Informatie

Welke subtypes van immuuncellen worden tijdens het ouder worden het meest getroffen?


Het is nu algemeen bekend dat veroudering bij de mens gepaard gaat met een toename van systemische, laaggradige (chronische) ontstekingen, soms ontstekend (Franceschi, 2007). Dit is gedeeltelijk te wijten aan meer globale veranderingen in het lichaam, waaronder een verhoogd aantal verouderde cellen, maar momenteel interessant voor mij is de verandering in de samenstelling van de circulerende immuuncelsubtypes die ofwel de oorzaak kunnen zijn van of worden beïnvloed door , de toename van 'globale' ontstekingen.

Ik stel me voor dat het antwoord op deze vraag een onderzoek is waarbij monsters van verschillende leeftijden worden genomen en de verschillende leukocytfracties worden gescheiden. Hiermee kon worden bepaald welke immuunsubtypes over-/ondervertegenwoordigd zijn bij ouderen en op welke leeftijd de veranderingen optreden (bijv. monocytenaantallen kunnen afnemen vanaf 40 jaar, terwijl neutrofielenaantallen kunnen toenemen...). Ik heb redelijk uitgebreid onderzoek gedaan, maar heb geen onderzoek kunnen vinden dat dit heeft gedaan - hoewel het waarschijnlijk is dat het is uitgevoerd. Bedankt.


Uit mijn aantekeningen over immunologie:

* Afname van hematopoëtische stamcellen, resulterend in een afname van Affector-cellen. Erytroïde en myeloïde nakomelingen lijken niet te worden aangetast.

*Minder pro-B-cellen, wat resulteert in minder affector-B-cellen.

* Lymfoïde voorlopers in het beenmerg en de thymus rijpen.

*Lymfocyten in secundaire lymfoïde organen.

Voor het aangeboren systeem:

*Neutrofielen hebben een verminderd vermogen tot oxidatieve uitbarstingen, batericide activiteit en chemotaxis.

*Macrofagen hebben een verminderd vermogen tot fagocytische activiteit, oxidatieve uitbarstingen en MHC II-expressie (wat hun vermogen om antigeen te presenteren en CD4-helper-T-celreacties te initiëren vermindert).

*NK-cellen hebben een verminderd vermogen tot cytotoxiciteit, pro-inflammatoire cytokinen en chemokinen en proliferatie als reactie op IL-2. Het totale aantal NK-cellen neemt echter toe.

De bronnen: zowel klinisch (het was in een academisch ziekenhuis) en Veroudering en immuunsysteem, Hoofdstuk 33 van de lestekst: Cellulaire en moleculaire immunologie


Grenzen in Cellen ontwikkelingsbiologie

De affiliaties van de redacteur en de recensenten zijn de meest recente op hun Loop-onderzoeksprofielen en weerspiegelen mogelijk niet hun situatie op het moment van beoordeling.



DELEN OP

Invoering

Veroudering beïnvloedt geleidelijk de activiteit van het immuunsysteem. De leeftijdgerelateerde afname van immuunresponsen, ook wel immunosenescentie genoemd, is prominent aanwezig in het adaptieve immuunsysteem, waar T-cellen het meest worden aangetast tijdens het ouder worden 1,2. Zowel CD4+- als CD8+-T-celcompartimenten veranderen met de leeftijd, maar met name de CD8+-T-celpopulatie wordt verrijkt met een groot aantal terminaal gedifferentieerde effectorcellen, die minder goed reageren op antigenen 1 . Chronische infectie met cytomegalovirus (CMV) is betrokken bij de leeftijdsafhankelijke uitbreiding van de CD8+ T-celsubset 3,4 en bij oudere volwassenen kan 25-50% van de CD8+-cellen specifiek zijn voor CMV 5,6,7 . Een typisch kenmerk van veroudering is een chronische, laaggradige ontstekingsstatus, ontstekingsveroudering genaamd, die wordt gekenmerkt door een algemene toename van pro-inflammatoire cytokines 8,9. De verhoogde expressie van de pro-inflammatoire markers suggereert dat immunosenescentie wordt aangedreven door een chronische antigene belasting, die het pro-inflammatoire fenotype 10 induceert. Dienovereenkomstig is het concept van een immuunrisicoprofiel, geassocieerd met hogere sterftecijfers, voorgesteld. Dit is samengesteld uit uitgeputte naïeve T-celaantallen, een omgekeerde CD8+/CD4+ T-celverhouding, lage respons op mitogeenstimulatie, verhoogde populatie van anergische terminaal gedifferentieerde CD8+ T-cellen en verhoogde pro-inflammatoire cytokine-expressie 11 .

Leeftijdgerelateerde transcriptoommarkeranalyses in perifere bloedleukocyten (PBL) of mononucleaire cellen hebben veranderingen in genexpressieniveaus en afwijkende mRNA-splitsing 12,13,14 aan het licht gebracht, met geslachtsspecifieke effecten 15 en afhankelijkheid van CMV-fenotype 16 . Verschillende onderzoeken hebben perifere bloedcellen gebruikt voor de analyse van DNA-methylatieveranderingen tijdens veroudering en hebben differentieel gemethyleerde CpG-plaatsen 17,18, hypermethylering van CpG-eilanden in promoters 19,20, aanwezigheid van gehypomethyleerde blokken op megabaseschaal 21 en voorgestelde methyleringsbiomarkers onthuld als voorspellers van leeftijd 22,23,24. Er moet echter worden opgemerkt dat de transcriptionele en epigenetische analyses in menselijke perifere bloedmonsters worden beïnvloed door de numerieke wijziging van specifieke celsubsets in bloed, waaronder T-cellen, B-cellen, monocyten en granulocyten 25,26. Zelfs als normalisatietools worden toegepast 27 , is het gebruik van gezuiverde celsubsets superieur aan de identificatie van methyloomveranderingen en hun correlatie met celtype-specifieke functies.

In het licht van deze overwegingen hebben we ons gericht op gesorteerde CD4+- en CD8+-T-cellen en wilden we vaststellen of de DNA-methyleringsveranderingen betrokken zijn bij de ontwikkeling van leeftijdsgerelateerde afname van de respons van T-cellen. We hebben DNA gezuiverd van PBL-, CD4+- en CD8+-T-cellen van jongere en oudere individuen en hun genoombrede DNA-methyleringsverschillen vergeleken. We correleerden de leeftijdsgerelateerde methyleringsveranderingen met genexpressieniveaus en histon-modificaties in dezelfde regio's. Onze genoombrede analyses geven voor het eerst in CD8+ T-celsubgroep een sterke leeftijdsgebonden correlatie aan tussen DNA-methylatie en de expressie van genen die een functionele rol spelen bij het beheersen van T-celimmuunresponsen en hun differentiatie.


Oorzaken, gevolgen en omkering van veroudering van het immuunsysteem

Afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde, David Geffen School of Medicine aan de UCLA, Los Angeles, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Kenneth Dorshkind, David Geffen School of Medicine aan de UCLA, 10833 Le Conte Avenue, Los Angeles, Californië 90095, VS. Telefoon: 310.206.9535 Fax: 310.206.9391 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Montecino-Rodriguez, E. in: JCI | PubMed | Google geleerde

Afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde, David Geffen School of Medicine aan de UCLA, Los Angeles, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Kenneth Dorshkind, David Geffen School of Medicine aan de UCLA, 10833 Le Conte Avenue, Los Angeles, Californië 90095, VS. Telefoon: 310.206.9535 Fax: 310.206.9391 E-mail: [email protected]

Zoek artikelen van Berent-Maoz, B. in: JCI | PubMed | Google geleerde

Afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde, David Geffen School of Medicine aan de UCLA, Los Angeles, Californië, VS.

Correspondentieadres aan: Kenneth Dorshkind, David Geffen School of Medicine aan de UCLA, 10833 Le Conte Avenue, Los Angeles, Californië 90095, VS. Telefoon: 310.206.9535 Fax: 310.206.9391 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Dorshkind, K. in: JCI | PubMed | Google geleerde

De effecten van veroudering op het immuunsysteem manifesteren zich op meerdere niveaus, waaronder verminderde productie van B- en T-cellen in beenmerg en thymus en verminderde functie van rijpe lymfocyten in secundaire lymfoïde weefsels. Als gevolg hiervan reageren oudere personen niet zo krachtig op immuunuitdagingen als jongeren. Een belangrijk doel van verouderingsonderzoek is het definiëren van de cellulaire veranderingen die optreden in het immuunsysteem en de moleculaire gebeurtenissen die daaraan ten grondslag liggen. In dit opzicht is aanzienlijke vooruitgang geboekt en deze informatie heeft de grondgedachte geleverd voor klinische proeven om het verouderende immuunsysteem te verjongen.

Een van de meest erkende gevolgen van veroudering is een achteruitgang van de immuunfunctie. Hoewel oudere personen geenszins immunodeficiënt zijn, reageren ze vaak niet efficiënt op nieuwe of eerder aangetroffen antigenen. Dit wordt geïllustreerd door een verhoogde kwetsbaarheid van personen van 70 jaar en ouder voor griep ( 1 ), een situatie die wordt verergerd door hun slechte respons op vaccinatie ( 2 – 4 ).

De effecten van veroudering op het immuunsysteem zijn wijdverbreid en beïnvloeden de snelheid waarmee naïeve B- en T-cellen worden geproduceerd, evenals de samenstelling en kwaliteit van de rijpe lymfocytenpool. Het doel van dit artikel is om recente ontwikkelingen te bespreken, met een focus op adaptieve immuniteit, in het begrip van de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan deze door leeftijd veroorzaakte veranderingen en om hun implicaties te bespreken voor het ontwerp van strategieën om het immuunsysteem bij ouderen te verjongen. .

Na hun productie in het beenmerg en de thymus migreren naïeve B- en T-cellen naar secundaire lymfoïde weefsels zoals de milt (5-7). Dit proces is bijzonder robuust bij jongeren om een ​​divers immuunrepertoire te genereren en om perifere lymfoïde compartimenten te vullen. Daarentegen is primaire lymfopoëse bij ouderen aanzienlijk verminderd, zoals geïllustreerd door involutie van de thymus (8-10). De oorzaken van deze leeftijdsgebonden vermindering van de ontwikkeling van lymfocyten zijn multifactorieel en omvatten veranderingen in HSC's en voorlopercellen (11, 12) evenals de lokale weefsel- en systemische omgevingen (13, 14).

HSC's vertonen meerdere leeftijdsgerelateerde veranderingen, waaronder een verminderde hechting aan stromale cellen en, in sommige stammen van muizen (15, 16) en oudere mensen (17), een toename in aantal. Vanuit een immunologisch perspectief is het meest ingrijpende effect van stamcelveroudering bij zowel muizen (11, 18) als mensen (17) een verminderd vermogen om lymfocyten te produceren en een toename van het myeloïde potentieel. Deze verschuiving is gecorreleerd met verhoogde expressie van myeloïde afstammingsgenen en downregulatie van genen die een lymfoïde afstammingsbestemming specificeren (11, 17).

Het vermogen om, althans bij muizen, verschillende HSC-subsets te identificeren die lymfoïde vooringenomen of myeloïde vooringenomen zijn, of die een uitgebalanceerd lymfo-myeloïde potentieel vertonen, heeft nieuwe inzichten opgeleverd in hoe veroudering de stamcelpool beïnvloedt (Figuur 1 en refs. 19, 20). ). Omdat elk van deze afstammings-negatieve (Lin-) CD117+ (c-kit+) Sca-1+-populaties kan worden gedefinieerd op basis van hun relatieve expressie van CD150, een familielid van de signalerende lymfocytische activatiemolecule (Figuur 1 en refs. 21 – 23), wordt nu ingezien dat het aantal lymfoïde-vooringenomen stamcellen afneemt met de leeftijd, samen met een toename van myeloïde-vooringenomen HSC's (19). De leeftijdgerelateerde toename in expressie van myeloïde afstammingsgenen in de hierboven vermelde onderzoeken (11, 17) was waarschijnlijk het gevolg van de accumulatie van myeloïde-vooringenomen HSC's, aangezien deze analyses werden uitgevoerd op niet-gescheiden pools van HSC's. Ondanks de toename van hun aantal, zijn myeloïde vooringenomen stamcellen niet zo robuust als hun jonge tegenhangers (24), wat op zijn beurt ten grondslag zou kunnen liggen aan de talrijke leeftijdsgerelateerde tekortkomingen die worden waargenomen in volwassen myeloïde cellen zoals neutrofielen en macrofagen (25, 26) .

Effecten van veroudering op HSC's en lymfocytvoorlopers. Lymfopoëse bij de jongen (links) wordt gekenmerkt door robuuste B- en T-celproductie in het beenmerg en de thymus. De pool van HSC's omvat een relatief groot aantal lymfoïde-biased stamcellen die efficiënt lymfoïde voorlopers genereren met een hoog proliferatief potentieel. Echter, met toenemende leeftijd (rechts), neemt het aantal lymfoïde vooringenomen HSC's af en overheersen myeloïde vooringenomen stamcellen, wat bijdraagt ​​aan het verminderde aantal lymfoïde voorlopers. Bovendien vertonen B-celvoorlopers in het beenmerg en T-celvoorlopers in de thymus verminderde proliferatiesnelheden en hogere niveaus van apoptose in vergelijking met hun jonge tegenhangers. De verhoogde expressie van Inkt4a en Arf in pro-B-cellen en Ink4a in ETP's dragen bij aan deze verminderde proliferatie/verhoogde apoptose. De afname van primaire lymfopoëse resulteert op zijn beurt in een verminderd aantal naïeve cellen die migreren naar secundaire lymfoïde weefsels zoals de milt.

Lymfoïde-vooringenomen HSC's bij oude muizen lijken ook tekortkomingen te accumuleren die, zoals hieronder besproken, hun zelfvernieuwingspotentieel in gevaar kunnen brengen en kunnen bijdragen aan de achteruitgang van deze populatie (27). Met het oog hierop is het niet verwonderlijk dat het aantal B-cel (28 – 31) en T-cel (32, 33) voorlopers in beenmerg en thymus aanzienlijk wordt verminderd met de leeftijd. Bovendien verergert de slechte kwaliteit van de lymfoïde voorlopers die bij ouderen worden gegenereerd de afname van lymfopoëse verder (29, 32, 34). Gemeenschappelijke lymfoïde voorlopers, pre-pro-B-cellen en pro-B-cellen van oude muizen prolifereren bijvoorbeeld niet zo uitgebreid als jonge cellen, en ze vertonen significant hogere apoptose-snelheden. De meest onrijpe intrathymische voorlopers, die vroege T-afstammingsvoorlopers (ETP's) worden genoemd, genereren CD4-CD8-dubbel-negatieve (DN) nakomelingen die uiteindelijk rijpe CD4+ Th-cellen en CD8+ cytotoxische T-cellen worden (35). Net als voorlopers van B-cellen vertonen ETP's en DN-cellen van oude muizen ook leeftijdsgerelateerde defecten in proliferatie en hoge snelheden van apoptose (referentie 32 en figuur 1).

Waarom veroudering resulteert in een afname van het aantal lymfoïde-biased HSC's en verminderde kwaliteit van lymfoïde voorlopers is niet volledig begrepen. Aan de ene kant kunnen intrinsiek geprogrammeerde gebeurtenissen in stam- en voorlopercellen werkzaam zijn, wat zou veronderstellen dat deze cellen een soort interne klok hebben die hun functie en levensduur regelt. Steeds meer bewijs suggereert echter dat afname van lymfopoëse wordt beïnvloed door leeftijdsgerelateerde veranderingen in de omgeving. De precieze, leeftijdgerelateerde omgevingsfactoren die resulteren in uitputting van lymfoïde-biased HSC's zijn niet geïdentificeerd, hoewel veranderingen in niveaus van transformerende groeifactor β-1 mogelijk een rol spelen (21). Dalingen in de micro-omgeving van het beenmerg, mogelijk als gevolg van verminderde IL-7-secretie door stromale cellen, zijn betrokken bij veroudering van B-cellijnen (36, 37). Leeftijdgerelateerde veranderingen in de micro-omgeving hebben ook een grote impact op de thymus, waar de ontwikkeling van T-cellen afhankelijk is van een intact thymusmilieu dat bestaat uit fibroblasten, macrofagen, dendritische cellen en thymusepitheelcellen. Het is duidelijk dat het aantal thymusepitheelcellen in de loop van de tijd afneemt en dat ze niet worden vervangen als gevolg van een verstoorde proliferatie (38). Bovendien neemt de productie van ontstekingsmediatoren die mogelijk thymocytotoxisch zijn ook toe met de leeftijd (39). De thymus, vooral bij mensen, is in toenemende mate geïnfiltreerd met adipocyten, waarvan de bijproducten toxisch kunnen zijn voor de zich ontwikkelende thymocyten en voor de resterende stromale celpopulaties (40). Een vergelijkbare vettige achteruitgang van de micro-omgeving van het beenmerg treedt op (41), maar de rol van adipocyt-afgeleide factoren bij het onderdrukken van B-lymfopoëse is niet goed begrepen.

Systemische veranderingen die optreden tijdens het ouder worden, kunnen ook van invloed zijn op de productie van lymfocyten (14) en in het bijzonder op de thymopoëse. Talrijke rapporten hebben bijvoorbeeld aangetoond dat groeihormoon (GH) en IGF-1 thymopoëse kunnen stimuleren (13, 42). Omdat de productie van deze hormonen afneemt met de leeftijd (43), heeft dit geleid tot de conclusie dat leeftijdsgerelateerde veranderingen in het endocriene systeem bijdragen aan afname van lymfopoëse. Deze visie heeft de grondgedachte gevormd voor klinische onderzoeken met GH, die we hieronder bespreken.

Hoewel het aantal naïeve B- en T-cellen dat migreert van primaire naar secundaire lymfoïde organen door veroudering wordt verminderd, stopt de ontwikkeling van B- en T-cellen niet volledig. Er blijft inderdaad wat functioneel thymusweefsel over, zelfs bij oudere mensen (44). De aanhoudende productie van lymfocyten, zij het beperkt, en de aanwezigheid van relatief normale aantallen lymfocyten in organen zoals de milt roept de vraag op waarom de functionele immuniteit bij ouderen afneemt. Het antwoord is dat de samenstelling en kwaliteit van de rijpe lymfocytenpool door veroudering ingrijpend verandert.

Een toename van het aantal geheugen-T-cellen is nu bijvoorbeeld een algemeen erkend kenmerk van veroudering. Deze cellen, die worden gegenereerd na de eerste ontmoeting met antigeen, blijven lang bestaan ​​nadat de eerste uitdaging is verdwenen en vormen een bron van effectoren die snel kunnen reageren bij hernieuwde blootstelling aan antigeen. Blootstelling aan meerdere pathogenen in de loop van de tijd resulteert in een divers immuunrepertoire dat een grotere pool van beschermende geheugencellen omvat. Chronische stimulatie met aanhoudende virale infecties zoals CMV kan echter de naïeve pool van cellen uitputten en resulteren in een uitbreiding van oligoklonale geheugencellen. Aangenomen wordt dat dit fenomeen een belangrijke factor is die bijdraagt ​​aan de accumulatie van CD8+-geheugencellen bij ouderen (45), hoewel antigeenonafhankelijke expansie van CD8+ T-cellen ook kan optreden (46). Deze oligoklonaal geëxpandeerde CD8+-geheugen-T-cellen worden bij mensen verder onderscheiden door verlies van expressie van het co-stimulerende molecuul CD28 (47, 48) en een verminderde immuunfunctie. De accumulatie van CD8 + CD28 - T-cellen en CMV-seropositiviteit zijn componenten van het immuunrisicoprofiel, dat is voorgesteld als een voorspeller van mortaliteit bij personen van 65 jaar en ouder (49), maar precies hoe de combinatie van deze gebeurtenissen resulteert in een verhoogde sterfte is niet duidelijk ( 50 ).

Het immuunrisicoprofiel omvat ook B-cellen met een verminderde functie. Het aantal B-cellen bij muizen is onveranderd door veroudering, maar in humaan perifeer bloed is hun absolute aantal verminderd (51). Deze afname is waarschijnlijk te wijten aan verminderde aantallen IgM+-geheugen en geschakelde geheugen B-cellen, omdat het totale aantal naïeve B-cellen onveranderd blijft door veroudering (51, 52). Menselijke en muriene B-cellen vertonen ook een verminderde klasse-switch-recombinatie, die is toegeschreven aan verminderde inductie van door activering geïnduceerd cytidinedeaminase (AID) -enzym (53). Gezien de cruciale rol die CD4+-T-cellen spelen bij het orkestreren van de immuunrespons, zijn enkele van de leeftijdsgerelateerde tekortkomingen die zijn waargenomen in B-cellen (51, 53, 54), waaronder een vermindering van het aantal plasmablasten dat zich als reactie ontwikkelt. tegen griepvaccinatie ( 55 ) en de productie van antilichamen van slechte kwaliteit tegen koolhydraatantigenen ( 56 - 58 ), kan secundair zijn aan T-celdeficiënties.

Er zijn meerdere B-celsubpopulaties gedefinieerd en er is aanvullend onderzoek nodig om te bepalen hoe veroudering hen beïnvloedt. Humorale immuniteit tegen influenzavirus vindt dus plaats in T-cel-onafhankelijke en T-cel-afhankelijke golven waarbij B1-, marginale zone en folliculaire B-cellen betrokken kunnen zijn (59). Onlangs werd gemeld dat het aantal B-cellen in de marginale zone bij oude muizen is verminderd (60), maar of en hoe dit de productie van antilichamen tegen specifieke antigenen beïnvloedt, is onbekend. Hoewel aanwezig in een lage frequentie (61), spelen B1 B-cellen een cruciale rol in de reactie op S. pneumoniae bij muizen door de afscheiding van anti-koolhydraatantilichamen (62). Er is echter zeer weinig bekend over de effecten van veroudering op hun functie. Onlangs is een populatie van CD20 + CD27 + CD43 + CD70 - menselijke B1-cellen beschreven (63), maar nogmaals, er is niets bekend over hoe veroudering hun ontwikkeling of functie beïnvloedt.

