Informatie

Ligatie zonder zuiverende insert


Ik ben van plan een sequentie van 45 bp in een vector in te voegen. Nadat ik mijn inzetstuk heb beperkt om compatibele plakkerige uiteinden te maken, vind ik geen manier om het op te ruimen. Is er een manier om dit fragment na beperking op te schonen of moet ik doorgaan zonder opruimen?


Bedankt allemaal voor jullie reacties jongens. Ik heb geprobeerd te zuiveren met een PCR-zuiveringskit. Ik kon 120 ng gezuiverd fragment terugwinnen van 500 ng. Het is oké voor mijn verdere werk.


DNA-ligatie¶

1 nmol donor-DNA kan onder deze omstandigheden worden geligeerd aan een equivalente hoeveelheid acceptor-DNA, met andere woorden, gebruik KLEINE hoeveelheden fragment en vector (anders blijft er aan het einde van de reactie veel vector over zonder enig fragment)

Dit protocol gaat ervan uit dat alle noodzakelijke behandelingen aan de DNA-fragmenten (bijvoorbeeld: DNA-fragmentisolatie uit LM-agarose, Fill In/Chew Back van DNA-overhangen, Alkalische fosfataseverwijdering van PO4 uit DNA-fragmenten, Kinase-toevoeging van g-fosfaten aan 5'- OHs) inmiddels zijn uitgevoerd en dat de fragmenten klaar zijn om aan elkaar te worden geligeerd.

Na restrictiedigestie en defosforylering (de twee stappen die in dezelfde reactie kunnen worden uitgevoerd, de een na de ander, zonder de noodzaak van zuivering - DNA Fragment Isolation from LM agarose-), kan het gedefosforyleerde fragment (meestal vector) direct worden gebruikt zonder de noodzaak van een zuiveringsstap (dit is met name het geval als de vector alleen gelineariseerd werd door digestie met een enkel restrictie-enzym. Aangezien er slechts één fragment in de reactie is, is het niet nodig om het op gel te zuiveren. Om dit te doen, AP moet door HEAT worden geïnactiveerd (verwijdering van alkalische fosfatase van PO4 uit DNA-fragmenten) voorafgaand aan de ligatiereactie


Kloontruc: ligatie van meerdere inserts

[2013.02.26 Edit: een aantal mensen vinden dit via Google-zoekopdrachten. Ik heb geen bijgewerkte post over het onderwerp, maar als je probeert meerdere DNA-fragmenten samen te stellen, raad ik aan om naar Gibson Assembly te kijken. NEB verkoopt* een doodeenvoudige mastermix, die per reactie een beetje prijzig is (ik maak mijn reacties maar half zo groot) maar te goedkoop uitkomt als je rekening houdt met de arbeidskosten (zolang je PI je tijd waardeert) 8230).]

Ik heb de afgelopen maanden besteed aan het bouwen van een plasmidebibliotheek en daarbij bedacht ik een truc. Ligaties, misschien wel het slechtste deel van klonen, zijn notoir kieskeurige reacties. Het doel is om verschillende stukken lineair DNA te nemen, waarvan de uiteinden slechts op een bepaalde manier kunnen worden verbonden, en vervolgens een enzym (T4 Ligase) te gebruiken om ze allemaal samen te naaien tot één stuk (in mijn geval een cirkelvormig plasmide ).

Figuur 1. Ligase (2HVQ.pdb) weergegeven in PyMOL. Klik om een ​​waardeloze geanimeerde GIF te zien!

Ik moest drie fragmenten tegelijk in een enkele ruggengraat invoegen. In mijn onwetendheid (vanwege mijn gebrek aan ervaring) dacht ik dat het ligeren van vier fragmenten net zo goed zou moeten werken als twee, dus gooide ik ze allemaal bij elkaar en voerde de reactie uit. Het resultaat was een puinhoop, en toen ik daarna 40 verschillende klonen testte, was geen enkele correct. Dus begon ik ze stuk voor stuk toe te voegen, wat natuurlijk drie keer zo lang zou duren.

