ml. van water.
  6. Vul nog drie potten met 30% zoutgehalte in 50 ml. van water.
  7. Vul nog drie potten met 40% zoutgehalte in 50 ml. van water.
  8. Vul de laatste drie potten met 50% zoutgehalte in 50 ml. van water.
  9. Verdeel de potten in drie sets met elk 0%, 10%, 20%, 30%, 40% en 50% zoutgehalte in 50 ml. van water.

10. Plaats een bietenblokje in elk van de potten van 2 van de sets. Laat de derde set leeg!

11. Zet een van de sets met bieten erin in de vriezer. Zet de andere twee sets in de koelkast.

12. Haal na een dag of twee alle bietenpotten eruit.

13. Meet met de spectrofotometer het absorptie- en transmissiepercentage voor elk van de bietenpotten. Gebruik de lichtinstelling 530 nm. Gebruik de set potten zonder bieten erin als blanco monsters (controle).

Fezing Cells: effect van zoutconcentratie op celbeschadiging

Discussie

Wat gaat er door een membraan?

De gegevens in dit project vertellen ons waar een ruwe grenslijn ligt van hoe groot een molecuul kan zijn en nog steeds door een membraan kan diffunderen. Dit zou ons kunnen helpen begrijpen waarom de spijsvertering zo belangrijk is en zo lang duurt om daadwerkelijk te gebeuren. Dit kan ons ook vertellen wat voor soort dingen je eigenlijk in je cellen zou kunnen hebben.

Cellen bevriezen

De gegevens voor dit project vertellen ons hoeveel zout er nodig is voor het behoud van cellen na het invriezen. Beschadigde cellen geven hun pigment af aan het water, waardoor de lichttransmissie afneemt. 0% zoutoplossing na bevriezing resulteerde in 0% lichttransmissie, met bijna volledige celbeschadiging. In een 20% zoutoplossing nam de conserveringssnelheid dramatisch toe, wat blijkt uit een toename van de lichttransmissie. Met een zoutgehalte van 40% lijkt te zijn voorkomen dat de meeste cellen scheuren. De koelkastgegevens fungeren als controle en vertonen weinig celschade, wat wordt aangegeven door een hoge lichttransmissie. Er was een daling van de lichttransmissie bij 40% zout en hoger. Ik heb hier geen verklaring voor.

De gegevens vertellen ons ook dat het misschien mogelijk is om cellen te bevriezen en ze daarna weer tot leven te wekken. Dit is een van de eerste stappen in het behoud van dieren.

Conclusie

Wat gaat er door een membraan?

Mijn hypothese dat een zetmeelmolecuul te groot zou zijn om door een membraan te gaan, klopte. Ik had ook gelijk dat glucose kon diffunderen. Dit project bewijst dat, hoewel zowel zetmeel als suikers koolhydraten zijn, ze verschillend van grootte zijn. Zetmeelmoleculen zijn te complex om door een membraan te diffunderen. Het project bewijst dat niet alle moleculen door een membraan kunnen.

Deze informatie helpt ons het proces van de spijsvertering te begrijpen. De voedselmoleculen moeten tot een bepaalde grootte worden verteerd voordat de cel het kan 'accepteren'.

Cellen bevriezen

Mijn hypothese, dat het zout bevroren bietencellen zou bewaren, was juist. De potten met het meeste zout in de vriezer hadden slechts een klein beetje last van het invriezen, terwijl de potten met weinig zout fel paars waren van dode cellen.

Dit project bewijst dat er een manier is om cellen op te slaan en te bewaren. Dit bewijst ook dat mensen op een dag dieren zouden kunnen bevriezen en weer tot leven kunnen wekken.Het belang van deze bevindingen is dat als mensen later in de geschiedenis van de wereld zouden kunnen worden bevroren en zoveel jaren later weer tot leven zouden kunnen worden gewekt, ze veel over de geschiedenis zouden kunnen vertellen.

Mijn aanbevelingen voor toekomstig onderzoek zijn om een ​​verscheidenheid aan cellen te gebruiken en zoveel mogelijk cellen te bewaren. Het kan de geschiedenis helpen! Een andere aanbeveling zou zijn om verdere tests te doen om te zien of de bevroren cellen na ontdooien daadwerkelijk overleven. Ook zou men verschillende soorten conservering kunnen gebruiken om te zien wat het beste werkt.

Bibliografie

Starr, C., Biologie: concepten en toepassingen, Belmont, CA, 1991, blz. 27 - 29, 40 - 43.

Disclaimer en veiligheidsmaatregelen

Education.com biedt de Science Fair Project Ideas alleen voor informatieve doeleinden. Education.com geeft geen enkele garantie of verklaring met betrekking tot de Science Fair Project Ideas en is niet verantwoordelijk of aansprakelijk voor enig verlies of schade, direct of indirect, veroorzaakt door uw gebruik van dergelijke informatie. Door toegang te krijgen tot de Science Fair Project Ideas, doet u afstand van en doet u afstand van alle claims tegen Education.com die daaruit voortvloeien. Bovendien wordt uw toegang tot de website van Education.com en Science Fair Project Ideas gedekt door het privacybeleid en de gebruiksvoorwaarden van de site, die beperkingen op de aansprakelijkheid van Education.com bevatten.

Hierbij wordt gewaarschuwd dat niet alle projectideeën geschikt zijn voor alle personen of onder alle omstandigheden. De uitvoering van een Idee voor een Wetenschapsproject mag alleen worden uitgevoerd in een geschikte omgeving en met passend ouderlijk of ander toezicht. Het lezen en opvolgen van de veiligheidsmaatregelen van alle materialen die in een project worden gebruikt, is de exclusieve verantwoordelijkheid van elk individu. Raadpleeg voor meer informatie het handboek van Science Safety van uw staat.


Gebruik materialen en procedures

Cultuur van diatomeeën

Xenische culturen van Thalassiosira weissflogii werden gekweekt in een f/2+ medium (Guillard 1962) in 34 psu GF/F-gefilterd kunstmatig zeewater (Instant Ocean) bij 66 μmol m −2 s −1 continue verlichting. Voor het eerste batchcultuurexperiment (d.w.z. het tijdsverloop van nutriëntbeperking), werden diatomeeën gekweekt in 6 × 2 L Erlenmeyer-kolven, bedekt met aluminiumfolie en gevuld met 1 L f/2 + medium. Vervolgens werd 1 ml van een exponentieel groeiende startercultuur overgebracht naar elke kolf als inoculum, en het experiment werd uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 20°C). Voor de tweede reeks experimenten werden diatomeeën gekweekt in kolven van 2 liter die 1 liter f/2 + medium bevatten met losse plastic schroefdoppen bij dezelfde verlichting. Twee kolven voor elke temperatuurbehandeling werden ondergedompeld in waterbaden van 15°C, 20°C en 25°C met temperatuurgecontroleerde baden. Afzonderlijke kleinere batchculturen van dezelfde alg gekweekt in een f/2+ medium bij kamertemperatuur en dezelfde lichtomstandigheden werden gebruikt om extractie- en analytische procedures te testen.

Extractie van ATP

Er werden verschillende extractieprocedures getest, maar de meeste resulteerden in een sterke remming van de luciferine-luciferasereactie. Remmende effecten werden waargenomen bij detergenten zoals Triton X-100 en Dodecyltrimethylammoniumbromide (DTAB), evenals bij ontsluiting met zuren en basen die in een aparte stap moesten worden geneutraliseerd en dus een hoog zoutgehalte hadden. Deze chemicaliën interfereerden met de bioluminescentietest op een vergelijkbare manier als de chemische extractieprocedure die hieronder wordt besproken. We ontdekten dat een eenvoudige extractieprocedure met kokend heet ultrapuur water zeer compatibel was met de ATP-assay, wat de bevindingen van Yang et al. bevestigt. (2002). We hebben ook een chemische extractieprocedure onderzocht met behulp van P-BAC, een mengsel van benzalkoniumchloride (1% w/w fin. conc.) met fosforzuur (5% w/w fin. conc.) in een 25 mM Tricine-buffer (Welschmeyer en Kuo 2016). Merk op dat de dichtheid van 85% fosforzuur 1,6845 kg L -1 is en dat de concentraties worden uitgedrukt in gewichtspercentages.

Om het hete water rechtstreeks te vergelijken met de P-BAC-extractieprotocollen, hebben we een experiment ontworpen waarin de concentratie van ATP hetzelfde is voor de laatste stap van de luminescentietest (Fig. 1). Voor deze experimenten werd 5 ml van elk van zes monsters gefilterd op GF/F in hetzelfde filterrek (6-posities van 25 mm glazen filtratieverdeelstuk uitgerust met een roestvrijstalen rooster [Millipore]) en met hetzelfde vacuüm. De tijd die nodig was voor het overbrengen van de filters van het filterrek naar de eerste extractiestap was ook hetzelfde in de vloeibare stikstof-warmwater- en P-BAC-procedures. Voor de extractieprocedure met heet water werden de filters in 15 ml polypropyleen centrifugebuizen (Falcon) geplaatst en in vloeibare stikstof onder shock bevroren. De centrifugebuisjes kunnen bij -80°C worden bewaard of na enkele minuten worden gebruikt. Kokend heet ultrapuur water moet echter direct op de nog bevroren filters worden gegoten om ATPasen te inactiveren en niet langzaam ontdooien. De centrifugebuizen werden vervolgens elk 10 s gevortext en ondergedompeld in een beker met kokend heet water gedurende

15 minuten (Fig. 1A). Na afkoeling tot kamertemperatuur werd ultrapuur water toegevoegd tot de 5 ml-markering in de centrifugebuizen en opnieuw enkele seconden gevortext om het monster homogeen te mengen. Voor P-BAC-extractie werden monsters gedurende bij kamertemperatuur geweekt

30 min in cryovials gevuld met 1 ml P-BAC (Welschmeyer en Kuo 2016 Fig. 1B). Monsters kunnen in dit stadium bevroren worden bewaard of na het extractie-interval worden geanalyseerd. Voor de uiteindelijke analyse met behulp van het vuurvliegreagens, 50 μL van het warme water of 10 μL van het P-BAC-extractiemiddel werden gebruikt. Deze benadering hield de ATP-concentraties hetzelfde in de laatste analytische stap voor beide extractiemethoden (d.w.z. 50 μL van 5 ml extractiemiddel = 10 μL van 1 ml extractiemiddel). Voor een subset van monsters, een 50 μL standaard (variërend in concentraties van 3,24 tot 162 nM), afhankelijk van het type monster, werd toegevoegd, gevolgd met 3 ml ultrapuur water voor verdunning (zien de sectie Discussie voor de vereiste van een verdunningsstap in de P-BAC-procedure). Ten slotte werd 50 L vuurvliegextract toegevoegd (CellTiter-Glo 2.0). Voor testmonsters gebruikten we culturen van T. weissflogii gekweekt in een f/2 + medium, verzameld oppervlaktewater uit de Elizabeth River in het Old Dominion University Sailing Center (16 september 2020, breedtegraad: 36.885 N, lengtegraad: 76.308 W, zoutgehalte: 16,4 psu, temperatuur: 24,0°C), en mesopelagisch water voor de kust op 300 m (06 oktober 2020, breedtegraad: 36.734 N, lengtegraad: 74.629 W, zoutgehalte: 34,4 psu, temperatuur: 12,7°C).

