Informatie

Hoe vaak komt bacteriële gemedieerde transformatie voor? Bij planten? In dierlijke cellen?


De meest gebruikelijke methode om planten te transformeren is door plantenweefsel te weken in culturen van agrobacteriën (dit is niet hun huidige classificatie) die DNA in de planten overbrengen.

Wordt lateraal genoverdrachtsvermogen zoals dit veel in de natuur gevonden? Is agrobacterium tumificans hier bijzonder goed in of wordt het alleen gebruikt in de plantengenetica omdat deze soort goed is bestudeerd?

Wordt zo'n methode überhaupt gebruikt voor dierlijke cellen?


Een vroeg rapport van conjugatieve overdracht in zoogdiercellen (CHO-cellen) is:

Waters, VL (2001) Conjugatie tussen bacteriële en zoogdiercellen, Nat. Genet. 29: 375-376.

Dit werk gebruikte het brede gastheerbereik-plasmide RK2 om shuttle-vectoren te mobiliseren die selecteerbare markers dragen. Om transfectie uit te sluiten werd DNAse I toegevoegd (en bij controles werd aangetoond dat dit transfectie blokkeerde door een grote hoeveelheid vector-DNA). In ieder geval is het feit dat de overdracht van de vector de aanwezigheid van het mobiliserende plasmide vereiste, een behoorlijk sterk bewijs voor een conjugatief mechanisme.

Er is ook recenter bewijs voor overdracht naar menselijke cellen via Type IV-secretiesystemen: hier is een recent voorbeeld:

Fernandez-Gonzalez et al. (2011), Overdracht van R388-derivaten door een Pathogenese-geassocieerd Type IV-secretiesysteem in zowel bacteriën als menselijke cellen. J Bacteriol 193: 6257-6265

En hier is een recente recensie van het onderwerp:

Llosa et al. (2012) Nieuwe perspectieven op bacteriële DNA-overdracht naar menselijke cellen Trends in Microbiology 20: 355-359.


In dierlijke cellen wordt het proces genoemd transfectie, om te onderscheiden van transformatie dat is het proces waardoor cellen vereeuwigd worden (kankerachtig). Ik ben vooral bekend met zoogdiercellen, en in deze systemen is enige reactie nodig om de een of andere soort poriën in het celmembraan te openen zodat het genetische materiaal kan binnendringen. Virussen kunnen zelf de cel binnendringen, maar ik ken geen enkele methode die gebruik maakt van levende bacteriën (hoewel dit niet betekent dat er geen gespecialiseerde methode bestaat).


Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie van een hevein-achtig gen in asperges leidt tot resistentie tegen stengelverwelking

Aansluitingen Instituut voor Tropische Landbouw en Bosbouw, Hainan Universiteit, Haikou, China, Instituut voor Tropische Biowetenschappen en Biotechnologie/Hainan Academie voor Tropische Landbouwkundige Hulpbronnen, Chinese Academie voor Tropische Landbouwwetenschappen/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture , Haikou, China

Gelijkelijk bijgedragen aan dit werk met: Helong Chen, Anping Guo, Zhiwei Lu, Shibei Tan, Jian Wang

Rollen Conceptualisering, Supervisie

Aansluitingen Instituut voor Tropische Landbouw en Bosbouw, Hainan Universiteit, Haikou, China, Instituut voor Tropische Biowetenschappen en Biotechnologie/Hainan Academie voor Tropische Landbouwkundige Hulpbronnen, Chinese Academie voor Tropische Landbouwwetenschappen/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture , Haikou, China

Gelijkelijk bijgedragen aan dit werk met: Helong Chen, Anping Guo, Zhiwei Lu, Shibei Tan, Jian Wang

Rollen Gegevensbeheer, Formele analyse

Affiliation South Subtropical Crops Institute, Chinese Academie voor Tropische Landbouwwetenschappen / Zhanjiang City Key Laboratory for Tropical Crops Genetic Improvement, Zhanjiang, Guangdong, China

Gelijkelijk bijgedragen aan dit werk met: Helong Chen, Anping Guo, Zhiwei Lu, Shibei Tan, Jian Wang

Rollenonderzoek, bronnen

Affiliation Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academie voor Tropische Landbouwwetenschappen, Haikou, Hainan, China

Gelijkelijk bijgedragen aan dit werk met: Helong Chen, Anping Guo, Zhiwei Lu, Shibei Tan, Jian Wang

Rollen Formele analyse, Middelen

Affiliation Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, China

Affiliation Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology/Hainan Academy of Tropical Agricultural Resource, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences /Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Haikou, China

Affiliation Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology/Hainan Academy of Tropical Agricultural Resources, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences /Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Haikou, China

Affiliation Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academie voor Tropische Landbouwwetenschappen, Haikou, Hainan, China

Affiliation Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academie voor Tropische Landbouwwetenschappen, Haikou, Hainan, China

Affiliation Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academie voor Tropische Landbouwwetenschappen, Haikou, Hainan, China

Rollen Conceptualisering, Financiering acquisitie, Middelen, Schrijven - review & redactie

Affiliation Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academie voor Tropische Landbouwwetenschappen, Haikou, Hainan, China


Planttransformatie met behulp van: Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens is een wijdverbreide natuurlijk voorkomende bodembacterie die kroongal veroorzaakt en het vermogen heeft om nieuw genetisch materiaal in de plantencel te introduceren (Gelvin, 2003). Het genetisch materiaal dat wordt ingebracht heet T-DNA (transferred DNA) dat zich op een Ti-plasmide bevindt. Een Ti-plasmide is een cirkelvormig stuk DNA dat in bijna alle bacteriën wordt aangetroffen.

Dit natuurlijke vermogen om de genetische samenstelling van de plant te veranderen, was de basis van planttransformatie met behulp van Agrobacterium. Momenteel, Agrobacterium-gemedieerde transformatie is de meest gebruikte methode voor genetische manipulatie van planten vanwege de relatief hoge efficiëntie. Aanvankelijk werd aangenomen dat dit Agrobacterium infecteert alleen tweezaadlobbige planten, maar later werd vastgesteld dat het ook kan worden gebruikt voor transformatie van eenzaadlobbige planten zoals rijst.

Tijdens transformatie maken verschillende componenten van het Ti-plasmide een effectieve overdracht van de van belang zijnde genen naar de plantencellen mogelijk. Waaronder:

  • T-DNA-grenssequenties, die het DNA-segment (T-DNA) afbakenen dat naar het plantengenoom moet worden overgebracht
  • vir-genen (virulentiegenen), die nodig zijn voor de overdracht van het T-DNA-gebied naar de plant, maar zelf niet worden overgedragen, en
  • gemodificeerd T-DNA-gebied waar de genen die kroongalvorming veroorzaken, worden verwijderd en vervangen door de genen van belang.

