Informatie

2.1: aptameer-coderend DNA versterken - Biologie


Invoering

Toen hij een postdoctoraal onderzoeker was, screende professor Niles een willekeurige bibliotheek van RNA-aptameren om er een te vinden die bindt aan heem - de ijzerbevattende plaats in hemoglobine. Het is bekend dat heem kan binden aan bepaalde transcriptiefactoren en genexpressie kan moduleren (zie referenties) Zhang en Hach, 1999 en Ogawa, et al., 2001), en RNA-aptameren zijn een potentieel hulpmiddel om meer te leren over signaleringsnetwerken waarbij heem betrokken is. Een aptamer genaamd "6-5" overleefde de 6e screeningsronde, maar bleek uiteindelijk niet aan heem te binden. Een aptameer genaamd "8-12" overleefde alle 8 screeningsrondes en heeft een heembindingsaffiniteit van 220 nM. Beide werden beschreven in de Niles, et al., 2006 papier waarnaar hieronder wordt verwezen.

Vandaag krijgt u twee archiefplasmiden die respectievelijk de 6-5 en 8-12 sequenties bevatten. RNA is niet erg stabiel in vergelijking met DNA; dus worden RNA-aptameren gekopieerd naar hun geassocieerde DNA-sequenties voor langdurige opslag. Ligering van het DNA-fragment in een plasmide dat in bacteriën kan worden gedragen, verschaft verdere amplificatie- en opslagmogelijkheden. In Module 2 gaan we uitgebreider gebruik maken van deze mogelijkheden.

Om alleen het korte DNA-fragment dat codeert voor het aptameer te selecteren en te amplificeren, gebruikt u de polymerasekettingreactie, PCR. PCR omvat drie hoofdstappen: 1) matrijs-DNA met een gewenste sequentie wordt gesmolten, 2) primers hechten aan specifieke locaties op het nu gesmolten (dwz enkelstrengs) DNA, en 3) de primers worden verlengd met een polymerase om te selecteren en het gewenste product maken. Verlenging vindt plaats bij ~ 70 ° C, smelt bij ~ 95 ° C en gloeit bij een temperatuur ~ 5 ° C onder de smelttemperatuur van de primer; dus wordt de herhaling van deze stappen thermische cycli genoemd. Na elke cyclus worden de nieuw gevormde producten zelf sjablonen, waardoor de geselecteerde sequentie exponentieel wordt versterkt. (Merk op dat de vroege PCR-rondes niet het gewenste product zullen opleveren - we zullen zien waarom in de pre-lab lezing van vandaag.)

Zodra de PCR draait, begint u enkele rekenhulpmiddelen voor RNA-analyse te verkennen. Tijdens deze module zul je uiteindelijk drie verschillende programma's gebruiken om zowel sequentieovereenkomsten tussen RNA-kandidaat-aptameren als hogere-ordestructuren die voortkomen uit de primaire sequenties te onderzoeken. Voor vandaag zul je kijken naar de mate van sequentieovereenkomst tussen een lijst van aptameren, waarvan sommige binden aan heem en andere niet.

Op basis van de talrijke toepassingen van PCR lijkt het misschien alsof de techniek altijd al bestaat. In feite is het pas 25 jaar oud. In 1984 beschreef Kary Mullis deze techniek voor het amplificeren van DNA van bekende of onbekende sequentie, waarbij hij zich onmiddellijk de betekenis van zijn inzicht realiseerde.

"Lieve Thor!," riep ik uit. Ik had de meest irritante problemen in de DNA-chemie opgelost in een enkele bliksemschicht. Overvloed en onderscheid. Met twee oligonucleotiden, DNA-polymerase en de vier nucleosidetrifosfaten kon ik zoveel van een DNA-sequentie maken als ik wilde en ik kon het maken op een fragment van een specifieke grootte die ik gemakkelijk kon onderscheiden. Op de een of andere manier, dacht ik, moest het een illusie zijn. Anders zou het de DNA-chemie voor altijd veranderen. Anders zou ik beroemd worden. Het was te gemakkelijk. Iemand anders zou het gedaan hebben en ik zou er zeker van gehoord hebben. We zouden het de hele tijd doen. Wat zag ik niet? 'Jennifer, wakker worden. Ik heb iets ongelooflijks bedacht.' --Kary Mullis van zijn Nobellezing, 8 december 1983.

(Copyright © The Nobel Foundation 1993. Alle rechten voorbehouden. Deze inhoud is uitgesloten van onze Creative Commons-licentie. Zie voor meer informatie http://ocw.mit.edu/fairuse.)

Referenties

Zhang, L., en A. Hach. "Moleculair mechanisme van heemsignalering in gist: de transcriptionele activator Hap1 dient als de belangrijkste bemiddelaar." Cell Mol Life Science 56, nee. 5-6 (30 oktober 1999): 415-26.

Ogawa, K., et al. "Heme bemiddelt derepressie van Maf-herkenningselement door directe binding aan transcriptierepressor Bach1." EMBO J 20, nee. 11 (1 januari 2001): 2835-43.

Niles, J.C."Gebruik maken van RNA-aptameren om een ​​fysiologisch belangrijk heme-gereguleerd cellulair netwerk te onderzoeken." ACS Chem Biol 1, nr. 8 (19 september 2006): 515-24.

Protocollen

Deel 1: Practicum in het laboratorium

U en uw partner kunnen samen aan het labpracticum werken. (Opmerking: dit zal niet het geval zijn voor toekomstige quizzen.) Je bent natuurlijk welkom om verschillende antwoorden te geven als je het er niet mee eens bent.

Deel 2: Versterk het DNA-fragment dat codeert voor Aptameer

Voordat u met het natte laboratoriumwerk van vandaag begint, wilt u misschien uw pipetten en uw werkblad afvegen met 70% ethanol.

  1. U krijgt plasmiden die coderen voor het DNA voor twee aptameren: "6-5" en "8-12", beide met ~250 g/ml. Maak een plan voor het toevoegen van 2,5 ng DNA aan elke PCR-reactie, in niet meer dan 20 L eindvolume van plasmide en water.
    • Houd er rekening mee dat u het DNA mogelijk serieel moet verdunnen. Als u het DNA bijvoorbeeld 10.000 keer moet verdunnen om een ​​concentratie van 2,5 ng/20 L te bereiken, moet u een verdunning van 1:100 maken van de oorspronkelijke voorraad en vervolgens een verdunning van 1:100 van de resulterende oplossing. Het is het beste om ten minste 5 L oplossing per keer te pipetteren om de onnauwkeurigheden te voorkomen die gepaard gaan met het pipetteren van zeer kleine volumes. Voel je vrij om je plan uit te voeren door de onderwijsfaculteit.
  2. Voeg per reactie 20 L PCR Master Mix, 5 μL elk primer, de DNA-template en water zodat het totale volume van de reactie 50 L is. Naast de twee DNA-bevattende reacties, moet u een controle zonder sjabloon maken die zuiver water zonder plasmide bevat.
    • Wat zou het betekenen als uw controle zonder sjabloon zou resulteren in amplificatie van DNA van dezelfde grootte als uw aptameren?
  3. De PCR duurt ongeveer 1 uur, in de volgende cyclus:
SEGMENTENCYCLUSTEMPERATUUR (°C)TIJD
11944 minuten
2-4259430 seconden
5730 seconden
7230 seconden
517210 minuten
614onbepaalde tijd

Deel 3: Inleiding tot computationele analyse

Uw begrip van deze module zal gedeeltelijk worden geëvalueerd door de RNA Computational Analysis-opdracht. Hoewel je vandaag niet bereid zult zijn om de hele opdracht te begrijpen - totdat je beter begrijpt wat SELEX inhoudt - zou je een goed begin moeten kunnen maken met het eerste deel.

  1. Begin met het lezen van het opdrachtenoverzicht en achtergrondinformatie. (Het is prima als dat laatste nog niet helemaal logisch is.)
  2. Download het bijbehorende databestand en lees de achtergrond. Nogmaals, de inleidende tekst kan over een week of twee logischer zijn.

