Informatie

Kan olie worden gebruikt in plaats van water bij het voorbereiden van natte montages voor microscopie?


Is er een reden dat er geen olie (bijvoorbeeld plantaardig of helder mineraal) wordt gebruikt om natte preparaten in microscopie te maken? Ik verwijs niet naar olie-immersietechniek, maar vervang olie door water in natte bergen in helderveldmicroscopie.

De vraag gaat vooral over mos of schimmel, dingen die plantaardig lijken op een glijbaan. De optische eigenschappen kunnen goed zijn en de viscositeit geeft, net als bij glycerine, een beetje diepte aan het objectglaasje. Misschien veroorzaakt het een soort vervorming? Ik zie dit niet vermeld als een suggestie op microscopiesites.

Bedankt.


Meestal worden natte mounts gebruikt om de mobiliteit en het gedrag van micro-organismen te observeren. Een klassiek gebruik voor een natte berg zou zijn om zoiets als vijverwater te bestuderen, waar je alle verschillende organismen zou kunnen zien rondzwemmen zoals ze zouden doen in hun natuurlijke omgeving. Oliën zijn stroperiger en zouden de mobiliteit belemmeren en kunnen het gedrag beïnvloeden of zelfs giftig zijn voor de micro-organismen.

Als u een olijfoliefabrikant was en u dacht dat u een vreemde microbiële besmetting van uw olijfolie had, zou u naar een druppel van uw olijfolie kunnen kijken tussen een glaasje en dekglaasje en dus een op olie gebaseerde natte montage gebruiken zoals u beschrijft. Je zou dit ook kunnen doen als je de microbiologie van een olielek in water zou bestuderen.

Er staat nergens dat je een monster niet in olie zou kunnen hangen. Er kan zelfs een onbekend voordeel zijn van het gebruik van deze methode in bepaalde omstandigheden, dat wacht om ontdekt te worden.


Microscopie met olie-immersie

Wanneer licht van een materiaal met de ene brekingsindex naar een ander materiaal gaat, zoals van glas naar lucht of van lucht naar glas, buigt het. Licht van verschillende golflengten buigt onder verschillende hoeken, zodat naarmate objecten worden vergroot, de beelden steeds minder duidelijk worden. Met "droge" objectieven voorkomt dit verlies van resolutie het gebruik van vergrotingen van meer dan 400x of zo. In feite, zoals u later zult zien, zijn zelfs bij 400x de afbeeldingen van zeer kleine objecten ernstig vervormd.

Olie-immersiemicroscopie is essentieel voor elk microbiologisch laboratorium. Gekleurde uitstrijkjes van gemengde bacteriën worden aanbevolen voor de praktijk.


Kan olie worden gebruikt in plaats van water bij het voorbereiden van natte montages voor microscopie? - Biologie

Het maken van microscoopglaasjes is niet al te ingewikkeld en kan met een beetje kennis eenvoudig worden uitgevoerd. De twee soorten voorbereidingstechnieken voor microscoopglaasjes zijn onder meer dry-mount slides en wet-mount slides.

Droog gemonteerde microscoopglaasjes

Voor droge montage is een blanco glazen microscoopglaasje, een glazen dekglaasje en een niet op vocht gebaseerd monster nodig. Voorbeelden van droog gemonteerde dia's zijn onder meer insectenpoten, bloembladen, poeders of stoffen zoals zandkorrels of droge chemicaliën, vuilmonsters en zelfs krantenpapier.

Plaats bij het voorbereiden van een droge montage-dia het monster tussen het glazen microscoopglaasje en het dekglaasje. Druk stevig op het dekglaasje om het monster plat te maken. Als het monster bij gebruik van een krachtige microscoop niet vlak is, zal het niet volledig scherp zijn, vooral bij hogere vergrotingen.

Bladluis gevangen met een vergroting van 100x. (Voorbeeld van een droog gemonteerde dia).

Nat gemonteerde microscoopglaasjes

Natte objectglaasjes worden gebruikt om vloeistoffen onder de microscoop te bekijken. Voorbereiding van een objectglaasje met natte montage omvat een depressieglaasje, een dekglaasje en een oogdruppelaar kan nuttig zijn, maar is niet vereist. Nat gemonteerde objectglaasjes kunnen vijverwater, wangcellen, bloed- of spermamonsters bevatten.

Plaats bij het voorbereiden van de natte montagedia een kleine druppel van het monster tussen de depressiedia en het dekglaasje. Gebruik een papieren handdoek wanneer u het dekglaasje op de dia drukt, omdat een deel van uw monster over de randen kan lopen. Als u een permanente glijbaan wilt maken, kunt u de randen van uw dekglaasje omlijnen met transparante nagellak. Hierdoor kunt u het permanent op de dia bevestigen, waardoor het vocht in de kamer wordt vergrendeld die u tussen de depressieschuif en het dekglaasje creëert. Als u uw glaasje permanent maakt, zorg er dan voor dat u de hele rand van uw dekglaasje afdicht, zodat het monster na verloop van tijd niet verdampt.


Kan olie worden gebruikt in plaats van water bij het voorbereiden van natte montages voor microscopie? - Biologie

De microscoop is absoluut essentieel voor het microbiologisch laboratorium: de meeste micro-organismen zijn niet te zien zonder de hulp van een microscoop, op enkele schimmels na. En natuurlijk zijn er enkele microben die zelfs met een microscoop niet kunnen worden gezien, tenzij het een elektronenmicroscoop is, zoals de virussen.

Je gebruikt een toegewezen lichtmicroscoop voor een verscheidenheid aan laboratoriumoefeningen gedurende het semester, van het bekijken van vijverwater tot het identificeren van je onbekende bacterie. Daarom is het uiterst belangrijk dat u begrijpt hoe u de microscoop effectief kunt gebruiken en hoe u verschillende soorten microscopie kunt gebruiken.Helder veld, fasecontrast, en donker veld. Fasecontrast- en donkerveldmicroscopieën worden gebruikt voor natte montages, terwijl helderveld kan worden gebruikt voor zowel natte montages als gekleurde specimens.

U krijgt ook uw eerste blootstelling aan de voorbereiding van een bacterieel uitstrijkje en de daaropvolgende kleuring ervan. U maakt echter een eenvoudige vlek met slechts één kleurstof. Alles op de dia heeft dezelfde kleur, maar u kunt onderscheid maken tussen vormen, maten en rangschikkingen van bacteriën.

BENODIGDE MATERIALEN

  • microscoop
  • vijverwater
  • objectglaasjes
  • dekglaasjes
  • olie druppelaar
  • geprepareerde dia's van Bacil
  • tandenstokers
  • kleurstof kits

DE PROCEDURES

Bekijk de onderstaande secties over het gebruik van de microscoop.

Maak een natte berg vijverwater klaar (indien beschikbaar)

  1. Ga OMLAAG in de algen en mest om een ​​echt goed monster van protozoa en algen te krijgen, indien mogelijk.
  2. Stel scherp op het voorbeeld met 10X en ga vervolgens naar 40X (NIET 100X). Begin met helderveld en schakel dan over naar donkerveld en fasecontrast (zie onderstaande instructies).
  3. Oefen met de microscoop, verander de instellingen van de condensor, gebruik verschillende lenzen. Het is NIET belangrijk om protozoa of algen te identificeren.

Maak een uitstrijkje en een eenvoudige vlek van het materiaal tussen je tanden.