Agrobacterium-gemedieerd planttransformatieproces

De Agrobacterium-gemedieerd transformatieproces omvat een aantal stappen: (a) isolatie van de genen van belang uit het bronorganisme (b) ontwikkeling van een functioneel transgeen construct met inbegrip van het gen van belang promotors om expressiecodonmodificatie aan te sturen, indien nodig om succesvol eiwit te verhogen productie- en markergenen om het volgen van de geïntroduceerde genen in de waardplant te vergemakkelijken (c) insertie van het transgen in het Ti-plasmide (d) introductie van het T-DNA-bevattende plasmide in Agrobacterium (e) mengsel van de getransformeerde Agrobacterium met plantencellen om overdracht van T-DNA naar plantenchromosoom mogelijk te maken (f) regeneratie van de getransformeerde cellen in genetisch gemodificeerde (GM) planten en (g) testen op eigenschapprestaties of transgenexpressie op laboratorium-, kas- en veldniveau. Figuur 1 illustreert: Agrobacterium-gemedieerde planttransformatie. .

Figuur 1: Agrobacterium-gemedieerd planttransformatieproces

De algemene voordelen van het gebruik: Agrobacterium-gemedieerde transformatie ten opzichte van andere transformatiemethoden zijn: vermindering van het aantal transgenkopieën en intacte en stabiele integratie van het transgen (nieuw geïntroduceerd gen) in het plantengenoom (Jones et al., 2005).


Het mechanisme verlichten achter hoe planten de zetmeelsynthese reguleren

Een onderzoeksgroep van Kobe University onder leiding van universitair hoofddocent FUKAYAMA Hiroshi van de Graduate School of Agricultural Science heeft rijst gebruikt om het mechanisme te verlichten waarmee planten de hoeveelheid zetmeel die via fotosynthese wordt geproduceerd, reguleren. Deze kennis kan bijdragen aan het verbeteren van de kwaliteit en opbrengst van landbouwgewassen.

Deze onderzoeksresultaten zijn gepubliceerd in het internationale wetenschappelijke tijdschrift Plant, cel en omgeving op 14 mei 2021.

Hoofdpunten

  • Planten zetten koolstofdioxide (CO2) via fotosynthese om in organische stoffen (zoals zetmeel). Als een plant groeit onder omstandigheden met een verhoogde CO .-concentratie2, neemt de hoeveelheid zetmeel die het produceert toe.
  • CRCT (*1) eiwitniveaus nemen toe wanneer CO2 concentraties zijn verhoogd. Men denkt dat dit eiwit de zetmeelsynthese bevordert, maar hoe het dit doet was voorheen onbekend.
  • De onderzoeksgroep onthulde dat 14-3-3-eiwitten (*2) een rol spelen bij CRCT-gemedieerde regulatie van zetmeelsynthese.
  • Ze wezen op de mogelijkheid dat CRCT zich verplaatst naar en geactiveerd wordt in de zetmeel-opslaande parenchymcellen nadat het is gesynthetiseerd in de vaatbundels van het floëem.
  • De onderzoekers onthulden ook dat CRCT zich bindt aan regulatieplaatsen op meerdere zetmeelsynthese-gerelateerde genen en een transcriptioneel activator-eiwit is.
  • Het synthetiseren van zetmeel is een essentieel proces voor planten. De verlichting van het regulerende mechanisme achter dit proces zal nuttig zijn voor het verbeteren van de productiviteit en kwaliteit van gewassen.

Onderzoeksachtergrond

De verhoogde concentratie CO2 in de atmosfeer is de belangrijkste oorzaak van de opwarming van de aarde, een wereldwijd probleem. Er is echter gezegd dat dit gunstig kan zijn voor planten omdat ze CO . omzetten2 via fotosynthese omgezet in zetmeel. Als een gewas wordt geteeld onder omstandigheden met een verhoogde CO .-concentratie2zetmeelsynthese wordt versneld, wat resulteert in krachtige groei en verhoogde opbrengst. CO2- Responsief CCT-eiwit (CRCT) wordt geactiveerd in omstandigheden waarbij CO2 concentratie is hoog, maar de functie bleef onbekend. Deze onderzoeksgroep deed onderzoek naar deze eiwitten met behulp van rijstplanten en ontdekte eerder dat CRCT een belangrijk eiwit is dat de zetmeelsynthese reguleert. In hun laatste bevindingen heeft de groep onthuld hoe CRCT dit proces reguleert, wat tot nu toe niet werd begrepen.

Onderzoeksmethodologie en bevindingen

Voor zetmeelsynthese in planten zijn verschillende eiwitten nodig, waaronder: glucose 6-fosfaat/fosfaat translocator, ADP-glucosepyrofosforylase, zetmeelsynthase en zetmeelvertakkingsenzym. De onderzoekers veronderstelden dat CRCT de expressie reguleert van meerdere genen die overeenkomen met deze zetmeelsynthese-gerelateerde eiwitten. Eiwitten die genexpressie reguleren, worden transcriptiefactoren genoemd. In veel gevallen vormen deze transcriptiefactoren een complex met een ander eiwit. Toen de onderzoekers het volume CRCT in een plant analyseerden, ontdekten ze dat het een complex kan vormen met sommige soorten eiwitten. Om dit verder te onderzoeken, voerden ze een analyse uit met een antilichaam dat specifiek bindt aan CRCT, waaruit bleek dat CRCT bindt aan 14-3-3-eiwitten. Uit een andere analyse, dit keer met behulp van groene fluorescerende eiwitten, belichtte de onderzoeksgroep dat CRCT en 14-3-3-eiwit een complex vormen in de kern. Ze wezen ook op de mogelijkheid dat CRCT zich verplaatst naar en geactiveerd wordt in de zetmeel-opslaande parenchymcellen nadat het is gesynthetiseerd in de vaatbundels van het floëem. Verder onthulden de onderzoekers dat CRCT transcriptie bevordert door te binden aan regio's die de expressie van meerdere zetmeelsynthese-gerelateerde genen reguleren.

Het is bekend dat er een negatieve correlatie bestaat tussen de expressie van 14-3-3 eiwitten en de hoeveelheid zetmeel. Onze resultaten toonden echter aan dat er een positieve correlatie is tussen de hoeveelheid zetmeel en de expressie van CRCT. De onderzoeksgroep gaat er dan ook van uit dat 14-3-3 eiwit en CRCT een inactief complex vormen.