Primer-analyse

Merk op dat alle sequenties in het gegevensbestand van 5' tot 3' worden weergegeven.

  1. Begin met het kopiëren van de sense-streng van het SELEX-bibliotheekcoderende DNA naar een nieuw Word-document.
    • Zorg ervoor dat u het Courier-lettertype gebruikt, zodat elke basis dezelfde grootte heeft.
  2. Bepaal en schrijf de complementaire antisense streng (van 3' tot 5') direct onder de sense streng.
  3. Aan welke streng zal de 5'-primer hechten? Kopieer en plak om de primer uit te lijnen met de genoemde streng - toon deze ofwel boven of onder de twee strengen van sjabloon-DNA, niet ertussen. Markeer de primer vetgedrukt.
  4. Aan welke streng zal de 3'-primer hechten? Lijn deze primer uit met de genoemde streng en markeer vetgedrukt. Zorg ervoor dat de complementaire basenparen op één lijn liggen. Wat heb je aan de primer moeten doen om dit voor elkaar te krijgen?
  5. Lever je inleidingsdiagram (en antwoorden op de bovenstaande vragen) vandaag nog in met je notitieboekje.

Sequentie-uitlijning

  1. Vandaag werk je aan deel één van de rekenopdracht, namelijk sequentie-uitlijning met behulp van het CLUSTAL-programma. U kunt misschien nog niet alle interpretatieve vragen beantwoorden, maar u kunt beginnen met het beantwoorden van de meer rechttoe rechtaan analytische vragen, zoals delen van 2, 3 en 4.
  2. Om de schermafbeelding voor de gewenste figuur vast te leggen, kunt u de Grijpen hulpprogramma op een Mac.
    • Zoek naar "Grab" met spotlight (het vergrootglasachtige pictogram in de rechterbovenhoek) of ga naar ToepassingenNutsvoorzieningen Grijpen.
  3. Je bent niet verplicht om je werk op dit onderdeel in je schrift te noteren.

Voor de volgende keer

  1. Blijf vertrouwd raken met de werking van OpenWetWare. In het bijzonder moet u:
    • Voeg uw gebruikerspagina toe aan de pagina Personen van de klas.
    • Vul de studentenregistratie/vragenlijst in om de volgende keer in te leveren..
  2. De belangrijkste beoordeling voor deze module is de: RNA-engineeringrapport. Begin vertrouwd te raken met de verwachte structuur en inhoud.
  3. Over een week zullen we in de Module 1 Dag 3-sessie een klasdiscussie hebben over een artikel uit de primaire wetenschappelijke literatuur. U kunt nu beginnen met lezen en erover nadenken, in plaats van dit pas in de twee dagen tussen dag 2 en dag 3 te doen.

Lijst met reagentia

  • PCR-mastermix (2,5x)
    • 62,5 E/ml Taq DNA-polymerase
    • 125 mM KCl
    • 75 mM Tris-HCl, pH 8,3
    • 3,75 mM Mg(OAc)2
    • 500 M elke dNTP
  • Voorwaartse primer: 20μM voorraad
  • Omkeerprimer: 20μM voorraad
  • Sjablonen: 8-12 en 6-5

Afwijking in het DNA van de Egyptische farao: was hij een buitenaardse hybride?

De oude Egyptenaren probeerden zijn erfenis uit de geschiedenis te wissen, dus er is heel weinig over hem bekend. Maar wat we weten over deze heerser doet ons afvragen wie of wat hij werkelijk was. In tegenstelling tot alle eerdere farao's die in uitstekende fysieke vorm werden afgebeeld, is het uiterlijk van Achnaton verrassend vreemd: amandelvormige ogen, een kleine buik, dunne ledematen, een langwerpige schedel.

Het monotheïsme van Achnaton

Een oude Egyptische farao Achnaton

Achnaton zette heel Egypte op zijn kop en creëerde de grootste ketterij die de Egyptenaren nooit hadden gekend. Hij beweerde dat de Egyptenaren niet langer in een pantheon van meerdere goden hadden moeten geloven, maar één god hadden moeten aanbidden. In dit opzicht is er een veronderstelling dat Achnaton en het bijbelse personage Abraham dezelfde persoon kunnen zijn geweest. Onderzoekers hebben de lichamen van veel farao's en hun familieleden in gemummificeerde vorm ontdekt, maar er is nooit een mummie van Achnaton gevonden. 'Maar beeldhouwwerken en houtsnijwerk uit die tijd tonen Achnaton zowel alleen als in een liefdevolle familieomgeving, waaronder zijn belangrijkste gemalin, Nefertiti, en hun kinderen. Dergelijke instellingen werden nooit gebruikt in kunstwerken van farao's voor of na Achnaton

Achnaton geloofde echter niet echt in het monotheïsme, hij was er absoluut van overtuigd dat er andere goden bestaan, maar besloot dat alle aanbidding en gebeden aan één God zouden worden gegeven, Aten (de zonnegod in de oude Egyptische traditie). Zijn heersende periode staat bekend als de Amarna-periode. Hij verplaatste ook de hoofdstad van Egypte van Thebe naar de stad die hij stichtte, bekend als Tell el-Amarna (of Amarna). Deze periode is de meest besproken en bestudeerde periode in de Egyptische geschiedenis.

Achnaton en de koninklijke familie gezegend door Aten Afbeelding tegoed: door Troels Myrup

DNA-onderzoek van farao

Alles aan Achnaton was ongewoon, zelfs zijn DNA.

In 2015 publiceerden Stuart Fleischmann, een assistent-professor vergelijkende genomica aan de universiteit van Caïro, en zijn team het resultaat van een 7-jarig onderzoek. Ze brachten het genoom van negen oude Egyptische farao's in kaart. Acht monsters waren volkomen normaal en de negende die van Achnaton was, was nogal ongebruikelijk.

“Fleischmann en zijn team hebben de kostbare monsters van oud DNA onderworpen aan een proces dat Polymerse Chain Reaction (PCR) wordt genoemd. In de moleculaire biologie wordt deze techniek vaak gebruikt om een ​​enkele kopie van een stukje DNA te repliceren en te versterken, waardoor onderzoekers een duidelijk beeld krijgen van iemands genetische vingerafdruk.

Acht van de negen monsters leverden interessante maar typische resultaten op. Het negende exemplaar was van Achnaton, de raadselachtige farao uit de 14e eeuw voor Christus en vader van Toetanchamon. Een klein fragment van uitgedroogd hersenweefsel was de bron van het DNA-monster en de test werd herhaald met botweefsel, maar dezelfde resultaten werden verkregen.

Een van de boosdoeners was een gen genaamd CXPAC-5, dat verantwoordelijk is voor de groei van de cortex. De anomalie is zichtbaar in de onderstaande afbeelding.”

Afbeelding tegoed: Abovetopsecret

“Nog een interessant bewijsstuk biedt ondersteuning voor deze hypothese. De afbeelding hieronder toont twee microscoopfoto's van botweefsel dat is bemonsterd uit de schedel van Achnaton en dat van een andere mummie van dezelfde leeftijd.'

Afbeelding tegoed: Abovetopsecret

De schedel wordt slechts door twee processen vergroot: extreme veroudering en extreme genetische mutatie, dus Achnaton kan niet ouder zijn dan 45 jaar. Archeologisch bewijs weerlegt dit. Bovendien hebben elektronenmicroscopen tekenen gevonden van een nucleonlitteken, wat een duidelijke manifestatie is van de genezing van de DNA-helix na blootstelling aan sterke mutagenen.

Irwin M. Braverman op de 14e jaarlijkse historische clinicopathologische conferentie

Volgens Yale-professor Irwin M. Braverman zou de afwijking in het uiterlijk van Achnaton familiale gynaecomastie en craniosynostose kunnen zijn. Gynaecomastie is de aandoening die voornamelijk wordt aangetroffen bij mannen bij wie de borst is gezwollen als gevolg van hormonale onbalans. Braveman zei dat de vader, grootvader en overgrootvader van Achnaton familiale gynaecomastie hadden. Het vergrote hoofd van Achnaton was te wijten aan de aandoening die craniosynostose wordt genoemd.

