Informatie

Verzadigde mutagenese screening


Ik hoop de actieve plaats te muteren van het enzym dat ik onderzoek en dat 5 residuen heeft in de buurt van het substraat. Ik vraag me af hoeveel kolonies ik moet beoordelen om theoretisch alle mogelijke combinaties van mutanten te kunnen bemonsteren?

Ik vermoed dat alleen het screenen van het aantal mogelijke combinaties niet erg succesvol zal zijn omdat ik waarschijnlijk een bepaalde mutant meer dan eens zal bemonsteren?

Ik heb gekeken naar 'NNK verzadigde mutagenese' die de redundantie in de genetische code gebruikt om alle residucoderingen te kunnen maken waarbij N = A/G/C/T en K = G/T, terwijl het aantal herhaalde residuen wordt beperkt van synonieme codons.

Zijn er andere manieren om dit soort mutagenese uit te voeren met betere codoncompressie?


Dit soort methode is inderdaad heel nuttig en wordt vaak gebruikt in de synthetische biologie: ik heb eerder een vergelijkbare benadering gebruikt om 5'-isolatoren voor promotors te genereren.

Het berekenen van de exacte theoretische waarschijnlijkheid van wat je wilt, voor zover ik begrijp, is een complexe combinatorische vergelijking waar ik met een paar minuten werk geen mooie gesloten vorm op kon krijgen. Voor uw doeleinden verwacht ik echter dat een redelijke schatting ook goed zal zijn, en dat kan veel gemakkelijker worden gemaakt door de populatie van elke combinatie te modelleren als een onafhankelijke reeks vooringenomen muntopgooien, d.w.z. een binominale verdeling.

Overweeg een situatie met: $n$ mogelijke combinaties waarmee u probeert te dekken $k$ willekeurige mutanten. Als we ons concentreren op een bepaalde combinatie, kunnen we zien dat elke willekeurige mutant een $frac{1}{n}$ kans om die combinatie te raken. De hele set van mutanten is dus een reeks van $k$ bevooroordeelde coinflips, met een waarschijnlijkheid $p_0 = (1-frac{1}{n})^k$ om geen mutanten te krijgen die die combinatie raken. Dit betekent dat de kans $p_c$ dat de combinatie gedekt is, is $p_c = 1-p_0$, uit te breiden naar: $$p_c = 1-(1-frac{1}{n})^k$$

Met een groot aantal mogelijke combinaties en een groot aantal mutanten kunnen we een redelijke benadering maken door elke combinatie als onafhankelijk te behandelen. In dit geval is de kans dat alle combinaties gedekt zijn, is het product van de kansen dat elke combinatie afzonderlijk gedekt is. Ze zijn niet echt onafhankelijk: elke combinatie die wordt gedekt, doet enigszins af aan het vermogen van andere combinaties om te worden gedekt. Een schatting op basis van een onafhankelijkheidsveronderstelling is dus een overschatting van de werkelijke kans, en hoe hoger dat $k$ is hoe dichter de schatting bij de exacte kans moet liggen. Kortom: $$p_{all} < (1-(1-frac{1}{n})^k)^n$$

Dit ruikt naar het soort vergelijking waar een mooie identiteit voor zou moeten zijn, maar ik ken de identiteit niet, dus ik zal een paar voorbeelden geven om ermee te rekenen:

  • NNK = 32 combinaties, 50 mutanten (n=32, k=50): $p_{all}$ < 0.07%
  • NNK = 32 combinaties, 100 mutanten (n=32, k=100): $p_{all}$ < 25.5%
  • NNK = 32 combinaties, 200 mutanten (n=32, k=200): $p_{all}$ < 94.6%

Zoals u kunt zien, is er een scherpe overgang naarmate het aantal dekkingen toeneemt.

Belangrijk voorbehoud: de theoretische waarde geeft je misschien niet wat je wilt. In het artikel dat ik hierboven heb gelinkt, gebruikten we twee gedegenereerde primers met 18 N basen om 36 bp willekeurig materiaal te injecteren, wat betekent dat we $ 4,7x10^{21}$ mogelijke combinaties en had nooit een herhaling mogen zien --- behalve dat sequencing aantoonde dat we inderdaad meerdere herhalingen kregen uit slechts een paar honderd kolonies. Vooroordelen in de biologie kunnen er dus toe leiden dat uw statistieken afwijken van wat de theorie suggereert.


CyberDope werd eerst geschreven aan het MIT, dan weer bij Kairos, dan weer door mij (privé) in Mathematica. Het programma geeft de beste "dopes" voor een doelset van aminozuren. Je hebt iemand nodig die Mathematica heeft om dit programma in ".nb"-formaat te bekijken en uit te voeren. Ik zou verder willen voorstellen dat ze het programma upgraden naar Mathematica versie 12. Ik heb zojuist een kopie geüpload naar de Wolfram-cloud (openbaar):

CyberDope

De originele publicatie is:

Arkin en Youvan

Twintig jaar geleden bevond het werk zich in dit stadium:

https://www.researchgate.net/publication/228715857_Directed_evolution_and_solid_phase_enzyme_screening

Als je gewoon een goede dope wilt "eyeballen", kijk dan naar deze figuur, omcirkel de gewenste aminozuurresten en kijk dan naar de drie nucleotide-assen:

(Dat komt uit het artikel over de genetische code van Wikipedia)


Het OP heeft ook te maken met combinatorische complexiteit. Dus misschien willen ze naar deze figuur kijken als ze mutageen zijn op de tweede positie van het codon. Nogmaals, van Wikipedia (genetische code)


Enzym-engineering: een synthetische-biologische benadering voor een effectievere bibliotheekgeneratie en geautomatiseerde screening met hoge doorvoer

Affiliaties Département de Chimie, Université de Montréal, Montréal, QC, Canada, Centre for Green Chemistry and Catalysis (CGCC), Université de Montréal, Montréal, QC, Canada, PROTEO, The Québec Network for Research on Protein Function, Engineering and Applications, Quebec, QC, Canada

Affiliations Centre for Green Chemistry and Catalysis (CGCC), Université de Montréal, Montréal, QC, Canada, PROTEO, The Québec Network for Research on Protein Function, Engineering and Applications, Québec, QC, Canada, Département de Biochimie, Université de Montréal, Montreal, QC, Canada

Affiliatie DSM Nutritional Products, 101 Research Drive, Dartmouth, NS, Canada

Affiliaties Département de Chimie, Université de Montréal, Montréal, QC, Canada, Centre for Green Chemistry and Catalysis (CGCC), Université de Montréal, Montréal, QC, Canada, PROTEO, The Québec Network for Research on Protein Function, Engineering and Applications, Québec, QC, Canada, Département de Biochimie, Université de Montréal, Montréal, QC, Canada


Samenvatting

Een uitgebreide mutantpopulatie is een basisbron voor het onderzoeken van de genfunctie. We ontwikkelden een isogene 'mutatiebibliotheek' van tomaten in de genetische achtergrond van de inteeltvariëteit M82. In totaal 13 000 M2 families, afgeleid van EMS (ethylmethaansulfonaat) en snelle neutronenmutagenese, werden visueel gefenotypeerd in het veld en gecategoriseerd in een morfologische catalogus die 15 primaire en 48 secundaire categorieën omvat. Momenteel zijn er 3417 mutaties gecatalogiseerd, waaronder de meeste van de eerder beschreven fenotypes uit de monogene mutantcollectie van The Tomato Genetics Resource Center, en meer dan duizend nieuwe mutanten, met meerdere allelen per locus. De fenotypische database geeft aan dat de meeste mutaties in meer dan een enkele categorie vallen (pleiotroop), waarbij sommige organen zoals bladeren meer vatbaar zijn voor veranderingen dan andere. Alle gegevens en afbeeldingen kunnen worden doorzocht en geopend in het Solanaceae Genome Network (SGN) op een site genaamd 'The Genes That Make Tomatoes' (http://zamir.sgn.cornell.edu/mutants/).


Referenties

Ahloowalia B., Maluszynski M. (2001) Geïnduceerde mutaties - Een nieuw paradigma in plantenveredeling. Euphytica 118: 167-173.

Auld D., Ethridge M., Dever J., Dotray P. (1998) Chemische mutagenese als een hulpmiddel bij het verbeteren van katoen, Proceedings of the Beltwide Cotton Conferences (VS), Memphis, TN. blz. 550-552.

Auld D., Heikkinen M., Erickson D., Sernyk J., Romero J. (1992) Raapzaadmutanten met verminderde niveaus van meervoudig onverzadigde vetzuren en verhoogde niveaus van oliezuur. Gewaswetenschap 32:657-662.

Bibikova M., Beumer K., Trautman JK, Carroll D. (2003) Verbetering van gentargeting met ontworpen zinkvingernucleasen. Wetenschap 300:764.

Brunner H., Keppl H. (1991) Door straling geïnduceerde appelmutanten met verbeterde commerciële waarde, Proc Plant Mutation Breeding for Crop Improvement, Internl Symp, IAEA en Food Agric Org van de VN, Wenen. blz. 547-552.

Chakrabarti S. (1995) Mutatieveredeling in India met bijzondere aandacht voor PNR-rijstvariëteiten. TIJDSCHRIFT VAN KERNENLANDBOUW EN BIOLOGIE 24:73-82.