Ontsteking (64), een aandoening waarbij er een opeenhoping van ontstekingsmediatoren in weefsels is, is in verband gebracht met veroudering. Er is voorgesteld dat de bron van deze ontstekingsfactoren cellen zijn die een senescentie-geassocieerd secretoir fenotype (SASP) hebben gekregen (65). De SASP kan door cellen worden verkregen als ze eenmaal zijn verouderd, of het kan in de loop van de tijd geleidelijk optreden in verschillende populaties, omdat ze DNA-laesies krijgen die op hun beurt de verhoogde productie van ontstekingsmediatoren zoals IL-6 veroorzaken (66, 67). Ongeacht hoe de verschuiving plaatsvindt van een heilzaam naar een inflammatoir milieu, het eindresultaat kan een negatief effect zijn op het vermogen van naïeve lymfocyten uit het beenmerg of de thymus om zich in een orgaan zoals de milt te nestelen, evenals de functie van volwassen lymfocyten die al in dat weefsel aanwezig zijn. In het laatste geval prolifereren bijvoorbeeld CD8+-T-cellen die zich ophopen bij oudere personen slecht (68, 69), en, zoals in de volgende paragraaf in meer detail wordt besproken, vertonen CD4+-T-cellen een verminderde signaalintensiteit van de T-celreceptor en veranderde productie van verschillende cytokinen na antigeenbinding (70, 71).

De precieze bron van de verschillende ontstekingsmediatoren kan van persoon tot persoon verschillen. In één scenario zouden leeftijdsgerelateerde veranderingen in micro-omgevingselementen zoals stromale cellen of dendritische cellen (72) resulteren in een verschuiving van een heilzame naar een inflammatoire omgeving. Het is echter even aannemelijk dat veranderingen die optreden in verouderende B- en T-cellen of aangeboren effectoren (26) micro-omgevingselementen kunnen veranderen. Met een hogere leeftijd vertonen bijvoorbeeld naïeve CD4+-T-cellen vooringenomen differentiatie in Th17 in plaats van Th1- en Th2-cellen, en de ontstekingsmediatoren die door de laatstgenoemde cellen worden uitgescheiden, kunnen op hun beurt stromale cellen of andere omgevingspopulaties beïnvloeden (73). De ontwikkeling van Th17-cellen is afhankelijk van de basis leucine zipper transcriptiefactor ATF-achtige (BATF) transcriptiefactor (74), maar waarom de expressie ervan zou kunnen toenemen met de leeftijd is niet duidelijk. Evenzo kunnen de CD8 + CD28-geheugen-T-cellen die zich ophopen bij oudere mensen ook een bron zijn van inflammatoire cytokines (68, 69) die de functie van stromale elementen beïnvloeden. De specifieke cellen en de volgorde waarin leeftijdsgerelateerde veranderingen daarin optreden, kunnen van persoon tot persoon verschillen als gevolg van verschillen in genetische achtergrond en milieublootstelling. Zodra de effecten van veroudering zich echter manifesteren in een of meer doelpopulaties, kan er een vicieuze cirkel ontstaan ​​die leidt tot een neerwaartse spiraal van steeds meer aangetaste immuunfunctie (Figuur 2).

De sterkte van de immuunrespons neemt af met de leeftijd. Meerdere leeftijdsgerelateerde veranderingen kunnen de samenstelling en functie van lymfocyten in secundaire lymfoïde weefsels beïnvloeden. CD4+ Th-cellen vertonen activeringsdefecten en verhoogde differentiatie tot Th17-cellen. CD8+ T-cellen ondergaan een oligoklonale expansie en verlies van CD28 bij mensen en vertonen een verminderde functie. Het aantal B-cellen dat reageert op influenza is verminderd en de aviditeit van antilichamen als reactie op koolhydraatantigenen is verminderd. Bovendien omvat de weefselomgeving een verhoogde concentratie van inflammatoire cytokinen, die kunnen worden geproduceerd door stromale elementen, dendritische cellen of verouderende B- en T-cellen. Het toegenomen aantal geheugencellen die weefselnissen innemen en het ontstekingsmilieu kan op zijn beurt het vermogen van naïeve B- en T-cellen die migreren vanuit het beenmerg en de thymus om zich in het weefsel te nestelen, in gevaar brengen. Samen resulteren deze veranderingen in een verminderde immuunfunctie bij ouderen.

De analyse van stam- en voorlopercellen uit verschillende weefsels heeft aangetoond dat veroudering vaak resulteert in de ontregeling van vergelijkbare moleculaire routes (75). Veranderingen in de PI3K-route worden bijvoorbeeld vaak vertoond door verouderende cellen. In overeenstemming met deze waarneming zijn HSC's uitgeput als gevolg van de opbouw van ROS bij muizen waarin FOXO, een belangrijke stroomafwaartse PI3K-component, is verwijderd (76). Niveaus van ROS in cellen kunnen ook worden gereguleerd door ataxie telangiectasie gemuteerd (ATM) kinase, en leeftijdsgerelateerde dalingen in de expressie van ATM kunnen resulteren in een toename van ROS in cellen (77, 78). Verhoogde expressie van tumorsuppressor-eiwitten zoals p16 Ink4a en ARF komt ook voor in verouderende cellen uit meerdere weefsels (79, 80). Expressie van p16 Ink4a resulteert in activatie van retinoblastoom, wat leidt tot remming van de celcyclus, terwijl p19 Arf de activiteit van p53 bevordert, wat tot stilstand van de celcyclus en/of apoptose leidt. We waren vooral geïnteresseerd in het begrijpen waarom de kwaliteit van lymfoïde voorlopers afneemt met de leeftijd, en recente studies hebben aangetoond dat zowel Ink4a en Arf expressieverhogingen in pro-B-cellen van oude muizen en dat het remmen van hun expressie de effecten van veroudering gedeeltelijk kan omkeren (81). We zagen ook een verhoogde expressie van Ink4a, maar niet Arf, in ETP's en hun DN-nakomelingen (82).

Andere leeftijdsgebonden veranderingen kunnen specifieker zijn voor het hematopoëtische systeem. Er is bijvoorbeeld voorgesteld dat veranderde expressie van verschillende B-afstammingstranscriptiefactoren ten grondslag liggen aan afnames in B-lymfopoëse (83). Recente interesse heeft zich gericht op BATF, waarvan de expressie het hoogst is in het hematopoëtische systeem, in de achteruitgang van lymfoïde-vooringenomen HSC's tijdens veroudering. Wang en collega's toonden aan dat BATF-niveaus in HSC's stegen als reactie op DNA-schade en dat dit resulteerde in de differentiatie van lymfoïde-biased HSC's ten koste van hun zelfvernieuwing (27). Dit is een bijzonder interessante bevinding, omdat het een moleculair mechanisme biedt voor de leeftijdsgerelateerde afname van het aantal lymfoïde-biased HSC's dat hierboven is besproken.

Hoewel er veel aandacht is geweest voor stam- en voorlopercellen, beïnvloedt veroudering ook patronen van genexpressie in rijpe B- en T-cellen. Zoals eerder besproken, wordt de recombinatie van klasse-switches aangetast bij ouder wordende muizen- en humane B-cellen als gevolg van verminderde expressie van enzymen zoals AID (53, 84). Afwijkende T-celsignalering is ook in verband gebracht met veroudering (48, 85), en de lijst van ontregelde genen blijft groeien, zoals blijkt uit verschillende recente rapporten (86 – 88), waarvan er twee gericht waren op veranderde expressie van dubbele specifieke fosfatasen ( DUSP's). DUSP's deactiveren doelkinasen, inclusief die in de MAPK-route waarvan de activiteit cruciaal is voor T-celactivering, differentiatie en cytokineproductie. Eén studie rapporteerde de inductie en aanhoudende transcriptie van DUSP4 in geactiveerde CD4+-geheugen T-cellen van mensen van 65 jaar en ouder, wat correleerde met hun veranderde cytokineproductie en een verminderd vermogen om B-cellen te helpen (87). Een volgend rapport van hetzelfde laboratorium beschreef de verhoogde expressie van DUSP6 in naïeve CD4+ humane T-cellen, wat resulteerde in activering van een lagere fractie van Th-cellen, vooral als reactie op stimuli met lage affiniteit (88).

Deze signaleringsafwijkingen in HSC's, lymfoïde voorlopers en rijpe B- en T-cellen kunnen, ten minste gedeeltelijk, optreden als gevolg van de leeftijdgerelateerde veranderingen in de systemische en lokale weefselomgevingen die hierboven zijn besproken. Na verloop van tijd kan blootstelling aan een inflammatoir milieu bijvoorbeeld epigenetische modificaties induceren die de expressie van genen beïnvloeden die nodig zijn voor groei, overleving of differentiatie (89, 90). De waarneming dat veranderingen in de methyleringsstatus als gevolg van differentiële expressie van verschillende DNA-methyltransferasen (DNMT's) het HSC-gedrag kunnen beïnvloeden, komt overeen met deze visie. In dit opzicht schaadt het verlies van DNMT3a de differentiatie van HSC's, terwijl hun aantal in het beenmerg toeneemt (91), en muizen met hypomorfe expressie van DNMT1 vertonen een relatief normaal myeloerytroïde potentieel, maar vertonen een significante blokkering in de ontwikkeling van lymfoïde (92). Desalniettemin kunnen cel-autonome gebeurtenissen ook bijdragen aan veroudering. Herhaalde celdeling kan dus resulteren in progressieve telomeerverkorting die op zijn beurt resulteert in DNA-schade die niet langer efficiënt kan worden gerepareerd vanwege leeftijdsgerelateerde defecten in DNA-herstelmechanismen (75). Het is interessant dat telomeerdisfunctie in verband is gebracht met veranderingen in het mitochondriale metabolisme (93), met het oog op een onderzoek dat een verband legt tussen een gecompromitteerde mitochondriale functie en depressieve thymopoëse (94).

Het uiteindelijke doel van onderzoek naar veroudering van het immuunsysteem is om de informatie te gebruiken om strategieën te ontwikkelen om de immuniteit bij ouderen te stimuleren (samengevat in tabel 1). Zoals hierboven besproken, is een aantal moleculen geïdentificeerd waarvan de afwijkende expressie bijdraagt ​​aan veroudering, en het richten op deze moleculen kan het verouderingsproces mogelijk vertragen of omkeren. Farmacologische remming van Cdc42, een kleine Rho GTPase waarvan de verhoogde expressie is gekoppeld aan HSC-veroudering bij muizen, met een selectieve Cdc42-activiteitsremmer verjongde HSC's (95), en andere onderzoeken hebben het potentieel van antioxidanten aangetoond om de functie van oude HSC's (76, 96). Naarmate aanvullende leeftijdsgerelateerde veranderingen in de expressie van transcriptiefactoren, signaleringstussenproducten, celcyclusregulatoren en microRNA's (97, 98) worden gedefinieerd, zullen waarschijnlijk nieuwe farmacologische interventies ontstaan. In dit opzicht was de verhoogde expressie van DUSP6 in naïeve CD4+ T-cellen zoals hierboven beschreven het gevolg van de leeftijdsgerelateerde afname van miR-181a-expressie (88).

Mogelijke interventies om het ouder wordende immuunsysteem te verjongen

Vanwege de sleutelrol die T-lymfocyten spelen in de immuunrespons en het duidelijke effect van veroudering op rijpe CD4+- en CD8+-cellen, is verjonging van de geïnvolueerde thymus om de perifere T-celpool aan te vullen van aanzienlijk belang. Een volledige bespreking van de verschillende betrokken hormonen en groeifactoren is elders besproken (99, 100), maar er is aanzienlijke belangstelling geweest voor het gebruik van klassieke endocriene hormonen zoals GH en IGF-1, evenals andere middelen zoals IL-7 en FGF7 om thymopoëse te stimuleren (Figuur 3).

Geselecteerde strategieën om de geïnvolueerde thymus te verjongen. Het potentieel van verschillende hormonen en groeifactoren om de geïnvolueerde thymus te verjongen, is getest in verschillende preklinische en klinische onderzoeken. Veel van deze factoren zijn onder te verdelen in drie categorieën. Die in de eerste (i), zoals IL-7, binden aan voorlopers in het beenmerg en de thymus en hebben slechts een bescheiden effect op de thymopoëse. Er is weinig bewijs dat IL-7 effecten heeft op stromacellen van de thymus. In plaats daarvan kan het voordeel van IL-7 liggen in zijn vermogen om overleving/expansie van perifere T-cellen te stimuleren. De tweede categorie (ii) omvat hormonen zoals GH waarvan in preklinische en klinische onderzoeken is aangetoond dat ze de thymopoëse stimuleren en de thymus vergroten. Veel GH-effecten worden gemedieerd door inductie van IGF-1. IGF-1 kan binden aan receptoren op thymus stroma en thymocyten, hoewel de werking ervan voornamelijk wordt gemedieerd door effecten op de voormalige cellen. Stromale cel-afgeleide factoren werken vermoedelijk dan op thymocyten (gebogen pijl). Een derde categorie van factoren (iii), getypeerd door FGF7, bindt aan stromale cellen maar niet aan thymocyten. Door stromacellen geïnduceerde factoren werken vervolgens op thymocyten (gekromde pijl), en we hebben onlangs aangetoond dat effecten onder meer neerwaartse regulatie van Ink4a in ETP's (82). De thymopoëtische effecten van verschillende aanvullende factoren zijn geëvalueerd en recente gedetailleerde beoordelingen moeten worden geraadpleegd voor meer informatie (99, 100).

GH en IGF-1 binden aan receptoren die tot expressie worden gebracht op thymocyten (101) en thymusepitheelcellen (102) en talrijke onderzoeken (42) hebben aangetoond dat de grootte van de thymus groter is bij oude muizen die een van beide hormonen toegediend kregen (101, 103). Deze preklinische gegevens vormden de basis voor een klinische studie bij mensen om te bepalen of een jaar dagelijkse toediening van GH de thymus van met HIV geïnfecteerde volwassenen zou kunnen verjongen. Ondanks lage virale ladingen hadden degenen die deelnamen aan deze studie een laag aantal CD4+ T-cellen. GH-behandeling resulteerde in verhoogde thymusmassa, verhoogde thymusproductie zoals gemeten door excisiecirkels van T-celreceptorherschikking in circulerende T-cellen, en verhoogde aantallen naïeve CD4+ T-cellen. Veel GH-effecten worden gemedieerd door inductie van IGF-1-productie, en de verhoogde niveaus van IGF-1 bij met GH behandelde patiënten waren hiermee consistent. Toediening van IGF-1 aan oude muizen versterkt de thymopoëse, voornamelijk door effecten op epitheelcellen van de thymus en niet op thymocyten (104). De laatste waarnemingen suggereren dat GH bij de menselijke proefpersonen resulteerde in een inductie van IGF-1 die op een vergelijkbare manier functioneerde. Het is belangrijk op te merken dat de effecten van GH niet thymus-specifiek waren, aangezien de proefpersonen ook een groter aantal naïeve perifere CD4+ T-cellen hadden (105).

In tegenstelling tot GH en IGF-1, die het aantal thymuscellen bij muizen ongeveer verdubbelen (101), is FGF7 vooral opmerkelijk omdat de toediening ervan aan oude muizen resulteert in een vernieuwing van de micro-omgeving van de thymus, een verhoogd aantal ETP's en een herstel van thymus cellulariteit tot niveaus waargenomen bij jongeren (106, 107). FGF7, ook bekend als keratinocytgroeifactor en op de markt gebracht als Kepivance (palifermin Biovitrum), is door de FDA goedgekeurd voor de behandeling van orale mucositis bij patiënten die myelotoxische therapie ondergaan. We veronderstelden dat de verhoogde thymopoëse in met FGF7 behandelde oude muizen optrad omdat signalen van de verjongde micro-omgeving op hun beurt de Ink4a expressie in ETP's. Zoals voorspeld, niveaus van Ink4a expressie in ETP's en DN-cellen die waren geoogst uit met FGF7 behandelde muizen werden neerwaarts gereguleerd en deze cellen vertoonden verhoogde proliferatie (82). Deze waarnemingen komen overeen met een recent rapport waaruit blijkt dat voorwaardelijke verwijdering van Ink4a in DN kunnen thymocyten de involutie van de thymus aanzienlijk vertragen (108). Het zal dus van belang zijn om de factor(en) te identificeren die vrijkomen uit FGF7-gestimuleerde thymusepitheelcellen die vervolgens inwerken op verouderde ETP's en DN-cellen, aangezien deze therapeutisch potentieel zouden kunnen hebben.

Strategieën die zich richten op rijpe B- en T-cellen kunnen ook van waarde zijn bij het stimuleren van de immuniteit bij ouderen. Als naïeve lymfocyten bijvoorbeeld niet in staat zijn om efficiënt in de milt te nestelen omdat nissen worden ingenomen door geheugencellen, kan deletie van deze laatste cellen ruimte creëren. De uitputting van rijpe lymfocyten kan een terugkoppelingseffect hebben op primaire lymfoïde organen, aangezien is gemeld dat afschaffing van rijpe B-cellen bij ouder wordende muizen de primaire beenmerg-B-lymfopoëse stimuleert (109). Het kan ook mogelijk zijn om specifieke routes in oude lymfocyten aan te pakken. In preklinische onderzoeken is bijvoorbeeld aangetoond dat remming van mTOR, een tussenproduct van de PI3K-route, met rapamycine CD8+ T-celresponsen stimuleert (110). Het richten op de expressie van DUSP4 (87) of DUSP6 (88) in respectievelijk oud geheugen of naïeve CD4+ T-cellen kan ook therapeutisch potentieel hebben. Ter ondersteuning hiervan verbeterde de verlaging van de DUSP6-niveaus door de miR-181a-expressie te verhogen of de activiteit met de allosterische remmer BCI te onderdrukken, de responsiviteit van oude naïeve CD4+-T-cellen (88).

Het corrigeren van leeftijdsgerelateerde tekortkomingen in lymfocytvoorlopers of rijpe T- en B-cellen kan resulteren in een significant herstel van de immuunfunctie bij ouderen. Deze cellen zouden echter nog steeds in een verouderde micro-omgeving verblijven die uiteindelijk hun potentieel om te rijpen of te functioneren zou kunnen dempen. In overeenstemming met deze visie, vonden Haynes en collega's (111) dat CD4+ T-cellen gegenereerd uit oude HSC's functioneel waren in jonge maar niet in oude gastheren, wat impliceert dat de verouderde thymus of perifere micro-omgevingen een kritische invloed hebben op de mate waarin verjonging van het immuunsysteem kan optreden. Met het oog op dit punt kunnen optimale interventies nodig zijn om de effecten van veroudering op meerdere cellulaire doelen aan te pakken.

Benaderingen om veroudering te remmen of om te keren moeten algemeen beschikbaar zijn en toepasbaar zijn op een groot cohort. Naast farmacologische interventies kan calorierestrictie (CR) ook aan deze criteria voldoen. Van CR is gemeld dat het meerdere gunstige effecten heeft op het immuunsysteem van zowel knaagdieren als niet-menselijke primaten, waaronder een vertraging in de accumulatie van verouderde T-cellen (112) en een stimulatie van thymopoëse (113). Dit laatste effect is in eerste instantie raadselachtig, omdat CR naar verluidt de secretie van IGF-1 verlaagt (114) en lage niveaus van IGF-1 zijn, zoals hierboven besproken, in verband gebracht met involutie van de thymus. CR kan echter ook de GH-spiegels verhogen (114), wat thymopoëtisch zou kunnen zijn, of kan werken via IGF-1-onafhankelijke routes. Er is bijvoorbeeld gemeld dat CR de leeftijdsgerelateerde verhoging van de thymus proadipogene hoofdregulator, PPARγ, blokkeert (113). Naast verdere studies om ons begrip te vergroten van hoe CR het immuunsysteem beïnvloedt, moeten we ook meer leren over wanneer het zou moeten beginnen met het oog op een rapport dat gunstige effecten werden waargenomen toen het begon bij volwassenen, maar niet duidelijk waren toen het werd gestart in prepuberale of verouderde niet-menselijke primaten (112). Een laatste punt is dat, hoewel CR bijzonder aantrekkelijk is omdat het een niet-invasieve benadering is, het een uitdaging kan zijn om een ​​groot aantal individuen dit regime te laten adopteren.

De hierboven besproken onderzoeken leveren proof-of-concept-gegevens dat farmacologische stimulatie van de immuniteit bij ouderen mogelijk is, en suggereren dat dergelijke interventies kunnen worden toegediend aan een groot cohort van individuen. Naarmate het veld echter vooruitgaat, zijn er verschillende punten waarmee rekening moet worden gehouden. Ten eerste, hoe lang moeten middelen worden toegediend en hoeveel verjonging is nodig om positieve effecten op de immuunfunctie waar te nemen? Deze problemen zijn relevant voor het gebruik van GH, IGF-1 en FGF7 om de thymus te stimuleren, omdat hun effecten van voorbijgaande aard zijn en de thymus terugkeert naar zijn vroegere grootte na stopzetting van de behandeling. Een ander voorbehoud is dat factoren zoals GH, IGF-1 en FGF7 wijdverbreide systemische effecten hebben vanwege de expressie van hun receptoren op cellen in meerdere weefsels. Een punt van zorg bij het gebruik van sommige middelen is dat neoplastische cellen ook receptoren tot expressie kunnen brengen, wat resulteert in tumorgroei ( 115 ). Dus, zoals elk medicijn, moet het gebruik van deze hormonen om de thymus te verjongen worden afgewogen tegen mogelijke nadelige effecten. Het zal ook cruciaal zijn om ervoor te zorgen dat het verjongde immuunsysteem normaal functioneert. In het bijzonder zal het belangrijk zijn vast te stellen dat de effectorpopulaties die zich ontwikkelen op de juiste wijze zijn getolereerd en niet autoreactief zijn.Het feit dat veel auto-immuunziekten in de late volwassenheid voorkomen, maakt dit een bijzonder belangrijk punt (116).

Zoals hierboven aangegeven, is er nu enorm veel bekend over de cellulaire veranderingen die optreden in het verouderende immuunsysteem en de moleculaire gebeurtenissen die daaraan ten grondslag liggen. Het is dus niet onredelijk om te verwachten dat deze informatie zal blijven worden vertaald in therapieën om het verouderende immuunsysteem te verjongen.

Het is waarschijnlijk dat de effecten van veroudering op het immuunsysteem niet uniform zullen zijn tussen individuen. Het uiteindelijke doel zou dus zijn om belangrijke biomarkers te identificeren en eenvoudige laboratoriumtests op te zetten om het verouderingsprofiel van elke persoon te bepalen. Dergelijke informatie kan vervolgens worden gebruikt om een ​​gepersonaliseerde aanpak te ontwikkelen waarin gerichte interventies kunnen worden gericht op het specifieke verouderingstekort van het individu. Welke zorgstandaard uiteindelijk ook wordt gehanteerd om de immuniteit te stimuleren, de nadruk moet niet noodzakelijkerwijs worden gelegd op het verlengen van de levensduur. Het doel is eerder om de gezondheidsspanne te vergroten, gedefinieerd als jaren van gezond leven (117).

