Informatie

Hoe worden 3D-beelden met lichtplaatmicroscopie en hun berekende secties opgebouwd uit stapels 2D-beelden?


De videomicroscopie van iBiology Techniques: Dual-View Inverted Selective Plane Illumination (diSPIM) (Hari Shroff) beschrijft lichte plaatmicroscopie en de verbetering van de resolutie door de introductie van dual-view (twee camera's).

Wat er gebeurt, is dat het object willekeurig beweegt in 3D, en dus voor elk frame worden de stapels gebruikt om een ​​3D-beeld te genereren, en vervolgens wordt het gederoteerd om een ​​weergave te synthetiseren in een vlak dat aan het object is bevestigd, in plaats van de microscoop.

Is er een eenvoudige manier om te begrijpen hoe deze beeldstapels worden verwerkt om een ​​soepele 3D-reconstructie te verkrijgen die vervolgens rekenkundig kan worden gesegmenteerd? Is er een soort van interpolatie of modellering van structuur aan de limiet van de diepteresolutie?

In plaats van een volledige uitleg, die waarschijnlijk redelijk wiskundig en diepgaand zou zijn, zou een eenvoudigere uitleg plus een verwijzing of link naar een meer diepgaande beschrijving een betere manier kunnen zijn om me op het juiste spoor te helpen.


Volgens hun website dispim.org gebruiken ze registratiesoftware zoals de ImageJ Multiview-Reconstruction Plugin. Afgaande op de beschrijvingen, gebruikt deze plug-in de uitlijning van meerdere punten in de verschillende hoekafbeeldingen (zoals fluorescerende kralen die in het medium of de celkernen zijn geïntroduceerd) door rigide transformatie en deconvolueert vervolgens de 3D-informatie met behulp van de puntspreidingsfuncties.

Als u uw optische systeem kent (microscooplenzen enz.), kunt u berekenen hoe het beeld van een puntlichtbron eruit zou zien in het beeld. Dit kan worden gebruikt om de werkelijke positie van uw lichtbron uit de afbeelding omgekeerd te berekenen en een afbeelding te reconstrueren zonder de vervormingen.

Van daaruit krijgen ze een volumetrisch beeld dat in elk coördinatensysteem kan worden geprojecteerd. Ik raad aan om de video's op de plug-inpagina te bekijken om een ​​idee te krijgen hoe dit werkt.


Light sheet theta-microscopie voor snelle beeldvorming met hoge resolutie van grote biologische monsters

Vooruitgang in weefselzuivering en moleculaire labelingsmethoden maken ongekende optische toegang tot grote intacte biologische systemen mogelijk. Deze ontwikkelingen voeden de behoefte aan snelle microscopiebenaderingen om grote monsters kwantitatief en met hoge resolutie af te beelden. Hoewel lichte plaatmicroscopie (LSM), met zijn hoge planaire beeldsnelheid en lage fotobleking, effectief kan zijn, werd het opschalen naar grotere beeldvolumes belemmerd door het gebruik van orthogonale lichtbladverlichting.

Resultaten

Om deze fundamentele beperking aan te pakken, hebben we light sheet theta-microscopie (LSTM) ontwikkeld, die monsters uniform verlicht van dezelfde kant als het detectiedoel, waardoor limieten op laterale afmetingen worden geëlimineerd zonder de beeldresolutie, diepte en snelheid op te offeren. We presenteren een gedetailleerde karakterisering van LSTM en demonstreren de complementaire voordelen ervan ten opzichte van LSM voor snelle kwantitatieve beeldvorming met hoge resolutie van grote intacte monsters met een hoge uniforme kwaliteit.

Conclusies

De gerapporteerde LSTM-benadering is een belangrijke stap voor het snel kwantitatief in kaart brengen van de structuur en functie van zeer grote biologische systemen met hoge resolutie, zoals een opgehelderde dikke coronale plak van menselijke hersenen en uniform geëxpandeerde weefsels, en ook voor snelle volumetrische calciumbeeldvorming van zeer beweeglijke dieren, zoals Hydra, ondergaat niet-isomorfe lichaamsvormveranderingen.


VIPAR, een kwantitatieve benadering van 3D-histopathologie toegepast op lymfatische misvormingen

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Hägerling, R. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Scherzinger, A. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Dierkes, C. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Zoek artikelen van Martin-Almedina, S. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Schäfers, M. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Hinrichs, K. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Ostergaard, P. in: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Vestweber, D. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Zoek artikelen van Mansour, S. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Jiang, X. in: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

Vind artikelen van Mortimer, P. in: JCI | PubMed | Google geleerde

1 Mammalian Cell Signaling Laboratory, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Münster, Duitsland.

2 Groep patroonherkenning en beeldanalyse, afdeling Informatica, en

3 Visualization and Computer Graphics Group, Departement Computerwetenschappen, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

4 Molecular and Clinical Sciences Institute, St. George's University of London, Londen, Verenigd Koninkrijk.

5 Afdeling Vasculaire Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Münster, Duitsland.

6 Europees Instituut voor Moleculaire Beeldvorming, Universiteit van Münster, Münster, Duitsland.

7 DFG Cells-in-Motion Cluster of Excellence 1003, Münster, Duitsland.

8 Afdeling Dermatologie, Universitair Ziekenhuis van Münster, Münster, Duitsland.

Adrescorrespondentie aan: Friedemann Kiefer, Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, Röntgenstraße 20, D-48149 Münster, Duitsland. Telefoon: 43.251.70365.230 E-mail: [email protected]

ACHTERGROND. Gebrek aan onderzoeks- en diagnostische hulpmiddelen is een belangrijke factor die heeft bijgedragen aan het onvermogen om lymfoedeem en andere lymfatische aandoeningen mechanisch te begrijpen om effectieve medicamenteuze en chirurgische therapieën te ontwikkelen. Een moeilijkheid was het begrijpen van de ware veranderingen in de pathologie van lymfevaten uit standaard 2D-weefselcoupes.

METHODEN. VIPAR (volume lop informatie gebaseerde histoPathologisch eenanalyse door 3D Reconstruction and data-extractie), een op lichtbladmicroscopie gebaseerde benadering voor de analyse van weefselbiopten, is gebaseerd op digitale reconstructie en visualisatie van microscopische beeldstapels. VIPAR maakt semi-geautomatiseerde segmentatie van het vaatstelsel en daaropvolgende niet-vooringenomen extractie van karakteristieke vaatvorm en connectiviteitsparameters mogelijk. We hebben VIPAR toegepast om biopsieën van gezonde lymfoedemateuze en lymfangiomateuze huid te analyseren.

RESULTATEN. Digitale 3D-reconstructie zorgde voor een direct visueel interpreteerbare, uitgebreide weergave van de lymfevaten en bloedvaten in de geanalyseerde weefselvolumes. De meest opvallende kenmerken waren verstoorde lymfevaten in de lymfoedemateuze huid en een hyperplasie (4,36-voudige toename van het lymfevatvolume) in de lymfangiomateuze huid. Beide afwijkingen werden gedetecteerd door de connectiviteitsanalyse op basis van geëxtraheerde vorm- en structuurgegevens van het vat. De kwantitatieve evaluatie van geëxtraheerde gegevens onthulde een significante vermindering van de lengte van het lymfatische segment (51,3% en 54,2%) en rechtheid (89,2% en 83,7%) voor respectievelijk lymfoedemateuze en lymfangiomateuze huid. De lengte van de bloedvaten was significant toegenomen in het lymfangiomateuze monster (239,3%).

CONCLUSIE. VIPAR is een op volume gebaseerde methode voor het extraheren en analyseren van gegevens voor weefselreconstructie die met succes onderscheid maakt tussen gezonde en lymfoedemateuze en lymfangiomateuze huid. De toepassing ervan is niet beperkt tot de vasculaire systemen of de huid.

FINANCIERING. Max Planck Society, DFG (SFB 656) en Cells-in-Motion Cluster of Excellence EXC 1003.

Lymfevaten zijn onmisbaar voor het behoud van de plasma- en weefselvochtbalans, voor weefselimmunosurveillance en voor vethomeostase (1). De homeostase van weefselvocht is afhankelijk van een delicaat evenwicht tussen microvasculaire filtratie (lymfebelasting) en lymfatische resorptie (lymfedrainage). Verstoringen in de lymfatische functie kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van hart- en vaatziekten, infecties, kanker en obesitas. Verminderde lymfedrainage resulteert specifiek in lymfoedeem (2). Het is pas zeer recent dat lymfevaten worden beschouwd als een actieve bijdrage aan deze medische aandoeningen (3). Een disfunctioneel lymfestelsel kan de ontwikkeling van hypertensie en atherosclerose bevorderen ( 4 , 5 ), en een verminderde lymfefunctie kan getroffen personen vatbaar maken voor bacteriële en schimmelinfecties (6).

Ondanks het ernstige effect van lymfoedeem op de kwaliteit van leven van getroffen personen, bestaat er momenteel geen curatieve of moleculair gerichte therapie (7). Lymfoedeem komt veel vaker voor dan algemeen wordt aangenomen (8, 9). Het kan worden veroorzaakt door onbedoeld of opzettelijk trauma aan de lymfeafvoerende paden, bijvoorbeeld de behandeling van kanker, maar er is een verborgen lymfoedeem-epidemie als gevolg van obesitas en slechte mobiliteit (10). Bovendien veroorzaken wereldwijde infecties, zoals filariasis, miljoenen gevallen en kan lymfoedeem ook worden veroorzaakt door genetische defecten. Recente vorderingen bij het identificeren van causale genen hebben ook informatie opgeleverd over de functie van deze genen. Genetische factoren kunnen inderdaad verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van vele secundaire vormen van lymfoedeem, bijv. borstkankergerelateerd lymfoedeem (11).

Een groot probleem in de kliniek is het gebrek aan onderzoeksinstrumenten om de mechanismen van lymfoedeem te begrijpen. Het gebrek aan technieken voor onderzoek en diagnose is een belangrijke factor die heeft bijgedragen aan het niet ontwikkelen van effectieve medicamenteuze en chirurgische therapieën. Bovendien hebben beperkte onderzoeken ook geleid tot het falen om klinisch onderscheid te maken tussen verschillende fenotypes van lymfoedeem, waardoor een specifieke diagnose moeilijker wordt.

De huidhistopathologie geassocieerd met lymfoedeem wordt traditioneel geanalyseerd in gekleurde paraffinecoupes, met een sterke nadruk op de prominente aspecten hyperkeratose, fibrotische veranderingen en inflammatoire infiltraties. In deze setting zijn lymfevaten echter moeilijk te onderscheiden, en inderdaad, de schaarste aan beeldvormende modaliteiten voor de beoordeling van de functie en structuur van het lymfestelsel is een significante beperking geweest (7). Groter transport van lymfevaten kan alleen worden afgebeeld door lymfoscintigrafie en indocyanine-groen (ICG) lymfografie (12, 13). Lymfoscintigrafie biedt functionele informatie over lymfetransport binnen een ledemaat, maar kan niet worden gebruikt om lymfevaten in beeld te brengen. Deze benadering kan echter worden gebruikt om de accumulatie van tracer in regionale lymfeklieren binnen regionale lymfeklieren in beeld te brengen. ICG-lymfografie brengt het contrast in bloedvaten en niet de vaatwand in detail in beeld en kan lymfedrainageroutes en contractiliteit van de bloedvaten in gelokaliseerde gebieden in beeld brengen (14).

Samen bieden lymfoscintigrafie en ICG-lymfangiografie belangrijke informatie over de lymfatische functie en de grove architectuur van het verzamelen van lymfevaten. Fluorescentiemicrolymfangiografie (FML) en intravitale kleurstoffen kunnen in vivo initiële lymfevaten in de huid in beeld brengen (15, 16). Intravitale kleurstoffen worden nog steeds gebruikt om lymfedrainageroutes naar de lymfeklieren in beeld te brengen om de schildwachtklier te identificeren voorafgaand aan biopsie bij kankerbehandeling. FML is geen standaardonderzoek in de klinische setting. Deze waardevolle klinische beeldvormingsmodaliteiten geven echter geen informatie over de pathologische details van de microcirculatie, die met name relevant zijn voor een beoordeling van de functie van de initiële lymfevaten.

Dergelijke details bij subcellulaire resolutie worden onthuld in histologische secties, die door middel van immunohistochemie met behulp van positief identificerende antilichamen het unanieme onderscheid van bloed- en lymfevaten mogelijk maken. Vanwege de beperkte informatie die is opgenomen, is extractie van vasculaire parameters, zoals ruimtelijke structuur, connectiviteit en netwerkkenmerken, onmogelijk uit de standaard 2D-secties in cellulaire pathologie. Theoretisch zou de benodigde volume-informatie kunnen worden afgeleid door reconstructie van de 3D-vasculaire architectuur uit seriële secties. In de praktijk is deze benadering echter extreem arbeidsintensief en zijn de resultaten vaak onbevredigend vanwege het weefselverlies dat met coupes gepaard gaat en de vervorming van het monster.

In de afgelopen tien jaar beleefde vlakke verlichting of lichtplaatmicroscopie een schitterende renaissance en onderging een snelle technologische vooruitgang (17, 18). Lichtbladmicroscopen genereren in bepaalde gevallen aaneengesloten reeksen optische secties van geklaarde monsters met een volume tot een kubieke centimeter. Een volledige weergave van de ruimtelijke structuur van het monster kan worden gegenereerd door digitale reconstructie van deze beeldstapels. Dergelijke lichtbladmicroscopiemethoden zijn met succes gebruikt in experimentele 3D-reconstructies en analyse van ontwikkelingsprocessen, de vasculaire systemen en kankeronderzoek (18-22).

