Informatie

12: N- en S-assimilatie, Biosynthese van aminozuren en nucleotiden - Biologie


12: N- en S-assimilatie, biosynthese van aminozuren en nucleotiden

12: N- en S-assimilatie, Biosynthese van aminozuren en nucleotiden - Biologie

1. Biochemie: een inleiding
Leven: het is een mysterie!
1.1 Wat is leven?
1.2 Biomoleculen
Functionele groepen van organische biomoleculen
Grote klassen van kleine biomoleculen
1.3 Is de levende cel een chemische fabriek?
Biochemische reacties
Energie
Overzicht van het metabolisme
Biologische Orde
1.4 Systeembiologie
Verschijning
robuustheid
Modulariteit
Biochemie in het laboratorium: een inleiding

2. Levende cellen
Ons lichaam, ons zelf
2.1 Basisthema's
Water Biologische Membranen
Zelfmontage
Moleculaire Machines
Macromoleculaire drukte
Signaaltransductie
2.2 Structuur van prokaryotische cellen
celwand
Plasma membraan
Cytoplasma
Pili en Flagella
2.3 Structuur van eukaryote cellen
Plasma membraan
Endoplasmatisch reticulum
Golgi-apparaat
Kern
Vesiculaire organellen
mitochondriën
peroxisomen
plastiden
cytoskelet
ribosomen
Biochemie in perspectief: primaire cilia en ziekte bij de mens
Biochemie in het laboratorium: celtechnologie
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: organellen en ziekten bij de mens

3. Water: de levensmatrix
Water, overal water
3.1 Moleculaire structuur van water
3.2 Niet-covalente binding
Ionische interacties
Waterstofbruggen
Van der Waals Forces
3.3 Thermische eigenschappen van water
3.4 Oplosmiddeleigenschappen van water
Hydrofiele moleculen, celwaterstructurering en sol-gelovergangen
Hydrofobe moleculen en het hydrofobe effect
Amfipathische moleculen
Osmotische druk
3.5 Ionisatie van water
Zuren, basen en pH
Buffers
Fysiologische buffers
Biochemie in perspectief: celvolumeregulatie en metabolisme
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: water, abiotische stress en compatibele opgeloste stoffen
Biochemie in het laboratorium: dialyse

4. Energie
De diepe duistere geheimen van energie en leven
4.1 Thermodynamica
Eerste wet van de thermodynamica
Tweede wet van de thermodynamica
4.2 Gratis energie
Standaard gratis energieveranderingen
Gekoppelde reacties
Het hydrofobe effect opnieuw bekeken
4.3 De rol van ATP
Biochemie in perspectief: thermodynamica zonder evenwicht en de evolutie van het leven
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: de extremofielen: organismen die hun brood verdienen in vijandige omgevingen

5. Aminozuren, peptiden en eiwitten
Spinzijde: een biosteel-eiwit
5.1 Aminozuren
Aminozuurklassen
Biologisch actieve aminozuren
Gemodificeerde aminozuren in eiwitten
Aminozuur stereo-isomeren
Titratie van aminozuren
Aminozuurreacties
5.2 Peptiden
5.3 Eiwitten
Eiwitstructuur
Het vouwprobleem
Vezelige eiwitten
Bolvormige eiwitten
5.4 Moleculaire machines
Motor eiwitten
Biochemie in perspectief: spinnenzijde en biomimetica
Biochemie in het laboratorium: eiwittechnologie
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: Myosine: een moleculaire machine
Biochemie in perspectief: eiwitvouwing en ziekte bij de mens
Biochemie in perspectief: eiwitvergiftiging
Biochemie in het laboratorium: eiwitsequentieanalyse: de Edman-degradatie

6. Enzymen
Mensen en enzymen: een korte geschiedenis
6.1 Eigenschappen van enzymen
6.2 Classificatie van enzymen
6.3 Enzymkinetiek
Michaelis-Menten Kinetics
Lineweaver-Burk Percelen
Multisubstraatreacties
Enzym remming
Enzymkinetiek, metabolisme en macromoleculaire verdringing
6.4 Katalyse
Organische reacties en de overgangstoestand
De rollen van aminozuren bij enzymkatalyse
De rol van cofactoren bij enzymkatalyse
Effecten van temperatuur en pH op door enzymen gekatalyseerde reacties
Gedetailleerde mechanismen van enzymkatalyse
6.5 Enzymregulering
Genetische controle
Covalente modificatie
Allosterische regulatie
Compartiment
Biochemie in perspectief: alcoholdehydrogenase: een verhaal over twee organismen
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: kwantumtunneling en katalyse
Biochemie in perspectief: enzymen en klinische geneeskunde

7. Koolhydraten
Zoete en bittere smaken: de rol van suikermoleculen
7.1 Monosachariden
Monosacharide stereo-isomeren
Cyclische structuur van monosachariden
Reacties van monosachariden
Belangrijke monosachariden
Monosacharidederivaten
7.2 Disachariden
7.3 Polysachariden
homoglycanen
Heteroglycanen
7.4 Glycoconjugaten
proteoglycanen
Glycoproteïnen
7.5 De ​​suikercode
Lectines: vertalers van de suikercode
Biochemie in het laboratorium: Glycomics
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: zoete geneeskunde
Biochemie in perspectief: conversie van Fischer-structuur naar Haworth-structuur

8. Koolhydraatmetabolisme
Metabolisme en straalmotoren
8.1 Glycolyse
De reacties van de glycolytische route
Het lot van Pyruvate
De Energetica van Glycolyse
Regulatie van glycolyse
8.2 Gluconeogenese
Gluconeogenese-reacties
Gluconeogenese-substraten
Gluconeogenese verordening
8.3 De pentosefosfaatroute
8.4 Metabolisme van andere belangrijke suikers
Fructose-metabolisme
8.5 Glycogeenmetabolisme
glycogenese
glycogenolyse
Regulering van het glycogeenmetabolisme
Biochemie in perspectief: Saccharomyces cerevisiae en het Crabtree-effect
Biochemie in perspectief: turboontwerp kan gevaarlijk zijn
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: fermentatie: een oud erfgoed

9. Aeroob metabolisme I: de citroenzuurcyclus
Zuurstof en evolutie: kans en noodzaak
9.1 Oxidatie-reductiereacties
Redox-co-enzymen
Aeroob metabolisme
9.2 Citroenzuurcyclus
Conversie van pyruvaat naar acetyl-CoA
Reacties van de citroenzuurcyclus
Lot van koolstofatomen in de citroenzuurcyclus
De amfibische citroenzuurcyclus
Regelgeving citroenzuurcyclus
De citroenzuurcyclus en menselijke ziekte
De glyoxylaatcyclus
Biochemie in perspectief: de evolutionaire geschiedenis van de citroenzuurcyclus
Beschikbaar online:
Hans Krebs en de citroenzuurcyclus

10. Aeroob metabolisme II: elektronentransport en oxidatieve fosforylering
Zuurstof: een moleculaire paradox
10.1 Elektronentransport
Elektronentransport en zijn componenten
Elektronentransport: het vloeistofmodel versus het vastestofmodel
Elektronentransportremmers
10.2 Oxidatieve fosforylering
De chemiosmotische theorie
ATP-synthese
Controle van oxidatieve fosforylering
De volledige oxidatie van glucose
Ontkoppeld elektronentransport
10.3 Zuurstof, celfunctie en oxidatieve stress
Reactieve zuurstofsoorten
Antioxidant-enzymsystemen
Antioxidant moleculen
Biochemie in perspectief: myocardinfarct: ischemie en reperfusie
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: glucose-6-fosfaatdehydrogenasedeficiëntie

11. Lipiden en membranen
Het vetarme dieet
11.1 Lipideklassen
Vetzuren
De Eicosanoïden
Triacylglycerolen
Wasesters
fosfolipiden
fosfolipasen
sphingolipiden
Sfingolipide-opslagziekten
isoprenoïden
Lipoproteïnen
11.2 Membranen
Membraanstructuur:
Membraan Functie:
Biochemie in perspectief: membraanfunctie en botulisme

12. Lipidemetabolisme
Abetalipoproteïnemie
12.1 Vetzuren, triacylglycerolen en de lipoproteïneroutes
Vetzuurafbraak
De volledige oxidatie van een vetzuur
Vetzuuroxidatie: dubbele bindingen en oneven ketens
Vetzuurbiosynthese
Regulering van het vetzuurmetabolisme bij zoogdieren
Lipoproteïnemetabolisme: de endogene weg
12.2 Membraanlipidemetabolisme
Fosfolipide metabolisme
Sfingolipidenmetabolisme
12.3 Isoprenoïde metabolisme
Cholesterolmetabolisme
Biochemie in perspectief: atherosclerose
Biochemie in perspectief: biotransformatie