De Vries H. (1909) De mutatietheorie, Open Court Pub. Co., Chicago.

Drake JW, Charlesworth B., Charlesworth D., Crow JF (1998) Tarieven van spontane mutatie. Genetica 148:1667-1686.

Fernández-Martínez JM, Mancha M., Osorio J., Garcés R. (1997) Zonnebloemmutant met hoge niveaus van palmitinezuur in een hoge oliezuurachtergrond. Euphytica 97:113-116.

Harten AM (1998) Mutatieveredeling: theorie en praktische toepassingen. Cambridge University Press.

Hartwell L., Hood L., Goldberg M.L., Reynolds A.E., Silver L., Veres R.C. (2008) Genetics'160: van genen tot genomen. 3 ed. McGraw-Hill, New York.

Hensz R. (1991) Mutatieveredeling van grapefruit (Citrus paradisi Macf.), Proc Plant Mutation Breeding for Crop Improvement, IAEA, Wenen. blz. 533-536.

Hohmann U., Jacobs G., Jung C. (2005) Een EMS-mutageneseprotocol voor suikerbieten en isolatie van niet-uitschietende mutanten. Plantenveredeling 124:317-321.

GezamenlijkeFAO/IAEA. (2011) Database van mutante variëteiten en genetische voorraden.

Lapade A. (1995) Genetische verbetering van de koninginnevariëteit ananas door middel van geïnduceerde mutatie en in vitro kweektechnieken, Proc Plant Mutation Breeding for Crop Improvement, IAEA, Wenen. blz. 145-146.

Luria SE, Delbrück M. (1943) Mutaties van bacteriën van virusgevoeligheid voor virusresistentie. Genetica 28:491.

Maruyama K., Araki H., Kato H. (1991) Thermogevoelige genetische mannelijke steriliteit geïnduceerd door bestraling. Agribookstore/Winrock.

Masuda T., Yoshioka T., Inoue K., Murata K., Kitagawa K., Tabira H., Yoshida A., Kotobuki K., Sanada T. (1997) Selectie van mutanten die resistent zijn tegen zwarte vlekziekte door chronische bestraling van gammastraling in Japanse peer [Pyrus pyrifolia]" Osanijisseiki". Journal of the Japanese Society for Horticultural Science (Japan).

McCallum CM, Comai L., Greene EA, Henikoff S. (2000) Targeting van geïnduceerde lokale laesies in genomen (TILLING) voor functionele genomica van planten. Plantenfysiologie 123:439.

McClintock B. (1948) Veranderlijke loci in maïs. Carnegie Inst. Washington Jaarboek 47:155-169.

Muller H. (1928) De productie van mutaties door röntgenstralen. Proceedings van de National Academy of Sciences van de Verenigde Staten van Amerika 14:714.

Muller HJ (1927) Kunstmatige transmutatie van het gen. Wetenschap 66:84.

Rowland G. (1991) Een EMS-geïnduceerde laag-linoleenzuur-mutant in McGregor-vlas (Linum usitatissimum L.). Can J Plant Sci 71:393-396.

Stadler L. (1928) Mutaties in gerst veroorzaakt door röntgenstralen en radium. Wetenschap (New York, NY) 68: 186.

Stadler L. (1930) De frequentie van mutatie van specifieke genen in maïs. Anatomisch record 47:381.

Tonnemaker K., Auld D., Thill D., Mallory-Smith C., Erickson D. (1992) Ontwikkeling van sulfonylureumresistent raapzaad met behulp van chemische mutagenese. Gewaswetenschap 32:1387-1391.


3. Doelgeselecteerde mutagenese

Target-geselecteerde mutagenese wordt gebruikt om mutaties in een specifiek gen van een willekeurig gemutageniseerd genoom te identificeren. De benadering omvat standaard mutagenese met behulp van bijvoorbeeld EMS of UV/TMP, gevolgd door screening met behulp van de polymerasekettingreactie (PCR) of een andere methode om dieren te identificeren die laesies dragen in het gen van belang.

Twee gemeenschapsconsortia, de C. elegans Knockout Consortium (celeganskoconsortium.omrf.org), en de C. elegans National Bioresource Project of Japan (NBRP, http://www.shigen.nig.ac.jp/c.elegans/mutants/index.jsp) gebruiken momenteel doelgeselecteerde mutagenese om mutante allelen te identificeren voor elk gen in de C. elegans genoom ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012). Samen zijn meer dan 6.700 deletie- of nul-allelen geïsoleerd door deze groepen en beschikbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012). Stammen van de C. elegans Knockout Consortium zijn verkrijgbaar bij de Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http://www.cbs.umn.edu/research/resources/cgc) onder de allelaanduiding Oke of gk. Stammen gegenereerd door de NBRP, met allelaanduiding tm , zijn beschikbaar na indiening van een Materials Transfer Agreement (Mitani, 2009). Deletiestammen worden vermeld op Wormbase, die eerst moet worden geraadpleegd om te bepalen of er al een allel beschikbaar is voor een gen van belang. Zo niet, dan kan men een verwijderingsstam aanvragen bij het Consortium. Na ontvangst van een stam moet deze worden gekruist om irrelevante mutaties te verwijderen. Het is altijd belangrijk om de aanwezigheid van de mutatie in een stam te verifiëren. Bovendien kunnen deletiemutaties verkregen door doelselectie gepaard gaan met proximale duplicaties, wat resulteert in obligate heterozygositeit voor het gen in kwestie. In deze situaties onthult fenotypische beoordeling van de mutante stam mogelijk niet de defecten die gepaard gaan met volledig genverlies. Om te bevestigen dat een gen van belang verantwoordelijk is voor een waargenomen defect, moeten transgene reddingsexperimenten worden uitgevoerd en/of moeten meerdere allelen worden onderzocht ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012). Naast het verzamelen van deleties heeft het Million Mutations Project (http://genome.sfu.ca/mmp/) meer dan 800.000 single nucleotide polymorphisms (SNP's) en meer dan 16.000 indels in meer dan 20.000 genen geïdentificeerd ( C. elegans Deletion Mutant Consortium, 2012 Thompson et al., 2013). Hoewel sommige van deze SNP's de genfunctie niet beïnvloeden, kunnen vele nuttige structuur-functiegegevens opleveren.

3.1. Target-geselecteerde mutagenese met behulp van PCR

Het doel van target-geselecteerde mutagenese is het genereren van een bibliotheek met pools van gemutageniseerde dieren die kunnen worden gescreend op specifieke DNA-laesies. Deletie-allelen zijn gemakkelijker te identificeren met behulp van PCR dan puntmutaties, dus UV/TMP en EMS zijn de mutagenen die de voorkeur hebben (Lesa, 2006). Voor bibliotheekconstructie worden 600.000 hermafrodieten willekeurig gemutageniseerd. Zodra de gemutageniseerde dieren zwanger zijn geworden, worden ze gebleekt en mogen L1's 's nachts uitkomen in M9. De L1's worden vervolgens onderverdeeld in 1.152 subculturen (55 mm NGM-platen) van elk 500 dieren. Na twee generaties zelfbevruchting wordt 20% van de dieren per plaat afgespoeld voor genomische DNA-isolatie in twaalf platen met 96 putjes (Lesa, 2006). De overige dieren worden maximaal zes weken bij 15°C bewaard. Hoewel bibliotheken kunnen worden ingevroren, zijn bibliotheken van levende dieren minder vatbaar voor fouten bij het herstel van mutanten (Lesa, 2006).

Er worden gewoonlijk drie benaderingen gebruikt om te zoeken naar deleties in een gen van belang: beperkte PCR-omstandigheden, gifprimers en thermostabiele restrictie-enzymen. Elke benadering maakt gebruik van geneste PCR-primers die zijn ontworpen om de genomische sequentie van belang te flankeren om de specificiteit te verhogen, en elke methode geeft de voorkeur aan amplificatie van deletieproducten boven grotere wildtype producten (Edgley et al., 2002 Jansen et al., 1997 Wei et al., 2002 Zwaal et al., 1993). Al deze methoden zijn vatbaar voor hoge percentages valse positieven (50%-90%), daarom moet elk gepoold monster in tweevoud worden gescreend (Jansen et al., 1997). Een uitgebreid protocol voor het maken van bibliotheken en de Poison Primer PCR-techniek is beschikbaar in het hoofdstuk Reverse genetics in WormBook.