Het werk van het laboratorium van de auteurs werd ondersteund door NIH-subsidie ​​AG034875.

Belangenverstrengeling: De auteurs hebben verklaard dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Referentie informatie: J Clin Invest. 2013123(3):958-965. doi:10.1172/JCI64096.


Discussie

In deze studie hebben we drie belangrijke subsets van plasma-EV's geïdentificeerd die zijn afgeleid van HC's die zijn onderscheiden op basis van hun grootte, waaronder LEV, MEV en SEV. De drie EV-populaties delen enkele oppervlaktemarkeringen, maar kunnen worden onderscheiden op basis van de combinatie van grootte, oppervlaktemarkeringen en lading. In overeenstemming met bevindingen van een andere groep [49], identificeerden we traditionele EV-markers CD81, CD9, CD29 en CD63 op alle maten plasma-EV's van HC's. Dit staat in contrast met eerdere studies waarin CD9, CD63 en CD81 werden beschouwd als specifieke markers voor kleine EV's (20-100 nm) die exosomen worden genoemd [7, 8, 10, 49]. Van deze traditionele EV-markers werd CD81 sterk uitgedrukt door LEV, terwijl het percentage CD9+, CD29+ en CD63+ EV's laag was in plasma van HC's. Merk op dat we met dezelfde detectie-antilichamen hogere percentages CD81+, CD9+, CD29+ en CD63+ EV's hebben waargenomen in menselijke synoviale vloeistof in vergelijking met gematcht plasma in een ander cohort (hoger met 4,3-voudig, 3,7-voudig, 3,6 -fold en, 10-fold, respectievelijk N = 16 paar). Daarom lijkt de waargenomen lage expressie in plasma niet gerelateerd te zijn aan technische beperkingen, maar is deze eerder afhankelijk van en varieert per biovloeistoftype en individuele weefsel- en celfenotypes.

CD34+ EV's geassocieerd met HSC's en progenitorcellen waren overvloedig aanwezig in plasma van HC's en aanwezig in alle groottes van EV's. Bovendien brachten plasma-LEV's HLA-ABC, CD81 en CD14 in hoge mate tot expressie en droegen ze pro-inflammatoire cytokines IL-1β, IL-6 en IL-17A. Daarentegen droegen SEV's voornamelijk IFN-γ en ontstekingsremmende cytokine IL-10. Het duidelijke expressiepatroon van oppervlaktemarkers en cytokinelading, in het bijzonder het vergelijken van LEV versus MEV en SEV, suggereerde dat plasma-EV-subsets verschillende bioberichten kunnen dragen en afkomstig zijn van verschillende biogenese-routes.

We merkten verschillende specifieke EV's van immuuncellen op die afnamen met het ouder worden, waaronder meerdere MEV- en SEV-subsets die oppervlaktemarkers van B-cellen, T-cellen, NK-cellen en APC's dragen. Veel immuuncellen nemen af ​​met de leeftijd, waaronder B-cellen, T-cellen, neutrofielen, NK-cellen en APC's [2, 4]. De leeftijdgerelateerde afname van plasma-EV's van deze immuuncellen tijdens normale menselijke veroudering kan een gevoelige indicator zijn voor de leeftijdsgerelateerde defecten in hun oudercellen tijdens immunosenescentie en ontsteking [2, 4]. De selectieve afname van plasma-EV's van immuuncellen kan ook het gevolg zijn van een verhoogde vraag naar de oudercellen bij veroudering of opname van EV's op weefselniveau, waardoor de meetbare circulerende EV-populatie wordt verminderd [11].

Aangezien alle hematopoëtische cellen zijn afgeleid van HSC's, kan immunosenescentie, de leeftijdsafhankelijke afname van immuuncellen, worden toegeschreven aan de disfunctionele activiteit van HSC's bij ouderen. Hoewel de hematopoëse echter afneemt met de leeftijd [2, 4], namen CD34+ plasma-EV's, mogelijke indicatoren van HSC's, bij gezonde controles niet af met de leeftijd. Bovendien droeg een groot aantal CD34+ plasma-EV's functionele mitochondriën die ademen, die ook niet werden aangetast door veroudering. Daarentegen zagen we leeftijdsgerelateerde dalingen in mitochondriën inademen in de lading van EV's geassocieerd met bepaalde soorten stamcellen (zoals CD29 + vet-afgeleide stamcellen, CD29 + HLA-G + mesenchymale stamcellen en CD31 + HSC's) en immune cellen. De afname met de leeftijd in de ademende mitochondriale lading van meerdere EV-subpopulaties deed zich voor in EV's waarvan het totale aantal afnam met de leeftijd, evenals in EV's die niet afnamen met de leeftijd.

EV's zijn ingedeeld in drie hoofdgroepen: uitgestoten blaasjes die rechtstreeks afkomstig zijn van het plasmamembraan, apoptotische lichaamsblaasjes die afkomstig zijn van desintegrerende cellen tijdens gecontroleerde celdood, en exosoomblaasjes die afkomstig zijn van multivesiculaire organellen/multivesiculaire lichamen in cellen [54] ]. Aangezien de meeste EV's die in onze studie zijn geïsoleerd functionele mitochondriën bevatten, suggereren onze gegevens dat de overgrote meerderheid van de circulerende EV's in plasma exosoomblaasjes en/of apoptotische lichaamsvesikels zijn, aangezien bekend is dat subsets van apoptotische lichamen mitochondriën kunnen bevatten [55] .

Mitochondriën dragen bij aan cellulaire veroudering door de modulatie van het metabolische profiel van de cel [13]. Wanneer een uitputting van het mitochondriale genoom of accumulatie van verkeerd gevouwen eiwitten in de mitochondriën een stressreactiepad induceert, lijkt mitofagie, de autofagie van mitochondriën, de schadelijke gevolgen van de accumulatie van mitochondria-DNA-mutaties te verminderen en de levensduur te bevorderen [13]. Onze observatie van verminderde productie van EV's met respiratoire mitochondriën met de leeftijd kan wijzen op leeftijdsgebonden defecten van mitofagie met de leeftijd. Dit zou leiden tot accumulatie van mitochondria-DNA-mutaties en verkeerd gevouwen eiwitten in cellen, wat op zijn beurt cellulaire veroudering kan veroorzaken. Door mitochondriale disfunctie gemedieerde hyperproductie van reactieve zuurstofsoorten [56], samen met immunosenescentie en ontsteking, kan leiden tot apoptose van immuuncellen [57], waardoor plasma-EV's van deze immuuncellen kunnen afnemen. Deze waarneming ondersteunt verder de hypothese dat de oudercellen van deze EV's leeftijdsafhankelijke door mitochondriale disfunctie geïnduceerde celdood kunnen ervaren tijdens immunosenescentie [2, 14]. Mitochondriale ademhaling genereert adenosinetrifosfaat (ATP), dat essentieel is voor de regulatie van celdood door apoptose [58]. Mitochondriën zijn gezwollen en verstoord in cellen met necrose [59]. Hoewel mitochondriën er bijna normaal uitzien in apoptotische lichamen en cellen met apoptose, geven mitochondriën cytochroom c af aan het cytosol waar het deelneemt aan de vorming van het caspase-activerende complex - apoptosoom [59]. Verstoring van de elektrochemische gradiënt over het mitochondriale transmembraan kan caspase-activering en uitvoering van apoptose bevorderen [60]. Onze waarneming van een duidelijke verminderde productie van EV's in specifieke immuuncellen met de leeftijd kan dus een oorzaak en/of gevolg van veroudering zijn.

We hebben een methodologie ontwikkeld om plasma-EV's van een breed scala aan groottes te karakteriseren met behulp van flowcytometrie met hoge resolutie. Flowcytometrie met hoge resolutie is een van de aanbevolen methoden voor het meten van EV's van grote tot kleine afmetingen [11]. Omdat er nog geen duidelijke, nauwgezette definitie van EV's is vastgesteld [61], is het momenteel moeilijk om EV-subtypes te definiëren, zoals een type gerelateerd aan veroudering met een bepaalde biogenese-route [10]. Termen als "exosomen", "microvesicles" en "apoptotische lichamen" worden in de literatuur vaak gebruikt om EV-subtypes te beschrijven, hoewel er momenteel geen uniforme definities zijn van deze EV-subtypes op basis van grootte, dichtheid, vorm, lading of functie [7] , 8]. Met een beter begrip van EV's, is men het er nu algemeen over eens dat er geen specifieke markers van EV-subtypes zijn [10]. Daarom heeft de International Society for Extracellular Vesicles het gebruik aanbevolen van operationele termen voor EV-subtypen die verwijzen naar: fysieke kenmerken van EV's, zoals grootte of dichtheid, met gedefinieerde bereiken of biochemische samenstelling, zoals CD81 + EV's of beschrijvingen van omstandigheden of cel van oorsprong zoals podocyte EV's of hypoxische EV's [10]. Om deze reden hebben we plasma-EV's gekarakteriseerd door een combinatie van hun grootte, oppervlaktemarkeringen en lading. Kalibratieparels kunnen nuttige hulpmiddelen zijn voor voorwaartse, op scatter gebaseerde dimensionering van blaasjes van nanoformaat door middel van flowcytometrie. Resultaten van op voorwaartse verstrooiing gebaseerde dimensionering van biologische blaasjes van nanoformaat en kalibratiekorrels van vergelijkbare grootte kunnen echter conflicteren, afhankelijk van meerdere factoren, waaronder de samenstelling van de bestudeerde blaasjes en kralen, en de voorwaartse verstrooiingshoeken van de flowcytometer [16] . Daarom vertegenwoordigen onze gerapporteerde EV-afmetingen benaderingen, hoewel de relatieve afmetingen (kleine tot grote EV's) geldig zijn.


Discussie

De belangrijkste kenmerken van de immuunrespons en verschillende immuungerelateerde ziekten zijn verhoogde vasculaire permeabiliteit, cellulaire infiltratie door chemotaxis en andere vormen van celhoming. De mobilisatie van immuuncellen van het ene orgaan naar het andere, naast hun differentiatie en proliferatie onder specifieke signalen, vormt de kern van het vermogen van het immuunsysteem om een ​​nauwkeurige tegenreactie op verschillende pathologische aandoeningen te detecteren en op te zetten (Murphy, 2012) . Het ontdekken van de dynamiek van het immuunsysteem is een moeilijk probleem, dat een betrouwbare resolutie en gelijktijdige kwantificering van honderden soorten immuuncellen vereist. Huidige studies zijn echter meestal beperkt tot het onderzoek van slechts een paar celtypen tegelijk met een beperkte karakterisering van de synchronisatie tussen celtypen (Brandes et al, 2013 Panga et al, 2013 ). Hier hebben we een digitale celkwantificator ontworpen die een unieke systematische kwantificering van de immuundynamiek op een wereldwijde manier biedt. Met name maakt DCQ gelijktijdige voorspelling van meer dan 200 immuunceltypen mogelijk en kan het onderscheid maken tussen nauw verwante immuunsubtypen (bijv. NKT's van verschillende oorsprong in het lichaam) en verschillende activiteitsniveaus.

Een belangrijk voordeel van onze methode is het vermogen om gedetailleerde testbare hypothesen te genereren met betrekking tot de rol van specifieke immuuncellen onder bepaalde omstandigheden. We bieden experimentele resultaten die vier van onze computationeel gegenereerde hypothesen ondersteunen, waaronder twee cDC's en twee pDC's-subpopulaties. Transcriptoomanalyse suggereert dat verschillende DC-subsets verschillende immunologische rollen krijgen tijdens de influenza-infectie, zoals (i) verschillende immunologische niches, via expressie van specifieke chemokinen door de cDC versus pDC (bijv. CCL17, CCL22) (ii) verschillende temporele timing van activering waardoor een snelle maar langdurige antivirale respons kan optreden in plaats van een vroegtijdige executie en (3) differentiële expressie van celsubset-specifieke antivirale eiwitten, via de activering van verschillende routes. Onze andere hypothesen van de dynamiek van immuuncellen tijdens influenza-infectie zijn nog niet getest en verdienen verder onderzoek.

Onze methode opent de weg naar veel verschillende richtingen van toekomstig onderzoek. Een opwindende mogelijkheid is dat DCQ's voorspelling van celdynamiek, gebaseerd op vroege genexpressie in het bloed of weefsel van patiënten, kan worden gebruikt voor ziekteprognose en individuele classificatie. Om dit te laten gebeuren, is het belangrijk om de methode voor menselijke monsters aan te passen en een voorafgaand compendium van immuunceltypen en oppervlaktemarkers bij mensen te construeren. Ten tweede zal onze methode, met enkele aanpassingen, van toepassing zijn op andere celtypen en niches, zoals verschillende kankers en hersengebieden. Ten derde kan het karakteriseren van gecoördineerde veranderingen in celhoeveelheden van verschillende immuunceltypen een gemeenschappelijk onderliggend mechanisme weerspiegelen, waardoor belangrijke informatie van klinische relevantie wordt verschaft. Een paar van dergelijke "co-toenemende" celtypen kunnen bijvoorbeeld samen migreren vanwege hetzelfde chemotaxis-agens of zich op een georkestreerde manier prolifereren als reactie op een vergelijkbare combinatie van cytokinen. Hoewel onze methode aanzienlijk beter presteert dan bestaande methoden voor veel celtypen, kan deze mogelijk nog verder worden verbeterd met alternatieve sets markers die specifiek zijn afgestemd op een bepaald monster (in plaats van een gemeenschappelijke, vooraf gedefinieerde set markers voor alle monsters te gebruiken ). Met name kan DCQ geen verschillende immunologische mechanismen onderscheiden (bijv. Differentiatie, migratie). In plaats daarvan bieden de voorspelde relatieve hoeveelheden veelbelovende hypothesen voor verder mechanistisch onderzoek.

Over het algemeen biedt onze methode een duidelijk globaal beeld van de dynamiek van het immuunsysteem in een complex weefsel en suggereert het hypothesen over de rollen van deze cellen in organen in het lichaam. Het is onze overtuiging dat het toepassen van DCQ op de dynamiek van zowel normale als pathologische aandoeningen kan leiden tot belangrijke nieuwe inzichten in het begrijpen van de complexe rollen van verschillende immuunceltypen en het suggereren van nieuwe doelen voor klinische interventie.


Immuunmechanismen bij longfibrose

Longfibrose, in het bijzonder idiopathische longfibrose, is een chronische en progressieve ziekte met een hoge mortaliteit en beperkte therapeutische opties. Overmatige afzetting van extracellulaire matrixeiwitten resulteert in fibrotische hermodellering, alveolaire vernietiging en onomkeerbaar verlies van longfunctie. Zowel aangeboren als adaptieve immuunmechanismen dragen bij aan fibrogenese op verschillende cellulaire en niet-cellulaire niveaus. Hier vatten en bespreken we de rol van immuuncellen (T-cellen, neutrofielen, macrofagen en fibrocyten) en oplosbare mediatoren (cytokinen en chemokinen) die betrokken zijn bij longfibrose, wijzend op nieuwe immuungebaseerde therapeutische strategieën in het veld.

In deze review bespreken we de opkomende rol van immuuncellen (T-cellen, neutrofielen, macrofagen en fibrocyten) en oplosbare mediatoren (cytokinen en chemokinen) die betrokken zijn bij longfibrose, wijzend op nieuwe immuungebaseerde therapeutische strategieën in het veld.

Pulmonaire fibrose vertegenwoordigt een chronische en progressieve weefselherstelreactie, die leidt tot onomkeerbare littekens en hermodellering van de long. De fibrogene triggers die fibrotische pulmonale remodellering initiëren en in stand houden, blijven controversieel, maar omvatten waarschijnlijk infecties (1), sigarettenrook (2), radiotherapie (3), chemotherapie (4), milieu- en beroepsverontreinigende stoffen (5, 6), obesitas (7 ), diabetes mellitus (8), gastro-oesofageale reflux (8), pulmonale hypertensie (9), obstructieve slaapapneu (10), chronische graft-versus-host-ziekte (11) en bindweefselaandoeningen/auto-immuunziekten (12), zoals zoals reumatoïde artritis (13), sclerodermie (14) en het syndroom van Sjögren (15). Longfibrose kan zich echter ook manifesteren zonder enige bekende etiologie. Idiopathische longfibrose (IPF) is de prototypische leeftijdsgebonden en onomkeerbare fibrotische ziekte, met een mediane overleving van 2-6 jaar na diagnose, en is grotendeels ongevoelig voor huidige farmacologische behandelingen (16). Tot op heden is de hoogste genetische risicofactor voor het ontwikkelen van IPF een polymorfisme in het MUC5B-gen (17-19). Longtransplantatie is de enige effectieve behandelmethode voor patiënten met IPF (20).

Men denkt dat fibrogenese staat voor ontregelde en aanhoudende wondgenezing/bindweefselherstel als reactie op terugkerende alveolaire microverwondingen. Een kenmerk van dit fibrotische herstelproces is de overmatige afzetting van extracellulaire matrix (ECM) componenten, zoals hyaluronan, fibronectine en interstitiële collagenen, die de longweefselstructuur onomkeerbaar hermodelleren, wat leidt tot verdikking van de alveolaire en peribronchiale wanden, waardoor gas wordt aangetast. uitwisseling (21, 22). Tijdens wondgenezing zijn fibroblasten sleutelcellen die verantwoordelijk zijn voor de synthese en afzetting van ECM, omdat ze een initiële basis vormen voor weefselregeneratie (21, 22). Wanneer afwijkende wondgenezing en fibrose zich ontwikkelen, reageren fibroblasten door hyperproliferatie op plaatsen van verwonding, verwerven ze een "profibrotisch" fenotype dat resistent is tegen apoptose en differentiëren tot contractiele myofibroblasten die het fibrotische proces bestendigen (21, 22). Deze geactiveerde fibroblast/myofibroblast reageert zeer goed op groeifactoren/cytokinen, zoals bindweefselgroeifactor (CTGF), van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), transformerende groeifactor (TGF)-β1, IL-1β, IL-6, IL-13 en IL-33 (23), evenals afwijkend geactiveerde profibrotische routes, waaronder TGF-β (24), lid van de familie van de MMTV-integratieplaats zonder vleugels (Wnt/WNT) (25), Sonic Hedgehog (26, 27), of Notch (28), die de transformatie van fibrotisch weefsel in stand houden. Bovendien toonde recent werk aan dat het samenspel tussen perivasculaire fibroblasten, epitheelcellen, endotheelcellen en perivasculaire macrofagen de fijnafstemming tussen alveolair herstel en fibrose reguleert door middel van Wnt- en Notch-signaleringsinteractie (29). Kortom, endotheliale expressie van CXC-chemokinereceptor (CXCR) 7 voorkomt epitheliale schade door Jagged1-remming, terwijl rekrutering van macrofagen die vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) tot expressie brengen, Wnt/β-catenine-afhankelijke opregulatie van Jagged1 stimuleert, waardoor Notch-signalering in fibroblasten en verbetering van fibrose (29).

Onlangs werden subtypes van huidfibroblasten met intrinsiek fibrogeen potentieel geïdentificeerd die engrailed-1 (En1) tot expressie brengen. Deze fibroblasten veroorzaken verhoogde ECM-afzetting tijdens ontwikkeling en herstel en dragen bij aan weefselfibrose in meerdere muismodellen (30). CD26/dipeptidyl peptidase-4 werd geïdentificeerd als een oppervlaktemarker van En1-positieve fibroblasten. Uitputting van En1-positieve fibroblasten of op kleine moleculen gebaseerde remming van CD26 / dipeptidylpeptidase-4 leidt tot verminderde bindweefselafzetting en fibrose (30).

Proteasen spelen een sleutelrol bij ECM-remodellering (31). Met name matrixmetalloproteïnasen (MMP's) en hun remmer, weefselremmers van metalloproteïnase (TIMP)-1 zijn betrokken bij de pathogenese van IPF en sarcoïdose (32). MMP's en TIMP's, voornamelijk afgeleid van macrofagen, kunnen op een pro- of antifibrotische manier werken, afhankelijk van de protease / antiprotease-nettobalans en de micro-omgevingsweefselcontext (33-35). MMP-3 bleek de epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) in IPF te initiëren door activering van de β-catenine-signaleringsroute door splitsing van E-cadherine (36).Genexpressiestudies leverden verder bewijs van een opwaartse regulering en mogelijke rol van MMP-1, MMP-2, MMP-7 en MMP-9 in IPF (37, 38). Longepitheelcellen zijn kritisch betrokken bij fibrogenese via een sequentie die varieert van vroege epitheliale schade tot fibrogene EMT (39). EMT zorgt ervoor dat epitheelcellen hun canonieke kenmerken verliezen, met name cel-tot-cel hechting, en migrerende en mesenchymale eigenschappen verwerven, waardoor hun vermogen om om te zetten in fibroblasten toeneemt en uiteindelijk transdifferentiatie ondergaan in myofibroblasten die ECM synthetiseren (40). Tijdens EMT verliezen epitheelcellen ook hun duidelijke markerexpressieprofiel, waaronder E-cadherine, schildkliertranscriptiefactor-1, aquaporine-5, zonula occludens-1 en cytokeratines, en verwerven ze een mesenchymale morfologie geassocieerd met expressie van fibroblastische markers, met name fibronectine extra domein A, α-gladde spieractine (α-SMA), type I en III collageen, CTGF, vimentine en desmine (39-41).

