Informatie

RNA-integriteit en RNA-fragmentatie


Na RNA-isolatie en voor het volgen van experimenten, weet ik dat RNA-kwaliteit, de zogenaamde RNA-integriteit, zo belangrijk is. Dus waarom is er een RNA-fragmentatiekit? Hebben we RNA intact of gefragmenteerd nodig? (RNA wordt daarna gebruikt voor biotinylering en RT-qPCR)


Dit artikel gebruikt een vergelijkbare techniek als u door het zuiveren van totaal RNA, synthese van dubbelstrengs cDNA met een T7-promotersequentie, cDNA-zuivering, in vitro transcriptie in aanwezigheid van biotine-gelabelde ribonucleotiden en deze transcriptie is mogelijk met T7 RNA-polymerase aangezien de cDNA bevat het T7-promotergebied en tenslotte fractionering van RNA. Dit maakt vervolgens target-biotine-gelabeld RNA mogelijk voor korte (~ 25 nucleotiden) oligonucleotide-arrays. Het T7-polymerase voert een lineaire amplificatie uit en het verkregen in vitro RNA weerspiegelt de overvloed van elk transcript in het initiële RNA.

Daarom neem ik aan dat je een soortgelijk protocol volgt, hoewel ik niet zeker weet waarom je RT-qPCR doet op het gefragmenteerde RNA, aangezien het onwaarschijnlijk is dat dit werkt als je primers voor specifieke regio's gebruikt, aangezien alles gefragmenteerd is. Dus ik denk dat je vóór de fragmentatie een RT-qPCR doet om de expressieniveaus van bepaalde (bekende) genen te testen (om te zien of je de verwachte resultaten krijgt) voordat je doorgaat met fragmentatie en naar de globale RNA-expressie kijkt. Als mijn aannames onjuist zijn, zou het geweldig zijn als je meer details van je experimentele protocollen zou toevoegen met de verschillende stappen en de exacte volgorde van de gevolgde stappen en de beoordeelde resultaten en de uitgevoerde experimenten, zodat ik mijn reactie kan aanpassen.


Integriteit van SRP-RNA wordt verzekerd door La en de machines voor kwaliteitscontrole van nucleair RNA

De RNA-component van signaalherkenningsdeeltje (SRP) wordt getranscribeerd door RNA-polymerase III en de meeste stappen in SRP-biogenese vinden plaats in de nucleolus. Hier onderzoeken we de verwerking en kwaliteitscontrole van het gist SRP RNA (scR1). Net als bij andere pol III-transcripten eindigt scR1 in een U-kanaal en behoudt het rijpe scR1 een U4-5-sequentie aan zijn 3'-uiteinde. In cellen die het exonuclease Rex1 missen, eindigt scR1 in een langere U5-6-staart die vermoedelijk het primaire transcript vertegenwoordigt. Het 3' U-kanaal van scR1 wordt beschermd tegen afwijkende verwerking door de La-homoloog, Lhp1 en tot overexpressie gebracht Lhp1 concurreert blijkbaar met zowel het RNA-surveillancesysteem als de SRP-assemblagefactoren. Onverwacht zijn de TRAMP- en exosome nucleaire RNA-surveillancecomplexen ook betrokken bij de bescherming van het 3'-uiteinde van scR1, dat zich ophoopt in de nucleolus van cellen die de activiteiten van deze complexen missen. Verkeerd geassembleerd scR1 heeft een primaire afbraakroute waarin Rrp6 vroeg werkt, gevolgd door TRAMP-gestimuleerde exonuclease-afbraak door het exosoom. We concluderen dat de RNA-surveillancemachinerie een sleutelrol speelt in zowel de SRP-biogenese als de kwaliteitscontrole van het RNA, wat de beslissing tussen deze alternatieve lotgevallen mogelijk vergemakkelijkt.

© The Author(s) 2014. Uitgegeven door Oxford University Press in opdracht van Nucleic Acids Research.

Figuren

Mutaties in TRAMP en exosome...

Mutaties in TRAMP en exosoomcomponenten leiden tot accumulatie van afgeknot scR1. (AF)…

Het wijzigen van de Lhp1p-expressie beïnvloedt scR1...

Het veranderen van Lhp1p-expressie beïnvloedt scR1-niveaus in cellen die deficiënt zijn in SRP-kerneiwitten, ...

Het scR1 3'-uiteinde is veranderd in de afwezigheid van Lhp1 en in ...

Trf4, Rrp6 en Rrp44 associëren…

Trf4, Rrp6 en Rrp44 associëren met scR1. Sequentie-uitlezingen toegewezen aan scR1 waren ...

ScR1, maar geen SRP-eiwitten, ...

ScR1, maar geen SRP-eiwitten, hopen zich op in de nucleolus van cellen die Lhp1 tot overexpressie brengen.

ScR1 hoopt zich op in de nucleolus...

ScR1 hoopt zich op in de nucleolus van cellen die TRAMP- of exosoomactiviteiten missen. Gist…

Interacties van Lhp1 en RNA...

Interacties van Lhp1- en RNA-surveillancefactoren met scR1. Een model dat bevindingen integreert...


Fragmentatie van tRNA in aseksuele levenscyclusstadia van Phytophthora infestans en tijdens waardplantinfectie

Achtergrond: De oomyceet Phytophthora infestans bezit actieve RNA-uitschakelingsroutes, waardoor deze plantpathogeen vermoedelijk de grote aantallen transponeerbare elementen in zijn 240 Mb-genoom kan beheersen. Van kleine RNA's (sRNA's), centrale moleculen in RNA-silencing, is bekend dat ze ook een sleutelrol spelen in dit organisme, met name bij de regulatie van kritische effectorgenen die nodig zijn voor infectie van zijn aardappelgastheer.

Resultaten: Om aanvullende klassen van sRNA's in oomyceten te identificeren, hebben we diepe sequencing-uitlezingen in kaart gebracht om RNA's (tRNA's) over te dragen, waardoor de aanwezigheid van 19-40 nt van tRNA afgeleide RNA-fragmenten (tRF's) werd onthuld. Northern-blot-analyse identificeerde overvloedige tRF's die overeenkomen met halve tRNA-moleculen. Sommige tRF's stapelden zich differentieel op tijdens infectie, zoals te zien is door sRNA's te onderzoeken die zijn gesequenced uit P. infestans-aardappelinteractiebibliotheken. Het vermeende verband tussen tRF-biogenese en de canonieke RNA-uitschakelingsroutes werd onderzocht door gebruik te maken van haarspeld-RNA-gemedieerde RNAi om de genen die coderen voor P. infestans Argonaute (PiAgo) en Dicer (PiDcl) endoribonucleasen tot zwijgen te brengen. Door sRNA-sequencing laten we zien dat tRF-accumulatie PiDcl1-onafhankelijk is, terwijl Northern-hybridisaties verminderde niveaus van specifieke van tRNA afgeleide soorten in de PiAgo1-knockdown-lijn detecteerden.

conclusies: Onze bevindingen breiden de sRNA-diversiteit in oomyceten uit met fragmenten die zijn afgeleid van niet-eiwitcoderende RNA-transcripten en identificeren tRF's met verhoogde niveaus tijdens infectie van aardappel door P. infestans.


Resultaten

Monstervoorbereiding en gegevensbasis

Totaal RNA werd verkregen uit verschillende weefsels en verschillende organismen, voornamelijk mensen, ratten en muizen. Alle monsters werden geanalyseerd op de Agilent 2100 bioanalyzer. Voor de ontwikkeling van het algoritme werd een grote set gegevensbestanden beschikbaar gesteld door zowel het Resource Center for Genome Research [6] als Agilent. Het totale aantal monsters in de database bedraagt ​​in totaal 1208. Ongeveer 30% van de monsters is van bekende oorsprong van mens, muis en rat, geëxtraheerd uit lever, nier, colon, milt, hersenen, hart en placenta. De herkomst van de overige monsters was niet traceerbaar, maar het is bekend dat deze afkomstig zijn van zoogdiercellen of cellijnen. Voor de ontwikkeling van het algoritme was het belangrijk om samples van alle degradatiestadia in de database op te nemen. De uiteindelijke dataset omvatte veel intacte en bijna volledig gedegradeerde RNA-monsters (zie tabel 1 voor de verdeling van monsters). Gedeeltelijk afgebroken RNA-monsters kwamen minder vaak voor, maar waren nog steeds voldoende in aantal. Bovendien omvatte de dataset verschillende monsterconcentraties en verschillende extractiemethoden. Ook in de dataset werden tot op zekere hoogte afwijkingen gevonden. Dit leverde een realistische verzameling invoergegevens op met een representatieve basis voor alle stadia van RNA-afbraak.

Het toepassen van onze hieronder beschreven methode op de gegevensbasis levert een gesorteerde lijst met functies op, die werd gebruikt om functieruimten te construeren voor het trainen van regressiemodellen. Verder worden resultaten gegeven voor modellen op basis van kenmerken die in de literatuur worden voorgesteld. Ten slotte tonen we de correlatie van de RIN met de uitkomst van realtime PCR-experimenten.

Functie selectie

De totale RNA-ratio werd geselecteerd als eerste kenmerk dat 79% van de entropie van de categorische waarden dekt. De volgende twee kenmerken geven informatie over de 28S-regio: 28S-piekhoogte en de 28S-oppervlakteverhouding.

Het vierde kenmerk vergelijkt het 18S- en 28S-gebied met het gebied van de snelle regio. Kenmerk 5 is de waarde van een lineaire regressie op het eindpunt van het snelle gebied, terwijl het volgende kenmerk de hoeveelheid gedetecteerde fragmenten in het snelle gebied weerspiegelt. Vervolgens wordt de aan- of afwezigheid van de 18S-piek geselecteerd, waardoor het model onderscheid kan maken tussen zwakkere en sterkere degradatie. Het laatste kenmerk geeft de relatie van de totale gemiddelde waarde tot de mediaanwaarde. Omdat de gemiddelde waarde gevoelig is voor grote pieken, bevat deze informatie over volledig afgebroken RNA of over afwijkingen zoals pieken. Tabel 2 vat de resultaten van het functieselectieproces samen. Een interpretatie van deze kenmerken vanuit biologisch oogpunt wordt gegeven in de bespreking en een overzicht van alle kenmerken wordt gegeven in de aanvullende bestanden [zie Aanvullend bestand 2].

Modeltraining

Op basis van de gesorteerde lijst met functies hebben we neurale netwerken getraind als regressiemodellen en systematisch het aantal verborgen neuronen verhoogd van 0 naar 8, totdat het modelbewijs duidelijk afnam. Verder hebben we de functieruimte gevarieerd zoals beschreven in de vorige sectie. We hebben maximaal modelbewijs waargenomen met behulp van 5 tot 7 functies met 2 tot 5 neuronen in de verborgen laag. De waarden worden gemiddeld over de resultaten van een 10-voudige kruisvalidatieprocedure (Fig. 3).

Evidence-based modelselectie. Afhankelijkheid van modelbewijs op een logaritmische schaal van het aantal gebruikte kenmerken en van de mate van niet-lineariteit in de verborgen laag. De waarden zijn gemiddelde waarden over een 10-voudige kruisvalidatieprocedure. Het hoogste bewijs wordt bereikt voor modellen met respectievelijk 5 tot 7 invoerfuncties en 2 tot 5 verborgen neuronen. Al deze modellen hebben een lage generalisatiefout van minder dan 0,25.

Zoals verwacht is het modelbewijs sterk negatief gecorreleerd met de generalisatiefout (ρ = -0,93), wat aantoont dat het modelbewijs een verstandig modelselectiecriterium is (Fig. 3 en 4). We selecteerden de topologie met behulp van 5 functies en 4 verborgen neuronen als het meest waarschijnlijke model en voerden de laatste training uit op de hele trainingsgegevensset. De logwaarde voor het bewijs van het uiteindelijke model was iets hoger in vergelijking met de waarden tijdens kruisvalidatie (-74 vs. -100), terwijl de generalisatiefout stabiel was (MSE van 0,26). De kruisvalidatiefout bleek een goede schatting te zijn voor de generalisatiefout op de testgegevens.