We stelden voor dat light-sheetmicroscopie zou kunnen worden gebruikt om de bloed- en lymfevatbedden in menselijke weefselmonsters te analyseren. We stelden de vraag of het mogelijk was om karakteristieke en onderscheidende parameters te extraheren die, met grote zekerheid, pathologische veranderingen zouden identificeren. In een haalbaarheidsstudie hebben we huidbiopten geanalyseerd van gezonde vrijwilligers en een patiënt die lijdt aan primair lymfoedeem geassocieerd met WILD (met wiekunst, depressieve celgemedieerde lmunitie, primair ikymfoedeem en anogenitale NSysplasie) syndroom (23). Om ten volle te profiteren van de kracht van lichtbladmicroscopie, hebben we beeldvorming van immunologisch gekleurde, optisch geklaarde huidbiopten met cellulaire resolutie (mesoscopie) gecombineerd met computergebaseerde reconstructie en visualisatie. Voor verdere analyse van de lymfatische vasculatuur werd de structuur van het lymfevat herkend door halfautomatische beeldanalyse (segmentatie) en werden karakteristieke parameters berekend na niet-vooringenomen gegevensextractie. Dit resulteerde in een volume lop informatie gebaseerde histoPathologisch eenanalyse door 3D Reconstructie- en gegevensextractieprocedure, waarnaar we verwijzen met het acroniem VIPAR.

Hier laten we zien dat VIPAR in biopsieën van een gezonde huid bloed- en lymfevaten met veel vertrouwen onderscheidde. De digitale 3D-reconstructie genereerde een getrouwe ruimtelijke weergave van beide scheepsbodems, die visueel direct toegankelijk en zeer informatief was. Met behulp van halfautomatische segmentatieroutines heeft VIPAR de basisvorm en connectiviteit van de vasculaire systemen geëxtraheerd, wat de daaropvolgende niet-vooringenomen bepaling van fundamentele bloed- en lymfevatparameters mogelijk maakte.

Analyse van patiënt-afgeleide monsters van lymfoedemateuze huid en een lymfangiomateuze laesie onthulde karakteristieke verschillen, die direct herkenbaar waren in de ruimtelijke reconstructie. De 3D-visualisatie bracht afwijkingen aan het licht, zoals de fragmentatie van lymfevaten die niet onmiddellijk herkenbaar waren in standaard 2D-histologische secties. Belangrijk is dat de visueel waarneembare structurele verschillen in de lymfevaten van lymfoedemateuze en lymfangiomateuze huid ook werden weerspiegeld in de parameters van de geëxtraheerde vaten. Daarom heeft VIPAR met succes ziektegerelateerde veranderingen in de structuur van lymfevaten gedetecteerd en gerapporteerd.

De op light-sheet microscopie gebaseerde benadering die we hier beschrijven, VIPAR, is niet beperkt tot huidmonsters, maar kan worden toegepast op alle menselijke weefsels die optisch kunnen worden gewist en waar geschikte protocollen voor volledige immunokleuring voor de onderzochte doelcelpopulatie beschikbaar zijn . VIPAR biedt een eenvoudige praktische route naar 3D-histopathologie, die in staat is om de analytische kloof tussen microscopische en macroscopische klinische beeldvormingstechnieken te overbruggen.

Light-sheet microscopie beeldvorming en computergebaseerde visualisatie bieden een getrouwe weergave van de 3D microvasculaire anatomie in de normale huid. Om diagnostisch potentieel aan te tonen, hebben we met immunofluorescentie gekleurde biopsieën van de menselijke huid gevisualiseerd met behulp van een LaVision UltraMicroscope II (aanvullend materiaal van figuur 1, A en B dat online beschikbaar is met dit artikel https://doi.org/10.1172/jci.insight.93424DS1 ). De resulterende beeldstapels omvatten ongeveer 2.000-4.000 optische secties op een afstand van 1-2 μm in z werden digitaal gereconstrueerd met behulp van het volumevisualisatiekader Voreen (aanvullende figuur 1C) (24, 25).

In onze volumereconstructies diende het endotheelcel-selectieve adhesiemolecuul 1 (ESAM1) (26) als een surrogaatmarker die de positie van bloedvaten afbakende. Hoewel tot expressie gebracht op alle endotheelceltypen, was de ESAM1-immunoreactiviteit op lymfatische endotheelcellen vergelijkbaar zwak (Figuur 1, A-D). Lymfevaten werden specifiek gekleurd door het mucine-type transmembraan-oppervlakte-eiwit podoplanine (PDPN) (27) en nucleaire expressie van de transcriptiefactor prospero homeobox-eiwit 1 (PROX1) (28), die beide de identificatie van lymfevaten met hoog vertrouwen mogelijk maakten ( Figuur 1, E–H).

Ruimtelijke rangschikking van bloed- en lymfevaten in de menselijke dermis gevisualiseerd door microscopie op basis van lichtplaten. Een hele-mount immunogekleurde menselijke huidbiopsie van een gezonde controle werd geanalyseerd met behulp van lichtbladmicroscopie (ultramicroscopie). Getoond worden projecties van 3D-computerreconstructies die zijn gegenereerd met behulp van het volumevisualisatieraamwerk Voreen. De afgebeelde antigenen zijn aangegeven in hun respectievelijke kleuren bovenop de afbeeldingen. ESAM1 diende als een algemene endotheelmarker, PROX1 fungeerde als een transcriptiefactormarker en podoplanine (PDPN) identificeerde lymfatische endotheelcellen. (EEN, C, E, en G) Visualisatie van het weefselvolume met de papillaire dermis bovenaan en de cutane plexus onderaan. (B, NS, F, en H) Digitaal geroteerde weergave van hetzelfde exemplaar, waarbij de vaten van de papillaire plexus worden getoond, gezien door de epidermis. (EEN en C) Papillaire en cutane lymfatische en bloedvatplexus zijn duidelijk zichtbaar (rode pijl, papillaire plexus groene pijl, cutane plexus). (B, F, en H) Kleppen, geïdentificeerd door gecondenseerde hoge PROX1-expressie (tussen tegenovergestelde witte pijlen), werden regelmatig gedetecteerd in verbindende lymfatische (precollector) vaten van de papillaire plexus. Blind eindigende lymfatische haarvaten zijn gemarkeerd met witte sterretjes. Schaalbalken: 100 m.

De 3D-visualisatie onthulde onmiddellijk prominente lymfatische plexussen in de papillaire laag (Figuur 1C, rode pijl) en aan de basis van de reticulaire laag (Figuur 1C, groene pijl) van de dermis. Beide plexussen waren verbonden door discontinu verdeelde bundels bloedvaten die vaak gepaard gingen met een lymfevat (Figuur 1A en aanvullende video 1). Kijkend naar de papillaire plexus en face door de epidermis, identificeerden we onmiddellijk blind eindigende lymfatische capillairen (aangeduid met asterisken in B, F en H van figuur 1) en gebieden die zijn samengesteld uit gecondenseerde PROX1-expressie lymfatische endotheelcellen (aangeduid met tegengestelde witte pijlen in B, F en H van figuur 1). Dergelijke condensaties (Figuur 1, G en H) werden vaak waargenomen naast vertakkingen van lymfevaten, wat extra bewijs levert voor onze veronderstelling dat ze lymfatische kleppen vertegenwoordigen.

Samenvattend, microscopische beeldvorming met lichtplaten met behulp van de UltraMicroscope II (LaVision) en daaropvolgende digitale volumereconstructie leverde een uitstekend en onmiddellijk interpreteerbaar beeld op van de ruimtelijke ordening van bloed- en lymfevaten in biopsieën van menselijke huid. Het uitzonderlijk hoge niveau van complexiteit dat wordt geboden door op volume gebaseerde analyses van vasculaire parameters bemoeilijkt de analyse en de interpretatie ervan. Daarom vroegen we ons af of het mogelijk was om automatisch gegevens te extraheren over de vorm en ruimtelijke structuur van de vasculaire systemen op een onbevooroordeelde manier die de beoordeling en beschrijving van de vaatsystemen zouden kunnen helpen, evenals de identificatie van minder voor de hand liggende verschillen tussen individuele monsters, waardoor diepere fenotypering van het monster mogelijk wordt.

VIPAR, een kwantitatieve benadering van histologie en histopathologie op basis van 3D-reconstructie en extractie van volumegegevens. Voortbouwend op de beschreven light-sheet imaging- en visualisatieprocedure ontwikkelden we een analytische workflow, die vervolgens de basis vormde van de 3D-weefselreconstructie, bestaande uit drie aanvullende basisprocedures: (a) segmentatie, (b) skeletonisatie en (c) functie extractie. We verwijzen naar deze volledige op lichtplaten gebaseerde beeldvorming, visualisatie en analysebenadering als VIPAR. In een poging om de kracht van VIPAR te testen, gebruikten we het voor de visualisatie, 3D-reconstructie en kwantitatieve analyse van de 3D microvasculaire anatomie in huidbiopten. De diepgaande analyse van de vaatbedden door VIPAR, die we hier rapporteren, is gebaseerd op semi-geautomatiseerde vaatsegmentatie gevolgd door extractie van karakteristieke vasculaire parameters op een volledig onbevooroordeelde manier (aanvullende figuur 1D).

VIPAR identificeert snel verschillen tussen gezonde en pathologische huidmonsters die uitgebreide analyse vereisen om te worden onthuld door standaard histopathologische methoden. Om het vermogen van VIPAR te testen om gezond en door ziekte aangetast weefsel te onderscheiden en mogelijk pathologieën te identificeren, hebben we niet alleen meerdere monsters van gezonde huid geanalyseerd, maar ook huidmonsters van lymfoedeem en lymfangiomen. Zieke monsters werden afgeleid van een 33-jarige Aziatische mannelijke patiënt met WILD-syndroom (aanvullende figuur 2, A-D) en lymfoedeem van de linkerarm en -been (aanvullende figuur 2, A en B). Lymfedrainage aan de linkerkant van het lichaam was ernstig verminderd, wat in feite resulteerde in een volledige functionele lymfvataplasie (aanvullende figuur 2C). Naast lymfoedeem was er een grote papillomateuze en gesteelde laesie op de linkerhiel, die klinisch een lymfangiomateuze verandering vertegenwoordigde (supplementaire figuur 2, E-G).We vergeleken daarom 3 huidbiopten: (a) normale huid (kuit) van drie gezonde vrijwilligers, (b) lymfoedeemhuid (kuit) en (c) de lymfangiomateuze huidknobbel.

We vergeleken de analytische kracht van VIPAR met een beoordeling van de aangetaste laesies met behulp van traditionele 2D-histologische secties. We hebben daarom cryosecties van 10 m immunologisch gekleurd met antilichamen gericht tegen ESAM1, PDPN en de endotheliale hyaluronanreceptor 1 (LYVE1) van het lymfevat (29). Secties waren ofwel afgeleid van de huid van een gezond been (Figuur 2A) of van lymfoedemateuze huid van het been (Figuur 2, B en C). Zoals eerder opgemerkt, werd ESAM1 bij voorkeur tot expressie gebracht op bloedvaten, terwijl LYVE1 en PDPN samen betrouwbaar de lymfatische vasculatuur markeerden. Controlehuid toonde de aanwezigheid van bloedcapillairen (2,1% van het totale sectiegebied) evenals gelumeniseerde lymfevaten (0,4% van het totale sectiegebied) (Figuur 2A). Ter vergelijking: in de biopsie die werd verkregen uit het door lymfoedeem aangetaste been, leken zowel de bloed- als de lymfevatbedden verwijd te zijn, wat gepaard ging met een toename van het door bloed ingenomen gebied (3,1% van het totale coupeoppervlak) en lymfatische (2,4% van het totaal) sectiegebied) schepen (Figuur 2B). In de secties verschenen lymfevaten zonder uitzondering gelumeniseerd, wat indicatief is voor vochtopname en geen hints geeft naar de onderliggende pathologie. We bevestigden deze bevinding verder in anti-PDPN- en anti-PROX1-gekleurde secties, die ook ondubbelzinnig gelumeniseerde lymfevaten vertoonden (Figuur 2C).

Op licht-sheet microscopie gebaseerde analyse van gezonde en zieke huidbiopten onthult lymfvatdefecten die onherkenbaar zijn in microtoomcoupes. (EENC) Immunohistologische detectie van vasculaire markers in microtoomcoupes van gezonde controle (EEN) en patiënt (B en C) huidbiopten van de onderste ledematen. ESAM1, endotheliale marker PDPN, LYVE1 en PROX1, lymfatisch-specifieke endotheliale markers. Gelumeniseerd bloed (gele pijlen) en lymfevaten (witte pijlpunten) zijn aangegeven. Stippellijn geeft de grens weer tussen epidermis (aangegeven met rode sterretjes) en dermis. Schaalbalken: 100 m. (NSL) Maximale intensiteitsprojecties van beeldstapels afgeleid door licht-velmicroscopie (UltraMicroscope II) van immunostained controle met volledige montage (NS, G, en J) en huidbiopten van patiënten (E, F, H, l, K, en L). Beeldstapels werden weergegeven met behulp van het volumevisualisatieraamwerk Voreen. Gedetecteerde antigenen en respectieve kleuren worden aangegeven. (NS en F) Lymfatische klepgebieden (geïdentificeerd door hoge PROX1-expressie) zijn gemarkeerd door witte pijlen klepgebieden waren afwezig in patiëntbiopten (E en F). Exemplaren zijn zo afgebeeld dat de epidermale laag zich bovenaan de afbeelding bevindt (rode sterretjes). Let op acanthose en hyperkeratose in patiëntbiopsie (B en C). Schaalbalken: 100 m.