3.1.1. Beperkte PCR-verlengingstijd (Jansen et al., 1997)

Elke bibliotheekpool wordt eerst geïncubeerd met een primerpaar (10 pmol per primer) dat 2,5-3,5 kb uit elkaar is ontworpen over een interessegebied, gevolgd door incubatie van een 1:500 verdunning van de eerste PCR met een genest primerpaar (Liu et al. ., 1999). Na toevoeging van polymerase, nucleotiden en buffer worden monsters gecycleerd met korte verlengingstijden (45 s tot 1 min) om accumulatie van het deletieproduct te bevorderen (Jansen et al., 1997). DNA-polymerasen hebben specifieke omzetsnelheden (maximaal aantal nucleotiden dat in een bepaalde tijd wordt gepolymeriseerd), die variëren afhankelijk van het type Taq dat wordt gebruikt (Kornberg en Baker, 1992). Als het wildtype (WT) product bijvoorbeeld 2 kb is, het deletieproduct 500 bp is en het Taq-polymerase een omzetsnelheid van 1 kb/min heeft, zijn er ongeveer twee minuten nodig om de WT-reactie te voltooien en 30 sec voor het verwijderingsproduct. Als de verlengingstijd beperkt is tot 45 s, wordt alleen het deletieproduct versterkt. Gedurende vele rondes wordt een of ander WT-product versterkt, maar in een veel langzamer tempo dan de verwijdering. Dit verhoogt de kans om het minder overvloedige deletie-allel te detecteren aanzienlijk. Gedetecteerde deleties variëren in omvang en zijn gemiddeld ongeveer 1,4 kb groot (Liu et al., 1999). Voltooide reacties worden uitgevoerd op een agarosegel en pools die een product hebben dat kleiner is dan het wildtype product worden geïdentificeerd. Bibliotheekdieren uit deze pool worden ofwel afzonderlijk ofwel in kleinere pools uitgeplaat en opnieuw getest om enkele hermafrodieten te identificeren die de relevante laesie dragen (Jansen et al., 1997).

3.1.2. Poison primer-methode (Edgley et al., 2002)

Deze benadering is ontwikkeld om te verrijken voor deleties die kleiner zijn dan 500 bp (Edgley et al., 2002). Het protocol is vergelijkbaar met dat voor de beperkte PCR-verlengingstijdmethode, behalve dat een derde primer wordt toegevoegd tussen de externe primers van de eerste PCR (Figuur 3). Deze gifprimer is ontworpen om alleen te amplificeren van wildtype genomisch DNA, dat concurreert met het wildtype product van volledige lengte, waardoor de hoeveelheid wildtype template die beschikbaar is voor de tweede PCR wordt verminderd. De tweede set geneste primers is alleen in staat om het verwijderde product en het wildtype product van volledige lengte te binden, waarvan de totale concentratie is gehalveerd vanwege het gifprimerproduct. Dit leidt tot een 500-voudige toename van de gevoeligheid door de verhouding van deletie tot wildtype producten te verbeteren. Het gebruik van een korte verlengingstijd (45 s) vergemakkelijkt ook de synthese van het deletieproduct. Omdat de gifprimer de locatie van geamplificeerde deletieproducten bepaalt, is het meestal het beste om het 5'8217-uiteinde van een gen te targeten om nul-allelen te genereren (Edgley et al., 2002).

Figuur 3. Poison primer methode voor het opsporen van deleties. Deze techniek verrijkt zeldzaam, verwijderd DNA ten opzichte van het meer overvloedige wildtype product van volledige lengte. Primers a, b en p worden in de eerste PCR gebruikt om een ​​wildtype-template, een mutant-template en een ‘poison'8217-template te genereren. In de tweede PCR worden deze producten gebruikt als template met primers a’ en b’ om het signaal van het verwijderde product te verhogen. Zonder de gifprimer domineert het product van volledige lengte de PCR-reactie en is het deletieproduct onder de detectielimiet. Wanneer de gifprimer wordt opgenomen, wordt de totale amplificatie over de volledige lengte verminderd en wordt het deletieproduct onthuld.

3.1.3. Thermostabiele restrictie-enzymen (Huang et al., 2006 Wei et al., 2002)

In deze minder vaak gebruikte methode worden sequenties in een doelgen geïdentificeerd die een thermostabiele restrictie-enzymherkenningsplaats hebben in het interval dat wordt overspannen door de primerparen (Wei et al., 2002). Deze enzymen zijn stabiel bij hoge temperaturen, waardoor ze ideaal zijn voor gebruik met PCR. Gepoold genomisch DNA wordt 2 uur vóór PCR gedigereerd om genomisch DNA te splitsen en de hoeveelheid beschikbare wildtype-template te verminderen. De enzymen worden ook opgenomen tijdens de PCR-amplificaties om elk wildtype product continu te splitsen. Er worden twee sets geneste primers gebruikt. Gerichte deletiesequenties missen de restrictie-enzymplaats en worden niet gesplitst, waardoor de gevoeligheid van de reactie toeneemt (Wei et al., 2002). Met deze methode zijn deleties gevonden van 330 bp tot 1,7 kb (Huang et al., 2006 Wei et al., 2002). Gevalideerde thermostabiele restrictie-enzymen omvatten: Psp GI, Tli L, Bst gebruikersinterface, Aap KI, en tsp 45I (Huang et al., 2006 Wei et al., 2002).

3.2. BEWERKEN

TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) maakt de identificatie mogelijk van puntmutaties en kleine indels in een gen van belang (McCallum et al., 2000). Oorspronkelijk ontwikkeld in Arabidopsis thaliana , TILLING gebruikt een enkelstrengs DNA-nuclease om de locatie van mismatches te bepalen na hybridisatie van een gemuteerd genoom met een niet-gemuteerd genoom (Colbert et al., 2001 Till et al., 2003). Hoewel deze methode slechts één keer is gebruikt om puntmutaties te isoleren in een gen van belang in C. elegans , het is meer gebruikt in andere organismen. Mutaties in een populatie van C. elegans worden gegenereerd met behulp van EMS of ENU (Gilchrist et al., 2006). PCR gericht op een gen van belang wordt uitgevoerd op genomisch DNA dat is afgeleid van vele pools van dieren (Figuur 4). Primers zijn gelabeld met verschillende fluoroforen, waardoor de 5'8217 en 3'8217 uiteinden van het product met verschillende kleuren worden gemarkeerd. Na PCR wordt het DNA in elke reactie gedenatureerd. Opnieuw annealen maakt vervolgens heteroduplexvorming tussen wildtype en mutant DNA mogelijk. Opnieuw geanneald DNA wordt geïncubeerd met een enkelstrengs DNA-nuclease, CEL1, afgeleid van extract van selderijsap (CJE) (Till et al., 2004). CJE knipt heteroduplex-DNA waar een mismatch of indel een enkelstrengs uitstulping creëert. Monsters worden uitgevoerd op denaturerende LI-COR-gels en de gels worden onderzocht in beide fluorescerende kanalen om te bepalen in welke pool een mismatch optreedt (Gilchrist et al., 2006). In een screening op tien genen (variërend van 788 bp tot 9,1 kb groot) werden 71 mutaties geïdentificeerd. Hiervan bestond 59% uit missense allelen en 3% waren nonsens allelen (Gilchrist et al., 2006).

Figuur 4. TILLING maakt identificatie van puntmutaties in pools van gemuteerd DNA mogelijk. Zowel gemuteerd DNA als wildtype DNA worden onderworpen aan PCR, met behulp van differentieel gelabelde 5'8217 en 3'8217 primers (hier in groen en rood). De PCR-producten worden langzaam gedenatureerd en opnieuw gehybridiseerd, zodat zich heteroduplex-DNA vormt tussen een gemuteerde DNA-streng en een wildtype DNA-streng. De opnieuw geannealde PCR-producten worden behandeld met Cel1, een enzym dat specifiek heteroduplex-DNA klieft. De reactie wordt gevisualiseerd op een LI-COR-gel in twee fluorescentiekanalen. Wanneer heteroduplex-DNA wordt geknipt, worden kleinere DNA-fragmenten gezien in zowel de groene als de rode kanalen binnen dezelfde baan. Ongesneden product van volledige lengte zal prominent aanwezig zijn aan de bovenkant van de gel.

Individuele gemutageniseerde F1-dieren worden afzonderlijk uitgeplaat op 1500 gezaaide NGM-platen. Nadat de voedselvoorraad is verbruikt, wordt de helft van de dieren ingevroren bij 󔽘°C. De andere helft wordt gebruikt om individueel genomisch DNA te genereren in platen met 96 putjes. Om het aantal PCR-reacties te verminderen, worden acht F1-DNA-monsters samengevoegd voor analyse. Zodra een positieve pool is geïdentificeerd, worden DNA-genoommonsters afzonderlijk getest om te bepalen van welke plaat het monster oorspronkelijk afkomstig is. PCR-primers zijn ontworpen over een gebied van 1,5 kb en omvatten voornamelijk exonische gebieden. Primers kunnen worden ontworpen met behulp van het programma CODDLE om te selecteren op regio's met een hoog G/C-gehalte, die het meest vatbaar zijn voor mutatie door EMS (Gilchrist et al., 2006).