Groeisnelheid experimenten met T. weissflogii

In alle experimenten vond de bemonstering dagelijks plaats, beginnend op de dag van inoculatie van het f/2+-medium. Na het schudden van de kolven om de bezonken cellen te resuspenderen en gelijkmatig te mengen, werd 25 ml uit elke kolf onttrokken met behulp van een steriele wegwerppipet. Vervolgens werd 5 ml onmiddellijk gefiltreerd door een diameter van 25 mm, 0,2 μm polycarbonaatfilter (Isopore type GTTP) bij een vacuüm van 200 mbar in een filterstation dat vooraf is geladen met zes filters. Het filtraat werd opgevangen in 15 ml polypropyleen centrifugebuizen (Falcon) die onder de filtertrechter in de vacuümkolven waren geplaatst. De filters werden snel overgebracht in polypropyleen centrifugebuisjes van 15 ml, en

4,5 ml kokend heet ultrapuur water (18,2 MΩ) werd toegevoegd. De centrifugebuizen werden enkele seconden gevortext en vervolgens ondergedompeld in een beker met heet water (> 90 °C). Het hete ultrazuivere water breekt cellen af ​​en inactiveert ATPasen (Yang et al. 2002 ). Voor ongefilterd heel water werden drievoudige monsters van 0,5 ml toegevoegd aan centrifugebuisjes van 15 ml, gevolgd door

4 ml kokend heet water en vortex. Van het filtraat werd 0,5 ml overgebracht naar de centrifugebuizen en op dezelfde manier behandeld als de hele watermonsters. Alle buizen werden ongeveer 15 minuten in warmwaterbaden gehouden. De monsters werden vervolgens afgekoeld tot kamertemperatuur en dezelfde dag geanalyseerd. Aangezien ATPasen in dit stadium grotendeels zijn geïnactiveerd, kunnen monsters desgewenst ook worden ingevroren bij -20 °C of -80 °C voor latere analyse. Met behulp van een gedempte Pasteur-pipet werd druppelsgewijs ultrapuur water toegevoegd tot precies de 5 ml-markering (markeringen op de Falcon-centrifugebuisjes van 15 ml zijn voldoende nauwkeurig). Voor analyse, 50 μL monster, 3 ml ultrapuur water en 50 μL van de ATP-werkvoorraad (alleen voor de interne standaard, zie hieronder), en 50 μL vuurvliegextract (CellTiter-Glo 2.0, Promega Corp.) werd gecombineerd in plastic scintillatieflesjes van 6 ml (Pico Prias, Perkin Elmer) en kort gevortext.

We hebben de scintillatieteller geprogrammeerd om de monsters herhaaldelijk tot 10 keer achter elkaar te laten lopen, en hebben alleen de gegevens van de tweede cyclus gebruikt. De andere cycli werden gebruikt om het afnemende luminescentiesignaal te observeren (aanvullende figuur 1). Herhaalde runs zijn meestal niet nodig, en als monsters slechts één keer worden uitgevoerd, raden we aan een reactietijd van ongeveer 30 minuten te geven voordat de eerste flacon wordt geteld om te tellen over het meer lineaire tijdstraject. We wisselden altijd monsters en bijbehorende interne standaarden af.

Normen

10 μM met behulp van ultrapuur water. De voorraadoplossing werd vervolgens verdeeld in afzonderlijke 15 ml polypropyleen centrifugeflesjes en bevroren bewaard bij -20°C. De exacte concentratie van de

10 μM-standaard werd bepaald met behulp van een spectrofotometer (Shimadzu UV-2401PC) bij een golflengte van 259 nm, een cuvet van 1 cm en een molaire absorptiecoëfficiënt van 15,4 × 103 M −1 cm −1 (Karl 1993 ) in de vergelijking

(1)

Berekeningen

(2) waarbij [ATP] de concentratie van de interne standaard is (d.w.z. 16,4 nM), CPMsteekproef het foton telt per minuut voor het monster, de gemiddelde waarde van 4 tot 6 blanco's (50 μL vuurvliegreagens alleen toegevoegd aan 3 ml ultrapuur water), de gemiddelde tellingen per minuut voor de standaard flacons, de gemiddelde waarde van herhaalde monsters, Vsoa het volume van de standaard toegevoegd aan de scintillatieflacon in μL, R de verhouding tussen het volume van het extract (teller) en het volume van het gefilterde monster (noemer), en Vextra het volume van het extract dat aan de scintillatieflacon is toegevoegd (μL). Als er veel monsters worden geteld, zoals in ons geval, is de meest nauwkeurige procedure om de standaardwaarden te berekenen met behulp van een regressievergelijking met tijdstempel van tellen als verklarende variabele en deze regressie vervolgens toe te passen op elk monster op basis van zijn tijdstempel in de telling protocol. Deze procedure, in plaats van de waarden van de aangrenzende flacons te gebruiken, vermindert de variantie die wordt veroorzaakt door standaard-tot-standaardvariabiliteit. Als echter wordt verwacht dat de ATP-concentraties zeer verschillend zullen zijn tussen monsters, raden we aan in plaats daarvan de waarden van de individuele flacons af te trekken van die met de interne standaarden. Om tot de uiteindelijke ATP-waarden in de resultaten te komen, werden de waarden verder met twee vermenigvuldigd om het verschil in extractie-efficiëntie tussen materiaal verzameld op filters en hele watermonsters te corrigeren (Fig. 2). Deze factor was zeer consistent tussen de twee hoofdexperimenten en in andere experimenten met T. weissflogii.

Aantal cellen

T. weissflogii werd geteld in een Z2 Coulter Counter Multisizer met een 100 μm opening buis. Er werden elk zeven metingen gedaan voor deeltjesgroottes groter dan 10 μm, de eerste waarden worden weggegooid en de volgende zes metingen worden geregistreerd (de eerste meting kan nog luchtbellen bevatten).

(3)

Vervolgens werd 5 ml van elk monster bewaard in 2% (fin. conc.) 0.2 μm spuit-gefilterd formaldehyde gestabiliseerd met 10% methanol voor bacterietellingen. De volgende dag werd 1 ml van het met formaldehyde geconserveerde monster gefilterd op 25 mm diameter 0.2 μm poriegrootte zwarte polycarbonaat filters (Isopore type GTBP). De filters werden overgebracht op objectglaasjes. Een of twee druppels van een montagemedium dat DAPI bevat (Vectashield, Vector Laboratories) werd toegevoegd, bedekt met een dekglaasje en bewaard bij -20 ° C totdat het werd geteld. Bacteriën werden geteld onder een epifluorescentiemicroscoop (100 x olie-immersie objectieflens, 2 x loep, 10 x oculaire vergroting, uitgerust met een DAPI-filterkubus) door 60 velden (elk 0,025 mm2) te tellen (30 verticaal, 30 horizontaal over het filter). Veldafmetingen werden bepaald met behulp van een tafelmicrometer met stappen van 0,01 mm.

T. weissflogii koolstof werd berekend met behulp van de vergelijking van Strathmann (1967) als 110 pg cel −1 gebaseerd op een diameter van 15 μm. Deze koolstofwaarde per cel kwam goed overeen met de onbewerkte gegevens over: T. weissflogii (voorheen Thalassiosira fluviatilis) in Strathmann (1967) en was zeer vergelijkbaar met de waarden berekend met behulp van vergelijkingen gerapporteerd in Menden-Deuer en Lessard (2000 gemiddelde tussen regressies van kleine en grote diatomeeën). Voor prokaryoten werd 20 fg koolstofcel −1 gebruikt. Dit aantal is geschikt voor in kweek gekweekte bacteriën, maar waarschijnlijk lager voor in het wild gevonden prokaryoten (Fukuda et al. 1998).

Literatuurvergelijkingen

Om ATP per drooggewicht uit verschillende literatuurbronnen (bijv. tabellen in Karl 1980 ) om te rekenen naar molaire concentraties (mol ATP per celvolume), moesten we aannames doen met betrekking tot de droge massadichtheid per celvolume. We gebruikten een universele conversie van 0,2 g cm −3 (pg μm−3) drogestofgehalte met de erkenning dat de verhouding drooggewicht tot volume kan veranderen van 0,1 tot 0,57 g cm−3 (Bratbak en Dundas 1984 Norland et al. 1987 Simon en Azam 1989). Een factor van 0,2 g cm 3 is ook een geschikte benadering voor bacteriën met een vergelijkbare verhouding tussen nat en droog gewicht (Bakken en Olsen 1983). Om de conversiefactor op algen te testen, hebben we de verhouding drooggewicht tot volume berekend van een breed scala aan fytoplankton van klein tot groot, van Thalassiosira pseudonana tot Lingulodinium (eerder Gonyaulax) polyedra met behulp van de allometrische volume-naar-koolstofconversies in Menden-Deuer en Lessard (2000). Met een conversie van 50% koolstof naar droog gewicht kwamen we uit op 0,26 g cm −3 voor T. pseudonana (de kleinste alg in Menden-Deuer en Lessard 2000 ) en 0,13 g cm −3 for L. polyedra (de grootste alg in Menden-Deuer en Lessard 2000 ), die de door ons gebruikte conversiefactor tussen haakjes zet. Voor Skeletonema costatumgebruikten we het gemiddelde van ATP (0,041 pg cel −1 Sakshaug 1977) en het bereik van celvolumes voor S. costatum zoals gerapporteerd in Strathmann (1967) om molaire concentraties van ATP te berekenen. Bij gebrek aan andere informatie over ciliaten hebben we het lorica-volume van tintinnid-ciliaten in Verity en Lagdon (1984) gebruikt om molaire concentraties van ATP te berekenen uit pg per cel in die taxonomische groep.

Statistische analyse

Resten werden getest op normaliteit met behulp van de Komolgorov-Smirnov-test (Lilliphors 1967). Aangezien de residuen in verschillende gevallen niet voldeden aan de normaliteitsaanname van parametrische tests, P-waarden waren gebaseerd op 10.000 randomisaties van de gegevens en op maat F-distributies (Manly 2007).


Kunt u een ATP-assaymonster invriezen voor later gebruik? - Biologie

De aanwezigheid van antilichamen tegen het Newcastle disease virus bij kippen wordt gedetecteerd door serologisch onderzoek. De resultaten van deze tests worden voor drie doeleinden gebruikt.

1. Om de werkzaamheid van het vaccin tegen de ziekte van Newcastle te beoordelen in laboratorium- en veldproeven.

2. Om het niveau van antistoffen tegen de ziekte van Newcastle in het veld te beoordelen.

3. Serum waarvan bekend is dat het antilichamen tegen het virus van de ziekte van Newcastle bevat, wordt gebruikt om de aanwezigheid van het virus van de ziekte van Newcastle in een testmonster van allantoïsvloeistof te bevestigen. Een dergelijk monster zou worden verkregen tijdens de isolatie van het virulente virus van de ziekte van Newcastle. Zie paragraaf 15.

Er zijn twee analyses die gewoonlijk worden gebruikt om serologische tests uit te voeren op antilichamen tegen het Newcastle disease virus.

1. Test op hemagglutinatieremming (HI). De HI-test is een handige en veelgebruikte test die goedkope reagentia vereist en met het oog wordt gelezen.

2. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Dit is een colorimetrische test en vereist het gebruik van een geavanceerd instrument om de optische dichtheid van de reacties te lezen. ELISA-kits voor de detectie van antilichamen tegen de ziekte van Newcastle worden bereid en commercieel verkocht. Gedetailleerde instructies worden bij de kits geleverd. Ze zijn meestal vrij duur.

In deze handleiding wordt een protocol voor de HI-test gebruikt op basis van de door Allan en Gough beschreven test voor serologisch onderzoek. (Allan en Gough, 1974 a.)