Als eerste stap bij het vergelijken van 2D-histologie en VIPAR, hebben we de op lichtbladmicroscopie gebaseerde benadering onderzocht door drie identiek gekleurde huidbiopten van de benen van drie gezonde personen te vergelijken (een representatief voorbeeld van de drie wordt getoond in figuur 1 en figuur 2 , D, G en J) met het door lymfoedeem aangetaste beenmonster (Figuur 2, E, H en K) en met het lymfangiomateuze monster (Figuur 2, F, I en L). In overeenstemming met de histopathologische analyse (Figuur 2, A-C), onthulde de volumereconstructie, die deel uitmaakt van VIPAR, onmiddellijk een hyperplasie van de lymfevaten (vergelijk Figuur 2, D en G, met Figuur 2, E en H, en Figuur 2, F en I). Het lymfevatvolume per weefselvolume was verhoogd van ongeveer 1,1% in de controlemonsters tot 2,7% in het lymfoedeemmonster en 4,9% in het lymfangiomateuze monster. In tegenstelling tot de standaard histologie op basis van 2D-secties, die eenvoudigweg een toename van gelumeniseerde lymfevaten had geïdentificeerd, onthulde VIPAR bovendien een groot aantal hyperplastische maar ook verstoorde, geïsoleerde lymfevatfragmenten in het lymfoedemateus monster (Figuur 2E en Aanvullende video 2). Van dergelijke vaatfragmenten kan worden verwacht dat ze niet functioneel zijn voor lymfedrainage en kunnen daarom hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van klinische symptomen. De fragmentatie van lymfevaten was specifiek voor de lymfoedemateuze biopsie en werd niet gezien in het lymfangiomateuze monster met sterke hyperplasie (Figuur 2F en aanvullende video 3). In beide biopsieën die waren aangetast door lymfvatafwijkingen, was het duidelijke onderscheid tussen de papillaire en reticulaire basale lymfatische plexus niet meer mogelijk. Bovendien werden we getroffen door de schijnbare afwezigheid van gecondenseerde gebieden van PROX1-tot expressie brengende lymfatische endotheelcellen, wat wijst op een gebrek of verslechtering van lymfatische kleppen in de precollecterende lymfevaten (Figuur 2, D-F).

Karakteristieke verschillen van lymfevaten in gezonde en pathologische huidmonsters werden betrouwbaar gedetecteerd door VIPAR. 3D-reconstructie van de PDPN-positieve lymfatische vasculatuur onthulde onmiddellijk herkenbare verschillen tussen een gezonde huid en zowel de lymfoedemateuze als lymfangiomateuze huidbiopten (Figuur 3, A-C). We vroegen ons nu af of deze verschillen werden gehandhaafd tijdens de segmentatie van vaten en konden worden gekwantificeerd na de geautomatiseerde gegevensextractie die in VIPAR werd geïmplementeerd.

Geautomatiseerde segmentatie van de lymfatische vasculatuur in digitale 3D-volumereconstructies van controle- en huidbiopten van patiënten. Huidbiopten, volledig immunologisch gekleurd voor PDPN, werden onderworpen aan microscopie op basis van lichtplaten (UltraMicroscope II) en de verkregen beeldstapels werden gevisualiseerd met behulp van het volumevisualisatiekader Voreen (EENC, ook weergegeven in figuur 2, D-F). Lymfevatoppervlakken werden geëxtraheerd uit de volumereconstructie door automatische segmentatie van een subvolume met behulp van een random walker-benadering, gevolgd door nabewerking. Ruimtelijke 3D-weergaven van het monster worden getoond vanuit een zijaanzicht waarbij de epidermis zich bovenop de afbeelding bevindt (xz projectie, NSF) en na een virtuele rotatie van 90° rond de x as, van het en-face-aanzicht van de huid, d.w.z. gezien door de epidermis (xy projectie, Gl). In het controlemonster komt dit beeld grotendeels overeen met de lymfevaten van de papillaire plexus. Vervolgens werden vaten geskeletteerd (JL), gevolgd door detectie en classificatie van de vertakkingspunten van de vaatkronkels (gekleurde stippen in mO). De rotatiepositie van het gerenderde monster in de ruimte wordt aangegeven door de asindicatoren in de panelen.

Voor segmentatie van de lymfevaten hebben we een interactieve semi-automatische random walker-benadering (30) toegepast op een gedownsamplede versie van het PDPN-positieve kanaal met stapels van maximaal 4.000 optische secties (Figuur 3, A–C). Daaropvolgende skeletonisatie, vertakkingspuntanalyse van de lymfatische morfologie en gegevensextractie van markers die mogelijk gezonde en pathologische monsters kunnen onderscheiden, werden uitgevoerd op een niet-bevooroordeelde, volledig automatische manier. 3D-visualisatie na de segmentatie van lymfevaten gaf aan dat verschillen in dichtheid, volume en organisatie van de lymfatische vasculatuur tijdens het segmentatieproces werden gehandhaafd. De onregelmatig gevormde vaatfragmenten die kenmerkend zijn voor de lymfoedemateuze biopsie en de sterke hyperplasie van het lymfangiomateuze monster waren gemakkelijk visueel herkenbaar in de gesegmenteerde vaatweergave (Figuur 3, D-I).

Voor een kwantitatieve beoordeling van veranderingen in het pathologische monster, gebruikten we het geëxtraheerde skelet (Figuur 3, J-L), dat was gebaseerd op het binaire beeld gegenereerd door segmentatie, om karakteristieke topologische kenmerken te berekenen, inclusief de vertakkingspunten van lymfevaten en hun connectiviteit (Figuur 3, M-O). Naast de afstand van het vertakkingspunt, de lengte van de verbindende segmenten en het segmentvolume (aanvullende figuur 3, A en B), hebben we aanvullende morfologische kenmerken berekend, waaronder gemiddelde straal, rondheid (dwz de verhouding tussen de oppervlaktevoxels met de grootste en kleinste afstand tot de mediale as in de dwarsdoorsnede), en rechtheid van de lymfevatsegmenten (voor definities van de berekende parameters, zie aanvullende figuur 3, A–C). Een correlatieplot met de correlatiecoëfficiënt van Pearson voor de automatisch geëxtraheerde vasculaire parameters wordt weergegeven in aanvullende figuur 4. Segmentlengte, afstand en volume vertoonden de hoogste correlatie, wat suggereert dat deze parameters verschillende aspecten van dezelfde of gerelateerde structurele veranderingen beschrijven. In de analyse van de connectiviteit van het vat hebben we elk vasculair vertakkingspunt geclassificeerd op basis van het aantal vaartuigsegmenten dat is verbonden met dit specifieke knooppunt (aanvullende figuur 3D). Langwerpige bloedvatfragmenten werden geclassificeerd als een segment dat werd begrensd door twee knopen van vertakkingsgraad één, aangezien de randen van deze segmenten werden gevormd door twee knopen die elk een tak uitstrekken. Voor bolvormige kleine bloedvatfragmenten liggen de twee knooppunten dicht bij elkaar, zodat ze, vanwege de beperkte beeldresolutie, degraderen tot een enkel knooppunt en bijgevolg werden geclassificeerd als een knooppunt met vertakkingsgraad nul, aangezien er geen takken zich uitstrekken van deze fragmenten. Vertakkingspunten met een connectiviteit van twee, die kunnen worden gegenereerd als een artefact door de huidige versie van het grafiekextractie-algoritme, werden in deze analyse niet in overweging genomen, omdat ze geen echt vatknooppunt of vertakkingspunt in het systeem vertegenwoordigen (aanvullende figuur 3D ). Voor alle andere vaartuigsegmenten werd het aantal takken dat zich uitstrekte van elk randknooppunt bepaald als de vertakkingsgraad (aanvullende figuur 3D). De globale vertakkingspuntanalyse classificeerde vervolgens alle knooppunten in het volume op basis van hun vertakkingen (Figuur 4G). Bovendien werden voor elk segment de hogere en lagere (per-rand) vertakkingsgraden gedefinieerd als de maximale/minimale vertakkingsgraad van de twee knooppunten die door het segment zijn verbonden. De verdeling van de hogere vertakkingsgraad voor alle takken wordt getoond in figuur 4H.

Kwantitatieve parameters onderscheiden het lymfatische vasculaire netwerk in controle en huidbiopten van de patiënt na geautomatiseerde extractie van vaatvorm en connectiviteitskenmerken. Parameters die het controlemonster onderscheiden (N = 1) van de lymfoedemateus (N = 1) en lymfangiomatose monster (N = 1) werden berekend op basis van automatisch geëxtraheerde vatvorm en connectiviteitsgegevens. (EENF) De lijn in de box-and-whisker-grafieken in representeert de mediaan, de boxen vertegenwoordigen het bovenste en onderste kwartiel en het einde van de snorharen vertegenwoordigen het 1,5-voudige interkwartielbereik. (G en H) Resultaten van de connectiviteitsanalyse voor (G) totale vertakkingspuntgraad en (H) de hogere vertakkingsgraad per rand. De totale vertakkingspuntanalyse wordt gegalvaniseerd op de bollen die elk knooppunt vormen, terwijl de hogere graad per randanalyse voor elk segment de maximale vertakkingsgraad van beide verbonden knooppunten in aanmerking neemt. Een totale vertakkingsgraad van nul vertegenwoordigt daarom sferische vasculaire elementen, terwijl een hogere per-edge vertakkingsgraad van één het aantal langwerpige, niet-verbonden, niet-vertakte vasculaire elementen vertegenwoordigt. Let op de afgenomen segmentlengte en afstand in door lymfoedeem en lymfangiomatose aangetaste monsters, evenals het toegenomen aantal bolvormige en langwerpige, niet-vertakte vaatelementen in het lymfoedeemmonster. Aanvullend figuur 3 geeft een overzicht van de definities van de geëxtraheerde parameters weergegeven in figuur 4. Mann-Whitney U test met een Bonferroni-correctie voor meervoudige vergelijking werd gebruikt om gegevens tussen groepen te vergelijken. **P < 0,01, ***P < 0,001.

Een selectie van parameters die significant verschilden tussen gezonde en de twee verschillende zieke monsters van de hier onderzochte patiënt is weergegeven in figuur 4. Segmentvolume (46,6%, P < 0,001 en 55,7%, P < 0,001) (Figuur 4A), segmentlengte (51,3%, P < 0,001 en 54,2%, P < 0,001) (Figuur 4B), en vertakkingspuntafstand (43,5%, P < 0,001 en 49,1%, P < 0,001) (Figuur 4C) waren significant verminderd in respectievelijk het lymfoedeem en het lymfangiomateuze monster. Gemiddelde doorsnede van het schip (75,1%, P < 0,001) (Figuur 4D) was ook verminderd in het lymfoedeem, maar niet in het lymfangiomateuze monster (102,0%, NS). De gemiddelde straal van het vaartuig was niet significant veranderd in vergelijking met de controlehuid (Figuur 4E). Rechtheid (89,2%, P = 0,009 en 83,7%, P < 0,001) (Figuur 4F) en rondheid (gegevens niet getoond) waren opnieuw significant verminderd in zowel het lymfoedemateuze monster als het lymfangiomatose-monster. Bovendien onthulde de connectiviteitsanalyse onderscheidende verschillen tussen gezonde en zieke monsters. Vergeleken met de controlebiopsie was in beide monsters afkomstig van de patiënt het aantal langwerpige maar losgekoppelde lymfvatfragmenten toegenomen. Het lymfoedeemmonster was echter sterker aangetast (Figuur 4H). Interessant is dat kleine, geïsoleerde bolvormige vaatfragmenten beperkt waren tot het lymfoedemateuze monster (2,38-voudige toename) (Figuur 4G).

Alles bij elkaar genomen werden in onze datasets onderscheidende verschillen in vaatstructuur en connectiviteit gehandhaafd tijdens op VIPAR gebaseerde skeletonisatie en gegevensextractie. Daarom was VIPAR in staat om op betrouwbare wijze onderscheidende verschillen tussen gezonde en twee verschillende zieke biopsieën te onthullen. Identificatie van parameters die robuuste verschillen tussen gezonde en lymfoedemateuze monsters rapporteren en daarom de diagnostische kracht van VIPAR zouden aantonen, vereist de analyse van een groter patiëntencollectief.

VIPAR is een algemeen toepasbaar hulpmiddel voor de analyse van histologische monsters. Nadat we de kracht van VIPAR voor de histopathologische analyse van de dermale lymfatische vasculatuur hadden aangetoond, wilden we deze benadering uitbreiden naar dermale bloedvaten om de algemene toepasbaarheid ervan aan te tonen. Zoals weergegeven in figuur 1, zorgden veelkleurige immunokleuring voor lymfatische-specifieke markers (PROX1 en PDPN) en de surrogaat bloed vasculaire marker (ESAM1) voor een duidelijk onderscheid tussen beide vasculaire systemen, waardoor de gelijktijdige analyse van bloed- en lymfevaten in hetzelfde exemplaar mogelijk was.

Beoordeling van het bloedvatstelsel was gebaseerd op ESAM1-immunokleuring (Figuur 5, A-C). Bloedvaten werden semi-automatisch gesegmenteerd door de kenmerken van Hessische vaten op meerdere Gaussische schalen te berekenen (31), gevolgd door handmatige globale drempelwaarde om een ​​binair beeld te verkrijgen en nabewerking om kleine segmentatie-artefacten te verwijderen. De gesegmenteerde vaatstructuren werden weergegeven als binair volume (Figuur 5, D-F), en voor daaropvolgende skeletonisatie werd de mediale as binnen elk vat berekend met behulp van de voxelverdunnende methode (Figuur 5, G-I) (32). De topologie van het resulterende vaartuignetwerk werd geëxtraheerd door identificatie van vertakkingspunten en skeletvoxels die tot vaartuigsegmenten behoren op basis van de definities van Klette (33). Connectiviteitsanalyse en de extractie van morfologische kenmerken werden uitgevoerd zoals beschreven voor lymfevaten.