  1. Neem een ​​steriele tandenstoker, verwijder wat vast materiaal tussen je verstandskiezen en meng het in een druppel water zodat je een suspensie hebt verspreid over het middelste derde deel van het microscoopglaasje. GEEN HOESSLIP GEBRUIKT!
  2. Laat de dia luchtdroog.
  3. Warmte-fix het droge uitstrijkje door het glaasje een paar keer snel door de vlam te halen. Als je vingers heet worden, heb je TE VEEL warmte gefixeerd.
  4. Plaats de dia op de draad over de vlekkenlade. Overgiet het uitstrijkje met kristalviolet: 1 minuut laten intrekken.
  5. Was de dia GOED met gedestilleerd water. Dep het uitstrijkje met je absorberende papieren pad.
  6. Stel scherp op het monster met behulp van de 10X-lens (Wees ZEKER dat u op helderveldmicroscopie bent): je zou massa's paars materiaal moeten zien, het meeste te klein om te zien.
  7. Klaar om nu naar 100X te gaan? Niet doen beweeg het podium of de instelknoppen voordat u volg de onderstaande aanwijzingen.
  8. Identificeer de verschillende vormen en rangschikkingen van bacteriën in uw mond. De meeste van hen zullen bacillus- of coccus-vormig zijn, maar het zou niet ongewoon zijn om wat spirilla te zien. Let op de rangschikkingen van de paren, clusters, kettingen van de bacteriën?
  9. Elk objectglaasje dat u voor uitstrijkjes gebruikt, gaat terug naar uw objectglaasjesdoosje, om te worden schoongemaakt en opnieuw te worden gebruikt.

Bekijk voorbereide bacteriële uitstrijkjes

  1. Omdat deze bevlekte uitstrijkjes zijn gekocht, zitten er dekglaasjes op. Je gebruikt er nog steeds olie op met de olie-immersielens.
  2. Zorg ervoor dat u alle olie VERWIJDERT voordat u ze op de trays plaatst.

ALVORENS EEN DIA OP HET MICROSCOOPPODIUM TE PLAATSEN

  1. Vind alle structuren op de microscoop (diagrammen aan het einde van de oefening) ervoor zorgen dat u hun functies kent. Draai de condensor zodat u alle instellingen ziet (witte letters zijn gegraveerd in de voorkant van de condensorwijzerplaat). Beweeg ook het irisdiafragma naar links en rechts zodat je het effect op de hoeveelheid licht kunt zien.
  2. Verhoog de condensortrap HELEMAAL BOVEN. Er is een speciale knop voor de condensortrap onder de mechanische fase. De condensor verzamelt al het beschikbare licht van de lamp en leidt het naar het podium. Bij het bekijken van micro-organismen hebben we altijd het condensorstadium dat het dichtst bij het mechanische stadium ligt. Bij het bekijken van de grootste objecten, zoals wormen of insecten, kunt u de condensor naar beneden bewegen om de lichtdichtheid die op het monster valt te verbeteren, maar niet voor micro-organismen.
  3. Draai de helderheidsregelknop HELEMAAL omhoog, en dan een kwart slag achteruit. Hier blijft de bedieningsknop: raak hem niet meer aan. De hoeveelheid licht die door de condensor naar boven komt, wordt geregeld door de Iris diafragma.
  4. Draai de draaiend neusstuk tot de 10X objectieflens met laag vermogen op zijn plaats klikt.
  5. Breng het podium helemaal naar boven met de grove aanpassing knop. Houd de afstand tussen de dia en de lens in de gaten om ervoor te zorgen dat u de lens niet in het podium laat crashen.
  6. Reinig alle lenzen (oculairs, objectieflenzen en lens op condensor) met LENS PAPIER.
  7. Stel de oculaire lenzen in op de juiste afstand voor uw gezicht (de oculairs kunnen naar eigen behoefte uit elkaar of dichter bij elkaar worden bewogen). Deze oculair oculair lenzen zijn beide 10X vergroting.

OM EEN EXEMPLAAR TE BEKIJKEN

  1. Plaats de natte montage of het uitstrijkje op het podium en bevestig deze aan de binnenkant van de toneel clips.
  2. Probeer te raden waar het preparaat zich op het objectglaasje bevindt en plaats het in het midden van het gat zodat er licht door het werkgebied kan schijnen.
  3. Terwijl u door het oculair kijkt, laat u de fase LANGZAAM met behulp van de grove instelknop. Zorg ervoor dat u met BEIDE ogen door de verrekijkerkop van de microscoop kijkt.
  4. Zodra u het preparaat ziet, STOP met de grofinstelling en schakel over naar de fijninstellingsknop. Na in het begin scherp te hebben gesteld met de grove instelknop, wordt deze NIET MEER AANGERAAKT. Alle scherpstelling wordt nu gedaan met de fijne afstelknop.
  5. DOELSTELLINGEN VERANDEREN:

De meeste microscooplenssystemen zijn: PARFOCALDe objectieven zijn zo uitgelijnd dat rotatie naar een andere lens kan worden gedaan zonder grote scherpstelling. Draai de 40X-lens op zijn plaats en zorg ervoor dat deze op zijn plaats klikt. Uw exemplaar zou nog steeds in het gezichtsveld moeten worden gezien, maar nu 4 keer groter. Gebruik je fijnafstellingsknop om de objecten te verduidelijken.

ALS UW VISIEGEBIED FUZZY IS, EN GEEN ENKELE HOEVEELHEID SCHERPSTELLING HET OBJECT IN BEELD BRENGT, HEBT U WAARSCHIJNLIJK OLIERESTEN OP DE 40X-DOELSTELLING. HET MOET GOED WORDEN REINIGD MET LENS PAPIER.


Zelf microscoopglaasjes maken

Er zijn drie soorten houders waaruit u kunt kiezen bij het maken van microscopiedia's. Dit zijn droge montage, natte montage en voorbereide montage. Elke berg heeft zijn eigen plussen en minnen. Uw persoonlijke vaardigheidsniveau en beschikbare uitrusting bepalen hoe gemakkelijk het is om elk type te maken.

Hoe maak je drooggemonteerde microscoopglaasjes

Instructies:

Droge montages zijn de gemakkelijkste microscoopglaasjes om te maken. Je hebt een glasplaatje en een dekglaasje nodig. Droge montages werken het beste voor monsters zoals pollen, haar, veren of zelfs stofdeeltjes die in een microfilmfilter zijn opgevangen.

De basisstappen om je eigen dry-mount slide te maken zijn heel eenvoudig. Plaats het monster op de dia en dek af. Dat is het! De hoes beschermt zowel uw monster- als objectieflenzen.

nadelen:

Hoewel het maken van microscoopglaasjes in de droge montering eenvoudig is, kleven er enkele nadelen aan. Deze bevestigingen zijn tijdelijk, tenzij u het dekglaasje op de een of andere manier verzegelt. Het is ook moeilijker om de meer ingewikkelde structuren van sommige soorten te zien. Daarvoor moet je leren hoe je een voorbereide montage maakt.

Hoe maak je natte microscoopglaasjes?

Instructies:

Het maken van objectglaasjes in een wet mount heeft veel voordelen. De vloeistofbreking maakt het veel gemakkelijker om ingewikkelde structuren te zien. Als het specimen in leven is, zal de vloeistof het mogelijk maken om zowel de natuurlijke kleur als mobiliteitspatronen te zien.

Om een ​​natte montage te maken, plaats je een paar druppels van je gewenste vloeistof op de glijbaan. Voeg het monster toe aan uw vloeistof en plaats er nog een paar druppels bovenop. Dit zorgt ervoor dat het monster onder de vloeistof komt te staan. Als u naar een aquatisch exemplaar zoals algen kijkt, gebruik dan het water waarin het exemplaar zich bevindt.

Breng vervolgens het dekglaasje aan. Dit gebeurt heel voorzichtig om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Laat het deksel langzaam onder een hoek zakken en het zal uiteindelijk op zijn plaats worden gehouden door oppervlaktespanning. Als het dekglaasje op de onderste helft van het glaasje drijft, heb je te veel vloeistof gebruikt.