De resultaten van de analyse van botweefsel uit de schedel van Achnaton, toonden aan dat de botten van de schedel veel dichter zijn en fundamenteel verschillen van andere mummies van dezelfde leeftijd en periode. Bovendien zijn de schedel en het skelet van Achnaton twee keer zo dicht en duurzaam als die van de moderne mens.

Dus, wie of wat was Achnaton eigenlijk: een hybride van een buitenaards wezen, een mutant of een wezen van een andere planeet? Als een van deze waar is, is er een mogelijkheid dat oude buitenaardse wezens in het verre verleden op aarde zijn aangekomen, in de buurt van de rivier de Nijl hebben gewoond en tussen de lokale bevolking hebben gewoond.


PALEOBOTANY | Oud planten-DNA

Problemen in verband met DNA-afbraak

DNA-afbraak levert verschillende problemen op voor het aDNA-veld (vgl. Gilbert et al., 2005). Ten eerste zijn onderzoekers beperkt in de hoeveelheden amplificeerbaar DNA die ze kunnen terugwinnen. Ten tweede zijn onderzoekers vanwege DNA-fragmentatie en verknoping vaak beperkt in hun vermogen om sjablonen van minder dan een paar honderd bp groot te amplificeren (zie Willerslev en Cooper, 2005). Wanneer dit wordt gecombineerd met de inzichten over de implicaties van de relatieve abundantie van verschillende genetische doelen, wordt duidelijk dat er beperkingen zijn aan wat in dit vakgebied kan worden bereikt. Een ander probleem, dat het meest ernstig is voor de geloofwaardigheid van de discipline, is dat van monsterverontreiniging. De geringe hoeveelheid DNA geëxtraheerd uit een gedegradeerd monster kan gemakkelijk worden gemaskeerd door modern DNA van externe verontreinigingen van dezelfde of een vergelijkbare DNA-sequentie. Zonder de juiste behandeling om het omgevings-DNA te verwijderen, is het een zeer eenvoudige (en helaas veel voorkomende) zaak om beide bronnen van DNA te co-amplificeren. Afhankelijk van de relatieve concentraties van gastheer-naar-verontreinigende DNA in de PCR, kan het doel-DNA ofwel volledig worden overspoeld of voldoende gemodificeerd om te resulteren in foutieve gegevens.


Resultaten

Een divers panel van loci volgen door de voorbereiding van de Illumina-bibliotheek

Het Illumina-bibliotheekvoorbereidingsprotocol is een meerstapsproces dat bestaat uit het afschuiven van het input-DNA, enzymatische eindreparatie, 5'-fosforylering en 3'-single-dA-verlenging van de resulterende fragmenten, adapterligatie, groottefractionering op een agarosegel en PCR-amplificatie van met adapter geligeerde fragmenten. Bias kan mogelijk bij elke stap worden geïntroduceerd, inclusief de fysieke opruimstappen die eiwitten, nucleotiden en kleine DNA-fragmenten verwijderen.

Aangezien vrijwel alle genomen hun basissamenstelling in een smal %GC-bereik hebben, hebben we een samengesteld genomisch DNA-monster met een reeks basensamenstellingen die bijna het hele spectrum bestrijken als testsubstraat tijdens ons onderzoek naar bronnen van vooringenomenheid. We zijn begonnen met een equimolair mengsel van DNA bereid uit Plasmodium falciparum (genoomgrootte 23 Mb GC-gehalte 19%), Escherichia coli (4,6 Mb 51% GC) en Rhodobacter sphaeroides (4,6 Mb 69% GC). Het samengestelde 32-Mb 'PER'-genoom is ongeveer 100 keer kleiner dan een typisch zoogdiergenoom, waardoor het een meer handelbare grootte is voor onze analyses. Een histogram van de %GC-verdeling van 50-bp-vensters in de drie genomen wordt weergegeven in figuur S1 in aanvullend bestand 1.

Vervolgens hebben we een panel van qPCR-assays ontwikkeld die amplicons definiëren variërend van 6% tot 90% GC (tabel S1 in aanvullend bestand 2). De amplicons waren erg kort (50 tot 69 bp) en stelden ons dus in staat qPCR-assays uit te voeren op geknipt 'PER'-DNA en op aliquots die op verschillende punten in het protocol waren getrokken (Figuur 1). We bepaalden de abundantie van elke locus ten opzichte van een standaardcurve van input 'PER'-DNA. Om te corrigeren voor verschillen in DNA-concentratie, hebben we de berekende hoeveelheden genormaliseerd ten opzichte van de gemiddelde hoeveelheid van de 48% GC- en 52% GC-amplicons in elk monster.

Een divers panel van loci traceren door de Illumina-bibliotheekvoorbereiding. (a-e) Bij vijf stappen in het standaardprotocol werden aliquots verwijderd en geanalyseerd op basissamenstellingsbias door qPCR. (v,g) Om de ligatie-competente populatie van DNA-fragmenten te isoleren en te analyseren, werd een afzonderlijke ligatiereactie met gebiotinyleerde adapters uitgevoerd, gevolgd door het vangen met streptavidine van fragmenten die ten minste één adapter droegen. De hoeveelheid van elk amplicon in een bepaald monster werd gedeeld door de gemiddelde hoeveelheid van de twee amplicons die het dichtst bij 50% GC lag. De resulterende relatieve abundanties van amplicons werden uitgezet op een log10 schaal over hun respectieve GC-inhoud.

De input 'PER' genomisch DNA is per definitie onbevooroordeeld. Zoals verwacht was een spreidingsplot van de genormaliseerde hoeveelheid van elk amplicon over het GC-gehalte in wezen vlak van 6% tot 90% GC wanneer uitgezet op een logschaal, waarmee de op qPCR gebaseerde bias-assay werd gevalideerd (Figuur 1a). Het afschuiven van het DNA leidde niet tot een duidelijke scheeftrekking van de basissamenstelling (Figuur 1b), evenmin als de daaropvolgende drie enzymatische reactiestappen tot aan de adapterligatie (Figuur 1c). Dit is niet verwonderlijk aangezien er tot nu toe geen expliciete stap van DNA-fractionering had plaatsgevonden, behalve de opruimstappen. Het analyseren van het ligatiemengsel van adapter-geligeerde fragmenten door qPCR zou geen mogelijke vertekening aan het licht brengen tijdens een van de enzymatische reacties die nodig zijn voor het ligeren van de adapter aan de afgeschoven DNA-fragmenten, omdat het mengsel vermoedelijk enkele adapterloze fragmenten bevat.

Om een ​​bias-assay uitsluitend uit te voeren op de adapter-geligeerde fractie, hebben we een ligatie opgezet met niet-gefosforyleerde gebiotinyleerde adapters, de adapter-geligeerde DNA-fragmenten geïsoleerd door streptavidine-capture en de gevangen insert-fragmenten vrijgegeven door denaturatie voor analyse door qPCR. We zagen heel weinig of geen systematische GC-bias in de adapter-geligeerde fractie (Figuur 1f, g), en dus geen bewijs voor sterke discriminatie op basis van de basissamenstelling tijdens een van de voorgaande enzymatische reacties en opruimstappen.

Het uitsnijden van een smal groottebereik (overeenkomend met genomische fragmenten van ongeveer 170 tot 190 bp) uit een preparatieve agarosegel scheef de basissamenstelling niet (Figuur 1d). Echter, slechts tien PCR-cycli met behulp van de enzymformulering (Phusion HF DNA-polymerase) en thermocyclische omstandigheden die zijn voorgeschreven in het standaard Illumina-protocol verarmde loci met een GC-gehalte van > 65% tot ongeveer een honderdste van de mid-GC-referentieloci (Figuur 1e ). Amplicons < 12% GC waren verminderd tot ongeveer een tiende van hun pre-amplificatieniveau. Tussen de steile flanken aan weerszijden was de GC-bias-plot in wezen vlak. De plateaufase (gedefinieerd als het segment op de %GC-as met niet meer dan één gegevenspunt onder een relatieve abundantie van 0,7) varieerde van 11% tot 56% GC.