Verdere ontwikkelingen

Zetmeelsynthese is onmisbaar voor planten en CRCT, dat dit proces reguleert, is een belangrijk doelwit voor inspanningen om de kwaliteit en productiviteit van gewassen te verbeteren. Daarnaast is CRCT een gen dat wordt geactiveerd onder omstandigheden waarbij sprake is van een verhoogde concentratie CO2, en deze kennis zal in de toekomst nuttig zijn voor het selecteren van geschikte rijstcultivars voor dergelijke omgevingen. Bovendien zijn in elke tot nu toe onderzochte plant vergelijkbare genen als CRCT gevonden. De onderzoeksgroep onderzoekt momenteel ook de CRCT-functie in aardappel, een stapelzetmeelgewas.

Vanuit wetenschappelijk oogpunt zijn er nog vragen die beantwoord moeten worden. Kijkend naar de huidige onderzoeksresultaten, kan worden aangenomen dat CRCT-eiwitten tussen cellen bewegen, maar het onderliggende mechanisme is niet bekend. Bovendien is het niet duidelijk hoe CRCT zijn eigen expressieniveau verandert als reactie op CO2 concentraties en suikerniveaus. Als het mechanisme achter CRCT-gemedieerde regulatie van zetmeelsynthese volledig kan worden belicht, zal het mogelijk zijn om nog grotere verbeteringen aan landbouwgewassen aan te brengen.

1. CRCT: CRCT staat voor CO2-Responsief CCT-eiwit. Het is een eiwit dat voorkomt in planten en waarvan de accumulatie toeneemt als CO2 hoge concentraties (of mogelijk als reactie op verhoogde suikerconcentraties). Er wordt aangenomen dat het de zetmeelsynthese bevordert.

2. 14-3-3 eiwitten: Een familie van eiwitten die tot expressie komen in de cellen van alle eukaryote organismen (planten, dieren enz.). Het is bekend dat ze onder andere een rol spelen bij signaaloverdracht en metabole regulatie.


Gewastechniek mogelijk gemaakt door het CRISPR/Cas-gestuurde evolutieplatform

Om de kiemoverdracht van GEX1A-resistentie onder SGR-mutanten te beoordelen, voerden Butt en collega's genetische en fenotypische analyse uit in de volgende generatie. Homozygote mutanten waren fenotypisch niet te onderscheiden van de wildtype planten, wat suggereert dat deze SF3B1-varianten volledige splicingactiviteit in rijst vertonen. De resistentie tegen GEX1A is echter dosisafhankelijk en variabel onder SGR-mutanten. De mutant SGR4 vertoonde de sterkste weerstand tegen GEX1A. De zaden van deze mutant kunnen zich goed vestigen op medium met GEX1A zo hoog als 10 μM onder dezelfde omstandigheden die andere SGR-mutanten niet konden ontkiemen. Hoewel SGR4 drie mutaties droeg, is het waarschijnlijk dat de K1050E missense-mutatie grotendeels heeft bijgedragen aan het verzwakken van de SF3B1- en GEX1A-interactie.

Deze studie toonde aan dat het mogelijk is om gerichte evolutie in planten uit te voeren, wat belangrijke implicaties heeft. Planten evolueren om zich aan te passen aan hun groeiomgeving in een typisch langdurig proces. Versnelde evolutie kan een efficiënte weg zijn naar het bereiken van een hoge landbouwproductiviteit en voedselzekerheid in het licht van de opwarming van de aarde en klimaatverandering. Gezien de enorme omvang van de genomen van gewassen, is het in feite onmogelijk om verzadigende mutagenese in vivo te bereiken. Met CRISPR wordt bijna-verzadigingsmutagenese haalbaar, zoals blijkt uit deze studie. Daarom zal een dergelijke gerichte evolutiebenadering zeer krachtig zijn voor het ontwikkelen en ontwikkelen van gunstige eigenschappen in gewassen, zoals herbicideresistentie, verbeterde fotosynthese en verhoogde tolerantie of resistentie tegen abiotische of biotische stress. Genomics-tools zoals genoombrede associatiestudies (GWAS's) hebben geholpen bij het snel in kaart brengen en ontdekken van belangrijke genen en allelen in gewasproductiviteit en stresstolerantie in belangrijke gewassen. Er wordt verwacht dat CRISPR-enabled gerichte evolutie op deze doelwitgenen zou helpen bij het verbeteren van agronomische eigenschappen of het genereren van nieuwe allelen direct in elite-cultivars. Hoewel gerichte evolutie vaak wordt gebruikt voor eiwittechnologie, is het ook mogelijk om het toe te passen op kwantitatieve eigenschappen door middel van targeting cis-regelgevende elementen [7]. Bovendien stellen we ons voor dat vergelijkbare gerichte evolutiebenaderingen ook bij dieren kunnen worden toegepast, zoals wormen, fruitvliegen en zebravissen.


Conclusie

Een snelle en zeer efficiënte productie van transgene Superwortel-afgeleid van L. corniculatus planten door A. rhizogenes-gemedieerde transformatie werd ontwikkeld, waarbij de eenvoud en efficiëntie van de Superwortel regeneratiesysteem en de zeer efficiënte A. rhizogenes gemedieerde transformatie. De transformatiefrequentie kan 92% bereiken op basis van de detectie van GUS-activiteit. Dit systeem is verbeterd door enkele parameters te valideren die de transformatiefrequentie kunnen beïnvloeden. Het snelle en zeer efficiënte transformatie- en regeneratiesysteem van Superwortel-afgeleid van L. corniculatus biedt een krachtig hulpmiddel voor het testen van de genfunctie in L. corniculatus in een korte tijd.