Er zijn verschillende vloeistoffen die acceptabel zijn voor het maken van een wet mount, van kraanwater tot glycerine. Het belangrijkste om te overwegen is uw type exemplaar. Sommige exemplaren doen het niet goed wanneer ze worden geconfronteerd met bepaalde vloeistoffen. Zorg ervoor dat u uw vloeistof zorgvuldig kiest, zodat deze bij uw exemplaar past.

nadelen:

Natte montages hebben ook nadelen. Het vinden van een bewegend exemplaar kan een probleem zijn. De objectglaasjes hebben ook de neiging uit te drogen onder het licht van de microscoop. Als uw natte mounts uitdrogen voordat u klaar bent, brengt u een extra druppel vloeistof onder het dekglaasje aan.

Hoe u voorbereide microscoopglaasjes kunt maken

Instructies:

Het maken van geprepareerde insteekdia's is meer werk, al heeft het voordeel dat als je eenmaal klaar bent je ze lang kunt bewaren.

Eerst moet je exemplaar heel dun worden gesneden. Het beste gereedschap hiervoor is een microtoom, een instrument dat wordt gebruikt om materialen in vederlichte schijfjes te snijden.

Zodra het monster dun genoeg is, plaatst u het op uw objectglaasje. U moet overtollig water verwijderen. Afhankelijk van het monster kunt u het monster aan de lucht drogen, deppen of een warmtebron gebruiken om het te drogen.

U wilt een kleurstof zoals methyleenblauw toevoegen om de ingewikkelde structuren van het monster te bevlekken. U kunt een druppel kleurstof aan het monster toevoegen en vervolgens het deksel erop plaatsen. Het toevoegen van een fixeermiddel aan het monster voordat u het dekglaasje aanbrengt, helpt bederf te voorkomen.

Het exemplaar rechts, een stuk van een quadriceps van een muis, is gekleurd met hematoxyline. Merk op hoe duidelijk je de kleine structuren kunt zien, die individuele spiervezels zijn.

Als je een exemplaar hebt dat zich in een natte montage bevindt, is er een heel eenvoudige manier om het te bevlekken. Plaats een druppel kleurstof op de rand van het dekglaasje. Leg een klein stukje keukenpapier aan de andere kant. Omdat de papieren handdoek de vloeistof absorbeert, moet de kleurstof onder het deksel en over het monster worden getrokken.

De voorbereide montagemethode is complexer, dus het wordt niet vaak gedaan door de hobbymicroscopist. Deze glaasjes zijn voor biologisch of pathologisch onderzoek.

Microscoopdia's maken: conclusie

Wees echter niet bang, als je complexere structuren wilt onderzoeken, maar niet de tijd/kennis hebt om je eigen exemplaren voor te bereiden, kun je altijd voorbereide dia's kopen bij Amazon.

Met een beetje oefening is het maken van microscoopglaasjes niet zo moeilijk. Je kunt er zelfs van genieten als je enkele technieken onder de knie hebt. Als u eenmaal de benodigde stappen kent, staat niets uw eigen nieuwsgierigheid meer in de weg!


Objectglaasjes: recensies en artikelen

Voorbereide dia's:

    bieden een leuke en gemakkelijke introductie tot de microscopische wereld. Deze set wordt geleverd met vijfentwintig geprepareerde dia's die delen van planten, dieren en insecten bevatten. Deze set is populair bij zowel nieuwsgierige kinderen als volwassenen en biedt urenlang educatief entertainment tegen een zeer betaalbare prijs.
    zijn een stap hoger dan het 44410-model. Deze set wordt geleverd met maar liefst 100 voorbereide dia's, en biedt een nog bredere introductie tot basismicroscopie. Als je wat meer geld te besteden hebt, zal deze set de ontluikende wetenschapper lang geboeid houden.
  • De Meade set geprepareerde objectglaasjes maakt het leren werken met een microscoop gemakkelijk en leuk. Deze set bevat vijfentwintig dia's die een indrukwekkende verscheidenheid aan biologische onderwerpen behandelen. Lees hier meer over deze set, inclusief de bijbehorende dia's.
    brengen de microscopische wereld tot leven. Hier zullen we de verschillende sets bekijken om u te helpen de beste te kiezen voor uw behoeften.

Lidwoord:

  • Weten hoe je een goede microscooptekening maakt, kan zelfs in de wereld van digitale beeldvorming een handige vaardigheid zijn. Met een beetje geduld en oefening wordt het zelfs leuk! Leer hier hoe.

Natte montages gebruiken een vloeibaar montagemedium, zoals water, immersieolie of glycerine. De verschillende vloeistoffen hebben een verschillende brekingsindex en zijn daarom geschikt voor verschillende soorten preparaten. In de meeste gevallen zijn natte montages tijdelijke dia's. Het is echter mogelijk om dia's met een vloeibaar montagemedium permanent te maken, door het dekglas op zijn plaats te houden met lijm of nagellak. De keuze van het vloeibare montagemedium is afhankelijk van het monster. Water is het meest voorkomende medium en is compatibel met de meeste biologische exemplaren (levende wezens bestaan ​​immers grotendeels uit water). Glycerine heeft conserverende eigenschappen en olie wordt gebruikt voor volledig droge exemplaren (insectenvleugels enz.) of voor hydrofobe exemplaren.

Droog gemonteerde objectglaasjes gebruiken helemaal geen montagemedium. Het dekglas wordt direct op het droge monster geplaatst, dat is omgeven door lucht. Deze kunnen nuttig zijn als er een chemische onverenigbaarheid is tussen het monster en het montagemedium. Stuifmeel en sporen kunnen worden waargenomen met een droge berg. Dry mounts produceren echter een lagere beeldkwaliteit. Dit komt door het sterke verschil in brekingsindex tussen het monster en de omringende lucht.


Kan olie worden gebruikt in plaats van water bij het voorbereiden van natte montages voor microscopie? - Biologie

Waarom een ​​voorgemengd medium kopen als het goedkoop en gemakkelijk zelf te maken is?

JA Kiernan

Afdeling Anatomie & Celbiologie

De Universiteit van West-Ontario

Samenvatting. Er worden instructies gegeven voor het maken van vijf waterige montagemedia: glycerolgelei, gebufferde glycerol met anti-vervaging, fructosesiroop, apathische gomsiroop en een polyvinylpyrrolidonmedium waarvan de samenstelling kan worden gevarieerd om aan de behoeften van de gebruiker te voldoen. Voor elk worden tips gegeven over het gebruik en de bewaring van de afgedekte preparaten. Media gemaakt in het laboratorium zijn goedkoper dan commerciële waterige mountants en bevatten geen geheime ingrediënten.

Vrijwel alles dat voor gebruik in een laboratorium wordt verkocht, is waanzinnig duur, en de prijs wordt nog hoger als dingen voor een bepaald doel op de markt worden gebracht in plaats van voor algemeen gebruik. Op water gebaseerde montagemedia zijn een voorbeeld. Ze bestaan ​​bijna volledig uit goedkope chemicaliën als kauwgom, gelatine en suiker, maar een inspectie van recente catalogi toont aan dat het goedkoopste waterige bindmiddel meer dan een dollar per milliliter kost. Dat komt neer op 10 cent of meer voor elk glaasje, bovenop de kosten van het glas en de kleurreagentia die werden gebruikt. Het is heel eenvoudig om uw eigen waterige montagemedia te maken, bijna gratis. Het enige wat je nodig hebt zijn een paar kleine bekers of kolven, een warmtebron en ofwel veel elleboogvet of een magnetische roerder. Naast geldelijke besparingen is er nog een goede reden om je eigen te mixen: je weet wat je hebt. Een commercieel montagemedium kan uitstekend zijn voor wat u wilt doen, of misschien niet. Als de formulering een handelsgeheim is, kun je er pas achter komen nadat je het spul hebt gekocht.