Drie thermocyclers vergelijken bij hun standaard hellingssnelheden

PCR-protocollen die zijn gepubliceerd door kitfabrikanten of in de wetenschappelijke literatuur specificeren gewoonlijk de temperatuur en duur van elke thermocyclische stap (bijvoorbeeld 10 s bij 98°C voor de denaturatiestap tijdens elke cyclus voor de PCR-verrijking van Illumina-bibliotheken), maar zelden de temperatuurstijgingssnelheid of het merk en model van de thermocycler. Voor het experiment getoond in figuur 1 (en voor een herhalingsexperiment getoond in figuur 2, heldere rode lijn), gebruikten we de standaard verwarmings- en koelsnelheden (respectievelijk 6°C/s en 4,5°C/s) op thermocycler 1 ( zie Materialen en methoden voor merk en model).

Effect van temperatuurstijgingssnelheden. Het standaard PCR-protocol met Phusion HF DNA-polymerase en korte initiële (30 s) en in-cyclus (10 s) denaturatietijden werd uitgevoerd op drie verschillende thermocyclers met hun respectievelijke standaard temperatuurhellinginstellingen. De verwarmings- en koelsnelheden waren 6 °C/s en 4,5°C/s op thermocycler 1 (felrode lijn), 4°C/s en 3°C/s op thermocycler 2 (paarse lijn) en 2,2°C/s en 2,2°C/s op thermocycler 3 (donkerrode lijn).

Het uitvoeren van het PCR-protocol op thermocyler 2 (bij de standaard verwarmings- en koelsnelheden van respectievelijk 4 °C/s en 3 °C/s) breidde het plateau uit tot 76% GC (Figuur 2, paars). Thermocyler 3 had de langzaamste standaard aanloopsnelheid (2,2°C/s). De bias-plot was vlak van 13% tot 84% GC voordat het daalde tot een tiende van het niveau voor de twee meest GC-rijke loci (Figuur 2, donkerrood). Deze resultaten zijn consistent met het idee dat een te steil thermoprofiel niet voldoende tijd laat boven een kritische drempeltemperatuur, wat onvolledige denaturatie en slechte amplificatie van de GC-rijke fractie veroorzaakt.

Optimalisatie van de PCR-condities

Om een ​​robuust protocol te ontwikkelen dat consistente resultaten oplevert voor een breed scala aan hellingssnelheden en thermocyclers, hebben we ervoor gekozen om de reactieomstandigheden op thermocycler 1 te optimaliseren, de slechtste presteerder, bij zijn hoge standaard hellingssnelheid. We redeneerden dat een protocol dat goed werkt op deze machine ook zou werken op een langzamere thermocycler.

Door simpelweg de initiële denaturatiestap (van 30 s tot 3 minuten) en de denaturatiestap tijdens elke cyclus (van 10 s tot 80 s) uit te breiden, werden de nadelige effecten van de te snelle hellingssnelheid overwonnen, zij het zonder de extreem hoge GC-fractie volledig te herstellen (Figuur 3a, donkerrode vierkanten). Lange denaturatie produceerde een bibliotheek van vergelijkbare kwaliteit als de kortere denaturatie op de langzaam oplopende thermocyler 3 (Figuur 2, donkerrood).

Optimalisatie van de PCR-condities. (een) Noch het verlengen van de denaturatietijden (donkerrode vierkanten) noch het toevoegen van 2M betaïne (zwarte driehoeken) is voldoende om extreem GC-rijke DNA-fragmenten te winnen door PCR met Phusion HF. (B) De combinatie van lange denaturatie en 2M betaïne is effectief voor de hoge GC-fractie (zwarte driehoeken), maar het profiel is niet zo gelijkmatig over het gehele GC-spectrum als na PCR met AccuPrime Taq HiFi (blauwe diamanten) met langere denaturatietijden en een lagere temperatuur ( 65°C) voor het uitgloeien en verlengen van de primer.

Het toevoegen van 2M betaïne zonder het thermoprofiel te veranderen had een equivalent effect op fragmenten met matig hoge GC, maar leidde tot een lichte verlaging van loci in het 10% tot 40% GC-bereik (Figuur 3a, zwarte driehoeken). Het toevoegen van 2M betaïne en het verlengen van de denaturatietijden redde - in feite enigszins oververtegenwoordigde - loci aan het extreem hoge uiteinde van het GC-spectrum ten koste van lage-GC-fragmenten (Figuur 3b, zwarte driehoeken), waardoor het plateau naar rechts werd verschoven ( 23 tot 90% GC).

Door Phusion HF te vervangen door het AccuPrime Taq HiFi-mengsel van DNA-polymerasen en het thermoprofiel te verfijnen, met name door de denaturatiestap te verlengen en de temperatuur voor primer-annealing en -extensie te verlagen van 72 ° C naar 65 ° C, verkregen we de GC-bias profiel weergegeven in figuur 3b (blauwe ruiten). Deze omstandigheden herstelden extreem hoge GC-loci bijna volledig, terwijl de onderdrukking van matig lage GC-amplicons die werden gezien met Phusion HF en 2M betaïne (zwarte driehoekjes) werd vermeden. Het plateau varieerde van 11% tot 84% GC met slechts een zeer lichte daling daarboven. Door de temperatuur voor de verlenging nog verder te verlagen (tot 60°C) verschoof de balans enigszins in het voordeel van AT-rijke loci ten koste van GC-rijke loci (zie hieronder).

We voerden een zij-aan-zij vergelijking uit van het AccuPrime Taq HiFi PCR-protocol op de snelst oplopende thermocycler 1 en op de langzaamst oplopende thermocycler 3 en vonden weinig of geen verschillen in de GC-biascurves (Figuur S2a in Extra bestand 1). We hebben het ook getest op met adapter geligeerde fragmentbibliotheken die waren geschoren en op grootte waren geselecteerd tot ongeveer 360-bp in plaats van 180-bp-inserts. De GC-profielen van PCR-versterkte bibliotheken met grotere inserts waren bijna net zo vlak als die van een controlebibliotheek met kleine inserts die parallel werd versterkt, met een iets rondere schouder, en bereikte de vlakke fase met 17% in plaats van 13% GC (Figuur S2b in Extra bestand 1).

Directe vergelijking van fragmentbibliotheek en sequentielezingen

De qPCR-assay meet de samenstelling van de met PCR versterkte bibliotheek. Het is waarschijnlijk dat stroomafwaartse stappen zoals clusterversterking, sequencing-by-synthese, beeldanalyse en off-instrument dataverwerking ook vooringenomenheid introduceren. Om invoerbibliotheken en de uiteindelijke uitvoergegevens direct te vergelijken, dat wil zeggen de op kwaliteit gefilterde en uitgelijnde Illumina-uitlezingen, hebben we vier 400-bp fragmentbibliotheken gesequenced waarvoor we ook qPCR-gegevens hadden en de sequencing-uitlezingen geteld die dezelfde loci bestreken.

Zoals weergegeven in figuur 4, voor een bibliotheek die is versterkt met AccuPrime Taq HiFi met 60 ° C voor de primerverlengingsstap, volgen sequencing en qPCR GC-profielen elkaar nauw op, inclusief enkele van de uitgesproken ups en downs die amplificatiekenmerken van individuele loci kunnen weerspiegelen. , zoals sequentiecontext of potentieel voor haarspeldvorming, niet vastgelegd in hun gemiddelde GC-inhoud aangegeven op de x-as. Een superpositie van qPCR- en sequentiegegevens voor drie verschillend versterkte bibliotheken is beschikbaar in figuur S3 in aanvullend bestand 1.

Invoerbibliotheek en uitvoervolgordegegevens vergelijken. Getoond wordt de relatieve overvloed aan loci in de bibliotheek zoals bepaald door qPCR (paars) en de relatieve overvloed aan Illumina-sequencing-lezingen die deze loci bestrijken in één rij met Hi-Seq-gegevens (zwart). Beide datasets werden genormaliseerd naar het gemiddelde van de twee loci die het dichtst bij 50% GC lagen.