3.3. G4 DNA-geïnduceerde deletiemutagenese

De consensussequentie G3+N1-7G3+N1-7G3+ N1-7G3+ plooien in vitro om een ​​guanine quadruplex (G4) structuur te vormen die replicatie kan blokkeren in vivo (Kruisselbrink et al., 2008). Het FANCJ-eiwit (DOG-1 in C. elegans ) is een DNA-helicase die nodig is voor een goede replicatie van dergelijke guanine-rijke traktaten (Kruisselbrink et al., 2008). In hond-1 mutanten, zijn deze traktaten vatbaar voor 5'8217 deleties. Er zijn meer dan 2.900 guanine quadruplex-sites in de C. elegans genoom, geannoteerd in Wormbase onder '8220G4 Motif'8221 in GBrowse, en meer dan 1.600 genen bevinden zich op 5'8217 van een G4-site (Pontier et al., 2009). Van de tien genen die in één onderzoek werden getest, werden 11 deletie-allelen gegenereerd, waarvan de meeste tot enkele kilobasen stroomopwaarts van de beoogde G4-site waren (Pontier et al., 2009). Deze methode is een keer gebruikt om deletie-allelen te genereren (Pontier et al., 2009).

hond-1(pk2247) mutanten worden op individuele NGM-platen geplukt en mogen groeien totdat er geen OP50 op de plaat achterblijft (Pontier et al., 2009). De helft van de dieren op elke plaat wordt afgespoeld met M9 voor isolatie van genomisch DNA. Voorafgaand aan DNA-isolatie worden de dieren in twee groepen gesplitst. Als een deletie in slechts één van de monsters aanwezig is, is deze waarschijnlijk het gevolg van een somatische gebeurtenis. Als in beide monsters echter een deletie wordt gedetecteerd, is dit hoogstwaarschijnlijk een erfelijke mutatie (Pontier et al., 2009). Deleties worden gescreend met behulp van een van de hierboven beschreven PCR-protocollen. Na isolatie wordt de stam gekruist met wildtype dieren om de hond-1 mutatie en eventuele off-target deleties.


Abstract

Verzadigingsmutagenesesondes definiëren secties van de enorme eiwitsequentieruimte. Maar zelfs als randomisatie op deze manier wordt beperkt, is het probleem van combinatorische getallen ernstig. Omdat diversiteit op codonniveau wordt gecreëerd, is codonredundantie een cruciale factor die de noodzakelijke inspanning voor bibliotheekscreening bepaalt. Bovendien, vanwege de probabilistische aard van het bemonsteringsproces, is oversampling vereist om de volledigheid van de bibliotheek te garanderen, evenals een hoge waarschijnlijkheid om alle unieke varianten tegen te komen. Onze truc maakt gebruik van een speciaal mengsel van drie primers, waardoor een degeneratie ontstaat van 22 unieke codons die coderen voor de 20 canonieke aminozuren. Daarom wordt de codonredundantie en de daaropvolgende screeninginspanning significant verminderd, en wordt een evenwichtige verdeling van codons per aminozuur bereikt, zoals als voorbeeld wordt aangetoond voor een bibliotheek van cyclohexanonmono-oxygenase. We laten zien dat deze strategie geschikt is voor elke methode van verzadigingsmutagenese om minder redundante bibliotheken te genereren.


Materialen en methodes

Plasmiden en DNA-analyse

Het lentivirale vectorplasmide pSIN-EGFP met een EGFP gen, IRES en Puromycine gen werd gegenereerd uit pSIN-EF2-Lin28-Puro (Addgene-plasmide #16580) met behulp van EcoRI- en BamHI-restrictie-enzymplaatsen. SaCas9-plasmide was een geschenk van Feng Zhang (Addgene-plasmide #61591) VPR-expressieplasmide (GP230) en mCherry-reporterplasmide (ZP30) waren geschenken van Dr. Yang, Hui (Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS). CRISPR-Cas9-plasmiden werden geconstrueerd zoals online beschreven (//www.genome-engineering.org/crispr/). De oligonucleotidesequenties voor sgRNA-constructie zijn samengevat in S2-tabel. Plasmide-DNA en genomisch DNA werden met standaardtechnieken geïsoleerd. De DNA-sequencing bevestigde de gewenste specifieke sequentie in de constructen.

Cellen en celcultuur

HEK-293-cellen werden verkregen van ATCC (CAT # CRL-1573) en gekweekt bij 37 ° C in 5% CO2 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (Life Technologies, Carlsbad, CA), 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum, penicilline/streptomycine. HEK-293 cellen die tot expressie brengen EGFP werden eerder beschreven [29]. Geneesmiddelresistente enkele kolonies van getransduceerde HEK-293-cellen werden geïsoleerd en 293-SC1 genoemd. Om EGFP-expressie te behouden, omvat het medium voor 293-SC1-cultuur puromycine.

Bouw van SaCas9-bibliotheek

De bibliotheek werd gegenereerd door foutgevoelige PCR (primerssequentie in S1-tabel). In het bijzonder werd plasmide (pX601) dat de voor SaCas9 coderende sequentie herbergde, gedigereerd met respectievelijk AgeI/HindIII of HindIII/BamHI. De AgeI/HindIII- of HindIII/BamHI-fragmenten werden gemuteerd door middel van willekeurige mutagenesekit (CAT#101005, TIANDZ) en vervolgens gezuiverd, infusie met gelineariseerde pX601-ruggengraat zonder het overeenkomstige fragment. De individuele kolonies van de LB-plaat werden vervolgens handmatig geplukt. De plasmiden van individuele kolonies werden geïsoleerd. De concentratie van elk plasmide werd aangepast als 100 ng/μL.

Gerichte diepe sequencing

Off-target-sites (S1-tabel) werden voorspeld door Cas-OFFinder-software [40] en off-target-sites met minder dan 5 niet-overeenkomende nucleotiden werden gescreend. Bovendien zijn de off-target sites van OT1 en OT2 voor EMX1_1 werden gemeld [5]. Off-target sites voor chr2:156.968.467-156.968.493, DLGAP2, en DUS2 werden door een algoritme gescreend op minder dan 2 niet-overeenkomende nucleotiden in het hele genoom. Gerichte diepe sequencing-experimenten werden uitgevoerd met WT SaCas9 en Mut268 voor verschillende loci op het menselijk genoom. In het kort werden 1,8 x 105 HEK-293-cellen getransfecteerd met 750 ng alles-in-één expressieplasmiden. Tweeënzeventig uur na transfectie werd genomisch DNA geëxtraheerd met behulp van standaard fenol/chloroform-extractieprotocollen. Voor de constructie van de NGS-bibliotheek werd de primaire PCR uitgevoerd om 100 tot 230 bp on/off-target sites te amplificeren van ongeveer 60 ng genomisch DNA met behulp van Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme Biotech Co., Ltd). De secundaire amplificatie was om streepjescodes, index- en adaptersequenties in de primaire PCR-producten te fixeren (S2-tabel). Amplificatieproducten werden gezuiverd (Thermo Fisher Scientific) en samengevoegd tot één buis. Na het verwijderen van adapters en reads van lage kwaliteit, werden paired-end reads samengevoegd en vervolgens toegewezen aan de sjabloon. Base-substitutie en in/del werden geanalyseerd met behulp van open-source "CRISPResso"-software (versie 1.0.10) met een leeskwaliteit boven Q30 [41].

PEM-seq voor SaCas9

Het protocol is eerder beschreven [42]. Specifiek werden 3,2 μg pX601-plasmiden getransfecteerd in HEK-293-cellen in schalen van 6 cm. Cellen werden 48 uur na transfectie geoogst, gevolgd door de standaard PEM-seq-procedure. Hiseq-lezingen werden verwerkt door de "SuperQ" -pijplijn en off-target hotspots werden geïdentificeerd door "MACS2" oproeppieken modus. De MACS2-resultaten werden verder gefilterd om sites met minder dan 2 knooppunten en geen op de doellocatie gelijkende volgorde te verwijderen door "Bedtools" en "Needle".

T7EI-test voor genbewerking

In het kort, 293-SC1 werd op dag 0 uitgeplaat met een dichtheid van 1,8 x 105 cellen per putje in een plaat met 12 putjes en getransfecteerd met 750 ng CRISPR-SaCas9-sgRNA-plasmiden met Turbofect op dag 1. Vers medium werd toegevoegd aan de getransfecteerde 293-SC1-cellen op dag 2. Cellen werden geoogst op dag 3. Voor T7EI-assay werden 150 ng gezuiverde PCR-producten gemengd met 1,5 L 10x NEB#2-buffer en ultrapuur water tot een eindvolume van 14,5 L en werden onderworpen aan hergloeiproces om heteroduplexvorming mogelijk te maken. Na opnieuw gloeien werden producten gedurende 45 minuten behandeld met 0, 5 μL T7 Endonuclease I.

Transcriptionele activeringstest

De ChIP-seq-test werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [7]. Voor de fluorescentiereportertest werden 1,0 x 105 HEK-293-cellen van elk putje (platen met 24 putjes) op dag 0 gezaaid. Op dag 1 werd elk putje getransfecteerd met 375 ng dCas9-VPR-plasmide, 150 ng plasmide met sgRNA en 250 ng miniCMV-mCherry-plasmide. Vers medium werd op dag 2 aan de getransfecteerde cellen toegevoegd. Cellen werden op dag 3 geoogst voor FCM.

Western blotting

HEK-293-cellen werden op dag 0 uitgeplaat met een dichtheid van 5,0 x 105 cellen per putje in een plaat met 6 putjes en getransfecteerd met 1,5 μg-plasmiden (pX601, Mut268 en efSaCas9) via TurboFect-transfectiereagens op dag 1. Vers medium werd na 12 uur toegevoegd. Cellen werden op dag 3 geoogst. Eiwitten werden na kwantificering op SDS-PAGE geanalyseerd. Membranen werden geblot met antilichamen gericht tegen de volgende eiwitten: HA (Mouse-1F5C6, Proteintech Cat#66006-2-Ig, 1:2500 verdunning) en β-Actin (Mouse-8H10D10, Cell Signaling Technology Cat#3700, 1:1000 ). Een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (Goat, Abcam Cat#ab97023, 1:5.000) werd gebruikt voor chemiluminescentiedetectie.