13. Fotosynthese
Klimaatverandering, hernieuwbare energie en fotosynthese
13.1 Chlorofyl en chloroplasten
13.2 Licht
13.3 Lichtreacties
Fotosysteem II en wateroxidatie
Fotosysteem I en NADPH-synthese
Fotofosforylering
13.4 De lichtonafhankelijke reacties
De Calvincyclus
Fotorespiratie
Alternatieven voor C3-metabolisme
13.5 Regulering van fotosynthese
Lichtregeling van fotosynthese
Controle van ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase
Biochemie in perspectief: fotosynthese in de diepte
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: zetmeel- en sucrosemetabolisme
Biochemie in het laboratorium: fotosynthetische studies

14. Stikstofmetabolisme I: synthese
Stikstof en de dode zone van de Golf van Mexico
14.1 Stikstoffixatie
De stikstoffixatiereactie
Stikstofassimilatie
14.2 Aminozuurbiosynthese
Overzicht aminozuurmetabolisme
Reacties van aminogroepen
Synthese van de aminozuren
14.3 Biosynthetische reacties met aminozuren
Eén-koolstofmetabolisme
glutathion
Neurotransmitters
Nucleotiden
Heme
Biochemie in perspectief: Gasotransmitters
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: de ziekte van Parkinson en dopamine
Biochemie in perspectief: heem- en chlorofylbiosynthese
Biochemie in perspectief: de amine-neurotransmitters
Biochemie in perspectief: loodvergiftiging

15. Stikstofmetabolisme II: afbraak
Degradatieve paden en menselijke aandoeningen
15.1 Eiwitomzet
Autofagie-lysosomaal systeem
15.2 Aminozuurkatabolisme
deaminatie
ureum synthese
Controle van de ureumcyclus
Katabolisme van aminozuurkoolstofskeletten
15.3 Afbraak van de neurotransmitter
15.4 Nucleotideafbraak
Purine-katabolisme
Pyrimidine-katabolisme
Biochemie in perspectief: aandoeningen van aminozuurkatabolisme
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: hyperammoniëmie
Biochemie in perspectief: jicht
Biochemie in perspectief: Heme Biotransformatie

16. Integratie van het metabolisme
Hypertensie en urinezuur: een dieetverbinding?
16.1 Overzicht van het metabolisme
16.2 Hormonen en intercellulaire communicatie
Peptidehormonen
Groeifactoren
Steroïd- en schildklierhormoonmechanismen
16.3 Metabolisme in het zoogdierlichaam
Maagdarmkanaal
Lever
Spier
Vetweefsel
Brein
Nier
16.4 De voedings-vasten cyclus
De voedingsfase
De vastenfase
Voedingsgedrag
Biochemie in perspectief: diabetes mellitus
Biochemie in perspectief: obesitas en het metabool syndroom
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: zoogdierhormonen en het hormooncascadesysteem
Biochemie in het laboratorium: hormoonmethoden

17. Nucleïnezuren
Wat maakt ons menselijk?
17.1 DNA
DNA-structuur: de aard van mutatie
DNA-structuur: het genetische materiaal
DNA-structuur: variaties op een thema
DNA-supercoiling
Chromosomen en chromatine
Genoomstructuur
17.2 RNA
Overdracht RNA
ribosomaal RNA
Messenger-RNA
Niet-coderend RNA
17.3 Virussen
Bacteriofaag T4: een virale levensstijl
Biochemie in het laboratorium: nucleïnezuurmethoden
Biochemie in perspectief: epigenetica en het epigenoom: genetische overerving
Voorbij DNA-basesequenties
Biochemie in perspectief: forensisch onderzoek
Biochemie in perspectief: HIV-infectie
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: een korte geschiedenis van DNA-onderzoek: de begindagen

18. Genetische informatie
DNA en hersenschimmen: een biologisch en medisch mysterie
18.1 Genetische informatie: replicatie, reparatie en recombinatie
DNA-replicatie
DNA-reparatie
DNA-recombinatie
18.2 Transcriptie
Transcriptie in Prokaryoten
Transcriptie in eukaryoten
18.3 Genexpressie
Genexpressie in prokaryoten
Genexpressie in eukaryoten
Biochemie in het laboratorium: genomica
Biochemie in perspectief: carcinogenese

19. Eiwitsynthese
MRSA: De Superbug
19.1 De genetische code
Codon-anticodon-interacties
De aminoacyl-tRNA-synthesereactie
19.2 Eiwitsynthese
Prokaryote eiwitsynthese
Eukaryote eiwitsynthese
Biochemie in perspectief: gevangen ribosomen: RNA om te redden
Biochemie in perspectief: contextafhankelijke herschikking van codering
Biochemie in het laboratorium: Proteomics
Beschikbaar online:
Biochemie in perspectief: EF-Tu: A Motor Protein


Karakterisering en expressie in Streptomyces lividans van cefD- en cefE-genen van Nocardia lactamdurans: de organisatie van het cephamycine-gencluster verschilt van die in Streptomyces clavuligerus

De cefD- en cefE-genen van Nocardia lactamdurans, die respectievelijk coderen voor isopenicilline N-epimerase en deacetoxycefalosporine C-synthase, zijn 0,63 kb stroomopwaarts van het lysine-6-aminotransferase (lat)-gen gelokaliseerd. cefD bevat een open leesraam (ORF) van 1197 nucleotiden (nt) dat codeert voor een eiwit van 398 aminozuren met een M(r) van 43.622. De afgeleide aminozuursequentie vertoont 62,2% identiteit met het cefD-genproduct van Streptomyces clavuligerus. De sequentie SXHKXL in isopenicilline N-epimerase lijkt op de consensussequentie voor pyridoxalfosfaatbinding die wordt gevonden in verschillende aminozuurdecarboxylasen van Enterobacteria. cefE bevat een ORF van 945 nt dat codeert voor een eiwit van 314 aminozuren met een M(r) van 34.532, wat vergelijkbaar is met het deacetoxycephalosporine C-synthase van S. clavuligerus. Expressie van beide genen, cefD en cefE, in S. lividans-transformanten, resulteert in deacetoxycefalosporine C-synthase- en isopenicilline-N-epimerase-activiteiten die 10-12 keer hoger zijn dan die in N. lactamdurans. De cefD- en cefE-genen van N. lactamdurans zijn nauw met elkaar verbonden, maar de algehele organisatie van het cephamycine-gencluster verschilt in N. lactamdurans en S. clavuligerus.


12: N- en S-assimilatie, Biosynthese van aminozuren en nucleotiden - Biologie

Als een enzymnaam vetgedrukt wordt weergegeven, is er experimenteel bewijs voor deze enzymatische activiteit.

Synoniemen: L-glutamine - L-glutamaatroute

Samenvatting:
Algemene achtergrond

Het aminozuur glutamine is een bestanddeel van eiwitten en een stikstofdonor voor veel biosynthetische reacties, waaronder de biosynthese van aminozuren, purines, pyrimidinen, glucosamime en carbamoylfosfaat. De biosynthese van glutamine wordt gekatalyseerd door glutaminesynthetase, een sleutelenzym van het stikstofmetabolisme dat in alle domeinen van het leven wordt aangetroffen. Fylogenetische analyse van glutaminesynthetase-genen heeft gesuggereerd dat ze behoren tot de oudste functionerende genen in de geschiedenis van de evolutie [Kumada93]. In micro-organismen en planten speelt glutaminesynthetase (ook bekend als GS) een rol bij de assimilatie van ammoniak in combinatie met glutamaatsynthase (glutamine:&alpha-oxoglutaraataminotransferase, of GOGAT), zoals aangegeven door de routeverbindingen en routes (ammoniakassimilatiecyclus III en superpathway van ammoniakassimilatie (planten)). Dit staat bekend als de GS/GOGAT-route [Gottschalk86].

Deze route dient als een belangrijk mechanisme voor de assimilatie van ammoniak tijdens stikstofbeperking. Het heeft slechts één reactie, die wordt gekatalyseerd door glutaminesynthetase. Er zijn drie soorten glutaminesynthetase, die verschillen in aantal subeenheden. Glutaminesynthetase type I wordt vooral aangetroffen in bacteriën en archaea, waaronder E coli (besproken in [Stadtman01]). Het is een goed bestudeerde homododecamer opgebouwd uit twee back-to-back hexamere ringen [Woolfolk66, Frey75, Bywater75, Kabsch76, Heidner78]. Het enzym bevat twee metaalbindende plaatsen (n1 en n2) waaraan Mg2+ of Mn2+ kan binden. Binding op de n1-plaats leidt tot stabilisatie van het eiwit en vergemakkelijkt de binding van glutamaat aan de katalytische plaats, terwijl metaalbinding aan de n2-plaats betrokken is bij fosforyloverdracht (besproken in: Stadtman E.R (2004) "Regulation of Glutamine Synthetase Activiteit." EcoSal 3.6.1.6 [ECOSAL].