We hebben enkele uitschieters opgemerkt. Amplicons met ongeveer 70% of 80% GC ontvingen bijvoorbeeld minder sequentiedekking dan hun buren in% GC-ruimte, ondanks een relatief hoge abundantie in de bibliotheek. Nauwkeurig onderzoek van amplicons > 50% GC suggereerde een effect van sequentiecontext. We vonden de% GC van een 250-bp-venster gecentreerd op de amplicons een betere voorspeller van onderdekking dan de% GC van de eigenlijke amplicons (Figuur S4 in aanvullend bestand 1). De systematische daling van de sequentiedekking met toenemende GC-inhoud werd niet veroorzaakt door een evenredige ondervertegenwoordiging van loci met hoge GC in de bibliotheek, wat aangeeft dat er stroomafwaarts van de bibliotheekvoorbereiding een bias is.

Genoombrede sequentiedekking

Onze testloci, die gedeeltelijk waren geselecteerd op basis van hun vermogen om door PCR te worden geamplificeerd, kunnen al dan niet echte vertegenwoordigers zijn van hun respectieve basissamenstellingen in het algemeen. Om sequencing bias genoom-breed te meten, berekenden we de gemiddelde verhouding van waargenomen tot verwachte (onbevooroordeelde) dekking voor schuifvensters van 50 bp. Het superponeren van genoombrede en loci-specifieke biasgegevens, elk genormaliseerd ten opzichte van de midden-GC (48 tot 52%) fractie, toonde aan dat de geselecteerde loci over het algemeen goede proxy's waren voor hun respectieve %GC-categorieën - ondanks de verschillende amplificatiegedrag van individuele loci (Figuur S5 in aanvullend bestand 1).

De standaard Phusion HF PCR (korte denaturatie en snelle helling) deplete sequenties > 70% GC tot minder dan een honderdste van de mid-GC referentievensters (Figuur 5, rode vierkantjes). Door betaïne toe te voegen en de denaturatiestap te verlengen, werd de hoge-GC-fractie efficiënt en grondig gered (Figuur 5, zwarte driehoeken): 50-bp-vensters met tot 94% GC ontvingen nog steeds meer dan de helft van de gemiddelde dekking van die met ongeveer 50% GC, wat aantoont dat stukken van 50 basen die bijna volledig uit Gs en Cs bestaan, kunnen worden gesequenced, op voorwaarde dat ze in de bibliotheek aanwezig zijn. Deze winst van high-GC-sequenties ging echter ten koste van high-AT-sequenties, die een aanzienlijk verlies leden in vergelijking met de standaard Phusion HF-bibliotheek.

'PER' genoom-brede bias-curves voor basissamenstelling. (a,b) Getoond wordt de GC-bias in Illumina-lezingen van een 400-bp fragmentbibliotheek versterkt met behulp van het standaard PCR-protocol (Phusion HF, korte denaturatie) op een snel oplopende thermocycler (rode vierkanten), Phusion HF met lange denaturatie en 2M betaïne (zwarte driehoekjes ), AccuPrime Taq HiFi met lange denaturatie en primerverlenging bij 65°C (blauwe ruiten) of 60°C (paarse ruiten). Om de waargenomen tot verwachte (onbevooroordeelde) leesdekking te berekenen, werd het aantal leesbewerkingen dat overeenkomt met 50-bp-vensters bij een gegeven %GC gedeeld door het aantal 50-bp-vensters dat in deze %GC-categorie valt. Deze waarde werd vervolgens genormaliseerd ten opzichte van de gemiddelde waarde van 48% tot 52% GC en uitgezet op een log10 schaal (a) of lineaire schaal (b).

In overeenstemming met de qPCR-gegevens waren bibliotheken versterkt met AccuPrime Taq HiFi minder scheef dan bibliotheken die waren versterkt met Phusion. Het verlengen van de gegloeide primer met AccuPrime Taq HiFi bij 65°C (Figuur 5, blauwe ruiten) presteerde beter dan beide Phusion-reacties aan het lage-GC-uiteinde, terwijl de hoge-GC-fractie bijna net zo goed behouden bleef als Phusion met betaïne (Figuur 5, zwarte driehoekjes) . Het verlagen van de verlengingstemperatuur tot 60 ° C (Figuur 5, paarse diamanten) leverde nog meer lage-GC-sequenties op, terwijl de opbrengst van GC-rijke uitlezingen enigszins werd verminderd. Verlenging bij 60°C produceerde een versterkte bibliotheek waarin alle bins met vensters van 50 bp tussen 2% en 96% GC ten minste een tiende van de gemiddelde dekking van de mid-GC-referentie ontvingen.

Geen enkel PCR-protocol was ideaal. Het beste protocol voor hoge GC, Phusion HF met betaïne, leidde tot een slechte weergave van hoge AT-loci. Het protocol dat het beste werkte voor hoge AT, AccuPrime Taq HiFi met primerverlenging bij 60°C, bracht de hoge GC-fractie in gevaar. Een pool van twee verschillend versterkte bibliotheken zou complexer zijn dan een van beide bibliotheken alleen, maar zou ook kosten verhogen door de hoeveelheid benodigde bibliotheekconstructie te verdubbelen. Het zou nog steeds bevooroordeeld zijn en, wanneer de sequentie wordt bepaald, een tussenliggend GC-bias-profiel produceren dat vergelijkbaar is met het profiel dat wordt weergegeven in figuur S6 in aanvullend bestand 1 dat is gegenereerd door het bundelen van sequencing-uitlezingen.

We hebben ook de fractie van het genoom berekend die minder dan een tiende van de gemiddelde genoombrede dekking ontving (tabel 1). Volgens deze maatstaf was AccuPrime Taq HiFi PCR met primerverlenging bij 60°C duidelijk de beste amplificatieconditie voor de AT-rijke P. falciparum genoom, en in het algemeen voor het samengestelde 'PER'-genoom, waarvan 71% bestaat uit P. falciparum DNA. This method was slightly worse than the 65°C extension protocol for the GC-rich R. sphaeroides genome, for which long-denaturation PCR with Phusion in the presence of betaine came out on top. De E coli genome was very evenly covered by three conditions. Only the standard PCR protocol with Phusion HF and short denaturation, when performed with an overly fast temperature ramp, left more than 0.5% of the E coli genome under-covered.

Rescuing GC-rich loci in the human genome

To test if our optimized conditions improve the representation of biologically relevant loci in the human genome, we developed qPCR assays for eight GC-rich loci near gene promoters and four size-matched control loci. All eight test loci had been under-represented in previous sequencing runs with standard PCR-amplified libraries. We amplified a fragment library of human DNA on the fast-ramping thermocycler 1 using the standard Phusion and the AccuPrime Taq HiFi (extension at 65°C) protocols. The first protein-coding exon of the tumor suppressor gene RB1 was below the detection limit in the standard library (Figure 6a) and near unity (109% of the average of the four control loci) in the improved library (Figure 6b). The mean relative abundance of all eight test loci rose from 3% (range 0 to 11%) to 116% (range 60 to 153%).

Optimized PCR conditions rescue GC-rich promoter regions in the human genome. (a,b) A 180-bp fragment library of human DNA was amplified using (a) standard conditions (Phusion HF, short denaturation) or (b) optimized conditions (AccuPrime HiFi, long denaturation, extension at 65°C) on the fast-ramping thermocycler 1. The amplified libraries were analyzed by qPCR. Orange bars indicate the quantity of eight GC-rich loci near gene promoters relative to the mean quantity of four size-matched control loci (blue bars mean set to 100% in each graph). Error bars represent the range of two measurements averaged to calculate the quantity of each locus. Locus 7 is the first protein-coding exon of the tumor suppressor gene RB1.