De American Heart Association beveelt aan te streven naar een voedingspatroon dat 5% tot 6% van de calorieën uit verzadigd vet haalt.

Als je bijvoorbeeld ongeveer 2.000 calorieën per dag nodig hebt, mogen er niet meer dan 120 uit verzadigd vet komen.

Dat is ongeveer 13 gram verzadigd vet per dag.

Wat zijn verzadigde vetten?

Vanuit chemisch oogpunt zijn verzadigde vetten gewoon vetmoleculen die geen dubbele bindingen tussen koolstofmoleculen hebben omdat ze verzadigd zijn met waterstofmoleculen. Verzadigde vetten zijn typisch vast bij kamertemperatuur.

Hoe beïnvloeden verzadigde vetten mijn gezondheid?

Het vervangen van voedingsmiddelen met een hoog gehalte aan verzadigd vet door gezondere opties kan het cholesterolgehalte in het bloed verlagen en het lipidenprofiel verbeteren

Welke voedingsmiddelen bevatten verzadigd vet?

Verzadigde vetten komen van nature voor in veel voedingsmiddelen. Het merendeel is voornamelijk afkomstig van dierlijke bronnen, waaronder vlees en zuivelproducten.

Voorbeelden van voedingsmiddelen met verzadigd vet zijn:

  • vet rundvlees,
  • lam,
  • varkensvlees,
  • gevogelte met huid,
  • rundervet (talk),
  • reuzel en room,
  • boter,
  • kaas en
  • andere zuivelproducten gemaakt van volle of magere melk (2 procent).

Bovendien kunnen veel gebak en gefrituurd voedsel een hoog gehalte aan verzadigde vetten bevatten. Sommige plantaardige oliën, zoals palmolie, palmpitolie en kokosolie, bevatten ook voornamelijk verzadigde vetten, maar geen cholesterol.

Wat zijn alternatieven om verzadigde vetten te vervangen in het voedsel dat ik eet?

Kies mager vlees en gevogelte zonder vel en bereid ze zonder toegevoegde verzadigde en trans vet.

U dient voedingsmiddelen met een hoog gehalte aan verzadigde vetten te vervangen door voedingsmiddelen met een hoog gehalte aan enkelvoudig onverzadigde en/of meervoudig onverzadigde vetten. Dit betekent het eten van voedsel dat is gemaakt met vloeibare plantaardige olie, maar niet met tropische oliën. Het betekent ook het eten van vis en noten. U kunt ook proberen een deel van het vlees dat u eet te vervangen door bonen of peulvruchten.

Er is veel tegenstrijdige informatie over verzadigde vetten. Moet ik ze eten of niet?

De American Heart Association beveelt aan om verzadigde vetten en ndash die worden aangetroffen in boter, kaas, rood vlees en ander dierlijk voedsel te beperken. Decennia van gedegen wetenschap heeft bewezen dat het je cholesterol kan verhogen en je een hoger risico op hartaandoeningen kan geven.

Het belangrijkste om te onthouden is het algemene voedingsbeeld. Verzadigde vetten zijn slechts een stukje van de puzzel. Over het algemeen kun je fout gaan door meer fruit, groenten, volle granen en minder calorieën te eten.

Als je hoort over het nieuwste "dieet van de dag" of een nieuwe of vreemd klinkende theorie over voedsel, overweeg dan de bron. De American Heart Association doet alleen voedingsaanbevelingen na zorgvuldige overweging van het laatste wetenschappelijke bewijs.

Geschreven door de redactie van de American Heart Association en beoordeeld door adviseurs op het gebied van wetenschap en geneeskunde. Zie ons redactionele beleid en onze medewerkers.


Resultaten

Onderdrukking meten door staande variatie

We wilden mutatie-effecten testen in segregante nakomelingen van verschillende gistisolaten uit verschillende geografische locaties en bronnen ("wilde gisten") (Liti et al, 2009 Bergström et al, 2014). Om dit te doen, gebruikten we de Synthetic Genetic Array-benadering (Tong et al, 2001) om een ​​verzameling van 1.106 temperatuurgevoelige allelen (“TS-allelen”) van 580 essentiële zoekgenen in de laboratoriumstam S288C (Costanzo et al, 2016) tot 10 stabiele haploïde wilde gisten (Fig 1A) (Cubillos et al, 2009 ), evenals in de S288C-besturing als referentie. We isoleerden poelen van

60.000 segregante nakomelingen die het TS-allel dragen om populaties van haploïde individuen te verkrijgen met genomen die, met uitzondering van de genomische regio's rond het TS-allel en selectiemarkers, een mozaïek zijn van de referentie en wilde ouders (Fig 1B, Methoden). We groeiden de segregantpools bij tolerante (26°C) en restrictieve (34°C) temperaturen en maten hun fitheid. In the control cross with S288C, no segregants are expected to grow at the restrictive temperature due to temperature sensitivity of the TS allele. However, in cases where the wild yeast strain harbours variants that can suppress the TS phenotype, the haploid segregants that carry them will be able to grow at the restrictive temperature and will take over the population (Fig 1B).

Figure 1. Experimental overview

  1. Strains used in the study. Seven wine / European strains, and three other distant ones (all blue) were crossed to the S288C reference (yellow).
  2. Strategy for identifying suppression by standing variation. A temperature sensitive (TS) allele collection of

1,100 partial loss-of-function mutants in the reference background (yellow) was crossed to the 10 wild yeast strains with potential suppressor alleles (blue), to produce large segregant populations selected to carry the TS allele. Each cross was performed in one or two biological and four technical replicates. The fitness of the resulting

Data information: Panel (A) adapted from Liti et al ( 2009 ).

We first measured the growth defect of each TS allele in complex pools of wild yeast strain cross progeny (Dataset EV1, Appendix Fig S1). We estimated suppression as normalised log2-scale growth difference between the wild and reference strain crosses at the restrictive temperature and considered a TS allele phenotype suppressed, if this value was above 0.75, i.e. the wild strain segregants had a 1.68-fold improvement in growth, and if this was unlikely due to chance (Bonferroni-corrected P = 0.04, Methods, Dataset EV2).

Our screen included several positive control crosses that were expected to show suppression. Three of the wild strains harbour a chrVIII-chrXVI reciprocal translocation (Pérez-Ortín et al, 2002 Fig EV1A). Crossing these strains to the reference strain results in 25% of the progeny carrying a duplication of a substantial part of the left arm of chromosome XVI (Fig EV1B). This creates an extra copy of the essential query genes in this region that complements the TS allele. Reassuringly, we confirmed that this extra copy suppressed 35 out of 53 TS alleles in the duplicated region on average, while segregant progeny from the other wild strains suppressed a median of two (Fig 2A). Further, the extra copy of chromosome VIII carried by the NCYC110 strain resulted in a similar pattern of suppression (Fig EV2A–C).

Figure EV1. Suppression by a translocation between chrVIII and chrXVI

  • A. Three of the strains used in our screens carried a translocation between the promoter regions of ECM34, located at the left arm of chrVIII, and SSU1, located at the left arm of chrXVI (Pérez-Ortín et al,2002 ).
  • B. Crossing S228C to one of the strains carrying the translocation will result in 25% spore lethality, due to the absence of a large part of the left arm of chrXVI, which is essential for viability. Of the viable spores, one third will carry the S288C chromosome arrangement, one third will carry the arrangement of the translocated strain, and one third will carry the S288C version of chrXVI, combined with the rearranged chromosome that carries the chrVIII centromere. This last combination of chromosomes will lead to the presence of two copies of a large part of the left arm of chrXVI.
  • C, D. A second copy of part of the left arm of chrXVI can suppress the TS phenotype of TS alleles located on this part of chrXVI. FAS2 (YPL231W) en DIM1 (YPL266W) are located on the translocated left arm of chrXVI. (C) Population sequencing read depth of haploid progeny carrying a fas2-ts allele, isolated from a cross between a S228C fas2-ts mutant and a DBVPG1373 wild-type strain, at either 26 or 34°C. Part of the left arm of chrXVI is present at increased copy number in the population at 26°C, due to the lethality of spores lacking the chromosome arm. At 34°C, selection occurs for cells carrying two copies of this chromosomal fragment, because in addition to carrying the TS allele, they will also carry a wild-type copy of FAS2 that is inherited from DBVPG1373. (D) Tetrad dissection of a cross between a S288C dim1-ts mutant and a YJM978 wild-type strain. Cells carrying both a dim1-ts en een DIM1 wild-type allele have increased fitness compared to mutants carrying only a dim1-ts allel.