Hier zijn instructies voor het maken van een paar waterige montagemedia. Ze zijn niet allemaal hetzelfde, want er is niet één medium dat voor elk doel kan worden gebruikt. Met uitzondering van enkele van de antibacteriële additieven, worden er geen gevaarlijke chemicaliën gebruikt in deze mengsels, dus je hoeft geen ruimtepak te dragen als je ze mengt. Eenmaal gemaakt, moeten waterige montagemedia worden bewaard in kleine (10-30 ml) flesjes met schroefdop of injectieflacons van transparant glas of plastic. De dop kan op zijn plaats worden gecementeerd, maar is meestal verwijderbaar door in warm water te weken. Als het medium troebel wordt of andere tekenen van bacterie- of schimmelgroei vertoont, gooi het dan weg en open een andere fles.

Waterige media worden veel gebruikt voor fluorescentiemicroscopie en sommige van deze mengsels bevatten stoffen die het vervagen van fluorochromen vertragen. Sommige media harden of drogen om redelijk vast te worden, andere zijn altijd vloeibaar. Bij alle is het raadzaam om de randen van het dekglaasje af te dichten als u een permanente voorbereiding wilt. Gebruik nagellak of een soortgelijk materiaal dat niet vermengt met water. Elk harsachtig montagemedium, verdund met een gelijke hoeveelheid tolueen of xyleen, kan op dezelfde manier als nagellak worden gebruikt.

Glycerol gelei.

Dit traditionele montagemedium is het moeilijkst om te gebruiken. Als je een fatsoenlijke bereiding kunt maken in glycerolgelei, kun je elk ander waterig bindmiddel gebruiken met je ogen dicht.

Door opwarmen oplossen en toevoegen:

Toevoegen of één druppel verzadigde waterige oplossing van fenol ("vloeibare fenol") of 15 mg natriummerthiolaat als antibacterieel middel. Dit is enkele weken houdbaar bij 4C. Gooi weg wanneer het troebel of beschimmeld wordt.

Glycerolgelei moet voor gebruik worden opgewarmd tot ongeveer 40 °C om de gel te laten smelten. Het moet vaak ook worden ontdaan van luchtbellen. Dit kan door de fles (met dop los) te verwarmen in een vacuümkamer.

Laat het objectglaasje na het afdekken met glycerolgelei ongeveer 30 minuten op een warme (40-45C), vlakke ondergrond staan ​​om het medium in de sectie te laten trekken en verwijder het vervolgens naar een koele plaats om uit te harden. Het is vrij moeilijk om met dit medium een ​​bubbelvrije bereiding te maken en de bubbels kunnen klein en talrijk zijn. Controleer met een microscoop terwijl het objectglaasje nog warm is. Als het niet goed is, verwijder dan het dekglaasje door in warm water te weken en probeer het opnieuw.

Dit medium heeft een lage brekingsindex (1,42). Hierdoor blijven veel ongekleurde structuren zichtbaar, wat een voordeel of een nadeel kan zijn, afhankelijk van wat je verwacht te zien in de afgewerkte voorbereiding.

Gebufferde glycerol met anti-fade.

Gebufferde glycerol wordt voornamelijk gebruikt voor fluorescerende immunohistochemische preparaten. De hoge pH zorgt voor een optimaal efficiënte fluorescentie van de veelgebruikte labels. de toegevoegde P-fenyleendiamine (PPD) (Platt & Michael, 1983) of N-propylgallaat (Longin et al., 1993 Battaglia et al., 1994), vertraagt ​​het vervagen.

Of 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4): 10 ml

of 0,1 M TRIS-buffer (pH 9,0): 10 ml

Of P -Fenyleendiaminehydrochloride: 100 mg

of N -propylgallaat: 500 mg

Minstens 3 maanden houdbaar, waarschijnlijk veel langer, in het donker (wat het anti-vervagingsmiddel beschermt) bij -20C. De werkende fles wordt een week of twee op 4C gehouden.

Dit stolt niet, maar het dekglaasje kan op zijn plaats worden gehouden door een beetje nagellak op de randen aan te brengen.

Fructose siroop.

Dit medium is plakkerig genoeg om een ​​dekglaasje op zijn plaats te houden. Het is het gemakkelijkste waterige medium om te gebruiken, maar te zuur (pH ongeveer 4,5) voor het conserveren van basische kleurstoffen. Waarschijnlijk zou het in een neutrale buffer kunnen worden gemaakt, dat heb ik zelf nog nooit geprobeerd. Fructosesiroop is handig als je weet dat je het dekglaasje gaat verwijderen om iets anders aan de sectie te doen.

Doe samen in een goed afgesloten fles en laat 1-2 dagen in een oven (ongeveer 60C) staan, totdat alle suiker is opgelost tot een heldere siroop.

Op kamertemperatuur enkele maanden houdbaar.

Bij langdurige opslag zal dit medium uitdrogen en kristalliseren als de randen van het dekglaasje niet worden afgedicht.

De kauwgomsiroop van apathie.

Dit is een andere traditionele mountant: lastig om te maken, maar gemakkelijk te gebruiken. De thymol is om de groei van micro-organismen te vertragen. In plaats daarvan zou een ander ontsmettingsmiddel (zie onder glycerolgelei) kunnen worden gebruikt.

Arabische gom (= acaciagom): 50 g

Los de ingrediënten op, onder regelmatig roeren en af ​​en toe verwarmen op een waterbad. Als er zich grote klonten vormen, kan het enkele dagen duren voordat de kauwgom is opgelost. Het uiteindelijke volume moet ongeveer 100 ml zijn. Bij kamertemperatuur enkele maanden houdbaar. Gooi weg als het geïnfecteerd raakt of als de suiker kristalliseert. Sanderson (1994) beveelt fructose (levulose) aan in plaats van sucrose, vermoedelijk omdat het minder snel kristalliseert.

De brekingsindex van Apathy's medium (ongeveer 1,5) is hoger dan die van glycerolgelei of fructose, en het levert preparaten op die bijna net zo transparant zijn als die gemaakt met een harsachtig montagemedium.

Polyvinylpyrrolidon (PVP) medium

Dit is mijn favoriete waterige montagemedium. De samenstelling kan worden aangepast aan de individuele behoeften (Kiernan, 1990). Voor immunofluorescentie, verzin het in een buffer en voeg een anti-vervagingsmiddel toe.

Polyvinylpyrrolidon (M.W. 10.000): 25 g

Water (of een 0,1 M fosfaat of

TRIS-buffer, pH 7,4 of 9): 25 ml

Los de PVP op door enkele uren op een magneetroerder te laten staan. Dan toevoegen:

Flessen PVP-medium zijn meestal 2 tot 3 jaar houdbaar bij kamertemperatuur. Bewaar het op een donkere plaats als er een anti-vervagingsmiddel is toegevoegd. Gooi weg als het er geïnfecteerd uitziet of te stroperig wordt.

Dit montagemedium is vloeibaarder dan glycerolgelei of Apathy's. Het is heel gemakkelijk aan te brengen en niet gevoelig voor luchtbellen. De brekingsindex is 1,46 (Pearse, 1968), maar neemt toe naarmate het water aan de randen van het dekglaasje verdampt totdat ongekleurde structuren nauwelijks zichtbaar zijn. Als u een hoge mate van transparantie wilt, wacht dan enkele dagen voordat u de randen van het dekglaasje verzegelt.

Battaglia, M., Pozzi, D., Grimaldi, S. en Parasassi, T. 1994. Hoechst 33258-kleuring voor het detecteren van mycoplasma-besmetting in celculturen: een methode voor het verminderen van fluorescentiefotobleken. Biotech. Histochem. 69: 152-156.

Kiernan, JA 1990. Histologische en histochemische methoden. Theorie en praktijk. 2e ed. Oxford: Pergamon Press. [Er is een 3e edn, 1999 * zie details aan het einde van dit document.]