Comparison of PCR-amplified and PCR-free Illumina libraries

Kozarewa et al. [21] developed a protocol for Illumina sequencing without PCR to amplify and enrich adapter-ligated DNA fragments. We sequenced a PCR-amplified and a PCR-free human 180-bp fragment library side-by-side on an Illumina Hi-Seq flowcell and calculated the mean coverage (relative to the mean genome-wide coverage) of a larger set of GC-rich loci (Table S3 in Additional file 2). The 100 test loci were 200 bp in length, located on or near annotated transcription start sites, had a mean GC content of 80% (standard deviation 5%) and were known to be poorly covered in previous whole-genome sequencing runs. By this measure, the PCR-amplified library (AccuPrime Taq HiFi with extension at 65°C) and the PCR-free library performed equally: the mean coverage of the test loci was 28% in both data sets, a 3.6-fold under-representation.

By sequencing the PCR-amplified library, 50-bp windows from 12% to 92% received at least half the mean coverage of those with 50% GC (Figure 7a,b). Only about 0.2% of 50-bp windows in the human reference genome - and less than 0.02% of 50-bp windows that overlap with the human exome - fall outside this range. With the PCR-free library, the mean relative coverage of GC-rich loci stayed near or above unity all the way to 100% GC. The PCR-free library was also slightly better for AT-rich loci, with up to 1.4-fold better coverage of 50-bp stretches containing only one G or C. From 8% to 88% GC, the fold increase by sequencing an unamplified fragment was less than 1.25 (Figure 7c). More than 99.9% of all 50-bp windows in the human genome fall in this category.

Sequencing bias with PCR-amplified and PCR-free libraries. (a,b) Shown is the mean normalized coverage of 50-bp windows in the human genome having the GC-content indicated on the x-axis for a PCR-free (orange dots) and a PCR-amplified (blue diamonds) Illumina sequencing library. Both fragment libraries had approximately 180-bp inserts. The PCR amplification was performed with AccuPrime Taq HiFi (long denat., primer extension at 65°C). The coverage was plotted on a log10 (a) and a linear scale (b). The data points at extremely high GC, where the reads from the PCR-free library had a mean base quality of less than Q20 (open symbols), were omitted in the middle panel (b). (C) The ratios of the two curves in (a,b), that is, the fold-increase in mean coverage by sequencing a PCR-free library instead of a PCR-amplified library. The shaded histogram is the %GC distribution of 50-bp windows in the human genome. More than 99.9% of all 50-bp windows in the genome contain 8% to 88% GC and received a less than 1.25-fold increase in coverage. Less than 0.01% of all 50-bp windows contain 90% or more GC. The open circles at 96% and 98% GC denote data for which the mean base quality of the reads from the PCR-free library was below Q20.

We note that skipping the PCR step during library preparation does not necessarily yield unbiased Illumina sequencing reads, presumably due to bias introduced further downstream in the sequencing process.


Biologics Medicine

6.11.11.3 Oligonucleotide Chromatography Equipment

Unlike ON synthesis that requires highly specialized equipment, which may not be readily available especially at large scales, chromatography systems are more accessible since these systems have wider applications ranging from biopharmaceuticals to small molecules. The key to efficient therapeutic-grade ON purifications therefore lies mostly on the stationary phase, eluent, and conditions used. Equally important is the purification column and column packing strategy employed. Nonetheless, for purification equipment designed for ONs, GE is among the industry leaders with the ÄKTA purification platforms, which complement their synthesizers. Just like in synthesis, GE provides skids from the research-scale (ÄKTA purifier/pure) to large-volume manufacturing (BioProcess/ÄKTAprocess). The ÄKTApurifier and BioProcess have been discontinued and replaced with AKTApure and ÄKTAprocess, respectively. The ÄKTAprocess can deliver flow rates up to 2000 L/h, whereas the UNICORN software makes processes developed on GE’s purification platforms easy to scale up and transfer the systems suffer from their both pressure and low temperature ratings and are not amenable for processes, which require high pressure and sufficient denaturing temperature conditions. Similarly to the equipment, GE’s purification columns are generally designed for low-pressure applications at temperatures below 40°C.

For high pressure and temperature purification equipment, ASAHI KASEI, LEWA, and Novasep are among the major players. For purification columns, Load & Lock stainless columns (Agilent and Agar Machining) have high-pressure dynamic axial compression (DAC) packing, which provides improved bed stability and higher loading. They can also be jacketed for use at higher temperatures.


Methoden:

Yeast strain, growth conditions and extraction of total RNA

Total yeast RNA was isolated by a modification of the procedure described previously [11]. Strain W303-1A (Mata, ade2-1, trp1-1, leu2,3-112, his3-11,15, ura3, can1-100) was grown in YPD-supplemented medium (1% yeast extract, 2% bacto peptone, 2% glucose and 0,01% of adenine, uracil, tryptophan, leucine and histidine) in a rotatory shaker (160 rpm and 28°C). Cell growth was monitored by reading OD at 570 nm. Cells (10 mg of dry weight) were harvested by centrifugation and washed with DEPC (diethylpyrocarbonate) treated water at 2200 × g for 5 min before they were resuspended in 0.6 ml RNA extraction buffer (10 mM EDTA (ethylenediaminetetracetic acid), 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1M NaCl, 5% SDS) and 0.6 ml of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (50:50:1) mixture. After 6 min at room temperature, 2 g of glass beads (0.45 mm diameter) were added and the cells were broken by vigorous agitation for 2 min on a vortex mix set at maximum speed. The extract was transferred to a microfuge tube (1.5 ml) and cell debris and organic phase were separated from upper aqueous phase by centrifugation at 2200 × g for 5 min (24°C). The upper phase was collected, extracted twice with 1 volume of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (50:50:1) and once with 1 volume of chloroform: isoamyl alcohol (24:1). The RNA was precipitated from the last upper aqueous phase by the addition of 0.1 volume of 3M NaOAc, pH 5.2, plus 3 volumes of ice-cold absolute ethanol followed by incubation at -20°C for 1 h. The RNA was pelleted by centrifugation at 15000 × g for 15 min (4°C), washed once with ice-cold 70% ethanol and again pelleted at 15000 × g for 15 min. After the remaining alcohol was allowed to evaporate, the pellet was resuspended in 30 μl of DEPC treated water. Concentration of RNA in the sample was measured by reading OD at 260 nm in a Beckman DU-6 spectrophotometer (1 OD = 42 μg RNA/ml). All materials and solutions were previously treated with DEPC [12].

Removal of contaminating genomic DNA from unfractionated RNA

RNA samples were treated with RNase-free bovine pancreatic DNase I (E.C. 3.1.21.1) to eliminate DNA contamination using two different protocols. Protocol I was a modification of the procedure previously described for C. Botulinum [13]. Six micrograms of RNA, 6.25 mM MgCl2 and 10U of RNase-free DNase I (Sigma) in a 10 μl reaction mixture in water were incubated at 37°C for 30 min. The reaction was stopped by the addition of 2 mM EDTA, pH 8.0, followed by incubation at 37°C for 1 min before inactivation at 65°C for 10 min. RNA was extracted with 1 volume of phenol: chloroform (5:1) and after centrifugation at 2200 × g for 5 min, the RNA present in the upper aqueous phase was precipitated with ice-cold absolute ethanol and collected by centrifugation at 15000 × g for 15 min (4°C). The remaining alcohol was allowed to evaporate and the pellet was resuspended in 30 μl of DEPC treated water. Protocol II was performed using the DNase I amplification grade kit (Life Technologies, Inc.) following the recommended procedure. In brief, 1 μg of RNA was resuspended in 20 mM Tris-HCl pH 8.4 2.0 mM MgCl2 50 mM KCl and 1U of DNase I into a final volume of 10 μl. After incubation for 15 min at room temperature, DNase was inactivated by the addition of 2,2 mM EDTA, pH 8.0, and subsequent incubation at 65°C for 10 min. The product of this reaction was used directly for RT-PCR without further treatment.