Resultaten

N-opname en metabolisme door kiemende sporen

Wanneer sporen werden gekweekt in afwezigheid van externe N, namen de concentraties in schimmelweefsel van de aminozuren Asn, Cys, Gln, Gly, Leu, Phe en Pro twee- tot vijfvoudig toe in 14 dagen, terwijl de concentraties van Ala, Arg, Asp , Ile, Ser, Thr en Val namen in de loop van de tijd af (figuur 1). Wanneer de veranderingen in de concentraties van vrije aminozuren worden vergeleken en het aantal aminogroepen per molecuul wordt beschouwd (bijv. 4 N in Arg), komt de toename van sommige aminozuren overeen met ongeveer een derde van de N die vrijkomt bij het katabolisme van bijvoorbeeld Ala, Arg of Asp. Asp was veruit het meest voorkomende aminozuur in sporen vóór ontkieming (zie andere schaal in Fig. 1), maar Ala, Arg en His werden ook gedetecteerd in relatief hoge concentraties. De concentraties van Gln, Gly en His waren echter significant hoger na 14 dagen dan de concentraties van Ala en Arg. De concentraties van Glu, Met en Lys bleven constant gedurende het tijdsverloop.

De vrije aminozuursamenstelling in kiemende sporen van Glomus intraradices gekweekt in gemodificeerd M-medium zonder toegevoegde stikstof (N) na 0 dagen (witte balken), 7 dagen (lichtgrijze balken) of 14 dagen (donkergrijze balken). Het recht ja-as toont de concentratie van Asp, en de linker ja-as de concentratie van alle andere aminozuren. Gemiddelde van N = 4 ± SEM.

Incubatie met anorganische vormen van N of ureum resulteerde in dramatische verhogingen van de vrije aminozuurconcentraties, met de grootste verhogingen in Arg en Glu (Fig. 2a de concentratie van Cys, Phe, Met, Ile en Leu verhoogde ook de resultaten die niet werden getoond ). Toevoer van ureum of kiemende sporen leidde tot de hoogste concentraties vrije aminozuren. Toen ureum werd geleverd, was de concentratie van Arg 25-voudig en die van Glu meer dan 100-voudig hoger dan onder controle-omstandigheden. De concentratie van de andere aminozuren was tussen de 1,5 en 5 keer hoger dan in de controles. Nitraattoevoeging leidde ook tot een verhoging van de concentratie van vrije aminozuren, maar het effect was over het algemeen kleiner dan na- of ureumtoevoeging. Veroorzaakte echter de hoogste stijgingen in Asp, Lys en Pro. Alleen de concentraties van Cys en Gln werden niet significant beïnvloed door de N-toevoer. De Gln-concentratie bleef zelfs constant wanneer Gin als de enige N-bron werd geleverd (figuur 2b). Vergeleken met de anorganische N-bronnen werden slechts kleine verhogingen van de vrije aminozuurconcentraties waargenomen na toevoer van Gin of Arg. Gln leidde slechts tot kleine verhogingen van de concentraties van Ala, Glu, Gly en Ser. Toen Arg werd geleverd, was alleen de concentratie van Arg in ontkiemende sporen significant hoger, de andere aminozuren werden niet aangetast.

Vrij aminozuurgehalte van kiemende sporen van Glomus intraradices na toevoer van verschillende stikstof (N) bronnen gedurende 7 d. (a) Geen stikstof (witte balken), 4 m m KNO3 (lichtgrijze balken), 4 m m NH4Cl (gearceerde staven) of 2 m m ureum (middengrijze staven). (b) Geen stikstof (witte balken), 2 m m Arg (donkergrijze balken) of 2 m m Gln (lichtgrijze balken). Gemiddelde van N = 4 ± SEM.

Etikettering in vrije aminozuren na incubatie met 15 N-gelabelde substraten

Ala, Arg, Asn, Asp, Gln en Glu werden sterk gelabeld (50-90% bevatte een of meer 15 N-atomen) wanneer kiemende sporen werden geleverd met verschillende anorganische N-bronnen (figuur 3a). Wanneer 15N-gelabeld of ureum werd geleverd als de enige N-bron gedurende 7 dagen, was de 15N-labeling in vrije aminozuren hoger dan na 15-toevoer (figuur 3a). We vergeleken ook de opname van 15 N van of wanneer de sporen gedurende 7 dagen aan beide werden blootgesteld. De opname van label in alle aminozuren en in het bijzonder in Ala, Arg, Asn, Gln en Glu was aanzienlijk hoger wanneer de sporen werden blootgesteld aan 15 NH4NEE3 vergeleken met NH4 15 NEE3 (Fig. 3b). Toen 15 werd geleverd als de enige N-bron voor 7 d, C. 80% van de vrije Arg en Asn werd geëtiketteerd, terwijl < 20% werd geëtiketteerd toen 15 werd geleverd met . Vergelijkbaar met de hierboven getoonde resultaten (Fig. 2a, b), was de labeling van vrij Gin onafhankelijk van de N-bron (Fig. 3a).

N-labeling in vrije aminozuren in kiemende sporen van Glomus intraradices na levering van verschillende 15 N-verrijkte substraten gedurende 7 d. (a) 4 m m KNO3 (witte balken), 4 m m NH4Cl (gearceerde staven), of 2 m m ureum (donkergrijze staven) (b) 4 m m NH4 15 NEE3 (witte balken) of 4 m m 15 NH4NEE3 (grijze balken). Gemiddelde van N = 5 ± SEM.

Vergeleken met de anorganische N-bronnen leidde een toevoer van Gin en Arg slechts tot een lage 15 N-verrijking in vrije aminozuren (niet getoond). [15 N]Gln werd opgenomen en voornamelijk opgenomen in Glu (9,1 ± 1,2%), maar de opname in andere aminozuren was < 4%. Toen [15N]Arg werd geleverd, werd een lage labeling van Ala, Asn, Gly, Ser en Val (≤ 3%) waargenomen.

Effecten van wortelexsudaten op het gebruik van

Van de wortelexudaten die in deze experimenten werden gebruikt, is aangetoond dat ze de presymbiotische groei, de opname van koolstof, de ademhaling en de genexpressie van schimmels stimuleren onder de hier gebruikte omstandigheden (Bücking et al., 2008 ). Onderzoeken of mogelijke effecten van wortelexsudaten op de N-opname worden veroorzaakt door een toename van het nutriëntenabsorberende oppervlak (als gevolg van de presymbiotische groeirespons) of door effecten op de efficiëntie van de nutriëntenopname (voedingsstofopname per oppervlakte-eenheid), kiemende sporen werden gedurende 24 uur blootgesteld aan wortelexudaten en of gedurende 6 dagen gekweekt met of zonder wortelexudaten en vervolgens 24 uur gelabeld met . De opname en opname van exogeen in vrije aminozuren waren zeer snel en verrijkingen van >80% voor Arg en voor Gln werden gevonden 24 uur na levering van (Tabel 2). De labeling in vrije aminozuren was vergelijkbaar met de resultaten na 7 dagen getoond in Fig. 3a. Ruwe en gedeeltelijk gezuiverde wortelexsudaten hadden geen effect op de opname en opname van aminozuren na 24 uur, maar gedeeltelijk gezuiverde wortelexudaten verminderden de opname op het latere tijdstip. De labeling in vrije aminozuren wanneer sporen eerst gedurende 6 dagen werden blootgesteld aan gedeeltelijk gezuiverde wortelexudaten en daarna werden geleverd was maar liefst 70% lager dan na de 1-d behandeling. Ook vertoonde de methanolcontrole een lagere opname in Ala, Asn en Glu. De verminderde opname in Arg, Gln en Glu geeft aan dat ruwe wortelexudaten ook een effect hebben (niet alle verschillen waren significant op het 5%-niveau met de Student-Newman-Keuls-test, maar significant volgens de Mann-Whitney U-toets).