Er worden serummonsters verzameld om te testen op de aanwezigheid van antilichamen tegen het Newcastle disease virus. Het bloed wordt verzameld zoals beschreven in rubriek 7. Het bloed vormt in enkele minuten een stolsel in de spuit. Zodra het bloed stolt, kunnen de injectiespuiten met de naald rechtop worden gehouden om te voorkomen dat het serum de naalddop vult. Het serum zal binnen een paar uur bij kamertemperatuur of ongeveer 2 uur bij 37°176C van het stolsel scheiden. Bewaring bij 37°176C helpt het serum te scheiden van het stolsel.

  • Spuiten met bloedmonsters.
  • Steriele glazen pasteurpipetten.
  • Microfuge buizen.
  • Opslag buizen. (1,8 ml Nunc cryotubes zijn ideaal, maar microfugebuizen zijn een goedkoper alternatief.)
  • Naaldcontainer en afvalzak voor biologisch afval.

1. Verwijder de zuiger uit de spuit. Breng het serum over naar een microfugebuis door te gieten of een glazen pasteurpipet te gebruiken.

2. Gooi naalden, spuiten, stolsels en pipetten weg in daarvoor bestemde containers.

3. Vaak bevat het serum rode bloedcellen. Centrifugeer gedurende 30 seconden in een microfuge-centrifuge of laat een nacht onder zwaartekracht bezinken bij 4'176C om de cellen te pelleteren. Vries de monsters bij deze stap niet in. Invriezen zal de rode bloedcellen lyseren.

4. Breng helder serum over in een tweede buisje.

5. Vergeet niet om elke buis te labelen na de overdracht van het serum. Dit zorgt ervoor dat de serologische resultaten kunnen worden toegepast op individuele vogels en groepen.

Bewaar ampullen serum bij -20'176C.

Opslag bij 4°C is acceptabel voor een korte periode, maximaal 2 weken.

Monsters die in het veld worden verzameld, kunnen 's nachts bij kamertemperatuur terechtkomen en scheiden vaak niet goed.

In het John Francis Virology Laboratory is vastgesteld dat in sommige monsters het serum niet van het stolsel scheidt. In deze gevallen wordt het hele stolsel gecentrifugeerd. Dit resulteert meestal in een kleine hoeveelheid serum die zich afscheidt.

Het is belangrijk dat de serummonsters helder zijn. Roze monsters bevatten gelyseerde rode bloedcellen. Wanneer roze monsters worden getest, moet u zowel het test- als het controlemonster zorgvuldig observeren om het effect van de kleur op de resultaten van de test te bepalen.

Roze gekleurde monsters kunnen de resultaten van een ELISA beïnvloeden, wat een colorimetrische test is.

Een overzicht van de hemagglutinatieremmingstest (HI)

De antilichaamrespons op het hemagglutinine-eiwit in de envelop van het virus van de ziekte van Newcastle kan worden gemeten met de HI-test.

Wanneer serum dat deze antilichamen bevat, wordt gemengd met het virus van de ziekte van Newcastle, binden de antilichamen aan het hemagglutinine-eiwit in de envelop van het virus. Dit blokkeert de binding van het hemagglutinine-eiwit met de receptorplaats op rode bloedcellen van kippen.

Zo wordt de hemagglutinatiereactie tussen het virus en de rode bloedcellen geremd.

Door tweevoudige seriële verdunningen op het serum uit te voeren voorafgaand aan het testen, kan de concentratie van de serumantilichamen worden uitgedrukt als een HI-titer ten opzichte van de logbase 2.

Standaardisatie van de HI-test

Het is belangrijk dat er een correlatie is tussen de resultaten van tests die door verschillende technici en in verschillende laboratoria zijn uitgevoerd. Om deze reden moeten HI-testen zowel binnen een laboratorium als tussen laboratoria worden gestandaardiseerd.

Standaardisatie wordt bereikt door het volgen van een standaardprotocol. Dit omvat:

Met behulp van een standaard 4 HA-eenheden van Newcastle disease virus-antigeen.

Gebruik standaard positief anti-serum en negatief serum.

Inclusief een serumcontrole voor elk testserum om de aanwezigheid van niet-specifieke agglutinines te detecteren.

Met behulp van een standaard 1 procent verdunning van rode bloedcellen.

Het gebruik van controleserum in de HI-test

Positieve en negatieve controlesera worden getest om fouten bij de interpretatie van de resultaten van de HI-test te voorkomen. Inconsistenties in de resultaten van de HI-test kunnen worden veroorzaakt door variaties in reagentia en procedures.

Voorbeelden van mogelijke variaties zijn:

De bron en het exacte volumepercentage van de rode bloedcellen.

De exacte hoeveelheid antigeen die in de HI-test is gebruikt.

Nauwkeurigheid van verdunningen.

Temperatuur.

Toegestane tijd voor het optreden van de antilichaam/antigeenreacties.

Kwaliteit van testserummonsters (gehemolyseerde serummonsters kunnen verantwoordelijk zijn voor niet-specifieke reacties)

Er worden twee standaardsera gebruikt.

1. Een standaard negatief controleserum waarvan bekend is dat het geen antilichamen tegen het Newcastle disease virus bevat. Het heeft geen HI-titer en agglutineert de rode bloedcellen van kippen niet.

2. Een standaard positief controleserum, ook wel standaard antiserum genoemd. De HI-titer van het antiserum zal zijn vastgesteld door herhaalde titratie.

Variabiliteit in HI-titers van standaard positief serum

Soms wordt waargenomen dat de standaard HI-titer van het standaard antiserum dat op dezelfde dag wordt getest met hetzelfde antigeenpreparaat en protocol kan variëren. Een verschil in HI-titer van één verdunning die één log base 2 (2 1 ) is, kan worden beschouwd als het gevolg van willekeurige fouten en een inherente variabiliteit in biologische reacties. Als de titer van het standaard positieve serum echter meer dan één verdunning of logbase 2 verschilt, is de test ongeldig. In dit geval moet vers antigeen worden bereid en getest en moet de HI-test worden herhaald.

Drie categorieën standaard sera

1. Internationaal standaard referentieserum. Bepaalde laboratoria bereiden referentieserum volgens een zeer hoge standaard. Standaard referentie-anti-Newcastle-ziekteserum is beschikbaar voor aankoop. Het wordt gebruikt als referentieserum bij de bereiding van nationale en laboratoriumstandaardsera.

Het National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) in het Verenigd Koninkrijk kan een internationaal standaard referentieserum leveren. De potentie van het internationale referentieserum is bepaald door de leverancier en wordt uitgedrukt in Internationale Eenheden (IE) per ampul gevriesdroogd serum.

E-mail [e-mail protected]
Tel 44 (0) 1707 654753
Fax 44 (0) 1707 646730
Website http://www.nibsc.ac.uk

2. Nationaal standaardserum wordt bereid door een nationaal laboratorium en indien nodig gedistribueerd naar samenwerkende laboratoria. Dit serum wordt bereid door sera te mengen met bekende HI-titers. Er wordt een reeks HI-tests uitgevoerd om de HI-titer van de nationale norm vast te stellen. Dit wordt vergeleken met de HI-titer van het internationale standaardreferentieserum, indien beschikbaar. Het nationale standaardserum wordt vervolgens in meerdere porties opgeslagen en gedistribueerd naar samenwerkende laboratoria in een land.

3. Laboratoriumstandaardserum wordt door sommige laboratoria bereid om de voorraad nationaal standaardserum te behouden. De laboratoriumstandaard wordt bereid door serummonsters te mengen met bekende HI-titers. Vergelijkende HI-testen van de laboratoriumstandaard en de nationale standaard worden gebruikt om de HI-titer van de laboratoriumstandaard vast te stellen.

Bereiding van nationale en laboratoriumstandaardsera

Elk laboratorium heeft een voorraad negatief en positief controleserum nodig om HI-tests op serummonsters uit te voeren.

Verzameling van HI-negatief serum

Verzamel serum van kippen die niet zijn blootgesteld aan het virus van de ziekte van Newcastle. Het serum mag geen remming van de virale hemagglutinatie-activiteit vertonen wanneer het wordt getest met de HI-test. Het is vaak moeilijk om serum te vinden zonder enige HI-activiteit. Gebruik in dit geval serum met lage HI-titers van 2 1 .

Verzameling van HI-positief serum

Er kan serum worden bewaard dat hiervoor geschikt is. Zo niet, vaccineer dan meerdere kippen met het I-2 vaccin tegen de ziekte van Newcastle. Geef twee weken na de basisvaccinatie een boostervaccinatie. Neem twee weken later een serummonster van elke kip en test de HI-titer. Verzamel extra serum van kippen met een titer van 2 5 of hoger. De hoeveelheid bloed die van elke kip wordt verzameld, is afhankelijk van de grootte van de kip. Verzamel alle serummonsters met HI-titers van 2 5 of hoger en test de HI-titer van het samengevoegde serum.

Vergelijkende HI-testen van internationale referentie- en nationale standaardsera

Informatie verstrekt door NIBSC in 2001 gaf aan dat hun internationale standaardreferentie 320 IE per ampul bevatte.

Het serum kan worden gereconstitueerd in PBS. Een geschikt volume PBS zou 2 ml zijn, wat 4 IE zou opleveren in het 25 µL testmonster. Raadpleeg de instructies van de fabrikant.

Gebruik de standaard HI-test die in dit gedeelte wordt beschreven om de titer van de internationale referentiestandaard en de nationale standaard te bepalen.

Test beide monsters in drievoud op dezelfde microwell-plaat.

Voer een reeks van minimaal drie tests uit op verschillende dagen.

Zodra de HI-titer van het internationale standaardserum en het nationale standaardserum zijn vastgesteld, bereidt u een reeks tweevoudige verdunningen van het serum voor die worden verspreid rond het eindpunt dat wordt gebruikt om de HI-titers vast te stellen. Titreer de verdunningen die variëren van volledige remming tot geen remming als extra controle op de HI-titers. De resultaten van het testen van deze verdunningen zullen de HI-titer van het onverdunde serum bevestigen.

Voorbeeld van het bevestigen van de HI-titer van standaardmonsters door een reeks verdunningen van het monster te testen.

Herhaalde testen van het samengevoegde serum stelden de HI-titer op 2 5 vast.

Bereid 1/8, 1/16, 1/32 en 1/64 verdunningen van het samengevoegde serum voor.

Test elke verdunning op HI-titer.

Bevestigende resultaten: De weergegeven resultaten bevestigen dat de HI-titer van het serum dat werd gebruikt om de verdunningen te bereiden een titer van 2 5 had.

Tabel 3: Resultaten die de HI-titer van serum bevestigen = 2 5

De testresultaten geven een HI-titer voor zowel het internationale referentieserum als het nationale laboratoriumserum dat wordt getest. De HI-titer voor 4 IE van het internationale referentieserum kan worden gebruikt om het aantal IE in het nationale referentieserum te bepalen.

De standaard HI-test van 25 µL van het internationale referentieserum bevat 4 IE en heeft een HI-titer van 8 (2 3 ). Het nationale serum testte een HI-titer van 64 (2 6 ).

Hoeveel IE bevat het nationale serum?

4 IE in een monster met een HI-titer van 8.

Hoeveel (?) IU in een monster met een HI-titer van 64.

Niet alle laboratoria gebruiken hetzelfde protocol voor het testen van HI-titer en IU zijn onafhankelijk van het gebruikte testsysteem.