RT-PCR assay

mRNAs were amplified by using the kit Ready-to-Go RT-PCR Beads (Amershan Pharmacia Biotech Inc.) in a GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Inc.). Each reaction contained

2.0U of TaqDNA polimerase, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 60 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM of each dNTP, MMuLV reverse transcriptase, RNA guard ribonuclease inhibitor, stabilizer including RNase/DNase free BSA, 1 μg of total RNA and 20 pmol of the appropriate primers (Del Aguila et al, 2003 Souza, 2001) (Table 1) into a final volume of 50 μl. Synthesis of cDNA was performed at 50°C for 20 min and stopped by inactivation of reverse transcriptase at 95°C for 10 min. Amplification of cDNA by PCR was performed for 30 sec at 95°C 30 sec at 65°C and 1 min at 72° C for 30 cycles, chosen after testing amplification from 20 to 40 cycles. RT minus controls was incubated at 95°C for 10 min to inactivate M-MuLV (Moloney murine leukemia virus) reverse transcriptase before cDNA synthesis and PCR steps. RT-PCR products were run on 1.3% agarose gel in 1x TAE (40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA) buffer, pH.8.0, and stained with aqueous ethidium bromide at a concentration of 0.5 μg/mL [12]. Data represent a typical result obtained from three different experiments.


Methoden:

Plasmid construction

The nCas9, APOBEC1, UGI, ecTadA, and ecTadA7.10 portions of PBEcs and PABEcs were amplified from PBE or PABE-7 [19, 25]. The Cas9 variant nCas9-NG (D10A) containing the R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R substitutions was amplified from STEME-NG [41]. Binding proteins, including MCP, PCP, N22p, and Com, were synthesized commercially (GenScript, Nanjing, China). The different components of PBEcs, PABEcs, and SWISSv2/v3 were assembled into the pJIT163 backbone by One Step Cloning (ClonExpress II One Step Cloning Kit, Vazyme, Nanjing, China). The sgRNA constructs pOsU3-sgRNA and pOsU3-esgRNA have been previously described [25] the TaU6 promoter was amplified from pTaU6-sgRNA [25]. All the scRNAs listed in Additional file 2: Sequences S2 were synthesized commercially and used to replace the sgRNA in pOsU3-esgRNA by One Step Cloning. Annealed oligos were inserted into BsaI (New England BioLabs)-digested OsU3-derived vectors. To construct the pH-SWISSv2/v3 binary vector, this cassette was cloned into the pHUE411 backbone under the Ubi-1 promoter of maize [47]. PCR was performed using TransStart FastPfu DNA Polymerase (TransGen Biotech, Beijing, China). All primer sets used in this work were listed in Additional file 1: Table S5 and were synthesized by Beijing Genomics Institute (BGI).

Installing multiple sgRNAs

The templates for assembling multiple sgRNAs listed in Additional file 2: Sequences S4 were synthesized commercially. For dual sgRNAs, the PCR products were amplified from esgRNA-pTaU6 or esgRNA-2×boxB-pTaU6 and installed into pOsU3-esgRNA or pOsU3-esgRNA-2×MS2 by Golden Gate cloning [37]. For triple or quadruple sgRNAs, the PCR products were amplified from single- or dual-sgRNA vectors and assembled by Multi One Step Cloning (ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit, Vazyme, Nanjing, China).

Protoplast transfection

We used the Japonica rice variety Nipponbare to prepare protoplasts. Protoplast isolation and transformation were performed as described [48]. Ten micrograms of each of nuclease and sgRNA plasmid DNA was introduced into the protoplasts by PEG-mediated transfection, with a mean transformation efficiency of 30–45% as measured by flow cytometry (FCM) or hemocytometer. The transfected protoplasts were incubated at 23 °C. The protoplasts were collected after 60 h incubation, and the genomic DNA were extracted for amplicon deep sequencing.

Agrobacterium-mediated transformation of rice callus cells

The binary vector was transformed into A. tumefaciens AGL1 by electroporation and used to transform about 120 rice calli. Agrobacterium-mediated transformation of callus cells of the Japonica rice variety Zhonghua11 was conducted as reported [48]. Hygromycin (50 μg/ml) was used to select transgenic plants.

DNA-extractie

Genomic DNA of protoplasts was extracted with a DNA-Quick Plant System (Tiangen Biotech, Beijing, China). Genomic DNA of regenerated rice seedlings was extracted with CTAB. Targeted sites were amplified with specific primers, and the amplicons were purified with an EasyPure PCR Purification Kit (TransGen Biotech, Beijing, China) and quantified with a NanoDrop™ 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Amplicon deep sequencing and data analysis

Genomic DNA extracted from the desired protoplast samples at 60 h post-transfection served as template. Two rounds of PCR were performed for the amplicons of protoplasts. In the first round, the target region was amplified using site-specific primers (Additional file 1: Table S5). In the second, both forward and reverse barcodes were added to the ends of the PCR products for library construction (Additional file 1: Table S5). Equal amounts of the PCR products were pooled and purified by Gel DNA Extraction, and samples were sequenced commercially (Novogene, Tianjin, China) using the Illumina NextSeq 500 platform. The protospacer sequences in the reads were examined to identify base substitutions or indels. Amplicon sequencing was performed three times for each target site, using genomic DNA extracted from three independent protoplast samples. Amplicon reads with a quality score < 30 were filtered out. Analyses of base-editing processivity were performed as previously described [49].

Mutant identification by T7EI and Sanger sequencing

Site-specific primers were used to amplify genomic DNA from regenerated rice seedlings. T7EI enzyme (Vazyme, Nanjing, China) was used to identify rice mutants with C-to-T conversions, A to G conversions, or indels in target regions, with an optimized protocol: 200 ng sample PCR products, 200 ng wild-type PCR products, and reaction buffer added to 8.0 μL 98 °C denaturation for 10 min, 95 °C denaturation for 5 min, and temperature lowered from 90 to 10 °C in next 10 steps followed by denaturation for 1 min 0.2 μL T7EI (10 U/μL) added with water to 10.0 μL and incubate at 37 °C for 20 min and assay immediately. Sanger sequencing was performed to confirm genotypes. The genotypes of indels were analyzed with the online tools DSDecodeM [50] and TIDE [51].

Off-target analysis

Potential off-target sites were predicted using the online tool Cas-OFFinder [52]. Sites containing up to 3-nt mismatches were examined. The whole-genome sequencing assay and genome-wide Cas9-independent off-target analysis were conducted as reported [32].

Statistische analyse

GraphPad Prism version 7.0 was used for all data analysis. All numerical values are presented as means ± s.e.m. Statistical comparison adjustments were performed using two-tailed Mann-Whitney U toets.


Resultaten

Quality indicators in DNA samples isolated from human 118 frozen tissues in OCT, 68 FFPE tissues, 119 frozen blood samples, and 26 saliva samples were analyzed.

The 260/280 purity ratio was obtained for each DNA sample, with the average value between 1.8 and 2.0 for all the groups (Table 1). For DNA extracted from FFPE tissue samples, only a single sample with a ratio out of range was found, as it is represented by the percentage of samples for each group with a purity ratio between 1.6 and 2.0. The 260/230 purity ratio was also determined for each DNA sample and represented versus its corresponding DNA concentration value (Fig. 1). The 260/230 ratio for high-concentration DNA was ∼2.0 for all groups (frozen tissue in OCT [Fig. 1A], FFPE tissue [Fig. 1B], frozen blood [Fig. 1C], and saliva [Fig. 1D]), whereas low-concentration DNA presented a higher 260/230 ratio for frozen tissue and blood samples.

Afb. 1. DNA purity 260/230 ratio. Absorbance at 260 and 230 nm was measured for each DNA sample isolated from frozen tissue in OCT (EEN), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (NS), and 260/230 ratio obtained was represented versus its corresponding DNA concentration based on spectrophotometric measurement. The trendline for each group of samples is shown. FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded OCT, optimal cutting temperature.

Table 1. DNA Purity 260/280 Ratio

Absorbance at 260 and 280 nm was measured for each DNA sample isolated from frozen tissue in OCT, FFPE tissue, frozen blood, and saliva, and the purity of the DNA was calculated using 260/280 ratio. The average 260/280 ratio and standard deviation for each type of source of DNA are shown. Since an optimum value for 260/280 ratio for pure DNA is 1.8, the percentage of samples for each group with a purity ratio between 1.6 and 2.0 was determined (in parentheses). Only for FFPE tissue, we found a single DNA sample with a 260/280 ratio out of range (2.1).

FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded OCT, optimal cutting temperature.

Next, we observed the integrity for DNA samples from frozen tissue in OCT, FFPE tissue, frozen blood, and saliva by electrophoresis on an agarose gel (Fig. 2), and we estimated the ratio between the HMW band higher than 20 kb and the smear using densitometry analysis (Table 2). The percentage of DNA samples with presence of the HMW band was also determined. DNA integrity for all the groups of samples was high as the percentage near 100% indicated, except for DNA samples isolated from FFPE tissue, which were observed as a smeared band and the HMW band was not observed. Densitometric measurements supported the integrity results as the HMW band/smear ratio was considerably higher than 1.0 for frozen tissue and blood samples and lower than 1.0 for FFPE tissues. The ratio for saliva samples was 1.31 because of the lower intensity of the HMW band.

Afb. 2. DNA integrity observation by electrophoresis in agarose gel. DNA samples were analyzed by loading 50 ng of DNA on a 0.8% agarose gel. The Lambda-pUC Mix Marker 4 (MW) was also separated as size reference. Four representative samples of DNA for frozen tissue in OCT (EEN), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (NS) are shown.

Table 2. DNA Integrity Analysis by Agarose Gel Electrophoresis

The extracted DNA samples from frozen tissue in OCT, FFPE tissue, frozen blood, and saliva were evaluated by loading 50 ng of DNA on a 0.8% agarose gel electrophoresis. Densitometry analysis was performed to gauge the ratio between the HMW band higher than 20 kb and the smear. The average ratio and standard deviation for each type of source of DNA are shown. The percentage of samples for each group with presence of a HMW band was also determined (in parentheses).

HMW, high molecular weight.

When DNA integrity was estimated using the ratio between both absolute yields by PicoGreen and by spectrophotometry, results corroborated the higher integrity for DNA samples from frozen tissue, blood, and saliva with trend values of 1.0, and the lower integrity for DNA from FFPE tissue. However, the ratio for blood was lower than that we expected from agarose gel results (Fig. 3).

Afb. 3. PicoGreen ® /A260 yield ratio. PicoGreen DNA quantification and DNA quantification using Lambert–Beer law from 260 nm absorbance were performed for each DNA sample isolated from frozen tissue in OCT (EEN), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (NS). Absolute yields in micrograms of DNA obtained for both methods were calculated. The average ratio and standard deviation of the ratio between absolute yield using PicoGreen and spectrophotometry for each type of source are represented.

To determine the usability of DNA samples for downstream applications, a real-time PCR assay for the GAPDH en RPLP0 genes was performed. Although all DNA samples amplified for both genes, the Ct value for FFPE tissue was significantly higher (almost five cycles) (Fig. 4), supporting the higher fragmentation of DNA.

Afb. 4. DNA performance for real-time PCR assay. Fifteen randomized DNA samples isolated from frozen tissue in OCT (EEN), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (NS) were amplified by real-time PCR for the GAPDH (links) en RPLP0 (Rechtsaf) genen. The average Ct value and standard deviation for each type of source were calculated. PCR, polymerase chain reaction.

In fact, when different sized PCR products were amplified (5049, 1137, and 400 bp corresponding to ACVR2B, ZFX, AF4 genes, respectively), DNA from FFPE tissue failed to amplify the 400 bp product (Fig. 5). Only frozen tissue in OCT and blood were able to amplify all the products.

Afb. 5. DNA quality for PCR analysis. Fifteen randomized DNA samples isolated from frozen tissue in OCT (EEN), FFPE tissue (B), frozen blood (C), and saliva (NS) were amplified by PCR for the ACVR2B, ZFX, AF4, en GAPDH genen. PCR products of 5049, 1137, 400, and 87 bp, respectively, were analyzed by agarose gel electrophoresis. Four representative samples for each group are shown.


Affibody-mediated hot-start PCR enzyme with improved speed, yields, and amplicons length

Thermo Scientific Phire Hot Start II DNA Polymerase is fused with a dsDNA-binding domain that allows short extension times (10–15 sec/kb) and helps improve yields compared to a standard hot-start Taq DNA polymerase. In addition, its hot-start technology with Affibody molecules allows complete activation of the enzyme in “zero-time” at standard cycling temperatures. This combination of features, along with 2x fidelity of Taq DNA polymerase, makes Phire Hot Start II DNA Polymerase an ideal solution for routine and high-throughput PCR applications.

Functies:

  • Fast enzyme with quick hot start (no separate activation step required)
  • Minimal reaction optimization due to high inhibitor tolerance and amplicons length than with traditional hot-start Taq DNA-polymerase
  • Direct gel loading of PCR products, with green reaction buffer formats

Complete PCR cycling in less than half the time

Phire Hot Start II DNA Polymerase provides extension time of 10 sec/kb, requires no separate activation step, and allows direct loading of PCR products onto gels. Due to these features, PCR protocols with Phire Hot Start II DNA Polymerase is significantly faster than protocols with Taq DNA polymerases.

Short cycling times with Phire Hot Start II DNA Polymerase. A 600 bp fragment from human genomic DNA was amplified with five different hot-start DNA polymerases. With Phire Hot Start II DNA Polymerase, the PCR protocol was completed up to four times faster than with Taq DNA polymerases utilizing chemical or antibody-based hot-start technologies (suppliers A-D). Green buffer further reduces experimental time by allowing fewer pipetting steps and direct gel loading.


Scientists discover a way to sequence DNA of rare animals

Rare and extinct animals are preserved in jars of alcohol in natural history museum collections around the world, which provide a wealth of information on the changing biodiversity of the planet. These preserved specimens of snakes, lizards, frogs, fish and other animals can last up to 500 years when processed in a chemical called formalin. While formalin helps preserve the specimen making it rigid and durable, it poses a challenge to extracting and sequencing DNA. Furthermore, DNA degrades and splits into small fragments over time. This fragmented DNA is difficult to amplify into long informative stretches of DNA that can be used to examine evolutionary relationships among species when using older DNA sequencing technology. Therefore, scientists have not been able to effectively sequence DNA from these specimens until now.

LSU Museum of Natural Science Curator and Professor Christopher Austin and his collaborator Rutgers-Newark Assistant Professor Sara Ruane developed a protocol and tested a method for DNA sequencing thousands of genes from these intractable snake specimens. Their research was published today in the international scientific journal Molecular Ecology Resources.

"Natural history museums are repositories for extinct species. Unfortunately, naturalists in the 1800s were not collecting specimens for analyses we conduct today such as DNA sequencing. Now with these new methods, we can get the DNA from these very old specimens and sequence extinct species like the Ivory Billed Woodpecker, the Tasmanian Wolf and the Dodo Bird," Austin said.

He and Ruane found and tested an approach that includes taking a small piece of liver tissue from the snake specimen, heating it up over a longer period of time and applying an enzyme that digests the tissue sample and enables the DNA to be extracted. Their minimally invasive protocol preserves the specimen so additional information can be collected from the specimen in the future. It also includes applying the latest technology to chemically sequence the specimens' DNA.

"A genome is a complex jigsaw puzzle broken up in to hundreds of millions of small pieces. We can sequence those pieces and computationally put them back together," Austin said.

They extracted and sequenced the DNA of 13 historic or rare snake specimens from all over the world many of which had never been analyzed using modern genetic methods. Some of the specimens were more than 100 years old. They also integrated these data with modern samples to create a genetic family tree, or phylogeny, that maps the evolutionary relationships of various snake species. This work resulted in thousands of genetic markers for snake specimens collected as far back as the early 1900s.

"The exciting thing about this work is that it makes species that have been essentially lost to science, due to extirpation, rarity or general secretiveness, which applies to many animals and not just snakes, available for scientific research in the modern age of genomics," Ruane said.

"We also believe this research will benefit scientists working with rare animals that are either hard to collect or extinct but are represented in fluid-preserved historical collections. It also underscores the continued importance of museum collections in modern science," Austin said.


Bekijk de video: Aptamer Binding Affinity Project Overview Video (December 2021).