Generalisatie fouten. Afhankelijkheid van de generalisatiefout van het model van het aantal gebruikte objecten en van de mate van niet-lineariteit in de verborgen laag. De waarden zijn gemiddelde waarden over een 10-voudige kruisvalidatieprocedure. Modellen met het hoogste bewijs (respectievelijk 5 tot 7 invoerkenmerken en 2 tot 5 verborgen neuronen) hebben een lage generalisatiefout van minder dan 0,25.

De functieselectieprocedure biedt in elke stap de lokale optimale aanvullende functie, die niet noodzakelijkerwijs zal leiden tot de wereldwijd beste combinatie. In de latere iteratiestappen bieden verschillende kandidaatkenmerken dezelfde winst in informatie over het doel en is er enige willekeur in de uiteindelijke selectie. Exploratief zoeken naar de beste combinatie is onhandelbaar vanwege de rekenkosten van het combinatorisch zoeken. In een aanvullende, handmatige optimalisatiestap werd toepassingskennis gebruikt om enkele functies te vervangen door plausibele alternatieven. Feature 3 en 4 werden vervangen door de oppervlakteverhouding in de snelle regio (fast.area.ratio). Daarnaast werd de markerhoogte geselecteerd. In het genormaliseerde elektroferogram maakt de markeringshoogte het mogelijk om sterk gedegradeerde monsters te detecteren, omdat dit het enige deel van het signaal is dat verschilt van de achtergrondruis. Deze combinatie heeft ook een relatieve MI-waarde van 0,83, maar het beste model met 5 verborgen neuronen had een logwaarde voor het bewijs van -42. Het bereikt een kruisvalidatiefout van 0,25 en een testfout van 0,25, wat iets beter is in vergelijking met de resultaten uit figuur 4. Beide modellen presteren even goed, de latere is gekozen voor de uiteindelijke implementatie in de expertsoftware omwille van van eenvoud.

Ten slotte evalueerden we regressiemodellen voor een subset van 400 monsters op twee verschillende functieruimten: de 28S/18S-verhouding en de functie berekend door de degradometersoftware [1]. Tabel 3 laat zien dat het RIN-model is gebaseerd op een functieruimte, met een hogere informatie-inhoud dan de andere twee modellen. Modelbewijzen geven aan dat het gebruik van een enkele functie resulteert in een lagere posterieure waarschijnlijkheid van het model. Dit is opnieuw consistent met de generalisatieprestaties van de modellen. De fout van het RIN-model is veertig keer lager in vergelijking met het 28S/18S-model en ongeveer twintig keer lager in vergelijking met het op de degradometer gebaseerde model als alle monsters in aanmerking worden genomen.

Als de monsters die zijn gelabeld ZWART door de degradometersoftware worden verwijderd uit de dataset (N = 186, 42%), de relatieve MI-waarde neemt toe tot 0,63, het bewijs bereikt een waarde van -121, terwijl de kruisvalidatiefout 0,60 is, wat nog steeds vier keer hoger is dan voor het RIN-model.

Modelevaluatie

Als een model een relatie uit experimentele gegevens moet halen, is het nuttig voor de modelevaluatie om de gegevens in de belangrijkste twee dimensies te onderzoeken, evenals om te controleren op grote foutwaarden die overeenkomen met categorische misclassificaties. Bovendien kan de modelvoorspelling worden vergeleken met controleparameters van vervolgexperimenten, zoals RT-PCR.

Visualisatie van beslissingsgrenzen

De 2D-visualisatie van de totale RNA-ratio en 28S-piekhoogte laat zien dat we hoge integriteitswaarden duidelijk kunnen scheiden van lage integriteitswaarden. De categorieën vormen clusters in deze ruimte. Zoals in de vorige paragraaf is vermeld, is de grens tussen categorieën echter niet scherp, wat te wijten is aan het feit dat degradatie een continu proces is.

Categorische verkeerde classificaties

Eenvoudige kenmerken zoals de ribosomale verhouding die slechts één aspect van het afbraakproces bestrijkt, hebben de neiging om grotere fouten te hebben voor bepaalde groepen experimenten. Dat wil zeggen, ze kunnen de categorieën niet goed van elkaar onderscheiden. Het is erg nuttig om te controleren of slechts een paar experimenten worden uitgewisseld over meer dan één categorische grens, dat wil zeggen dat het model alle aspecten van het afbraakproces dekt. Misclassificaties worden gemeten door Receiver Operating Characteristics (ROC, cf. [7]) voor het onderscheiden van elektroferogrammen uit verschillende groepen categorieën, terwijl de waarde van het gebied onder de ROC-curve (AUC: gebied onder de curve) een evenwichtige maatstaf is voor de classificatie fout.

We beschrijven kort en informeel hoe een ROC-curve wordt geconstrueerd. De elektroferogrammen worden gesorteerd in een geordende lijst volgens de integriteitsmaat die door het model wordt geschat. Voor een vaste classificatietaak wordt een ROC-curve geconstrueerd zoals hieronder beschreven voor de taak om elektroferogrammen van categorie 10 te onderscheiden van alle andere categorieën: loop door de gesorteerde lijst in aflopende volgorde. Controleer bij elke stap of het beschouwde item in categorie 10 valt of niet volgens het originele expertlabel. Als het waar is, teken dan een lijnfragment in verticale richting, als het onwaar is, teken het dan in horizontale richting. Een perfecte scheiding van categorie 10 van de andere zou impliceren dat de ROC-curve verticaal omhoog schiet op de y-as naar de maximale waarde, voordat de eerste horizontale stap wordt gezet. Willekeurige toewijzing van elektroferogrammen zou resulteren in een ROC-curve die overeenkomt met een diagonale lijn van de oorsprong naar de rechterbovenhoek. Een ROC-curve geeft een evenwichtige maatstaf voor de modelprestaties door integratie over alle mogelijke classificatiegrenzen heen. Elke grens komt overeen met een specifieke verhouding van gevoeligheid tot specificiteit, d.w.z. een specifiek punt op de ROC-curve.

Verschillende elektroferogrammen worden uitgewisseld tussen de aangrenzende categorieën 9 en 10 (AUC 0,96), wat natuurlijk is vanwege de ruis in de labeltoewijzingsstap. Zeer zelden zijn toewijzingen van elektroferogrammen van categorie 10 tot categorie 8 of minder (AUC 0,98). Tussen categorie 7 en categorie 10 wordt slechts 1 elektroferogram uitgewisseld (AUC 0.999, zie fig. 5).

Werkingskenmerken van de ontvanger van categorische misclassificaties. De afbeelding toont de werkingskenmerken van de ontvanger voor het onderscheiden van elektroferogrammen van categorie 10 ten opzichte van de ingestelde unie van andere categorieën. Het gebied onder de curve (AUC) geeft een maatstaf voor de classificatieprestaties. Willekeurige toewijzing is gelijk aan een oppervlakte van 0,5, terwijl perfecte toewijzing gelijk is aan een oppervlakte van 1,0. Slechts weinig experimenten worden uitgewisseld over meer dan één categorische grens.

Het berekenen van de AUC-waarde voor alle andere verstandige groepen categorieën laat zien dat categorische misclassificaties zelden worden waargenomen. De gemiddelde AUC-waarde is 98,7 met een standaarddeviatie van 1,4. Tabel 4 vat de categorische fouten samen over alle mogelijke reeksen experimenten.

Correlatie met de uitkomst van experimenten

Correlatie van RIN-waarden met stroomafwaartse experimenten is van cruciaal belang. Enerzijds zal een goede correlatie de validiteit van deze benadering aantonen. Aan de andere kant maakt het de bepaling van drempelwaarden mogelijk om zinvolle stroomafwaartse gegevens te verkrijgen. Voor tweekleurige microarray-experimenten zou dit bijvoorbeeld kunnen betekenen dat de twee invoermonsters niet meer dan een bepaald aantal RIN-klassen mogen verschillen, terwijl ook de laagste acceptabele RIN kan worden bepaald.

In de huidige studie werden RIN-waarden en ribosomale ratio's gecorreleerd met realtime PCR-gegevens. Een gedetailleerde beschrijving van de monstertypes en extractiemethoden en van de gehele experimentele opstelling is eerder gepubliceerd [5]. Kortom, een genscore werd berekend op basis van het gemiddelde schijnbare expressieniveau van 4 verschillende huishoudgenen (GAPDH, KYNF, NEFL, β 2M) zoals gemeten door real-time PCR. Houd er rekening mee dat in dit experiment verschillen in de schijnbare genexpressieniveaus worden geïnduceerd door voortschrijdende afbraak van het RNA-stringmateriaal. Figuur 6 toont de grafiek van de gemiddelde schijnbare genexpressie op een logaritmische schaal tegen de RIN. Onmiddellijk verschijnen er 2 clusters van gegevens die overeenkomen met hoge genexpressie (intact RNA) met een hoge RIN-waarde en lage genexpressie (afgebroken RNA) met een lage RIN-waarde. Aan de andere kant vertoont de ribosomale verhouding slechts een zwakke correlatie met het experimenteel waargenomen genexpressieniveau (RNA-integriteit). Het RIN zorgt voor een eenvoudige scheiding in positieven en negatieven, terwijl de ribosomale verhouding veel meer experimenten zou afwijzen dan nodig is. De historische waarde van 2,0 zou ongeveer 40 experimenten van goede kwaliteit verwerpen en een waarde van 1,75 resulteert in ongeveer 15 fout-negatieven.

Correlatie tussen RNA-integriteit en rt-PCR-experimenten. De figuur toont de correlatie tussen RNA-integriteitswaarden en de uitkomst van een realtime-PCR-experiment, d.w.z. de gemiddelde expressiewaarden van 4 huishoudgenen (GAPDH, KYNF, NEFL, β 2M). De verticale lijn is een betekenisvolle drempelwaarde voor RIN-classificatie, terwijl de horizontale een scheiding maakt tussen acceptabele en onaanvaardbare real-time PCR-resultaten, a) De RIN vertoont een sterke correlatie (0,52) met de expressiewaarde van de huishoudgenen. Een duidelijke scheiding in positieven en negatieven is mogelijk. b) De ribosomale ratio vertoont een slechte correlatie (0,24) met de expressiewaarde van de huishoudgenen.


Resultaten

Afbraak van RNA in vaste toestand in aanwezigheid of afwezigheid van een vochtige atmosfeer

We evalueerden eerst de stabiliteit van twee RNA-soorten bij kamertemperatuur. Eerst ingekapseld β-galactosidase-mRNA-monsters werden tot 6 maanden bij kamertemperatuur bewaard en op een elektroforesegel gelopen (Figuur la). Op basis van de metingen van de fluorescentie-intensiteit van de banden kan men concluderen dat er in deze periode geen significante degradatie heeft plaatsgevonden (Figuur 1a). Daarna vergeleken we de afbraakkinetiek van rRNA bij volledige bescherming tegen lucht en bij blootstelling aan lucht. Zoals te zien is in figuur 1b, vertoonde RNA blootgesteld aan lucht een duidelijke degradatie: na 92 ​​weken bij kamertemperatuur was er geen intact 28S rRNA-molecuul te zien en de RIN-waarde daalde van 7,3 naar 2,0. Daarentegen daalde het RIN-getal bij bescherming tegen lucht licht van 7,2 naar 6,8 na 23 maanden bij kamertemperatuur.