Longin, A., Souchier, C., Ffrench, M. en Bryon, P.A. 1993. Vergelijking van anti-vervagingsmiddelen die worden gebruikt in fluorescentiemicroscopie: beeldanalyse en laserconfocale microscopiestudie. J. Histochem. Cytochem. 41: 1833-1840.

Pearse, A.G.E. 1968. Histochemie, theoretisch en toegepast, 3e druk. Vol. 1. Edinburgh: Churchill-Livingstone.

Platt, J.L. en Michael, A.F. 1983. Vertraging van vervaging en versterking van de intensiteit van immunofluorescentie door P-fenyleendiamine. J. Histochem. Cytochem. 31: 840-842.

Sanderson, JB 1994. Biologische Microtechniek. (Royal Microscopical Society Handbook No. 28) Oxford: BIOS Scientific Publishers.

Valnes, K. en Brantzaeg, P. 1985. Vertraging van immunofluorescentievervaging tijdens microscopie. J. Histochem. Cytochem. 33: 755-761.

* Kiernan, JA 1999. Histologische en histochemische methoden: theorie en praktijk. 3e ed. Oxford: Butterworth-Heinemann, p. 52. Herdrukt 2000, en nu uitgegeven door Arnold Publishers, Londen - (ISBN 0750649364) Beschikbaarheid in Groot-Brittannië Beschikbaarheid in de VS Beschikbaarheid in Canada

Copyright (c) 1997 door Today Enterprises.

Artikel gepubliceerd in Microscopie vandaag 97-10 blz. 16-17 (1997).


Directe natte montage KOH-voorbereiding:

Directe natte voorbereiding van ontlastingsspecimen wordt veel gebruikt voor de parasitologische analyse in laboratoria en ook voor de microscopische diagnose van darmparasieten. KOH – Kaliumhydroxide, wordt op grote schaal gebruikt in de directe natte voorbereiding voor verschillende specimens, bijvoorbeeld schimmelelementen en schimmels, haarvoer, huidschilfers en nagelafkrabsels of andere klinische monsters met kleine druppels 10% kaliumhydroxide '8211 KOH op een glas schuiven. Het kaliumhydroxide verteert het hardnekkige/vastberaden celafval en bleekt pigmenten, maakt de sclerotische bestanddelen los, maar beschadigt hun klinische bestanddelen niet. Ze geven dus uitstekend zicht bij microscopisch onderzoek.


Kan olie worden gebruikt in plaats van water bij het voorbereiden van natte montages voor microscopie? - Biologie

Vlieg vleugel afbeelding - Het is een mozaïek van vier verschillende afbeeldingen. Een foto gemaakt met het x40 objectief van het omcirkelde gebied
zou worden gebruikt als een test van het gedrag voor de verschillende montagemedia die hieronder worden beschreven.

DEEL 1 DEEL 2 DEEL 3

INVOERING

In een histologisch onderzoekslaboratorium of een pathologisch laboratorium, montage is de laatste procedure in de reeks die eindigt met een permanent histologisch preparaat op tafel, ruim na de 1) fixatie, 2) inbedding in paraffine, 3) coupes, 4) kleuring, 5 ) dehydrateren en 6) opruimen.

Afgezien van enkele uitzonderingen, doen amateurs zelden onderzoek waarvoor lange en gecompliceerde histologische technieken nodig zijn. Het meeste van hun werk is gemaakt op live materiaal. Hoewel velen van hen soms materiaal nodig hebben of willen bewaren voor toekomstig onderzoek, of om een ​​vergelijkende verzameling van monsters te maken, of om cytologische details te zien, zoals een celkern.

Na enkele voorbehandelingen willen ze de objecten of organismen als semi-permanente of zelfs permanente preparaten monteren.

Normaal gesproken manipuleren ze hele organismen of delen die ervan zijn ontleed en vaak bestijgen microscopisten hun beestjes zonder te kleuren. Sommige onderwerpen kunnen zelfs worden gemonteerd zonder enige voorafgaande manipulatie, vooral als het droge objecten zijn. In deze serie over microscopische technieken maakt dit de studie van montagemedia gemakkelijker en nuttiger, waarbij het gebruikelijke presentatieschema wordt omgekeerd.

Canadese balsem.- De standaard mountant voor histologie, en ook voor taxonomie, zij het zoölogisch of botanisch, is Canada Balsam, een nu schaarse en zeer dure natuurlijke hars. Dit wordt bereid door het opvangen van de uitgescheiden hars Abies balsamico (de "balsemspar") en verdunnen in oplosmiddelen (waarvan vele nu als giftig worden beschouwd, bijvoorbeeld xyleen).

Uit ervaring tot nu toe gaan de op Canada Balsam gemonteerde preparaten meer dan een eeuw mee.

Omdat Canada Balsam niet met water vermengt, impliceert het erin aanbrengen het gebruik van een opeenvolging van dehydratatie, te beginnen met alcoholen van lage kwaliteit, gevolgd door alcoholen van hoge kwaliteit, absolute alcohol, gemengde klaringsmiddelen plus alcohol, klaringsmiddelen, klaringsmiddelen gemengd met xyleen , pure xyleen en balsem opgelost in xyleen , tolueen of benzeen kunnen worden gebruikt in plaats van xyleen .

Maar alle drie de oplosmiddelen zijn even giftig en gevaarlijk. (Tekst in rood duidt op giftige stoffen.) De ontwikkeling van sommige synthetische media als vervanging voor balsem lost het probleem niet op, het zijn merkgebonden handelsmerken, even duur, die dezelfde stappen vereisen en dezelfde (giftige) oplosmiddelen gebruiken. Er zijn minder giftige en minder gevaarlijke merkgebonden vervangers, maar ze zijn duur.

Alternatieven.- Amateurs willen normaal gesproken een eenvoudigere manier om hun beestjes te laten monteren en hebben normaal gesproken geen '100 jaar bestendige' montagemedia nodig. Ze hebben gemakkelijk te vinden, gebruiksvriendelijke, niet-toxische, goedkope en redelijk duurzame media nodig (misschien maanden, misschien enkele jaren) die een duidelijk beeld met een goed contrast garanderen van de morfologische eigenschappen waarnaar hij (of zij) op zoek is.

Er bestaan ​​verschillende van deze montagemedia. Een paar van hen zijn harsachtig, verschillende zijn waterig. Maar normaal gesproken wordt er maar één uitgebreid geciteerd in de bibliografie van een amateur. Het is glycerinegelei, een zeer nuttige optie, maar niet de enige of meest gemakkelijk te gebruiken. Ik zal die media bekijken, alleen de niet-toxische selecteren en formules en opmerkingen verstrekken voor hun toepassing. Mijn formules zijn in veel gevallen niet de originele, zelfs niet de klassieke formules. Ik heb mijn toevlucht genomen tot gemakkelijk te vinden ingrediënten, veel voor huishoudelijk gebruik, hier verheven tot laboratoriumrang.

Brekingsindex.- Elke keer dat ik de waarde weet, geef ik de Brekingsindex (RI) van de voorgestelde mountant. De brekingsindex is belangrijk omdat deze het contrast bepaalt tussen het detail dat u zoekt en de achtergrond, en ook de transparantie van het waargenomen monster tegen het heldere veld van de microscoop. Een medium met een hogere index zorgt voor meer transparantie. Het montagemedium moet altijd een RI hebben die hoger is dan het gemonteerde monster. Some aqueous media have an index of about 1.41 (very pure water has an index of 1.33) but Canada Balsam has an RI of 1.524, very near that of the glass of slides and coverslips. Naphrax which is used as a specific mountant for diatoms, whose frustules are made of a material similar to glass, has a very high RI of more than 1.65 . There is now even a synthetic media that reaches a really high 1.70+ RI.