De volgende ochtend, terwijl ik onder de douche stond (een van de beste plekken voor willekeurige ideeën) dacht ik dat, hoewel het meeste van wat in mijn reageerbuis zat, niet het gewenste product, was er hoogstwaarschijnlijk een kleine populatie die eigenlijk was het juiste fragment. Het probleem was alleen dat ik mijn producten in E coli en dan proberen om het juiste te vinden zou niet werken als slechts 1/100 (of minder!) van de ligatieproducten correct was. Maar PCR is geweldig om kleine hoeveelheden DNA in grote hoeveelheden te maken, dus ik dacht, waarom probeer ik niet gewoon PCR te gebruiken om het juiste uit de puinhoop te halen? Aangezien elk product is gemaakt uit een combinatie van de invoerfragmenten, zouden de lengtes discreet zijn en daarom zichtbaar en mogelijk scheidbaar op een gel. Ik moest gewoon genoeg kunnen kopiëren om het te kunnen zien DNA liep op een gel, en dan kon ik degene met de juiste lengte eruit zuiveren.

Figuur 2. Elk verschillend gekleurd fragment wordt geligeerd in de grijze ruggengraat. De primers (zwarte pijlen) flankeren het gehele inzetstuk.

Ik ontwierp primers die de gecombineerde insert zouden flankeren en deed PCR, en kreeg inderdaad een band van de gewenste lengte! Na gelzuivering kon ik het gehele inzetstuk probleemloos in de ruggengraat afbinden.

Je vraagt ​​je misschien af: 'Is dit nu niet een proces in twee stappen, slechts één minder dan de drie die anders nodig zijn, en dus nauwelijks de moeite waard?' Bijna, behalve dat het niet nodig is om de multi te transformeren -fragment ligatie mengsel. Dus het is meer als 1,5 stappen. Bovendien kunnen de ligatie, PCR, gelzuivering, definitieve ligatie en uiteindelijke transformatie allemaal in één dag worden gedaan!

Hoewel mijn laboratoriumgenoten verrast waren toen dit werkte, bleek ik een jaar te laat om dit idee te publiceren :(. Als je toegang hebt tot Analytische biochemie, zie het artikel van An, Wu en Lv genaamd ''8220A PCR-after-ligation method for cloning of multiple DNA inserts''8220. Als je niet zoveel geluk hebt, heb ik je al alles verteld wat je moet weten!


Volg ons

Recente berichten

Auteursrechtverklaring

© Promega Corporation, 2009–2020.
Alle rechten voorbehouden. Ongeoorloofd gebruik en/of duplicatie van dit materiaal zonder de uitdrukkelijke en schriftelijke toestemming van deze Promega Corporation is ten strengste verboden. Fragmenten en links mogen worden gebruikt, op voorwaarde dat Promega Corporation volledig en duidelijk wordt vermeld met de juiste en specifieke richting voor de originele inhoud. Zie onze algemene voorwaarden voor meer informatie.

Redactioneel beleid

Hoewel we open en eerlijke gesprekken aanmoedigen, behouden we ons het recht voor om opmerkingen die aanstootgevend, obsceen of godslasterlijk taalgebruik bevatten, te bewerken of te verwijderen. We verwijderen ook opmerkingen die wetenschappelijke onwaarheden of desinformatie bevatten of promoten.

Onderscheidingen

X We gebruiken cookies en vergelijkbare technologieën om onze website te laten werken, analyses uit te voeren, onze website te verbeteren en u gepersonaliseerde inhoud en advertenties te tonen. Sommige van deze cookies zijn essentieel om onze website te laten werken. Voor anderen stellen we ze niet in, tenzij u ze accepteert. Voor meer informatie over onze benadering van privacy nodigen we u uit om Lees meer

Door op "Alles accepteren" te klikken, stemt u in met het gebruik van ALLE cookies. U kunt echter de Cookie-instellingen bezoeken om een ​​gecontroleerde toestemming te geven.

Privacyoverzicht

We gebruiken cookies en vergelijkbare technologieën om onze website te laten werken, analyses uit te voeren, onze website te verbeteren en u gepersonaliseerde inhoud en advertenties te tonen. Sommige van deze cookies zijn essentieel om onze website te laten werken. Voor anderen stellen we ze niet in, tenzij u ze accepteert. Lees ons Cookiebeleid voor meer informatie over cookies en hoe u cookies kunt beheren.