Serologische resultaten van monsters uitgedrukt in IE zouden gelijkwaardige resultaten moeten opleveren wanneer ze door verschillende systemen worden getest.

Door de HI-titer van het standaard nationale serum te vergelijken met de HI-titer van het internationale referentieserum kunt u de resultaten van HI-testen in IE uitdrukken. Het komt echter niet vaak voor dat u de resultaten van HI-testen in IE moet uitdrukken.

De meeste publicaties van de serologische resultaten van de ziekte van Newcastle beschrijven de gebruikte test en brengen HI-titers tot logbase 2 tot expressie.

Een laboratoriumstandaardserum bereiden

Elk laboratorium moet een nationaal standaardserum ontvangen van een centraal laboratorium. De HI-titer en activiteit in internationale eenheden van het serum zullen zijn bepaald door middel van rigoureuze tests zoals hierboven beschreven. Om de voorraad nationaal standaardserum te behouden, zullen sommige laboratoria besluiten een secundair standaardlaboratoriumserum te bereiden.

Verzamel positief serum zoals hierboven beschreven. Voer vergelijkende testen uit van het laboratorium en de nationale normen. Test elk monster in drievoud op dezelfde microwell-plaat. Herhaal dit meerdere keren en analyseer de HI-titers voor beide monsters. Noteer de HI-titer voor de laboratoriumstandaard.

Bewaar aliquots van 1 ml van de laboratoriumstandaard bij -20'176C. Deze standaard wordt elke keer dat de HI-test wordt uitgevoerd gebruikt en moet altijd dezelfde HI-titer vertonen wanneer getest met de 4 HA-eenheden antigeen.

Een nationaal standaardserum bereiden zonder een internationaal referentieserum

Veel laboratoria zullen geen internationaal referentieserum kunnen verkrijgen om hun nationale standaardserum mee te vergelijken. In dit geval zullen strengere HI-testen van de gepoolde HI-positieve serummonsters nodig zijn om de HI-titer van het standaardserum vast te stellen. Er wordt gesuggereerd dat het serum tot tien keer wordt getest. Gebruik voor elke test vers bereide 4 HA-eenheden antigeen en voer de test indien mogelijk op verschillende dagen uit. De resultaten zullen een reeks HI-titers zijn. De meest voorkomende titer kan worden beschouwd als de HI-titer van het standaardserum. Alle toekomstige HI-tests die op het standaardserum worden uitgevoerd, zouden deze titer moeten geven.

Opslag van standaard serum

Zodra de positieve en negatieve standaardsera zijn getest, kunnen porties worden bereid, geëtiketteerd en ingevroren bewaard. Opslag bij -70'176C is optimaal (maar -20'176C is voldoende). Ontdooi de monsters niet en vries ze niet vaak opnieuw in. Representatieve monsters moeten worden ontdooid en getest om te bevestigen dat er geen titerverlies optreedt tijdens het opslagproces.

Bereiding van Newcastle disease virus-antigeen voor gebruik in HI-tests

Antigeen wordt bereid door geëmbryoneerde eieren te inoculeren met een monster van het Newcastle Disease-virus en vier dagen later de allantoïsvloeistof te oogsten. Een deel van de eerste batch I-2 vaccin tegen de ziekte van Newcastle, bereid uit het I-2 werkende zaad, kan opzij worden gezet voor opslag als antigeen. Een volume van 50 ml tot 100 ml is voldoende voor een groot aantal tests. Centrifugeer het monster bij 1 200 g om eventuele verontreinigende rode bloedcellen op te helderen en te verwijderen. Bewaar het antigeen in aliquots van één ml bij -20'176C.

Bereiding van 4HA-eenheden van Newcastle disease virus-antigeen

De standaardhoeveelheid Newcastle disease-virus die wordt gebruikt in de hemagglutinatieremmingstest (HI) is 4HA-eenheden. Om de HI-test uit te voeren, moet een suspensie van het Newcastle disease-virus met 4HA-eenheden worden bereid en getest. Dit omvat een reeks volgende stappen.

1. Titreer de opgeslagen virussuspensie die als antigeen in de HI-test moet worden gebruikt. Zie paragraaf 10 Bereken de HA-titer.

2. Bereken de verdunningsfactor die nodig is om 4 HA-eenheden te produceren. Een eenvoudige manier is om de HA-titer door 4 te delen.

3. Breng de verdunningsfactor aan en verdun de oorspronkelijke suspensie van antigeen in PBS om een ​​voldoende volume 4HA-antigeen te produceren om de HI-test uit te voeren. Laat 2,5 mL voor elke microwell-plaat.

4. Titreer de verdunde (4HA) suspensie van het virus. Dit is een terugtitratie om te controleren of het verdunde antigeen 4 HA-eenheden bevat.

5. Lees de HA-titer af. Het moet gelijk zijn aan 4HA-eenheden. Zo niet, pas dan de verdunning aan en titreer opnieuw.

6. Gebruik de 4HA-eenheidsverdunning van antigeen in een HI-test om het standaard positieve en negatieve serum te testen. De HI-titer van het laboratoriumstandaardpositieve serum moet gelijk zijn aan de vooraf bepaalde titer.

De resultaten van de terugtitratie van het verdunde antigeen en de HI-titer van het standaard positieve worden beide gebruikt om te bevestigen dat het antigeen is verdund tot een concentratie die equivalent is aan de standaard 4 HA-eenheden.

Als de HI-titer van het positieve controleserum lager is dan de standaardtiter, is het antigeen te geconcentreerd. Bereid een nieuwe verdunning voor en test opnieuw.

Omgekeerd, als de HI-titer van het positieve controleserum te hoog is, is het antigeen te verdund. Bereid een nieuwe verdunning voor en test opnieuw.

Bereiding van 4HA-eenheden antigeen voor HI-test in platen met 10 microwells:

De HA-titer van het antigeen werd getest volgens het hierboven beschreven protocol. De HA-titer = 128

Berekening van de verdunningsfactor om 4 HA-eenheden te bereiden: 128/4 = 32

Berekening van het vereiste volume van 4HA-eenheidsverdunning van antigeen:

Laat 2,5 ml per plaat totaal vereist volume toe = 10 × 2,5 ml = 25 ml

Verdunningsfactor toepassen = 25 ml/32 = 0,781 ml = 781 µL

Bereiding van het verdunde antigeen: meng 781 µL originele virussuspensie met 24,219 ml verdunningsmiddel. PBS is een geschikt verdunningsmiddel.

Opmerking: In dit geval is het het gemakkelijkst om 32 ml van het 4HA-antigeen te bereiden. Dit zou 1 ml van de oorspronkelijke suspensie gebruiken, verdund in 31 ml PBS.

  • Ontdooide serummonsters in rekken
  • Microwellplaten en deksels met V-bodem
  • PBS
  • 1 procent gewassen rode bloedcellen
  • V-bodem reagensbak
  • 25 µL enkel- en meerkanaalspipetten en tips
  • Microwell plaat opnameblad.
  • Newcastle disease virus antigeen verdund tot 4 HA eenheden per 25 µL
  • Standaard positief en negatief serum

1. Vul registratiebladen in om vast te leggen hoe de monsters in microwellplaten worden verdeeld.

2. Bereken het aantal benodigde platen en nummer elke plaat.

3. Doseer 25 µL PBS in elk putje van de platen.

4. Schud elk serummonster en doseer 25 µL in het eerste putje en het laatste (controle)putje van een rij microwells-plaat.

5. Maak met een meerkanaalspipet tweevoudige seriële verdunningen langs de rij tot het voorlaatste putje vanaf het einde. Het laatste putje is de serumcontrole. Verdun dit niet goed. Zie bijlage 4 voor instructies voor het uitvoeren van tweevoudige seriële verdunningen.

6. Voeg 25 µL van de 4HA-verdunning van antigeen toe aan elk putje, met uitzondering van de controleputjes in de laatste kolom. Zie rubriek 10 voor de bereiding van 4HA-eenheden antigeen

7. Tik zachtjes op de zijkanten van de microwellplaten om de reagentia te mengen. Afdekplaten met deksel. Laat 30 minuten staan ​​bij kamertemperatuur.

8. Voeg 25 µL van 1 procent gewassen rode bloedcellen toe aan elk putje, inclusief de controleputjes in de laatste kolom.

9. Tik voorzichtig op de zijkanten van de microwellplaten om de reagentia te mengen. Bedek de borden met een deksel. Laat 45 minuten op kamertemperatuur staan.

10. Lees de bezinkingspatronen voor elk serummonster. Lees eerst het controleserum goed en lees vervolgens de patronen in de andere putjes.

11. Noteer het patroon dat in elk putje is waargenomen op een opnameblad van een microwellplaat. Bepaal het eindpunt. Dit is het punt waarop de hemagglutinatie volledig wordt geremd.

12. Noteer het antilichaamniveau voor elk serummonster. Dit wordt uitgedrukt als een log-base 2. Voor het gemak wordt de titer vaak alleen als log-index geregistreerd. Een titer van 26 zou bijvoorbeeld worden geregistreerd als 6.

interpretatie van resultaten

In de putjes waar antilichamen aanwezig zijn, zal er remming van hemagglutinatie optreden. De rode bloedcellen zullen als een knop bezinken.

In de putjes waar antistoffen ontbreken, zullen de rode bloedcellen agglutineren.

Het eindpunt van de titratie is het putje dat volledige remming van hemagglutinatie vertoont. Soms is het niet eenvoudig te bepalen. Kijk naar de grootte van de knop als indicatie voor de mate van hemagglutinatieremming. Gebruik de controle goed als een vergelijkingspunt. Wees consistent in het bepalen van het eindpunt.

Het neuraminidase-enzym dat in het virusdeeltje aanwezig is, zal uiteindelijk de binding tussen het virus en de rode bloedcellen verbreken. Dit proces wordt elutie genoemd.

Wanneer elutie optreedt, worden de rode bloedcellen niet langer geagglutineerd. Ze rollen langs de zijkant van microwellplaten met V-bodem om te lijken op het negatieve bezinkingspatroon, een strakke knop.

Sommige virusstammen van de ziekte van Newcastle elueren sneller en de test moet worden gelezen voordat dit gebeurt.

Gewoonlijk duurt de elutie langer dan 45 minuten. Een controleputje met virus en rode bloedcellen is nuttig om de elutietijd te bepalen.

Sommige sera kunnen andere stoffen dan antilichamen bevatten die het virale hemagglutinine remmen. Deze stoffen worden beschreven als niet-specifieke remmers en worden zelden waargenomen met kippenserum en de ziekte van Newcastle.

Sommige kippensera bevatten stoffen die de rode bloedcellen van kippen zullen agglutineren. Het bezinkingspatroon van de geagglutineerde cellen is vergelijkbaar met dat van het Newcastle disease virus. Deze natuurlijke agglutinines zijn in lage concentraties aanwezig. Het controleserumputje zal de aanwezigheid van natuurlijke agglutinines aangeven.

Adsorptie van natuurlijke agglutinines

Als natuurlijke agglutinines in een serummonster aanwezig zijn, kunnen ze worden verwijderd door adsorptie met rode bloedcellen van kippen. Het serum kan dan opnieuw worden getest in de HI-test.

  • Suspensie van 10 procent gewassen rode bloedcellen van kippen.
  • Microfuge (Eppendorf) buis
  • Micropipet, 200 mL tot 1 000 mL en tips
  • lade weggooien
  • Microfuge centrifuge
  • Serummonsters

1. Plaats 200 mL van de 10 procent gewassen rode bloedcellen in een microfugebuis.

2. Centrifugeer gedurende 15 seconden.

3. Verwijder het supernatant.

4. Schud het serummonster en verwijder 500 mL serum. Sommige monsters kunnen minder volume bevatten. Gebruik voor elk monster een nieuwe tip.