RNA-afbraak bij kamertemperatuur in aanwezigheid of afwezigheid van een vochtige atmosfeer. β-Galactosidase mRNA-monsters (een) en totaal RNA (BNS) werden gedroogd en ingekapseld onder anoxische en watervrije atmosfeer. Na incubatie bij kamertemperatuur, bij -20 ° C of bij 90 ° C, werden porties die overeenkomen met 500 ng van de initiële RNA-hoeveelheden gedurende 3 minuten bij 75 ° C gedenatureerd en op agarosegel gelopen. (een) Afbraak van HPLC-gezuiverd β-galactosidase-mRNA. Het aandeel niet-afgebroken mRNA in minicapsules die bij -20 ° C zijn bewaard, wordt onder elke baan gegeven (de experimenten werden in drievoud uitgevoerd, maar er wordt een enkele representatieve gel getoond). '-80 °C': RNA 24 weken bewaard bij -80 °C. ‘-20 °C’: RNA in minicapsules 24 weken bewaard bij -20 °C. (B) Afbraak van totaal RNA bij kamertemperatuur. De helft van de capsules werd geopend en blootgesteld aan lucht. De verhoudingen van de fluorescentie-intensiteiten van 28S-rRNA en 18S-rRNA, evenals de RIN-waarden worden voor elk monster onder de respectieve rijstroken gegeven. (C) Totale RNA-afbraak bij 90 °C in afwezigheid van lucht (minicapsule-omstandigheden). Totaal-RNA-monsters werden gedroogd en bewaard onder anoxische en watervrije atmosfeer in minicapsules. Ze werden verwarmd tot 90 ° C onder 50% relatieve vochtigheid (RH). Er werden twee kinetica uitgevoerd gedurende 8 uur en 240 uur. Vijfhonderd nanogram totaal-RNA-monsters werden geanalyseerd op elektroforesegels. Het aandeel intact 28S-molecuul, gemeten door de Bio1D-software, wordt voor elk tijdstip aangegeven (de experimenten werden in drievoud uitgevoerd, een enkele representatieve gel wordt getoond). (NS) Hetzelfde als in (C), maar met RNA blootgesteld aan lucht onder 50% RH (de experimenten werden in drievoud uitgevoerd, een enkele representatieve gel wordt getoond).

Om het verschil in afbraaksnelheid van RNA te kwantificeren dat bewaard is gebleven in de aanwezigheid of afwezigheid van een vochtige atmosfeer, werd RNA-veroudering versneld door verhitting. Afbraak van totaal RNA werd uitgevoerd bij 90 ° C, hetzij in gesloten capsules of in geopende capsules, en geplaatst in een atmosfeer van 50% relatieve vochtigheid (relatieve vochtigheidsregeling was nodig om RNA in dezelfde hydratatietoestand te houden als bij kamertemperatuur).

Figuren 1c en d laten zien dat na 8 uur blootstelling aan 50% relatieve vochtigheid de hoeveelheid 28S rRNA-band niet langer meetbaar was, terwijl, wanneer beschermd tegen lucht, ongeveer 90% van de 28S-band nog steeds aanwezig was. De degradatiesnelheidsconstanten bij 90 °C, k90 °C, zoals bepaald door exponentiële curve-aanpassing, waren respectievelijk 7,7 × 10 −10 /nt/s en 1,9 × 10 −8 /nt/s voor RNA beschermd of onbeschermd tegen vochtige lucht. Dit komt overeen met een 25-voudige toename van de afbraaksnelheidsconstante bij 90 °C.

Bepaling van de kettingbreuksnelheid bij kamertemperatuur van luchtbeschermd RNA in vaste toestand

Omdat de RNA-afbraaksnelheid bij kamertemperatuur in de minicapsules langzaam was, was het niet mogelijk om deze gedurende de tijd van het onderzoek direct te meten. Het kan echter worden geschat door het Arrhenius-model te gebruiken op gegevens die zijn ontleend aan kinetiek die bij verschillende temperaturen is uitgevoerd. Om een ​​grote verscheidenheid aan monsters te verkrijgen, gebruikten we RNA-monsters die verschilden in hun oorsprong (bacteriën en menselijke cellijnen) en de aard van de resuspensiebuffer die aan het einde van de extractie werd gebruikt (10 m M Tris-HCl pH 7, 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 8 en RNAse-vrij water pH 7,2). Tweeënzeventig kinetiek werd uitgevoerd bij temperaturen variërend van 50 tot 130 ° C (niet getoond). Het aandeel van twee intacte RNA-soorten (humaan 28S-rRNA en E coli 23S-rRNA in totaal-RNA-monsters) in de loop van de tijd gevolgd. Aanvullend figuur 1, aanvullend materiaal, is een representatief voorbeeld van deze kinetiek.

R-software werd gebruikt voor het bepalen van de snelheidsconstante voor het breken van de streng kt van elk van de kinetica. De kt waarden en de betrouwbaarheidsintervallen voor alle RNA-soorten (28S en 23S) werden gemiddeld. het logboek10 van deze waarden gaf een rechte lijn wanneer uitgezet als een functie van 1/T (K 1) (Figuur 3). De temperatuurafhankelijkheid van de RNA-strengbrekingssnelheden volgde het Arrhenius-model. Er werden geen discrepanties gevonden tussen de 28S en de 23S strengbrekende snelheidsconstanten. Zo kon de degradatiesnelheidsconstante bij kamertemperatuur in afwezigheid van zowel atmosferisch water als zuurstof worden bepaald door lineaire extrapolatie en werd geschat op 3,2 10 −13 /nt/s bij 25 °C met een 95%-betrouwbaarheidsinterval van (2,3– 4.2) 10 −13 /nt/s. Dit experiment bevestigde ook de afname van de stabiliteit veroorzaakt door blootstelling aan vocht (Figuur 3, druppelgegevenspunt).

Afhankelijkheid van de grootte van de RNA-afbraaksnelheid in de minicapsules

De degradatiesnelheidsconstanten bij 90 ° C werden berekend voor vijf mRNA-soorten door lineaire regressie van de plots van CQ waarden als functie van de tijd (gegevens niet getoond). Deze snelheidsconstanten bleken evenredig te zijn met de afstand tussen de 5′ van de terminale poly(A) en het 5′-uiteinde van het amplicon (Figuur 2) (ja= 6.10 −10 * (grootte in nt), R 2 = 0,84). Dit suggereert dat in de minicapsules de RNA-afbraaksnelheid voornamelijk afhangt van de grootte ervan en kan worden beschouwd als onafhankelijk van de sequentie en van de aanwezigheid van lokale structuren.

Afbraaksnelheden als een functie van RNA-lengte op verschillende mRNA-soorten. Totaal-RNA-monsters in minicapsules werden verwarmd tot 90 ° C om veroudering te versnellen. Omgekeerde transcriptiereacties werden opgezet met behulp van (dT)18 oligonucleotiden. De qPCR-reacties werden uitgevoerd met behulp van een SybrGreen-fluorescerende kleurstof en transcript-specifieke oligonucleotiden van TBP, β2M, GAPDH, TUBA1B en PSMB6 zoals beschreven in materialen en methoden (zie tabel 1). Voor elk tijdstip, de CQ waarde werd gemeten en uitgezet als functie van de tijd t. De relatie CQ=f(t) was lineair voor elke mRNA-soort (niet getoond) en maakte de berekening van de afbraaksnelheidsconstanten bij 90 ° C, k. k werd uitgezet als een functie van de afstand tussen het 3'-uiteinde van de mRNA-soort (+18 nucleotiden) en het 5'-uiteinde van de voorwaartse primer. De rechte lijn is een lineaire passing door de gegevenspunten.

Eindelijk, de genormaliseerde berekende k waarden voor elke mRNA-soort werden gerapporteerd op de Arrhenius-grafiek (Figuur 3, kleine cirkels). Deze waarden komen overeen met de andere gegevens die in de Arrhenius-grafiek zijn samengevat.

Temperatuurafhankelijkheid van de degradatiesnelheidsconstante van RNA opgeslagen in de minicapsules uitgezet volgens het Arrhenius-model. Afbraaksnelheden (k) van 23S rRNA geresuspendeerd na zuivering in water (open vierkanten), Tris-HCl-EDTA (open ruitjes) of alleen Tris-HCl (open cirkels) en die van 28S rRNA geresuspendeerd in water (gesloten ruit) werden bepaald bij temperaturen van 50 tot 130 °C met R-software (28S=5070 nt 23S=2904 nt, mRNA=3313 nt). Afbraaksnelheden van vijf mRNA-soorten werden berekend via RT-qPCR-reacties (Figuur 2). Logboek10(k) waarde werd uitgezet als een functie van 1/T. Betrouwbaarheidsinterval (95%) werd berekend met R-software zoals beschreven in Methoden. Ter vergelijking: het logboek10(k) overeenkomend met het 23S-rRNA geïncubeerd in geopende minicapsules onder 50% RH bij 90 ° C (druppel) werd ook uitgezet.

QPCR-validatie-experimenten op in minicapsules opgeslagen RNA

Aangezien RT-qPCR-metingen veel worden gebruikt, met name voor analyse van genexpressie, was het noodzakelijk om dit soort experimenten uit te voeren op verouderde RNA-monsters. Ingekapseld humaan totaal RNA werd gedurende toenemende perioden verwarmd tot 90 °C. De gerehydrateerde RNA-monsters werden onderworpen aan een willekeurig geprimede reverse transcriptie en qPCR-reacties werden uitgevoerd op acht RNA-soorten met zeer verschillende expressieniveaus in HeLa-cellen. Als controles werden RT-qPCR-reacties voor TUBA1B- en 18S-amplicons uitgevoerd op RNA-oplossingen die bij -80 ° C waren bewaard. Figuur 4 laat ofwel geen significante veranderingen ofwel een lichte stijging van de CQ waarden voor EEF1a1 en β2M qPCR-reacties.

Evolutie van CQ als functie van de tijd bij 90 °C. RT-qPCR-reacties en CQ berekeningen werden uitgevoerd zoals beschreven in Materialen en methoden op amplicons van de volgende transcripten: TUBA1B (open ruiten), PSMB6 (open vierkanten), PPIE (gesloten cirkels), TBP (open cirkels), EEF1a1 (open driehoeken), β2M (gesloten vierkanten), GAPDH (gesloten ruiten) en 18S rRNA (gesloten driehoeken). De hellingen van de lineaire regressies zijn aangegeven voor elk amplicon.

De PCR-efficiëntie van de qPCR-reacties bleef stabiel over de kinetiek voor elk amplicon (SD's van de gemiddelde efficiëntie voor elk amplicon waren tussen 0,01 en 0,17 en correleerden niet met de degradatie-evolutie in de tijd). Deze gegevens komen overeen met eerdere onderzoeken die geen verandering in PCR-efficiëntie met RNA-afbraak aantonen. 25

Geen verschil in CQ waarden werden waargenomen tussen de controleoplossing bewaard bij -80 ° C en het ingekapselde RNA (TUBA1B: CQ= 20.55 en CQ= 20,54 en 18S-rRNA: CQ= 7.7+/−0.15, N= 4). Deze gegevens evenals andere (onafhankelijke evaluaties, te publiceren) suggereren dat er geen vertekening is in de RT-qPCR-uitkomst tussen RNA dat is opgeslagen in de minicapsules en RNA dat is opgeslagen in een oplossing bij -80 °C.

Concluderend bleef RNA compatibel met analyses door RT-qPCR wanneer het werd bewaard in minicapsules (zie discussie).


MRIN voor directe beoordeling van genoombrede en genspecifieke mRNA-integriteit van grootschalige RNA-sequencinggegevens

Het volume van RNA-Seq-datasets in openbare repositories is exponentieel gegroeid, wat ongekende mogelijkheden biedt om genexpressieregulatie te bestuderen. Omdat gedegradeerde RNA-monsters, zoals die verzameld uit postmortale weefsels, kunnen resulteren in verschillende expressieprofielen met mogelijke vooroordelen, is kwaliteitscontrole een bijzonder belangrijke stap bij het ontginnen van deze gegevens. Hier ontwikkelen we een methode met de naam mRIN om de mRNA-integriteit direct te beoordelen op basis van RNA-Seq-gegevens op monster- en individueel genniveau. We analyseren systematisch grootschalige RNA-Seq-gegevenssets van het transcriptoom van de menselijke hersenen gegenereerd door verschillende consortia. Onze analyse toont aan dat 3'-bias als gevolg van gedeeltelijke RNA-fragmentatie in postmortale weefsels een duidelijke invloed heeft op globale expressieprofielen, en dat mRIN monsters met verschillende niveaus van mRNA-afbraak effectief identificeert. Onverwacht heeft dit proces een reproduceerbare en genspecifieke component, en transcripten met verschillende stabiliteiten worden geassocieerd met verschillende functies en structurele kenmerken die doen denken aan mRNA-verval in levende cellen.