Natural media or synthetic ones of RI = 1.5 or more are used routinely in histological mounts of tissues, previously stained and cleared. Most objects (including micro-crustacea, or arthropods) look good when recently mounted in them, but show additional undesirable clearing as time passes by, and many important details, such as setae in cladocera, or copepods or acarii, could become invisible. For these materials the modest RI of the friendly aqueous media are actually a better choice.

Selected mounting media.- We shall review pure water, glycerin, sugars (karo and fructose), gum arabic, gelatin , and PVA . I disregard Damar , a very economic alternative to balsam, generally used as a xylene solution, because it is not soluble in any easy to obtain, or safe, solvent. Together the selected products provide a selection of aqueous media, two of them liquids (antiseptic water and glycerol) the others solids, and also one easy to use synthetic resinous medium, NPM (Nail Polish Mountant) that I proposed in a previous article in Micscape Magazine (see references).

Standard subject - To review the practical solidifying mountants and to provide some comparative images to judge its behavior, it's best to start with an easy to mount standard subject. And to use a dry one, that needs no fixative, nor any stain to be applied before mounting. I selected fly wings as my, more or less easy to find, standard objects. Of course for some special mountant media I needed and added some alternative test objects.

Equipment.- Most of the cited equipment is obvious. But throughout the article I speak about capsules . In professional papers the descriptions would be most probably watch glasses , Syracuse glasses or cavity blocks . These are useful pieces of equipment. If you have them, or could buy them. don t hesitate, they are the best choice.

But if you don t have watch glasses make a visit to your old relatives. They surely have consumed some medicine tablets sealed in those dimpled plastic sheets. If they take care to not push up the tablet, thereby ruining your prospective laboratory equipment, they can provide you with an assortment of sizes of concave plastic recesses (capsules) which are very useful for your laboratory work. Select the largest for the actual purpose. I have concave circular capsules of 10, 12, 15 and 17 mm in diameter, and also some useful ones of 8 x 22 mm.

Here in Durango I have identified one almost ideal large plastic capsule: the caps of one brand of ice-cream cones are plastic cupules of 5.5 cm in diameter. I must make a big sacrifice to acquire one dozen of them, but you understand that science is a priority for me.

Of course don t use them with powerful solvents such as xylene, or acetone. If your materials allows you the use of a white opaque background (indeed it is an advantage in the process of staining) you have recourse to the plates with several concavities, or to the little individual dishes that watercolour artists use to mix their colors.

In addition you may need droppers, tweezers or forceps, fine pointed brushes, wire loops, mounted needles, fine pointed scissors, and a small scalpel. I've searched for but haven t found a substitute for test tubes. There are very useful. If you can, you must buy a dozen or so of 1 cm of internal diameter and a length of no more of 8 to 9 cm. Richard Howey has made a sound review of the laboratory materials an amateur can use more often. Please read his articles . (See the references.)


NOTES AND FORMULARY LIQUID MEDIA

AW.- ANTISEPTIC WATER
(Defined here as water containing some diluted fixative, i.e. the water containing the fixed sample.)

This technique has much to do with the usual method of temporary water mounts (wet mounts) you use when studying water samples, microscopic algae and organisms you have just collected in your favorite pond. Except you don t use pond water and live organisms. This is not of course a long lasting mounting medium, but it is useful when you don't want to have your critters drying out, after a long session of microscopic work.


A collection of vegetable debris with Paramecium and what is probably a Tetrahymena. Paramecium alive. x40. Rheinberg oblique illumination.

Many times we return from our field trip with some different samples with one characteristic in common: they are a collection of concentrated planktonic microorganisms, or a handful of detritus, some times very fine, from many possible origins, with probably thousands of interesting .but hidden organisms.

Suppose you have a plankton sample. You mount your drop between slide and coverslip, and start your search. You find many interesting subjects that you want to measure, or to draw or photograph. In a few your sample may be crushed, or lost. You must continuously add water with a fine pointed pipette to the coverslip border or, better yet, you can seal the water medium to stop evaporation.

Do not absorb the excess water with absorbent paper, this can remove just the critter you are most interested in. Let the preparation evaporate just to the point in which there is no more water outside the coverslip. Now with a fine brush, or the tool I describe afterwards, put one little drop of sealant in each of the four corners. Give the sealant opportunity to set, and continue sealing all the borders.

If you have not fixed your critters, with time they will asphyxiate and disintegrate. It would be a good precaution to take two samples. You take home one of them alive and treat it with all the precautions Richard Howey has explained in his recent Micscape article.

You can fix the other using one of the recommended traditional formulae, that, before the new trend for safety were mostly composed of formalin, glutaraldehyde, mercury chloride and other chemicals . They are now reported to be toxic, and not recommended for amateurs.

One useful, effective and safe fixative, that I have designed to fix protozoa, rotifers and the like, has a mild action, and which even preserves the green color of algal plastids for a while, is:

GALA 20 GALA 60 60 (professional formula)


GALA 20 is less prone to distort delicate organisms such as protozoa. For most of the other microinvertebrate groups use GALA 60.

Preparing the formula.- Don t be deceived by the low concentration of the active substances in the formula. Het werkt. Put 100 ml of water in a suitable flask. Mark the level accurately. Empty the flask. With a 20 ml hypodermic syringe withdraw 1 ml of lactic acid, 5 ml of glycerol, 10 ml of vinegar (that is: 9.5 ml of water and 0.5 ml of acetic acid), and some water. Agitate to mix. Put the mixture in the flask. Syringe out some water, agitate to wash the remnants of the lacto-acetic mixture. Pour into the flask. Repeat one or two additional times. Add the alcohol (21 ml at 96% = 20.2 ml absolute alcohol and 0.8 ml water more or less). Now replenish the flask with water to the 100 ml mark, and stir until the solution is homogeneous. Alternatively, if you are in the rich group of amateur microscopists, use your measuring pipettes and graduated cylinders, to prepare your formula.

Label your flask as GALA 20 fixative (because it is composed of G lycerol, A lcohol 20%, L actic acid and A cetic acid) or GALA 60 if you have used the higher alcoholic formula.

Fixing the sample.- To fix your plankton sample (or any aqueous sample with suspended organisms of the same order of sizes) you must add to it 1/10th of its volume, of this solution. (1 drop to 9 drops, or 1 ml to 9 ml, etc) and agitate well to mix immediately. If you want to fix larger animals (some micro-arthropods, hydracarina, some anesthetized worms, arthropod larvae etc.) put them directly in the concentrated fixative (2, 3 or more volumes of fixative by 1 volume of biomass).


Paramecium fixed and mounted in GALA 60. As I did not used any clearing agent it is somewhat opaque. Nevertheless the exploded trichocysts and the macronucleus are visible. Monostyla lunaris.- a rotifer fixed and mounted in GALA 60

Searching your sample.- Of course you can search your materials as is , or apply some color to better differentiate them from the detritus, or to identify some organelles. One beautiful and useful dye is Rose Bengal , but as for all the good reagents of old times it is forbidden now. It is toxic. In future articles on staining I hope to review some safe (but inferior) substitutes.

To make your preparation, to aid with the evaporation problem, and to give the subjects a minimal clearing that mimics the live appearance of many micro-invertebrates, mix one drop of fixed sample with a drop of glycerin, or even lactoglycerol (see formula below). Allow to stand for one minute, cover and start your observations. If the materials promise a long working session proceed to seal. You can search by this technique thecamebae, gastrotrichs, rotatoria, nematodes, microalgae and the like. Some specimens, especially some of the protozoa, microoligochaeta and other soft bodied organisms don t support this drastic procedure and become dehydrated and wrinkled. With these materials you'd better proceed to mount in glycerol or lactoglycerol (see formula below) with all the precautions I explain later.