Als u zich in de EER, het Verenigd Koninkrijk of Zwitserland bevindt, kunt u uw instellingen op elk moment wijzigen door op Cookietoestemming beheren te klikken in de voettekst van onze website.


T4 DNA-ligase

Bacteriofaag T4 DNA-ligase is een enkelvoudig polypeptide met een M.W van 68.000 Dalton waarvoor ATP als energiebron nodig is. Het maximale pH-bereik voor activiteit is 7,5-8,0. Het enzym vertoont 40% van zijn activiteit bij pH 6,9 en 65% bij pH 8,3. De aanwezigheid van Mg++-ionen is vereist en de optimale concentratie is 10 mM.

T4-DNA-ligase heeft het unieke vermogen om kleverige en stompe fragmenten samen te voegen. Cohesieve eindligatie wordt uitgevoerd bij 12°C tot 16°C om een ​​goede balans te behouden tussen het uitgloeien van de uiteinden en de activiteit van het enzym. Als de reactie op hogere temperaturen wordt ingesteld, wordt het uitgloeien van de uiteinden moeilijk, terwijl lagere temperaturen de ligase-activiteit verminderen. Alle T4-DNA-ligase wordt geïnactiveerd door gedurende 10 minuten op 65°C te verwarmen. Naast deze ligerende complementaire kleverige uiteinden, kan T4-ligase elke twee stompe DNA-uiteinden ligeren. Gebrek aan samenhangende uiteinden maakt ligatie van stompe uiteinden complexer en aanzienlijk langzamer. Aangezien het gloeien van de uiteinden geen factor is, wordt de reactie uitgevoerd bij 24˚C. Er is echter 10 - 100 keer meer enzym nodig om een ​​vergelijkbare ligatie-efficiëntie te bereiken als die van cohesieve eindligatie. Het enzym is betrokken geweest bij de katalyse van de verbinding van RNA met ofwel een RNA- ofwel een DNA-streng in een duplexmolecuul, maar dit is niet betrokken bij de samenvoeging van enkelstrengige nucleïnezuren.


Gerelateerde producten

Takara Bio USA, Inc.
Verenigde Staten/Canada: +1.800.662.2566 &stier Azië-Pacific: +1.650.919.7300 &stier Europa: +33.(0)1.3904.6880 &stier Japan: +81.(0)77.565.6999
UITSLUITEND VOOR ONDERZOEK. NIET VOOR GEBRUIK IN DIAGNOSTISCHE PROCEDURES. &kopie 2021 Takara Bio Inc. Alle rechten voorbehouden. Alle handelsmerken zijn eigendom van Takara Bio Inc. of haar dochteronderneming(en) in de VS en/of andere landen of hun respectievelijke eigenaren. Bepaalde handelsmerken zijn mogelijk niet in alle rechtsgebieden geregistreerd. Aanvullende informatie over producten, intellectueel eigendom en beperkt gebruik is beschikbaar op Takarabio.com.

Takara Bio Europe is lid van de Takara Bio Group, een toonaangevend life sciences bedrijf dat zich inzet voor het verbeteren van de menselijke conditie door middel van biotechnologie. Via onze merken Takara, Clontech en Cellartis is het onze missie om innovatieve tools en diensten van hoge kwaliteit te ontwikkelen om ontdekking te versnellen.


Afkortingen

cDNA, complementair DNA CDS, coderende sequentie GO, genontologie GSEA, analyse van genensetverrijking HA, hemagglutinine IP, immunoprecipitatie mTOR, zoogdierdoelwit van rapamycine NES, genormaliseerde verrijkingsscore OPC, oligodendrocytprecursorcel ORF, open leeskader PBS, fosfaatgebufferd zoutoplossing PCR, polymerasekettingreactie qPCR, kwantitatieve PCR RT, omgekeerde transcriptie TE, translatie-efficiëntie TOP, terminale oligopyrimidine uORF, stroomopwaarts open leesraam UTR, onvertaald gebied


Waarom zou ik stomp klonen willen gebruiken?