5. Voeg het serum toe aan de rode bloedcellen in het microfugebuisje. Meng voorzichtig.

6. Sta niet minder dan 30 minuten op 4'176C.

7. Centrifugeer gedurende 15 seconden.

8. Verwijder het serum (supernatant) onmiddellijk en breng het over naar een schoon microfugebuisje.

9. Bewaar de geadsorbeerde sera 's nachts bij 4'176C of voor langere perioden bij -20'176C.


Vries-ontdooicycli en waarom we het niet zouden moeten doen

Vries-ontdooien - u weet dat het slecht is voor uw monsters, nietwaar? Terwijl u in het laboratorium aan het werk bent, heeft u waarschijnlijk iemand horen zeggen: 'deel uw eiwit/cellen/DNA/RNA in om te veel vries-dooicycli te voorkomen'. Maar begrijpt u eigenlijk waarom?

Je dacht waarschijnlijk dat het vermijden van vries-dooi-cycli iets te maken had met het beschadigen van de celstructuur, maar ook met eiwitten of DNA/RNA - en je zou gelijk hebben. Maar het zal u misschien verbazen te weten dat vries-dooicycli uw monsters op verschillende andere manieren kunnen beschadigen, en we begrijpen niet helemaal hoe ze allemaal werken.

Beschadiging van uw monsters tijdens vries-dooicycli kan problemen veroorzaken met stroomafwaartse processen. Meerdere ronden van bevriezen en ontdooien kunnen bijvoorbeeld eiwitstructuren beschadigen, wat kan interfereren met de eiwitkinetiek van het onderzoek met behulp van oppervlakteplasmonresonantie. Zelfs kleine DNA-schade kan resulteren in niet-interpreteerbare gegevens van PCR.

Uw monsters zijn niet de enige zorg als het gaat om vries-dooicycli. Op dit moment wordt er veel onderzoek gedaan naar de cryopreservatie van embryo's en gameten. Mensen zijn niet de enigen die geassisteerde voortplantingstechnologie gebruiken. Professionals in de veehouderij, zoölogen en anderen gebruiken kunstmatige voortplantingstechnologie om de landbouwproductie te verhogen of te helpen bij het behoud van bedreigde diersoorten. Veel onderzoeken hebben aangetoond dat het vries-dooiproces de DNA-integriteit in sperma kan beïnvloeden en ook de ontwikkeling van embryo's kan belemmeren.

Door dit onderzoek en jarenlange experimenten in het laboratorium hebben we geleerd dat verschillende factoren verantwoordelijk zijn voor schade veroorzaakt door vries-dooicycli.
Verschillende mechanismen veroorzaken instabiliteit tijdens vries-dooicycli
Ijskristallen

IJskristallen die tijdens het vries-dooiproces worden gevormd, kunnen celmembranen doen scheuren. Snelle bevriezing resulteert in de vorming van ijskristallen in de buitenste delen van cellen, waardoor het binnenste van de cellen uitzet en tegen het plasmamembraan duwt totdat de cel barst. Terwijl langzaam afkoelen ervoor zorgt dat water kan uitlogen en de vorming van ijskristallen wordt verminderd, leidt langzame afkoeling nog steeds tot celbreuk als gevolg van een onbalans in de osmotische druk. Als u levende cellen of micro-organismen invriest, kunnen beide processen de levensvatbaarheid aanzienlijk verminderen.
Concentratie bevriezen

Naast het mechanisch beschadigen van cellen, kunnen ijskristallen er ook voor zorgen dat de zouten en eiwitten in de buffer geconcentreerd worden. Dit probleem staat bekend als vriesconcentratie en kan aanzienlijke stress veroorzaken op de stabiliteit van eiwitten. Hoewel het exacte mechanisme van door ijs geïnduceerde eiwitdenaturatie niet volledig wordt begrepen, weten we wel dat veranderingen in de fysieke omgeving van het eiwit leiden tot spanningen die de stabiliteit kunnen beïnvloeden. Er is bijvoorbeeld aangetoond dat de vriesconcentratie ervoor zorgt dat eiwitten zich ontvouwen op het ijs:waterige grensvlak voor verschillende eiwitten, waaronder azurine, leveralcoholdehydrogenase en alkalische fosfatase.
Oxidatieve stress

Een ander veelvoorkomend probleem dat wordt gezien als gevolg van meerdere vries-dooicycli is oxidatieve stress, die door verschillende mechanismen kan worden gegenereerd. Door ijskristallen veroorzaakte schade aan organelstructuren kan leiden tot activering van reddingssystemen die verband houden met energieopwekking. Dit resulteert in een daaropvolgende toename van oxidatieve stress en productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS, vrije radicalen geproduceerd als bijproducten van reductie-oxidatie of redoxreacties). Wanneer de balans tussen ROS en antioxidanten verloren gaat, resulteert oxidatieve stress in moleculaire schade aan DNA, eiwitten en lipiden in de cel. Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat ontdooide cellen een toename van gefosforyleerd H2AX bevatten, een marker van dubbelstrengs breuken in DNA.
Tips om de schade veroorzaakt door vries-dooicycli te minimaliseren

Er zijn twee manieren om de veranderingen die worden waargenomen na vries-dooicycli te voorkomen:

Doe het niet. De eenvoudigste en meest voor de hand liggende oplossing is het voorkomen van vries-dooicycli. Zoals ik aan het begin al zei, is een van de beste manieren om meerdere vries-dooicycli te vermijden, alles te verdelen - je monsters, je antilichamen, je cellen en al het andere dat je maar kunt bedenken.
Gebruik cryoprotectanten. Voeg naast het aliquoteren ook een cryprotectant toe aan uw cellen/monsters/etc. om de stress veroorzaakt door bevriezing te helpen voorkomen.

Cryoprotectanten, die een belangrijke toevoeging zijn aan monsters tijdens hun bevriezingsreis, werden voor het eerst ontdekt in het Verenigd Koninkrijk door Christopher Polge in 1949. Hij vulde per ongeluk een experimentele bevriezingsoplossing aan met glycerol, wat resulteerde in de onverwachte overleving van zijn experimenteel ingevroren cellen. Ik weet zeker dat jullie allemaal iets in het laboratorium hebben gebruikt waaraan glycerol is toegevoegd voor dit doel (bijvoorbeeld antilichamen of RNase). Zelfs aan de antivries voor je auto is glycerol toegevoegd.

Er zijn twee hoofdklassen van cryoprotectanten:

Intracellulaire middelen. Deze middelen dringen de cel binnen om de vorming van ijskristallen en daardoor membraanbreuk te voorkomen. Er zijn verschillende veelvoorkomende reagentia, waaronder dimethylsulfoxide (DMSO), glycerol en ethyleenglycol. Het meest voorkomende middel dat in het laboratorium wordt gebruikt, is DMSO, dat zorgt voor een hoge celoverleving. Sommige groepen hebben echter aangetoond dat het stamceldifferentiatie in neuronale cellen kan bevorderen. Ook kan DMSO cytotoxisch zijn bij kamertemperatuur. Hoewel DMSO enkele nadelen kan hebben, werkt het goed genoeg voor de meeste toepassingen.
Extracellulaire middelen. Deze middelen dringen niet door het celmembraan maar werken door het verminderen van het hyperosmotische effect bij het invriezen. Veel voorkomende extracellulaire middelen zijn sucrose, dextrose en polyvinylpyrrolidon. Cellen bewaard in extracellulaire middelen (bijvoorbeeld sucrose) hebben de neiging om een ​​lagere levensvatbaarheid te hebben na ontdooien dan DMSO-geconserveerde cellen. Dit kan zijn omdat extracellulaire middelen de vorming van ijskristallen niet voorkomen.

Welke methode u ook gebruikt, u moet altijd rekening houden met de veranderingen die u in uw monsters veroorzaakt tijdens het invriezen en ontdooien. Vooral degenen die niet kunnen worden gezien - ze kunnen uw resultaten beïnvloeden.


24.3 Homeostase

In deze sectie onderzoek je de volgende vragen:

  • Wat is homeostase?
  • Welke factoren beïnvloeden homeostase?
  • Wat zijn verschillen tussen negatieve en positieve feedbackmechanismen die worden gebruikt in homeostase?
  • Wat zijn verschillen tussen thermoregulatiemechanismen bij endotherme en ectotherme dieren?

Aansluiting voor AP ® Cursussen

Dieren moeten in staat zijn om homeostase te handhaven - het vermogen om een ​​dynamisch evenwicht rond een instelpunt te behouden - en tegelijkertijd in staat te zijn om te reageren op veranderende omstandigheden. Als endotherm blijft je lichaamstemperatuur bijvoorbeeld redelijk constant rond de 37◦C of 98,6◦F. Als je temperatuur boven het setpoint stijgt, zweet je om af te koelen, als je temperatuur onder het setpoint daalt, ril je om op te warmen. Uw bloedglucosewaarden blijven ook redelijk constant omdat de lever glucose uit het bloed verwijdert en omzet in glycogeen wanneer de lichaamscellen glucose nodig hebben, glycogeen wordt afgebroken. (Je kunt je waarschijnlijk voorstellen hoe je lever zal reageren als je een dozijn gelei-donuts eet!) Het niet handhaven van de homeostase kan schadelijk zijn en zelfs de dood veroorzaken. Bijgevolg, negatief en/of positieve feedbackloops homeostase reguleren.

Negatieve feedbackmechanismen resulteren in lichte fluctuaties boven en onder het setpoint. Als u bijvoorbeeld een dozijn gelei-donuts zou consumeren, zou uw bloedsuikerspiegel stijgen en zou uw alvleesklier insuline afgeven, een hormoon dat betrokken is bij de omzetting van glucose in glycogeen, waardoor uw bloedglucosespiegel terugkeert naar het juiste instelpunt. Ter vergelijking, positieve feedback versterkt reacties in dezelfde richting, waarbij de variabele die de reactie initieert het systeem nog verder van het instelpunt verwijdert. Er zijn minder voorbeelden van positieve feedback, maar een daarvan is het begin van de bevalling wanneer de samentrekkingen van de baarmoeder sterker worden door de afscheiding van oxytocine, een ander hormoon. Het verlies van intern evenwicht als gevolg van positieve feedback kan echter schadelijk zijn, bijvoorbeeld een klein gebied met beschadigd hartweefsel kan een hartaanval veroorzaken die op zijn beurt nog meer hartspier beschadigt.

De gepresenteerde informatie en de voorbeelden die worden benadrukt in de sectie ondersteunen concepten die worden beschreven in Big Idea 2 van het AP Biology® Curriculum Framework. De AP ® Leerdoelen die in het Curriculum Framework worden vermeld, bieden een transparante basis voor de AP ® Biologie-cursus, een op onderzoek gebaseerde laboratoriumervaring, educatieve activiteiten en AP ® -examenvragen. Een leerdoel voegt vereiste inhoud samen met een of meer van de zeven Wetenschapspraktijken.