Van de tot nu toe bestudeerde cytokinen is beschreven dat voornamelijk het profibrotische cytokine TGF-β1 een centrale rol speelt bij het bevorderen van EMT (22, 24). TGF-β1 stuurt EMT aan via SMAD2 / 3-afhankelijke stroomafwaartse mechanismen (42, 43) en bevordert de overgang van epitheelcellen naar fibroblasten via de transcriptiefactoren, zinkvingereiwit SNAI1 (SNAI) en TWIST (44, 45). Ontsteking heeft een modulerend effect op door TGF-β1 gemedieerde routes, aangezien de pro-inflammatoire cytokinen, IL-1β, TNF-α en IFN-γ, de door TGF-β1 geïnduceerde EMT bleken te versterken via opregulatie van de TGF-β-receptor type I (46). Verder verhoogde het schade/gevaar-geassocieerde moleculaire patroon/alarm in hoge-mobiliteitsgroepbox 1, afgegeven bij weefselbeschadiging door necrotische cellen, EMT via de TGF-β1/SMAD2/3-route (47). Het integrine-α3β1, tot expressie gebracht op epitheelcellen, fosforyleert β-catenine en activeert pβ-catenine om een ​​complex te vormen met SMAD2 om EMT te initiëren (48). Li en collega's (49) toonden verder aan dat prostaglandine E2 celmigratie na EMT kon moduleren door activering van E-prostanoïde (EP) 2 en EP4, evenals remming van EP1- en EP3-receptoren. Onlangs is aangetoond dat p63-positieve longepitheliale basale cellen die over fibroblastische foci liggen, kunnen fungeren als EMT-voorlopers (50). Andere EMT-inductoren zijn sigarettenrook (51), straling (52), oxidatieve stress (53), mechanische rek (54) en IL-17A (55). Daarentegen vonden andere onderzoeken, waaronder benaderingen voor het traceren van afkomst, geen bewijs van EMT in fibrotische instellingen (56-60). Aanvullende translationele onderzoeksstudies zijn nodig om deze discrepanties op te lossen.

Naast TGF-β speelt ontregelde activering van het WNT-1-induceerbare signaaleiwit een sleutelrol bij IPF (25), waarbij longfibrogenese wordt bevorderd door de afgifte van profibrotische cytokinen en proteasen te verhogen, waaronder uitgescheiden fosfoproteïne 1, MMP-7, MMP- 9, en plasminogeenactivatorremmer 1, uit het alveolaire epitheel, evenals door EMT te induceren en de collageenproductie door fibroblasten te verhogen (25). Wnt1/β-catenine-signalering bevorderde verder de omzetting van menselijke embryonale pulmonaire fibroblasten in myofibroblasten en verbeterde ECM-afzetting bij weefselbeschadiging (61). Low-density lipoproteïnereceptor-gerelateerd eiwit 5, een WNT-coreceptor, werd geïdentificeerd als een aanjager van longfibrose bij muizen en een marker van de ernst van de longfibroseziekte bij mensen met IPF (62). Therapeutisch keerden remmers van de WNT/β-catenine-route de gevestigde fibrose om en verbeterden de overleving bij door bleomycine geïnduceerde longfibrose significant (63, 64). Onlangs toonden Wang en collega's (65) aan dat remming van WNT/β-catenine-signalering de differentiatie van van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen tot alveolaire type II-epitheelcellen bevorderde en de transdifferentiatie van fibroblast naar myofibroblast remde, evenals ECM-accumulatie in bleomycine-geïnduceerde longfibrose.

Zowel aangeboren als adaptieve immuuncelreacties zijn in verband gebracht met (myo)fibroblastbiologie en fibrogenese. Figuur 1 en Tabel 1 vatten de belangrijkste effecten samen die zijn gerapporteerd voor de belangrijkste adaptieve (T-celsubsets) en aangeboren (macrofagen, neutrofielen) immuunceltypen. Het scheeftrekken van de immuuncel bij longfibrose beïnvloedt waarschijnlijk de antimicrobiële afweerfuncties van de gastheer en de vatbaarheid voor infecties, een onderwerp dat buiten het bestek van deze review valt en wordt besproken in beoordelingen gewijd aan fibrose en infecties (1). In de hoofdstukken die hierna worden gepresenteerd, bespreken we de belangrijkste studies die tot nu toe zijn gepubliceerd over verschillende subsets van immuuncellen en hun mogelijke betrokkenheid bij longfibrose.

Figuur 1. Effect van immuuncellen op myofibroblasten en fibrogenese. Luchtwegepitheelcelbeschadiging/epitheel-mesenchymale overgang en fibroblast transdifferentiatie en/of chemokine (CC chemokine ligand [CCL] 2, CXC chemokine ligand [CXCL] 12) – gemedieerde fibrocyten rekrutering dragen bij aan het genereren van myofibroblasten, die de belangrijkste producenten van extracellulaire matrix (ECM) componenten. Beide adaptieve (T-cellen, linker vak) en aangeboren (macrofagen en neutrofielen, rechter doos) immuuncellen moduleren fibrogenese via verschillende mechanismen. Adaptieve immuniteit: Th2- en Th17-cellen bevorderen longfibrose, terwijl Th1-, Th22- en γδ-T-cellen fibrogenese remmen. Regulerende T-cellen (Tregs) en Th9-cellen zijn in verband gebracht met zowel anti- als profibrotische effecten. Aangeboren immuniteit: macrofagen kunnen longfibrose versterken door de productie van transformerende groeifactor (TGF)-β en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), of longfibrose verbeteren door ECM-degradatie te verbeteren door middel van matrix metalloproteïnase (MMP) activiteiten. Macrofagen vormen verder een bron van weefselremmers van metalloproteïnasen (TIMP's) die MMP-gemedieerde ECM-degradatie kunnen tegenwerken. Neutrofielen produceren verschillende proteasen, met name serineproteasen (neutrofiel elastase [NE]) en MMP's, die matrixcomponenten afbreken maar ook TGF-β via NE kunnen activeren en TIMP's kunnen produceren, waardoor ECM-accumulatie wordt bevorderd. Stippellijnen effecten/interacties vertegenwoordigen die complex/veelzijdig zijn of niet stevig verankerd zijn.

Tafel 1. Immuuncellen en bemiddelaars die betrokken zijn bij longfibrose

Definitie van afkortingen: AP-1, activator eiwit 1 CCL, CC chemokine ligand CTGF, bindweefselgroeifactor CXCL, CXC chemokine ligand ECM, extracellulaire matrix EMT, epitheliaal-mesenchymale transitie ERK, extracellulair signaal-gereguleerd kinase IL-1R1, IL-1 receptor 1 JNK, c-Jun N-terminale kinasen MAPK, mitogeen-geactiveerd proteïnekinase MMP, matrix metalloproteïnase MyD88, myeloïde differentiatie primaire responsgen 88 PDGF, van bloedplaatjes afgeleide groeifactor PF, longfibrose PI3K, fosfatidylinositol 3-kinase PKC, eiwit C Rac1, Ras-gerelateerd C3-botulinumtoxinesubstraat 1 SMAD, SMA/MAD-homologie Sp1, specificiteitseiwit 1 TGF, transformerende groeifactor TIMP, weefselremmers van metalloproteïnase Tregs, regulerende T-cellen.

Er is steeds meer bewijs dat een scheve Th1/Th2-balans een modulerende rol speelt tijdens de ontstekingsfase van longfibrose (22, 66). Systemische uitputting van T-cellen met behulp van anti-CD3-monoklonale antilichamen dempte ECM-accumulatie en fibrose in een muizenmodel van door bleomycine geïnduceerde longfibrose (67). De Th1-cytokinen, IFN-γ en IL-12, verzwakten fibrose (68), terwijl de prototypische Th2-cytokinen, IL-4, IL-5 en IL-13, zijn gekoppeld aan fibrogenese (69, 70), wat leidt tot de opvatting dat Th1-reacties beschermend zijn, terwijl Th2-reacties schadelijk zijn (22, 70). Op transcriptioneel niveau gemoduleerde overexpressie van de Th2-transcriptiefactor, GATA-bindend eiwit 3, of remming van de Th1-transcriptiefactor, T-bet, longfibrose (71, 72). Terwijl in één onderzoek Th17-cellen (T-cellen gekenmerkt door productie van IL-17) geen directe invloed op fibrose vertoonden (73), ondersteunden andere onderzoeken een rol voor IL-17- en Th17-cellen door aan te tonen dat blokkering/neutralisatie van IL- 17A vertraagde de progressie en bevorderde de resolutie van longfibrose in verschillende muizenfibrosemodellen (55, 74, 75). De mogelijke rol van regulerende T-cellen (Tregs CD4 + CD25 high FOXP3 + ) bij IPF blijft controversieel. Terwijl aan de ene kant verhoogde Tregs werden gerapporteerd (76), toonden andere een afname van Tregs in perifeer bloed en bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof bij patiënten met IPF (77). Andere bevindingen ondersteunen een profibrotische rol van Tregs in vroege stadia van longfibrose door de afgifte van TGF-β1 en collageenafzetting te verhogen (78), terwijl in late stadia Tregs longfibrose bleek te dempen (78). Xiong en collega's (79) toonden aan dat Treg-uitputting bescherming bood tegen door straling geïnduceerde longfibrose door de Th17-responsen te verhogen en de Th1/Th2-balans naar Th1 te verschuiven. Andere onderzoeken toonden echter aan dat Tregs de rekrutering van fibrocyten en longfibrose verzwakte via onderdrukking van fibroblastgroeifactor (FGF)-9 en CXC-chemokineligand (CXCL) 12 (80, 81). Als we deze onderzoeken in combinatie bekijken, blijft de potentiële rol van Tregs bij longfibrose onvolledig gedefinieerd. Tregs kan waarschijnlijk zowel anti- als profibrotische rollen uitoefenen, afhankelijk van het stadium van longfibrose en onderlinge interacties met andere T-celsubtypes, een kwestie die verder onderzoek vereist. Th9- en Th22-cellen, T-celsubsets die IL-9 of IL-22 produceren, waren ook betrokken bij fibrose, met dubbele pro- en antifibrotische effecten beschreven voor Th9 (82-84) en beschermende effecten voor Th22 (85). In het bijzonder IL-9-overexpressie in vivo leverde profibrotische effecten op geassocieerd met hoge collageen- en fibronectine-afzetting in bronchiale gebieden (82), terwijl andere onderzoeken bewijs leverden voor een antifibrotische rol van IL-9 door aan te tonen dat IL-9 door silica geïnduceerde longfibrose en type-2-immuniteit verzachtte (83) , en was beschermend in een door bleomycine geïnduceerd longfibrosemodel via een prostaglandine E2–afhankelijk mechanisme (84). γδ T-cellen bleken fibrotische reacties te verzwakken via de productie van CXCL10 (86). Gezamenlijk lijkt de rol van T-cellen bij longfibrose complex en grotendeels afhankelijk van het subtype van T-cellen.

Afgezien van hun rol als antimicrobiële fagocyten, zijn alveolaire macrofagen betrokken bij de pathogenese van fibrotische longziekten. Alveolaire macrofagen vormen een krachtige bron van profibrotische cytokinen (zoals TGF-β1 en PDGF), chemokinen en proteasen (MMP's) (87). Voorwaardelijke uitputting van TGF-β1 uit macrofagen had echter geen invloed op fibrose (88). Afhankelijk van hun polarisatie, het lokale micromilieu en het stadium van fibrotische ziekte, is gemeld dat alveolaire macrofagen zowel pro- als antifibrotische effecten uitoefenen (22, 87, 89). In het bijzonder zijn de twee contrasterende macrofaagfenotypes, M1 (klassiek geactiveerd) en M2 (alternatief geactiveerd), sleutels om de gunstige versus schadelijke rol van alveolaire macrofagen bij fibrotische ziekten te begrijpen (90, 91). De prototypische Th2-cytokinen, IL-4 en IL-13, induceren M2-macrofaagpolarisatie, gekenmerkt door productie van IL-10, arginase-1, gevonden in ontstekingszone 1, en verschillende chemokinen, met name CC chemokine ligand (CCL) 17 en CCL18 (92). Hoewel M2-macrofagen zich ophopen in fibrotische longen en algemeen zijn geassocieerd met profibrotische activiteiten (91), blijft hun precieze functionele rol in fibrotische omgevingen onzeker en slecht begrepen. M2-macrofagen waren ook gekoppeld aan antifibrotische activiteiten, omdat ze ECM bleken af ​​te breken door MMP-10 te gebruiken (93). Bovendien zijn M1-macrofagen geassocieerd met profibrotische rollen, zoals ondersteund door in vivo uitputtingsonderzoeken (94). Collageen bleek M2-macrofagen te induceren via de profibrotische chemokine, CCL18, waardoor een positieve lus tussen fibroblasten en alveolaire macrofagen werd gevoed (95, 96). Macrofaagreceptor met collageenstructuur is verder betrokken geweest bij polarisatie van macrofagen naar een profibrotisch M2-fenotype en het bevorderen van fibrotische reacties op longbeschadiging (97). Src-homologie fosfotyrosylfosfatase 2, een cytoplasmatisch tyrosinefosfatase geassocieerd met IL-4Rα, remde Janus-kinase 1 / signaaltransducer en activator van transcriptiesignalering door zijn fosfatase-activiteit, remde macrofaag scheeftrekken naar M2-fenotype en voorkwam longfibrose (98). Een centrale route voor macrofaaginfiltratie, MMP-productie en bevordering van longfibrose is CCL2 en zijn receptor, CCR2 (zien onderafdeling CCL2 in afdeling IV. C hemokines in pulmonale fibrose voor details) (99). Van TNF-α is gemeld dat het antifibrotische effecten uitoefent en de resolutie van gevestigde longfibrose versnelt door het verminderen van M2-macrofagen, mogelijk als gevolg van CCR2-downregulatie en/of verhoogde gevoeligheid van M2-macrofagen voor door TNF-α-geïnduceerde apoptose (100). Aan de andere kant vertoonde arginase-1, tot expressie gebracht door M2-macrofagen, krachtige antifibrotische activiteit tijdens Th2-aangedreven ontstekingsreacties door uitputting van L-arginine, een aminozuur dat essentieel is voor de proliferatie van CD4+-T-cellen en myofibroblasten (101). In andere modellen had voorwaardelijke uitputting van het M2-geassocieerde arginase-1 uit macrofagen geen invloed op Th2-gemedieerde longontsteking (102). Uitputting van macrofagen/monocyten in een diermodel van longfibrose verminderde ECM-afzetting en, omgekeerd, adoptieve overdracht verergerde fibrose (103). De profibrotische rollen van macrofagen zijn voornamelijk geassocieerd met rekrutering en activering van fibroblasten door TGF-β1 en PDGF-secretie (87, 89, 104). Afhankelijk van de cellulaire en omgevingscontext zijn macrofagen ook in staat om TIMP's te produceren, waardoor de afbraak van ECM wordt geremd (89, 104). Aangenomen wordt dat antifibrotische rollen van macrofagen worden gemedieerd door een verscheidenheid aan mechanismen, waaronder het opruimen van pro-inflammatoire celresten, het verteren van ECM-componenten door activering van collageen-afbrekende MMP's en door mediatoren uit te scheiden die myofibroblast-apoptose induceren (89, 105-107). Kortom, meerdere in vitro en in vivo studies hebben macrofagen en hun producten betrokken bij longfibrose, maar de duidelijke gunstige versus schadelijke rollen van specifieke M1/M2-fenotypes blijven onduidelijk en controversieel.

Net als macrofagen zijn neutrofielen niet alleen antibacteriële effectoren, maar geven ze ook vorm aan hun weefselomgeving door proteasen, oxidanten, cytokinen en chemokinen vrij te geven (108). Neutrofielen bleken verhoogd te zijn in BAL-vloeistof van patiënten met IPF en waren geassocieerd met vroege mortaliteit (109). Consistent waren de niveaus van IL-8/CXCL8, een belangrijke chemotactische factor voor neutrofielen, verhoogd in humane IPF (110), en het aantal neutrofielen in IPF BAL-vloeistof correleerde met niveaus van granulocytkolonie-stimulerende factor (G-CSF), een sleutelfactor groeifactor voor neutrofielen (111). Cytokeratine 19, een potentiële marker voor alveolair epitheelletsel, correleerde met het aantal neutrofielen in BAL-vloeistof van patiënten met IPF (112). Neutrofielen in de luchtwegen bij IPF lijken geactiveerd te zijn, zoals blijkt uit hun belangrijkste proteolytische product, neutrofiel elastase (NE), dat werd verhoogd in luchtwegvloeistoffen van patiënten met IPF (113). NE breekt een verscheidenheid aan ECM-eiwitten af, waaronder collagenen (type I-IV), laminine, entactine, fibronectine en elastine, en orkestreert daardoor de uitkomst van longfibrose (114, 115). NE-deficiënte muizen vertoonden verzwakking van longfibrose door verminderde TGF-β-activering (115). Evenzo verbeterde Sivelestat, een NE-remmer, longfibrose door opheffing van TGF-β-activering en rekrutering van ontstekingscellen naar de long (116). Onlangs hebben Gregory en collega's (117) deze bevindingen uitgebreid door een significante vermindering van fibroblast- en myofibroblastaccumulatie in NE −/−-muizen aan te tonen, die beschermd waren tegen door asbest geïnduceerde longfibrose. Verdere studies toonden aan dat NE de proliferatie van fibroblasten bevorderde en de differentiatie van myofibroblasten verbeterde (117). Naast serineproteasen zijn neutrofielen ook een belangrijke bron van MMP's, zoals MMP-2, MMP-8 (collagenase 2) en MMP-9 (gelatinase B), die betrokken zijn bij longfibrose (32, 118). De balans tussen MMP's en hun antiproteasen (TIMP's) speelt een cruciale rol bij accumulatie of afbraak van ECM bij longfibrose (32, 119). De uitputting van neutrofielen is in verband gebracht met een MMP-9/TIMP-1-onbalans, maar veranderde de gevoeligheid voor door bleomycine geïnduceerde longfibrose niet (120).

Traditioneel worden fibroblasten beschouwd als uit mesenchymale weefsel afkomstige/ingezeten cellen, maar recente studies hebben het concept vastgesteld dat circulerende van myeloïde afgeleide cellen, fibrocyten genaamd, naar weefsels kunnen migreren en kunnen differentiëren tot fibroblasten en myofibroblasten (121). Bovendien scheiden fibrocyten paracriene factoren af, die residente fibroblasten activeren om longfibrose te bevorderen (122). Fibrocyten brengen myeloïde markers tot expressie, zoals CD45 en CD34, de chemokinereceptor, CXCR4 en collageen-1 (123). Fibrocyten produceren ECM-componenten (collageen I, collageen III, fibronectine en vimentine), verknopende enzymen (lysyloxidasefamilie), cytokinen (TNF-α, IL-6, IL-8 en IL-10), chemokinen (macrofaag inflammatoir eiwit 1-1α/β, monocyt chemoattractant eiwit-1 en GROα), groeifactoren (VEGF, PDGF, granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor [GM-CSF] en andere), en verschillende MMP's, zoals MMP- 9 (124-126). Moeller en collega's (127) toonden aan dat circulerende fibrocyten verhoogd waren bij patiënten met IPF en een prognostische marker en een onafhankelijke voorspeller van vroege mortaliteit vertegenwoordigden. CCL12 en CXCL12 bleken betrokken te zijn bij het aantrekken van fibrocyten in de bloedsomloop naar de plaats van longbeschadiging (128, 129). Het neuronale geleidingseiwit, spleetgeleidingsligand 2, uitgescheiden door fibroblasten, bleek de differentiatie van fibrocyten te remmen en door bleomycine geïnduceerde longfibrose bij muizen te verminderen (130). Onlangs zijn nieuwe immunoregulerende eigenschappen van fibrocyten vastgesteld door aan te tonen dat fibrocyten met myeloïde-afgeleide suppressorcel (MDSC)-kenmerken accumuleren bij patiënten met uitgezaaide kanker (131). MDSC's worden in principe monocytische of granulocytische/neutrofiele aangeboren immuuncellen genoemd, gekenmerkt door hun potentieel om T-cellen te onderdrukken (132). Het nieuwe voorgestelde subtype van MDSC's, fibrocytische MDSC, bleek te differentiëren van voorlopers van navelstrengbloed na kweek met GM-CSF/G-CSF (133).Verdere studies hebben aangetoond dat verschillende factoren, waaronder CD4+ T-cellen, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF/G-CSF, Kruppel-achtige factor 4 en fibroblast-specifiek eiwit 1, getransdifferentieerde Gr1 + MDSC-achtige cellen in ECM (collageen type I) producerende fibrocyten (133-135). Fibrocytische MDSC's bleken ook Tregs uit te breiden (133).

TGF-β is waarschijnlijk het best bestudeerde cytokine bij fibrose en wordt beschouwd als een prototypische "profibrotische" mediator (24). Van de drie isovormen is beschreven dat TGF-β1 voornamelijk betrokken is bij longfibrose (136). Na dissociatie van latentie-geassocieerd eiwit, verhoogt TGF-β1 de transcriptie van stroomafwaartse doelgenen, waaronder procollageen I en III, via transmembraanreceptor serine/threoninekinasen en de cytoplasmatische SMAD-2/3-signaleringsroutes (137). In het bijzonder is aangetoond dat SMAD-3-deficiëntie door bleomycine geïnduceerde longfibrose verbetert (138). Bovendien is aangetoond dat extracellulair signaal-gereguleerd kinase (ERK), mitogeen-geactiveerd eiwitkinase, de fosfatidyl inositol 3-kinase/Akt-route en Rho-achtige GTPase-routes betrokken zijn bij door TGF-β1 geïnduceerde fibrose (139– 141). Mechanistisch bevordert TGF-β1 de accumulatie van ECM, met name collageen en fibronectine, en stimuleert het fenotypische veranderingen van fibroblasten (43, 142). TGF-β1 differentieert fibroblasten in myofibroblasten door expressie van α-SMA te induceren (143). Onlangs is echter aangetoond dat myofibroblasten die α-SMA tot expressie brengen mogelijk niet de enige bron zijn van pathologische collageenafzetting in fibrotische omgevingen (144). Onlangs toonde een andere studie aan dat TGF-β1 vasculaire celadhesiemolecuul 1 verhoogt en fibroblastproliferatie bevordert bij patiënten met IPF (145). Bovendien verbetert TGF-β1 de proliferatie van fibroblasten en bevordert het longfibrose via gen 1-geassocieerde gen 1-geassocieerde echt interessante nieuwe gendomein 1-route (146). Galectin-3 is ook betrokken bij door TGF-β1 geïnduceerde longfibrose door EMT, myofibroblastactivering en collageenproductie te verhogen (147). Glycogeensynthasekinase-3 reguleert TGF-β1-geïnduceerde fibroblast-naar-myofibroblast-differentiatie via een cAMP-responselement-bindend eiwit-afhankelijk mechanisme (148). Verder is waargenomen dat chitinase-1 betrokken is bij TGF-β1-geïnduceerde longfibrose door de TGF-β1-receptorexpressie te verhogen (149). Onlangs toonden Oruqaj en collega's (150) aan dat peroxisomen betrokken zijn bij TGF-β-geïnduceerde myofibroblastdifferentiatie en collageenproductie bij IPF.