Stel je voor dat je een PCR-product wilt klonen dat aan de uiteinden en binnen de sequentie veel gebruikelijke restrictie-endonucleaseplaatsen voor kleverige uiteinden bevat, zoals EcoRI of HindIII. Het zou een uitdaging zijn om gedeeltelijke verteringen uit te voeren die de plakkerige overhangen genereren zonder ook uw PCR-product te versnipperen (zie figuur 1.). (LET OP: dit is alleen waar als je een DNA-polymerase gebruikt dat een proefleesfunctie heeft, zoals Pfu. Daarover verderop meer in de discussie over hoe stomp klonen werkt).

Figuur 1: de aanwezigheid van restrictieplaatsen in de insert maakt het een uitdaging om te verteren en te klonen in de MCS van de vector.

Overweeg een ander scenario, u wilt fragmenten van genomisch DNA klonen nadat u de uiteinden fysiek hebt afgeknipt en gerepareerd. Je zou kunnen verwachten dat die uiteinden willekeurig zijn in nucleotidesequentie en dat ze variëren in het aantal nucleotiden aan elk uiteinde en van fragment tot fragment. Het zou moeilijk, zo niet onmogelijk zijn om deze in de multikloneringsplaats van een vector te kloneren (zie figuur 2). Na reparatie van het uiteinde zouden echter alle uiteinden afgestompt zijn en compatibel zijn met een gelineariseerde vector met een stomp uiteinde.

Figuur 2: Willekeurig geknipte DAN-fragmenten zijn allemaal compatibel met ligaties met stompe uiteinden

Hoe het ook zij, het belangrijkste voordeel van klonen met stompe uiteinden is de universaliteit van stompe uiteinden, terwijl bij het klonen van kleverige fragmenten rekening moet worden gehouden met de complementariteit van de overhangende sequenties.


Wees voorzichtig bij het ontwerpen van plasmide-primers voor het klonen van genen

Op basis van de bovenstaande afbeelding kun je zien dat als de restrictieplaats van een enzym zich in je gen van interesse bevindt, je dat restrictie-enzym niet kunt gebruiken omdat je je gen zult knippen. Je gaat dit gen ook in een nieuw plasmide stoppen. Zorg ervoor dat het restrictie-enzym dat u gebruikt compatibel is met de '8220multiple cloning site' binnen dit nieuwe plasmide. Als je dit gen op willekeurige plaatsen inbrengt, wordt de kans dat dit plasmide in de bacteriën wordt ingebouwd of uitgebreid, aanzienlijk kleiner.

Kijk naar de afbeelding hieronder om deze tips te begrijpen:


Restrictie-ligatie-vrij (RLF) klonen: een high-throughput kloneringsmethode door in vivo homologe recombinatie van PCR-producten

In deze studie hebben we een restrictie-ligatievrije (RLF) methode geoptimaliseerd om tijd en kosten te besparen bij het construeren van meerdere plasmiden met hetzelfde gen-insert, en hebben we de werkzaamheid van RLF op multi-plasmide klonen met hoge doorvoer onderzocht. Deze methode maakt gebruik van de precieze DNA-reparatie- en recombinatiesystemen binnen Escherichia coli, waardoor de in vitro restrictie- en ligatie-enzymreacties die gewoonlijk worden opgenomen in routinematige kloonprocedures, kunnen worden omzeild. Een homologe arm is gekoppeld aan het 5'-uiteinde van de voorwaartse primer die wordt gebruikt om zowel het doelgen als de vector te amplificeren. Een andere homologe arm is gekoppeld aan het 5'-uiteinde van de reverse primer. Daarom kunnen genen in de vectoren worden gekloneerd door homologe recombinatie na co-transformatie van het geamplificeerde doelgen en de gelineariseerde vector, die aan beide uiteinden dezelfde homologe arm dragen. Met deze methode werden meer dan vierentwintig verschillende plasmiden gegenereerd, waarbij gebruik werd gemaakt van twee eenvoudige polymerasekettingreactiestappen. Deze methode is zeer efficiënt in het klonen van elk gen van belang in elke vector op elke plaats zonder sequentiebeperkingen, aangezien er geen restrictie- en ligatiereacties vereist zijn.