Effecten van wortelexsudaten op de opname van aminozuren

Het effect van ruwe wortelexudaten op de opname van zes aminozuren tijdens presymbiotische groei werd gemeten met 14C-gelabelde aminozuren. Bij afwezigheid van wortelexsudaten was de opname van Gln, Glu en Gly hoger dan die van Ala, Arg en Orn (Fig. 4). De toevoeging van ruwe wortelexudaten resulteerde meestal in een iets hogere opname van Gln, Gly en Orn, maar het effect was alleen significant voor de eerste tijdstippen (1 of 2 d). Daarentegen was de opname van Glu op de eerdere tijdstippen iets lager dan die in de controles wanneer de sporen werden blootgesteld aan wortelexudaten.

Aminozuuropname (in %) door kiemende sporen van Glomus intraradices zonder (0) of met toevoeging van 7,7% ruwe wortelexudaten (+). Getoond wordt de opname na 1 d (witte balken), 2 d (lichtgrijze balken), 4 d (gearceerde balken) en 8 d (donkergrijze balken). Gemiddelde van N = 8 ± SEM.

Effecten van wortelexsudaten op genexpressie in ontkiemende sporen

Veranderingen in de expressie van genen die werden geïdentificeerd door sequentieovereenkomst als vermeende genen die betrokken zijn bij het N-metabolisme van G. intraradices werden gemeten in ontkiemende sporen met behulp van real-time kwantitatieve PCR. De toevoeging van ruwe wortelexudaten had geen effect op de genexpressie, maar sommige genen reageerden sterk op de aanwezigheid van gedeeltelijk gezuiverde wortelexudaten in het medium. De relatieve expressie van een AMT (Fig. 5a) en van GS (Fig. 5b) was niet veranderd in de aanwezigheid van ruwe of gedeeltelijk gezuiverde wortelexudaten. Daarentegen namen de transcriptniveaus van GDH (Fig. 5c), UAP (Fig. 5d) en OAT (Fig. 5e) significant toe na de toevoeging van gedeeltelijk gezuiverde wortelexudaten aan ontkiemende sporen. Verhogingen van de transcriptniveaus waren al detecteerbaar 2 uur nadat gedeeltelijk gezuiverde wortelexudaten aan de sporen waren toegevoegd. De expressie van GDH en UAP was drie tot vijf keer hoger en die van OAT ongeveer tien keer hoger dan bij de controles. De expressie van GDH en UAP daalde echter aanzienlijk op het laatste tijdstip (4 d).

Effect van wortelexsudaten op de expressie van (a) een vermeende schimmel-ammoniumtransporter (AMT), (b) glutaminesynthetase (GS), (c) glutamaatdehydrogenase (GDH), (d) urease-accessoire-eiwit (UAP) en ( e) ornithine-aminotransferase (OAT) ten opzichte van onbehandelde controles met gebruikmaking van een transcriptieregulator van het GATA-type als referentie-eiwit. De toevoeging van ruwe wortelexudaten wordt weergegeven als witte balken, de toevoeging van gedeeltelijk gezuiverde wortelexudaten als grijze balken. Gemiddelde van N = 3 ± SEM.


12: N- en S-assimilatie, Biosynthese van aminozuren en nucleotiden - Biologie

Als een enzymnaam vetgedrukt wordt weergegeven, is er experimenteel bewijs voor deze enzymatische activiteit.

Synoniemen: uridine-5'-fosfaat biosynthese I de novo biosynthese van uridine-5'-fosfaat I de novo biosynthese van uridine-5'-monofosfaat I

Samenvatting:
Algemene achtergrond

Pyrimidine- en purinenucleotiden zijn componenten van nucleïnezuren in alle levende organismen. Hoewel de enzymatische stappen in hun de novo biosynthese behouden blijven, bestaan ​​er enkele verschillen in de enzymen. Bij bacteriën en planten worden de drie stappen van carbamoylfosfaat naar orotaat bijvoorbeeld gekatalyseerd door drie verschillende eiwitten, terwijl ze bij zoogdieren worden gekatalyseerd door een enkel multifunctioneel CAD-eiwit. Bij planten en dieren worden de laatste twee stappen van de route gekatalyseerd door het bifunctionele enzym UMP-synthase, terwijl bacteriën hiervoor twee afzonderlijke eiwitten tot expressie brengen (in [Iwahana96, Giermann02] en besproken in [Zrenner06].

De de novo pyrimidine-nucleotide biosynthetische route zet bicarbonaat, L-glutamine, L-aspartaat en 5-fosfo-&alfa-D-ribose 1-difosfaat (PRPP) om in uridine 5'-fosfaat (UMP), een pyrimidine-ribonucleotide dat vervolgens kan worden omgezet in andere pyrimidine-ribonucleotiden zoals weergegeven in de link aan het einde van deze route, en in de superpathway-links hieronder.

Het eerste enzym, carbamoylfosfaatsynthetase, vormt carbamoylfosfaat uit ATP, bicarbonaat en ammoniak afgeleid van L-glutamine. Carbamoylfosfaat is zowel een tussenproduct van de pyrimidinesynthese als een voorloper voor de synthese van aminozuren zoals L-arginine en L-citrulline zoals getoond in de routelink, en L-canavanine in planten [Cronk06].

De volgende stap, die wordt gekatalyseerd door aspartaattranscarbamylase, is de condensatie van carbamoylfosfaat met vorming van L-aspartaat N-carbamoyl-L-aspartaat. Dit is de toegewijde stap in de biosynthese van pyrimidine-nucleotiden. N-carbamoyl-L-aspartaat, wordt vervolgens gecycliseerd tot (S)-dihydroorotaat, het eerste tussenproduct dat een pyrimidinering bevat. Deze verbinding wordt geoxideerd tot orotaat door dihydroorotaatdehydrogenase. Orotaat, een aromatische pyrimidinebase, wordt daarom in drie stappen gevormd uit carbamoylfosfaat.

De laatste twee stappen, de condensatie van orotaat met PRPP dat het eerste pyrimidinenucleotide orotidine 5'-fosfaat (OMP) vormt, gevolgd door de decarbylering van OMP tot UMP, worden uitgevoerd door de enzymen orotaatfosforibosyltransferase en orotidine 5'-fosfaatdecarboxylase. UMP werd in vroeg werk geïdentificeerd als een remmer van het eerste enzym carbamoylfosfaatsynthase [Trotta74].

In darmbacteriën zijn de biosynthetische genen van pyrimidine verspreid over het chromosoom en kunnen een enkele transcriptionele eenheid zijn of een deel van een klein operon. Ze hebben hun eigen regulerende mechanismen en worden niet gereguleerd door een gemeenschappelijke repressor.


Titel: Hiaten in bacteriële aminozuurbiosyntheseroutes opvullen met high-throughput genetica

Voor veel bacteriën met genoomsequentie begrijpen we niet hoe ze sommige aminozuren synthetiseren. Dit maakt het een uitdaging om hun metabolisme te reconstrueren en heeft geleid tot speculatie dat bacteriën aminozuren met elkaar kunnen voeden. Hier bestudeerden we heterotrofe bacteriën van 10 verschillende geslachten die groeien zonder toegevoegde aminozuren, hoewel een geautomatiseerd hulpmiddel voorspelt dat de bacteriën hiaten hebben in hun aminozuursyntheseroutes. Bij deze bacteriën waren er 11 hiaten in hun aminozuurbiosyntheseroutes die we met de huidige kennis niet konden opvullen. Met behulp van genoombrede mutante fitnessgegevens identificeerden we nieuwe enzymen die 9 van de 11 hiaten opvullen en daarmee de biosynthese van methionine, threonine, serine of histidine door bacteriën uit zes geslachten verklaren. We ontdekten ook dat de sulfaatreducerende bacterie Desulfovibrio vulgaris homocysteïne synthetiseert (wat een voorloper is van methionine) door gebruik te maken van DUF39-, NIL/ferredoxine- en COG2122-eiwitten, en dat homoserine geen tussenproduct is in deze route. Onze resultaten suggereren dat de meeste vrijlevende bacteriën waarschijnlijk alle 20 aminozuren kunnen maken en illustreren hoe high-throughput genetica voorheen onbekende aminozuurbiosynthese-genen kan ontdekken.