Figure 2. The extent of genetic suppression of essential gene mutants by standing variation

  1. A positive control region shows suppression signal. Average suppression score (ja-axis) for TS alleles of query genes located on the left arm of chromosome XVI (TS allele index, sorted by chromosome coordinates, x-axis) across strains with a translocation that generates a duplication of the shaded area (blue markers), and strains without the translocation (grey markers). Stippellijn: ja = 0.75 (suppression cut-off in screen).
  2. Genotype and phenotype trees are concordant. Top: Hierarchical clustering (UPGMA) of the ten wild strains used in this study based on sharing segregating sites. Colours: global genetic cluster membership. Bottom: as top, but based on correlation distance between genetic suppression profiles. Strain abbreviations as in Fig 1A, with in addition: NC = NCYC110, UW = UWOPS87-2421, and 27 = 273614N.
  3. About a third of suppressed alleles can be explained by a deficiency in the reference strain that is not present in the majority of wild strains. The frequency (ja-axis) of the number of wild strains that suppress a TS allele (x-axis) for the 187 alleles that could be suppressed by at least one strain, using a more lenient criterion (suppression > 0.5 no z-score cut-off) to avoid edge effects and winner’s curse.
  4. Genetic suppression is consistent across different TS alleles of the same gene. Suppression score (colour scale) in crosses to different wild strains (x-axis) for TS alleles (ja-axis) of GAB1 en NSE4 genen.
  5. Genetic suppression is consistent across genes encoding members of the same complex. Strongest suppression score across TS alleles for a gene (colour scale, as in (D)) in crosses to different wild strains (x-axis) for genes (ja-axis) that encode members of the GPI-anchor trans-amidase complex (bottom) or the nuclear condensin complex (top). De GPI16 gene suppression was not estimated in the NCYC110 strain due to chromosome II copy-number variation (“X”).

Figure EV2. Aneuploidies and suppression validation

  • A, B. The NCYC110 strain that was used in our screen carried aneuploidies of chromosomes II and VIII. Chromosome VIII is highlighted as an example. Crossing S228C to NCYC110 will result in 50% of the progeny carrying one copy of chrVIII, and 50% of the progeny carrying two copies of chrVIII. Of the progeny carrying one copy of chrVIII, one third will carry the S288C chromosome and two thirds the NCYC110 chromosome. Of the progeny carrying two copies of chrVIII, one third will carry two NCYC110 chromosomes, and two thirds will carry one S288C and one NCYC110 version of chrVIII. We note that recombination can occur between the S288C and NCYC110 chromosomes.
  • C, D. A second copy of a chromosome can suppress the TS phenotype of TS alleles located on this chromosome. (C) For each TS allele located on chrVIII, the suppression scores are plotted for haploid progeny of a cross to NCYC110 (blue) or other wild isolates (grey). (D) Shown are the relative sequencing read depth per chromosome of populations of haploid progeny isolated from a cross of NCYC110 to TS alleles located on either chrII (yellow) or chrVIII (blue). Cells carrying a TS allele on chrVIII have substantially higher coverage of this chromosome compared to query genes located on chrII. Note that aneuploidy of chromosome II is lost in the absence of positive selection, suggesting that it is detrimental in the population.
  • E. Screen and individual colony scores are concordant. Screen suppression score (x-axis log2-scale growth ratio between wild strain and reference crosses at 34°C Methods) and individual colony count difference (ja-axis log2-scale colony count ratio in the wild strain cross between 26 and 34°C minus log2-scale colony count ratio in the reference cross between 26 and 34°C). Marker size: individual colony count at permissive temperature (smaller markers for fewer colonies) marker type: “x” for TS strains with low temperature sensitivity in the control cross (colony count ratio between 26 and 34°C below 2) “o” for the rest marker colour: blue for crosses with visually confirmed suppression yellow for unconfirmed. Note that visual confirmations also include cases of increased colony size, not solely increased colony number (Dataset EV3). Dashed grey line: the cut-off used for calling suppression in the screen.

Also beyond these large genomic determinants, suppression of fitness defects by standing variation in the species was relatively common. Excluding the copy-number suppression events discussed above, 192 of 1,106 TS alleles (17%) and 149 of the 580 tested genes (26%) were suppressed in segregant progeny from at least one genetic background, and on average progeny from a wild strain cross could suppress 37 essential gene mutant alleles (3%). Due to variation in temperature sensitivity, different TS alleles of the same gene are not necessarily expected to show suppression at the same temperature. Nevertheless, if a TS allele was suppressed in segregant progeny from a wild strain, the strongest suppression of another TS allele of the same gene in segregants of the same wild strain was on average substantially higher than expected by chance (0.61 vs 0.39, Appendix Fig S2).

To further validate the suppression events identified in our screen, we tested a selection of 102 suppression effects of variable strength by examining the fitness of hundreds of single colony progeny from individual crosses. As the progeny of most crosses showed high variation in colony size, which was also influenced by the number of colonies on the plate, we used stringent thresholds for identifying suppression (Methods). We observed good concordance of strong effects between the phenotypes of the population in the initial screen and the individual progeny in this assay (62% of crosses with suppression scores above 0.75 in the screen show suppression in the individual colony assay, 16% for crosses with a suppression score below 0.75, Fig EV2E, Dataset EV3).

Thus, we found that suppression by standing genetic variation is relatively common and that the identified suppression events can often be validated by additional TS alleles or in complementary assays.

Patterns of suppression

Next, we asked whether segregant progeny from genetically similar wild strains were more likely to suppress the same TS alleles compared to more diverse wild strains. Indeed, suppression patterns were more distinct for the two wild strains genetically furthest from the wine/European cluster (maximum Pearson’s R to any other wild strain for NCYC110, UWOPS87-2421 less than 0.52, and between 0.64 and 0.77 for the rest) and were consistent with the genetic relatedness otherwise (Fig 2B). The DBVPG1106 wine strain was a phenotypic outlier of Wine/European strains due to overall poor growth at the restrictive temperature (0% of TS allele crosses with log2-scale colony size of more than 10.5 across all crosses at least 11% for all other strains, Appendix Fig S1). When using different wild strains as the phenotypic reference to call suppression, the total number of suppressed TS alleles was lower compared to S288C, but their relative frequency across strains was similar (Appendix Fig S3). This suppression pattern is consistent with the reference strain acquiring additional loss-of-function mutations in the laboratory that can be suppressed by crossing to the wild strains, as well as the presence of additional suppression events that are linked to distances in both genetic and phenotypic trees.

The patterns of suppression of the same TS allele or gene in the various wild strain crosses were diverse. In 31% of the cases, the TS allele is possibly temperature-sensitive only in the reference background, with suppression in segregant progeny of most of the tested wild strains (61 of 192 TS alleles with suppression at a lower 0.5 threshold, e.g. TS alleles of GAB1, Fig 2C and D). For other TS alleles, suppression was generally limited to a single wild strain (e.g. TS alleles of NSE4, Fig 2D). Suppression was also shared across genes with related function. For example, Gab1 is a member of the GPI-anchor trans-amidase complex, mutations to three screened members of which were strongly suppressed (Fig 2E), and the GPI8 gene with less suppression was likely carrying the suppressor variant (see below). Again, we also observed suppression in specific backgrounds, e.g. mutations to genes in the nuclear condensin complex were suppressed almost exclusively in the UWOPS87-2421 background (Fig 2E). In general, we observed consistent suppression patterns between genes encoding members of the same protein complex most frequently (18% of protein complexes with average between-gene suppression correlation higher than permuted controls, Methods), followed by KEGG pathways (15%) broad functional categories (10%), cellular locations (10%) and Gene Ontology categories (3%). This concordance is consistent with the nature of connectedness within genetic networks in general, where many interactions are shared within complexes, compared to broader functional connections. Finally, we tested whether loss-of-function mutations have accumulated in essential genes in the wild strains that suppress TS alleles of the gene in S288C, but found limited signal (0.14 deleterious mutations in suppressed genes 0.16 in others).

Mapping of genomic regions involved in suppression

Given frequent, strong and technically and biologically consistent suppression of TS alleles by variants from wild genetic backgrounds, we next sought to identify the causal loci and genes. First, to estimate the average number of modifiers involved in the suppression phenotype, we dissected meiotic progeny of 16 crosses and examined the growth of spores carrying the TS allele at 26 and 34°C. In all cases, 15–65% of the spores grew well at the restrictive temperature, with little additional phenotypic variation in growth beyond survival, suggesting that most of the detected suppression phenotypes are the result of at most 1–3 strong modifier variants in the wild strain background (Fig EV3, Discussion).

Figure EV3. Estimating the number of strong modifiers

TS alleles were crossed to the wild strain in which they were suppressed, and the resulting hybrid strains were dissected at 26°C. The first 12 spores carrying the TS allele were selected from the dissection plate and were grown overnight in liquid media. Cultures were diluted to an optical density at 600 nm of 0.1 and a series of tenfold dilutions was spotted on agar plates and incubated for 2 days at 26°C or 34°C. The number of strong modifiers was estimated by determining the fraction of the spores that grew well at 34°C.

To map the suppressor loci, we performed bulk segregant analysis on 38 segregating TS allele populations at both 26°C (TS allele functional) and 34°C (TS allele loss-of-function, Fig 1B) (Liti & Louis, 2012 ). We sequenced the populations and compared variant allele frequencies between the two temperatures (Datasets EV4 and EV5). We first considered positive controls expected to involve suppression by an additional, wild-type copy of the query gene described above, either generated by the chrVIII-chrXVI translocation (six samples) or located on an aneuploid chromosome (six samples). In all 12 cases, we could indeed observe selection for either the translocation or the aneuploidy and further confirmed that suppression occurred by the presence of a second, wild-type allele of the query gene (Figs EV1C and D, and EV2D).