Figuren

Figuur 1. Impact van vermoedelijke mRNA-degradatie...

Figuur 1. Impact van vermoedelijke mRNA-degradatie op globale genexpressieprofilering.

Figuur 2. mRIN meet effectief mRNA-integriteit...

Figuur 2. mRIN meet effectief mRNA-integriteit van RNA-Seq-gegevens.

( een ) Schematische voorstelling…

Figuur 3. Vergelijking van mRIN met RIN...

Figuur 3. Vergelijking van mRIN met RIN en andere QC-statistieken.

Figuur 4. Vergelijking van mRIN en RIN...

Figuur 4. Vergelijking van mRIN en RIN bij het voorspellen van veranderde genexpressieprofielen.

Figuur 5. Genspecifieke degradatie en hun functionele...

Figuur 5. Genspecifieke degradatie en hun functionele en transcript structurele kenmerken.


DISCUSSIE

Een aanzienlijk deel van de exRNA's is niet ingekapseld in EV's, maar het extracellulaire niet-vesiculaire RNAoom is nog niet op een alomvattende manier bestudeerd. Door extracellulaire RNasen te remmen, benadrukken onze resultaten dat de niet-vesiculaire exRNA-fractie zeer dynamisch is. Deze experimentele benadering stelde ons in staat om exRNA-profielen te verkrijgen met een ongekend detailniveau en met temporele resolutie. Verder zijn we erin geslaagd extracellulaire tRNA's en ribosomen van volledige lengte te stabiliseren, die niet eerder buiten EV's zijn geïdentificeerd vanwege hun gevoeligheid voor extracellulaire ribonucleasen. Daarentegen bleken sommige van hun fragmenten zeer stabiel te zijn en ze definiëren gezamenlijk het niet-vesiculaire RNAoom onder standaardomstandigheden, vooral in de aanwezigheid van serum. Deze resultaten hebben ingrijpende gevolgen voor de manier waarop we de mechanismen begrijpen die verantwoordelijk zijn voor de afgifte van RNA.

De aanwezigheid van ribosomale aggregaten in de extracellulaire EV-arme fractie wordt verder ondersteund door de co-isolatie van rRNA's, ribosomale eiwitten en polyA+-mRNA's uit dezelfde chromatografische fracties. Extracellulaire ribosomen werden in de jaren 70 beschreven in de blaasvlieg Calliphora vicina ( 39) maar vervolgens gekoppeld aan een experimenteel artefact ( 40) en sindsdien weinig aandacht gekregen. We hebben echter aangetoond dat extracellulaire ribosomen op zijn minst tijdelijk voorkomen in de media van gekweekte zoogdiercellen en mogelijk ook in lichaamsvloeistoffen. Ter ondersteuning van dit laatste is recentelijk een gemodificeerde small-RNA-sequencingmethode gerapporteerd die de identificatie van mRNA-fragmenten in bloedplasma of serum mogelijk maakt (41). Opvallend was dat de auteurs ontdekten dat de distributie en lengte van de read-mapping naar mRNA's deed denken aan ribosoomprofilering, wat suggereert dat de fragmenten waarvan de sequentie is bepaald de voetafdrukken kunnen zijn van ribosomen die in biovloeistoffen circuleren.

Er is steeds meer bewijs dat aantoont dat EV's in feite meer ncRNA's van volledige lengte bevatten dan microRNA's of ncRNA-fragmenten. De pieken van Bioanalyzer die overeenkomen met intacte 18S- en 28S-rRNA's zijn bijvoorbeeld geïdentificeerd in gezuiverde EV's (32, 42-45), terwijl YRNA's van volledige lengte en andere ncRNA's zijn geïdentificeerd door middel van sequencing, RT-qPCR en/of Northern blot (17 , 46). Het gebruik van thermostabiele groep II-intron-reverse-transcriptasen (TGIRT-seq) heeft de identificatie van tRNA's van volledige lengte in EV's mogelijk gemaakt, die aanzienlijk meer zijn dan tRNA-afgeleide fragmenten (47-49). Onze resultaten zijn consistent met deze rapporten en tonen duidelijk de aanwezigheid van tRNA's en 7SL-RNA's in EV's die zijn gezuiverd door drijvende dichtheidsflotatie in lineaire iodixanol-gradiënten. Op het niveau van gevoeligheid dat haalbaar is door op DIG gebaseerde Northern-blotting, waren tRNA-afgeleide fragmenten niet detecteerbaar in EV's (Figuur 4H). Daarom lijkt TGIRT-seq de resultaten niet te beïnvloeden in de richting van tRNA's van volledige lengte (48), en geeft het een beeld van het RNA-gehalte van EV's dat goed overeenkomt met onze Northern-blot-resultaten. Dit kan echter veranderen wanneer EV's worden gezuiverd uit gestresste cellen. Gezien het feit dat gestreste cellen tRNA-afgeleide fragmenten opreguleren (23, 24) en dat veranderingen in intracellulaire RNA-profielen worden weerspiegeld in EV's (50), is het redelijk om te speculeren dat EV's afkomstig van gestresste cellen hogere ladingen van door stress geïnduceerde tRNA-helften zouden kunnen bevatten ( 51).

Niet-vesiculaire exRNA's hebben tot voor kort heel weinig aandacht gekregen (15). In het verleden hebben we het kleine RNA-gehalte tussen EV's en 100.000 xg supernatanten van celgeconditioneerd medium vergeleken en ontdekten dat de EV-arme fractie sterk verrijkt was in 5'-tRNA-helften van precies 30 of 31 nucleotiden en bijna uitsluitend afgeleid van glycine of glutaminezuur-tRNA's (16). Vergelijkbare resultaten werden verkregen door andere groepen die werkten aan primaire kweken van glioblastoom (17). Bovendien worden glycine-tRNA-helften voornamelijk buiten EV's in serum gevonden (20) en zijn ze alomtegenwoordig in veel biovloeistoffen, waaronder serum, urine, speeksel en gal (18). We laten nu zien dat deze fragmenten niet direct uit cellen worden vrijgegeven in vitro. In plaats daarvan worden ze gegenereerd in de extracellulaire ruimte (Figuur 6). Verrijking van deze fragmenten, vooral wanneer ze worden aangetroffen in de EV-arme fractie, is waarschijnlijk een gevolg van hun differentiële extracellulaire stabiliteit in plaats van hun preferentiële of selectieve secretie. Dit wordt verder ondersteund door de recente waarneming dat circulaire RNA's, waarvan bekend is dat ze zeer stabiel zijn, in bijna alle menselijke biovloeistoffen worden verhoogd in vergelijking met gematchte weefsels (52).

Voorgesteld model. (EEN) Cellen in kweek geven tRNA's, ribosomale subeenheden of ribosomen af ​​aan de extracellulaire ruimte, zelfs buiten EV's. Wanneer de CCM wordt geanalyseerd door SEC, definiëren deze RNA's respectievelijk de P0- en P1-pieken (i). Hun detectie is echter alleen mogelijk na toevoeging van RI aan het medium. Actieve secretie (bijv. Autofagie-afhankelijk) kan bijdragen aan niet-vesiculaire exRNA-profielen, maar beschadigde of dode cellen met een aangetaste plasmamembraanintegriteit kunnen kwantitatief belangrijker zijn. Extracellulaire RNasen degraderen niet-vesiculaire RNA's en genereren stabiele fragmentatieproducten zoals glycine-tRNA-helften (ii), die kunnen assembleren tot dimeren en elueren in de chromatografische P1-piek, zelfs in afwezigheid van RI. De P2-piek is waarschijnlijk samengesteld uit rRNA-afgeleide fragmenten (rRF's) die stevig gebonden dsRNA's vormen die niet vatbaar zijn voor standaard kleine RNA-sequencingtechnieken. Hoewel tRNA's en YRNA's van volledige lengte niet worden gedetecteerd in de niet-EV-fractie in afwezigheid van RI, worden degenen die aanwezig zijn in EV's beschermd tegen afbraak. EV's zijn dus waarschijnlijk de enige bron van ncRNA's van volledige lengte in RNase-rijke extracellulaire monsters. Over het algemeen vertegenwoordigt dit diagram de opmerkelijke verschillen tussen wat wordt gesequenced in de extracellulaire ruimte in afwezigheid van RI en wat cellen daadwerkelijk vrijgeven, zoals onthuld door RI-SEC-seq. (B) Een diagram met uitleg over mogelijke biogenetische routes voor extracellulair, niet-vesiculair tRNA Gly GCC 5' helften.

Voorgesteld model. (EEN) Cellen in kweek geven tRNA's, ribosomale subeenheden of ribosomen af ​​aan de extracellulaire ruimte, zelfs buiten EV's. Wanneer de CCM wordt geanalyseerd door SEC, definiëren deze RNA's respectievelijk de P0- en P1-pieken (i). Hun detectie is echter alleen mogelijk na toevoeging van RI aan het medium. Actieve secretie (bijv. Autofagie-afhankelijk) kan bijdragen aan niet-vesiculaire exRNA-profielen, maar beschadigde of dode cellen met een aangetaste plasmamembraanintegriteit kunnen kwantitatief belangrijker zijn. Extracellulaire RNasen degraderen niet-vesiculaire RNA's en genereren stabiele fragmentatieproducten zoals glycine-tRNA-helften (ii), die zich kunnen assembleren tot dimeren en elueren in de chromatografische P1-piek, zelfs in afwezigheid van RI. De P2-piek is waarschijnlijk samengesteld uit rRNA-afgeleide fragmenten (rRF's) die stevig gebonden dsRNA's vormen die niet vatbaar zijn voor standaard kleine RNA-sequencingtechnieken. Hoewel tRNA's en YRNA's van volledige lengte niet worden gedetecteerd in de niet-EV-fractie in afwezigheid van RI, worden degenen die aanwezig zijn in EV's beschermd tegen afbraak. EV's zijn dus waarschijnlijk de enige bron van ncRNA's van volledige lengte in RNase-rijke extracellulaire monsters.Over het algemeen vertegenwoordigt dit diagram de opmerkelijke verschillen tussen wat wordt gesequenced in de extracellulaire ruimte in afwezigheid van RI en wat cellen daadwerkelijk vrijgeven, zoals onthuld door RI-SEC-seq. (B) Een diagram met uitleg over mogelijke biogenetische routes voor extracellulair, niet-vesiculair tRNA Gly GCC 5' helften.

Levende cellen kunnen een representatieve fractie van hun cytoplasma afgeven door mechanismen zoals cytoplasmatische extrusie (53) of amfisoomfusie met het plasmamembraan (32) en deze mechanismen kunnen betrokken zijn bij de afgifte van niet-vesiculaire ribosomen en tRNA's naar de extracellulaire ruimte. Een paar gebeurtenissen van cellulaire schade of dood kunnen echter kwantitatief belangrijker zijn bij het definiëren van exRNA-profielen, zoals hierboven is besproken. Ter ondersteuning hiervan is aangetoond dat extracellulaire rRNA-niveaus correleren met extracellulaire lactaatdehydrogenase (LDH) -activiteit, die veel wordt gebruikt als een marker van celdood (54). Hoewel exRNA-analyse afgeleid van dode cellen kan worden beschouwd als een artefact van celcultuur, zijn er situaties waarin niet-napoptotische, immunogene celdood (ICD) optreedt met abnormale frequenties in een organisme. Deze situaties omvatten veroudering (55), trauma (56), ischemie-reperfusieschade (57), infectieziekten en kanker. In het laatste geval kan ICD optreden vanwege de hypoxische inwendige massa die kenmerkend is voor solide tumoren of na behandeling met cytotoxische middelen (58). In alle gevallen geven stervende cellen intracellulaire componenten af ​​die worden waargenomen door aangeboren immuuncellen en worden geïnterpreteerd als schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMP's). Bovendien omvat de therapeutische activiteit van verschillende geneesmiddelen tegen kanker die ICD uitlokken een autocrien en paracrien circuit dat ten minste gedeeltelijk afhangt van de afgifte van zelf-RNA's door gestresste of stervende kankercellen (59). Omdat rRNA's en tRNA's intracellulair zeer overvloedig aanwezig zijn en ze worden blootgesteld in de extracellulaire ruimte in geval van schade, en aangezien RNA's actief worden waargenomen door het aangeboren immuunsysteem (60, 61), veronderstelden we dat exRNA-bevattende niet-vesiculaire complexen zouden kunnen worden begiftigd met immunomodulerende vermogens. De hoge omzet van deze complexen als gevolg van extracellulaire RNasen zou activering onder fysiologische omstandigheden kunnen voorkomen.