RESULTATEN

Isolatie en klonen van b7-6

We hebben de mutant verkregen b7-6 in een genetisch scherm op R1Y4-achtergrond. R1Y4 is een Col-gl (de kale mutatie in Col-0-achtergrond) transgene lijn die RPW8.1-YFP ectopisch tot expressie brengt van zijn natieve promotor die resistentie verleent tegen valse meeldauw en virulente echte meeldauwpathogenen (Ma et al., 2014). De transgene lijn werd gebruikt in het functionele onderzoek omdat RPW8.1 tandem is gerangschikt met RPW8.2 in Arabidopsis toetreding Ms-0, en Col-0 mist beide RPW8.1 en RPW8.2 (Xiao et al., 2001). Elk waargenomen fenotype dat verschilt van Col-0 in de transgene lijn zou te wijten zijn aan de resultaten van ectopische expressie van het transgen. Om de genetische basis van RPW8.1-gemedieerde breedspectrumresistentie te begrijpen, hebben we zaden van de homozygote R1Y4-lijn gemutageniseerd met behulp van ethylmethaansulfonaat (EMS) en gescreend op mutanten met spontane celdoodfenotypes. In de huidige studie hebben we de isolatie en karakterisering van de mutant toegevoegd b7-6 die spontane HR-achtige celdood (SHL) vertoonde in volwassen bladeren in afwezigheid van een pathogeen (Figuur 1A, B). We brachten de mutatie in kaart op chromosoom 5 tussen twee SSLP-markers T22P22 en T24H18 met behulp van een F2 bevolking afgeleid van b7-6 × Ler (Figuur S1A). Door de genen in deze regio te sequencen in b7-6identificeerden we een enkele G-naar-A-puntmutatie in één ANNEXIN-familielid bij ANN8 (op 5g12380) dat resulteert in een substitutie van Ala op positie 94 naar Thr (figuren 1C, D, S1A). Uitlijning van sequentiehomologen van ANN8 van verschillende organismen toonde aan dat de A94-plaats zeer geconserveerd is (Figuur 1E), wat impliceert dat dit residu van cruciaal belang is voor de functie van AtANN8 en zijn orthologen in verschillende organismen. Om te bepalen of deze mutatie verantwoordelijk is voor het mutante fenotype, hebben we meer dan 20 transgene lijnen verkregen die het wildtype (WT) tot expressie brengen. bij ANN8 gen of de BijANN8-YFP fusiegen, respectievelijk van de natieve promotor in b7-6 en observeerde de verdwijning van de spontane HR-achtige celdood van b7-6 (Figuur 1F), wat aangeeft dat de A94T-mutatie in AtANN8 verantwoordelijk is voor het verbeterde celdoodfenotype dat wordt waargenomen in b7-6. We hebben dus omgedoopt tot b7-6 als R1Y4/ann8-1 en b7-6 transgene lijn die de WT . tot expressie brengt bij ANN8 gen als R1Y4/ann8-1/ANN8.

Isolatie van de RPW8.1 enhancer-mutant b7-6 en identificatie van de causale mutatie

(EEN) Representatieve planten van de aangegeven lijnen die het fenotype van R1Y4 en tonen b7-6. (B) Representatieve bladeren van de aangegeven lijnen die de putjes in R1Y4 (pijlpunten) en spontane hypersensitieve respons (HR)-achtige laesies in b7-6 (pijlen). (C) Schematische genstructuur van bij ANN8 (op 5g12380) en de positie van de causale mutatie in b7-6. P1 en P2 geven de positie aan van primers voor real-time polymerasekettingreactie en reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie. Het rode vak geeft de doellocatie van het kunstmatige microRNA-gen aan dat is ontworpen. (NS) Voorspelde eiwitstructuur van AtANN8 en de aminozuursubstitutieplaats in b7-6. ANX, ANNEXIN domein. (E) Uitlijning van het gebied tussen de eerste twee ANX-domeinen van voorspelde plantaardige en dierlijke ANN8-achtige eiwitsequenties. Identieke resten zijn geel gemarkeerd als rode letters. Ala op positie 94 van AtANN8, die wordt vervangen door Thr (*) in b7-6, wordt onderstreept bij de consensus. (F) Representatieve bladeren van de aangegeven lijnen die genetische complementatie van laten zien b7-6 met AtANN8-YFP tot expressie gebracht vanaf zijn natieve promotor. Volgordegegevens in (E) zijn te vinden in de GenBank/EMBL-databases of Arabidopsis Genome Initiative onder de volgende toetredingsnummers: Oryza sativa Japonica NP_001055408 Theobroma cacao (cacao) EOY32842 Cucumis sativus (komkommer) XP_004139124 Vitis vinifera (wijndruif) XP_002279669 Gossypium hirsutum (hooglandkatoen) ACJ11719 Prunus persica (perzik) EMJ19904 Nicotiana tabacum (gewone tabak) AAX78200 Glycine max (sojabonen) XP_003546292 Aegilops EMT22984 Drosophila melanogaster (fruitvlieg) NP_996253 Mus musculus (huismuis) NP_081487 Homo sapiens (mens) NP_004297 AtANN8 At5g12380 (CAC42899).

Bij ANN8 wordt snel en tijdelijk geïnduceerd door pathogene challenge

De Arabidopsis ANNEXIN eiwitfamilie bevat acht leden (Figuur S1C). AtANN1 werd gerapporteerd en was betrokken bij stressrespons en zou kunnen werken als Ca2+-kanaal (Laohavisit et al., 2012 Richards et al., 2014). Biologische functies voor de andere leden blijven echter onbekend, hoewel transcriptieniveaus van sommige leden veranderingen vertoonden bij een aanval door pathogenen op basis van expressiegegevens met hoge doorvoer (Wang et al., 2005 Truman et al., 2007 Chandran et al., 2010). We hebben dus eerst de uitdrukking van alle gezinsleden onderzocht, behalve: bij ANN6 (die zich niet vermenigvuldigden), in niet-geïnfecteerde stengel-, bloeiwijze (bloem) en bladweefsels, evenals in met echte meeldauw geïnfecteerde bladeren. Terwijl bij ANN1, bij ANN3, bij ANN5 en bij ANN7 werden in lage niveaus tot expressie gebracht in alle onderzochte weefsels, bij ANN4 en bij ANN8 bijzonder weergegeven preferentiële expressie in bladeren (Figuur 2A). Interessanter, uitdrukking van bij ANN2 en bij ANN8 maar niet bij ANN4 werd opgereguleerd in met echte meeldauw geïnfecteerde bladeren, met bij ANN8 zijnde de hoogste expressor (Figuur 2A). Om verder te beoordelen welke ANNEXIN-familieleden reageren op biotische stress, onderzochten we de expressie van: bij ANN1, bij ANN2, bij ANN4, en bij ANN8 als reactie op bladinoculatie van drie verschillende Pseudomonas syringae blz. Tomaat (Pst) stammen (Figuur 2B-E). bij ANN1, bij ANN2, en bij ANN4 waren allemaal min of meer opgereguleerd in zowel mock- als Pst-geïnoculeerde bladeren, wat suggereert dat deze drie genen kunnen reageren op zowel biotische als abiotische stress zoals eerder gemeld (Konopka-Postupolska et al., 2009 Huh et al., 2010), evenals op mechanische verwonding veroorzaakt door bladinfiltratie in deze studie. Daarentegen, bij ANN8 reageerde niet op verwonding, maar vertoonde sterke inductie als reactie op uitdagingen van verschillende P. syringae stammen met verschillende kinetiek. In bladeren ingeënt met de virulente stam Pst DC3000, bij ANN8 werd sterk tot expressie gebracht 24 uur na inoculatie (hpi) en daalde daarna

3-voudig bij 48 hpi (Figuur 2E). Na inoculatie van de avirulente stam Pst AvrRpm1, bij ANN8 werd sterk geïnduceerd bij 3 hpi en zakte vervolgens naar het achtergrondniveau op latere tijdstippen. Echter, in bladeren die zijn geïnoculeerd met de niet-pathogene stam Pst hrcC - , bij ANN8 werd slechts licht opgereguleerd bij 48 hpi (Figuur 2E). Gecombineerd suggereren deze gegevens dat: bij ANN8 kan meer specifiek betrokken zijn bij de reactie op biotische stress dan andere ANNEXIN-familieleden.