Figure EV4. Suppressor identification

To validate the suppressor candidates, we replaced the suppressor gene reference alleles with their wild version in the reference strain background and tested for suppression of the corresponding TS allele. Cultures of the indicated strains were grown until saturation, and a series of tenfold dilutions was spotted on YPD agar plates and incubated at the indicated temperatures. See Fig 5A for the suppression of nse3-ts4 door NSE1-UWOPS872421.

Figure EV5. De NSE1 allele of UWOPS87-2421 can suppress NSE3 en NSE4 TS mutants, but not deletion mutants

  1. Suppression of the DNA damage sensitivity of nse3-ts4 en nse4-ts4 TS mutants by the NSE1 allele of UWOPS87-2421. Cultures of the indicated strains were diluted to an optical density at 600 nm of 0.1 and a series of tenfold dilutions was spotted on agar plates and incubated for 2–3 days at 30°C. UW = UWOPS87-2421, WT = wild type.
  2. De NSE1-UW allele cannot suppress the lethality associated with deletion alleles of genes encoding SMC5/6 complex members. Spot dilutions were performed as described in (A).
  3. Smc6-FLAG levels are not affected by mutations in NSE1, NSE3, of NSE4. Western blot analysis of Smc6-FLAG in the indicated strains. Ponceau staining was used as a loading control.

Second, we sequenced meiotic progeny of nine crosses that showed weak “suppression” in our screen (suppression score below 0.7), unrelated to any known translocations or aneuploidies. Five cases showed selection for newly acquired aneuploidies of either the chromosome carrying the query gene or other loci selected in the crossing protocol. These cases often represent ways of cells to escape the strong selection applied in our protocol, rather than true cases of suppression. The remaining four cases harboured regions of selection for the wild strain sequence specific to high temperature (Datasets EV4 and EV5), suggesting that some of the weaker scores in our screen also represent true cases of suppression and corroborating the observations from the confirmation of individual suppression effects.

Third, we analysed 17 crosses that showed strong suppression in our screen (suppression score above 0.75). The large majority (14) showed regions of specific selection for the wild sequence at high temperature (Fig 3A, Datasets EV4 and EV5), whereas two populations diploidised or showed selection for an aneuploidy. The one remaining cross did not show any suppressor loci or aneuploidies. Thus, we could map suppressor loci for 14/17 (82%) of the crosses that showed strong suppression in our screen, and in 4/9 (44%) of the crosses that showed weak suppression.

Figure 3. Mapping suppressor loci by sequencing segregant pools

  1. Example of the mapping results. Wild allele frequency in progeny of a cross of the gab1-1 temperature-sensitive allele to the YJM975 strain (ja-axis) along the yeast genome (x-axis) at the permissive 26°C (blue) and restrictive 34°C (TS allele loss-of-function, cyan). The allele frequency change between the two temperatures is used in mapping. Labels: selected loci in the cross. Blue regions: called suppressor loci.
  2. Suppressors are plentiful. The average number of suppressor loci per cross (ja-axis) at a given allele frequency change cut-off (x-axis) with either the wild allele beneficial (blue) or the reference allele beneficial (yellow). Vertical line at an allele frequency change of 0.2: the cut-off used for calling suppressor loci.
  3. Suppressors are reproducible across TS alleles. Allele frequency change of suppressor loci in crosses using different TS alleles of the same gene (x- en ja-axis) crossed with the same wild strain. Colours: gene and wild strain combinations.
  4. Suppressors are reproducible across wild strains. Allele frequency change of suppressor loci at 34°C in crosses using the same TS allele and a different wild strain (x- en ja-as). Colours: TS alleles.

The landscape of suppressors is diverse. We identified 31 suppressor loci in the 19 crosses without aneuploidies (1.6 on average, Figs 3B and 4A, Dataset EV5) and an additional 48 weaker reproducible signals (2.5 on average, Figs 3B and 4A, Dataset EV5). This number of modifier loci is in agreement with our estimates based on segregation patterns observed after tetrad dissection (Fig EV3). Most of the suppressor loci (27/31) were selected for the wild strain sequence, consistent with the additional variation in the species providing the substrate for circumventing essential gene function. Reassuringly, suppressor loci were reproducible across biological replicates, different TS alleles of the same gene when crossed to the same wild strain (e.g. RPN11), and same TS alleles when crossed to different wild strains (TFG1 en GAB1 Figs 3C and D, and 4A). A suppressor locus on chromosome XIV was shared across five different essential genes (GPI13, MED7, RPN11, SEC24 en TFG1), indicating the presence of a pleiotropic modifier in this locus, co-localising with the previously characterised MKT1 gene (Steinmetz et al, 2002 ).

Figure 4. Identifying and validating suppressor candidates

  1. Mapping results for segregant pools involving the indicated TS alleles and wild strains. The change in S288C allele frequency between the meiotic progeny isolated at 26°C and 34°C is plotted by genomic coordinate. Causal suppressor genes are indicated for regions that show selection for the wild strain sequence. Genes in brackets have not been validated experimentally.
  2. Comparison of the change in reference allele frequency, either for suppressor loci for which a causal suppressor gene was validated (N = 17), or for loci for which we were unable to validate a suppressor gene (N = 10). Loci for which all experiments failed due to technical reasons were excluded from the analysis. Statistical significance was determined using a two-tailed Mann–Whitney’s U-test (**P < 0.005). Boxes: first, second, and third quartiles whiskers: 1.5 interquartile range away from the first and third quartiles.
  3. A cartoon of the TORC2 signalling pathway, highlighting suppression of a TORC2 mutant (tsc11) by mutations in ORM2.
  4. Suppressor prediction within the chromosome XV QTL of rpn11 TS mutants. The functional information prioritisation score (ja-axis) for genes in the suppressor region (x-axis) identified RPT4 en RPN8 as the two highest-scoring suppressor candidates.
  5. Experimental validation of RPN8 as the causal suppressor of the rpn11-8 TS mutant. Cultures of the indicated strains were diluted to an optical density at 600 nm of 0.1 and a series of tenfold dilutions was spotted on agar plates and incubated for 2–3 days at 34°C. UWOPS = UWOPS87-2421. See also Fig EV4.

Suppressor gene identification and validation

We next sought to identify the causal suppressor genes. As each of the mapped regions harbours tens of plausible candidates, we computationally prioritised them based on their functional connection to the query gene (Dataset EV6, Methods, van Leeuwen et al, 2020 ). We also included known general modifiers, such as MKT1 en HAP1, that each affects the expression of thousands of genes (Fay, 2013 Albert et al, 2014 , 2018 Parts et al, 2014 ). To test the phenotypic consequence of the candidate genes, we replaced their open reading frame and

100–400 bp surrounding region with the wild version in the reference strain background and tested for suppression of the corresponding TS allele. In total, we tested 50 suppressor gene candidates from 31 mapped loci of various strength (Dataset EV7, Fig EV4) and identified causal genes for 17 loci (55%, Dataset EV7, Figs 4A and EV4), validating both our mapping strategy, as well as the computational prioritisation. The 14 suppressor loci without a confirmed suppressor gene resulted from failed experiments, inconclusive results, or cases in which no suppression was observed for the wild allele (Dataset EV7). Causal suppressor genes were more likely to be identified for strong suppressor loci compared to weaker signals, suggesting that in unconfirmed cases the suppression phenotype may have been too weak to detect in our validation assay (Fig 4B).

Many of the validated suppressor genes were consistent with their known roles in the biology of the query gene. For example, two different TS alleles of TSC11, which encodes a subunit of TOR complex 2 (TORC2) that activates a phosphorylation cascade controlling sphingolipid biosynthesis, were suppressed by multiple variants present in the DBVPG1373 strain (Fig 4A). The two strongest suppressor loci were located around MSS4 en ORM2, which encode an upstream activator and a member of the TORC2 signalling pathway, respectively (Han et al, 2010 Lucena et al, 2018 Fig 4A and C). Indeed, we confirmed the suppression of tsc11-5 temperature sensitivity by the ORM2-DBVPG1373 allele (Fig EV4). Orm2 inhibits the first committed step in sphingolipid synthesis, and loss of Orm2 function may lead to the reactivation of sphingolipid biosynthesis in the absence of TORC2 (Fig 4C). Intriguingly, a third weak suppressor locus was identified for the tsc11-5 allele around ORM1, a paralog of ORM2. Echter, ORM1 has no variants within the ORF in the DBVPG1373 strain, and we were not able to confirm a suppression phenotype for the ORM1 promoter variants in the presence of reference alleles of MSS4 en ORM2.

Genetic mapping alone is not sufficient to identify causal genes. Our computational prioritisation identified RPT4 en RPN8 as potential suppressor genes within the chromosome XV suppressor locus of RPN11 with equally high scores (Fig 4A and D). As the query gene RPN11 encodes a metalloprotease subunit of the 19S regulatory particle of the proteasome, and the candidate suppressors RPT4 en RPN8 also both encode subunits of the same particle, genetic information and computational prior were not sufficient to pinpoint one as the causal suppressor gene. In experimental validations, the RPN8 allele from UWOPS87-2421 suppressed the rpn11-8 phenotype, whereas the RPT4 allele did not (Figs 4E and EV4). Rpn8 and Rpn11 form an obligate heterodimer (Bard et al, 2018 ), and the RPN8 allele from UWOPS87-2421 may thus restore the interaction between the two proteins, which could have been weakened by the RPN11 mutaties. This ability to resolve a causal gene from multiple linked candidates underscores the importance of thorough experimental validation to understand the mechanism of suppression.