Wat betreft het ribonuclease dat verantwoordelijk is voor extracellulaire, niet-vesiculaire tRNA-splitsing, het is duidelijk een van serum afgeleid ribonuclease in FBS-bevattende monsters (waarschijnlijk RNase A zelf). Wanneer serum niet aanwezig of sterk verdund is, zoals na het grondig wassen van cellen met serumvrije media of buffers, is het mogelijk dat endogene uitgescheiden RNasen verantwoordelijk zijn voor het vormgeven van niet-vesiculaire exRNA-profielen. Gestresste kankercellen scheiden enzymen af ​​om enkele metabolische reacties in de extracellulaire ruimte uit te voeren en nemen vervolgens de enzymatische producten op om cellulaire energie te voeden (62). Naar analogie komen we in de verleiding om te speculeren dat uitgescheiden RNasen zoals ANG een rol zouden kunnen spelen in het extracellulaire RNA-metabolisme, waardoor de toxiciteit die gepaard gaat met hun intracellulaire activiteit in niet-gestresste cellen wordt voorkomen (63). Hoewel de functie van ANG bij tRNA-splitsing gedeeltelijk overbodig lijkt te zijn (36, 64), moeten de implicaties ervan in extracellulaire RNA-splitsing onder fysiologische omstandigheden nog worden opgehelderd. Redundantie kan lager zijn in serumvrije omgevingen zoals het zenuwstelsel, waar verschillende mutaties in ANG functioneel zijn gekoppeld aan neurodegeneratieve ziekten (65). We hebben voorlopig bewijs geleverd dat suggereert dat extracellulaire, niet-vesiculaire RNA's of RNP's betrokken zijn bij immuunsurveillance. Een verband tussen mutaties in ANG en gedereguleerde extracellulaire RNA-fragmentatiepatronen is dus mogelijk bij ziekten zoals ALS waarvan de etiologie of evolutie nauw verbonden is met ontsteking (66).

Bacterieel rRNA en tRNA's induceren Toll-like receptor (TLR)-afhankelijke DC-rijping en IL-1β-secretie en worden daarom beschouwd als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. Om een ​​dergelijke respons op te wekken, lijkt toevoeging van de gezuiverde RNA's met kationische lipiden echter essentieel (67). Daarentegen hebben we hoge extracellulaire niveaus van IL-1β verkregen bij het incuberen van BMDC met ongeveer één microgram RNA verkregen uit de P0-piek van MCF-7-cellen (voornamelijk samengesteld uit ribosoomdeeltjes) in afwezigheid van enig transfectiereagens. Opvallend was dat dit effect verloren ging bij het incuberen van DC's met RNase A-voorbehandeld P0. Het moet nog worden opgehelderd of RNA zelf of mogelijk geassocieerde RNA-bindende eiwitten verantwoordelijk zijn voor deze effecten. We pakken enkele beperkingen in ons experimentele ontwerp aan, waaronder de incubatie van van de mens afgeleide RNA's met dendritische cellen van muis. Deze resultaten moeten dus met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Vervolgstudies zullen bevestigen of extracellulaire niet-vesiculaire RNA's actieve spelers zijn in immuunsurveillance.

Hoewel niet wordt voorspeld dat extracellulaire ribosomen bestand zijn tegen extracellulaire RNasen, kunnen ze toch functioneel relevante concentraties bereiken in vivo in extracellulaire micro-omgevingen. De identificatie van een RNase-resistente piek (P2) afgeleid van gedeeltelijke fragmentatie van P0 (en mogelijk ook P1) suggereert dat, vergelijkbaar met wat we hebben aangetoond voor 30-31 nt tRNA-helften, rRNA-afgeleide fragmenten zich kunnen ophopen in de extracellulaire ruimte en hun extracellulaire concentratie kunnen toenemen in situaties van abnormale celdood. Onlangs is een nieuwe methode beschreven die RNA-sequencing mogelijk maakt van enkele microliters humaan serum (68). Met deze methode was een bijna perfecte scheiding tussen normale en borstkankerpatiënten mogelijk op basis van rRNA- of mitochondriale tRNA-sequenties.

Concluderend, ribonucleaseremming vormt op dramatische wijze extracellulaire RNA-profielen en onthult een populatie van extracellulaire ribosomen, tRNA's en andere coderende en niet-coderende RNA's. Deze RNA's, die niet worden beschermd door inkapseling in EV's, worden snel afgebroken door extracellulaire RNasen. Sommige van hun fragmenten zijn echter bestand tegen afbraak en kunnen zich ophopen in celkweekmedia en in biovloeistoffen. Deze dynamische kijk op exRNA's heeft invloed op ons begrip van RNA-secretiemechanismen en kan een venster bieden op nieuwe moleculen met biomarkerpotentieel. Deze omvatten intrinsiek stabiele ncRNA-fragmenten en extracellulaire RNP's die worden gestabiliseerd door toevoeging van RI onmiddellijk na het verzamelen van monsters.


Alcohol en het zenuwstelsel

Greg T. Sutherland, . Jillian J. Kril, in Handbook of Clinical Neurology, 2014

Genexpressie

De andere belangrijke spin-off van de kennis en technologie die is ontwikkeld rond het menselijk genoomproject is genoombrede expressie of transcriptomische studies. Het vermogen om de totale genexpressie van een cel of weefsel te onderzoeken en vervolgens individuen met en zonder ziekte te vergelijken, geeft ons een onbevooroordeeld platform om zowel bestaande hypothesen te testen als tot nu toe onbekende pathobiologie te ontdekken. Nogmaals, de originele op probe-hybridisatie gebaseerde array-technologie wordt momenteel vervangen door sequencing van de volgende generatie, RNA-Seq genaamd, die een nauwkeurigere en uitgebreidere analyse van neurodegeneratieve ziekten belooft (Sutherland et al., 2011). Het succes van beide technieken is echter sterk afhankelijk van de kwaliteit van de startsjabloon, ribonucleïnezuur (RNA).

RNA-kwaliteit of -integriteit wordt gewoonlijk gemeten met behulp van een algoritme dat meerdere kenmerken van een RNA-elektroforese-gelscan combineert en deze weergeeft als een totaal RNA-integriteitsnummer (RIN) (Schroeder et al., 2006). Oorspronkelijk werd gedacht dat RNA-afbraak grotendeels te wijten was aan postmortale factoren, maar het is nu bekend, met name voor postmortaal hersenweefsel, dat het de premortale of agonale periode is die cruciaal is voor de kwaliteit van het RNA dat wordt geëxtraheerd (Monoranu et al. al., 2009 Durrenberger et al., 2010). RIN is sterk gecorreleerd met de pH van de hersenen (Monoranu et al., 2009) en de pH en RIN van de hersenen nemen af ​​met de lengte van de agonale periode en het aantal ongunstige, vaak hypoxische gebeurtenissen binnen die periode, zoals ziekenhuisopname, coma, kunstmatige beademing of aandoeningen van de luchtwegen (Durrenberger et al., 2010). Bovendien wordt de agonale periode geassocieerd met nieuwe genexpressiepatronen die niet direct gerelateerd zijn aan de ziekte (Li et al., 2004). Een belangrijk probleem voor case-control transcriptomische studies is dat patiënten met neurologische aandoeningen over het algemeen een meer langdurige en averse agonale periode hebben en vervolgens een lagere pH en RIN hebben in vergelijking met controles die vaak plotseling zijn overleden (Yates et al., 1990 Monoranu et al. , 2009 ). Het verwijderen van monsters met een laag RIN is een standaardpraktijk in de meeste onderzoeken waarbij postmortaal hersenweefsel wordt gebruikt, maar het blijft verstandig om de mogelijke effecten van RIN en andere verstorende factoren in transcriptomische gegevens te evalueren voordat geconcludeerd wordt dat er ziektespecifieke verschillen zijn.

Ondanks deze technische problemen hebben genoombrede expressiestudies van hersenweefsel van alcoholisten zonder comorbiditeiten zoals leverziekte of WKS zeer subtiele en grotendeels uiteenlopende gegevens onthuld (Flatscher-Bader et al., 2006). Een uitzondering was de ontregeling van de myeline-geassocieerde genen, hoewel de individuele genen zelf en hun richting van verandering varieerden tussen studies (Lewohl et al., 2000 Iwamoto et al., 2004 Li et al., 2004). Andere belangrijke thema's waren DNA-reparatie (Mayfield et al., 2002 Iwamoto et al., 2004), het ubiquitine-proteasoomsysteem en de immuunfunctie (Sokolov et al., 2003 Liu et al., 2004).

De pro-inflammatoire of neuro-immuunactiverende effecten van alcohol kunnen in eerste instantie de productie van cytokines door residente microglia en astrocyten inhouden via het aangeboren immuunsysteem, Toll-like receptors (TLR) (Blanco et al., 2005 Blanco en Guerri, 2007). Dit induceert op zijn beurt de pro-inflammatoire transcriptiefactor NF-KB (nucleaire factor van kappa light-polypeptide-genversterker in B-cellen), met verhoogde niveaus van de cytokinen interleukine 1beta, tumornecrosefactor-alfa en interleukine-6 ​​(Alfonso-Loeches et al., 2010). Onderzoek bij proefdieren heeft aangetoond dat de remming van TLR4-gemedieerde NF-κB signalering verzwakt zowel de toxische (Alfonso-Loeches et al., 2010) als acute gedragsmatige (Wu et al., 2012) acties van alcohol. Genexpressiestudies suggereren dat de activering van NF-κB transcriptie met acute alcoholblootstelling maakt uiteindelijk plaats voor downregulatie, met daaropvolgende cycli van intoxicatie en ontwenning (Okvist et al., 2007). In overeenstemming met het bekende regionale verlies van neuronen in ARBD, werden de genen met NF-κβ-elementen over het algemeen neerwaarts gereguleerd in de prefrontale cortex van chronische alcoholisten, maar niet in de motorische cortex (Okvist et al., 2007).

De veel voorkomende comorbiditeit HE is een andere belangrijke potentiële confounder voor transcriptomische analyse van ARBD. Net als hypoxische episodes in de agonale periode wordt HE geassocieerd met een metabole acidose, en alcoholisten met HE hebben een significant lagere hersen-pH en RIN dan degenen zonder HE (Sheedy et al., 2012). Ons eigen werk, waarbij het wittestoftranscriptoom van alcoholisten werd vergeleken met HE- en niet-HE-alcoholisten met controles, vond ook dat transcriptomische veranderingen grotendeels beperkt waren tot de HE-groep (Sutherland et al., 2014). Verder was HE, net als hypoxie, geassocieerd met een neerwaartse regulatie van energiemetabolismeroutes, en het additieve effect van HE en agonale hypoxische gebeurtenissen op het verlagen van de pH van de hersenen, RIN en de omvang van de neerwaartse regulatie van genen kon worden gezien. HE werd ook gekenmerkt door een opregulatie van pro-inflammatoire routes in overeenstemming met het toenemende besef dat zowel systemische ontsteking als verhoogde ammoniakniveaus in de hersenen waarschijnlijk in combinatie werken om deze aandoening te veroorzaken (Shawcross et al., 2005, 2011 Rama Rao et al., 2010). De term systemisch is hier belangrijk omdat de residente microglia, hoewel geactiveerd, geen prominente bron van inflammatoire cytokines in HE lijken te zijn (Zemtsova et al., 2011).