Differentiële reacties van BIJLAGE genen voor pathogene infectie

(EENE) Expressie van aangegeven genen in de aangegeven plantenweefsels (EEN) of in bladeren verzameld op de aangegeven tijdstippen na inoculatie van de aangegeven Pseudomonas syringae stammen met H2O als controle (BE). RNA werd geëxtraheerd uit de aangegeven weefsels (EEN) of van bladeren op de aangegeven tijdstippen (BE) voor reverse transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR) analyse. Messenger RNA-niveau was genormaliseerd naar dat in stam (EEN) of naar die in H2O (0 uur na inenting) (BE). Foutbalken geven aan: SD (N = 3). Student's t-test werd uitgevoerd om de significantie van verschillen tussen naïeve bladeren en met meeldauw geïnfecteerde bladeren te bepalen (EEN) of tussen H2O-behandelde bladeren en bladeren die op hetzelfde tijdstip zijn ingeënt met bacteriële pathogenen (BE). Sterretjes * en ** geven significante verschillen aan bij P < 0,05 en P < 0,01, respectievelijk. Let daar op bij ANN8 werd bij voorkeur tot expressie gebracht in bladeren ten opzichte van stengel- en bloemweefsels en opgereguleerd op 10 d na inoculatie van de echte meeldauwpathogeen Golovinomyces cichoracearum UCSC1.

Omdat bij ANN8 expressie reageert bijzonder goed op bacteriële uitdaging, we hebben getest of de A94T-mutatie in bij ANN8 beïnvloedt de afweer tegen bacteriële pathogenen. Hiertoe hebben we een Col-gl-lijn verkregen met ann8-1 bij afwezigheid van de RPW8.1 transgen uit de nakomelingen van de kruising tussen R1Y4/ann8-1 en Col-gl. De Col-gl/ann8-1 lijn (aangeduid als ann8-1 hierna) vertoonden geen fenotype van necrotische laesies (Figuur 3A), wat impliceert dat de necrotische laesies in R1Y4/ann8-1 zijn RPW8.1-afhankelijk. Omdat R1Y4 aanzienlijk minder groei van de virulente bacteriestam ondersteunde Pst DC3000 maar niet de avirulente stammen (Li et al., 2018), we hebben onderzocht of de mutatie in bij ANN8 leidt tot enige verandering in reactie op Pst DC3000. Onze resultaten toonden aan dat ann8-1 ondersteunde bacteriegroei vergelijkbaar met Col-gl, terwijl R1Y4/ann8-1 ondersteund aanzienlijk minder bacteriële groei dan Col-gl, maar vergelijkbaar met R1Y4 (Figuur 3B). Deze gegevens gaven aan dat de A94T-mutatie in AtANN8 mogelijk geen invloed heeft op de afweer van planten tegen virulente bacteriestammen, hoewel: bij ANN8 expressie reageert op bacteriële uitdaging.

tot zwijgen brengen van bij ANN8 leidt tot RPW8.1-afhankelijke necrotische laesies

(EEN) Vertegenwoordiger vertrekt vanaf de aangegeven lijnen waaruit blijkt dat: ann8-l alleen had geen necrotische laesies zoals in R1Y4/ann8-1. (B) Groei van de virulente bacteriestam Pseudomonas-spuit DC3000 in de aangegeven lijnen op de aangegeven tijdstippen. Foutbalken geven aan: SD (N = 4). Verschillende letters boven de balken geven significante verschillen aan (P < 0,05) bepaald door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA). (C) Een representatief blad van Col-gl vergeleken met representatieve bladeren van de aangegeven lijnen die gericht zijn op kunstmatige microRNA (amiRANN8) bij ANN8. (NS) Vergelijking van de bij ANN8 expressie in de aangegeven lijnen gedetecteerd door reverse transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR) met die in Col-gl, die is ingesteld op 1. Verschillende letters geven significante verschillen aan (P < 0,01) bepaald door eenrichtings-ANOVA. (E) Vertegenwoordiger vertrekt vanaf de aangegeven lijnen die laten zien dat het neerhalen van bij ANN8 door amiRANN8 in de R1Y4-achtergrond leidde tot necrotische laesies (pijlen) vergelijkbaar met die gezien in R1Y4/ann8-1.

Neerslaan bij ANN8 door kunstmatig microRNA leidt tot RPW8.1-afhankelijke celdood

Bevestigen bij ANN8 is functioneel verbonden met RPW8.1, gebruikten we kunstmatig microRNA dat specifiek gericht is op bij ANN8 (amiRANN8) om de expressie ervan te vernietigen volgens WMD Web MicroRNA Designer (http://wmd3.weigelworld.org). We kregen eerst meer dan 20 amiRANN8 transgene lijnen in de Col-gl-achtergrond, maar hebben geen duidelijk fenotype waargenomen van een van deze lijnen (Figuur 3C). We hebben het expressieniveau van gecontroleerd bij ANN8 in vier representatieve lijnen om te beoordelen of de amiRANN8 transgen werkte. De expressieniveaus van bij ANN8 in de vier amiRANN8 lijnen waren minder dan 20% van die in Col-gl zoals gemeten door reverse transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR) (Figuur 3D), wat aangeeft dat amiRANN8 heeft gewerkt om het zwijgen op te leggen bij ANN8. Toen we er echter drie overstaken, amiRANN8 transgene lijnen met R1Y4, we observeerden celdoodlaesies in alle F1 planten en de F2 individuen die zowel de RPW8.1-YFP en de amiRANN8 transgenen van een van de drie RNA-interferentie (RNAi) lijnen (Figuur 3E). Dus genetische uitputting van bij ANN8 door RNAi produceerde een soortgelijk effect als de ann8-1 mutatie bij het versterken van RPW8.1-YFP-afhankelijke HR-achtige celdood. Samen geven deze gegevens aan dat: bij ANN8 werkt genetisch als een negatieve regulator van RPW8.1-gemedieerde celdood.