Afgezien van TGF-β, vertegenwoordigt PDGF een andere krachtige fibrogene cytokine/groeifactor die longfibrose bevordert door fibroblastactivering (151). PDGF-expressie bleek verhoogd te zijn in epitheelcellen en macrofagen in de longen van patiënten met IPF (152). In vivo, veroorzaakte pulmonale PDGF-overexpressie ernstige longfibrose (153). PDGF werkt via inositoltrifosfaat-gepoorte kanalen en verhoogt de Ca2+-afgifte om ECM-genexpressie in menselijke longfibroblasten te moduleren (154). PDGF is een krachtig mitogeen en chemoattractant voor longfibroblasten en werkt via de PDGF-receptor (151). IL-13 bleek de PDGF-genexpressie in longfibroblast te verhogen via STAT1 en STAT6 (155). Tregs bevorderen pulmonale fibrotische reacties door fibroblasten te stimuleren door de afscheiding van PDGF in door silica geïnduceerde longfibrose (156). Imatinib, een PDGF-tyrosinekinaseremmer, vertoonde sterke antifibrotische effecten bij door bleomycine geïnduceerde longfibrose via remming van de proliferatie van mesenchymale cellen (157).

IL-1β, het primaire cytokineproduct van het inflammasoom, wordt voornamelijk geproduceerd door geactiveerde macrofagen, dendritische cellen, neutrofielen en epitheelcellen, en het is aangetoond dat het bijdraagt ​​aan de progressie van longfibrose (158). Uitdrukking van IL-1β mRNA bleek opwaarts gereguleerd te zijn in door bleomycine geïnduceerde longfibrose (159) en overexpressie van IL-1β in rattenlongen bevorderde longfibrose die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van myofibroblasten, fibroblastfoci en ECM-accumulatie (158). Door bleomycine geïnduceerde longfibrose was verzwakt in IL-1-receptor (IL-1R)- of myeloïde differentiatie primaire responsgen 88-deficiënte muizen, en exogeen recombinant IL-1β-eiwit leek op door bleomycine geïnduceerde longpathologie, wat een sleutelrol bevestigt voor IL- 1 in fibrogenese in vivo (160). In BAL-vloeistof en serum van patiënten met IPF was de verhouding van IL-1R-antagonist (IL-1Ra) en IL-1β verlaagd (161). Verschillende onderzoeken hadden verder betrekking op de NACHT-, LRR- en PYD-domeinen-bevattende proteïne 3-inflammasoom in door silica en asbest geïnduceerde longfibrose (162, 163). Extracellulair ATP, een activator van de NACHT-, LRR- en PYD-domeinen-bevattende proteïne 3-inflammasoom, was verhoogd in BAL-vloeistof van patiënten met IPF en in door bleomycine geïnduceerde longfibrose (164). Net als ATP is urinezuur, de NACHT-, LRR- en PYD-domeinen die proteïne 3 inflammasoomactivator bevatten, betrokken bij door bleomycine geïnduceerde longfibrose (165). Wilson en collega's (166) toonden verder aan dat IL-1β-geïnduceerde longfibrose IL-17-afhankelijk is. De WNT/β-catenine-signaleringsroute bleek IL-1β-expressie door alveolaire epitheelcellen bij longfibrose te induceren (167).

Het Th2-cytokine, IL-13, bleek verhoogd te zijn in het bloed en de BAL-vloeistof van patiënten met IPF en correleerde met de ernst van de ziekte (168). IL-13 bevorderde longfibrose in fluoresceïne-isothiocyanaat- en stralingsgeïnduceerde longfibrosemodellen (169, 170), terwijl IL-13-remming fibrotische veranderingen in longfibrosemodel verminderde in vivo (171). Door IL-13 geïnduceerde longfibrose werd gerapporteerd als TGF-β-afhankelijk of onafhankelijk (172, 173). Mechanistisch differentieert IL-13 menselijke longfibroblast tot myofibroblast via een c-Jun N-terminale kinasen-afhankelijke route (174). Stroomafwaartse IL-13-effecten werden gemedieerd via een complex receptorsysteem dat IL-4Rα, IL-13Rα1 en/of de IL-13Rα2 (175) omvat. Door IL-13 geïnduceerde fibrose was overdreven wanneer IL-13Rα2 laag was of afwezig was in doelcellen, zoals fibroblasten (176). Van de transcriptiefactor, Yin Yang 1, is aangetoond dat deze de expressie van collageen en α-SMA in fibroblasten direct reguleert (177). IL-13 bleek op zijn beurt fibroblasten te stimuleren en α-SMA te verhogen door middel van AKT-gemedieerde Yin Yang 1-activering (178).

Eerdere studies koppelden IL-17 aan profibrotische effecten, zoals EMT en collageenproductie, door interacties met TGF-β-signalering (55, 166). IL-17-remming verzwakte longfibrose via autofagische afbraak van collageen en verhoogde overleving bij door bleomycine geïnduceerde longfibrose (55). Neutralisatie van IL-17 verbeterde de progressie van door silica geïnduceerde longfibrose geassocieerd met vertraagde rekrutering van neutrofielen, verminderde Th17-cellen, verminderde IL-6/IL-1β-productie en verhoogde Tregs (75). Neutrofielen en monocyten/macrofagen, in plaats van Th17-lymfocyten, werden geïdentificeerd als de cellulaire bron van IL-17 en bevorderden longfibrose bij experimentele overgevoeligheidspneumonitis (179). Onlangs is aangetoond dat de B-celactiverende factor verhoogd was in BAL-vloeistof van patiënten met IPF, de afgifte van IL-17 uit Th17-cellen verbeterde en betrokken was bij door IL-17 geïnduceerde longfibrose (180). IL-27 verzwakte longfibrose door de secretie van IL-17 en de Janus-kinase/signaaltransducer en activator van transcriptie en TGF-β1/SMA/MAD-homologie-signaleringsroutes te onderdrukken (181). IL-17-productie door γδ-T-cellen als reactie op epitheelcelbeschadiging werd gemedieerd via IL-23 bij longfibrose (182).

CCL2 (monocyt chemoattractant protein-1), wordt geproduceerd door monocyten/macrofagen, fibroblasten en epitheelcellen en werkt via CCR2 (183). CCL2 bleek verhoogd te zijn in BAL-vloeistof en serum van patiënten met IPF (184), en pulmonale fibrose-onderzoeken bij muizen toonden aan dat ECM-afzetting is verzwakt in CCR2-knock-outmuizen (183) en dat dit effect verband houdt met een vermindering van infiltratie van macrofagen en van macrofagen afgeleide MMP-2- en MMP-9-productie (99). Bovendien verhoogde CCL2 de rekrutering van fibrocyten naar de alveolaire ruimte en bevorderde het de differentiatie tot fibroblasten, wat resulteerde in overmatige collageenafzetting (185). Proteïnase-geactiveerde receptor-1 verhoogde CCL2-afgifte (186). De CCL2 / CCR2-as bleek verder betrokken te zijn bij door IL-10 geïnduceerde rekrutering van macrofagen en fibrocyten, evenals M2-activering bij longfibrose (90). CCL2 stimuleerde de productie van IL-6 door menselijke longfibroblasten via de ERK1/2-signaleringsroute en verbeterde de overleving van fibroblasten door apoptose te remmen via IL-6/STAT3 bij longfibrose (187).

Thymus en activatie-gereguleerde chemokine (CCL17) wordt constitutief tot expressie gebracht in de thymus en is induceerbaar in mononucleaire cellen van perifeer bloed, macrofagen, bronchiale epitheelcellen, endotheelcellen en dendritische cellen. CCL17 bindt aan CCR4 vanwege zijn biologische effecten (188). CCL17 bleek verhoogd te zijn in beide diermodellen van longfibrose en menselijke patiënten met IPF, en bevorderde fibrose door de rekrutering van CCR4 + Th2-cellen en alveolaire macrofagen (189-191). Neutraliseren van CCL17 zou de progressie van fibrose aanzienlijk kunnen verbeteren in vivo (191). CCR4 bleek in hoge mate tot expressie te worden gebracht op T-lymfocyten in de BAL-vloeistof van patiënten met IPF (192).

De profibrotische chemokine, CCL18, voorheen bekend als pulmonale en activatie-gereguleerde chemokine, wordt geproduceerd door macrofagen, dendritische cellen, perifere bloedmonocyten, eosinofielen en neutrofielen. Er is waargenomen dat CCL18-spiegels verhoogd zijn in serum, BAL-vloeistof en sputum van patiënten met IPF (96, 193, 194). Patiënten met IPF met een CCL18-serumgrenswaarde hoger dan 150 ng/ml vertoonden een verhoogd risico op mortaliteit (193). Mechanistisch gezien verhoogde CCL18 de collageenproductie in longfibroblasten via verschillende routes, waaronder ERK1 / 2, proteïnekinase Cα en specificiteitseiwit 1 / SMAD3 (195-197). Na adenovirale genoverdracht bevorderde CCL18 T-celinfiltratie en collageenaccumulatie in een muismodel van longfibrose in vivo (198).

Er is gemeld dat de CXCL12/CXCR4-as betrokken is bij door bleomycine geïnduceerde longfibrose, aangezien neutralisatie van CXCL12 de rekrutering van fibrocyten en pulmonale collageenafzetting dempte (129). Evenzo verlichtten farmacologische CXCR4-antagonisten door bleomycine en straling geïnduceerde longfibrose (199, 200). Uit beenmerg afgeleide CXCR4+-longcellen bleken te migreren als reactie op CXCL12 en gedifferentieerd tot collageenproducerende longfibroblasten (201). Bij zowel familiale als sporadische longfibrose is genexpressie van CXCL12 werd verhoogd (202). Onlangs toonden Lin en collega's (203) aan dat de CXCL12/CXCR4-as het Ras-gerelateerde C3-botulinumtoxinesubstraat 1/ERK en c-Jun N-terminale kinasen-signaleringsroutes activeerde om activator-eiwit-1-activering en CTGF-expressie in menselijke longen te induceren. fibroblasten. CTGF bemiddelde op zijn beurt door CXCL12-geïnduceerde α-SMA-expressie en fibroblastdifferentiatie naar myofibroblasten (203).

TGF-β1 is mogelijk een van de belangrijkste doelen voor de behandeling van longfibrose (24, 204), aangezien remming van TGF-β1 antioxiderende, ontstekingsremmende en antifibrotische eigenschappen vertoonde, zowel in in vitro en in vivo modellen van longfibrose (205, 206). Studies hebben aangetoond dat het richten op TGF-β1 door monoklonale antilichamen longfibrose verminderde in een muizenmodel van door bleomycine geïnduceerde longfibrose (207). Het richten op avβ6-integrine, een belangrijke activator van TGF-β, verzwakte ook longfibrose (208). Paclitaxel, een antitumormiddel dat cellulaire microtubuli stabiliseert, verlaagde TGF-β1/SMAD3 via opregulerende microRNA-140 en verbeterde longfibrose (209). Het richten op de activinereceptor-achtige kinase 5, een type I-receptor van TGF-β die SMAD's fosforyleert en activeert, bleek verder longfibrose te remmen (210). Een TGF-β1-peptideremmer bleek longfibrose te verlichten in een muizenmodel van door bleomycine geïnduceerde longfibrose door remming van fibroblastdifferentiatie tot myofibroblasten (211).

Immunoneutralisatie van IL-13 verzwakte longfibrose bij door bleomycine geïnduceerde longfibrose (212). Jakubzick en collega's (213) toonden verder aan dat een IL-13 immunotoxine chimeer molecuul bleomycine-geïnduceerde longfibrose verzwakte door het aantal IL-13- en IL-4-responsieve cellen te verminderen. Onlangs is verder aangetoond dat tralokinumab, een humaan IL-13-neutraliserend monoklonaal antilichaam, longfibrose dempte en longherstel bevorderde in een gehumaniseerd IPF-model met ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (214).

Pirfenidon (5-methyl-1-fenyl-2-[1H]-pyridon) werd in 2008 in Japan goedgekeurd voor de behandeling van IPF en later in Europa, India, Canada en recentelijk in de Verenigde Staten (215) . Hoewel tot op heden het exacte werkingsmechanisme van pirfenidon slecht wordt begrepen, vertoont pirfenidon bewijs om longfibrose te verzwakken via remming van de collageensynthese en heat shock-eiwit 47-expressie in longfibroblasten (216), remming van profibrotische en pro-inflammatoire cytokinen, waaronder TGF -β1, IL-1β, IL-6 en FGF (217), en remming van fibrocytenmigratie via de verzwakking van CCL2- en CCL12-productie (218). Bovendien verminderde pirfenidon de proliferatie en differentiatie van menselijke longfibroblasten tot myofibroblasten door de TGF-β-geïnduceerde fosforylering van SMAD3 (219) te remmen, terwijl in een ander onderzoek is aangetoond dat het niet effectief is bij het verminderen van de collageenafscheiding in primaire menselijke longfibroblasten (220). Klinische studies ter beoordeling van pirfenidon bij idiopathische longfibrose: onderzoek naar werkzaamheid en veiligheidsresultaten (CAPACITY)-2, beoordeling van pirfenidon om de werkzaamheid en veiligheid bij idiopathische longfibrose (ASCEND) te bevestigen en een klinische studie in Japan heeft aangetoond dat pirfenidon de longfunctie vertraagt afname en verbeterde overleving van de patiënt (221, 222). In die onderzoeken was pirfenidon effectiever bij patiënten met milde tot matige IPF, wat het belang van vroege diagnose en behandeling bij longfibrose benadrukt.

Nintedanib (BIBF 1120), een drievoudige tyrosinekinaseremmer, werd op dezelfde dag goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration als pirfenidon voor IPF (223, 224). Nintedanib verbeterde de progressie van longfibrose in muizenmodellen van door silica of bleomycine geïnduceerde longfibrose (225, 226). Mechanistisch is aangetoond dat nintedanib FGF-, PDGF- en VEGF-geïnduceerde profibrotische effecten remt, TGF-β-geïnduceerde collageenafzetting vermindert, infiltratie van ontstekingscellen in de longen vermindert en TGF-β-geïnduceerde menselijke longfibroblast voorkomt differentiatie tot myofibroblast (220, 225-227). Bovendien blokkeerde nintedanib krachtig FGF-receptoren 1-3, PDGFR en VEGF-receptorkinase-activiteit (223) en moduleerde het de protease/antiprotease-balans (pro-MMP-2 en TIMP-2) (226). De onderzoeken To Improve Pulmonary Fibrosis with BIBF 1120 (TOMORROW) en INPULSIS hebben aangetoond dat nintedanib de achteruitgang van de longfunctie vertraagt, de frequentie van kortdurende exacerbaties en mortaliteit verlaagt en de kwaliteit van leven van patiënten met milde tot matige IPF behoudt (224, 228).

Longfibrose is een progressieve, onomkeerbare en meestal dodelijke longziekte. Aangenomen wordt dat microverwondingen van alveolaire epitheelcellen de ziekte initiëren, gevolgd door expansie van myofibroblasten en overmatige afzetting van ECM-componenten die uiteindelijk de longarchitectuur hermodelleren en vernietigen. Immuunmechanismen dragen bij aan fibrogenese op verschillende cellulaire en niet-cellulaire niveaus. Bij adaptieve immuniteit bestaat het meeste gepubliceerde bewijs voor T-cellen, waarvan de rol complex en subsetafhankelijk lijkt te zijn. Hoewel is voorgesteld dat Th1-, Th22- en γδ-T-cellen longfibrose verzwakken, bleken Th2- en Th17-cellen fibrotische ziekte te bevorderen. Van Tregs- en Th9-subsets is aangetoond dat ze zowel anti- als profibrotische effecten uitoefenen. Onder aangeboren immuuncellen werden met name M2-macrofagen en neutrofielen gesuggereerd om longfibrose te versterken, terwijl M1-macrofagen een beschermende rol kregen toegewezen, maar er zijn ook tegenstrijdige effecten beschreven, en toekomstige studies zijn nodig om hun rol duidelijk te definiëren in vivo. Fibrocyten vertegenwoordigen van beenmerg afgeleide immuuncellen die naar de long migreren en fibrose bevorderen. TGF-β, PDGF, IL-13, IL-17 en IL-1β zijn de belangrijkste cytokinen en CCL2, CCL17, CCL18 en CXCL12 de belangrijkste chemokinen die betrokken zijn bij de immunopathogenese van longfibrose. Specifieke subsets van profibrotische immuuncellen (zoals Th2/M2-cellen) of profibrotische cytokinen/chemokinen (zoals TGF-β, IL-13, CCL2 of CCL18) richten door monoklonale antilichamen of kleine moleculen, of door het uitbreiden/activeren van antifibrotische celtypen (zoals Th1/M1-cellen) kunnen de weg vrijmaken voor nieuwe immunofarmacologische interventies voor de behandeling van longfibrose. Ondanks deze intrigerende inzichten zijn verdere studies nodig om de functionele rol van immuuncelsubtypes en hun micro-omgevings- en contextuele interacties met epitheelcellen, (myo)fibroblasten en ECM-componenten in de pathogenese van longfibrose beter te begrijpen.

De auteurs danken Peter M. Weber (Universiteit van Tübingen, Tübingen, Duitsland) voor de uitstekende illustratie.


Differentiële immuunprofielen onderscheiden de mutatiesubtypen van gastro-intestinale stromale tumor

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, Kankeronderzoekscentrum van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

Vind artikelen van Vitiello, G. in: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Adres correspondentie aan: Ronald P.DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

Vind artikelen van Param, N. in: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

Vind artikelen van Goldfeder, R. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

Vind artikelen van Chibon, F. in: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: [email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

1 Afdeling Chirurgie en

2 Afdeling Geneeskunde, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), New York, New York, VS.

3 Afdeling Chirurgie, Universiteit van Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, VS.

4 Genome Technologies, The Jackson Laboratory for Genomic Medicine, Farmington, Connecticut, VS.

5 INSERM U1037, centrum voor kankeronderzoek van Toulouse, Toulouse, Frankrijk.

Correspondentieadres aan: Ronald P. DeMatteo, 3400 Spruce Street, Philadelphia, Pennsylvania 19104, VS. Telefoon: 215.662.7539 E-mail: ronald.dematteo[email protected]

Opmerking over auteurschap: GAV en TGB droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

Vind artikelen van DeMatteo, R. in: JCI | PubMed | Google geleerde

Gepubliceerd 14 februari 2019 - Meer info

Gastro-intestinale stromale tumor (GIST) is het meest voorkomende sarcoom bij de mens, vaak gekenmerkt door een oncogene mutatie in de KIT of PDGFRA gen. We voerden RNA-sequencing uit van 75 menselijke GIST-tumoren van 75 patiënten, wat naar onze mening het grootste cohort van GIST's is waarvan de sequentie tot nu toe is bepaald, om verschillen te ontdekken in de immuuninfiltraten van KIT- en PDGFRA-mutante GIST. Via bio-informatica, immunohistochemie en flowcytometrie ontdekten we dat in PDGFRA-mutante GIST's, immuuncellen waren talrijker en hadden een hogere cytolytische activiteit dan in KIT-mutante GIST's. PDGFRA-mutante GIST's brachten veel chemokines tot expressie, zoals CXCL14, op een significant hoger niveau in vergelijking met KIT-mutante GIST's en vertoonden meer diverse van de bestuurder afgeleide neoepitoop:HLA-binding, die beide kunnen bijdragen aan PDGFRA-mutante GIST-immunogeniteit. Door machine learning hebben we op genexpressie gebaseerde immuunprofielen gegenereerd die in staat zijn om te differentiëren KIT- en PDGFRA-gemuteerde GIST's en identificeerde aanvullende immuunkenmerken van tumoren met hoge PD-1- en -PD-L1-expressie in alle GIST-mutatiesubtypen, die inzicht kunnen verschaffen in immunotherapeutische mogelijkheden en beperkingen in GIST.

Gastro-intestinale stromale tumor (GIST) is het meest voorkomende sarcoom (1), vaak afkomstig uit de maag of de dunne darm. GIST is een paradigma voor gerichte moleculaire therapie, aangezien de meeste GIST's een activerende mutatie in exon 11 van de KIT proto-oncogen, waarvoor er effectieve en goed verdragen tyrosinekinaseremmers zijn (2, 3). Imatinibmesylaat, dat het KIT-oncoproteïne remt, verbeterde de mediane overleving bij patiënten met gevorderde en gemetastaseerde GIST van 1 tot 5 jaar (3), terwijl adjuvans imatinib de recidiefvrije overleving verbeterde bij patiënten met reseceerbare ziekte (4).

PDGFRA-mutante GIST is de tweede meest voorkomende vorm van GIST. Ongeveer de helft van PDGFRA-mutante GIST's bevatten a D842V substitutie, die inherent resistent is tegen therapie met imatinib (5). De meerderheid van PDGFRA-mutante GIST's ontwikkelen zich in de maag (6, 7), terwijl KIT-mutante GIST's kunnen optreden in de maag, dunne darm of rectum (8), wat wijst op een aangeboren en belangrijk biologisch verschil tussen deze driver-mutaties. Andere typen GIST-mutaties worden ook geassocieerd met voorspelbare klinisch-pathologische kenmerken. Bijvoorbeeld, KIT exon 9-mutant GIST's ontwikkelen zich bijna altijd in de dunne darm (9) neurofibromine 1-mutant (NF1-mutant) GIST's worden vaker aangetroffen in de duodenojejunale buiging (10) en succinaatdehydrogenasedeficiënte (SDH-deficiënt) GIST's zijn indolent, multifocaal en behoren tot de weinige GIST's - samen met die veroorzaakt door kinasefusies - die uitzaaien via het lymfestelsel (11, 12). De onderliggende biologische mechanismen die het mutatietype en de klinisch-pathologische kenmerken met elkaar verbinden, zijn niet goed begrepen.

Hoewel PDGFRA D842V (D842V)-mutante GIST's reageren niet op imatinib, het natuurlijke beloop laat zien dat recidiefvrije overleving gunstiger is bij patiënten met een PDGFRA mutatie in vergelijking met a KIT mutatie (4). Deze bevinding, samen met het voorspelbare gedrag van GIST-mutatietypes, deed ons vermoeden dat de mutatie-driver van invloed kan zijn op andere aspecten van de tumorbiologie, met name de micro-omgeving van de tumor en de immuunrespons van de gastheer. Onze groep heeft het immuuninfiltraat uitgebreid gekarakteriseerd in Kit-mutante GIST met behulp van een genetisch gemanipuleerd muismodel en menselijke monsters (13 – 17), wat een duidelijke reden biedt voor meerdere immunotherapie-onderzoeken bij patiënten met GIST, maar de immuunrespons op PDGFRA-mutante GIST is momenteel niet bekend.