Geautomatiseerde segmentatie van het bloedvatstelsel in digitale 3D-volumereconstructies van controle- en zieke huidbiopten. (EENC) Digitaal gegenereerde ruimtelijke reconstructies van beeldstapels verkregen door op licht gebaseerde microscopie (UltraMicroscope II) van huidbiopten, die immunologisch gekleurd waren voor ESAM1. Biopsieën waren ofwel van het onderbeen van een gezonde controle (EEN, NS, en G) of lymfoedemateuze beenhuid (B, E, en H) of een lymfangiomateuze huidbiopsie (C, F, en l). Schaalbalken: 100 m. Computerreconstructie en -weergave werd uitgevoerd met behulp van het volumevisualisatieraamwerk Voreen. (NSF) Geïdentificeerd door ESAM1-immunokleuring, werd het bloedvaatnetwerk op een semi-automatische manier gesegmenteerd en wordt weergegeven door digitale volumeweergave. (Gl) Na skeletonisatie werd een geautomatiseerde bepaling van de vertakkingspunten van het vasculaire netwerk uitgevoerd, waardoor een classificerende knooppuntanalyse mogelijk was. Let op het uitzonderlijke niveau van complexiteit binnen het gezonde controleweefselmonster dat nog steeds met succes werd gesegmenteerd, geskeletteerd en geanalyseerd voor geautomatiseerde gegevensextractie. Gebieden met een hoge achtergrondsignaalintensiteit (B, E, en H, rode onderbroken cirkel) kan resulteren in vals-positieve signalen, terwijl een laag voorgrondsignaal (C, F, en l, rode onderbroken ellips) kan resulteren in fout-negatieve segmentatieresultaten.

Ondanks het hoge niveau van precisie dat tijdens segmentatie werd bereikt, merkten we ook beperkingen op van de toegepaste algoritmen, met name geassocieerd met een lage signaal-ruisverhouding van de beeldgegevens, wat resulteert in segmentatie-artefacten (Figuur 5, B, C, E, F , H en I, rode gestippelde cirkels en ellipsen). Segmentatiefouten als gevolg van hoge achtergrond- of lage signalen leidden tot de toevoeging van vals-positieve vaatstructuren (Figuur 5, B, E en H) evenals het verlies van niet-gesegmenteerde schepen (Figuur 5, C, F en I), respectievelijk.

3D-microanatomie van het dermale bloedvaatstelsel en veranderingen in lymfatische pathologieën. 3D-reconstructie van de gezonde dermale bloedvaten (Figuur 3A) onthulde een sterk vertakt, complex gevormd vasculair netwerk. Haarvaten van de papillaire plexus (Figuur 1C, rode pijl) werden bediend en afgevoerd door grotere schepen die de dermis doorkruisten die verbonden was met het reticulaire basale netwerk (Figuur 1C, groene pijl). Bovendien waren dermale klieren omgeven door een bijzonder intense bloedvasculaire plexus (Figuur 5, A, D en G, rode pijl).

Over het algemeen analyseerden we de bloedvaten in huidmonsters van drie gezonde personen. Vergelijkbare kleurintensiteit, patroonvorming en morfologische vasculaire parameters, waaronder segmentlengte, afstand en volume, duidden op een hoge mate van reproduceerbaarheid van VIPAR (Figuur 6, controle 1-3).

Bepaling van onderscheidende karakteristieke parameters van de bloedvaten in gezonde en patiëntstalen. Na segmentatie en skeletonisatie werden de segmenteigenschappen van het bloedvaatstelsel in drie verschillende huidbiopten gecontroleerd (N = 3), de lymfoedemateuze huidbiopsie (N = 1), en de lymfangiomateuze huidbiopsie (N = 1) werden gekwantificeerd, volgens de definities in aanvullende figuur 3. (EEN) Afstand beschrijft de lengte van de directe verbinding tussen vertakkingspunten. (B) Segmentlengte komt overeen met de lengte van de hartlijn van een vaartuig tussen twee vertakkingspunten. (C) Het volume van het corresponderende vatsegment wordt berekend uit het totale aantal voxels dat bij het segment hoort. De dwarsdoorsnede van het vat wordt berekend als het quotiënt van volume en lengte. Gegevens worden weergegeven als box-and-whisker-plots, waarbij de lijn de mediaan weergeeft, de dozen het bovenste en onderste kwartiel en het einde van de snorharen het 1,5-voudige interkwartielbereik. Let op de toegenomen segmentlengte en afstand in lymfoedemateuze en lymfangiomateuze huidbiopten. Mann Whitney U test met een Bonferroni-correctie voor meervoudige vergelijking werd gebruikt om gegevens tussen groepen te vergelijken. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

In tegenstelling tot de lichte toename van de bloedvatdichtheid van 2,1%-3,1% van het totale gebied gemeten door histopathologische analyse in het lymfoedeemmonster (Figuur 2, A en B), onthulden 3D-reconstructie en analyse door VIPAR een afname van de bloedvatdichtheid evenals een verminderde netwerkcomplexiteit geassocieerd met zowel lymfoedeem als lymfangiomatose (Figuur 5, B en E, evenals Figuur 5, C en F). Bovendien ontbrak in de bloedvaten de gestructureerde hiërarchische organisatie van de papillaire en reticulaire plexus en hun verbindingen. Bloedvaten in de lymfangiomateuze papule leken verwijd te zijn. In tegenstelling tot het lymfestelsel waren de vertakkingspuntafstand, segmentlengte en segmentvolume in lymfoedeem en door lymfangiomatose aangetast weefsel allemaal significant toegenomen in vergelijking met de controles (Figuur 6). Dit was meer uitgesproken in door lymfangiomatose aangetast weefsel (2,4-voudige afstand, 2,4-voudige segmentlengte, 7,4-voudig volume) in vergelijking met lymfoedemateus (1,4-voudige afstand, 1,4-voudige segmentlengte, 2,9-voudig volume). Het verschil tussen afstand en segmentlengte was zeer significant tussen lymfoedeem en door lymfangiomatose aangetast weefsel (Figuur 6, A en B), terwijl het verschil in segmentvolume minder significant was (Figuur 6C). Bovendien was de toename van de vertakkingspuntafstand tussen controles en het lymfoedemateuze monster slechts gering (Figuur 6A).

Alles bij elkaar bleek VIPAR geschikt voor de analyse van beide vasculaire systemen in menselijke huidmonsters. Het detecteerde op betrouwbare wijze visueel duidelijke defecten en maakte een kwantitatieve beoordeling mogelijk van de pathologische toestanden lymfoedeem en lymfangiomatose na niet-vooringenomen gegevensextractie en berekening van morfologische parameters.

In deze studie demonstreren we de haalbaarheid van het combineren van lichtplaatmicroscopie en computerondersteunde visualisatie met semi-geautomatiseerde segmentatie en niet-bevooroordeelde gegevensextractie om biopsieën van menselijk weefsel te analyseren.

We voerden VIPAR uit op biopsieën van een gezonde menselijke huid. VIPAR produceerde een getrouwe, digitale 3D-weergave met hoge resolutie van de bloed- en lymfevatbedden, die direct toegankelijk was voor visuele interpretatie. De 3D-visualisatie in VIPAR is gebaseerd op het Voreen-visualisatieraamwerk (24, 25), dat volledige digitale herpositionering van het monster mogelijk maakt en dus inspectie vanuit elke kijkhoek en bij elke vergroting tot aan de microscopische resolutielimiet. Dermale capillaire plexussen in de biopsiemonsters plus specifieke details, zoals details van de initiële lymfevaten en lymfatische kleppen, waren gemakkelijk herkenbaar.

Volledige volume-informatie voor zowel de bloed- als lymfevatenbedden maakte semi-geautomatiseerde segmentatie mogelijk en daarmee de extractie van fundamentele vorm- en connectiviteitsparameters. In een daaropvolgende data-analyse werden karakteristieke eigenschappen berekend, zoals de afstand tussen vatvertakkingen en het gemiddelde volume of de lengte van vatsegmenten. Dit deel van de analyse is geautomatiseerd en dus onbevooroordeeld uitgevoerd. Het was gebaseerd op alle vaatsegmenten die aanwezig waren in het gehele geanalyseerde monstervolume.

We hebben deze procedure toegepast op drie biopsieën van een gezonde controlehuid en een hoge consistentie van de afgeleide vasculaire parameters waargenomen, wat de robuustheid van de techniek aantoont. Dit moedigde ons aan om de capaciteit van VIPAR te onderzoeken om veranderingen te identificeren in twee zieke huidbiopten verkregen van een patiënt met het WILD-syndroom die lymfoedemateuze en lymfangiomateuze huid vertegenwoordigde. Verschillen in vaatstructuur vergeleken met gezonde biopsieën waren direct duidelijk in het lymfoedemateus monster. De aanwezigheid van geïsoleerde, zij het gelumeniseerde fragmenten van lymfevaten was een onderscheidend kenmerk dat eerder niet eerder bij deze patiënt was geïdentificeerd. In histologische secties is de ontbrekende ruimtelijke informatie in de z dimensie verhinderde de herkenning van dergelijke fragmenten, die niet kunnen worden onderscheiden van aangrenzende, open vaten die loodrecht op het doorsnedevlak lopen. De lymfangiomateuze huidbiopsie onthulde slechts weinig fragmentatie, maar een sterke hyperplasie van het lymfatische vaatstelsel.

De pathologische veranderingen en onderliggende structurele veranderingen die goed zichtbaar waren in de 3D-visualisatie werden ook weerspiegeld in de daaropvolgende data-analyse, aangezien de zieke monsters significant veranderde vasculaire eigenschappen vertoonden.

De aanwezigheid van geïsoleerde lymfvatfragmenten in de lymfoedeemhuid werd weerspiegeld in de vertakkingsanalyse, die een verhoogde frequentie aantoonde van segmenten met nul vertakkingen, dwz bolvormige fragmenten, en één vertakking, dwz langwerpige fragmenten, in de totale analyse en zelfs meer opvallend, van segmenten met één vertakking per kruising in de hogere vertakkingsgraadanalyse per rand.

We hebben momenteel geen gegevens over het optreden van verstoorde lymfevaten in de etiologie van lymfoedeem bij de patiënt. Het lijkt echter aannemelijk dat de verstoring van lymfevaten veroorzaakt kan zijn door toenemende mechanische belasting in oedemateus weefsel. Eenmaal aanwezig, kunnen verstoorde lymfevaten de ontwikkeling van oedeem hebben vergemakkelijkt of reeds bestaand latent oedeem verergeren. Dit kan een factor zijn geweest die heeft bijgedragen aan de vertraagde manifestatie van de ziekte bij de patiënt. Een robuuste en kwantitatieve analytische benadering zoals VIPAR zou kunnen helpen bij het definiëren van een drempel voor het starten van een mogelijke toekomstige behandeling, lang voordat de klinisch manifeste symptomen zich voordoen.

Het meest onderscheidende kenmerk van een monster afkomstig van een lymfangiomateuze papel van de WILD-patiënt was de lymfevathyperplasie, wat tot uiting kwam in een 4,36-voudige toename van het lymfevatvolume per weefselvolume in vergelijking met een gezonde huid. Opmerkelijk is dat de segmentlengte (0,47-voudig [lymfoedeem], 0,50-voudig [lymfangiomatose] van controlebiopsie) en daarmee de vertakkingspuntafstand (0,48-voudig [lymfoedeem], 0,51-voudig [lymfangiomatose] van controlebiopsie) van lymfatische bloedvaten waren significant verminderd in beide monsters met lymfatische afwijkingen. Ondanks de sterke lymfatische hyperplasie, d.w.z. vaatuitzetting in het lymfangiomateuze monster, was het algemene resultaat van de gelijktijdige verkorting van vaatfragmenten een vermindering van het volume per lymfevatsegment. We interpreteren de bevinding dat gelijktijdig de rechtheid van de vaten werd verminderd als een indicatie dat de lymfevaten door extensie op mechanische rek hebben gereageerd, zeer waarschijnlijk door proliferatie en toegenomen vertakking. Daarentegen waren de segmentafstand en -lengte voor bloedvaten groter, wat zou beweren dat het vaatbed was opgezwollen door het oedeem en minder efficiënt reageerde door vasculaire hermodellering.

Het grote spectrum aan parameters dat door VIPAR kan worden afgeleid, moet zorgvuldig worden gescreend op parameters die significant zullen worden gewijzigd in de context van een bepaalde pathologie. Identificatie van dergelijke parameters zou VIPAR als een diagnostisch hulpmiddel vestigen (aanvullende figuur 4). In onze analyse van het lymfevatsysteem was de op volume-informatie gebaseerde analyse van huidbiopten zeer gunstig vergeleken met de analyse van histologische secties.

De overgang van de analyse van enkele histologische vlakken naar de op weefselvolume gebaseerde VIPAR-benadering gaat gepaard met een enorme toename van de hoeveelheid geëvalueerde gegevens, wat resulteerde in de eliminatie van de variabiliteit die onvermijdelijk werd geïntroduceerd door de willekeurige aard van doorsnedevlakken in standaard 2D-histologie en maakte de herkenning mogelijk van fenomenen die veel gemakkelijker en sneller kunnen worden geïdentificeerd in 3D-structuren. Dergelijke pathologische, structurele veranderingen werden getrouw en kwantitatief weerspiegeld in de geëxtraheerde beschrijvende weefselparameters.