Resultaten

Glucose verhoogt de biosynthese van indolglucosinolaat in Arabidopsis

De inhoud van drie individuele (I3M, 3-indolylmethylglucosinolaat 4MOI3M, 4-methoxy-3-indolylmethylglucosinolaat 1MOI3M, 1-methoxy-3-indolylmethylglucosinolaat) en totale indolglucosinolaten werden geanalyseerd in scheuten van 10 dagen oude Ler en Col -0 zaailingen behandeld met 3% (W/V) glucose of sorbitol. Er werd gemeld dat verschillende soorten abiotische stress, waaronder osmotische stress, het glucosinolaatgehalte 60,61,62 kunnen beïnvloeden, dus sorbitol werd gebruikt als een osmotische stresscontrole van glucosebehandeling. Zoals weergegeven in Tabel 1, werden significante verhogingen van het gehalte aan I3M, de overheersende indolglucosinolaatsamenstelling, evenals de totale indolglucosinolaten waargenomen in met glucose behandelde scheuten, vergeleken met met sorbitol behandelde scheuten. Bovendien hebben we, gezien het feit dat indolglucosinolaten een hoog percentage van de totale glucosinolaten in wortels uitmaakten 63 , ook de veranderingen gedetecteerd van het totale indolglucosinolaatgehalte in wortels van zaailingen die gedurende 3 dagen met glucose waren behandeld. Evenzo werd hun accumulatie versterkt door glucosebehandeling (Fig. S1). Gedetailleerde analyse van het totale gehalte aan indolglucosinolaten toonde aan dat glucosebehandeling de totale accumulatie van indolglucosinolaten op een tijdsafhankelijke manier dramatisch verhoogde, vergeleken met sorbitolbehandeling (Fig. S2). Aangezien een kleine gen-subfamilie van cytochroom P450-mono-oxygenasen, CYP81Fs, werden gemeld om I3M te converteren naar 4MOI3M (CYP81F2/3) en 1MOI3M (CYP81F4) 64 , we onderzochten expressieniveaus van CYP81F2/3/4 onder glucosebehandeling. Consistent, transcripties van CYP81F2/3/4 werden geïnduceerd door glucose, in het bijzonder van CYP81F3 en CYP81F4. Alles bij elkaar genomen suggereren onze gegevens dat glucose de biosynthese van indolglucosinolaten bevordert.

Glucose induceert de expressie van genen die verband houden met de biosynthese van indolglucosinolaat

De respons van drie vitale transcriptiefactoren (MYB34, MYB51 en MYB122) en twee belangrijke biosynthetische genen (CYP79B2, CYP83B1) tot glucose werd geanalyseerd. Expressie van al deze vijf genen werd geïnduceerd door exogene glucose (Fig. 1). Glucose-geïnduceerde mRNA-niveaus van MYB34, MYB122, CYP79B2 en CYP83B1 werden al 6 uur na de glucosebehandeling gedetecteerd en namen vervolgens gestaag toe tot een piek na 18 uur (MYB34, MYB122) of 24 uur (CYP79B2, CYP83B1). MYB51 reageerde langzamer en milder op glucose dan de andere twee transcriptiefactoren. De mRNA-niveaus van MYB34, MYB51, MYB122, CYP79B2 en CYP83B1 onder glucosebehandeling geaccumuleerd

3,40-, 1,78-, 2,68-, 2,45- en 2,92-voudig van die in sorbitolbehandeling, respectievelijk, na 18 uur. Op dit tijdstip werden dus planten bemonsterd voor de volgende analyses van genexpressie.

Relatieve expressieniveaus van MYB34 (EEN), MYB51 (B), MYB122 (C), CYP79B2 (NS) en CYP83B1 (E) in jonge zaailingen behandeld met glucose of sorbitol gedurende aangegeven tijden.

Het expressieniveau werd gemeten bij 10 dagen oude Arabidopsis zaailingen behandeld met 3% glucose of sorbitol en vervolgens werden de hele planten respectievelijk 6, 12, 18, 24 en 36 uur na behandeling verzameld. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde van vijf onafhankelijke biologische replica's per behandeling (gemiddelde ± SE). Het expressieniveau van genen in met water behandelde zaailingen was ingesteld op 1. De gentranscriptieniveaus na drie behandelingen werden voor elk tijdstip vergeleken en waarden die geen gemeenschappelijke letter delen, zijn significant verschillend bij P < 0,05.

Door glucose geïnduceerde biosynthese van indolglucosinolaten wordt beïnvloed door myb verlies-van-functie mutanten

Het gehalte aan totale indolglucosinolaten in mijnb34myb122, myb51myb122, mijnb34myb51 dubbel en mijnb34myb51myb122 drievoudige mutanten werden gemeten met of zonder glucosebehandeling. As shown in Fig. 2A, these mutants produced less indolic glucosinolates compared with the wild type under the condition without glucose. The level of indolic glucosinolates was significantly lower in myb51myb122 dan myb34myb122 and was almost undetected in myb34myb51 en myb34myb51myb122. However, the content of total indolic glucosinolates increased by 28% in myb34myb122 and 125% in myb51myb122 after glucose treatment compared with sorbitol treatment, whereas glucose had no such an effect on indolic glucosinolate accumulation in myb34myb51 en myb34myb51myb122 mutanten.

Total indolic glucosinolate content and relative expression levels of genes related to glucosinolate biosynthesis in double and triple myb mutant seedlings treated with glucose or sorbitol.

Effect of glucose on accumulation of total indolic glucosinolates (EEN) was measured in myb34myb122, myb51myb122, myb34myb51 double and myb34myb51myb122 triple mutants, as well as expression levels of MYB34 (B), MYB51(C), CYP79B2 (NS) and CYP83B1 (E) in these mutants. Ten-day-old Arabidopsis seedlings were treated with 3% glucose or sorbitol and then the whole plants were collected 3 days (EEN) or 18 h (ZIJN) after treatment. Each data point represents the mean of three to five (for qPCR assay) or six (for glucosinolate assay) independent biological replicates per treatment (mean ± SE). Expression level of genes in water-treated Col-0 seedlings was set to 1. Values not sharing a common letter are significantly different at P < 0,05.

Furthermore, transcript levels of MYB34, MYB51, CYP79B2 en CYP83B1 in myb mutants were analyzed. De expressieniveaus van MYB34 in myb51myb122 en MYB51 in myb34myb122 were induced by glucose treatment, which was similar to that in wild type. Notably, the steady-state levels of two biosynthetic genes, CYP79B2 en CYP83B1 were in line with the increased levels of indolic glucosinolates (Fig. 2D,E). In addition, the expression of CYP79B2 en CYP83B1 in myb51myb122 was induced almost as strong as in wild type by glucose, which was not the case for myb34myb122, myb34myb51 and the triple myb gemuteerd. This observation pointed out the importance of three MYBs and especially of MYB34 in glucose-induced indolic glucosinolate biosynthesis.

HXK1 is involved in glucose-induced indolic glucosinolate biosynthesis

De gin2-1 is a HXK1 null mutant, which is insensitive to glucose 54 . As shown in Fig. 3A, gin2-1 mutant contained a significantly reduced level of total indolic glucosinolates in comparison with the wild type. The increased accumulation of total indolic glucosinolates resulted from glucose treatment in wild type was also inhibited in this mutant. Consistently, over-expressing HXK1 in gin2-1 plants recovered the deficiency of glucosinolates (Fig. S4). Similarly, the induced expressions of MYB34, MYB51 en MYB122 by glucose were almost vanished in the gin2-1 mutant (Fig. 3B–D). All above results suggest that HXK1 is important in glucose-induced indolic glucosinolate biosynthesis.

Total indolic glucosinolate content and relative expression levels of MYB34, MYB51 en MYB122 in glucose- or sorbitol-treated gin2-1 seedlings.

Ten-day-old Arabidopsis seedlings were treated with 3% glucose or sorbitol and then the whole plants were collected 3 days (EEN) or 18 h (B–D) after treatment. Each data point represents the mean of five (for qPCR assay) or six (for glucosinolate assay) independent biological replicates per treatment (mean ± SE). Values not sharing a common letter are significantly different at P < 0,05. Relative expression values are given compared with Ler seedlings treated by water.

The role of ABI5 in glucose-induced indolic glucosinolate biosynthesis

De abi5-7 mutant produced notable decreased total indolic glucosinolate content, compared with the wild type, in the presence or absence of glucose (Fig. 4A). However, glucose treatment raised the accumulation of total indolic glucosinolates in abi5-7 by 27%, compared with sorbitol treatment, which was comparable to that in wild type (33%). To our surprise, the transcription levels of MYB34 en MYB51 in abi5-7 were the same as in the wild type (Fig. 4B,C). We then checked transcription levels of CYP79B2 en CYP83B1 in de abi5-7 gemuteerd. Quantitative PCR (qPCR) analysis showed that relative expression levels of CYP79B2 en CYP83B1 were much lower in abi5-7 than in the wild type (Fig. 5). However, glucose treatment dramatically enhanced the expression of these two genes in abi5-7, which was similar to that in the wild type, compared with sorbitol treatment.