Twee relatief recente paradigmaverschuivingen in onze kennis van genexpressieregulatie zijn de erkenning van de rollen die worden gespeeld door epigenetica en niet-coderende RNA-soorten, samen met interacties tussen beide. Ponomarev et al. (2012) toonden aan dat de alcoholische prefrontale cortex werd gekenmerkt door globale DNA-hypomethylering en stelden dat dit te wijten was aan alcohol-geïnduceerde tekortkomingen in foliumzuur en zijn derivaat, S-adenosylmethionine, het belangrijkste substraat voor DNA-methylatie. Interessant genoeg bleek het GC-gehalte van genen de belangrijkste factor te zijn die bepaalde of alcohol hun expressie beïnvloedde in plaats van hun lidmaatschap van een specifieke cellulaire route.

De interesse in niet-coderende RNA-soorten is geëvolueerd met het besef dat transcriptie alomtegenwoordig is en niet beperkt tot alleen het eiwitcoderende gebied van het genoom (Clark et al., 2011). Niet-coderende RNA's zijn er in vele vormen en maten, waaronder de relatief bekende microRNA's, kleine oligonucleotiden, 22 basen lang, die in staat zijn om eiwitexpressie te regelen door de toegang tot translationele machinerie te beperken of de transcriptieafbraak te vergroten (Fabian et al., 2010). Lewohl et al. (2011) ontdekten dat 35 microRNA's werden opgereguleerd in chronische alcoholische hersenen en dat hun vermeende doelen samenvielen met de downregulated mRNA's uit hun eerdere microarray-gegevens (Liu et al., 2006). MicroRNA's kunnen TLR- (en NF-KB) -signalering moduleren en ze vertonen regulerende wederkerigheid met epigenetische factoren (Nunez en Mayfield, 2012). Een speciale eigenschap van microRNA's is hun promiscuïteit, wat betekent dat ze in staat zijn om tegelijkertijd meerdere gendoelen te binden en neerwaarts te reguleren. Dit is niet alleen ideaal voor het coördineren van complexe genexpressienetwerken in organismen, maar het verhoogt ook de mogelijkheid dat microRNA's zeer effectieve therapeutische doelen kunnen zijn voor complexe aandoeningen zoals ARBD (Nunez en Mayfield, 2012).


DEGRADOMETER-software

De RNA Integrity-database (RINdb) is een vrij toegankelijke verzameling records met elektroferogrammen, RIN en andere metagegevens van monsters. Wetenschappers kunnen de database doorzoeken om methoden voor een nieuw experiment vooraf te screenen, RIN-drempels te vergelijken en eigen resultaten te valideren. Alle gebruikers kunnen hun eigen records bijdragen.

RNA Integrity Database (RINdb) - Bioanalyzer RNA-profielen
Marc Valer, programmamanager Microfluidics, Genomics, Agilent Technologies, Santa Clara.

Samenvatting: Duizenden gebruikers vertrouwen tegenwoordig op de bioanalyzer 2100 voor het kwalificeren van totaal-RNA-monsters, op zoek naar informatie over integriteit, zuiverheid, herstel en consistentie voor monstervoorbereidingsmethoden, en helpt hen bij het bepalen van de optimale omstandigheden voor hun experimenteel ontwerp. Marc Valer beschrijft het gebruik van Agilent's nieuwe RNA Integrity Database (RINdb) om te helpen bij de ontwikkeling van experimentele protocollen, met name monstervoorbereidingen, door onderzoekers een middel te bieden om RNA-profielen in een context te plaatsen.


RNA-integriteit en RNA-fragmentatie - Biologie

Procedures voor kwaliteitscontrole van RNA-monsters voor gebruik in kwantitatieve reverse transcriptie PCR
Tania Nolan 1,2 & Stephen Bustin 2,3
1 Sigma Aldrich, Cambridge UK 2 Eureka Biotechnology, Cambridge UK 3 Institute of Cell and Molecular Science, Barts en de London Queen Mary's8217s School of Medicine and Dentistry, Londen, VK
Essentials of Nucleic Acid Analysis: A Robust Approach (2008) redacteuren: Jacquie T. Keer, Lyndsey Birch


Boek hoofdstuk 9 inleiding - De kwaliteit van alle wetenschappelijke gegevens is recht evenredig met die van de originele startmonsters, of gewoon ‘garbage in, garbage out'. In de meeste gevallen is het logisch om met materiaal van de hoogste kwaliteit te werken. Voor sommige experimenten is de hoogst mogelijke kwaliteit echter nog steeds een serieus compromis van perfectie. De mate waarin de standaard van inputmateriaal de kwantitatieve gegevens van de reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) beïnvloedt en, mogelijk, de resulterende wetenschappelijke conclusie, wordt in dit hoofdstuk beschreven.
Behoud van fijnnaald-aspiratiespecimens voor toekomstig gebruik in RNA-gebaseerde moleculaire testen.
Ladd AC, O'Sullivan-Mejia E, Lea T, Perry J, Dumur CI, Dragoescu E, Garrett CT, Powers CN.
Kanker Cytopathol. 2011 april 25119(2): 103-110
Afdeling Pathologie, School of Medicine, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia

ACHTERGROND: De toepassing van aanvullende moleculaire testen wordt steeds belangrijker voor de diagnose en classificatie van ziekten. Het gebruik van fijne naald aspiratie (FNA) biopsie als middel om tumoren te bemonsteren in combinatie met moleculaire testen zou een krachtige combinatie kunnen zijn. FNA is minimaal invasief, kosteneffectief en vertoont meestal een nauwkeurigheid die vergelijkbaar is met diagnoses op basis van excisiebiopten. Kwaliteitscontrole (QC) en testvalidatie-eisen voor de ontwikkeling van moleculaire tests stellen een noodzaak voor toegang tot reeds bestaande klinische monsters. Weefselbanking van excisiebiopsiespecimens wordt vaak uitgevoerd bij grote onderzoeksinstellingen, maar weinigen hebben protocollen ontwikkeld voor het bewaren van cytologische specimens. Deze studie was gericht op het evalueren van cryopreservatie van FNA-monsters als een methode om de cellulaire morfologie en integriteit van ribonucleïnezuur (RNA) in opgeslagen weefsels te behouden.
METHODEN: FNA-monsters werden verkregen uit verse tumorresecties, verwerkt met behulp van een cryopreservatieprotocol en maximaal 27 weken bewaard. Na het ophalen werden monsters gemaakt in objectglaasjes voor morfologische evaluatie, en RNA werd geëxtraheerd en beoordeeld op integriteit met behulp van de Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Californië).
RESULTATEN: Gecryopreserveerde monsters vertoonden een goede celmorfologie en leverden in veel gevallen intact RNA op. Gevallen die matige of ernstige RNA-degradatie vertonen, kunnen over het algemeen in verband worden gebracht met langdurig hanteren van specimens of bemonstering van necrotische gebieden.
CONCLUSIES: FNA-specimens kunnen worden opgeslagen op een manier die de cellulaire morfologie en RNA-integriteit handhaaft die nodig zijn voor studies van genexpressie. Naast het aanpakken van kwaliteitscontrole (QC) en testvalidatie, zullen cytologiebanken een onschatbare bron zijn voor toekomstige moleculaire morfologische en diagnostische onderzoeksstudies.
Handhaving van RNA-integriteit in een homogene populatie van borstepitheelcellen geïsoleerd door Laser Capture Microdissection.
Bevilacqua C, Makhzami S, Helbling JC, Defrenaix P, Martin P.
BMC Cell Biol. 2010 december 611:95.
INRA, UMR1313 Unité Génétique Animale et Biologie Intégrative,équipe Lait, Génome & Santé F-78350 Jouy-en-Josas, Frankrijk

CONCLUSIES: RNA's die op deze manier uit MEC werden geïsoleerd, waren van zeer goede kwaliteit voor daaropvolgende lineaire amplificatie, waardoor het mogelijk werd om een ​​referentieel genexpressieprofiel vast te stellen van de gezonde MEC, een nuttig platform voor het ontdekken van tumorbiomarkers.
Impact van RNA-afbraak op genexpressieprofilering.
Opitz L, Salinas-Riester G, Grade M, Jung K, Jo P, Emons G, Ghadimi BM, Beissbarth T, Gaedcke J.
BMC Med Genomics. 2010 augustus 93: 36.

ACHTERGROND: Genexpressieprofilering is een zeer gevoelige techniek die wordt gebruikt voor het profileren van tumormonsters voor medische prognose.RNA-kwaliteit en -afbraak beïnvloeden de analyseresultaten van genexpressieprofielen. De impact van deze invloed op de profielen en de medische impact ervan is niet volledig begrepen. Aangezien patiëntmonsters zeer waardevol zijn voor klinische onderzoeken, is het noodzakelijk om criteria voor de RNA-kwaliteit vast te stellen om deze monsters in latere analyses te kunnen gebruiken.
METHODEN: Om de effecten van RNA-integriteit op genexpressieprofilering te onderzoeken, werden hele genoomexpressie-arrays gebruikt. We gebruikten tumorbiopten van patiënten met lokaal gevorderde rectumkanker. Om degradatie te simuleren, werd het geïsoleerde totale RNA van alle patiënten op een tijdsafhankelijke manier onderworpen aan door warmte geïnduceerde afbraak. Expressieprofilering werd vervolgens uitgevoerd en gegevens werden bio-informatisch geanalyseerd om de verschillen te beoordelen.
RESULTATEN: De verschillen geïntroduceerd door RNA-afbraak werden grotendeels gecompenseerd door de biologische verschillen tussen de patiënten. Slechts een relatief klein aantal probes (275 van de 41.000) laat een significant effect zien door degradatie. De genen die het sterkste effect vertonen als gevolg van RNA-afbraak, waren vooral die met korte mRNA's en probeposities nabij het 5'-uiteinde.
CONCLUSIES: Gedegradeerd RNA van tumormonsters (RIN > 5) kan nog steeds worden gebruikt om genexpressie-analyse uit te voeren. Er wordt een veel grotere biologische variantie tussen patiënten waargenomen in vergelijking met het effect dat wordt opgelegd door afbraak van RNA. Desalniettemin zijn er genen, zeer korte genen en die met de probe-bindingszijde dicht bij het 5'-uiteinde die moeten worden uitgesloten van genexpressie-analyse bij het werken met gedegradeerd RNA. Deze resultaten zijn beperkt tot het Agilent 44 k microarray-platform en moeten zorgvuldig worden geïnterpreteerd bij het overzetten naar andere instellingen.

RNA-integriteit in postmortemmonsters: beïnvloedende parameters en implicaties voor RT-qPCR-assays.
Koppelkamm A, Vennemann B, Lutz-Bonengel S, Fracasso T, Vennemann M.
Int J Juridische Med. 2011 juli125 (4): 573-580
Instituut voor Juridische Geneeskunde, Freiburg Universitair Medisch Centrum, Albertstrasse 9, 79104, Freiburg, Duitsland.

Analyse van circulerend microRNA - pre-analytische en analytische uitdagingen.
McDonald JS, Milosevic D, Reddi HV, Grebe SK, Algeciras-Schimnich A.
Clin Chem. 2011 juni 57 (6): 833-40. Epub 2011 12 april.
Afdelingen Laboratoriumgeneeskunde en Pathologie

Betrouwbare genexpressiemetingen van gedegradeerd RNA door kwantitatieve realtime PCR zijn afhankelijk van korte amplicons en een goede normalisatie.
Antonov J, Goldstein DR, Oberli A, Baltzer A, Pirotta M, Fleischmann A, Altermatt HJ, Jaggi R.
Lab Invest. 2005 aug.85 (8): 1040-1050.
Afdeling Klinisch Onderzoek, Universiteit van Bern, Bern, Zwitserland.