Genetic simplicity of strong suppression

Previous approaches for identifying suppressors have relied on spontaneous mutation, and thus sample genetic backgrounds that are very similar to that of the reference. As a result, more complex allele arrangements that may be required for suppression, e.g. combinations of two or more mutations, are not easily obtained. Despite observing multiple loci that are involved in the suppression phenotype in each of the sequenced populations (Fig 4A), we found no evidence for the interdependence of one suppressor locus genotype on the presence of another, and all strong suppressors acted in isolation (Figs 4B and EV4 Discussion). For example, both the RPN8 en de MKT1 allele from UWOPS87-2421 could individually suppress the rpn11-14 TS allele to near wild-type fitness (Fig EV4). We did not observe examples consistent with strong suppression by many small effect variants. Conversely, multiple mutations within a locus could be required for suppression. De ORM2-DBVPG1373 allele that independently suppressed tsc11-5 carries two missense mutations, P26T and G134S, that affect conserved residues, are predicted to be highly deleterious and are both required for a robust suppression phenotype (Fig EV4).

Next, we compared the suppressor genes identified by our mapping results to those previously found in the reference strain background (Oughtred et al, 2019 ). In cases where we confirmed a candidate suppressor, we also often found prior evidence of suppression in that gene (4/9 unique suppressor-query pairs Dataset EV7). In all four cases, the suppressor and query gene pairs encoded members of the same protein complex or pathway, and in three cases the suppressor and query proteins interact physically (Dataset EV7). The five suppressor-query gene pairs that had not been previously described included four cases of suppression by the general modifier MKT1. We have previously observed a similar prevalence of general suppressor genes that affect the expression of the query mutant among spontaneous suppressor mutations of TS alleles isolated in the reference strain (

50% of all suppressor genes van Leeuwen et al, 2016 , 2017 ). Out of the nine suppressor-query pairs, 7 (78%) appear to involve a gain-of-function suppressor allele (Methods Dataset EV7). When we exclude MKT1, three out of 5 (60%) suppressor genes were classified as gain-of-function alleles compared to the reference allele. This relatively large proportion of gain-of-function alleles is consistent with the idea that loss-of-function alleles may be under stronger negative selection in natural populations.

Overall, mechanisms of suppression identified in a laboratory setting mimic those driven by natural variation and can involve identical suppressor genes when considering suppressors that function within the same functional module as the query gene. In addition, despite the presence of multiple selected suppressor regions in nearly every cross, strong suppressor mutations always acted independently of the genetic background. Combined, these observations are consistent with a model where single genes evolve along a lineage, perhaps adapting to the rest of the environmental and genetic context via multiple gain-of-function mutations, which then in turn gives the derived allele the ability to independently suppress fitness defects of other alleles.

Mutations in NSE1 can suppress SMC5/6 complex dysfunction

One of our mapped suppressor interactions involved the suppression of a nse3-ts4 TS allele by the NSE1 allele from UWOPS87-2421 (“NSE1-UW” Figs 4A and 5A). Nse1, Nse3 and Nse4 form a subcomplex within the highly conserved SMC5/6 complex, which is essential for the removal of recombination intermediates during DNA replication and repair (Fig 5C) (De Piccoli et al, 2006 Menolfi et al, 2015 ). Nse3 and Nse4 bridge the globular head domains of Smc5 and Smc6 (Fig 5C), whereas Nse1 is a RING finger protein with ubiquitin ligase activity that strengthens the interactions between Nse3 and Nse4 (Pebernard et al, 2008 Hudson et al, 2011 ). De NSE1-UW allele also suppressed the growth defect of a nse4-ts4 TS allele, but not that of any of the other tested SMC5/6 subunits (Fig 5A). EEN nse1 loss-of-function allele exacerbates the fitness defect of a nse3 TS mutant (Costanzo et al, 2016 ), and overexpression of NSE1 suppresses a nse3 TS allele (Magtanong et al, 2011 ) (Fig 5D), suggesting that the NSE1-UW allele has a gain-of-function effect that improves the stability or activity of the SMC5/6 complex. Indeed, the NSE1-UW allele suppressed the sensitivity of nse3 en nse4 mutants to DNA damaging ageing agents hydroxyurea (HU) and methyl methanesulfonate (MMS) (Figs 5B and EV5A), but could not suppress the lethality associated with deleting either NSE3 of NSE4 (Fig EV5B). Thus, phenotypic defects of nse3 en nse4 partial loss-of-function mutants could be restored by the presence of NSE1-UW.

Figure 5. The NSE1 allele of UWOPS87-2421 can suppress NSE3 en NSE4 TS mutants

  • A, B. Suppression of nse3-ts4 en nse4-ts4 temperature sensitivity (A) and DNA damage sensitivity (B) by the NSE1 allele of UWOPS87-2421. Cultures of the indicated strains were diluted to an optical density at 600 nm of 0.1 and a series of tenfold dilutions was spotted on agar plates and incubated for 2–3 days. UW = UWOPS87-2421. The plates shown in (B) were incubated at 30°C.
  • C. A cartoon of the SMC5/6 complex.
  • D. An illustration of the various types of genetic interactions that have been observed between different alleles of NSE1 en NSE3.
  • E. Recruitment of Smc6-FLAG by ChIP-qPCR at two known SMC5/6-binding sites (pericentromere of chromosome XIV and CEN3) and one negative control locus (arm of chromosome III) in G2/M arrested strains. Relative enrichment corresponds to the ratio of the signal after immunoprecipitation (FLAG) over beads alone, normalised to the ratio in wild-type cells at CEN3. Error bars: standard error of the mean of three independent experiments. Statistical significance was determined using an unpaired, two-tailed t-test (*P < 0.05, **P < 0.005).

To more directly test the impact of NSE1-UW allele on the SMC5/6 complex function, we measured its accumulation at two established chromosomal SMC5/6-binding sites using an Smc6-FLAG-based ChIP-qPCR assay in the reference strain (Lindroos et al, 2006 Jeppsson et al, 2014 ). Although the amount of Smc6-FLAG protein was similar in all strains (Fig EV5C), the accumulation of Smc6-FLAG at the two genomic loci was substantially reduced in nse3-ts4 en nse4-ts4 mutants compared to wild type (Fig 5E). Replacing the reference NSE1 allele with the NSE1 allele of UWOPS87-2421 increased recruitment of the SMC5/6 complex to the DNA, both in the presence of wild-type or TS alleles of NSE3 of NSE4. This suggests that the NSE1-UW allele increases association of the SMC5/6 complex to the DNA, thereby counteracting the negative effects of the nse3 en nse4 TS alleles on SMC5/6 complex activity.


Overview of Target-Specific Assay Services

Reaction Biology offers compound screening assays for more than 1000 targets to support the discovery of new drugs. Most of our assays are high-throughput compatible and can be customized to your specific requirements.

Reaction Biology offers the largest portfolio of kinase assays in the industry. We are dedicated to provide end-to-end service for kinase drug discovery covering all steps of the preclinical drug discovery process.

Epigenetic enzymes control the mechanics of genetic expression, acting as "on" and "off" switches for the human genome. Malfunctions of these enzymes are implicated in many immunological and neurodegenerative conditions as well as cancer. We are dedicated to providing end-to-end service for epigenetic drug discovery covering all steps of the preclinical drug discovery process.

A suite of assay formats is available for drug discovery targeting the Kras pathway. Biochemical and biophysical methods allow the investigation of different KRas regulators.

Compound screening against Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) enzymes is performed with gold standard radiometric activity assays.

The activity of phosphatases is quantified with a fluorescence-based approach for anti-phosphatase compound profiling.

Our large panel of protease assays allows targeted drug discovery of protease inhibitors as well as selectivity screening with our protease panel. All assays are fluorescence-based and quantify protease activity.

Reaction Biology offers assays for the investigation of test molecules targeting the apoptosis pathway. The assay technology measures the binding of the apoptotic protein such as BCL2 to a substrate peptide such as BAK.

Metabolic Pathway Assays

To support the discovery of new drugs against phosphodiesterase enzymes Reaction Biology offers activity assays for compound screening.

Reaction Biology provides compound profiling against the 6 most important CYP isoforms to provide early guidance on a compound's toxicity.

Assays for compound screening to inhibit the proteasome and deubiquitinases are offered by Reaction Biology with fluorescent-based activity assays.

Reaction Biology offers cell-based testing for the discovery of drugs targeting ion channels.

Reaction Biology offers services to progress drug discovery research in the area of GPCR biology and pharmacology.

Reaction Biology offers a suite of cell-based assays to support the discovery of new drugs to modulate nuclear receptors.

Additional Targets

Reaction Biology can assist you with the production of proteins and assays for a variety of target classes such as kinases, epigenetics, PARPs, DUB, HSP, protease, phosphatase, and many more.


Bekijk de video: Complementation Testing (December 2021).