Sealant media.- For sealants you can use solid vaseline, paraffin wax or beeswax, Valap (see below), or nail polish. Your choice depends on how long you intend to store your preparation. The selection order is also the order of duration of the different media. A liquid preparation sealed well with nail polish could last some months. The other media need to be applied melted, they remain more or less soft, and can be easily ruined, except Valap, that adheres well to glass, but is also easy to remove if you want to recover your slide, and actually is the other media to be recommended. This is its formula:

Paraffin 1 part in weight
Vaseline 1 part in weight
Lanolin 1 part in weight

Mix, melt at a low heat and pour in a shallow profile can and cover. Allow to solidify and melt the quantity you need with the following sealing tool.

One sealing tool: you can melt the solid sealing media and use a small fine pointed brush to apply it, but it is very difficult to apply a neat coat to all four sides of your coverslip. An old economic sealing tool can be of help here.

Take a metallic wire, 2.5 mm in diameter, bend the tip at a right angle, to make the bent portion the same length as the side of the cover slip you use most often, and if you wish, make a loop at the other end as an aid to manipulate the tool.

Now, with a spirit lamp, or a cigarette lighter, apply some heat to the sealing wire. Touch the surface of the solid sealing medium. It melts. With the tip of your tool, touch every angle to fix the cover with a little drop of medium. Now apply the heated side of the wire to the medium and to each border. The molten medium spreads evenly along the sides and you have a very good seal all around. It takes only a few trials to become an expert. Use this tool with Vaseline, the waxes and Valap.

Comments: These simple, temporary mounting methods, are probably the ones which you would use most often, hopefully with much success. They are useful with hydracarina, thecamebae, nematoda, loricate rotifers, most of the Gastrotricha, Chlorophycea (which retains its green color for a long while), euglenoidina (many of them showing his flagellae), desmids and Cyanophycea.

A desmid retaining the color of its chloroplasts after two weeks fixed and mounted in GALA 60.

The entomostracans (cladocera and copepods) have calcium in their exoskeleton that could be dissolved by this highly acidic fixative. So you better fix and preserve them with 70% alcohol. If you fixed them with GALA, because they were mixed with other critters, select them after a few hours, and store in 70% alcohol.

Ciliates can be well preserved, showing their nucleii (macronucleii at least), and cilia. Those that have trichocysts, as Paramecium do, show them exploded most of the time.

Only for comparatively long lasting collections, morphological detailed studies, and demonstration purposes, or when your materials need clearing, as in many arthropods for example, you must resort to the more dense, permanent and more difficult to use mounting media.


Left picture: Probably a Tetrahymena. Right picture: A couple of conjugating Paramecium. Both fixed and mounted in GALA 60. The pictures increase the general opacity and the contrast of the nuclei. They are less contrasty, but easily visible in the mounted materials, without using dyes or clearing agents.

A note on mounting samples in aqueous media: Quite frequently, water evaporation applies a high pressure to the subjects with the risk of delicate subjects being crushed. To avoid this you must resort to the inclusion of some supports for the coverslip. Those supports must be thin enough to permit a high resolution objective to be used, but thick enough to give room for the observed subjects.

Use at will pieces of thin coverslip, paper, plastics, hairs or textile fibers. Many thin adhesive tapes can be cut into thin strips and neatly adhered beforehand to the slide.

Think before you have resort to these methods, because you can t revert the situation. If you think that it is possible that you may change your mind and want to slightly squeeze an organism, it is best that you use, instead of any of the fixed height materials, tiny balls of very soft wax, or drops of solid vaseline. These allow you to put a more or less controlled pressure on the coverslip, to stop the displacement of an organism or to reveal more clearly its internal organization.

Labeling.- Even with these not so permanent preparations you must label your slides. At least write the name of the mounted subjects, the source of the materials, any treatment applied, the mounting media, and the date . Add your name if you want.

Even if the slides are to last for only some weeks or a couple of months, when you make a revision you may have forgotten those details, and be sorry you did not label them. You can make the labels on your computer. But you must write the information with a good indelible black drawing ink or perhaps you could finish with an illegible label caused by accidentally wetting it.

MOUNTING IN PURE LIQUID GLYCEROL

PG.- PURE GLYCEROL

Glycerol, also known as glycerin, is a common product, cheap, and easily acquired in any drugstore. It's a very hygroscopic alcohol, with a weak syrupy consistency and when anhydrous has an RI = 1.46 . Buy well sealed small bottles of glycerol and open it only for the time needed to take out the drops you use.

It is most probable that glycerol was used, as a temporary mounting medium, from the very beginning of microscopic techniques. It is most easy to use. Put a drop of glycerol on a slide. Include the test object (our fly wing), removing it from water, or alcohol, cover and go to the microscope.

Many microscopists seduced by this simplicity, the very high compatibility of glycerol with many solvents, and the added fact that it is a mild clearing agent, that imparts a fair transparency to the small biological materials it impregnated, tried to make it the mounting media for their permanent preparations.

The straightforward method is to seal the glycerol mount. It is not at all easy, but it is possible.

When you want to turn your glycerin mounted slide into a more or less permanent preparation, put the slide on the table over one or two sheets of paper. Cover it with one sheet of absorbent paper (thick kitchen towels work, or even toilet paper) and slide the edge of your hand from end to end of the preparation, taking care not to exercise an excessive pressure. This squeezes the excess of glycerol from under the coverslip into the towel.


Stoma on the epidermis of the underside of a leaf of Tradescantia virginica. Fixed in AFA (alcohol, formalin, acetic acid). Mounted in glycerin. No stains applied. The well known epidermis of an onion. Fixed in AFA. The staining method will be explained in a future article. Mounted in glycerin.

Uncover the slide very carefully, wrap your finger in some thin non-absorbent plastic sheet, support one side of the coverslip, and with extreme care wipe with a dry cloth all the oily remnants you can. Now you need to seal the coverslip.

First of all put one drop of nail polish on each of the four corners, and allow to dry completely (not less than half an hour). Now support your coverslip, moisten a cloth with a little alcohol and wipe very carefully all the contours of the coverslip. Any rough movement and you'll ruin all your work. Use a dry cloth to finish. Both the slide and cover slip must be dry, with no glycerol present at all.

Now seal all four sides with a nail polish layer that overlaps more or less 1.5 mm of the cover, and on the slide. Or use your sealing tool and Valap. Particularly take care to also cover the four corners you fixed earlier. Laat volledig drogen. Wipe with alcohol, and apply another, very carefully applied, sealant layer of NP. Normally Valap won t need a second layer.

Make a check next day. Glycerol is highly hygroscopic and absorbs water greedily. If there is a minimal opening in your sealant there'll be a glycerol-water mixture flowing out. Dry, wash with alcohol, seal the opening. Make a daily check for one or two weeks. When you are satisfied there are no more leaks, finish the seal with automotive or hobby paints.

As the mounting media is a fluid, you must file these preparations in flat horizontal trays, otherwise the subjects can be displaced. Carefully label them of course.

As to the permanency of these glycerol preparations, it's worth pointing out that J.G. Baer, a French helminthologist, reviewed in 1931 the taxonomic characters of Temnocephala mexicana, Vayssiere, 1899 from the type slide mounted in glycerol, and filed in the collections of the Museum d Histoire Naturelle, at Paris, France for 31 years. (T. mexicana is a platyhelminth that lives on some crabs.)


This is the first picture of the test object. Fly wing collected and preserved in alcohol 70%, and mounted in glycerin. Head of the larvae of a Sarcofaag fly. Fixed in 70% alcohol, it was gradually passed through increasing concentrations of glycerin and mounted in 100% glycerin.

Difficult materials.- As I said, glycerol is hygroscopic. It acquires water from all substances that contain free water. When a soft biological object is surrounded with glycerol, water will pass from the object to the glycerol, and is replaced by it. The problem is that glycerol diffuses to the biological materials at a slower rate than when water goes out. The results of this imbalance is the biological materials are shrunk and distorted. To make a useful mount of this kind of subjects we must resort to two useful tricks.