Bijzondere waardevermindering van AtANN8 verbetert de expressie van RPW8.1

We hebben eerder waargenomen dat ectopische expressie van RPW8.1 leidde niet tot duidelijke celdoodlaesies (Ma et al., 2014). Optreden van celdoodlaesies in R1Y4/ann8-1 maar niet binnen ann8-1 ons ertoe aangezet om te onderzoeken of celdood te wijten is aan verhoogde expressie van RPW8.1. Onder laser scanning confocale microscopie verzamelde slechts een klein aantal geclusterde mesofylcellen RPW8.1-YFP in de volledig uitgezette bladeren van 6 weken oude R1Y4-planten (Figuur 4A). Daarentegen brachten bijna alle mesofylcellen RPW8.1-YFP in hoge mate tot expressie in bladeren van R1Y4/ann8-1 (Figuur 4B) en vergelijkbare accumulatie op hoog niveau van RPW8.1-YFP werd ook waargenomen in R1Y4/amiRANN8-3 (Figuur 4C) op dezelfde leeftijd. Kwantificering van de signaalintensiteit van YFP toonde aan dat RPW8.1-YFP-niveaus in R1Y4/ann8-1 en R1Y4/amiRANN8-3 waren ongeveer 3-voudig van die in R1Y4 (Figuur 4D, E). Ook toonde een western blot-assay aan dat de eiwitniveaus van RPW8.1-YFP hoger waren in R1Y4/ann8-1 en R1Y4/amiRANN8-3 dan in R1Y4 (Figuur S2). Verdere RT-qPCR-analyse toonde aan dat: RPW8.1-YFP werd uitgedrukt op 11 en vijf keer hoger in R1Y4/ann8-1 en R1Y4/amiRANN8-3 dan in R1Y4 (Figuur 4D, E), respectievelijk. Deze observaties gaven aan dat: bij ANN8 negatief reguleert RPW8.1 expressie op transcriptioneel niveau en mogelijk op post-transcriptioneel niveau.

Functionele beperking van bij ANN8 up-reguleert RPW8.1 expressie en verbeterde RPW8.1-gemedieerde ziekteresistentie

(EENC) Confocale microfoto's die de accumulatie van RPW8.1-YFP in R1Y4 (EEN), R1Y4/ann8-1 (B) en R1Y4/amiRANN8-3 (C). YFP-fluorescentie wordt weergegeven in groen en auto-fluorescentie van chloroplasten is in rood. Maat staaf, 20 m. (NS) en (E) Fluorescerende intensiteit in de aangegeven lijnen gemeten door Image J van confocale microfoto's en expressie van RPW8.1 in aangegeven lijnen gemeten door reverse transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR). Foutbalken geven aan: SD (N = 3). Student's t-test werd uitgevoerd om de significantie tussen R1Y4 en R1Y4/ te bepalenann8-1 of R1Y4/amiRANN8-3, respectievelijk. Sterretje * geeft significante verschillen aan bij P < 0,01. (F) Representatieve bladeren van de aangegeven lijnen die de ziektefenotypes tonen op 10 d na inoculatie (dpi) met Golovinomyces cichoracearum UCSC1. (G) Kwantificering van G. cichoracearum UCSC1-sporulatie op bladeren van de aangegeven lijnen bij 10 dpi. Waarden zijn gemiddelden van drie replicaties. Foutbalken geven aan: SD. Verschillende letters boven de balken geven significante verschillen aan (P < 0,01) bepaald door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA). (H) en (l) Expressie van het pathogeen-geassocieerde moleculaire patroon-getriggerde immuniteit (PTI) markergen FRK1 (H) en het SA-pathway defense marker-gen PR1 (l) op de aangegeven tijdstippen van de aangegeven lijnen geëvalueerd door RT-qPCR-analyse. Foutbalken geven aan: SD (N = 3). Student's t-test werd uitgevoerd om de significantie tussen R1Y4 en R1Y4/ te bepalenann8-1 op hetzelfde tijdstip. Sterretjes * en ** geven significante verschillen aan bij P < 0,05 en P < 0,01, respectievelijk.

Bijzondere waardevermindering van AtANN8 verbetert RPW8.1-gemedieerde afweerreacties

Omdat R1Y4 resistentie vertoonde tegen echte meeldauw (Ma et al., 2014), werden de versterkte necrotische laesies waargenomen in R1Y4/ann8-1 vroeg ons om te controleren of de meeldauwresistentie van deze mutant verder was verhoogd. Dus hebben we de echte meeldauwstam geënt Golovinomyces cichoracearum USCS1 op 6 weken oude planten en scoorde de ziektefenotypes. Terwijl de schimmelmassa in R1Y4 duidelijk minder was dan die in Col-gl-controleplanten, was deze nauwelijks zichtbaar in R1Y4/ann8-1 en R1Y4/amiRANN8-3 planten, wat wijst op verhoogde weerstand (Figuur 4F). Echter, schimmelmassa in ann8-1 en amiRANN8-3 was vergelijkbaar met die in Col-gl, wat aangeeft dat er geen weerstand is (Figuur 4F). Verdere kwantificering van de ziekte toonde aan dat terwijl R1Y4 verminderde sporulatie vertoonde met

2,5-voudig vergeleken met Col-gl, R1Y4/ann8-1 en R1Y4/amiRANN8-3 zelden ondersteund schimmelsporulatie (Figuur 4G). Deze waarnemingen ondersteunen negatieve regulatie van RPW8.1-afhankelijke resistentie tegen echte meeldauw door bij ANN8.

Vervolgens onderzochten we de expressies van de afweergerelateerde genen, PR1 en FRK1 die fungeren als merkergenen voor respectievelijk SA-signalering en PTI. Beide genen werden opgereguleerd tijdens de invasie van echte meeldauw en bereikten een piek op 7 dagen post-inoculatie (dpi) in R1Y4 en R1Y4/ann8-1 (Figuur 4H, I). Vergeleken met R1Y4, R1Y4/ann8-1 showed significantly enhanced FRK1 expression at 7 and 10 dpi (Figure 4H), and PR1 expression at 2, 4, 7, and 10 dpi (Figure 4I), suggesting that the enhancement of RPW8.1-mediated defense activation by functional impairment of AtANN8 upon powdery mildew challenge may be attributable to elevated PTI and SA-signaling.