Het is niet zo verrassend dat de kwaliteit van de bereikte bloedvatsegmentatie direct gecorreleerd was met de kwaliteit van de verkregen beeldgegevens. In dat opzicht kwamen we zeldzame vals-positieve resultaten tegen die werden veroorzaakt door de verkeerde interpretatie van autofluorescentie-achtergrond extracellulaire matrixcomponenten en ook het niet detecteren van zeer vaag gekleurde vaten van kleine fysieke afmetingen. Toekomstige benaderingen om deze problemen te minimaliseren, kunnen de ontwikkeling van verbeterde antilichamen en kleuringsprotocollen, meer gevoelige microscopische beeldacquisitie en, belangrijker nog, verfijning van de segmentatie-algoritmen met zich meebrengen. De analyse die we hier beschrijven, is afhankelijk van de beschikbaarheid van protocollen voor hele-mount immunokleuring voor de structuur of het celtype dat wordt onderzocht en op daaropvolgende weefselopruiming. Onlangs is een clearingprotocol beschreven dat compatibel is met een breed scala aan antilichamen voor immunokleuring (34). Als alternatief zijn er verschillende protocollen beschikbaar gekomen die de fluorescentie van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten behouden (35, 36). Een voor de hand liggende kostenpost voor de analytische kracht die door de VIPAR wordt geleverd, is de enorme hoeveelheid beeldgegevens die moet worden verwerkt en geëvalueerd, waarvoor momenteel nog steeds een krachtig grafisch werkstation nodig is voor een efficiënte toepassing. Hoewel de dalende kosten voor computergeheugen en gegevensopslag deze aanpak snel betaalbaarder moeten maken, blijft de overdracht, analyse en archivering van grote volumes lichte gegevens een uitdaging. Voor de microscopische observatie van ontwikkelingsprocessen bij drosophila en zebravissen op lichtplaten zijn efficiënte projectie-algoritmen ontworpen, wat resulteert in een substantiële datareductie (37). In deze gevallen is echter alleen het oppervlak van de zich ontwikkelende organismen van belang, terwijl voor VIPAR het gehele weefselvolume moet worden geanalyseerd, wat de mogelijke datareductie beperkt.

Concluderend, (a) de unieke kracht van de VIPAR-benadering is dat het een duidelijk diepere fenotypering van weefselmonsters mogelijk maakt dan de momenteel beschikbare standaard 2D-analyse van secties. We hebben hier aangetoond dat huidmonsters geassocieerd met lymfatische vaataandoeningen, vergeleken met gezonde huidbiopten, significante verschillen vertoonden in hun segmentlengte, segmentafstand, volume per segment, volume van lymfevaten per weefselvolume en hun vaatconnectiviteit, zoals aangetoond door vertakking punt analyse. (b) De VIPAR-benadering vermindert experimentele vooringenomenheid door de geautomatiseerde parameterextractie van VIPAR. Voor verschillende pathologieën zullen echter de beste uitkomstparameters moeten worden gedefinieerd. (c) Bovendien kan de VIPAR-benadering nieuwe inzichten verschaffen in de mechanismen van ziekteontwikkeling en zo de patiëntstratificatie helpen of een specifieke behandeling begeleiden zodra de optimale uitkomstparameters zijn gedefinieerd. In de context van dermale vasculaire lymfatische aandoeningen zal diepe fenotypering met behulp van VIPAR aanvullende criteria opleveren voor het diagnostische algoritme voor primaire lymfatische dysplasie en mogelijk helpen bij de identificatie van genetische defecten bij patiënten (38).

De VIPAR-benadering is niet beperkt tot de analyse van vasculaire structuren, maar kan breder worden toegepast op geschikte weefselbiopten tot een volume van 1 cm3. Het verbetert aanzienlijk de detectie van structurele defecten en veranderingen in weefsels met een ruimtelijk complexe opstelling. Omdat het gebaseerd is op mesoscopische lichtplaatmicroscopie, overbrugt VIPAR ook de schalen tussen microscopie met hoge resolutie en beeldvorming van het hele lichaam. Wij geloven dat VIPAR het potentieel heeft om een ​​nieuw veld van 3D-pathologie te openen.

Lichtbladmicroscopie. Na volledige kleuring met immunofluorescentie werden optisch geklaarde huidbiopten afgebeeld met behulp van een LaVision UltraMicroscope II (LaVision BioTec). Stapels werden vastgelegd met een stapgrootte van 1 of 2 m en bij verschillende vergrotingen. 3D-reconstructie, analyse en segmentatie en berekening van vasculaire parameters van ultramicroscopiestapels werden uitgevoerd met behulp van aangepaste software die gebruikmaakte van het Voreen-raamwerk (24, 25).

Antilichamen. De volgende antilichamen werden gebruikt: polyklonaal anti-humaan PROX1 van konijn (102-PA32, ReliaTech), polyklonaal anti-humaan PROX1 van geit (AF2727, R&D Systems), anti-humaan LYVE1 van geit (AF2089, R&D Systems), anti-humaan PDPN van muizen (kloon D2-40, Dako) en muis-anti-humaan PECAM1 (kloon 89C2, Cell Signaling Technologies). Antilichamen van konijnen die het extracellulaire domein van humaan ESAM1 herkennen, werden opgewekt tegen een ESAM1-Fc (ESAM-IgG1) fusie-eiwit, geproduceerd in stabiel getransfecteerde CHO-cellen. Antigeenspecifieke antilichamen van het serum (VE50) werden affiniteitsgezuiverd met ESAM1-Fc geïmmobiliseerd op CnBr-Sepharose (GE Healthcare) antilichamen tegen het IgG1 Fc-deel werden verwijderd door incubatie met geïmmobiliseerd humaan IgG.

Immunofluorescentie huidbiopsie geheel gemonteerde kleuringen. Verse huidbiopten werden gedurende 4 uur gefixeerd in 4% PFA/PBS bij 4°C. Na permeabilisatie (0,5% Triton X-100/PBS), werden de monsters geblokkeerd in PermBlock-oplossing (1% BSA, 0,5% Tween 20 in PBS) en kleuringen op de gehele montage werden uitgevoerd met behulp van anti-PECAM1, anti-ESAM1, anti -PROX1, anti-PDPN en anti-LYVE1 primaire antilichamen en Alexa kleurstof-gekoppelde secundaire antilichamen (Life Technologies) verdund in PermBlock. Na elke kleuringsstap werden de monsters driemaal gewassen in PBS-T (0,1% Tween 20/PBS).

Optische zuivering van huidbiopten. Optische klaring van weefselmonsters werd eerder beschreven (39). In het kort werden op de hele berg gekleurde huidbiopten ingebed in 1% agarose met laag smeltpunt. Na dehydratatie in methanol (50%, 70%, 95%, >99,0%, >99,0% [v/v] methanol, elke stap 30 minuten), werden de monsters optisch geklaard in een benzylalcohol/benzylbenzoaatoplossing (BABB , verhouding 1:2 [v/v]) gedurende 4 uur tweemaal. Gezuiverde monsters werden opgeslagen in BABB en afgebeeld met behulp van een LaVision UltraMicroscope II (39, 40).

Immunohistochemie. Huidbiopten werden gedurende 4 uur gefixeerd in 4% PFA/PBS, gewassen in PBS, ingebed en snel ingevroren in OCT. Cryosecties van 10 m en 20 m werden gedurende 15 minuten gefixeerd in 4% PFA, gewassen en geblokkeerd (10% kippenserum, 0,3% Triton X-100 in PBS). Vervolgens werden coupes gedurende 1 uur geïncubeerd met primaire antilichamen (verdund in 1% BSA, 1% kippenserum, 0,3% Triton X-100 in PBS), driemaal gewassen in PBS-T en uiteindelijk geïncubeerd in Alexa-kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen (Levenstechnologieën). Na monstermontage in Mowiol (Calbiochem, 475904), werden confocale beelden vastgelegd met behulp van een Zeiss LSM 780 (x20, NA = 0,8 en x63 olie, NA = 1,4) confocale microscoop.

Beeldverwerking en analyse. Voor analyse van lymfatische en bloedvateigenschappen hebben we onze verwerkingspijplijn geïntegreerd in het volumevisualisatieraamwerk Voreen (Volume Rendering Engine) (24), dat is uitgebreid om de visualisatie van grote beeldstapels mogelijk te maken (25). De analyseworkflow bestaat uit de drie basisstappen: segmentatie, skeletonisatie en feature-extractie. Voor segmentatie van de lymfevaten werd een interactieve semi-automatische random walker-segmentatie (30) toegepast op een gedownsamplede versie van het PDPN-positieve (D2-40) kanaal. Segmentatie van bloedvaten werd uitgevoerd door het berekenen van vaatkenmerken op meerdere Gaussiaanse schalen, vergelijkbaar met de methode voorgesteld door Sato et al. ( 31 ), gevolgd door een handmatige drempelstap om een ​​binair beeld te verkrijgen. Verbonden componentenanalyse (41) werd toegepast op beide segmentaties om artefacten in de vorm van kleine voxelcomponenten in zowel voorgrond (onechte objecten) als achtergrond (holtes) te identificeren en te verwijderen. Skeletonisatie berekende de mediale as in elk vat, waarbij de voxelverdunnende methode werd toegepast die werd voorgesteld door Chen et al. ( 32 ). We hebben het algoritme aangepast om het aantal valse vertakkingen te verminderen bij het itereren op vaten die zijn gereduceerd tot dunne vellen voxels. We houden dus rekening met anisotrope resolutie en niet-uniforme vaatstraal. De topologie van het resulterende scheepsnetwerk werd geëxtraheerd door identificatie van knooppunten en skeletvoxels die tot scheepssegmenten behoorden op basis van een vereenvoudigde versie van de definities van Klette (33). Dit stelt ons in staat om de connectiviteit van een voxel alleen te identificeren door de omgeving van 3 × 3 × 3 te observeren en maakt het dus mogelijk om de topologie van het volledige vaartuignetwerk te berekenen in een enkele beweging over het binaire volume. Speciale voxelconfiguraties die volgens Klette meer gecompliceerde connectiviteitsberekeningen vereisen, zijn al uitgesloten in de nabewerkingsstap van de segmentatie. Segmenten aan de monstergrens werden gemarkeerd en uitgesloten van de daaropvolgende analyse van parameters zoals segmentlengte. Op basis van het binaire beeld verkregen door segmentatie in combinatie met het geëxtraheerde skelet en de topologie van het vaatnetwerk werden karakteristieke kenmerken berekend. Topologische kenmerken omvatten de connectiviteit van kruispunten, terwijl morfologische kenmerken van de vaatsegmenten de gemiddelde straal, rondheid (verhouding tussen de oppervlaktevoxels met de grootste en kleinste afstand tot de mediale as in de dwarsdoorsnede) en rechtheid (kortste afstand tussen twee vertakkingen) omvatten punten gedeeld door de segmentlengte).

Lymfoscintigrafie. Voor visualisatie van de lymfedrainage en lymfeklieren van de hele ledemaat, evenals voor beoordeling van lymfetransport, werd een radioactieve tracer, Technetium-99m, geïnjecteerd in de webruimten tussen tenen en vingers. Beeldvorming werd uitgevoerd met een γ-camera en de opname van de tracer in de lies- en axillaire lymfeklieren werd 2 uur na injectie gekwantificeerd om het lymfetransport te bepalen.

Statistieken. Eigenschappen per knoop en per rand van elke vatgrafiek worden gevisualiseerd met behulp van box-and-whisker-plots, waarbij de lijn de mediaan weergeeft. De laagste en hoogste gegevens zijn die binnen 1,5 keer het interkwartielbereik van het onderste en bovenste kwartiel. Uitbijters worden afzonderlijk weergegeven als kleine cirkels. Mann Whitney U test met Bonferroni-correctie (voor meerdere vergelijkingen) werd gebruikt om gegevens tussen groepen te vergelijken. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SigmaPlot 11.0.

Studie goedkeuring. De proefpersoon in deze studie werd gerekruteerd via de genetische en lymfovasculaire kliniek van het St. George's Hospital in het Verenigd Koninkrijk. Ethische goedkeuring voor deze studie werd verkregen van de South West London Research Ethics Committee, Londen, Verenigd Koninkrijk (REC ref: 05/Q0803/257). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen voor het onderzoek en voor foto's van de patiënt die in het manuscript verschenen. Ethische goedkeuring voor de controle huidbiopten werd verkregen van de ethische commissie van de medische faculteit van de Universiteit van Münster (ref: 2008-319-f-S). Nadat geïnformeerde toestemming was verkregen, diende materiaal dat niet nodig was voor diagnostische doeleinden, verkregen door chirurgische ingrepen, onafhankelijk van deze studie, als gezond controleweefsel. Alle controlebiopten waren van kalfshuid.

FK en RH bedachten het project, ontwierpen experimenten, analyseerden en interpreteerden gegevens en schreven het manuscript DD en AS ontwierpen data-analysesoftware, analyseerden en interpreteerden gegevens en droegen bij aan de manuscript-cd voerden en analyseerden experimenten uit en droegen bij aan het manuscript SMA en MS bijgedragen aan het manuscript en SB, KG, KH, PO, DV, TG, SM, XJ en PSM leverden reagentia en analyseerden en droegen bij aan het manuscript.