Total indolic glucosinolate content and relative expression levels of MYB34, MYB51 en MYB122 in abi5-7 treated with glucose or sorbitol.

Ten-day-old Arabidopsis seedlings were treated with 3% glucose or sorbitol and then the whole plants were collected 3 days (EEN) or 18 h (B–D) after treatment. Each data point represents the mean of five (for qPCR assay) or six (for glucosinolate assay) independent biological replicates per treatment (mean ± SE). Values not sharing a common letter are significantly different at P < 0,05. Relative expression values are given compared with Col-0 seedlings treated by water.

Relative expression levels of CYP79B2 (EEN) and CYP83B1 (B) in abi5-7 treated with glucose or sorbitol.

Ten-day-old Arabidopsis seedlings were treated with 3% glucose or sorbitol and then the whole plantswere harvested 18 h after treatment. Each data point represents the mean of five independent biological replicates per treatment (mean ± SE). Values not sharing a common letter are significantly different at P < 0,05. Relative expression values are given compared with Col-0 seedlings treated by water.

Glucose induces the expression of sulfate metabolic genes

Most sulfur is absorbed by plants in inorganic sulfate and then, plants either reduce sulfate and incorporate it into cysteine and other sulfur-containing compounds of primary metabolism, or take it into the secondary metabolism to synthesize various sulfated compounds, including glucosinolates 33,35 . The response of sulfate metabolic genes to glucose treatment was analyzed to verify whether glucose exerted an effect on sulfate assimilation (Fig. 6). The results showed that ATPS1 responded to glucose treatment quickly, representing a high induced expression level at 6 h and then went back to the control level 12 h after glucose treatment. In addition, relative expression levels of APK1, APK2, APR1, SiR en SOTs (ST5a, ST5b, ST5c) were increased by glucose as early as 6 h after treatment and maintained at a high level until 12 h. It seemed that sorbitol treatment stimulated expression of some genes, such as ARP1 en ST5b, more slowly than glucose treatment (Fig. 6C,D), indicating that glucose signaling is switched on rapidly in regulating sulfate assimilation.

Relative expression levels of genes related to sulfate metabolism in glucose- or sorbitol-treated seedlings.

Ten-day-old Arabidopsis seedlings were treated with 3% glucose or sorbitol and then the whole plants were harvested 6 h (A,B) or 12 h (C,D) after treatment. Each data point represents the mean of five independent biological replicates per treatment (mean ± SE). Values not sharing a common letter are significantly different at P < 0,05. Relative expression values are given compared with seedlings treated by water.

Glucose increases glucosinolate accumulation and thiol content in plants cultured under different sulfate concentrations

To investigate whether glucose-regulated glucosinolate accumulation was associated with the concentration of sulfate, we measured the content of glucosinolates in Arabidopsis cultured with different concentrations of sulfate. As shown in Fig. 7, plants accumulated more glucosinolates along with the increased concentration of sulfate in culture medium in the absence of glucose. When the sulfate concentration was increased to 1500 μM, the accumulation of both aliphatic and indolic glucosinolates reached saturation. However, their levels were differentially affected by glucose. More aliphatic glucosinolates accumulated with the increased sulfate concentration. Conversely, plants synthesized almost the same amount of indolic glucosinolates when sulfate concentration reached 1500 μM or even higher. This observation suggests differential roles of both glucose and sulfur in the production of aliphatic and indolic glucosinolates. In addition, the effect of glucose on cysteine and GSH levels were assessed. As shown in Fig. 8, plants accumulated more thiols when they were supplied with more sulfate and glucose treatment promoted thiol accumulation at all tested sulfate concentrations, especially when the concentration was slightly low (100 μM) or high (3000 μM).

Glucosinolate contents in glucose-treated seedlings grown at different concentrations of sulfate.

Arabidopsis seedlings (wild type Col-0) were cultured at different concentrations of sulfate for 10 days and subsequently treated with 3% glucose. The whole plants were harvested 3 days after glucose treatment. Total aliphatic and indolic glucosinolate contents were measured. Each data point represents the mean of six independent biological replicates per treatment (mean ± standard error). Values not sharing a common letter are significantly different at P < 0,05.

Cys and GSH contents in glucose-treated seedlings grown at different concentrations of sulfate.

Arabidopsis seedlings (wild type Col-0) were cultured at different concentrations of sulfate for 10 days and then treated with 3% glucose. The whole plants were harvested 3 days after treatment and then cysteine and GSH contents were measured. Each data point represents the mean of five independent biological replicates per treatment (mean ± standard error). Values not sharing a common letter are significantly different at P < 0,05.


4. Materials and Methods

4.1. Plant and Insect Materials

Two rice genotypes, Pf9279-4 and O. sativa (cv. 02428), the SBPH-resistant and SBPH-susceptible rice line, respectively, were selected for this study. Pf9279-4 is an introgression line derived from the asymmetric somatic hybridization between Oryza officinalis en O. sativa (cv. 02428). Pf9279-4 bears a major QTL Qsbph3d and two minor QTLs Qsbph7a en Qsbph12b [57]. The SBPH insects used for infestation were collected from rice fields in Jiangsu Province, China, that was confirmed to be non-viruliferous or viruliferous by dotimmunobinding assay and PCR detection [58]. The non-viruliferous population and viruliferous SBPH population were independently maintained on 02428 plants in the insect-proof in greenhouse in Zhejiang Academy of Agricultural Sciences. For simulation the natural reaction of rice attacked by SBPH in open field in this study, second to fourth instar nymphae of the mixture of the non-viruliferous and viruliferous SBPH population were transferred from 02428 and employed for infestation experiments.

4.2. SBPH Infestation Experiments

The resistant and susceptible rice plants were planted in pots (50 cm in length and 30 cm in width). When the seedlings were at the fourth leaf stage, weak plants were removed from the pots. In the insect-proof in greenhouse, second to fourth instar nymphs of the mixture of non-viruliferous and viruliferous SBPH population were introduced at a density of ten insects per seedling [57]. At each selected time-point, the two outmost layers of leaf sheaths were separated from the rice plants which had been fed and not fed by SBPH infestation, frozen immediately in liquid nitrogen and stored at � ଌ. The rice plants that had not been fed upon by SBPH were performed as a control experiment and its two outmost layers of leaf sheaths were separated and collected as controls.

4.3. Affymetrix GeneChip Analysis

According to the results of our previously comparative two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis analysis, significant differences in protein expression level between these two contrasting rice genotypes that sampled at different times after SBPH infestation were obvious within 6 h of infestation. Therefore, the two outmost layers of leaf sheaths of these two contrasting rice genotypes that had been fed upon by SBPH for 6 h and controls were used for microarray experiments. Beijing Biochip Co., Ltd. carried out the microarray experiments and data analysis. RNA purification, cDNA probe preparation, target hybridization, washing, staining, scanning, image analysis and the initial data processing were performed according to Affymetrix GeneChip ® Expression Analysis Technical Manual. Three biological replications were performed. Expression levels were compared with those in Affymetrix ® Microarray Suite version 5.0 (MAS 5.0, Sacramento, CA, USA). Significantly differentially expressed genes were screened in the Significant Analysis of Microarray software (SAM, version 3.02, Palo Alto, CA, USA) [59]. Significantly differentially expressed genes were determined with a fold change of  𢙒.0 and a Q-value of π.05 in the SAM output result. Checks of annotations from Affymetrix for significant differentially expressed genes were performed by using Blastx program in NCBI public database [60] and performed in TIGR Rice Genome Annotation version 4.0 (http://rice.tigr.org) [61] corrected if necessary.

4.4. Validating of Rice Transcriptome Data for Pathway Tools Omics Viewer

The Pathway Tools Omics Viewer maps the expression values is in Gene ID-dependent manner [17]. Therefore, batch translation all probe set ids of the all differentially expressed genes to corresponding TIGR locus ids by using the Gene List Suite tool at the Plant Expression Database (http://www.plexdb.org) or by using the tool Omics Validator at the Gramene 𠇌yc” Pathways databases (http://pathway.iplantcollaborative.org/). For single experiment time step, listing all differentially expressed gene in a microsoft excel worksheet. The table in the microsoft excel worksheet contains 2 columns, the first row contains column header following TIGR locus id and the relative or absolute expression level of each differentially expressed gene, one gene per row. In the Pathway Tools Omics Viewer, for column numbering purposes, the first column, which contains the TIGR locus id, is column number 0 and the first potential data column is column number 1 [17]. Therefore, for time series, listing all differentially expressed gene in a microsoft excel worksheet, the first row contains column header following TIGR locus id and column numbers (with each column number corresponding to the relative or absolute expression level of each differentially expressed gene for a single timepoint), one gene per row. The microarray expression data is then saved as a tab-delimited data file and stored on the local computer [17].