Het effect van RNA-afbraak op de diagnostische bruikbaarheid van microRNA is niet systematisch geëvalueerd in klinische monsters. We vroegen of het microRNA-profiel wordt bewaard in gedegradeerde RNA-monsters die zijn afgeleid van muis- en menselijk weefsel. We hebben weefselspecifieke microRNA-kandidaten geselecteerd uit gepubliceerde menselijke microarray-gegevens en deze gevalideerd met behulp van kwantitatieve reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (QRTPCR) -analyses op snel ingevroren, normale muizenlever-, pancreas- en maagweefselmonsters. MiR-122a, miR-1 en miR-200b werden geïdentificeerd als weefselspecifiek, en de op 3-microRNA gebaseerde QRTPCR kon de weefseloorsprong voorspellen voor muizenweefselmonsters die gedurende 2 uur bij kamertemperatuur werden bewaard met een nauwkeurigheid van 91,7 %. Toen we deze 3-microRNA-voorspeller toepasten op klinische monsters met verschillende mate van RNA-afbraak, onderscheidde de voorspeller gedegradeerde RNA-monsters van lever, pancreas en maag met een nauwkeurigheid van 90% (26/29). Expressieniveaus van miR-122a, miR-1 en miR-200b waren bescheiden veranderd na de verlengde (2-4 uur) opslag bij kamertemperatuur, maar de grootte van de expressieveranderingen was klein in vergelijking met de expressieverschillen tussen verschillende weefsels van oorsprong . Deze proof-of-principle-studie toont aan dat RNA-afbraak als gevolg van langdurige opslag bij kamertemperatuur geen invloed heeft op de voorspellende kracht van weefselspecifieke microRNA QRTPCR-voorspeller.
Een robuust RNA-integriteitsbehoudend kleuringsprotocol voor laseropname-microdissectie van endometriumkankerweefsel.
Cummings M, McGinley CV, Wilkinson N, Field SL, Duffy SR, Orsi NM.
Anale Biochem. 2011 sep 1416(1): 123-125
Gynaeimmunology and Oncology Group, YCR en Liz Dawn Pathology and Translational Sciences Centre, Leeds Institute of Molecular Medicine, St. James's University Hospital, Leeds LS9 7TF, VK.

Laser capture microdissectie van bevroren weefselsecties maakt het mogelijk homogene celpopulaties te isoleren voor expressieprofilering. Dit vereist echter het vinden van een balans tussen het behouden van een adequate morfologie voor nauwkeurige microdissectie en het behouden van de RNA-integriteit. Verschillende kleuringsprotocollen werden toegepast op ingevroren endometriumcarcinoomweefselcoupes. Hoewel op alcohol gebaseerde methoden superieur waren aan waterige vlekken voor het behouden van RNA-integriteit, hadden ze last van niet-reproduceerbare kleurintensiteit. We hebben een aangepast op alcohol gebaseerd, gebufferd cresylviolet-kleuringsprotocol ontwikkeld dat reproduceerbare kleuring biedt met minimale RNA-afbraak die geschikt is voor weefsels met matige tot hoge niveaus van intrinsieke RNase-activiteit.
Effecten van RBC-verwijdering en TRIzol van perifere bloedmonsters op RNA-stabiliteit.
Kang JE, Hwang SH, Lee JH, Park DY, Kim HH.
Clin Chim Acta. 2011 juni 17
Afdeling Laboratoriumgeneeskunde, Pusan ​​National University Hospital, School of Medicine, Pusan ​​National University, Busan, Zuid-Korea.

ACHTERGROND: Zuivering van mRNA uit opgeslagen monsters is erg belangrijk omdat de resultaten van RT-PCR en microarray-analyses grotendeels worden beïnvloed door de kwaliteit van mRNA. Bovendien kunnen veel preanalytische factoren tijdens het verzamelen, verwerken en bewaren de mRNA-kwaliteit en de expressie van mononucleaire cellen van perifeer bloed (PBMC) beïnvloeden. In deze studie evalueren we de effecten van RBC-verwijderingstechnieken en TRIzol op de RNA-kwaliteit in bloedmonsters.
METHODEN: We verkregen EDTA-bloedmonsters van 50 volwassen vrijwilligers, en maakten 10 pools van buffy coats voor vergelijking tussen protocollen en evalueerden ook de RNA-kwaliteit van klinische monsters in biobank. Gebruik van TRIzol en verwijdering van RBC (RBC-lysis of celscheiding) werden geëvalueerd op hun effect op de kwaliteit van mRNA uit de opgeslagen bloedmonsters.
RESULTATEN: RNA-integriteit met TRIzol was significant beter dan die zonder TRIzol (RIN 4.5 vs. 9.2, respectievelijk P=0.002). De verandering in RIN van de PBMC-scheidingsmethode was gelijk aan die van de RBC-lysismethode. Na 12 maanden was IL6-mRNA-expressie van opgeslagen klinische monsters in celscheiding/TRIzol stabiel.
CONCLUSIES: De bloedmonsters die in TRIzol waren ingevroren na verwijdering van RBC behielden de RNA-kwaliteit goed. PBMC/TRIzol-conservering voor de opslag van bloedmonsters zou een eenvoudig protocol kunnen zijn voor snelle, goedkope biobanking.

Effecten van vertraging bij het snel invriezen van colorectale kankerweefsels op de kwaliteit van DNA en RNA.
Hong SH, Baek HA, Jang KY, Chung MJ, Moon WS, Kang MJ, Lee DG, Park HS.
J Koreaanse Soc Coloproctol. 2010 oktober26 (5): 316-323
Chonbuk National University Hospital Nationale biobank van Korea, Jeonju, Korea.

DOEL: Het succes van moleculair basisonderzoek met behulp van biospecimens hangt sterk af van de kwaliteit van het specimen. In deze studie evalueerden we de effecten van vertraagde bevriezingstijd op de stabiliteit van DNA en RNA in vers ingevroren weefsel van patiënten met colorectale kanker.
METHODEN: Weefsels werden ingevroren op 10, 30, 60 en 90 minuten na uitroeiing van colorectale kanker in 20 gevallen. Absorptieverhouding van 260 tot 280 nm (A(260)/A(280)) en agarosegelelektroforese werden geëvalueerd. Bovendien werd het RNA-integriteitsnummer (RIN) bepaald voor de analyse van de RNA-integriteit.
RESULTATEN: Ongeacht de vertraagde bevriezingstijd vertoonden alle DNA- en RNA-monsters A(260)/A(280)-verhoudingen van meer dan 1,9, en alle DNA-monsters vertoonden een discrete, hoogmoleculaire band op agarosegelelektroforese. De RIN's waren 7,53 ± 2,04, 6,70 ± 1,88, 6,47 ± 2,58 en 4,22 ± 2,34 na respectievelijk 10, 30, 60 en 90 minuten. Hoewel de RNA-concentratie niet werd beïnvloed door vertraagde bevriezing, nam de RNA-integriteit af met toenemende vertraagde bevriezingstijd.
CONCLUSIE: Volgens de RIN-resultaten bevelen we aan dat het verzamelen van colorectaal kankerweefsel binnen 10 minuten moet worden gedaan voor onderzoeken die RNA van hoge kwaliteit vereisen en binnen 30 minuten voor gebruikelijke RNA-onderzoeken.

l verbeterd protocol voor hoogwaardige co-extractie van DNA en RNA uit pens digesta.
Popova M, Martin C, Morgavi DP.
Folia Microbiol (Praag). 2010 juli 55 (4): 368-372
INRA Clermont-Ferrand-Theix, 63122, Saint Gégravenes Champanelle, Frankrijk.

We rapporteren een verbeterde methode voor de extractie van totale nucleïnezuren uit monsters van het pensgehalte. De methode maakt gebruik van het kloppen van parels en extractie met fenol-chloroform gevolgd door precipitatie met zout-alcohol. De totale opbrengst en zuiverheid van nucleïnezuren en RNA werden bepaald door spectrofotometrische metingen. De RNA-integriteit werd geschat met behulp van Agilent RNA 6000 Nano Kit op een Agilent 2100 Bioanalyzer. De methode verschafte totale nucleïnezuren en RNA-extracten van goede kwantiteit en kwaliteit. De extractie is niet tijdrovend en het is waardevol voor ecologische studies van de microbiële gemeenschapsstructuur en genexpressie in de pens.

mRNA-profilering in forensische genetica I - Mogelijkheden en beperkingen.
Vennemann M & Koppelkamm A.
Instituut voor Juridische Geneeskunde, Universiteit van Freiburg, Albertstr. 9, 79104 Freiburg, Duitsland
Forensisch Wetenschappelijk Int. 2010 december 15203 (1-3): 71-75

Postmortale mRNA-profilering II - Praktische overwegingen.
Vennemann M & Koppelkamm A.
Instituut voor Juridische Geneeskunde, Universiteit van Freiburg, Albertstr. 9, 79104 Freiburg, Duitsland
Forensisch Wetenschappelijk Int. 2010 december 15203 (1-3): 76-82

Behoud van RNA-integriteit in een homogene populatie van borstepitheelcellen geïsoleerd door Laser Capture Microdissection
Claudia Bevilacqua e-mail, Samira Makhzami e-mail, Jean-Christophe Helbling e-mail, Pierre Defrenaix e-mail en Patrice Martin e-mail
BMC Celbiologie 2010, gepubliceerd: december 2010

Robuuste microRNA-stabiliteit in gedegradeerde RNA-preparaten uit menselijk weefsel en celmonsters.
Jung M, Schaefer A, Steiner I, Kempkensteffen C, Stephan C, Erbersdobler A, Jung K.
Afdeling Urologie, Universitair Ziekenhuis Charité, Berlijn, Duitsland.
Clin Chem. 2010 juni 56 (6): 998-1006.

Beoordeling van mRNA- en microRNA-stabilisatie in perifeer menselijk bloed voor multicenterstudies en biobanken
Daniel Gilbert Weber1, Swaantje Casjens1, Peter Rozynek1, Martin Lehnert1, Sandra Zilch-Schöneweis1, Oleksandr Bryk1, Dirk Taeger1, Maria Gomolka2, Michaela Kreuzer2, Heinz Otten3, Beate Pesch1, Georg Johnen1 en Thomas Brüning11
Instituut voor Preventie en Arbeidsgeneeskunde van de Duitse Sociale Ongevallenverzekering, Instituut van de Ruhr-Universität Bochum (IPA), Bochum, Duitsland. 2Departement Stralingsbescherming en Gezondheid, Federaal Bureau voor Stralingsbescherming, Oberschleissheim, Duitsland. 3Duitse sociale ongevallenverzekering (DGUV), Sankt Augustin, Duitsland.
Biomarker Insights 2010(5): 95�

Pre-PCR-verwerking - Strategieën om PCR-compatibele monsters te genereren
Peter Rådström,* Rickard Knutsson, Petra Wolffs, Maria Lövenklev en Charlotta Löfström
MOLECULAIRE BIOTECHNOLOGIE Volume 26, 2004: 133-146

VERGELIJKING VAN TWEE BESCHIKBARE PLATFORMS VOOR BEPALING VAN RNA-KWALITEIT
I. Riedmaier, M. Bergmaier en M.W. Pfaffl
Technische Universitat Munchen, Fysiologie Weihenstephan, Freising, Duitsland
Biotechnologie. & Biotechnologie. Uitrusting 2010, 24(4): 2154-2159

De integriteit van RNA is een zeer kritisch aspect met betrekking tot downstream op RNA gebaseerde kwantitatieve analyse zoals RT-qPCR. RNA van lage kwaliteit kan de resultaten van dergelijke experimenten in gevaar brengen. Tegenwoordig maakt geautomatiseerde lab-on-chip capillaire elektroforese een snelle bepaling van de kwaliteit en kwantiteit van RNA mogelijk, b.v. 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) en de Experion (Bio-Rad). Beide platforms bepalen de RNA-kwaliteit met behulp van een numeriek systeem dat de integriteit van RNA weergeeft. De Bioanalyzer biedt het RIN-algoritme (RNA Integrity Number) aan op de Bioanalyzer 2100 en Bio-Rad ontwikkelde een nieuwe Experion-softwareversie die een algoritme biedt voor het berekenen van de RNA Quality Index (RQI). Het doel van deze studie was om beide systemen met betrekking tot gevoeligheid, reproduceerbaarheid, lineariteit en de invloed van individuele weefselextracties en verschillende chipruns op de bepaling van de RNA-kwaliteit en -kwantiteit. Over het algemeen werd bevestigd dat beide algoritmen zeer vergelijkbaar en gunstig zijn voor de bepaling van RNA-kwaliteit voor downstream-toepassingen. De Experion liet iets betere resultaten zien met betrekking tot reproduceerbaarheid en absolute gevoeligheid, terwijl de 2100 Bioanalyzer een hogere lineariteit liet zien.
Kwantitatieve beoordeling van de gevoeligheid van verschillende commerciële reverse transcriptasen op basis van gepantserd HIV-RNA.
Okello JB, Rodriguez L, Poinar D, Bos K, Okwi AL, Bimenya GS, Sewankambo NK, Henry KR, Kuch M, Poinar HN.
Afdeling Antropologie, McMaster Ancient DNA Centre, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. PLoS Een. 2010 november 105(11):e13931.