Onze dank gaat uit naar de patiënt. Wij danken Peter Baluk en Steve P. Watson voor het kritisch bekijken en bespreken van het manuscript.We danken Tobias Brix voor ondersteuning bij het volumevisualisatieraamwerk Voreen. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de DFG (SFB 656 aan FK, RH, XJ, MS, AS en KH), financiering van de Cells-in-Motion Cluster of Excellence EXC 1003 (aan FK, MS, XJ, en KH), en een reisbeurs van het Lymphatic Education and Research Network aan RH.

Belangenverstrengeling: De auteurs hebben verklaard dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.


Download en print dit artikel voor uw persoonlijke wetenschappelijke, onderzoeks- en educatieve doeleinden.

Koop een los nummer van Wetenschap voor slechts $ 15 USD.

Wetenschap

Vol 346, uitgave 6208
24 oktober 2014

Artikel Gereedschap

Log in om een ​​waarschuwing voor dit artikel toe te voegen.

Door Bi-Chang Chen, Wesley R. Legant, Kai Wang, Lin Shao, Daniel E. Milkie, Michael W. Davidson, Chris Janetopoulos, Xufeng S. Wu, John A. Hammer III, Zhe Liu, Brian P. English, Yuko Mimori-Kiyosue, Daniel P. Romero, Alex T. Ritter, Jennifer Lippincott-Schwartz, Lillian Fritz-Laylin, R. Dyche Mullins, Diana M. Mitchell, Joshua N. Bembenek, Anne-Cecile Reymann, Ralph Böhme, Stephan W. Grill , Jennifer T. Wang , Geraldine Seydoux , U. Serdar Tulu , Daniel P. Kiehart , Eric Betzig

Een nieuwe microscoop maakt driedimensionale beeldvorming van levende systemen met zeer hoge resolutie in realtime mogelijk.


Discussie

Het vermogen om 3D-hersenorganoïden te genereren uit van somatische cellen afgeleide menselijke hiPSC is een geweldig hulpmiddel om ons begrip van de ontwikkeling van het menselijk brein bij gezondheid en ziekte te vergroten [2𠄴, 6, 7, 17]. Meerdere bewijslijnen wijzen erop dat prenatale ontwikkeling een kritieke periode is voor het ontstaan ​​van cellulaire verschillen die kunnen bijdragen aan het ontstaan ​​van autisme [8]. Studies met behulp van van patiënten afgeleide hiPSC's die zijn gekweekt als 2D-aanhangende culturen of als 3D-organoïden, hebben dergelijke bevindingen verder ondersteund [9�]. Tot op heden zijn de meeste onderzoeken met 3D-organoïden gebaseerd op conventionele weefselverwerkings- en beeldvormingsmodaliteiten die niet zijn geoptimaliseerd voor het behoud en de beeldvorming van intacte organoïden [25, 28]. Dit resulteert in het verlies van de betekenis en het begrip van de cellulaire processen, organisatie en complexiteit binnen een driedimensionale omgeving [25]. Hier hebben we een immunohistochemische en weefselopruimingsbenadering geoptimaliseerd in combinatie met ALSM-beeldvorming die snelle en hoge resolutiebeeldvorming van intact hCS mogelijk maakt. Met behulp van deze benadering waren we in staat om de driedimensionale cellulaire structuur van het binnenste lumen van neurale rozetten te visualiseren en te kwantificeren. Deze structuur wordt beschreven als een in vitro correlaat van de menselijke neurale buis die zich begint te vormen in week 4 van de zwangerschap en de bron is van het gehele centrale zenuwstelsel [16]. Aangezien is gemeld dat de vorming of het onderhoud van de structuur van neurale rozetten is veranderd bij autisme en gerelateerde neurologische ontwikkelingsstoornissen [8, 12, 40], kan het kunnen onderzoeken van de cellulaire organisatie en morfologie van neurale rozetten in 3D inzicht bieden in pathologische mechanismen die bijdragen aan de kans op het ontwikkelen van dergelijke aandoeningen.

Conventionele methoden om hersenorganoïden zoals hCS te bestuderen, worden vaak gehinderd door een aantal beperkingen, zoals het onvermogen om beelden van cellulaire structuren en organisatie binnen intacte exemplaren te verkrijgen. We ontdekten bijvoorbeeld dat zelfs beeldvorming van intact hCS met een diameter van

� µm resulteerde in een snel verlies van fluorescentiesignaal van ongeveer 100 µm in het weefsel. Dit was niet te wijten aan een kwestie van antilichaampenetratie, aangezien het waargenomen signaalverlies ook werd waargenomen bij het afbeelden van DAPI, een niet-antilichaamkleuring. We waren in staat om deze beperking te overwinnen door een ALSM-beeldvormingsmodaliteit te gebruiken in combinatie met optische weefselopruiming en geoptimaliseerde immunohistochemie. Voordelen van het gebruik van deze vorm van LSM zijn onder meer de mogelijkheid om snel beelden in een groot volume en een groot gezichtsveld te verwerven [27]. Dit maakte visualisatie van het binnenste lumen van neurale rozetten in 3D mogelijk op een manier die niet mogelijk was met behulp van confocale microscopie. Met behulp van de F-actine-kleuring RDYPROBE hebben we eivormige of buisvormige lumina van neurale rozetten waargenomen. Het was ook mogelijk om radiale opstelling van NPC's-cellen rond de lumina te observeren. Dit was ons eerste bewijs van de 3D-vorm van neurale rozetten en omringende NPC's.

Ondanks dit verbeterde vermogen om neurale rozetten in intacte hCS's af te beelden, was er nog steeds een signaalverlies op diepte, zij het veel minder dan waargenomen na confocale beeldvorming. Het is algemeen bekend dat de aanwezigheid van lipiden in weefselmonsters een verstrooiing van licht veroorzaakt en daarom effectieve volumebeeldvorming belemmert [25, 29, 31, 38]. Bovendien kan ongelijke of onvolledige penetrantie van antilichamen ook bijdragen aan dit probleem [32]. Onze benadering om het probleem van ongelijkmatige of onvolledige antilichaampenetratie aan te pakken, was om de geoptimaliseerde immunokleuringbenadering te gebruiken die wordt beschreven in het FACT-opruimingsprotocol [32]. In dit protocol duurt het opruimen van weefsel echter 1 week, gevolgd door 4 dagen voor antilichaamkleuring. Om deze duur te verkorten, gebruikten we het geoptimaliseerde immunokleuringsprotocol in FACT (4ꃚys) in combinatie met een efficiëntere en snellere clearingmethode, ScaleS4, die 4 h [31] duurt. Door deze aanpak te combineren met het opruimen van ScaleS4, werd onze weefselvoorbereidingstijd teruggebracht tot minder dan de helft (

𠂕ꃚys) van het FACT-protocol. Dit is ook veel minder in vergelijking met andere gevestigde protocollen zoals CLARITY (

�ꃚgen) [29, 31, 32]. Omdat FACT en ScaleS4 beide op water gebaseerde protocollen waren, ontdekten we dat ze behoorlijk compatibel waren wanneer ze samen werden gebruikt. Deze geoptimaliseerde benadering van weefselopruiming verbeterde de ALSM-beeldvorming van intact hCS verder. Dit stelde ons in staat om het binnenste lumen en de radiale organisatie van de NPC's rond het binnenste domein van de rozet te visualiseren, en zo een weergave te geven van de 3D-structuur van de neurale rozet. Dit is van bijzonder belang, aangezien onze eerdere onderzoeken aangeven dat abnormale vorming van neurale rozet zichtbaar is in autisme-hiPSC's die zijn gedifferentieerd in 2D-aanhangende culturen of in 3D-hCS's [12] (aanvullend bestand 1: figuur 3). Belangrijk is dat de waargenomen radiale opstelling van NPC's rond het binnenste lumen van rozetten consistent is met de organisatie van DAPI-gekleurde cellen rond een centraal lumen van intacte embryoïde lichamen gegenereerd uit hiPSC's en vervolgens gewist en afgebeeld met behulp van een nieuwe vlakke verlichting met één enkel objectief -fotonenmicroscoop [28]. Een opmerkelijk verschil in het systeem beschreven door Rakotoson et al. is dat hun systeem een ​​laser met twee fotonen gebruikt. Een dergelijke microscoop is ook geoptimaliseerd voor snelle beeldvorming, geeft minder fotobleken en maakt een betere dieptepenetratie mogelijk in vergelijking met confocale microscopen [28], vergelijkbaar met het ALSM-systeem dat in deze studie werd gebruikt. We verwachten dat microscopie met twee fotonen in het algemeen diepere penetratie mogelijk zou maken omdat de infraroodgolflengten niet door het weefsel worden geabsorbeerd. Merk op dat we onlangs een twee-fotonen-ALSM-systeem hebben beschreven dat ook is geoptimaliseerd voor snelle twee-fotonbeeldvorming op diepte [41]. Een vergelijking van beide systemen, vooral in levende specimens waar snelle beeldvorming wenselijk is, zou in de toekomst interessant zijn. Desalniettemin, voor zover wij weten, is dit een van de eerste onderzoeken die het vermogen aantoont om het lumen en de rangschikking van NPC's rond neurale rozetten in 3D te visualiseren. Op basis van de gewiste afbeeldingen van neurale rozetten waren we in staat om de randen van het lumen duidelijk af te bakenen en een 3D-reconstructie van de vorm van het lumen te maken. Hierdoor konden we de grootte van de lumen kwantificeren en ontdekten we dat de meeste lumen in een bepaalde sferoïde een volume hadden van minder dan 1000 µm 3 , terwijl slechts weinigen een volume hadden dat groter was dan 10.000 µm 3 .

De aanwezigheid van een enkele neurale rozet met een groot lumen is vergelijkbaar met de eerder gerapporteerde [16]. De vorming van een enkele grote rozet wordt beschouwd als een essentieel kenmerk van normale hersenontwikkeling en is van cruciaal belang voor het vaststellen van typische weefselcytoarchitectuur en normale differentiatie van neuro-epitheelcellen tijdens hersenontwikkeling [16]. In overeenstemming hiermee was het mogelijk om de radiale organisatie van NPC's rond de grote rozet in 3D te observeren [2, 5𠄷]. Deze benadering suggereert dus dat het mogelijk is om typische cellulaire rijping te onderzoeken die wordt waargenomen bij neurologische ontwikkeling in 3D. Deze gecombineerde benadering zou dus een goed cellulair model zijn om neurologische aandoeningen zoals autisme te bestuderen.


DISCUSSIE

Vetweefsel is misschien wel het meest structureel dynamische weefsel in het volwassen menselijk lichaam. Het vermogen om met grote hoeveelheden te groeien en te krimpen, is van fundamenteel belang voor het metabolisme, de gezondheid, de fitheid en de aanpassing van de mens. Het ontrafelen van de mechanismen van dit proces is steeds belangrijker geworden vanwege de groeiende obesitas-epidemie, die meer dan 40% van de volwassen Amerikaanse bevolking treft en een steeds groter deel van de wereldbevolking, inclusief landen op alle ontwikkelingsniveaus (41). Weefselmicro-omgevingen en macrofaagcellen worden verondersteld essentieel te zijn voor de dynamiek van vetweefsel, waarbij CLS's worden beschouwd als de histopathologische ontstekingsverbinding met comorbiditeiten van obesitas, waaronder metabole stoornissen, glucose-intolerantie en cardiovasculaire gebeurtenissen (9). De contra-intuïtieve noodzaak om cellen te knippen en te doden om weefsel in de zwaarlijvige toestand te laten groeien, wordt nog niet volledig begrepen, deels vanwege ons onvolledige vermogen om microscopische weefselstructuren te correleren met het wereldwijde weefselmetabolisme. Ons huidige begrip is beperkt tot analyses van 2D-vetweefselcoupes met beperkte 3D-structurele informatie, en er zijn niet-lineaire veranderingen waargenomen in de progressieve ontwikkeling van obesitas (42). 3D-analyse is nodig om CLS-kenmerken zoals celsamenstelling, grootte en vorm nauwkeurig te beoordelen, terwijl zeldzame gebeurtenissen zoals grote CLS-structuren mogelijk niet kunnen worden geïdentificeerd in 2D-gegevenssets. Of deze aanvullende kenmerken de correlatie met klinische aandoeningen verder zullen verbeteren of de progressie naar comorbiditeiten zullen voorspellen, zal de focus zijn van verdere studies. Tijdsverloopmicroscopie in levende weefsels heeft belangrijke dynamische processen in vetweefsel aan het licht gebracht (43) Er zijn echter aanzienlijke beperkingen aan deze technieken, aangezien de ruimtelijke diepte van confocale beeldvorming alleen waarnemingen aan de weefselperiferie en met een lage doorvoer mogelijk maakt. Weefselopruiming en op deep learning gebaseerde beeldverwerking bieden in plaats daarvan de capaciteit om alle CLS-structuren volledig in kaart te brengen en om cel-celinteracties verder te evalueren met veel rijkere details, zij het zonder de capaciteit voor longitudinale analyse van individuele structuren (15, 44). Verdere studies zullen nodig zijn om de betrokken celsubclassificaties te analyseren, aangezien single-cell sequencing in magere en zwaarlijvige vetweefsels zeven verschillende subklassen van macrofagen aan het licht bracht (45). Adipocyten, hoewel niet direct onderzocht in dit werk, kunnen ook worden geëvalueerd met behulp van gerelateerde beeldanalyse-workflows, die meer inzicht kunnen geven in factoren die het metabolisme op organismeniveau moduleren, zoals adipokines (bijv. adiponectine en leptine) of vrije vetzuren. Geavanceerde vormen van multiplex-immunolabeling, waarbij mogelijk technologieën zoals kwantumdots worden toegepast, zullen nodig zijn om tal van aanvullende celtypen en fenotypemarkers in heterogene weefselmicro-omgevingen te identificeren (46) om hun ruimtelijke relaties, bijdragen aan pathologieën en reactie op interventies te helpen begrijpen. Deze workflows kunnen op dezelfde manier bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe bio-engineeringtechnologieën in vetweefsel, dat een veelvoorkomende bron van stamcellen is, een doelwit voor nieuwe biofarmaceutica en een potentieel depot voor medicijnafgifte (47, 48). Hoewel toepassingen in de wetenschappen duidelijk zijn, zijn er nog steeds uitdagingen die het gebruik van 3D-beeldvormingstechnieken in de kliniek voor histopathologische analyses verhinderen, zoals lange immunolabelingtijden en analysemethoden met een lage doorvoer voor gegevens van terabyte-formaat (44). Deep learning in de afgelopen 10 jaar heeft geleid tot gestroomlijnde procedures voor beeldverwerking en -analyse, met bijzonder impactvolle bijdragen voor objectherkenning en lokalisatie, processen die traditioneel handmatige knelpunten waren bij beeldanalyse. Desalniettemin kunnen de gecoördineerde ontwikkeling van benaderingen voor het opruimen en labelen van weefsel, microscopiemodaliteiten en geavanceerde deep learning-algoritmen samen oplossingen aandragen voor de uitdagingen in de 3D-structurele biologie van weefsel.