Because plant defense against powdery mildew is often associated with cell death, we examined host cell death by trypan blue staining of the leaves free or at 10 dpi of powdery mildew. In the absence of pathogen, Col-gl and ann8-1 did not have any cell death, whereas both R1Y4/ann8-1 and R1Y4/amiRANN8-3 displayed more clusters of dead cells than R1Y4, but R1Y4/ann8-1/ANN8 had cell death similar to that in R1Y4 (Figure 5A, B), confirming that functional impairment of AtANN8 results in RPW8.1-YFP-dependent leaf cell death independent of pathogen challenge. After powdery mildew pathogen infection, cell death in Col-gl and ann8-1 mutant was rarely if ever detectable, while cell death in R1Y4/ann8-1 and R1Y4/amiRANN8-3 were further increased compared to that in R1Y4 (Figure 5C, D). These data indicate that functional impairment in AtANN8 enhances RPW8.1-dependent cell death, which could further increase RPW8.1-mediated powdery mildew resistance.

Mutation in AtANN8 results in enhanced RPW8.1-mediated cell death and altered RPW8.1-triggered H2O2 patroon

(EENNS) Trypan blue-stained leaves (EEN) en (C) and leaf sections (B) en (NS) free of pathogen infection (EEN) en (B) and at 10 d post-inoculation (dpi) of Golovinomyces cichoracearum UCSC1 (C) en (NS) from the indicated lines. Dying/dead cells are stained blue by Trypan blue. Size bar, 50 μm. (E) en (F) Micrographs showing 3,3′-diaminobenzidine (DAB) stained H2O2 accumulation pattern in R1Y4. Note that H2O2 was distributed in apoplastic space with no cell-shape change (E) or surrounded by oval-shaped mesophyll cells (*) (F). (G) en (H) Micrographs showing DAB stained H2O2 accumulation pattern in R1Y4/ann8-1. White asterisk indicates the shrunken cytoplasm in a dying cell (G). Arrowheads indicate H2O2 in chloroplasts. Arrows indicate H2O2-containing objects in the extracellular space (H). Size bar, 20 μm.

Because cell death triggered by RPW8.1 and RPW8.2 is preceded by H2O2 production ( Xiao et al., 2003 ), we wondered whether H2O2 production and distribution in R1Y4/ann8-1 was different from that of R1Y4. To this end, we examined H2O2 accumulation by 3,3′-diaminobenzidine (DAB) staining at 2 dpi of G. cichoracearum USCS1. Consistent with a previous report ( Ma et al., 2014 ), R1Y4 showed H2O2 accumulation in the apoplastic space between mesophyll cells (Figure 5E, F). By contrast, H2O2 in R1Y4/ann8-1 was mainly found inside chloroplasts of some mesophyll cells (Figure 5G) and in unknown compartments between mesophyll cells (arrows in Figure 5H). These observations indicate that site of H2O2 accumulation triggered by RPW8.1 in mesophyll cells is altered when AtANN8 is functionally impaired, further suggesting that RPW8.1 may positively regulate H2O2 production in mesophyll cells.

Over-expression of AtANN8 compromises RPW8.1-mediated cell death and disease resistance

Since both the A94T mutation and knocking-down of AtANN8 could enhance RPW8.1-mediated defense response and cell death, we wondered if over-expression of AtANN8 could inhibit RPW8.1's function. To this end, we obtained transgenic plants expressing AtANN8 van de 35S promoter in Col-gl (ANN8OE) and R1Y4 (R1Y4/ANN8OE). While more than 15 transgenic ANN8OE lines did not show any obvious phenotype, eight transgenic R1Y4/ANN8OE lines showed leaf phenotypes similar to that of WT (Figure 6A), indicating compromised RPW8.1-mediated cell death. Further RT-qPCR analysis showed that the AtANN8 transgene was indeed highly expressed in all examined ANN8OE lines compared to the messenger RNA (mRNA) level of the endogenous AtANN8 gene in Col-gl (Figure 6B). Meanwhile, the expression of RPW8.1-YFP was significantly suppressed in the R1Y4/ANN8OE lines (Figure 6C). We then examined powdery mildew resistance in these lines. Not surprisingly, both R1Y4/ANN8OE-1 and R1Y4/ANN8OE-2 were more susceptible to powdery mildew than R1Y4 even though they were slightly less susceptible compared with Col-gl or a Col-gl line transgenic for 35S::AtANN8 (ANN8OE) (Figure 6D). These phenotypes were validated by spore quantification (Figure 6E). Taken together, these results reinforce the idea that AtANN8 negatively regulates RPW8.1-mediated disease resistance and cell death through mechanisms that include suppression of RPW8.1 uitdrukking.

Over-expression of AtANN8 compromises RPW8.1-mediated disease resistance

(EEN) A comparison of leaves from the indicated lines, showing pits (arrowheads) only in a leaf from R1Y4. (B) en (C) Expression of AtANN8 (B) and RPW8.1 (C) from the indicated lines examined by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Error bars indicate SD (N = 3). Student's t-test was carried out to determine the significance of differences between Col-gl and the other lines (B) or between R1Y4 and the other lines (C). Asterisks * and ** indicate significant differences at P < 0.01 and P < 0.0001, respectively. Values above the bars indicate transcripts abundance of AtANN8 (B) and RPW8.1 (C) in the indicated lines relative to that in the control lines, which were set to 1.0. (NS) Representative leaves from the indicated lines showing the disease phenotypes at 10 d post-inoculation (dpi) of Golovinomyces cichoracearum. (E) Kwantificering van G. cichoracearum sporulation on leaves of the indicated lines at 10 dpi. Values are means of three replications. Error bars indicate SD. Different letters indicate significant differences (P < 0.01) determined by one-way analysis of variance (ANOVA).

AtANN8 is involved in abiotic stress responses and associates with ER/endomembrane in the cytoplasm

ANNEXINs have been involved in Ca 2+ -signaling ( Laohavisit et al., 2010 ) and some family members such as AtANN1 and OsANN1 have been shown to be implicated in the abiotic stress responses ( Richards et al., 2014 Qiao et al., 2015 ). To examine if AtANN8 also plays a role in abiotic stress responses, we first tested seedlings under different salt concentrations. When grown in Murashige-Skoog (MS)-agar containing 100 mmol/L NaCl, ann8-1 en amiRANN8-3 generated shorter roots than Col-gl (Figure 7A, B), indicating hypersensitivity to NaCl. This result implied that AtANN8 may play a role in osmosis across the cell membrane in response to salt stress. By contrast, we observed no significant differences in root length when seedlings were grown in MS agar containing 10 µmol/L jasmonic acid (JA) or 0.1 mol/L H2O2 (Figure 7B). Intriguingly, ann8-1 seedlings seemed to have longer roots than Col-gl and amiRANN8-3 when grown in control MS agar, although not statistically significant. However, the difference became statistically significant when seedlings were grown in MS agar containing 10 µmol/L SA (Figure 7A, B). The implication of this phenotype for ann8-1 is currently unknown and will be a future research focus.