4.5. Visualization of Rice Transcriptome Data Using Pathway Tools Omics Viewer

This section was performed as follows according to the guidelines at Pathway Tools Omics Viewer webpage (http://pathway.iplantcollaborative.org). It is worth noting that the rice pathway database should be first selected when the rice transcriptomic data was visualized [17]. Open the Pathway Tools Omics Viewer webpage (http://pathway.iplantcollaborative.org), click on the 𠇌hange” link. In the dialog that pops up, select the Oryza sativa Japonica Group, then click OK to exit the dialog. The Pathway Tools Omics Viewer is next selected. Upload the transcriptomic data that validated as noted above. In the column number fields, enter 1 for single experiment time step and enter a list of column numbers (with each column number corresponding to a single timepoint) for animated time series. In the Color Scheme, “three color display with specified threshold” was selected and the specified threshold was entered in the specified threshold field. The other fields should be default selection. Then click the “Submit 𠇚t the bottom of the Pathway Tools Omics Viewer webpage. When the Oryza sativa Japonica groep metabolic map was generated, a metabolite can be identified by moving the mouse over the metabolite icon the metabolite page or a related pathway page can be navigated by clicking on the metabolite icon [17].

4.6. Animation the Comparative Transcriptome Analysis Using Pathway Tools Omics Viewer

For single experiment time step, the metabolic map generated by Pathway Tools Omics Viewer is static but not animated. It is more ready and direct to visualize the expression patterns for single experiment time step if the metabolic map generated by Pathway Tools Omics Viewer is animated. However, in the Pathway Tools Omics Viewer, one comparative transcriptome analysis of interest, e.g., the differentially expressed genes between before and after infestation in the resistant rice plants, was considered as single experiment time step. Meanwhile, the single experiment time step can’t mimic animated time series by enter two 1 in the column number fields or copy the relative or absolute expression level of each differentially expressed gene in the second column for a third column in the validating of rice transcriptome data for Pathway Tools Omics Viewer process and enter 1 and 2 in the column number fields in the visualization of rice transcriptome data using Pathway Tools Omics Viewer process. To get animated pictures for comparative transcriptome analysis and more readily visualize the expression patterns, in this study, the individual metabolic pathways that were differentially regulated between before and after infestation in the resistant (R6_R0) and susceptible rice plants (S6_S0) respectively was taken as one combination for animated time series while the individual metabolic pathways that were differentially regulated between resistant and susceptible rice plants before (R0_S0) and after infestation (R6_S6) respectively was taken as another combination for animated time series. Then mark the differentially regulated individual metabolic pathways between R6_S6 and R0_S0 or between R6_R0 and S6_S0 with green box.

4.7. Identification of the Differentially Regulated Individual Metabolic Pathways by the Pathway Tools Omics Viewer

Although a pathway in the metabolic map generated by pathway tools can be navigated, in most cases, e.g., comparative transcriptome analysis of interest, it is more ideal and direct to get clear understanding of the differentially regulated metabolic pathways in more details if the differentially expressed genes and its differential expression values can be mapped to the individual metabolic pathway. Notably, the Pathway Tools Omics Viewer provides an alternative display to generate a table containing all individual metabolic pathways [17]. Therefore, to get the differentially regulated individual metabolic pathways with omics data painted onto the metabolic pathway, in the 𠇍isplay Type”, the third option, “generate a table of individual pathways exceeding threshold”, was selected. Then do the others as do for visualization of rice transcriptomic data using Pathway Tools Omics Viewer as described above. According to the fold changes of the differentially expressed genes that belong to the corresponding individual metabolic pathways derived from the Pathway Tools Omics Viewer, the individual metabolic pathway was then classified into three groups, if all the differentially expressed genes were up-regulated or higher, the individual metabolic pathway was up-regulated or higher if all the differentially expressed genes were down-regulated or lower, the individual metabolic pathway was down-regulated or lower if the differentially expressed genes were both up-regulated and down-regulated or higher and lower, the individual metabolic pathway was both up-regulated and down-regulated or both higher and lower and marked up/down or higher/lower in this report.

4.8. Identification of Metabolic Pathways Potentially Related to SBPH Resistance by Pathway Tools Omics Viewer

To identify the most relevant metabolic pathways associated with SBPH resistance and susceptibility in rice, the web tool Venn (http://bioinfogp.cnb.csic.es/) was next employed. The differentially regulated individual metabolic pathways in the four comparisons that identified by the Pathway Tools Omics Viewer were represented in a Venn diagram. In the Venn diagram webpage, click the numbers in the Venn diagram to see the results and copy each result of 15 categories to a microsoft excel worksheet. The table in the microsoft excel worksheet contains five columns, the first row contains column header following metabolic pathway and four comparisons, one metabolic pathway per row. According to the result of the individual metabolic pathway that was classified into three groups mentioned as above, mark the individual metabolic pathway with up or down or up/down as well as higher or lower or higher/lower. By searching the metabolic pathway in the Gramene database or click the link of the metabolic pathway in the result that displayed as a table containing individual metabolic pathway, download the classification hierarchy for individual metabolic pathways from the rice pathway database (http://pathway.iplantcollaborative.org/).

4.9. Measurement of Free Amino Acids

The result of the identification of the metabolic pathway associated with resistance and susceptibility to SBPH showed that several kinds of the amino acids were correlated with resistance and susceptibility to SBPH, therefore, the concentrations of the free amino acids were then determined as described by Lei [62]. Briefly, leaf sheath power (0.2 g) was sampled, sulfosalicylic acid (3%) was then added to a volume of 4 mL for protein precipitation, and extracted in 80 ଌ water for 30 min. After cooling to room temperature, the extract was centrifuged at 13,500× G at 4 ଌ for 10 min. The extracted supernatant was then filtered through a 0.45-um membrane filter. Finally, the supernatant (100 µL) was determined by using the automatic amino acid analyzer L-8900 (Hitachi Construction Machinery Co., Ltd., Tokyo, Japan).


4 CONCLUSIONS

The differences in the respiration rates, TSS content, and TA content showed that room-temperature and low-temperature storage exert different effects on the quality of litchi pulps. An UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS analysis was performed to uncover the metabolism underlying these effects. Our results demonstrated that the RT-8 d and LT-28 d pulps presented active fructose and mannose metabolism and increased catabolism of nicotinate, nicotinamide, alanine, aspartate, and glutamate. Decreased levels of key metabolites in the EMP-TCA cycle and an accumulation of phenylalanine, tyrosine, and tryptophan were observed in the RT-8 d pulps. Interestingly, higher consumption of nucleotide metabolites and the biosynthesis of aliphatic metabolites were found in the LT-28 d pulps. The above-described results indicated that active EMP-TCA cycle pathways in room-temperature-stored litchi fruit might be associated with the high respiration rate moreover, the promotion of the PPP pathway and active aliphatic biosynthesis detected in the LT-28 d pulps could be related to inhibited respiration and various stresses during long-term low-temperature storage. The results definitely provide a metabolic fingerprint that reveals the different effects of room-temperature and low-temperature storage on the physiological activities and quality of litchi pulp.