In deze studie hebben we RNA-Seq uitgevoerd op 75 chirurgische monsters van 75 patiënten met GIST om de immuuninfiltraten van verschillende GIST-mutaties te karakteriseren. Verrassend genoeg ontdekten we dat PDGFRA- mutant GIST herbergt meer immuuncellen dan KIT-mutante GIST dit kan verband houden met oncogen-specifieke cytokineproductie of meer HLA-diverse neoepitoopherkenning, wat suggereert dat patiënten met PDGFRA-mutante GIST kan baat hebben bij therapeutische immunomodulatie. We hebben een willekeurig bosmachine-leeralgoritme getraind op RNA-Seq-gegevens van al onze KIT- en PDGFRA-mutante GIST's, evenals op een subset van onbehandelde, primaire, maag (UPG) KIT- en PDGFRA-mutante GIST's, om a . te karakteriseren PDGFRA-specifiek immuunlandschap. Ten slotte hebben we de belangrijkste immuunkenmerken geïdentificeerd die correleren met hoge PD-1- en PD-L1-expressie in alle GIST-specimens om mogelijke barrières en synergetische mogelijkheden voor succesvolle blokkering van immuuncheckpoints in GIST te identificeren.

Analyse van de verrijking van genensets met één monster identificeert de verrijking van de immuuncelroute in PDGFRA-mutante GIST. We voerden RNA-Seq en principale componentenanalyse (PCA) uit van 75 humane GIST-specimens met verschillende mutatietypen (N = 37 KIT-mutant, N = 24 PDGFRA-mutant, N = 7 SDH-gebrekkig, N = 4 meerdere stuurprogramma's, N = 2 WT, en N = 1 NF1-mutant Aanvullend Tabel 1 aanvullend materiaal online beschikbaar bij dit artikel https://doi.org/10.1172/JCI124108DS1). De gecombineerde PCA van alle mutatie-stuurprogramma's toonde clustering op mutatiesubtype (aanvullende figuur 1, boven), wat het duidelijkst was in PDGFRA-gemuteerd en SDH-deficiënte GIST's (aanvullende figuur 1, onderaan). Opmerkelijk, KIT- mutante GIST's leken te clusteren in 3 verschillende groepen, die bij nadere inspectie van de klinisch-pathologische kenmerken verband hielden met de behandelingsstatus en de tumorlocatie.

Gezien wat onze groep heeft ontdekt met betrekking tot het immuuninfiltraat van GIST (13-15, 17), de metabole kenmerken van met imatinib behandelde GIST (18), en de associatie van celcyclusactiviteit met GIST-agressiviteit (19, 20), gebruikten we onze sequencing-gegevens om verrijkingsanalyses met enkelvoudige monsters (ssGSEA's) uit te voeren, gericht op immuun-, metabolische en celcyclusroutes (Figuur 1). Met behulp van gepubliceerde genensets (21), samen met beoordeling van eerder gepubliceerde metabole, celcyclus- en immuunroutes (22), identificeerden we 136 genensets voor opname in ssGSEA (aanvullende tabel 2).

ssGSEA identificeert de verrijking van de immuuncelroute in PDGFRA-mutante GIST. ssGSEA van 75 GIST-specimens, georganiseerd door mutatie-driver en toenemende ESTIMATE-score. Ongecontroleerde rijclustering gegroepeerde genensets in 3 hoofdcategorieën op basis van celcyclusroutes, metabole routes en immuunroutes. Klinischpathologische kenmerken van de 75 GIST-monsters worden weergegeven in de annotatie en in aanvullende tabel 1.

ESTIMATE en CYT-scores, die respectievelijk de hoeveelheid en cytolytische activiteit van de immuuninfiltraten afleiden (23, 24), onthulden dat KIT-mutante GIST had een reeks immuuncelinfiltratie en cytolytische activiteit (Figuur 1). In de tussentijd, SDH-gebrekkig, NF1-gemuteerd, D842V-mutante GIST's met een concurrent CDKN2A (p16) deletie en WT GIST's (gedefinieerd als niet-KIT, niet-PDGFRA, niet-RAS-geactiveerd en niet-SDH-deficiënt, zoals eerder beschreven ref. 25) vertoonden over het algemeen lage ESTIMATE- en CYT-scores en een gebrek aan verrijking van de immuuncelroute.

Omgekeerd identificeerden ESTIMATE, CYT en ssGSEA verhoogde infiltratie van immuuncellen, grotere activiteit van immuuncellen en een significante verrijking van immuungerelateerde genensets in PDGFRA-mutante GIST's - een onverwachte bevinding die suggereerde dat PDGFRA- mutante GIST's waren meer immunogeen dan andere GIST-mutaties (Figuur 1). De activiteitsroutes van de celcyclus waren niet duidelijk gecorreleerd met de infiltratie van immuuncellen bij alle typen GIST-drivermutaties, terwijl de metabole activiteit omgekeerd bleek te correleren met de hoeveelheid immuuninfiltraat, met name in KIT exon 11-mutante GIST's. Over het algemeen laten deze gegevens zien dat hoewel tumoren die worden aangestuurd door een bepaalde GIST-mutatie, variabele immuunprofielen kunnen hebben, PDGFRA-mutante GIST bevat de sterkste op genexpressie gebaseerde immuunsignatuur in vergelijking met andere GIST-mutaties.

PDGFRA-mutante GIST is immunologisch actiever dan KIT-mutante GIST. Om onze ssGSEA-bevinding te valideren dat: PDGFRA-mutante GIST was sterk verrijkt in hoeveelheid immuuncellen en cytolytische activiteit, we vergeleken eerst de klinisch-pathologische kenmerken van alle KIT- en PDGFRA-mutante GIST's (aanvullende tabel 3) N = 61). Hoewel niet geassocieerd met infiltratie van immuuncellen in GIST, zijn tumorgrootte, mitotische snelheid en tumorlocatie voorspellend voor GIST-agressiviteit en recidiefvrije overleving na chirurgische resectie (26). PDGFRA-mutante GIST's werden vaker gevonden in de maag in vergelijking met KIT-mutante GIST's, en er waren significant meer mannen in onze PDGFRA-mutant GIST-cohort. Er was ook een trend naar verminderde mitotische activiteit in PDGFRA-mutant in vergelijking met KIT-mutante GIST's (aanvullende tabel 3). ESTIMATE en CYT-scores correleerden echter niet overal met de mitotische snelheid KIT- en PDGFRA-mutante GIST's (aanvullende figuur 2A). CYT-score en het totale aantal CD45-mRNA-transcripten waren significant hoger in PDGFRA-mutant in vergelijking met KIT-mutante GIST's (Figuur 2A), terwijl er ook een trend was in de richting van verhoogde ESTIMATE-score en CD8-mRNA-expressie, wat suggereert dat PDGFRA- mutante GIST's kunnen een grotere infiltratie en activering van immuuncellen vertonen dan KIT-mutante GIST's.

PDGFRA-mutante GIST is immunologisch actiever in vergelijking met KIT-gemuteerde GIST. (EEN) ESTIMATE en CYT-scores (links) en CD45- en CD8-genormaliseerde tellingen (rechts) van alle KIT- en PDGFRA-mutante GIST's (N = 61 Aanvullende tabel 3). (B). ESTIMATE en CYT-scores (links) en CD45- en CD8-genormaliseerde tellingen (rechts) van UPG KIT- en PDGFRA-mutante GIST's (N = 22 Aanvullende tabel 4). (C) GSEA toont meerdere immuunroutes verrijkt in UPG PDGFRA-mutant vergeleken met UPG KIT-gemuteerde GIST's. NES, genormaliseerde verrijkingsscore. (NS) ×10 vergroting CD45 en CD8 IHC kleuring in KIT- en PDGFRA-mutante GIST's. Rode tekst geeft aan dat het monster is opgenomen in het RNA-Seq-cohort, terwijl monsters in zwarte tekst niet zijn opgenomen. Representatieve monsters van N = 6 per groep worden getoond. (E) CD45 (boven) en CD8 (midden) kwantificering van IHC-kleuring. N = 6 per groep. Het aantal CD45+- en CD8+-cellen per HPF werd berekend door 5 HPF's per tumor te onderzoeken en het gemiddelde per tumor uit te zetten. Onder: CD45-expressie door flowcytometrie (voor monsters waarin flowcytometriegegevens beschikbaar waren). *P < 0,05, t toets. Balken geven de mediaan aan.

Omdat we significante verschillen in tumorlocatie hebben waargenomen tussen KIT- en PDGFRA-mutante GIST's en metastatische laesies en behandelingsstatus bleken ook het immuuninfiltraat in GIST te veranderen (14, 27), daarna vergeleken we alleen UPG PDGFRA- en KIT-mutante GIST's om confounders te minimaliseren en het potentieel te maximaliseren om belangrijke biologische verschillen waar te nemen die verband kunnen houden met de oncogene driver (aanvullende tabel 4 N = 22). UPG PDGFRA- en KIT- mutante GIST's met een lage mitotische snelheid vertoonden significant hogere ESTIMATE-scores in vergelijking met UPG GIST's met een hoge mitotische snelheid (aanvullende figuur 2B), wat suggereert dat infiltratie van immuuncellen gedeeltelijk gerelateerd kan zijn aan GIST-agressiviteit bij het controleren op tumorlocatie en behandelingsstatus.Bij controle voor de mutatiedriver naast de tumorlocatie en behandelingsstatus, correleerde de mitotische snelheid echter niet omgekeerd met de infiltratie van immuuncellen (aanvullende figuur 2C), wat impliceert dat de oncogene driver ook kan bijdragen aan verschillen in immuunrespons. In feite waren de ESTIMATE-score, CYT-score en de mRNA-expressie van CD45 significant groter in UPG PDGFRA-mutante GIST's in vergelijking met UPG KIT-mutante GIST's en expressie van CD8-mRNA was ook verhoogd (Figuur 2B). Bovendien toonden genset-verrijkingsanalyses (GSEA's) aan dat de algehele immuunresponsroute, adaptieve immuunresponsroute, antigeenbindingsroute en α/β T-celactiveringsroute (Figuur 2C), evenals lymfocytactivering, lymfocytdifferentiatie en B celactiviteitsroutes (gegevens niet getoond), waren significanter verrijkt in UPG PDGFRA-mutant vergeleken met KIT-mutante GIST's, wat suggereert dat het verschil in immuuninfiltratie en activiteit gerelateerd kan zijn aan de oncogene driver.

Om de waargenomen verschillen in immuuncelinfiltratie tussen PDGFRA- en KIT-mutante GIST's, we hebben IHC-kleuring uitgevoerd voor CD45 en CD8 op KIT- en PDGFRA-mutante GIST's, inclusief extra tumoren die niet zijn opgenomen in het sequencing-cohort (Figuur 2D). Bij grof microscopisch onderzoek bleek dat: PDGFRA- mutante GIST's bevatten meer CD45+- en CD8+-cellen, met een deel van de immuuncellen geclusterd rond perivasculaire structuren, een bevinding waarvan we hebben vastgesteld dat deze verband houdt met adaptieve immuniteit (onze niet-gepubliceerde waarnemingen). Kwantificering van CD45- en CD8 IHC-kleuring, inclusief kleuring van de meest geïnfiltreerde en cytolytisch actieve KIT-mutante GIST in de KIT-mutantencohort (humaan GIST 203), toonde aan dat: PDGFRA- mutante GIST's hadden significant meer CD45+- en CD8+-cellen per x20 hoogvermogensveld (HPF) dan KIT-mutante GIST's (Figuur 2E). Bovendien, flowcytometrische analyse van KIT- en PDGFRA-mutante GIST-specimens bevestigden dat: PDGFRA-mutante GIST's herbergden significant meer CD45+-immuuncellen dan KIT-mutante GIST's (Figuur 2E). Samen bevestigen deze bevindingen dat in PDGFRA- mutante GIST's, immuuncellen zijn talrijker en hebben een hogere cytolytische activiteit dan in KIT-mutante GIST's met vergelijkbare klinisch-pathologische kenmerken.

CIBERSORT en differentiële genexpressie-analyse identificeren unieke immuunhandtekeningen in GIST. Om aanvullende verschillen te ontdekken in het immuunlandschap tussen UPG PDGFRA- en UPG KIT-mutante GIST's, hebben we een eerder gedefinieerde set van 117 relevante immuunkenmerken geprofileerd (aanvullende tabel 5) (28, 29). Naast ESTIMATE- en CYT-scores, omvatte dit profiel scores die zijn afgeleid van CIBERSORT, dat verschillende immuuncelfrequenties afleidt via RNA-Seq-deconvolutie, evenals 93 relevante immuungerelateerde genen. UPG PDGFRA- mutante GIST's leken hogere proporties van intratumorale CD4+ T-cel en macrofaagexpressie te hebben (Figuur 3, midden), terwijl UPG KIT- mutante GIST's brachten voornamelijk CD4- en macrofaagsignaturen tot expressie, alleen in de meest door immuuncellen geïnfiltreerde tumoren. Bovendien werden B-cel- en CD8+-T-celsignaturen ook uitgedrukt in GIST's met hoge ESTIMATE- en CYT-scores, wat bevestigt wat wij en anderen hebben aangetoond met betrekking tot de prevalentie van immuuncellen in GIST (14, 27).

CIBERSORT- en DGE-analyse identificeren unieke immuunhandtekeningen in GIST. CIBERSORT (midden) en immuungenexpressie (onder) van UPG KIT- en UPG PDGFRA-mutante GIST's, georganiseerd door mutatie-driver en toenemende ESTIMATE-score (N = 22). Niet-gecontroleerde rij-genormaliseerde clustering van genen toont groepering van genen in verschillende groepen, wat wijst op door oncogen aangedreven immuunprofielen. Genen weergegeven in blauw waren significant verrijkt in UPG PDGFRA- vergeleken met UPG KIT-mutant, terwijl genen in groen significant verrijkt waren in UPG KIT- vergeleken met UPG PDGFRA- mutante monsters. Verrijking werd beschouwd als een aangepaste P < 0.1 zoals berekend door DESeq2 voor R, terwijl vet voor gennamen een significant verschil aangeeft, met een aangepaste P < 0,05. Klinischpathologische kenmerken van de UPG GIST-monsters worden weergegeven in de annotatie en in aanvullende tabel 4.

Differentiële genexpressie (DGE) analyse onthulde dat 20 van de 93 (21,5%) immuungerelateerde genen significant differentieel gereguleerd waren tussen UPG KIT- en UPG PDGFRA-mutante GIST's (vet geeft aan) P < 0,05 Afbeelding 3, onder). In het bijzonder, UPG PDGFRA-mutante GIST's brachten significant meer CCR5, BTLA, CD96, CD48, TNFRSF9, TNFSF8, CCR4, CXCL11, CXCR4, KDR, IL6R, TNFRSF8, TNFSF14, TIGIT, TNFRSF17, HLA-DQA2, CXCL14 en CXCL12 tot expressie. In de tussentijd, KIT- mutante GIST's brachten significant meer TNFSF18 en MICA tot expressie. Samen suggereren deze gegevens dat: PDGFRA- en KIT- mutante GIST's lokken een andere kwaliteit van immuuninfiltraat uit, wat uiteindelijk driver-specifieke strategieën voor immunotherapie kan opleveren.

PDGFRA- en KIT-mutante GIST's hebben verschillende signalerings- en cytokinesignaturen. Om te bepalen of intracellulaire signalering of cytokineverschillen zouden kunnen bijdragen aan de waargenomen verschillen in immuuninfiltratie tussen UPG PDGFRA-mutant en UPG KIT-mutante GIST's, gebruikten we GSEA om verschillen in deze routes te detecteren. Op GSEA zagen we voor het eerst verrijking van een bekende PDGFRA-mutant GIST-signaleringsroute-genset uit een eerder rapport dat analyseert PDGFRA-mutante GIST's (Figuur 4A, boven) (30). Vergeleken met UPG KIT-mutante GIST's, UPG PDGFRA-mutante GIST's toonden ook significante transcriptionele activering van de PI3K-signaleringsroute (Figuur 4A, onder), die mogelijk is veroorzaakt door expressieveranderingen in PDGFRA, RELN, KDR, of ERK, 4 genen waarvan is vastgesteld dat ze significant verschillend tot expressie worden gebracht tussen PDGFRA- en KIT-mutante GIST's, niet alleen in ons cohort, maar ook eerder (30). Bovendien waren veel cytokine- en chemokine-routes significant opgereguleerd in UPG PDGFRA-mutante GIST's (Figuur 4B), waarvan we vonden dat ze verband hielden met verhoogde expressie van CXCL14, CCL7, CCL19, VEGFA, en KITLG (Figuur 4C).

PDGFRA- en KIT- mutante GIST's hebben verschillende signalerings- en cytokinesignaturen. GSEA toont verrijking van (EEN) PDGFRA signalering, PI3K-signalering en (B) cytokine-signaleringsroutes in UPG PDGFRA- vergeleken met UPG KIT-gemuteerde GIST's (N = 22). (C) Verdeling van cytokinen tussen UPG KIT- en UPG PDGFRA-mutante GIST's, door RNA-Seq. Bijgestelde P < 0,05 zoals berekend door DESeq2. Alle gegevenspunten worden getoond in vakken die het interkwartielbereik definiëren, met snorharen die zich uitstrekken tot de laagste en hoogste gegevenspunten. (NS) Links: Relatief CXCL14 mRNA-expressie door qRT-PCR in KIT- (N = 7) en PDGFRA-gemuteerd (N = 7) GIST's van het RNA-Seq-cohort, vergeleken met de GIST-T1-cellijn (expressie ingesteld op 1 gegevens niet weergegeven). Rechts: CXCL14 mRNA-expressie ten opzichte van GAPDH × 10 6 in UPG KIT- en PDGFRA-mutante GIST's. Horizontale stippellijn staat voor CXCL14 mRNA-expressie nodig om tumorregressie te induceren (31). *P < 0,05, t toets. Balken geven de mediaan aan.

De verschillen waargenomen in CXCL14 expressie waren bijzonder intrigerend. Eerst, CXCL14 mRNA werd op significant hogere niveaus tot expressie gebracht in bijna alle UPG PDGFRA-mutante GIST's. Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) van menselijke bulk PDGFRA- en KIT-mutante tumoren onthulden ook dat: PDGFRA-mutante GIST's produceerden ongeveer 10 keer meer CXCL14 mRNA dan KIT-mutante tumoren, en 21 keer meer CXCL14 mRNA dan de KIT-mutant GIST-T1 (Figuur 4D, links) en GIST-882 cellijnen (gegevens niet getoond). Eindelijk, CXCL14 is aangetoond dat het bijdraagt ​​aan NK+, CD4+, CD8+ en regulerende T-cel chemotaxis en tumorregressie in andere tumormodellen (31, 32). UPG PDGFRA-mutante GIST's uitgedrukt CXCL14 mRNA op niveaus die hoger zijn dan die waarvan is aangetoond dat ze leiden tot immuungemedieerde tumorregressie bij HPV + hoofd-, nek- en baarmoederhalskanker, terwijl KIT-mutante tumoren tot expressie gebracht CXCL14 mRNA op niveaus onder deze drempel (Figuur 4D, rechts). Samen suggereren deze bevindingen dat CXCL14-expressie kan bijdragen aan de waargenomen verschillen in immuuninfiltratie tussen PDGFRA- en KIT-mutante GIST's (31, 32).

PDGFRA-mutatie produceert meerdere HLA-diverse, sterk bindende neo-epitopen. Gezien de associatie van neoantigeenpresentatie met ontstoken tumor/immuunmicro-omgevingen in andere maligniteiten, veronderstelden we dat PDGFRA-mutante GIST's kunnen krachtigere neo-epitopen produceren in vergelijking met KIT-mutante GIST's. Om dit te onderzoeken, hebben we eerst de 8-, 9- en 10-mer neo-epitopen in kaart gebracht die worden geproduceerd door alle driver-mutaties in ons cohort, waarbij neo-epitopen worden gegenereerd met de mutatie op elke aminozuurpositie in het mutante peptide. Vervolgens testten we de bindingsaffiniteit van elke neo-epitoop voor het overeenkomende, patiëntspecifieke HLA-type waarin die mutatie werd gevonden.

Ten eerste wilden we bepalen of de totale neo-epitoopbelasting en het aantal neo-epitopen met hoge affiniteit geproduceerd door elk GIST-monster gecorreleerd waren met immuuninfiltratie of cytolytische activiteit in GIST, aangezien is aangetoond dat de neo-epitoopbelasting correleert met een verhoogde respons op immunotherapie in een verscheidenheid van kankers (33, 34). De totale neoepitooplast en het aantal neo-epitopen met hoge affiniteit (<500 nM-binding) of zeer hoge affiniteit (<50 nM-binding) correleerden echter niet met immuuninfiltratie of cytolytische activiteit voor alle mutaties in het GIST-cohort (Figuur 5A) of tussen KIT- en PDGFRA- mutante GIST's specifiek (gegevens niet getoond).

PDGFRA mutatie produceert meerdere HLA-diverse, sterk bindende neo-epitopen. (EEN) Pearson's correlatie van ESTIMATE (boven) en CYT (onder) scores met totale neo-epitooplast (links), aantal neo-epitopen met hoge affiniteit (midden) en aantal neo-epitopen met zeer hoge affiniteit (rechts) onder alle GIST-monsters (N = 75). (B) Links: Percentage patiënten met de aangegeven mutatie bij wie de mutatie een voorspeld neo-epitoop met hoge affiniteit produceerde. Rechts: aantal potentiële neoepitoop:HLA-bindingsgebeurtenissen geproduceerd per mutatietype, gemiddeld over het aantal mutaties per groep. (C) Heatmap van de bindingsaffiniteiten van KIT en PDGFRA mutatiespecifieke neo-epitopen voor alle gevalideerde NetMHCPan 3.0 HLA-typen. Klinischpathologische kenmerken van de GIST-monsters worden weergegeven in aanvullende tabel 3. Aanvullende details met betrekking tot mutaties, neo-epitopen en HLA-typen die zijn gebruikt om deze heatmap te maken, worden weergegeven in aanvullende tabellen 6 en 7.