1) In a series of capsules put a series of increasing concentrations of glycerin, starting with the 10% side of the scale (20, 50, 75 could be the other steps). Put your materials in the first one and leave enough time. (Of course you must guess, and try some times, until you found the correct one for your actual material. Twenty or thirty minutes are wise initial guesses.) Using a suitable spatula or a little brush or a wire loop, or even an eyedropper, transfer the materials with care from one capsule to the next, leaving them for the same time in any one. Perhaps after more or less two hours you are done. Transfer the subject in the drop onto the slide, as was explained before.

2) Often the first alternative is good enough. but Seinhorst (1959) working with difficult nematodes, designed a technique to gradually replace the fluids with glycerol without disrupting the organ structure of the worms. By the same nature the method is excellent for any delicate material.

The materials, first collected in water, were then transferred to a capsule with a 1% solution of glycerol in 20% alcohol (more or less).

alcohol 96 21 ml
water 78 ml
glycerol. . 1 ml

Now take a wide mouthed flask, with a screw cap, not very tall. One of those short and wide containers that hold creams for the skin or hair fixatives, are good. Put in the bottom a cap from another smaller diameter flask, as a platform to support the capsule. Pour in 96% ethanol almost to the height of the platform, and put the capsule with your materials on the platform. Spread some solid vaseline on the rim of the flask. Screw on the cap of the interchange chamber tightly and set aside for 12 to 24 hours in a warm place. It s better if you apply some heat, say 35-40 C. In the interim all water in the capsule was to be replaced by alcohol.

Now fill the capsule with a solution of 5% glycerol in 96% ethanol, and put it in a partly closed container. In 3 or 4 hours at 40 almost all ethanol has evaporated, and your subjects must be in almost pure glycerol. Normally you can now proceed to mount in pure glycerol.

3) One special case is the mounting of mixed microscopic microinvertebrates, which because of their minute size cannot be manipulated individually, or in sorted uniform groups, and must be mounted in some liquid media. (The samples we spoke about in the antiseptic water section). The following, although not easy to apply, is a useful protocol.

A. Fix and preserve the materials in a suitable fixative (GALA is a good
alternative). Allow at least 6 hours for a good fixation.
B. Have a look at the sample to see if they are the critters you are searching for.
If there is a need for some staining (await a future article) this is the moment to
apply it.
C. Take a sample (say 19 drops). Add 1 drops of glycerin mixing very well after
the addition. You now have a solution with 5% glycerin. Set aside for 15 minutes.
NS. Add a new drop of glycerin, mixing well.The concentration is now near 10%.
e. With a syringe and a fine hypodermic needle remove half of the supernatant
liquid. If you work with care you now have 10 drops with more or less 9 drops of
sample water and 1 drop of glycerin. (10% glyc.) Add 2 drops of glycerin and mix well
. This amounts to 12 drops (9 + 3) of 33% glycerin (more or less). Set aside for 15 min.
e. As the density of the liquid increases, so the sedimentation time is longer.
Give enough time to have almost all of your sample in the test tube or concave
capsule bottom.
F. Now take one clean slide and put one drop of the concentrated sediment in the
center. Mix well with another drop of pure glycerin or lactoglycerol (see below), and
Hoes. You must make a fair estimate of the volumes to have a very thin
preparation but full to the margins of the cover.
G. Seal if you wish. The method is not quick, nor easy, but gives you pretty good
preparations of many difficult to preserve microinvertebrates

OPMERKINGEN: Make your preparations as thin as you can. Resolution is impaired in thick liquid preparations, and also it affects the quality of the sealing. Always allow enough time for the sealant to set completely. Never use the 100x OI objective (if you have one), with unsealed preparations.

LG.- LACTOGLYCEROL

I should point out that glycerol has a mild clearing power, enhancing the transparency of fixed cytoplasms and other small opaque subjects. The combination of glycerol with lactic acid (a more powerful clearing agent) produces a medium that is very useful to allow a better observation of opaque materials and organisms, like worms, plant materials and specially small arthropods.

Lactoglycerol is normally a 50/50 mixture of both reagents, but you can freely use other percentages according to the clearing action required by your subjects. It is most often used as a temporary mountant, but with suitable precautions, a satisfactory preparation can be turned into a permanent one. The manipulations are much the same as with just glycerol, but sealing is more difficult.

Lactoglycerol is more dense and syrupy and is more difficult to clean the outside of the coverslip. You must anchor the four corners, waiting until the sealant is very well set. With an absorbent paper wipe all the excess liquid you can. With a soft absorbent tissue wetted with ethyl or methyl alcohol or even acetone clean the slide with care. Always try to have the thinnest preparation that you can. When you are satisfied of the cleanliness you have attained, seal with Valap. Inspect after a few days to be sure you have no break in the seal. Cover Valap with a layer of nail polish and finish with another of an automotive paint. Label your slide.

Pantin's solvents density gradient.- If you like to mount a micro-arthropod (a mosquito larva as an example) you must clear the organism if you want to see the details of its structure. One of the methods is to dissolve the soft parts (all the internal organs) with hypochlorite or potassium hydroxide. Both are potentially harmful.

A safer method, usually enough for our purposes is to use the lactoglycerol mixture as a clearing agent. If you submerse the subject directly in lactoglycerol you know the result: a wrinkled and awful organism, mostly unusable. You can resort to gradual changes of higher concentrations of lactoglycerol.

But Pantin at the end of the 1930 s proposed a very useful and elegant method that provides organisms beautifully cleared with only one (long) easy step.

Take a test tube or similar, put 2 or 3 ml of lactoglycerol at the bottom. With all your care, with a long pipette, glide 2 or 3 ml of glycerol over the first layer. You can disturb it a little but only at the very interface to start a process of mixing. Now in the same way, make an upper layer of 96% ethanol.

With your tweezers, or a glass bar, or an entomological mounted needle, pick the subject from the alcohol in which you have it stored, and drop it on the alcohol upper layer. The organism drops to the interface of alcohol-glycerol and stays floating there for a long while.

If it is your first time you'll certainly want to watch the process, but better you go to take a nap or make other observations you were planning.

The larvae or other organism you leave bathing in the alcohol slowly mixes with the layer of glycerol, interchanging the alcohol, and after a time it sinks to the interface of glycerol and lactoglycerol where it repeats the process.

At the end you could recover the organism from the bottom of your tube. Perfectly cleared and with much less distortion . and requiring less effort from you.

Experiment, and become addicted to the method.

The organism you have cleared can be mounted in lactoglycerol or in some of the more solid mountants I describe in the next article.


These four pictures show the clearing power of lactoglycerol. The mosquito larva was fixed in 70% alcohol, and cleared using the solvent density gradient of Pantin. The solution layers used were alcohol 70% - glycerin - lactoglycerol. The sunken larva was mounted in pure lactoglycerol. The third picture shows the nucleus of the cells inside the caudal paddles. The fourth one shows two muscular cells at the end of the body. The left one shows the nucleus. The right one shows that these are striated muscle cells. Focus was a compromise to show both details in one picture
Click the first photo to see a fully labeled picture.

Another method for using glycerol as a mountant.- As you see above the biggest problems with glycerol and lactoglycerol arose from their nature as being viscous and hygroscopic liquids. Microscopists solve this by converting glycerol to a solid. The commonest solid form is glycerin Jelly. I have two other useful formulae fructogel and glycogel.

All of them are explained in the third part of this series. In the next (second part), I will explore the use of gums and sugars alone or in several combinations.

Microscopy UK Front Page Micscape Magazine Article Library

Microscopy UK or their contributors.

Published in December 2002 Micscape Magazine.

Please report any Web problems or offer general comments to the Micscape Editor.

Micscape is the on-line monthly magazine of the Microscopy UK web site at Microscopy-UK


Bekijk de video: Sains Tahun 1: Kegunaan objek yang boleh dan tidak boleh menyerap air. (December 2021).