Beperking Klonen Tips

Voor veel toepassingen is conventioneel restrictief klonen nog steeds de beste methode. Een paar eenvoudige trucs helpen ervoor te zorgen dat het klonen soepel verloopt.

  1. Wees eerst en vooral voorzichtig bij elke stap van een procedure. Deze aanpak bespaart op de lange termijn tijd.
  2. Zorg ervoor dat het DNA heel schoon is. Begin met ongeveer 2 g DNA bij het voorbereiden van een vector of het uitsnijden van een in te voegen fragment.
  3. Zuiver na elke enzymatische reactie het DNA met een spinkolom. Elueer het DNA in 40-45 ul van 10 mM Tris (pH 8,5), en voer vervolgens de volgende reactie uit. (Het is niet nodig om een ​​spinkolom te gebruiken voordat een DNA-fragment met een gel wordt gezuiverd.)
  4. Om de efficiëntie te maximaliseren, minimaliseert u het aantal stappen in een procedure. Het werkt bijvoorbeeld beter om een ​​fragment met een stomp uiteinde te klonen in een stompe vectorplaats, zoals een SmaI-plaats, dan in een plaats die stomp is gemaakt met Klenow- of T4-DNA-polymerase.
  5. Zuiver bij twijfel een DNA-fragment met een gel. Schoner uitgangsmateriaal geeft een beter resultaat.

Het meest voorkomende probleem bij restrictieklonen is dat de startvector na de procedure wordt teruggewonnen. Dit probleem heeft twee oorzaken: onvolledige vertering van de vector en herligatie van de gesneden vector met zichzelf. De hieronder beschreven trucs zullen deze effecten minimaliseren.

    Zorg ervoor dat de vertering van de vector tot voltooiing komt. Gebruik een overmaat restrictie-enzym (

20 U voor 2 μg DNA), en verteren voor

Zorg er met de vector voor dat de verterings- en fosfatasereacties tot een goed einde komen. Vortex de mengsels grondig en herhaaldelijk en laat geen druppeltjes vloeistof ontsnappen aan de enzymbehandeling. Het is een goed idee om na het vortexen kort te draaien om ervoor te zorgen dat er geen druppels aan de zijkant van de buis achterblijven.

Het ingevoegde fragment voorbereiden

  1. Voor de bereiding van een ingevoegd fragment is onvolledige vertering geen ernstig probleem, omdat gedeeltelijke terugwinning van het fragment acceptabel is. Je kunt relatief korte verteringstijden gebruiken en voor een dubbele digestie kun je een reactiebuffer gebruiken die niet optimaal is voor een of beide enzymen.
  2. Zuiver het ingevoegde fragment met een gel. Naast het verwijderen van ongewenst of onvolledig verteerd DNA, verwijdert deze procedure enzymen en kleine moleculen. Gebruik bij het visualiseren van DNA-banden met een transilluminator geen UV-licht met een korte golflengte van 312 nm of minder, omdat het DNA ernstig wordt beschadigd. Gebruik in plaats daarvan 360-365 nm UV-licht.
  3. Als het ingevoegde fragment door PCR is gegenereerd, zuivert u het met een gel of spinkolom voordat u restrictiedigesten uitvoert. Als u van plan bent een PCR-fragment met stompe uiteinden (gegenereerd met een polymerase zoals Pfu) in een met fosfatase behandelde vector te klonen, zorg er dan voor dat uw PCR-primers 5′-fosfaten bevatten.

Ligatie en transformatie

  1. Voer met een met fosfatase behandelde vector een controleligatie uit waarin het ingevoegde fragment wordt weggelaten. Deze controleligatie zou zeer weinig transformanten moeten opleveren omdat alleen circulaire DNA-moleculen transformeren E coli efficiënt, en recircularisatie van de vector kan niet plaatsvinden zonder ligatie aan een gefosforyleerd fragment.
  2. Als het DNA alleen plakkerige uiteinden heeft, ligateer dan bij kamertemperatuur voor


Bekijk de video: HAL Hemorrhoidal Artery Ligation (November 2021).