Discussie

Recent developments in high-throughput technologies have enabled the profiling of metabolites, including N-containing metabolites, giving rise to the field of metabolomics [23, 44]. Machado et al. [45] performed a metabolic analysis on freshwater Nitzschia palea strains, BR006 and BR022, collected from a eutrophic pond and from an artificial rock, respectively, and demonstrated that these strains developed distinct metabolic responses to different N conditions. BR022 maintained cellular homeostasis and slowed down growth in response to N availability, whereas BR006 maximized its growth rate even under N limitation by triggering a stress response that relocated carbon to lipid compounds and arrested growth after N exhaustion. A combination of physiological, transcriptional, and metabolic approaches revealed molecular and metabolic modifications that occur when the marine diatom Phaeodactylum tricornutum is grown under N-deprived conditions. These modifications indicated that P. tricornutum responded to N deprivation through increasing N transport and assimilation and utilizing organic N resources [16]. Following exposure to N deprivation, P. tricornutum reduced the biosynthesis of N-containing compounds and increased the recycling of N compounds such as amino acids, proteins, and nucleic acids. Similarly, a closely related symbiotic Desmodesmus sp. isolated from a hydroid was found to degrade Rubisco in response to N starvation, presumably to salvage the N contained in this protein [46]. In a previous study, we found that N is salvaged from nucleotides in Chlorella C3 grown under N starvation conditions, which enhances the expression of the obligatory response proteins (e.g., CaM and CAS), and thereby increase N-use efficiency [22]. In this study, we found that the total protein level and the amino acids (proline, GABA, alanine, arginine, and succinate) involved in N assimilation and re-distribution in C2 were higher than in the other two strains before N− treatment (time point 0), suggesting the surplus proteins and amino acids possibly provide substrates for N salvage and re-distribution under N− conditions, and the significant differences between C2 and C1 and C3 at time point 0 might be also an important reason for the differences in lipid metabolism significance. In a study, Gressler et al. [47] investigated the biochemical composition of four species of marine benthic algae (Laurencia filiformis, L. intricata, Gracilaria domingensis, en G. birdiae), and also found that the highest lipid content was detected in the algae with the highest protein level and amino acid level. Through metabolic profiling analysis, physiological tests, and real-time RT-PCR analysis (Figs. 2, 3, 4, 5, 6 and 8), we further showed that N salvage and re-distribution from proteins and amino acid catabolism via GS/GSN and the corresponding transaminase pathways in the C2 strain represent an important metabolic response of microalgae that contributes to lipid metabolism. In addition, in inverse proportion to its lipid-producing capacity, the levels of phospholipids, which are involved in membrane remodeling during growth and development [48], was lower in C2 than in C1 and C3 (shown in Additional file 3), implying that the high oil producing strain has a lower growth rate following re-suspension in N− medium (Additional file 4: Figure S2D, Figure S3).

As N assimilation requires energy, reducing molecules, and carbon skeletons, this process is influenced by C metabolic networks involved in photosynthesis, day respiration, and photorespiration. Park et al. [49] analyzed metabolic changes in C. reinhardtii grown under N deprivation and found that a N-sensing system was transduced to C- and N-responsive pathways, leading to the down-regulation of C assimilation and chlorophyll biosynthesis and an increase in N metabolism and lipid biosynthesis. The authors found that the expression of nearly all enzymes that catalyze N assimilation increased significantly. Our study as well as previous studies [20,21,22] showed that a number of key biological functions, including photosynthesis and C metabolism, were either up- or down-regulated under N-limited conditions. Glutamate, which plays a key role in the transamination step in the catabolism and biosynthesis of many amino acids, may also be converted to GABA (Fig. 2). Under N-limiting conditions, this is the preferred pathway for the partitioning of glutamate. α-ketoglutarate provided the C backbone for N assimilation. The C in GABA is diverted to the TCA cycle as succinate with the concurrent transfer of the amine residue to pyruvate to form alanine. These N/C distribution pathways mentioned above (e.g., GABA to succinate and the TCA cycle) play important roles in lipid metabolism. Glycolysis and the TCA cycle are associated with energy metabolism and provide C skeletons for lipid biosynthesis (Fig. 2). Guerra et al. [50] analyzed metabolite and transcript levels of central carbon metabolic pathways and determined the average fluxes and quantum requirements for the synthesis of proteins, carbohydrates, and fatty acids in the diatom P. tricornutum. They revealed that the GS/GSN pathway is the main regulation site for the nitrate-dependent control of C partitioning between protein and lipid biosynthesis, while the α-ketoglutarate/glutamate/glutamine metabolite ratio serves as a transcriptional signal, possibly related to the redox poise of intermediates in the photosynthetic electron transport system. In this study, when N is insufficient, the protein level decreased (Fig. 2b), and excess C was re-distributed between carbohydrates and lipid biosynthesis. Regulated via GS/GSN pathway, C was diverted into lipids in C2 but carbohydrate storage molecules in C3 and C1 (shown in Additional file 3). Moreover, for further confirming the contribution of nitrogen/carbon metabolism to lipid metabolism, the changes in transcription level related to nitrogen metabolism were detected in the model green alga Chlamydomonas with high lipid production. To withstand N starvation and mitigate the drastic drop in protein abundance, the transcription of enzymes involved in GS/GSN and the corresponding transaminase pathways was elevated. After extended periods of N starvation, mRNA levels rising while total enzymatic activity (which reflects protein abundance) declined (Fig. 8).

The limited understanding of the biology of microalgae is a bottleneck for further developing microalgal biofuels [4]. However, advances in sequencing and genome technologies and post-genomics, proteomics, and metabolomics approaches [51] will reveal which regulatory genes in photosynthetic microalgae (e.g., C. reinhardtii) can be manipulated to increase lipid production. Gargouri et al. [52] used a combined omics (transcriptomics, proteomics, and metabolomics) approach to identify several regulatory hubs that control various aspects of cellular metabolism, including N assimilation, central metabolism, photosynthesis, and lipid metabolism, in C. reinhardtii cells shifted from N-replete to N-depleted conditions. As there are neither genome information nor molecular manipulation protocols available in Chlorella, our study, based on the analysis of model green alga C. reinhardtii strain CC4533 and its knock-out mutants deficient in enzymes involved in N assimilation and C metabolism, confirmed that these enzymes contribute to lipid metabolism. Our results indicate that the metabolites and enzymes involved in N assimilation and C metabolism regulate lipid metabolism. Thus, enhancing or restricting the N assimilation pathway or C metabolism via genetic manipulation may increase lipid biosynthesis in microalgae.

Alipanah et al. [16] found that C metabolism was restructured through down-regulation of the Calvin cycle and the coordinated up-regulation of glycolysis, the TCA cycle, and pyruvate metabolism, leading to the funneling of C sources into lipid metabolism. Our metabolic profiling analysis showed that some metabolic pathways related to N/C assimilation and distribution make important contributions to lipid metabolism. It is suggested that not only carbon but also nitrogen assimilation and distribution pathways contribute to lipid biosynthesis. In regular culture condition (N+), N is assimilated into glutamate and glutamine, and then re-distributed to other molecules via amino-transferases system for synthesis of protein or other nitrogen-containing compounds. When N is insufficient, nitrogen-containing compounds especially cell protein content decreased significantly. In response to N starvation, major N salvage from the catabolism of proteins and non-essential amino acids was stored as some essential amino acids and intermediate molecules (particularly proline, alanine, arginine, succinate, and gamma-aminobutyrate) via the corresponding metabolic pathways, such as the glutamate–glutamine pathway, the corresponding transaminase pathway, GABA pathway, and TCA cycle, which led to carbon–nitrogen disequilibrium and made important contributions to lipid metabolism. In addition, nucleic acid catabolism and corresponding distribution pathways also play a role in N salvage when N is insufficient, but it is not the major pathway contributed to the lipid metabolic pathway. Following carbon–nitrogen disequilibrium, excess carbon obtained from photosynthesis or glycolysis was re-distributed into carbon-containing compounds, such as G6P, F6P, PEP, lactate, citrate, BHBA, and leucine, and then diverted into lipid metabolism via the GABA pathway, glycolysis, and the TCA cycle.

Thus, as shown in Fig. 10, we propose a scenario in which a series of metabolic pathways contribute to lipid metabolism. For high lipid-producing algae (e.g., C2), in N flow pathways, N salvaged from amino acid catabolism is assimilated and re-distributed via the glutamate–glutamine pathway and the corresponding transaminase pathways and stored as amino acids and intermediate molecules, including proline, GABA, alanine, arginine, and succinate, via the GABA pathway and the TCA cycle. In C flow pathways, C obtained either from photosynthesis or from glycolysis is re-distributed into C-containing compounds, such as G6P, F6P, PEP, lactate, citrate, BHBA, and leucine, via the GABA pathway and the TCA cycle. Further, as the re-distributed N is converted into N-containing molecules, leading to C/N disequilibrium, the excess C is re-distributed and diverted into storage lipid biosynthesis via the GABA pathway, glycolysis, and the TCA cycle. However, for medium or low lipid-producing algae (e.g., C1 or C3), in N flow pathways, N salvage is derived from nucleotide catabolism, assimilated and re-distributed via the glutamate–glutamine pathway and the corresponding transaminase pathways, and then stored as purine, pyrimidine, and intermediate molecules. In C flow pathways, the excess C obtained either from photosynthesis or from glycolysis is re-distributed and diverted into storage sugar molecules and fatty acids.

The distribution and contribution of nitrogen/carbon metabolism for lipid metabolism pathway. Black words the metabolic pathways which are related to lipid synthesis, gray words the metabolic pathways which are not related to lipid synthesis. Blue arrow N flow pathways, red arrow C flow pathways, green arrow N and C flow pathways. Solid arrow one step of metabolic flow, dotted arrow more than one step of metabolic flow


Bekijk de video: Assimilatie - Fotosynthese in detail (Januari- 2022).