AtANN8 is required for adaptation to salt stress

(EEN) Seedlings from the indicated lines at 10 d after transfer to control (H2O) or test plates. Note that the A94T missense mutation in AtANN8 (ann8-1) led to hypersensitivity to salt stress as shown by the shorter roots in NaCl media, and hyposensitivity to SA as shown by the longer roots in SA media. (B) Root inhibition assays of the indicated lines grown on media containing four different chemicals, each of which was normalized to root growth in the control plates. Error bars indicate SD (N = 3). Student's t-test was carried out to determine the significance of differences between Col-gl and the AtANN8 mutant lines. Asterisk * indicates significant differences at P < 0,01.

Finally, we examined the subcellular localization of AtANN8, in order to understand how AtANN8 regulates RPW8.1 function and abiotic stress responses. We first made and introduced a DNA construct in which AtANN8 was translationally fused with YFP at the C-terminus of AtANN8 under control of the AtANN8 native promoter in R1Y4/ann8-1. The transgenic plants showed phenotypes similar to that of R1Y4, indicating that AtANN8-YFP is functional (Figure 1F). Confocal imaging showed that although YFP signal was mainly detected along the plasma membrane of the epidermal cells, it was also found in intracellular structures (Figure 8A). To further determine the subcellular localization of AtANN8-YFP, we transiently co-expressed it with an RFP nuclear marker obtained in a previous investigation ( Huang et al., 2014 ) in leaves of Nicotiana benthamiana. While RFP signal from the nuclear marker was exclusively found in the nucleus, YFP signal from AtANN8-YFP was seen in the cytoplasm with strong signal visible around the nucleus as a typical ER ring (Figure S3). To further validate whether AtANN8-YFP has a co-localization with ER, we co-expressed AtANN8-YFP with the ER marker RFP-HDEL in N. benthamiana bladeren. As shown in Figure 8B and C, AtANN8-YFP signal looks largely overlapping with RFP signal however, the YFP signal in Figure 8C is diffuse when comparing to the sharp ER filaments, suggesting that AtANN8-YFP associates with ER in the cytoplasm. To exclude the possibility that a small pool of AtANN8 may co-localize and interact with RPW8.1, we performed a co-immunoprecipitation (Co-IP) assay. The result showed that these two proteins do not have physical association (Figure S4), suggesting that AtANN8 indirectly exerts its regulation on RPW8.1.

AtANN8 is localized at the endoplasmic reticulum (ER)

(EEN) A representative confocal image showing the localization pattern of AtANN8-YFP expressed from the native promoter in a stable transgenic Arabidopsis plant. Arrows indicate intracellular structure. (B) en (C) Representative confocal images showing co-localization between AtANN8-YFP and the ER marker 2RFP-HDEL transiently co-expressed in leaves of Nicotiana benthamiana. Arrow indicates the nucleus. Size bar, 10 μm.


Widespread occurrence of natural genetic transformation of plants by Agrobacterium

Naturally transgenic plant species occur on an unexpectedly large scale.

Abstract

Agrobacterium-mediated gene transfer leads to the formation of crown galls or hairy roots, due to expression of transferred T-DNA genes. Spontaneous regeneration of transformed cells can produce natural transformants carrying cellular T-DNA (cT-DNA) sequences of bacterial origin. This particular type of horizontal gene transfer (HGT) could play a role in plant evolution. However, the material available today is not enough for generalizations concerning the role of Agrobacterium in HGT from bacteria to plants. In this study, we searched for T-DNA-like genes in the sequenced genomes of dicots and monocots. We demonstrate the presence of cT-DNAs in 23 out of 275 dicot species, within genera Eutrema, Arachis, Nissolia, Quillaja, Euphorbia, Parasponia, Trema, Humulus, Psidium, Eugenia, Juglans, Azadirachta, Silene, Dianthus, Vaccinium, Camellia, en Cuscuta. Analysis of transcriptome data of 356 dicot species yielded 16 additional naturally transgenic species. Thus, HGT from Agrobacterium to dicots is remarkably widespread. Opine synthesis genes are most frequent, followed by plast genen. Species in the genera Parasponia, Trema, Camellia, Azadirachta, Quillaja, en Diospyros contain a combination of plast and opine genes. Some are intact and expressed, but the majority have internal stop codons. Among the sequenced monocot species, Dioscorea alata (greater yam) and Musa acuminata (banana) also contain T-DNA-like sequences. The identified examples are valuable material for future research on the role of Agrobacterium-derived genes in plant evolution, for investigations on Agrobacterium strain diversity, and for studies on the function and evolution of cT-DNA genes in natural transformants.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Production of Vaccines, Antibiotics, and Hormones

Traditional vaccination strategies use weakened or inactive forms of microorganisms or viruses to stimulate the immune system. Modern techniques use specific genes of microorganisms cloned into vectors and mass-produced in bacteria to make large quantities of specific substances to stimulate the immune system. The substance is then used as a vaccine. In some cases, such as the H1N1 flu vaccine, genes cloned from the virus have been used to combat the constantly changing strains of this virus.

Antibiotics kill bacteria and are naturally produced by microorganisms such as fungi penicillin is perhaps the most well-known example. Antibiotics are produced on a large scale by cultivating and manipulating fungal cells. The fungal cells have typically been genetically modified to improve the yields of the antibiotic compound.

Recombinant DNA technology was used to produce large-scale quantities of the human hormone insulin in E coli as early as 1978. Previously, it was only possible to treat diabetes with pig insulin, which caused allergic reactions in many humans because of differences in the insulin molecule. In addition, human growth hormone (HGH) is used to treat growth disorders in children. The HGH gene was cloned from a cDNA (complementary DNA) library and inserted into E coli cells by cloning it into a bacterial vector.


Meerkeuze

Which is the mechanism by which improper excision of a prophage from a bacterial chromosome results in packaging of bacterial genes near the integration site into a phage head?

A. conjugation
B. generalized transduction
C. specialized transduction
D. transformation

Which of the following refers to the uptake of naked DNA from the surrounding environment?

A. conjugation
B. generalized transduction
C. specialized transduction
D. transformation

The F plasmid is involved in which of the following processes?

A. conjugation
B. transduction
C. transposition
D. transformation

Which of the following refers to the mechanism of horizontal gene transfer naturally responsible for the spread of antibiotic resistance genes within a bacterial population?

A. conjugation
B. generalized transduction
C. specialized transduction
D. transformation


Bekijk de video: Havo 4. Inleiding in de biologie. Basisstof 4 Celorganellen (December 2021).