Resultaten

Light sheet fluorescentiemicroscopie maakt beeldvorming van de ongerepte plant mogelijk

Gekiemde zaailingen van de Arabidopsis Columbia (Col-0) lijn die de cytosolische gelokaliseerde FÃrster Resonance energy transfer (FRET) sensor Yellow Cameleon NES-YC3.6 (Krebs et al. 2012) tot expressie brengt, werden overgebracht net na het ontkiemen van het zaad (beoordeeld als breuk van de tegument en primaire worteluitkomst) van een petrischaal-agarplaat naar de bovenkant van gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP) buizen gevuld met een gelei medium (met 0,5% PhytagelTM). FEP heeft een brekingsindex die dicht bij die van water ligt (NFEP = 1.344, NWATER = 1,33) en vermijdt de sterke optische aberraties die gepaard gaan met plastic of glazen buizen. In deze stap selecteerden we gezonde en fluorescerende zaailingen die direct in de buis konden groeien, met hun wortels na positief gravitropisme (Fig. 1A-E). De wortel en wortelharen kunnen dagenlang groeien in bijna fysiologische omstandigheden en kunnen indien nodig worden afgebeeld. Deze montageprocedure vertegenwoordigt met name een toegevoegde waarde en een aanzienlijk voordeel voor beeldanalyses, omdat het monstermanipulatie bijna elimineert die nodig is voor traditionele wortelbeeldvorming (Behera en Kudla 2013, Loro en Costa 2013) en daardoor mogelijke artefacten of weefselbeschadiging vermindert. Toen de zaailingen zich in het gewenste ontwikkelingsstadium bevonden, werden de FEP-buizen met de groeiende zaailingen gekoppeld aan een holle aluminium houder en overgebracht naar de beeldkamer van de LSFM-opstelling (aanvullende figuur S1). We observeerden gebieden van ongeveer 800 × 450 μm 2 voor beide fluorescentiekanalen (cpVenus en CFP), die gelijktijdig werden opgenomen op dezelfde CMOS-sensor, waardoor we het signaal van de FRET-verhouding (berekend als de cpVenus/CFP-verhouding) in realtime (Fig. 1H). Zoals te zien is in de representatieve afbeelding in Fig. 1F, was het gezichtsveld van de microscoop voldoende om een ​​groot deel van de Arabidopsis-wortel en uitstekende wortelharen in jonge en volwassen stadia waar te nemen. We zouden routinematig morfologische screening van Arabidopsis-wortels kunnen uitvoeren, waarbij meerdere wortelharen (>20) uit de differentiatiezone werden gedetecteerd in een enkele 3D-meting (Fig. 1F-H). Om de beste 3D-reconstructies te verkrijgen, wordt een afstand tussen de plakjes aanbevolen die gelijk is aan of kleiner is dan de helft van de lichte plaatdikte, vooral als deconvolutie-algoritmen worden toegepast op de verkregen beeldstapel. In de praktijk vonden we dat een afstand vergelijkbaar met de dikte van de lichtplaat een goede afweging was tussen beeldkwaliteit, lichtdosis en datasetgrootte.

Dicht bij fysiologische montageprocedure voor 3D-beeldvorming van Arabidopsis-zaailingwortels. Na reiniging werden FEP-buisjes gekoppeld aan het bovenste deel van een 10 l pipetpunt en gevuld met een op Phytagel™ gebaseerde oplossing (A). Een laag op agarose gebaseerde oplossing werd vervolgens bovenop de buis (B) geplaatst, waar de zaailingen werden geplaatst (D) na ontkieming in petrischalen (C). De wortels groeiden in de gelei-matrix (E) en de zich ontwikkelende wortelharen konden door de FEP-buis worden afgebeeld. Driedimensionale reconstructies van Arabidopsis-wortel die de op cytosol gerichte Cameleon NES-YC3.6 tot expressie brengt. Plakjes werden verkregen met een stap van 1,5 m. De enkelkanaals reconstructie (F) toont de wortelharen driedimensionaal georganiseerd rond de volgroeide zone. Wortelharen zien er recht, glad uit en volgen meestal gravitropisme, zoals in detail wordt weergegeven in (G). Dezelfde overweging kan worden gemaakt door te kijken naar de FRET-reconstructie (H). De pijl in (F–H) geeft de opnamepositie aan.

Dicht bij fysiologische montageprocedure voor 3D-beeldvorming van Arabidopsis-zaailingwortels. Na reiniging werden FEP-buisjes gekoppeld aan het bovenste deel van een 10 l pipetpunt en gevuld met een op Phytagel™ gebaseerde oplossing (A). Een laag op agarose gebaseerde oplossing werd vervolgens bovenop de buis (B) geplaatst, waar de zaailingen werden geplaatst (D) na ontkieming in petrischalen (C). De wortels groeiden in de gelei-matrix (E) en de zich ontwikkelende wortelharen konden door de FEP-buis worden afgebeeld. Driedimensionale reconstructies van Arabidopsis-wortel die de op cytosol gerichte Cameleon NES-YC3.6 tot expressie brengt. Plakjes werden verkregen met een stap van 1,5 m. De enkelkanaals reconstructie (F) toont de wortelharen driedimensionaal georganiseerd rond de volgroeide zone. Wortelharen zien er recht, glad uit en volgen meestal gravitropisme, zoals in detail wordt weergegeven in (G). Dezelfde overweging kan worden gemaakt door te kijken naar de FRET-reconstructie (H). De pijl in (F–H) geeft de opnamepositie aan.

Groeiende wortelharen vertonen spontane calciumoscillaties

Om de groei van wortelhaar tijdens time-lapse-experimenten te volgen, moest het bleken van de calciumindicator (NES-YC3.6) zoveel mogelijk worden verminderd, vooral voor langetermijnanalyse van afzonderlijke cellen. Verminderde bleking werd bereikt door de afstand tussen de plakjes te selecteren (die de lichtdosis en de acquisitiesnelheid instelt). Zoals eerder vermeld, is een afstand vergelijkbaar met de dikte van de lichte plaat een goede afweging. Na het opzetten van het beeldacquisitie- en verwerkingsprotocol, hebben we het verband bestudeerd tussen calciumdynamiek in de wortelhaartoppen en hun groei. Zo hebben we de Arabidopsis-wortelharen afgebeeld in 3D time-lapse-experimenten over verschillende tijdschalen en de cpVenus- en CFP-fluorescentie gevolgd.

Als eerste volgden we de wortelhaarontwikkeling gedurende 5 uur, waarbij we elke 3 minuten een volledige volumestapel (100 vlakken met een tussenruimte van 3 m) registreerden. Het laservermogen werd bij het monster ingesteld op 20 μW om fototoxische effecten te beperken. Dankzij de lage dosis licht was het mogelijk om de wortelrijpingszone te volgen, waar de groei en verlenging van pasgeboren wortelharen en volwassen haren gedurende het hele experiment konden worden waargenomen (aanvullende film S1). Enkele wortelharen werden handmatig geselecteerd en, na beeldregistratie, werd het FRET-signaal van een interessegebied (ROI) bij de wortelhaarapex geëxtraheerd. In dit geval werd echter, hoewel het mogelijk was om de wortelhaargroei te volgen en de FRET-variaties te bestuderen, er geen relevante informatie over tipcalciumoscillaties en groeiregulatiemechanismen waargenomen vanwege de slechte tijdsbemonstering (aanvullende figuur S2). Om de tijdresolutie te vergroten, hebben we het interval tussen twee opeenvolgende acquisities dus teruggebracht tot 10 s. Om stralingsschade te voorkomen, hebben we het aantal per afbeelding verkregen plakjes teruggebracht tot 30, met een tussenruimte van 5 m. Dit maakte de detectie mogelijk van tipcalciumoscillaties (Fig. 2A Aanvullende Film S2) en de plot van de Cameleon-verhouding versus de tijd van geselecteerde ROI's die overeenkomen met verschillende wortelharen (Fig. 2B). In het bijzonder hebben we een hoogfrequente (HF) oscillatie waargenomen, gesuperponeerd op een lagere frequentie (LF) oscillatie.De resultaten van een eerste ruwe analyse van de HF-oscillaties waren vergelijkbaar met die gerapporteerd door Monshausen et al. (2008), eerder opgenomen door een enkel brandvlak te analyseren met confocale microscopie. De LF-oscillaties (waarvan de detectie langere acquisitietijden vereist en daarom verwaarloosbare fotobleking) werden echter niet gerapporteerd door de auteurs. We veronderstellen dat deze LF-oscillaties gerelateerd kunnen zijn aan de pulserende groei van wortelhaar. We hebben dit verder onderzocht door zowel de cpVenus (Fig. 3A) als de corresponderende FRET-verhouding (Fig. 3B Aanvullende Film S3) te volgen van een geselecteerd wortelhaar dat een duidelijke pulserende groei vertoonde. Om de wortelhaarverlenging beter te evalueren in een eenvoudige grafische methode, vertrouwden we op kymografen (pixellijn geel gemarkeerd in Fig. 3A) van het cpVenus fluorescerende kanaal (Fig. 3C). De afbeeldingen van de FRET-ratio die worden weergegeven in Fig. 3B laten zien dat de calciumconcentratie in de apicale 5 m van de haarpunt hoger was, en daarna snel afnam totdat een lagere calciumconcentratie werd bereikt (Bibikova et al. 1997, Wymer et al. 1997 ). Deze gradiënt hield aan zolang de wortelhaar groeide, oscillerend in de tijd. Het FRET-verhoudingssignaal, geëxtraheerd na beeldregistratie, werd uitgezet in Fig. 3D (overeenkomend met de gebieden die zijn gemarkeerd aan de top van het wortelhaar in Fig. 3B). Het calciumsignaal vertoonde een duidelijk oscillerend gedrag tijdens de groei, met een periode van ongeveer 5 min, geassocieerd met de pulserende groei, zoals benadrukt door de kymograaf, waaruit bleek dat de verlenging van het haar niet homogeen was in de tijd, maar werd gekenmerkt door een stapsgewijze groei. zoals groei, deze laatste wordt gekwantificeerd in Fig. 3D (oranje lijn). Bovendien bleek in hetzelfde voorbeeld een HF-signaal te worden gesuperponeerd op het LF-signaal, zoals eerder getoond voor de calciumsignalen die zijn gerapporteerd in Fig. 2B. Als derde acquisitiemodus hebben we, om de HF-puntcalciumoscillaties en de groeisnelheid van wortelharen beter te bestuderen, de bemonsteringssnelheid verhoogd door 3D-stapels van 15 vlakken te verwerven met een tussenruimte van 3 m elke 3 s gedurende 10 minuten. Een gemiddelde van vijf wortelharen per time-lapse-meting kon tegelijkertijd worden afgebeeld in een enkele zaailingwortel (Fig. 4A, B Aanvullende Film S4). We hebben wortelharen afgebeeld over een populatie van 12 verschillende planten om de dataset te vergroten en statistische analyse uit te voeren (zoals gerapporteerd in Fig. 5A). De FRET-verhouding van de top van geregistreerde wortelharen vertoonde nog steeds de HF-oscillaties (Fig. 4B), met een betere resolutie met betrekking tot die al gerapporteerd in Fig. 2B en 3D. Dankzij de verhoogde bemonsteringsfrequentie konden we de oscillerende componenten nauwkeurig kwantificeren door middel van Fourier-analyse. Met name het Fourier-formalisme stelde ons in staat om onbevooroordeelde statistische analyse uit te voeren van alle wortelhaaroscillaties gemeten vanuit de geanalyseerde cellen in de verschillende experimenten (verschillende zaailingen). Statistische analyse van gegevens wordt gerapporteerd in Fig. 5A die het gemiddelde toont van de genormaliseerde spectrale vermogensdichtheid (PSD), samen met zijn SD. De PSD vertoonde de aanwezigheid van twee hoofdfrequentiebanden die overeenkomen met twee verschillende oscillerende componenten. De LF-band strekte zich uit van een oscillatieperiode van 1,3 min tot 5 min (0,013 tot 0,003 Hz), en kwam ruwweg overeen met het tijdgedrag dat werd waargenomen in de experimenten gepresenteerd in Fig. 2B en 3D. In plaats daarvan varieerde de periode van de HF-oscillaties tussen 20 en 36 s (0,05 en 0,028 Hz), zoals weergegeven in figuur 4B. Als controle hebben we dezelfde routineanalyses uitgevoerd met ROI's getekend in de wortelhaarschacht of in het hoofdwortellichaam (aanvullende figuur S3A-C). In dit laatste geval benadrukt de gemiddelde PSD het ontbreken van de geïdentificeerde typische oscillatiefrequenties van de wortelhaarpunt (aanvullende figuur S3D).