CONCLUSIES/BELANGRIJK: We raden daarom het gebruik van Accuscript of Superscript III aan wanneer het gaat om RNA-niveaus met een laag aantal kopieën, en stellen voor om de RT-reacties te zuiveren voorafgaand aan downstream-toepassingen (bijv. qPCR) om de detectie te verbeteren. Hoewel de resultaten die in deze studie werden gepresenteerd, waren gebaseerd op een viraal RNA-surrogaat en werden toegepast op nucleïnezuurlysaten die zijn afgeleid van in gearchiveerd formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel, kunnen hun relatieve prestaties op RNA verkregen uit andere weefseltypen variëren en moet in de toekomst worden geëvalueerd. RNA stabiliseren bij kamertemperatuur in RNAstable
Sharron Ohgi1, Laurent Coulon, Rolf Muller, Judy-Muller-Cohn en Omoshile ClementBiomatrica, Inc., 5627 Oberlin Dr, #120, San Diego, CA 92121, VS.
Biotechniques Vol. 48 (nr. 6) 2010: 470

RNAstable is een nieuw conserveringsproduct dat is ontwikkeld om RNA te beschermen tegen afbraak tijdens opslag of verzending bij omgevingstemperatuur. Het synthetische opslagmedium is gebaseerd op de natuurlijke principes van anhydrobiose (wat betekent 'leven zonder water'8221), een biologisch mechanisme dat door sommige organismen wordt gebruikt en waardoor ze meer dan 100 jaar kunnen overleven als ze droog zijn. Anhyd-robiotische organismen beschermen hun DNA, RNA, eiwitten, membranen en cellulaire systemen om te overleven in een droge toestand en kunnen nieuw leven worden ingeblazen door eenvoudige rehydratatie. RNAstable is ontworpen om deze unieke kenmerken na te bootsen om RNA gedurende langere tijd bij omgevingstemperaturen te stabiliseren. Kwantitatieve RT-PCR-analyse toont succesvolle amplificatie aan van RNA-templates die gedurende 29 maanden droog werden bewaard in RNA-stabiel bij kamertemperatuur en onder versnelde verouderingsomstandigheden die overeenkomen met 12 jaar opslag bij kamertemperatuur (verhoogde temperaturen bij 45°C). Monsters werden verzegeld in een vochtwerende zak inclusief een droogmiddelpakket om ideale opslagomstandigheden te garanderen. Gerehydrateerde monsters werden direct in reacties gebruikt zonder verdere zuivering en vertoonden geen remming of verlies van activiteit. Deze innovatieve technologie voorkomt degradatie van RNA bij kamertemperatuur en biedt enorme kosten- en energiebesparingen als een gebruiksvriendelijk alternatief voor conventionele vriezeropslag.

Een gids voor ionen en RNA-structuur.
Draper DE.
Afdeling Scheikunde, Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland 21218, VS
RNA. 2004 10 maart (3):335-43.

Publicatie over DNA-integriteit:

Multiplex picoliter-druppel digitale PCR voor kwantitatieve beoordeling van DNA-integriteit in klinische monsters.
Didelot A, Kotsopoulos SK, Lupo A, Pekin D, Li X, Atochin I, Srinivasan P, Zhong Q, Olson J, Link DR, Laurent-Puig P, Blons H, Hutchison JB, Taly V.
Université Paris Sorbonne Cité, INSERM UMR-S775, Parijs, Frankrijk.
Clin Chem. 2013 mei59 (5): 815-823

ACHTERGROND: Beoordeling van DNA-integriteit en kwantiteit blijft een knelpunt voor high-throughput moleculaire genotyperingstechnologieën, waaronder sequencing van de volgende generatie. Met name DNA dat is geëxtraheerd uit in paraffine ingebedde weefsels, een belangrijke potentiële bron van tumor-DNA, varieert sterk in kwaliteit, wat leidt tot onvoorspelbare sequentiegegevens. We beschrijven een picoliter druppelgebaseerde digitale PCR-methode die gelijktijdige detectie van DNA-integriteit en de hoeveelheid amplificeerbaar DNA mogelijk maakt.
METHODEN: Met behulp van een multiplex-assay hebben we 4 verschillende doellengtes gedetecteerd (78, 159, 197 en 550 bp). Testen werden gevalideerd met humaan genomisch DNA gefragmenteerd tot groottes van 170 bp tot 3000 bp. De techniek werd gevalideerd met DNA-hoeveelheden zo laag als 1 ng. We evalueerden 12 DNA-monsters die waren geëxtraheerd uit in paraffine ingebedde longadenocarcinoomweefsels.
RESULTATEN: Eén monster bevatte geen amplificeerbaar DNA. De fracties van amplificeerbaar DNA voor de 11 andere monsters waren tussen 0,05% en 10,1% voor fragmenten van 78 bp en -88041% voor langere fragmenten. Vier monsters werden gekozen voor verrijking en sequencing van de volgende generatie. De kwaliteit van de sequentiegegevens was in overeenstemming met de resultaten van de DNA-integriteitstest. In het bijzonder leverde DNA met lage integriteit sequentieresultaten op met lagere dekkingsniveaus en uniformiteit en had hogere niveaus van fout-positieve varianten.
CONCLUSIES: De ontwikkeling van DNA-kwaliteitsassays zal onderzoekers in staat stellen om monsters te downselecteren of meer DNA te verwerken om betrouwbare genoomsequencing te bereiken met de hoogst mogelijke efficiëntie van kosten en inspanning, evenals het minimaliseren van de verspilling van kostbare monsters.

Opname van meting van DNA-integriteit in qPCR-assays.
Brisco M, Latham S, Bartley P, Morley A.
Biotechnieken. 2010 Dec49 (6): 893-897.
Afdeling Hematologie en Genetische Pathologie, Flinders University en Medisch Centrum, Bedford Park, Zuid-Australië, Australië.

Gevolgen van het opslaan van urine-DNA van verschillende populaties voor moleculaire analyses.
Cannas A, Kalunga G, Green C, Calvo L, Katemangwe P, Reither K, Perkins MD, Maboko L, Hoelscher M, Talbot EA, Mwaba P, Zumla AI, Girardi E, Huggett JF TB trDNA consortium.
Nationaal Instituut voor Infectieziekten L. Spallanzani, IRCCS, Roma, Italië.
PLoS Een. 2009 sep 104 (9): e6985.

Methode voor het isoleren van PCR-klaar genomisch DNA uit zebravisweefsels.
Meeker ND, Hutchinson SA, Ho L, Trede NS.
Huntsman Cancer Institute, Universiteit van Utah, Salt Lake City, UT 84112, VS.
Biotechnieken. 2007 nov.43(5):610, 612, 614.

Achtergrond: Tot op heden is PCR-detectie van Chlamydia pneumoniae-DNA in atherosclerotische laesies van Deense patiënten niet succesvol geweest. Om vast te stellen of niet-detectie werd veroorzaakt door een suboptimale DNA-extractiemethode, hebben we vijf verschillende DNA-extractiemethoden getest voor de zuivering van DNA uit atherosclerotisch weefsel. Resultaten: De vijf verschillende DNA-extractiemethoden zijn getest op gehomogeniseerd atherosclerotisch weefsel verrijkt met C. pneumoniae-DNA of EB , op zuivere C. pneumoniae DNA-monsters en op hele C. pneumoniae EB.Herstel van DNA werd gemeten met een C. pneumoniae-specifieke kwantitatieve real-time PCR. Een DNA-extractiemethode op basis van DNA-binding aan spinkolommen met een silicagelmembraan (DNeasy Tissue kit) toonde de hoogste recovery rate voor de weefselmonsters en zuivere DNA-monsters. Een geautomatiseerde extractiemethode op basis van magnetische glasdeeltjes (MagNA Pure) presteerde echter het beste op intact EB en atherosclerotisch weefsel verrijkt met EB. De DNeasy Tissue-kit en MagNA Pure-methoden en de zeer gevoelige realtime PCR werden vervolgens gebruikt op 78 atherosclerotische weefselmonsters van Deense patiënten die vaatherstel ondergingen. Geen van de monsters was positief voor C. pneumoniae-DNA. De atherosclerotische monsters werden getest op remming door toevoeging van twee verschillende, bekende hoeveelheden C. pneumoniae-DNA en geen monsters vertoonden remming. Conclusie: Als een zeer gevoelige PCR-methode en een geoptimaliseerde DNA-extractiemethode werden niet-detectie in atherosclerotisch weefsel van de Deense bevolking werd waarschijnlijk niet veroorzaakt door het gebruik van ongepaste methoden. Het kan echter zijn dat per patiënt meer monsters moeten worden geanalyseerd om hier helemaal zeker van te zijn. Mogelijke methodologische en epidemiologische redenen voor het niet detecteren van C. pneumoniae DNA in atherosclerotisch weefsel van de Deense bevolking worden besproken. Verder testen van DNA-extractiemethoden is nodig, aangezien dit onderzoek aanzienlijke intra- en inter-methodevariatie in DNA-herstel heeft aangetoond.
Vergelijking van methoden voor het terugwinnen van nucleïnezuren uit in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde autopsieweefsels uit archiefmateriaal.
Okello JB, Zurek J, Devault AM, Kuch M, Okwi AL, Sewankambo NK, Bimenya GS, Poinar D, Poinar HN.
McMaster Ancient DNA Centre, Afdeling Antropologie, McMaster University, Hamilton, Ontario L8S4L9, Canada
Anale Biochem. 2010 mei 1400(1): 110-117

Verzamelingen van menselijk weefsel in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) liggen doorgaans in slechte staat van opslag in ontwikkelingslanden. Met de vooruitgang in biomoleculaire technieken zijn deze buitengewone en vrijwel onaangeboorde bronnen een essentieel onderdeel geworden van retrospectieve epidemiologische studies. Om dergelijke weefsels met succes in genomische studies te gebruiken, hebben wetenschappers hoge nucleïnezuuropbrengsten en zuiverheid nodig. Ondanks het toenemende aantal beschikbare FFPE-weefselkits, hebben weinig studies hun toepasbaarheid geanalyseerd bij het terugwinnen van hoogwaardige nucleïnezuren uit gearchiveerde menselijke autopsiemonsters. Hier bieden we een onderzoek met 10 belangrijke extractiemethoden die worden gebruikt om totaal nucleïnezuur te isoleren uit FFPE-weefsels, variërend in leeftijd van 3 tot 13 jaar. Hoewel alle 10 methoden kwantificeerbare hoeveelheden DNA terugvonden, herstelden slechts 6 kwantificeerbare RNA's, die aanzienlijk varieerden en in het algemeen lagere DNA-concentraties opleverden. Over het algemeen laten we kwantitatief zien dat TrimGen's WaxFree-methode en onze interne fenol-chloroform-extractiemethode de hoogste opbrengsten van amplificeerbaar DNA herstelden, met aanzienlijke remming van de polymerasekettingreactie (PCR), terwijl Ambion's RecoverAll-methode het meest amplificeerbare RNA terugvond.


Bekijk de video: StatQuest: A gentle introduction to RNA-seq (Januari- 2022).