Groot idee 2 Biologische systemen gebruiken vrije energie en moleculaire bouwstenen om te groeien, te reproduceren en om dynamische homeostase te behouden.
Blijvend begrip 2.C Organismen gebruiken feedbackmechanismen om groei en reproductie te reguleren en om dynamische homeostase te behouden.
Essentiële kennis 2.C.1 Organismen gebruiken feedbackmechanismen om hun interne omgeving in stand te houden en te reageren op externe omgevingsveranderingen.
wetenschap praktijk 7.2 De student kan concepten in en over domein(en) verbinden om te generaliseren of te extrapoleren in en/of over blijvende inzichten en/of grote ideeën.
Leerdoel 2.16 De student kan verbinden hoe organismen negatieve feedback gebruiken om hun interne omgeving in stand te houden.
Essentiële kennis 2.C.1 Organismen gebruiken feedbackmechanismen om hun interne omgeving in stand te houden en te reageren op externe omgevingsveranderingen.
wetenschap praktijk 5.3 De student kan het bewijs geleverd door datasets evalueren met betrekking tot een bepaalde wetenschappelijke vraag.
Leerdoel 2.17 De student kan gegevens evalueren die het effect(en) van veranderingen in concentraties van sleutelmoleculen op negatieve feedbackmechanismen aantonen.
Essentiële kennis 2.C.1 Organismen gebruiken feedbackmechanismen om hun interne omgeving in stand te houden en te reageren op externe omgevingsveranderingen.
wetenschap praktijk 6.4 De student kan beweringen en voorspellingen doen over natuurlijke fenomenen op basis van wetenschappelijke theorieën en modellen.
Leerdoel 2.18 De student kan voorspellingen doen over hoe organismen negatieve feedbackmechanismen gebruiken om hun internationale omgeving in stand te houden.
Essentiële kennis 2.C.1 Organismen gebruiken feedbackmechanismen om hun interne omgeving in stand te houden en te reageren op externe omgevingsveranderingen.
wetenschap praktijk 6.4 De student kan beweringen en voorspellingen doen over natuurlijke fenomenen op basis van wetenschappelijke theorieën en modellen.
Leerdoel 2.19 De student kan voorspellingen doen over hoe positieve feedbackmechanismen activiteiten en processen in organismen versterken op basis van wetenschappelijke theorieën en modellen.
Essentiële kennis 2.C.1 Organismen gebruiken feedbackmechanismen om hun interne omgeving in stand te houden en te reageren op externe omgevingsveranderingen.
wetenschap praktijk 6.1 De student kan beweringen onderbouwen met bewijs.
Leerdoel 2.20 De student kan verantwoorden dat positieve feedbackmechanismen reacties in organismen versterken.

Dierlijke organen en orgaansystemen passen zich voortdurend aan interne en externe veranderingen aan via een proces dat homeostase ("steady state") wordt genoemd. Deze veranderingen kunnen betrekking hebben op het glucose- of calciumgehalte in het bloed of op externe temperaturen. Homeostase betekent het handhaven van een dynamisch evenwicht in het lichaam. Het is dynamisch omdat het zich voortdurend aanpast aan de veranderingen die de systemen van het lichaam tegenkomen. Het is evenwicht omdat lichaamsfuncties binnen bepaalde grenzen worden gehouden. Zelfs een dier dat schijnbaar inactief is, handhaaft dit homeostatische evenwicht.

Homeostatisch proces

Het doel van homeostase is het handhaven van een evenwicht rond een punt of waarde die een instelpunt wordt genoemd. Hoewel er normale schommelingen zijn vanaf het instelpunt, zullen de systemen van het lichaam meestal proberen terug te gaan naar dit punt. Een verandering in de interne of externe omgeving wordt een stimulus genoemd en wordt gedetecteerd door een receptor. De reactie van het systeem is om de afwijkingsparameter in de richting van het instelpunt aan te passen. Als het lichaam bijvoorbeeld te warm wordt, worden er aanpassingen gedaan om het dier af te koelen. Als de bloedglucose stijgt na een maaltijd, worden er aanpassingen gedaan om de bloedglucosespiegel te verlagen door de voedingsstof in weefsels te krijgen die het nodig hebben of om het op te slaan voor later gebruik.

Controle van homeostase

Wanneer er een verandering optreedt in de omgeving van een dier, moet er een aanpassing plaatsvinden. De receptor neemt de verandering in de omgeving waar en stuurt vervolgens een signaal naar het controlecentrum (in de meeste gevallen de hersenen) dat op zijn beurt een reactie genereert die naar een effector wordt gesignaleerd. De effector is een spier (die samentrekt of ontspant) of een klier die afscheidt. Homeostase wordt in stand gehouden door negatieve feedbackloops. Positieve feedbackloops duwen het organisme in feite verder uit de homeostase, maar kunnen nodig zijn om leven te laten ontstaan. Homeostase wordt gecontroleerd door het zenuwstelsel en het endocriene systeem van zoogdieren.

Negatieve feedbackmechanismen

Elk homeostatisch proces dat de richting van de stimulus verandert, is een negatieve feedbacklus. Het kan de stimulus verhogen of verlagen, maar de stimulus mag niet doorgaan zoals hij deed voordat de receptor hem voelde. Met andere woorden, als een niveau te hoog is, doet het lichaam iets om het naar beneden te brengen, en omgekeerd, als een niveau te laag is, doet het lichaam iets om het te laten stijgen. Vandaar de term negatieve feedback. Een voorbeeld is dierlijk onderhoud van de bloedglucosespiegels. Als een dier gegeten heeft, stijgt de bloedsuikerspiegel. Dit wordt waargenomen door het zenuwstelsel. Gespecialiseerde cellen in de pancreas voelen dit en het hormoon insuline wordt afgegeven door het endocriene systeem. Insuline zorgt ervoor dat de bloedglucosespiegels dalen, zoals te verwachten is bij een negatief feedbacksysteem, zoals geïllustreerd in figuur 24.20. Als een dier echter niet heeft gegeten en de bloedsuikerspiegel daalt, wordt dit waargenomen in een andere groep cellen in de alvleesklier en komt het hormoon glucagon vrij waardoor de glucosespiegel stijgt. Dit is nog steeds een negatieve feedbacklus, maar niet in de richting die wordt verwacht door het gebruik van de term 'negatief'. Een ander voorbeeld van een toename als gevolg van de feedbackloop is de regulatie van bloedcalcium. Als de calciumspiegels afnemen, voelen gespecialiseerde cellen in de bijschildklier dit en geven ze parathyroïdhormoon (PTH) af, wat een verhoogde opname van calcium door de darmen en nieren veroorzaakt en mogelijk de afbraak van bot om calcium vrij te maken. De effecten van PTH zijn om de bloedspiegels van het element te verhogen. Negatieve feedbackloops zijn het overheersende mechanisme dat wordt gebruikt in homeostase.

Positieve feedbacklus

Een positieve feedbacklus handhaaft de richting van de stimulus en versnelt deze mogelijk. Er zijn maar weinig voorbeelden van positieve feedbackloops in dierlijke lichamen, maar één wordt gevonden in de cascade van chemische reacties die leiden tot bloedstolling of coagulatie. Wanneer één stollingsfactor wordt geactiveerd, activeert deze de volgende factor in volgorde totdat een fibrinestolsel is bereikt. De richting wordt gehandhaafd, niet veranderd, dus dit is positieve feedback. Een ander voorbeeld van positieve feedback zijn de samentrekkingen van de baarmoeder tijdens de bevalling, zoals geïllustreerd in figuur 24.21. Het hormoon oxytocine, gemaakt door het endocriene systeem, stimuleert de samentrekking van de baarmoeder. Dit veroorzaakt pijn die door het zenuwstelsel wordt waargenomen. In plaats van de oxytocine te verlagen en de pijn te laten verdwijnen, wordt er meer oxytocine aangemaakt totdat de weeën krachtig genoeg zijn om tot een bevalling te komen.

Visuele verbinding

Geef aan of elk van de volgende processen wordt gereguleerd door een positieve of negatieve feedbacklus.

A. Een persoon voelt zich verzadigd na het eten van een grote maaltijd.

B. Het bloed bevat veel rode bloedcellen. Hierdoor komt erytropoëtine, een hormoon dat de aanmaak van nieuwe rode bloedcellen stimuleert, niet meer vrij uit de nier.

A. Dit wordt gereguleerd door een positieve feedbacklus als de stimulus (honger) van richting is veranderd als reactie op een signaal (volheid).

B. Dit wordt gereguleerd door een positieve feedbacklus, aangezien de stimulus (afgifte van rode bloedcellen) van richting is veranderd als reactie op een signaal (aanwezigheid van voldoende rode bloedcellen).

A. Dit wordt gereguleerd door een negatieve feedbacklus als de stimulus (honger) van richting is veranderd als reactie op een signaal (volheid).

B. Dit wordt gereguleerd door een positieve feedbacklus, aangezien de richting van de stimulus is gehandhaafd.

A. Dit wordt gereguleerd door een positieve feedbacklus als de stimulus (honger) van richting is veranderd als reactie op een signaal (volheid).

B. Dit wordt gereguleerd door een negatieve feedbacklus, aangezien de stimulus (afgifte van rode bloedcellen) van richting is veranderd als reactie op een signaal (aanwezigheid van voldoende rode bloedcellen).

A. Dit wordt gereguleerd door een negatieve feedbacklus als de stimulus (honger) van richting verandert als reactie op een signaal (volheid).

B. Dit wordt gereguleerd door een negatieve feedbacklus wanneer de stimulus (afgifte van rode bloedcellen) van richting verandert als reactie op een signaal (aanwezigheid van voldoende rode bloedcellen).

Setpunt

Het is mogelijk om het setpoint van een systeem aan te passen. Wanneer dit gebeurt, werkt de feedbacklus om de nieuwe instelling te behouden. Een voorbeeld hiervan is de bloeddruk: na verloop van tijd kan de normale of ingestelde bloeddruk stijgen als gevolg van een aanhoudende stijging van de bloeddruk. Het lichaam herkent de hoogte niet meer als abnormaal en er wordt geen poging gedaan om terug te keren naar het lagere instelpunt. Het resultaat is het in stand houden van een verhoogde bloeddruk die schadelijke effecten op het lichaam kan hebben. Medicatie kan de bloeddruk verlagen en het setpoint in het systeem verlagen tot een gezonder niveau. Dit heet een proces van wijziging van het instelpunt in een terugkoppelingslus.

Er kunnen veranderingen worden aangebracht in een groep lichaamsorgaansystemen om een ​​instelpunt in een ander systeem te handhaven. Dit heet acclimatisatie. Dit gebeurt bijvoorbeeld wanneer een dier naar een grotere hoogte migreert dan het gewend is. Om zich aan te passen aan de lagere zuurstofniveaus op de nieuwe hoogte, verhoogt het lichaam het aantal rode bloedcellen dat in het bloed circuleert om te zorgen voor voldoende zuurstoftoevoer naar de weefsels. Een ander voorbeeld van acclimatisatie zijn dieren die seizoenswisselingen in hun vacht hebben: een zwaardere vacht in de winter zorgt voor voldoende warmteopslag, en een lichte vacht in de zomer zorgt ervoor dat de lichaamstemperatuur niet tot schadelijke niveaus stijgt.

Link naar leren

Feedbackmechanismen kunnen worden begrepen in termen van het besturen van een raceauto langs een circuit: bekijk een korte videoles over positieve en negatieve feedbackloops.

Spanningsafhankelijke natriumkanalen komen voor in de celmembranen van zenuwcellen. Ze openen als reactie op natrium dat de cel binnenkomt. Hierdoor kan er meer natrium de cel binnenkomen.

Een wetenschapper beweert dat dit een positieve feedbacklus is. Welke redenering kan worden gebruikt om deze bewering te rechtvaardigen?