We zagen dat de meerderheid van de patiënten met een oncogene mutatie in PDGFRA of KIT produceerde ten minste één neo-epitoop met hoge affiniteit (<500 nM-binding), ongeacht het mutatiesubtype (Figuur 5B). We ontdekten ook dat de D842V mutatie produceerde 34 unieke neoepitoop:HLA-specifieke bindingscombinaties met hoge affiniteit over de voorspelde HLA-typen in ons cohort van 16 D842V-mutante patiënten (Figuur 5B), terwijl KIT exon 11 en andere PDGFRA mutaties produceerden gemiddeld slechts 2-3 per mutatie (aanvullende tabel 6). De D842V mutatie genereerde 6 verschillende neo-epitopen die bonden aan 12 verschillende HLA-typen bij 14 patiënten in ons cohort (aanvullende tabel 7), waarvan er één het meest voorkomende HLA-type is in de Verenigde Staten en aanwezig is in 95,7% van de blanke personen (HLA*A02: 01) (35, 36), wat suggereert dat deze mutatie een immuunrespons zou kunnen veroorzaken bij een grote verscheidenheid aan patiënten, terwijl: KIT exon 11 neo-epitopen gebonden aan minder voorkomende HLA-typen.

Aangezien het aantal patiënten met D842V mutaties (N = 16) overschreed het aantal patiënten met een individu KIT mutatie (N = 1–4, aanvullende tabel 7), en dit kan onze HLA-waarnemingen verdoezelen, hebben we mutatiespecifieke neoepitoopbindingsdiversiteit breder onderzocht tegen alle HLA-typen gevalideerd door NetMHCPan3.0 (Figuur 5C). Nogmaals, bijna allemaal PDGFRA en KIT GIST-mutaties produceerden ten minste één neo-epitoop met hoge affiniteit die aan veel verschillende HLA-typen kan binden. D842V neo-epitopen bonden met een zeer hoge affiniteit (<50 nM binding) aan HLA*A02:01 en vele andere veelvoorkomende HLA-types. Interessant is dat 50% (4 van 8) van alle PDGFRA mutaties produceerden ten minste één neo-epitoop met zeer hoge affiniteit (<50 nM-binding) voor HLA*A02:01, vergeleken met slechts 14% van de KIT mutaties (2 van 14). Dus, terwijl alle KIT- en PDGFRA- mutante GIST's lijken neo-epitopen met hoge affiniteit te produceren, PDGFRA- mutante GIST's lijken meer neo-epitopen met hoge affiniteit te produceren voor meer algemene HLA-typen. Aangezien GIST vaak wordt aangedreven door een enkele oncogene mutatie en GIST een rijk immuuninfiltraat herbergt, verhoogt dit de mogelijkheid dat oncogene GIST-mutaties neo-epitopen produceren die kunnen worden geclassificeerd als wat recentelijk provocerend is beschreven als neo-epitopen van hoge kwaliteit (37).

Machine learning identificeert immuungensignaturen voor GIST. Door middel van bioinformatica-voorspelling en biologische validatiemethoden blijkt dat in PDGFRA-mutante GIST, immuuncellen zijn talrijker en hebben een hogere cytolytische activiteit dan in KIT-mutante GIST's, en beide subsets bevatten een uniek immuunprofiel. Dit maakt het karakteriseren van een globaal immuuninfiltraat in GIST uitdagend en suggereert dat specifieke immunotherapiebenaderingen uiteindelijk moeten worden gericht op de specifieke oncogene mutatie in GIST. We hebben daarom geprobeerd de belangrijkste immuunkenmerken te definiëren die differentiëren PDGFRA- en KIT-mutante GIST's door middel van machine learning, wat een onbevooroordeelde benadering is die niet afhankelijk is van eerder gedefinieerde genenset-analyse, waardoor nieuwe en onpartijdige observaties mogelijk zijn. We hebben specifiek alles gebruikt KIT- en PDGFRA-mutante GIST's (aanvullende tabel 3) N = 61), evenals alleen UPG KIT- en PDGFRA-mutante GIST's (aanvullende tabel 4) N = 22) om 2 willekeurige bosmodellen te ontwikkelen, en veronderstelden dat deze immuunverschillen hoogstwaarschijnlijk gerelateerd zouden zijn aan de oncogene driver.

De combinatie van opvallende immuunkenmerken die in staat zijn om het meest nauwkeurig een profiel te PDGFRA- of KIT-mutante GIST werden geïdentificeerd op basis van het "belang" van elke functie, dat wordt berekend als onderdeel van caret voor R's implementatie van randomForest (38). De metriek voor het belang van een kenmerk is een maatstaf die aangeeft hoe nuttig een kenmerk is voor het scheiden van steekproeven in hun verschillende klassen. De kenmerken met het hoogste belang geven de classifier de hoogste prestatieverbetering.

We hebben alle 117 immuunfuncties opgenomen om het model in eerste instantie te maken (aanvullende tabel 5) en vervolgens het model opnieuw te trainen met minder functies. We merkten op dat het opnemen van meer functies in het model de prestaties van het model op de trainingsset verhoogde, maar de prestaties van het model op de testset verminderde, een fenomeen dat bekend staat als overfitting (aanvullende figuur 3A). Om overfitting te voorkomen, hebben we het model daarom opnieuw getraind met alleen de 6 belangrijkste functies, waarvan we denken dat ze de toepasbaarheid van ons model op toekomstige GIST-samples zullen verbreden. Toen we het model beperkten tot de 6 meest relevante kenmerken (Figuur 6A), 27 van 30 KIT-mutante GIST's werden correct geclassificeerd als: KIT-mutant in de trainingsset, terwijl 14 van 20 PDGFRA-mutante GIST's werden correct toegewezen als PDGFRA-mutant (gevoeligheid: 70%, specificiteit: 90%). De belangrijkste immuunfuncties waren CXCL14, TGFBR1, TNFSF9, MICA, TNFRSF25 en CD96 (Figuur 6B). Met name de PDGFRA-mutante tumoren die ten onrechte werden geclassificeerd als KIT-mutant door ons model had lagere ESTIMATE- en CYT-scores dan correct geclassificeerd PDGFRA-mutante tumoren (aanvullende figuur 4A), terwijl KIT-mutante tumoren ten onrechte geclassificeerd als PDGFRA- mutant had meer variabele CXCL14-mRNA-expressie en hogere TGFBR1- en CD96-mRNA-expressie dan correct geclassificeerd KIT-mutante tumoren (aanvullende figuur 4B). In onze afzonderlijke cohort van testmonsters (N = 11), het model met 6 kenmerken correct geïdentificeerd KIT- en PDGFRA-mutante GIST's met een nauwkeurigheid van 91% (Figuur 6C). Om het belang van deze 6 immuunkenmerken bij de classificatie aan te tonen: KIT- en PDGFRA-mutante GIST's, hebben we deze functies uitgesloten en ons willekeurige bosmodel opnieuw getraind, waardoor de classificatieprestaties en modelnauwkeurigheid werden verminderd van 91% tot 72,7% (aanvullende figuur 3B).

Machine learning identificeert een immuunhandtekening die voorspellend is voor: KIT- en PDGFRA-gemuteerde GIST. (EEN) Willekeurige bosmodellering met 5-voudige kruisvalidatie van KIT- en PDGFRA-mutante GIST-specimens (trainingsset gemaakt door 80% van KIT en PDGFRA monsters uit aanvullende tabel 3, N = 50). Verwarringsmatrix (rechts) geeft de beoordeling van de fit van het model aan de trainingsset aan. OOB, uit de zak. (B) Verdeling van top 6-kenmerken geïdentificeerd door willekeurige bosmodellering. *Bijgestelde P < 0,05 van DSeq2. (C) Voorspellende capaciteit van model op resterend KIT- en PDGFRA-mutante GIST-testset (N = 11) en het CINSARC-cohort (N = 12). Nauwkeurigheid (Acc), gevoeligheid, specificiteit en P waarde [Acc >no information rate (NIR)] van het model worden weergegeven, berekend door caret-pakket voor R. Staven geven het gemiddelde aan + SEM. (NS) Willekeurige bosmodellering met 5-voudige kruisvalidatie van UPG KIT- en UPG PDGFRA-mutante GIST-exemplaren (trainingsset gemaakt door 80% van UPG te partitioneren) KIT en UPG PDGFRA monsters uit aanvullende tabel 4, N = 18). Verwarringsmatrix (rechts) geeft de beoordeling van de fit van het model aan de trainingsset aan. (E) Verdeling van top 6-kenmerken geïdentificeerd door willekeurige bosmodellering. *Bijgestelde P < 0,05 van DSeq2. (F) Voorspellende capaciteit van het model op resterende UPG KIT- en UPG PDGFRA-mutante GIST-testset (N = 4) en het CINSARC-cohort (N = 12). Nauwkeurigheid, gevoeligheid, specificiteit en P waarde [Acc >NIR] van het model worden weergegeven, berekend door caret-pakket voor R. For B en E, worden alle gegevenspunten weergegeven, met vakken die het interkwartielbereik definiëren en snorharen die zich uitstrekken tot de laagste en hoogste gegevenspunten.

We hebben ons model verder gevalideerd op een extern cohort van GIST's uit de Complexity Index in Sarcomas (CINSARC)-studie (N = 12 ref. 39). Toepassing van ons immuunprofileringsmodel op het CINSARC-cohort correct gedifferentieerd KIT- en PDGFRA-mutante GISTS met een nauwkeurigheid van 83,3% (Figuur 6C). Vergelijkbare resultaten werden verkregen toen we een model maakten met alleen UPG PDGFRA- en KIT-mutante GIST's (Figuur 6, D-F), waarin CXCL14, IDO, TNFSF14, KDR, MICA en TNFRSF9 de belangrijkste kenmerken waren die het model definieerden.

We gebruikten dezelfde machine learning-aanpak om op genexpressie gebaseerde immuunkenmerken te identificeren die geassocieerd zijn met hoge PD-1- en PD-L1-expressie in alle GIST's (N = 75) om nieuwe therapeutische doelen en potentiële barrières voor blokkade van immuuncheckpoints in GIST te ontdekken. Interessant genoeg toonde ons 6-functiemodel aan dat verhoogde CD27-expressie sterk gerelateerd was aan PD-1-upregulatie (gevoeligheid: 90%, specificiteit: 87,1%, figuur 7A), samen met PDCD1LG2, BTLA, CD40, CXCL14 en MICB, wat suggereert dat deze routes kunnen synergetische mogelijkheden voor PD-1-immunomodulatie in GIST vertegenwoordigen (Figuur 7B). Met alleen deze 6 functies was ons model in staat om hoge PD-1-expressie correct te voorspellen in 92,9% van het testcohort en 66,7% van het externe CINSARC GIST-cohort (Figuur 7C).

Machine learning identificeert een immuunhandtekening die voorspellend is voor PD-1- en PD-L1-expressie in GIST. (EEN) Willekeurige bosmodellering van PD-1 met 5-voudige kruisvalidatie van GIST-specimens (trainingsset gemaakt door 80% van alle GIST-monsters te partitioneren uit aanvullende tabel 1, N = 61). Verwarringsmatrix (rechts) geeft de beoordeling van de fit van het model aan de trainingsset aan. (B) Verdeling van top 6-kenmerken geïdentificeerd door willekeurige bosmodellering. *Bijgestelde Q < 0,1. (C) Voorspellende capaciteit van het model op de resterende 14 GIST's (testset) en extern CINSARC GIST-cohort (N = 12). Nauwkeurigheid, gevoeligheid, specificiteit en P waarde [Acc > NIR] van het model worden weergegeven, berekend door caret-pakket voor R. (NS) Willekeurige bosmodellering van PD-L1 met 5 k-voudige kruisvalidatie van GIST-specimens (trainingsset gemaakt door 80% van alle GIST-monsters te partitioneren uit aanvullende tabel 1, N = 61). Verwarringsmatrix (rechts) geeft de beoordeling aan van de modellering die past bij de trainingsset. (E) Verdeling van top 6-kenmerken geïdentificeerd door willekeurige bosmodellering. *Bijgestelde Q < 0,1. (F) Voorspellende capaciteit van model op resterende 14 GIST's (testset) en extern CINSARC GIST-cohort (N = 12). Nauwkeurigheid, gevoeligheid, specificiteit en P value[Acc >NIR] van het model worden weergegeven, zoals berekend door het caret-pakket voor R. For B en E, worden alle gegevenspunten weergegeven, met vakken die het interkwartielbereik definiëren en snorharen die zich uitstrekken tot de laagste en hoogste gegevenspunten.

PD-L1-mRNA-expressie correleerde met PD-L1-eiwitexpressie in ons cohort (aanvullende figuur 5 zie volledige onbewerkte gel in het aanvullende materiaal). Bij het trainen van ons PD-L1 random forest-model waren de expressie van belangrijke antigeenpresenterende machines, waaronder B2M, HLA.DRA en TAP2, en de immuunresponsieve cytokines CXCL10 en LTA voorspellend voor verhoogde PD-L1-expressie in alle GIST's (gevoeligheid : 76,7%, specificiteit: 87,1%, figuur 7D), wat een verband suggereert tussen de opregulatie van het ligand van het immuuncheckpoint en de herkenning van het immuunsysteem (Figuur 7E). Door het model van deze antigeenpresenterende machinekenmerken en immuuncytokinen toe te passen, samen met PD-L2, dat ook werd geïdentificeerd als een kenmerk dat voorspellend is voor hoge PD-L1-expressie, identificeerde ons model correct hoge PD-L1-expressie met een nauwkeurigheid van 85,7% in de testcohort en 91,7% in het CINSARC GIST-cohort (Figuur 7F).

Het dramatische succes van blokkade van immuuncheckpoints bij een verscheidenheid aan notoir moeilijk te behandelen kankers heeft immunomodulatie bijna gestandaardiseerd als een benadering voor kankerbehandeling (40-42). Later onderzoek heeft ons begrip echter vergroot van hoe kankertype- en tumorcelspecifieke kenmerken, zoals genomische mutatiebelasting, de respons op immunotherapie kunnen voorspellen (33, 34). Onlangs is ook aangetoond dat de toestand van de immuunmicro-omgeving de respons op immunotherapie kan voorkomen als deze niet op de juiste manier wordt aangepakt (43). In feite is het duidelijk geworden dat de complexe relatie tussen kankercel-intrinsieke factoren en de subtiliteiten van de kankertype-specifieke immuunmicro-omgeving een algemene strategie van immuuncheckpointblokkade ineffectief kan maken (44). Daarom is het steeds duidelijker geworden dat kankerspecifieke immunotherapeutische strategieën nodig zijn.

In deze studie hebben we RNA-Seq uitgevoerd op 75 menselijke GIST-monsters van 75 patiënten om het immuunlandschap van verschillende GIST-mutatie-drivers te karakteriseren, waarvan wij denken dat dit het grootste cohort GIST's is dat moet worden geanalyseerd met RNA-Seq van de volgende generatie. Na het observeren van mogelijke verschillen in immuuninfiltratie, hebben we ons gericht op de 2 meest voorkomende GIST-mutatiesubtypen, namelijk: KIT en PDGFRA, en vond dat PDGFRA-mutante GIST's bevatten meer immuuncellen dan KIT-mutante GIST's. Dit suggereert dat patiënten met PDGFRA-mutante GIST kan uiteindelijk een groter potentieel hebben om te reageren op immunotherapie.

Door middel van differentiële genexpressie-analyse hebben we mutatiespecifieke immuunlandschappen geïdentificeerd die van belang kunnen zijn voor het aansturen van GIST-immunotherapie. Eerst, PDGFRAMutante GIST's vertoonden een hogere expressie van CD96, wat suggereert dat NK-cellen een grotere rol kunnen spelen in de immuunomgeving van PDGFRA-mutant vergeleken met KIT-gemuteerde GIST. Er is zelfs gesuggereerd dat NK-celinfiltraat een bijdrage levert aan de overleving op lange termijn in KIT-mutante GIST (45), wat kan helpen verklaren waarom PDGFRA-mutante GIST-patiënten hebben een betere algemene prognose (4). evenzo, PDGFRA-mutante GIST's hadden hogere CD4-, CCR4- en CCR5-expressie (indicatief voor regulerende T-cellen) en hogere expressie van de immunomodulatoren BTLA, CD48, TNFRSF9 en TIGIT. PDGFRA- mutante GIST's kunnen daarom meer ontvankelijk zijn voor een verscheidenheid aan immunotherapeutische benaderingen, zoals het richten op TIGIT, BTLA, CD48 of TNFRSF9 naast regulerende T-cellen en NK-cellen, en PD-1/PD-L1-controlepuntblokkade.

Vergelijking van UPG GIST's van de KIT- en PDGFRA-mutante fenotypes onthulden dat mitotische snelheid, een indicator van GIST-agressiviteit, omgekeerd evenredig was met de hoeveelheid van het immuuninfiltraat. Hoewel dit concept is beschreven bij andere kankers, is nog niet aangetoond dat de tumorproliferatieve index de hoeveelheid immuuninfiltraat in GIST beïnvloedt. PDGFRA-mutante GIST blijkt een lagere proliferatieve index te hebben in vergelijking met KIT-mutante GIST ( 46 ). Wanneer echter wordt gecontroleerd op mutatie-driver, verliest de relatie tussen mitotische snelheid en immuuncelinfiltratie in UPG GIST's aan betekenis, wat suggereert dat oncogene driver mogelijk belangrijker is voor het dicteren van het immuuninfiltraat. In feite, vergelijking van UPG KIT- en PDGFRA-mutante GIST's onthulden verschillende cytokineprofielen, waarvan we veronderstellen dat ze kunnen bijdragen aan chemotaxis van immuuncellen. CXCL14 is een relatief recent geïdentificeerd chemokine met een duidelijke rol bij het aantrekken van immuuncellen (31, 32, 47). CXCL14 bleek significant opgereguleerd te zijn in PDGFRA-mutant vergeleken met KIT-mutante GIST's, niet alleen in ons cohort, maar ook in een eerder gepubliceerd cohort (30). Helaas is het bestuderen van deze correlatie een uitdaging gebleken, aangezien er momenteel geen PDGFRA-mutant GIST muismodel of mens PDGFRA-mutante GIST-cellijn om te onderzoeken wat een duidelijke biologische relatie lijkt te zijn tussen PDGFRA-tyrosinekinase-activering en CXCL14-secretie. Dus de implicatie van onze bevinding op dit moment blijft onduidelijk.

Het is duidelijk dat bij kankers met een groot aantal mutaties de mutatiebelasting van de tumor correleert met de respons van immunotherapie (33). De rol van neo-epitopen in de immuunrespons van kankers met een enkele oncogene mutatie (d.w.z. GIST) is echter niet beschreven. Tot onze verbazing produceerde bijna elke GIST-mutatie in ons cohort een neo-epitoop dat in staat is om met hoge affiniteit te binden aan patiëntspecifieke HLA klasse I, wat suggereert dat zelfs kankers met één mutatie een neo-epitoop kunnen genereren dat herkenbaar is door het immuunsysteem. We ontdekten dat de D842V mutatie produceerde 6 verschillende neo-epitopen met hoge affiniteit, die alleen in dit cohort aan 12 verschillende HLA-types van patiënten bonden, waarvan er één het meest voorkomende HLA-type is in de Verenigde Staten en bij blanke individuen (35, 36). Hoewel we niet hebben aangetoond dat deze neo-epitopen een immuunrespons produceerden bij deze patiënten, is het intrigerend dat GIST's met een groter immuuninfiltraat een mutatie lijken te hebben die peptiden genereert met een brede HLA-bindingsspecificiteit, wat suggereert dat deze mutatie van hogere kwaliteit kan zijn ( 37). Bovendien kunnen de HLA-specifieke bindingsaffiniteiten van neo-epitopen die worden gegenereerd door mutatiespecifieke GIST-subtypes die in dit onderzoek zijn gerapporteerd, een routekaart bieden voor patiëntenselectie in toekomstige neoantigeenvaccinatieonderzoeken.

We hebben machinaal leren gebruikt om belangrijke verschillen te identificeren en de expressie van immuungerelateerde genen tussen PDGFRA- en KIT-mutante GIST's. Het genereren van een op genexpressie gebaseerd immuunprofiel dat nauwkeurig voorspelde: KIT- of PDGFRA-mutant genotype ondersteunt niet alleen onze hypothese dat het genotype het immuuninfiltraat kan beïnvloeden, maar introduceert ook een andere methode waarmee de immuunlandschappen van KIT- en PDGFRA-mutante tumoren kunnen leiden tot meer gepersonaliseerde kankerimmunotherapie. Het is niet verrassend dat CXCL14 een topfunctie bleek te zijn van PDGFRA-mutante GIST, wat opnieuw suggereert dat CXCL14-expressie oncogenspecifiek is en mogelijk verantwoordelijk is voor de waargenomen verschillen in immuuninfiltratie en activiteit. TGFBR1, TNFSF9, MICA, TNFRSF25, CD96, IDO, TNFSF14, KDR en TNFRSF9 droegen allemaal bij aan de voorspellende capaciteit van de modellen voor immuunprofilering, wat resulteerde in >90% diagnostische nauwkeurigheid in onze testset en in 83% van de CINSARC-validatieset . We hebben eerder het belang van IDO aangetoond bij het dicteren van het immuunfenotype van GIST (13). De rol van NK-cellen en de aanvullende immuunmodulerende receptoren die in deze studie zijn geïdentificeerd, moeten verder worden onderzocht.

Omdat immunotherapie nog geen werkzaamheid heeft aangetoond bij gevorderde en gemetastaseerde GIST (48), hebben we geprobeerd de immuunprofielen van PD-1-hoge en PD-L1-hoge GIST's in ons hele GIST-cohort te onderzoeken om zowel therapeutische mogelijkheden als potentiële barrières voor effectieve immunotherapie. CD27 bleek een belangrijke voorspellende factor te zijn voor hoge PD-1-expressie in ons random forest-model, dat hoge PD-1-expressie correct identificeerde in 93% van ons testende GIST-cohort. Agonistische CD27-antilichamen bestaan ​​al en hebben in andere modellen werkzaamheid aangetoond met anti-PD-1, wat suggereert dat dit een effectieve strategie voor GIST kan zijn (49). Evenzo waren de co-stimulerende en controlepuntreceptoren CD40 en BTLA, samen met het immuuncontrolepuntligand PDCD1LG2 en het MHC klasse I-eiwit MICB kenmerken die voorspellend zijn voor hoge PD-1-expressie. We hebben eerder aangetoond dat CD40-ligatie de antitumorimmuniteit in onze Kit exon 11 muismodel (17), en deze andere receptoren moeten in toekomstige onderzoeken worden overwogen.

Met name het toepassen van ons PD-1-model op het externe CINSARC-cohort resulteerde in slechts 67% nauwkeurigheid, hoewel ons PD-L1-model, waarin dezelfde methodologie werd gebruikt, nauwkeuriger was (92%). Een reden kan te maken hebben met de kleine steekproefomvang van het externe cohort. Deze modellen identificeren echter doelen met hoge prioriteit voor verdere experimentele validatie.

Ten slotte bleek de expressie van belangrijke antigeenpresenterende machines, waaronder B2M, PDCD1LG2, HLA-DRA en TAP, zeer voorspellend te zijn voor PD-L1-expressie, niet alleen in ons cohort (86% nauwkeurigheid) maar ook in het externe CINSARC GIST-cohort ( 92% nauwkeurigheid), wat een tumorcelspecifiek mechanisme suggereert om neoepitooppresentatie te koppelen aan immuunsuppressie. Een vergelijkbare bevinding is waargenomen in met HIV geïnfecteerde cellen, waar MHC klasse I-machines gelijktijdig met PD-L1 werden opgereguleerd (50). Dit is een belangrijk concept om te overwegen, aangezien pogingen om PD-L1 te blokkeren kunnen resulteren in tumorcelveranderingen die ook de MHC klasse I-antigeenpresentatie neerwaarts reguleren, wat essentieel is voor de CD8+ T-cel-gemedieerde immuunrespons. Van hoge PD-L1-expressie is onlangs ook aangetoond dat het onafhankelijk correleert met een slechtere prognose bij wekedelensarcomen, wat werd toegeschreven aan een verhoogde mate van immuunuitputting, onderdrukking en negatieve regulatie (51). Daarentegen kunnen pogingen om de antigeenpresentatie te verbeteren met behulp van neoantigeen-peptidevaccinatie of GM-CSF tot expressie brengende tumorcelvaccins PD-L1-remming vereisen.

Uiteindelijk wordt het steeds duidelijker dat immunotherapie een specifieke aanpak vereist, niet alleen gericht op het tumortype, maar ook op de tumorspecifieke immuunmicro-omgeving. Door middel van RNA-Seq en 4 getrainde machine learning-modellen hebben we belangrijke en consistente verschillen in het immuunlandschap van GIST's gekarakteriseerd die worden aangedreven door verschillende oncogene mutaties, waarvan we denken dat ze kunnen helpen bij het begeleiden van toekomstige immunotherapie-onderzoeken in GIST.

Menselijke GIST-monsters en klinisch-pathologische kenmerken. Verse chirurgische monsters werden onmiddellijk na resectie verzameld en snel ingevroren in vloeibare stikstof. RNA werd geëxtraheerd met behulp van de RNeasy-kit (QIAGEN) volgens het door de kit gespecificeerde protocol. Klinisch-pathologische kenmerken werden verkregen via kaartbeoordeling van patiënt- en pathologische dossiers.

Bio-informatica. Poly(A)-selectie en RNA-Seq van de volgende generatie werden uitgevoerd op een Illumina HiSeq 2500-platform door de kernfaciliteit van MSKCC Integrated Genomics Operations. Er werden voor elk monster minimaal 40-50 miljoen 50-bp gepaarde uitlezingen verkregen. RNA-Seq-uitlezingen werden verwerkt met Trimmomatic v0.36 ( 52 ) met behulp van de volgende parameters die worden aanbevolen voor gepaarde Illumina-sequencing: PE - phred33, ILLUMINACLIP: TruSeq3-PE.fa:2:30:10, LEADING: 3, TRAILING: 3, SLIDINGWINDOW: 4:15 en MINLEN: 36. Sequencing-uitlezingen werden vervolgens uitgelijnd met het menselijke genoom (versie hg38_r88) en tellingen op genniveau werden berekend met behulp van STAR-versie 2.6.0a ( 53 ). Leestellingen werden vervolgens genormaliseerd en DGE-analyses werden uitgevoerd op aangegeven groepen met behulp van het R-softwarepakket DESeq2 (54, 55). GSEA werd uitgevoerd met behulp van het java GSEA-softwarepakket (versie 3.0) en Molecular Signatures Database (MSigDB) versie 6.2 (Broad Institute) (56, 57).

De activiteit van cytotoxische T-cellen in elk monster werd geschat met behulp van de CYT-score, die werd berekend uit het geometrische gemiddelde van de genormaliseerde leestellingen voor perforine (PRF1) en granzyme A (GZMA) zoals eerder beschreven (23). Het immuuncelcompartiment van deze monsters werd verder gekwantificeerd uit de genormaliseerde leestellingen met behulp van het R-pakket ESTIMATE (23). Het ESTIMATE-algoritme bestaat uit een niet-immune "stromale score"-parameter en een "immuunscore" -parameter. In dit werk verwijzen we naar ESTIMATE-score als de immuunscore-subcomponent van het ESTIMATE-algoritme, dat de mate van immuuncelinfiltratie in tumorweefsel afleidt op basis van expressiegegevens van 141 immuungerelateerde genen waarvan eerder is aangetoond dat ze correleren met de aanwezigheid van leukocyten ( 24). De absolute hoeveelheden van individuele immuuncelsubtypes werden afgeleid uit de genormaliseerde leestellingen met behulp van het CIBERSORT-programma (29), dat gebruik maakt van een extern gevalideerde leukocytgensignatuurmatrix (LM22) van 547 genen die is ontworpen om 22 celfenotypes te onderscheiden, waaronder 7 T-celtypes. , B-cellen, macrofagen, monocyten en NK-cellen (29). Heatmaps van genexpressiegegevens met bijbehorende klinisch-pathologische kenmerken zijn gemaakt met het R-pakket ComplexHeatmap (58). ssGSEA's werden uitgevoerd met behulp van het R-softwarepakket GSVA (59).

Neoepitopen en HLA-voorspelling. HLA-haplotypes van patiënten werden afgeleid met behulp van het programma seq2HLA (60). Voor neo-epitoopidentificatie werden de aminozuursequenties van patiëntspecifieke mutaties toegewezen aan combinaties van 8-, 9- en 10-meer-peptiden, waarbij de mutatie op elke aminozuurpositie werd geëvalueerd. Elk patiëntspecifiek peptide werd vervolgens getest met het respectievelijke patiëntspecifieke HLA-type met behulp van NetMHCPan 3.0 om potentiële neo-epitopen met hoge affiniteit te identificeren (61, 62). Neoepitooplast werd gedefinieerd als elk epitoop met een voorspelde bindingsaffiniteit binnen de top 2% in vergelijking met 400 willekeurige natuurlijke peptiden, zoals aanbevolen door NetMHCPan 3.0. Neo-epitopen met hoge affiniteit werden verder gefilterd met behulp van een bindingsaffiniteitsdrempel van 500 nM, terwijl neo-epitopen met zeer hoge affiniteit werden gedefinieerd als hebbende < 150 nM bindingsaffiniteit. Ten slotte hebben we, om mutatiespecifieke neo-epitoopbindingsdiversiteit te onderzoeken, mutatiespecifieke neo-epitopen breder getest tegen alle gevalideerde NetMHCPan 3.0 HLA-typen en deze gevisualiseerd met behulp van heatmap.2 in R.

Machinaal leren. Willekeurige bosmodellering met 5-voudige kruisvalidatie werd uitgevoerd op de trainingsset met behulp van het softwarepakket caret voor R om topvoorspellers te identificeren (38). Honderdzeventien kenmerken, bestaande uit genormaliseerde leestellingen van verschillende immuungenen, en bioinformatisch afgeleide CIBERSORT-scores werden gebruikt om het model te trainen (aanvullende tabel 5). Voor karakterisering van PDGFRA-specifieke immuunkenmerken, KIT- en PDGFRA-mutante GIST-monsters werden eerst willekeurig verdeeld in trainingssets (80% van de monsters) en testsets (20% van de monsters). De trainingsgegevensset werd gebruikt om een ​​willekeurige classifier voor machine learning in het bos te trainen met behulp van 5-voudige kruisvalidatie. Tijdens elk van de 5 vouwen werd een willekeurig bosmodel getraind op 80% van de trainingsgegevens, en de nauwkeurigheid, gevoeligheid en specificiteit van de training werden berekend, de resterende 20% van de trainingsgegevens werden vervolgens gebruikt om de testnauwkeurigheid, gevoeligheid en specificiteit. Ten slotte werd ons getrainde machine learning-model toegepast op de 20%-testset en op het externe validatie CINSARC-cohort (N = 12 ref. 39 ) om de modelnauwkeurigheid te beoordelen op een naïeve steekproefset.

Gezien de totale steekproefomvang van onze cohort en om overfitting van ons model te voorkomen, werd willekeurige bosmodellering met 5-voudige kruisvalidatie opnieuw uitgevoerd op de trainingsset met alleen de top 6 geïdentificeerde kenmerken, en het model werd vervolgens toegepast op de naïeve testset en CINSARC externe dataset om de nauwkeurigheid van het model te beoordelen. Het belang van een kenmerk is een variabele die wordt berekend door het caret-pakket, waarbij een hoger getal aangeeft dat het kenmerk belangrijker is voor de nauwkeurigheid van het model (38). De verwarringsmatrices die in de figuren 6 en 7 worden getoond, weerspiegelen het model, met de hoogste nauwkeurigheid na vijfvoudige kruisvalidatie en optimalisatie door caret. De P waarde die wordt gebruikt door caret wordt berekend met behulp van een exacte binomiale test waarbij een eenzijdige test wordt uitgevoerd om te bepalen of de nauwkeurigheid van het model beter is dan de "geen informatiesnelheid", die het aandeel gegevens binnen de meerderheidsklasse vertegenwoordigt.Voor het genereren van PD-1- en PD-L1-specifieke immuunkenmerken werd dezelfde benadering gebruikt, waarbij de groepen werden opgesplitst in hoge en lage expressie op basis van mediaan PD-1 (mediaan: 14,1) of PD-L1 (mediaan: 209,5) genormaliseerde leestellingen in de trainingsset.

qRT-PCR. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit snel ingevroren menselijke tumoren, omgekeerd getranscribeerd en geamplificeerd met PCR TaqMan-sonde voor CXCL14 (Hs01557413_m1). qRT-PCR werd uitgevoerd met behulp van een ViiA 7 realtime PCR-systeem (Applied Biosystems). De gegevens werden berekend met de 2-ΔΔCt-methode zoals beschreven in het protocol van de fabrikant en werden uitgedrukt als een veelvoud van de toename ten opzichte van de GIST-T1- of GIST-882-cellijncontrole (63, 64).

Flowcytometrie. Flowcytometrische analyse werd onmiddellijk uitgevoerd op het moment van monsterafname op vers verkregen menselijke GIST-monsters na tumordissociatie zoals eerder beschreven (15). Cellen werden geanalyseerd op een BD FACSAria of LSRFortessa (BD Biosciences). Een humaan-specifiek antilichaam voor CD45 (2D1) werd verkregen van BD Biosciences.

Western-blot-analyse. Eiwit van snel ingevroren GIST-weefsel of cellijnen werd geanalyseerd zoals eerder beschreven (18). Antilichamen gebruikt tegen GAPDH (kloon D16H11) en PD-L1 (kloon E1L3N) werden gekocht bij Cell Signaling Technology.

Histologie. Vers verzamelde tumoren werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde, ingebed in paraffine en in secties van 5 m gesneden. CD45 (PD7/26 + 2B11) en CD8 (SP57) kleuring werd uitgevoerd door de MSKCC Molecular Cytology Core. Dia's werden gescand met MIRAX SCAN (Zeiss) en gefotografeerd met Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd.). Voor kwantificering van CD45- en CD8-kleuring werd het tellen van cellen handmatig op een geblindeerde manier uitgevoerd bij een vergroting van × 20 (HPF). Het aantal CD45+- en CD8+-cellen per HPF werd berekend door 5 HPF's per tumor te onderzoeken en het gemiddelde per tumor uit te zetten.

Statistieken. Sommige gegevens en grafieken zijn gemaakt met Prism 7.0 (Figuur 2, A, B en E Figuur 4, C en D Figuur 5, A en B Figuur 6, B en E Figuur 7, B en E GraphPad Software). Statistische tests werden uitgevoerd zoals beschreven in de figuurlegenda's, en waar mogelijk aangepast P waarden berekend door DESeq2 werden gebruikt om te beoordelen op significantie, met een drempel van aangepast P < 0,05. Voor figuur 7, B en E werd een FDR-benadering gevolgd met behulp van de Benjamini, Krieger en Yekutieli 2-traps step-up-methode, met een Q waardedrempel van <0.1 om te beoordelen op significantie.

Gegevensbeschikbaarheid en CINSARC externe validatie GIST-cohort. RNA-Seq-gegevens die in dit werk worden gepresenteerd, zijn beschikbaar via het Sequencing Read Archive onder toegangsnr. PRJNA521803. RNA-Seq-gegevens van vers ingevroren GIST-tumoren van het openbaar beschikbare CINSARC-cohort (39) werden verkregen uit het Sequence Read Archive onder toegangsnr. SRP057793.

Studie goedkeuring. Tumorspecimens werden verkregen van 2011 tot 2017 van 75 GIST-patiënten die chirurgische resectie ondergingen bij MSKCC. Voorafgaand aan de resectie gaven patiënten schriftelijke geïnformeerde toestemming onder een door de IRB goedgekeurd protocol. Met behulp van een prospectief onderhouden institutionele database werden klinisch-pathologische kenmerken gedocumenteerd en versleuteld, en al het onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van de Health Insurance Portability and Accountability Act.

GAV, TGB, BDM en RPD hebben bijgedragen aan de studie van conceptie en ontwerp. GAV, TGB en RPD hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van onderzoeksmethodologie. GAV, TGB, BDM, JQZ, JKL, NJP, SZ, ML en FC hebben bijgedragen aan het verzamelen van gegevens en het uitvoeren van experimenten. GAV, TGB, ML, RLG, NJP, FR en RPD hebben bijgedragen aan de analyse en interpretatie van gegevens. GAV, TGB en RPD hebben bijgedragen aan het schrijven, beoordelen en herzien van het manuscript. Alle auteurs hebben opmerkingen beoordeeld en bijgedragen die zijn opgenomen in de definitieve versie van dit manuscript. Studiebegeleiding werd verzorgd door RPD.

De onderzoekers werden ondersteund door NIH-subsidies R01 CA102613 en T32 CA009501, The David Foundation, Betsy Levine-Brown en Marc Brown, David en Monica Gorin, en het GIST Cancer Research Fund (RPD) en Division of Loan Repayment NIH grant L30 TR002111 (GAV ). De Molecular Cytology Core Facility bij MSKCC werd ondersteund door Cancer Center Support Grant P30 CA008748. Wij danken Russell Holmes voor logistieke en administratieve ondersteuning.

Belangenverstrengeling: De auteurs hebben verklaard dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.


De rol van CD4-T-cellen bij HIV-infectie

Een van de raadsels van een HIV-infectie is dat de cellen die bedoeld zijn om een ​​immuunafweer op gang te brengen, dezelfde cellen zijn die het doelwit zijn van een infectie met HIV. Als retrovirus moet HIV bepaalde "gastheercellen" infecteren om kopieën van zichzelf te kunnen maken. CD4-cellen zijn hiervoor het belangrijkste doelwit tijdens een infectie.

Tijdens infectie hecht HIV zich aan deze helpercellen, waardoor het genetische materiaal binnenin wordt geleegd, zodat de genetische codering van de gastheer kan worden gewijzigd om andere HIV-virions te produceren. Daarbij wordt de gastheer CD4-cel gedood. Het vermogen van de geïnfecteerde persoon om een ​​immuunafweer te activeren, wordt geleidelijk uitgeput tot een punt dat zijn lichaam openstaat voor opportunistische infecties.

De dynamiek van HIV is zodanig dat "killer" CD8 T-cellen steeds meer blind worden in een voortschrijdende infectie en uiteindelijk niet meer in staat zijn om te gaan met de groeiende populatie van HIV (gemeten aan de hand van de viral load).

Als een hiv-infectie niet wordt behandeld, zal het immuunsysteem in alle, maar zeldzame gevallen, volledig instorten (of worden aangetast).


Te veel zout verstoort de energieproductie van het lichaam, verandert de immuuncellen

BERLIJN, Duitsland — Zout is de ultieme smaakversterker, maar het heeft een lange geschiedenis als slecht voor je gezondheid. Van verhardende slagaders tot verergering van een opgeblazen gevoel, artsen adviseren patiënten doorgaans om hun gebruik van de zoutvaatje te beperken. Nu onthult een nieuwe studie wat zout eigenlijk doet met menselijke cellen, waardoor het ongezond kan worden om te consumeren.

Onderzoekers van het Max Delbrück Centrum voor Moleculaire Geneeskunde in de Helmholtz Association (MDC) zeggen dat het consumeren van natrium de energieproductie van mitochondriën (de energiecentrales van cellen) beïnvloedt. Het verstoren van deze energiebalans heeft ernstige gevolgen voor afweercellen, die daardoor niet meer goed werken.

In 2015 leidde MDC-professor Dominik Müller een onderzoek waarin werd ontdekt dat hoge zoutgehaltes in het bloed de activering en functie van monocyten beïnvloeden. Dit zijn de voorlopers van macrofagen, dit zijn gespecialiseerde cellen die schadelijke bacteriën in het lichaam detecteren en vernietigen.

"Maar we wisten niet precies wat er in de cellen gebeurde", legt dr. Sabrina Geisberger van MDC uit in een universitaire publicatie.

Zoutverbruik dempt de bouwstenen van het energieproductieproces

In de nieuwe studie onderzochten Geisberger en een internationaal team het metabolisme van immuuncellen die werden blootgesteld aan hoge niveaus van zout. De resultaten laten zien dat de veranderingen al binnen drie uur beginnen.

“Het verstoort de ademhalingsketen, waardoor de cellen minder ATP produceren en minder zuurstof verbruiken”, zegt de onderzoeksleider.

Dus wat betekent dat precies voor je gezondheid? ATP (adenosinetrifosfaat) is de '8220universele brandstof'8221 die de lichaamscellen van energie voorziet. Het levert de energie die mensen nodig hebben om 'chemisch werk' uit te voeren, zoals het maken van eiwitten en andere gezonde moleculen. Dit werk geeft mensen de biologische hulpmiddelen die het lichaam nodig heeft om de spieren aan te drijven en de stofwisseling op peil te houden.

De mitochondriën (de batterijen van de cel) produceren ATP via een biochemisch proces dat de ademhalingsketen wordt genoemd.

"Zout remt heel specifiek complex II in de ademhalingsketen", voegt Geisberger toe.

Wanneer dit gebeurt, zorgen lagere energieniveaus ervoor dat monocyten anders rijpen dan normaal.

“De fagocyten, die tot taak hebben ziekteverwekkers in het lichaam te identificeren en te elimineren, waren in staat om infecties beter te bestrijden. Maar dit kan ook ontstekingen bevorderen, wat het cardiovasculaire risico zou kunnen verhogen”, legt Müller uit.

Een stuk pizza zal niet veel pijn doen, maar overdrijf het niet

Onderzoekers toonden ook aan hoe meer zout de fagocyten van levende patiënten op dezelfde manier beïnvloedt. Het team bestudeerde een groep gezonde mannen die gedurende 14 dagen zes gram zout aan hun dieet (in tabletvorm) toevoegden. In een ander experiment analyseerden de auteurs van het onderzoek ook de monocyten in het bloed van eters die pizza aten van een Italiaans restaurant.

De resultaten tonen aan dat het dempende effect op mitochondriën niet alleen komt van langdurig zoutgebruik, een enkele plak pizza verandert de cellen! Onderzoekers namen drie en acht uur na hun maaltijd bloed af van de deelnemers. Terwijl de tests aantonen dat een verhoogde zoutinname na drie uur effect heeft, was de impact na acht uur nauwelijks merkbaar.

"Dat is een goed ding. Als het een langdurige storing was geweest, zouden we ons zorgen maken dat de cellen lange tijd niet genoeg energie krijgen”, merkt Müller op.

Daarom zeggen de auteurs van het onderzoek dat de impact van een zoute snack niet zal leiden tot permanente celveranderingen. Ze voegen er echter aan toe dat mensen dat nieuws letterlijk met een korreltje zout moeten nemen en niet continu voedsel met veel natrium moeten eten. Hun resultaten konden de mogelijkheid niet uitsluiten dat langdurige zoutinname zou kunnen leiden tot langdurige mitochondriale beschadiging.

Ter referentie: de pizza in het onderzoek bevatte 10 gram zout. Voedingsdeskundigen raden volwassenen aan om hun zoutinname op vijf of zes gram per dag te houden.

De grote impact van kleine ionen

Studie auteurs merken op dat hun studie ook laat zien hoe grootte geen factor is als het gaat om grote effecten op de menselijke gezondheid. Natriumionen zijn enkele van de kleinste moleculen in de natuur.

"Wanneer deze ionen de mitochondriën binnenstromen - en dat doen ze onder verschillende fysiologische omstandigheden - regelen ze het centrale deel van de elektronentransportketen", zegt Dr. Stefan Kempa van het Berlin Institute for Medical Systems Biology.

Het team gaat nu onderzoeken of zout de energieproductie in andere soorten cellen beïnvloedt. Professor Markus Kleinewietfeld van de Universiteit Hasselt zegt dat het zeer waarschijnlijk is dat onderzoekers hetzelfde effect zullen ontdekken, omdat mitochondriën in elke menselijke cel voorkomen, behalve in rode bloedcellen.

Hoewel er nog steeds enkele vragen zijn over hoe alle cellen omgaan met de natriumstroom naar de mitochondriën, geloven onderzoekers dat hun bevindingen opnieuw bevestigen hoe slecht zout kan zijn voor de menselijke gezondheid.

“Natuurlijk is het eerste waar je aan denkt het cardiovasculaire risico. Maar meerdere onderzoeken hebben aangetoond dat zout op verschillende manieren immuuncellen kan beïnvloeden. Als zo'n belangrijk cellulair mechanisme voor een lange periode wordt verstoord, kan dit een negatief effect hebben - en mogelijk ontstekingsziekten van de bloedvaten of gewrichten of auto-immuunziekten veroorzaken", besluit Kleinewietfeld.