  1. De spanningsafhankelijke natriumkanalen gaan open als reactie op de instroom van natrium. Wanneer een verandering plaatsvindt als reactie op een verandering in de omstandigheden, ontstaat er een positieve feedbacklus.
  2. De spanningsafhankelijke natriumkanalen sluiten wanneer er voldoende natrium in de cel is. Door deze zelfregulering is dit een voorbeeld van een positieve feedbackloop.
  3. De spanningsafhankelijke natriumkanalen gaan open door natrium en dit zorgt ervoor dat er meer natrium doorheen gaat. De respons versterkt de feedback, waardoor dit een positieve feedbacklus wordt.
  4. De spanningsafhankelijke natriumkanalen bevinden zich op het celmembraan. Alle kanalen door celmembranen zijn voorbeelden van positieve feedbackloops. Dit is een voorbeeld van een positieve feedbackloop.

Science Practice Connection voor AP®-cursussen

Denk er over na

Hoe worden negatieve feedbacklussen gebruikt om de lichaamshomeostase te reguleren? Hoe is een aandoening als diabetes een goed voorbeeld van het falen van een setpoint bij de mens? Stel een hypothese op en teken een diagram dat laat zien wat volgens u de feedbackfout is voor een persoon met diabetes.

Ondersteuning voor docenten

Negatieve feedbackloops houden de niveaus van een variabele in de buurt van een instelpunt. Bij diabetes duidt een stijging van de bloedglucose niet op de productie van insuline, wat normaal gesproken de bloedglucose zou verlagen tot het ingestelde punt. De Think About It-vraag is een toepassing van AP ® Leerdoel 2.16 en Wetenschapspraktijk 7.2 en Leerdoel 2.17 en Wetenschapspraktijk 5.3 omdat studenten negatieve feedback koppelen aan de regulatie van homeostase en vervolgens, met behulp van bloedsuikerspiegels bij mensen als voorbeeld, uitleggen hoe een verandering in een negatief feedbackmechanisme een schadelijk effect kan hebben.

Homeostase: Thermoregulatie

Lichaamstemperatuur beïnvloedt lichaamsactiviteiten. Over het algemeen neemt de enzymactiviteit ook toe als de lichaamstemperatuur stijgt. Voor elke temperatuurstijging van tien graden Celsius verdubbelt de enzymactiviteit tot op zekere hoogte. Lichaamseiwitten, inclusief enzymen, beginnen te denatureren en verliezen hun functie bij hoge temperaturen (ongeveer 50 o C voor zoogdieren).Enzymactiviteit zal met de helft afnemen voor elke temperatuurdaling van tien graden Celsius, tot het punt van bevriezing, op enkele uitzonderingen na. Sommige vissen zijn bestand tegen bevriezing en worden na ontdooien weer normaal.

Link naar leren

Bekijk deze Discovery Channel-video over thermoregulatie om illustraties van dit proces bij verschillende dieren te zien.

  1. Een losse huid is dikker, waardoor de overtollige warmte snel door de huid kan worden afgevoerd.
  2. Een losse huid brengt meer warmte en bloed naar het lichaamsoppervlak, waardoor warmteverlies wordt vergemakkelijkt.
  3. Een losse huid bevat een groter huidoppervlak, waardoor overtollige warmte kan worden afgevoerd als warmteverlies via de huid optreedt.
  4. Een losse huid heeft een kleiner huidoppervlak, waardoor overtollige warmte kan worden afgevoerd als warmteverlies via de huid optreedt.

Endothermen en ectothermen

Dieren kunnen in twee groepen worden verdeeld: sommige houden een constante lichaamstemperatuur aan ondanks verschillende omgevingstemperaturen, terwijl andere een lichaamstemperatuur hebben die gelijk is aan die van hun omgeving en dus varieert met de omgeving. Dieren die afhankelijk zijn van externe temperaturen om hun lichaamstemperatuur in te stellen, zijn ectothermen. Deze groep wordt koelbloedig genoemd, maar de term is mogelijk niet van toepassing op een dier in de woestijn met een zeer warme lichaamstemperatuur. In tegenstelling tot ectothermen zijn poikilothermen dieren met constant variërende interne temperaturen. Een dier dat een constante lichaamstemperatuur handhaaft ondanks veranderingen in de omgeving, wordt een homeotherm genoemd. Endothermen zijn dieren die afhankelijk zijn van interne bronnen voor het handhaven van een relatief constante lichaamstemperatuur bij variërende omgevingstemperaturen. Deze dieren kunnen een niveau van metabolische activiteit handhaven bij lagere temperaturen, wat een ectotherm niet kan vanwege verschillende activiteitsniveaus van enzymen. Het is vermeldenswaard dat sommige ectothermen en poikilothermen relatief constante lichaamstemperaturen hebben vanwege de constante omgevingstemperaturen in hun leefgebieden. Deze dieren zijn zogenaamde ectotherme homeothermen, zoals sommige diepzeevissoorten.

Dagelijkse verbinding voor AP®-cursussen

  1. vasodilatatie verhogen
  2. zweet
  3. ga in de schaduw
  4. verhoging van de stofwisseling

Warmtebehoud en -afvoer

Dieren behouden of verdrijven warmte op verschillende manieren. In bepaalde klimaten hebben endotherme dieren een vorm van isolatie, zoals vacht, vet, veren of een combinatie daarvan. Dieren met een dikke vacht of veren creëren een isolerende luchtlaag tussen hun huid en inwendige organen. IJsberen en zeehonden leven en zwemmen in een omgeving waar het vriest en behouden toch een constante, warme lichaamstemperatuur. Zo gebruikt de poolvos zijn pluizige staart als extra isolatie als hij zich bij koud weer opkrult om te slapen. Zoogdieren hebben een resteffect van rillingen en verhoogde spieractiviteit: arrector pili-spieren veroorzaken "kippenvel", waardoor kleine haartjes overeind komen als het individu het koud heeft, dit heeft het beoogde effect van het verhogen van de lichaamstemperatuur. Zoogdieren gebruiken vetlagen om hetzelfde doel te bereiken. Verlies van aanzienlijke hoeveelheden lichaamsvet zal het vermogen van een persoon om warmte vast te houden in gevaar brengen.

Endothermen gebruiken hun bloedsomloop om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Vasodilatatie brengt meer bloed en warmte naar het lichaamsoppervlak, waardoor straling en warmteverlies door verdamping worden vergemakkelijkt, wat helpt om het lichaam af te koelen. Vasoconstrictie vermindert de bloedstroom in perifere bloedvaten, waardoor het bloed naar de kern en de vitale organen die daar worden gevonden, wordt gedwongen en warmte wordt vastgehouden. Sommige dieren hebben aanpassingen aan hun bloedsomloop waardoor ze warmte van slagaders naar aders kunnen overbrengen, waardoor het bloed wordt verwarmd dat terugkeert naar het hart. Dit wordt een tegenstroomwarmte-uitwisseling genoemd en voorkomt dat het koude veneuze bloed het hart en andere inwendige organen afkoelt. Deze aanpassing kan bij sommige dieren worden uitgeschakeld om oververhitting van de inwendige organen te voorkomen. De tegenstroomaanpassing wordt gevonden bij veel dieren, waaronder dolfijnen, haaien, beenvissen, bijen en kolibries. Daarentegen kunnen vergelijkbare aanpassingen helpen om endothermen te koelen wanneer dat nodig is, zoals dolfijnvinnen en olifantenoren.

Sommige ectotherme dieren gebruiken veranderingen in hun gedrag om de lichaamstemperatuur te helpen reguleren. Een ectotherm woestijndier kan bijvoorbeeld op het heetste deel van de dag in de woestijn gewoon koelere gebieden zoeken om te voorkomen dat het te warm wordt. Dezelfde dieren kunnen op rotsen klimmen om warmte op te vangen tijdens een koude woestijnnacht. Sommige dieren zoeken water om verdamping te bevorderen bij het afkoelen, zoals gezien bij reptielen. Andere ectothermen gebruiken groepsactiviteit, zoals de activiteit van bijen, om een ​​bijenkorf te verwarmen om de winter te overleven.

Veel dieren, vooral zoogdieren, gebruiken metabolische restwarmte als warmtebron. Wanneer spieren worden samengetrokken, is de meeste energie van de ATP die wordt gebruikt bij spieracties verspilde energie die zich vertaalt in warmte. Ernstige kou wekt een rillende reflex op die warmte voor het lichaam genereert. Veel soorten hebben ook een soort vetweefsel, bruin vet genaamd, dat gespecialiseerd is in het genereren van warmte.

Neurale controle van thermoregulatie

Het zenuwstelsel is belangrijk om thermoregulatie, zoals geïllustreerd in figuur 24.22. De processen van homeostase en temperatuurregeling zijn gecentreerd in de hypothalamus van de geavanceerde dierlijke hersenen.

Visuele verbinding

  1. Pyrogenen circuleren naar de hypothalamus om de "thermostaat" van het lichaam te resetten, waardoor de temperatuur stijgt.
  2. Pyrogenen circuleren naar de thalamus om de "thermostaat" van het lichaam te resetten, waardoor de temperatuur stijgt.
  3. Pyrogenen zorgen voor een toename van de activiteit van de enzymen van het dier, waardoor de temperatuur stijgt.
  4. Pyrogenen die het bloed binnenkomen, geven enkele lipidenstoffen af, die uiteindelijk de temperatuurstijging veroorzaken.

De hypothalamus handhaaft het instelpunt voor lichaamstemperatuur door middel van reflexen die vasodilatatie en zweten veroorzaken als het lichaam te warm is, of vasoconstrictie en rillingen wanneer het lichaam te koud is. Het reageert op chemicaliën uit het lichaam. Wanneer een bacterie wordt vernietigd door fagocytische leukocyten, komen chemicaliën die endogene pyrogenen worden genoemd in het bloed vrij. Deze pyrogenen circuleren naar de hypothalamus en resetten de thermostaat. Hierdoor kan de lichaamstemperatuur stijgen tot wat gewoonlijk koorts wordt genoemd. Een verhoging van de lichaamstemperatuur zorgt ervoor dat ijzer wordt geconserveerd, waardoor een voedingsstof die bacteriën nodig hebben, wordt verminderd. Een toename van lichaamswarmte verhoogt ook de activiteit van de enzymen en beschermende cellen van het dier, terwijl de enzymen en activiteit van de binnendringende micro-organismen worden geremd. Ten slotte kan hitte zelf ook de ziekteverwekker doden. Koorts waarvan ooit werd gedacht dat het een complicatie van een infectie was, wordt nu beschouwd als een normaal afweermechanisme.

Wanneer een endotherm dier wordt geconfronteerd met een plotselinge daling van de omgevingstemperatuur, zal:

Wat is een voorbeeld van negatieve feedback?

Welke methode van warmte-uitwisseling vindt plaats tijdens direct contact tussen de bron en het dier?

De lichaamsthermostaat bevindt zich in de ________.

Waarom worden negatieve feedbacklussen gebruikt om de lichaamshomeostase te regelen?

Een aanpassing aan een verandering in de interne of externe omgeving vereist een verandering in de richting van de stimulus. Een negatieve feedbacklus bereikt dit, terwijl een positieve feedbacklus de stimulus zou voortzetten en schade aan het dier zou veroorzaken.

Waarom is koorts een 'goede zaak' tijdens een bacteriële infectie?

Zoogdierenzymen verhogen de activiteit tot het punt van denaturatie, waardoor de chemische activiteit van de betrokken cellen toeneemt. Bacteriële enzymen hebben een specifieke temperatuur voor hun meest efficiënte activiteit en worden geremd bij hogere of lagere temperaturen. Koorts leidt tot een toename van de vernietiging van de binnendringende bacteriën door de effectiviteit van de lichaamsafweer te vergroten en het bacteriële metabolisme te remmen.

Hoe is een aandoening als diabetes een goed voorbeeld van het falen van een setpoint bij de mens?

Diabetes wordt vaak geassocieerd met een tekort aan insulineproductie. Zonder insuline stijgen de bloedsuikerspiegels na een maaltijd, maar dalen ze nooit meer naar normale niveaus.

Als Amazon Associate verdienen we aan in aanmerking komende aankopen.

Wilt u dit boek citeren, delen of wijzigen? Dit boek is Creative Commons Attribution License 4.0 en je moet OpenStax toeschrijven.

    Als u dit boek geheel of gedeeltelijk in gedrukte vorm opnieuw distribueert, moet u op elke fysieke pagina de volgende bronvermelding opnemen:

  • Gebruik de onderstaande informatie om een ​​citaat te genereren. We raden aan om een ​​citatietool zoals deze te gebruiken.
    • Auteurs: Julianne Zedalis, John Eggebrecht
    • Uitgever/website: OpenStax
    • Titel van het boek: Biologie voor AP®-cursussen
    • Publicatiedatum: 8 maart 2018
    • Locatie: Houston, Texas
    • Boek-URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/1-introduction
    • Sectie-URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/24-3-homeostasis

    © 12 januari 2021 OpenStax. Tekstboekinhoud geproduceerd door OpenStax is gelicentieerd onder een Creative Commons Attribution License 4.0-licentie. De OpenStax-naam, het OpenStax-logo, de OpenStax-boekomslagen, de OpenStax CNX-naam en het OpenStax CNX-logo zijn niet onderworpen aan de Creative Commons-licentie en mogen niet worden gereproduceerd zonder de voorafgaande en uitdrukkelijke schriftelijke toestemming van Rice University.


    DISCUSSIE

    Receptor-gemedieerde endocytose via CCV is een primair mechanisme voor de efficiënte internalisatie van extracellulaire opgeloste stoffen. Een van de redenen voor de hoge efficiëntie is dat de cellulaire componenten die in dit proces worden gebruikt, efficiënt worden gerecycled voor meerdere ronden van endocytose. Clathrine komt bijvoorbeeld vrij uit beklede blaasjes door de werking van hsc70, en het resulterende oplosbare clathrine wordt gebruikt bij de vorming van nieuwe beklede putjes. Hoewel het mechanisme voor het vrijgeven en recyclen van clathrine goed is gekarakteriseerd, is er zeer weinig bekend over het mechanisme en de vereisten voor het vrijgeven en recyclen van AP. We hebben een nieuwe en kwantitatieve test ontwikkeld om de afgifte van AP's door CCV te bestuderen. Met behulp van deze test hebben we aangetoond dat AP-afgifte hsc70 vereist naast een niet-geïdentificeerde cytosolische factor (en) en ATP.

    AP-afgifte is direct afhankelijk van cytosol. Hier laten we zien dat hsc70 een snelheidsbeperkende cytosolische component is voor AP-afgifte. De toevoeging aan ruw cytosol vermindert de cytosolafhankelijkheid aanzienlijk en verhoogt de snelheid van de AP-afgiftereactie. Aangezien hsc70 een overvloedige cytosolische component is, is het paradoxaal dat de concentratie ervan beperkend is. Deze beperkingen worden waarschijnlijk verklaard door de talrijke functies die hsc70 in de cel speelt, bijv. het behoud van de natieve gevouwen structuur van cytosolische eiwitten (Hartl et al., 1994). Belangrijk is dat, zoals eerder gemeld (Schlossmanet al., 1984 Heuser en Keen, 1988 Greene en Eisenberg, 1990 Buxbaum en Woodman, 1995), is hsc70, hoewel noodzakelijk, niet voldoende om de vrijgave van AP's door CCV te ondersteunen. Verschillende bewijslijnen suggereren dat, naast hsc70, andere cytosolische factor(en) nodig zijn voor AP-afgifte. Ten eerste kan noch hsc70 noch hsc70-verarmd cytosol AP-afgifte ondersteunen, terwijl deze afzonderlijke fracties samen efficiënte AP-afgifte ondersteunen. Ten tweede vereist maximale AP-afgifte twee keer meer ATP dan nodig is voor hsc70-gemedieerde clathrine-afgifte. De extra factor kan dus direct ATP binden. Als alternatief kan deze factor een interactie aangaan met hsc70 op een zodanige manier dat het de affiniteit van hsc70 voor ATP verandert. Eerdere studies (Gross en Hessefort, 1996) hebben een 66-kDa-eiwit geïdentificeerd dat de affiniteit van hsc70 voor ATP verandert en dat nodig is om de recyclage van hsc70 te bevorderen. Naast de verschillende ATP-vereisten, remt ADPβS de afgifte van clathrine, maar niet de afgifte van AP. Ten derde kan cytosol-afhankelijke AP-afgifte worden losgekoppeld van hsc70-afhankelijke clathrine-afgifte. Ten slotte kan AP-afgevende activiteit worden gescheiden van clathrine-afgevende activiteit en totaal eiwit door gelfiltratiechromatografie.

    Immunodepletie van hsc70 uit cytosol geeft aan dat het nodig is voor AP-afgifte. Een functie van hsc70 is het vrijgeven van clathrine. Onze gegevens suggereren echter dat hsc70 een dubbele rol speelt bij de afgifte van beide vachtbestanddelen uit CCV. Met behulp van een antilichaam (3C5) dat de clathrine-bindingsplaats van hsc70 als een specifieke remmer herkent, hebben we aangetoond dat volledige clathrine-afgifte geen vereiste was voor AP-afgifte. We kunnen niet uitsluiten dat herschikkingen van het clathrine-rooster gemedieerd door hsc70 in aanwezigheid van 3C5 de vereiste voor AP-afgifte weerspiegelen. Onze bevindingen dat AP-afgifte kan plaatsvinden zonder afgifte van clathrine, komen echter overeen met in vitro-tests voor het samenstellen van de vacht die hebben vastgesteld dat AP's in de vacht kunnen worden geïntegreerd na het aanbrengen van clathrine (Ahle en Ungewickell, 1989 Keenet al., 1991 Prasad en Keen, 1991). Bovendien kunnen AP's selectief worden verwijderd uit gecoate blaasjes door beperkte proteolyse zonder de clathrin-coating te dissociëren (Matsui en Kirchhausen, 1990, Schroder en Ungewickell, 1991 Traub et al., 1995). Onze gegevens suggereren dus dat, naast de goed gedocumenteerde functie van hsc70 bij het vrijgeven van clathrine uit CCV, hsc70 ook een directe rol speelt bij het vrijkomen van AP's.

    Hoe kan het 3C5-antilichaam selectief hsc70-gemedieerde clathrine-afgifte remmen zonder de vermeende tweede rol bij AP-afgifte te verstoren? Eén mogelijkheid is dat AP-afgifte gebruik kan maken van een domein van hsc70 dat verschilt van de clathrine-bindingsplaats. Er zijn verschillende eiwitten geïdentificeerd die een interactie aangaan met hsc70 op een plaats die verschilt van de peptide/clathrin-bindingsplaats. Deze omvatten DnaJ-homologen, andere heat shock-eiwitten en kinasen (Perdew en Whitelaw, 1991 Cyr. et al., 1994 Tsaar et al., 1994 Pratt en Toft, 1997). De afgifte van clathrin door hsc70, een DnaK-homoloog van zoogdieren, vereist de aanwezigheid van het zoogdier-DnaJ-familielid auxilin (Ahle en Ungewickell, 1990 Ungewickell et al., 1995). DnaJ-domeinbevattende eiwitten zijn gepostuleerd om de functionele diversiteit van DnaK-homologen te reguleren door ze op verschillende substraten te richten (Cyr et al., 1994). Het is mogelijk dat hsc70 functioneert om deze andere factoren (mogelijk een nieuwe DnaJ-homoloog) te rekruteren of ermee in wisselwerking te staan ​​om de afgifte van AP te beïnvloeden. In overeenstemming hiermee heeft hsc70-verarmd cytosol een significant verminderde AP-afgevende activiteit. Dit kan het resultaat zijn van de selectieve codepletie van een extra AP-afgevende factor samen met hsc70 vanwege hun interactie in het cytosol.

    De dubbele rol van hsc70 in de ontmantelingsreactie suggereert niet alleen dat de afgifte van AP en clathrine kan worden gecoördineerd, maar dat ze ook kunnen plaatsvinden door een gemeenschappelijk mechanisme. De kinetiek van clathrine en AP-afgifte is vergelijkbaar en bifasisch. Er is een eerste en snelle afgifte van zowel AP's als clathrine, die binnen 3-5 minuten voltooid is. Deze eerste "burst" wordt gevolgd door een veel langzamere steady-state afgiftesnelheid (Greene en Eisenberg, 1990). Toevoeging van hsc70 aan cytosol verhoogt de snelheid van deze initiële uitbarsting van AP-afgifte. Deze kinetiek, samen met de mogelijke associatie van de cytosolische AP-afgevende factor(en) en hsc70, suggereert dat AP-afgifte samen met clathrine-afgifte kan optreden.

    Clathrin wordt vrijgegeven in een stabiel complex met hsc70, met maximaal drie hsc70-moleculen gebonden aan de top van het triskelion (Schlossmanet al., 1984 Heuser en Steer, 1989). Het is dus mogelijk dat AP's ook vrijkomen in een stabiel complex met de uncoating factor(s). Onze voorlopige inspanningen om dergelijke complexen of eiwitten die met AP's associëren te detecteren, zijn tot nu toe niet succesvol gebleken. Dit kan een weerspiegeling zijn van ongepaste reactieomstandigheden voor de vorming van een stabiel complex, dissociatie van het complex na AP-afgifte door de daaropvolgende werking van andere cytosolische eiwitten, of suboptimale gradiëntomstandigheden. Daarom kunnen we dit mechanisme voor het vrijgeven van AP's niet elimineren totdat we het proces hebben onderzocht met behulp van gezuiverde componenten.

    Fosforylering van AP's is een ander mogelijk mechanisme voor de afgifte van AP's. Dit is vooral aantrekkelijk omdat is aangetoond dat cytosolische AP's bij voorkeur worden gefosforyleerd (Wilde en Brodsky, 1996). Bovendien is aangetoond dat hsc70 associeert met een kinase-activiteit (besproken in Pratt en Toft, 1997). Deze interactie zou ook de selectieve codepletie van de AP-afgevende activiteit met hsc70 verklaren. In overeenstemming met de mogelijkheid dat de AP-afgevende factor een kinase is, ondersteunt ATPγS, dat kinase-activiteit kan ondersteunen, ook AP-afgifte, terwijl AMP-PNP dat niet doet. Pogingen om gefosforyleerde AP's te detecteren na hun cytosol-gemedieerde afgifte uit CCV waren niet succesvol. Dit resultaat elimineert echter niet de mogelijkheid dat AP-afgifte fosforyleringsafhankelijk is, omdat deze reacties werden uitgevoerd in aanwezigheid van ruw cytosol en daarom waren de AP's toegankelijk voor cytosolische fosfatasen. Een vollediger begrip van het mechanisme en de vereisten voor AP-afgifte wacht op de zuivering van de verantwoordelijke cytosolische AP-afgevende factor(en).


    Bekijk de video: Agribisnis tanaman perkebunan (December 2021).