MIP van de verhouding tussen de cpVenus en CFP fluorescerende kanaalbeelden verkregen uit 30 plakjes van het monster met een onderlinge afstand van 5 m (A). FRET-signaal geëxtraheerd uit drie wortelhaartoppen geëvalueerd als ΔR/R0 en uitgezet in de tijd (B). De bemonsteringstijd was 10 s en de meting werd gedurende 30 minuten uitgevoerd.

MIP van de verhouding tussen de cpVenus en CFP fluorescerende kanaalbeelden verkregen uit 30 plakjes van het monster met een onderlinge afstand van 5 m (A). FRET-signaal geëxtraheerd uit drie wortelhaartoppen geëvalueerd als ΔR/R0 en uitgezet in de tijd (B). De bemonsteringstijd was 10 s en de meting werd gedurende 30 minuten uitgevoerd.

Wortelhaar pulserende groei. MIP van een wortelhaar van het cpVenus-fluorescentiekanaal en van de verhoudingsbeelden op verschillende momenten van hun groei (respectievelijk A en B). Uit de cpVenus-frames werd door het observeren van de temporele evolutie van de pixellijn die in geel is gemarkeerd, een kymograaf geëxtraheerd (C), die de stapsgewijze verlenging benadrukt. Op de afbeeldingen van de verhouding kon, eenmaal geregistreerd, een ROI worden geselecteerd, zoals die in blauw geschetst, en het calciumsignaal kon worden geëxtraheerd (D, blauwe lijn). Bovendien kan de verlenging worden berekend als de afstand van de wortelhaartop tot zijn oorspronkelijke positie (D, oranje lijn).

Wortelhaar pulserende groei. MIP van een wortelhaar van het cpVenus-fluorescentiekanaal en van de verhoudingsbeelden op verschillende momenten van hun groei (respectievelijk A en B). Uit de cpVenus-frames werd door het observeren van de temporele evolutie van de pixellijn die in geel is gemarkeerd, een kymograaf geëxtraheerd (C), die de stapsgewijze verlenging benadrukt. Op de afbeeldingen van de verhouding kon, eenmaal geregistreerd, een ROI worden geselecteerd, zoals die in blauw geschetst, en het calciumsignaal kon worden geëxtraheerd (D, blauwe lijn). Bovendien kan de verlenging worden berekend als de afstand van de wortelhaartop tot zijn oorspronkelijke positie (D, oranje lijn).

MIP van de verhouding tussen de cpVenus en CFP fluorescerende kanalen beelden verkregen uit 15 plakjes van het monster met een onderlinge afstand van 3 m (A). FRET-signaal geëxtraheerd uit vijf wortelhaartoppen geëvalueerd als ΔR/R0 en uitgezet in de tijd (B). De bemonsteringstijd was 3 s en de meting werd 270 keer herhaald. De trend werd verwijderd om de frequenties van belang te markeren.

MIP van de verhouding tussen de cpVenus en CFP fluorescerende kanalen beelden verkregen uit 15 plakjes van het monster op een afstand van 3 m uit elkaar (A). FRET-signaal geëxtraheerd uit vijf wortelhaartoppen geëvalueerd als ΔR/R0 en uitgezet in de tijd (B). De bemonsteringstijd was 3 s en de meting werd 270 keer herhaald. De trend werd verwijderd om de frequenties van belang te markeren.

Fourier-analyse van de calciumoscillaties geëxtraheerd uit wortelhaartoppen onthulde een pulserend gedrag met de aanwezigheid van twee hoofdfrequentiebanden (LF, lage frequenties, gele achtergrond HF, hoge frequenties, groene achtergrond). De gemiddelde spectrale vermogensdichtheid (PSD) en de SE (N = 43, gearceerd) wordt gerapporteerd (A). Het calciumsignaal met hoge frequentie (blauw gevulde cirkels) van een representatieve wortelhaar werd uitgezet samen met de berekende groeisnelheid (oranje open cirkels) van hetzelfde haar (B), waarvan de pieken anticiperen op die van de calciumconcentratie. Kruiscorrelatieanalyse van calciumoscillaties met de groeisnelheid op 14 wortelharen toonde aan dat de cytosolische calciumtoename ongeveer 7 s (C) achterbleef bij de groeisnelheidspieken (C). De figuur toont de gemiddelde kruiscorrelatie uitgezet als functie van de vertraging samen met de SE (gearceerd).

Fourier-analyse van de calciumoscillaties geëxtraheerd uit wortelhaartoppen onthulde een pulserend gedrag met de aanwezigheid van twee hoofdfrequentiebanden (LF, lage frequenties, gele achtergrond HF, hoge frequenties, groene achtergrond). De gemiddelde spectrale vermogensdichtheid (PSD) en de SE (N = 43, gearceerd) wordt gerapporteerd (A). Het calciumsignaal met hoge frequentie (blauw gevulde cirkels) van een representatieve wortelhaar werd uitgezet samen met de berekende groeisnelheid (oranje open cirkels) van hetzelfde haar (B), waarvan de pieken anticiperen op die van de calciumconcentratie. Kruiscorrelatieanalyse van calciumoscillaties met de groeisnelheid op 14 wortelharen toonde aan dat de cytosolische calciumtoename ongeveer 7 s (C) achterbleef bij de groeisnelheidspieken (C). De figuur toont de gemiddelde kruiscorrelatie uitgezet als functie van de vertraging samen met de SE (gearceerd).

Groei en oscillaties zijn gecorreleerd

Het is aangetoond dat de verhoging van apicaal calcium essentieel is bij het reguleren van de wortelhaargroei (Monshausen et al. 2008), vergelijkbaar met die gerapporteerd voor pollenbuizen (Felle en Hepler 1997, Holdaway-Clarke et al. 1997). Inderdaad, in wortelharen die een sterke pulserende groei vertoonden (zoals het voorbeeld getoond in Fig. 3 waarin de beeldacquisitie was bij 10 s bemonstering), was het duidelijk duidelijk dat groei correleert met een toename van calcium in de punt (Fig. 3C, D ). Desalniettemin, door calciumvariaties te volgen samen met de groeisnelheid in de plots verkregen uit de acquisitie uitgevoerd met de hoge bemonsteringssnelheidsmodus (3 s bemonstering) (Fig. 5B), kan worden opgemerkt dat de calciumpieken overeenkomen met de HF-oscillaties volgde die van de groeisnelheid. Dit duidt op een sterke temporele relatie tussen de variatie van de cytoplasmatische calciumconcentratie en de groei zelf. Een kruiscorrelatieanalyse tussen de calciumoscillaties en de groeisnelheid van de wortelharen werd daarom uitgevoerd op een populatie van 14 wortelharen van vier zaailingen. De gemiddelde kruiscorrelatie uitgezet versus de vertraging toonde aan dat de calciumverhoging ongeveer 7,1 ± 0,9 s achterbleef bij de piek in de groeisnelheid (Fig. 5C), in overeenstemming met eerdere resultaten van Monshausen et al. (2008).

Screening van het effect van NAA in het medium langs de groei

Om ons protocol voor het screenen van de groei van zaailingen onder verschillende omstandigheden te beoordelen, hebben we de groeiparameters van de wortelharen van NES-YC3.6 Arabidopsis-zaailingen gevolgd door ze te kweken in een medium aangevuld met auxine. Van auxine is gemeld dat het de belangrijkste fytohormonale regulator is bij de ontwikkeling van wortelhaar (Lee en Cho 2006, Lee en Cho 2013, Velasquez et al. 2016, en referenties daarin). Voordat we verder gingen met de LSFM-analyse, hebben we een experiment uitgevoerd met verticaal gekweekte zaailingen die zijn gekweekt in Petrischalen, bereid met een standaard Murashige en Skoog (MS/2) medium en aangevuld met 50 nM 1-naftaleenazijnzuur (NAA). De lengtes van wortels en wortelharen van 6 dagen oude zaailingen werden gemeten met behulp van een stereomicroscoop. Zaailingen gekweekt in aanwezigheid van 50 nM NAA vertoonden een kortere primaire wortel (Fig. 6A) en wortelharen met een aanzienlijk hogere gemiddelde lengte (Fig. 6B). Dit resultaat toonde aan dat 50 nM NAA inderdaad effectief was in het beïnvloeden van het wortelgroeiapparaat in Arabidopsis, zoals eerder gemeld (Lee en Cho 2006, Lee en Cho 2013, Velasquez et al. 2016, en referenties daarin). Ons volgende doel was om te begrijpen of de waargenomen toename van de gemiddelde lengte van wortelharen (Fig. 6B), bevorderd door de aanwezigheid in het medium van 50 nM NAA, zou kunnen afhangen van de directe stimulering van de groei van jonge wortelharen evenals van invloed hebben op calciumschommelingen. We evalueerden visueel of het NAA-effect, waargenomen in zaailingen die in petrischalen waren gekweekt, kon worden gereproduceerd in planten die in de FEP-buizen waren gekweekt. Arabidopsis NES-YC3.6 zaailingen ontkiemd op standaard MS/2-medium gedurende 36-40 uur na vernalisatie werden overgebracht naar de bovenrand van FEP-buizen gevuld met standaard MS/2-medium of aangevuld met 50 nM NAA, en 6 dagen oud zaailingen werden visueel geïnspecteerd met behulp van LSFM uitgerust met een × 4 objectief (nodig om het gezichtsveld te vergroten tot 3.300 × 3.300 m2) (aanvullende figuur S 4A, B). In dit laatste geval, omdat we alleen geïnteresseerd waren in het visualiseren van het wortelapparaat en niet in het extraheren van functionele groeigegevens, hebben we beelden verkregen die alleen overeenkomen met de emissie van de cpVenus-fluorescentie. Representatieve afbeeldingen (van N ≥3) voor de twee geteste omstandigheden toonde aan dat 50 nM NAA effectief was in het bevorderen van de groei van de wortelharen in buizen (aanvullende figuur S4A, B). Daarom werden dezelfde zaailingen geanalyseerd door de LSFM-FRET-opstelling (met behulp van de × 20-doelstelling) om de groeisnelheid en calciumoscillaties van wortelharen in NAA en MS / 2 te evalueren. Interessant is dat de gemiddelde groeisnelheid van groeiende wortelharen hetzelfde was voor de twee populaties planten (Fig. 7A), wat aantoont dat NAA deze parameter niet beïnvloedde. Vervolgens hebben we de screeningroutine toegepast die eerder is beschreven voor de analyse van de calciumoscillaties van de HF-tip op de controle- en NAA-behandelde zaailingen. We hebben de PSD-spectra geëxtraheerd voor een populatie van 43 en 31 wortelharen voor respectievelijk de controle- en NAA-behandelde planten (Fig. 7B, C). Er konden twee hoofdfrequentiebanden worden geïdentificeerd voor de met NAA behandelde populatie (Fig. 7C). Om specifieke frequenties van de twee PSD's kwantitatief te vergelijken, hebben we de twee belangrijkste pieken uit het PSD-spectrum van elke zaailing geëxtraheerd, op basis van de a priori kennis van de aanwezigheid van twee oscillerende componenten. De corresponderende frequenties werden geclusterd via a k-betekent algoritme (k = 2), die twee duidelijk verschillende banden genereerde (Fig. 7B, C). Voor de twee geïdentificeerde groepen frequenties hebben we daarom de barycentra berekend, die gelijk zijn aan een oscillatieperiode van 104 s (0,0096 Hz) en 28 s (0,036 Hz) voor de controle en aan 111 s (0,009 Hz) en 29 s ( 0,035 Hz) voor de met NAA behandelde wortels. Fig. 7D toont de barycenter-waarden voor de twee populaties, met hun SD's. Het is duidelijk dat er geen verschil was tussen de frequenties van calciumoscillaties in de twee geteste omstandigheden. Dit is in overeenstemming met onze eerdere waarnemingen dat de gemiddelde groeisnelheid, die correleert met de calciumoscillaties, niet veranderde in aanwezigheid van NAA (Fig. 7A). Om deze bevinding te bevestigen, hebben we ook een twee-steekproef uitgevoerd t-test op de twee populaties, die de nulhypothese bevestigde dat de twee populaties gelijk zijn op het significantieniveau van 5% (P > 0,05).

Vergelijking tussen wildtype Arabidopsis-zaailing gekweekt in een standaard MS/2-medium of aangevuld met 50 nM NAA. Primaire wortel (A) en wortelhaarlengte (B) van zaailingen ontkiemd en gekweekt in petrischalen in aanwezigheid of afwezigheid van 50 nM NAA. Statistische analyse toont aan dat planten die worden gekweekt in aanwezigheid van NAA gemiddeld een kortere primaire wortel hebben (NCNT = 20 en NNAA = 18) (A) en langere wortelharen (NCNT = 23 en NNAA = 29) (B). Waarden zijn gemiddelden ± SD.

Vergelijking tussen wildtype Arabidopsis-zaailing gekweekt in een standaard MS/2-medium of aangevuld met 50 nM NAA. Primaire wortel (A) en wortelhaarlengte (B) van zaailingen ontkiemd en gekweekt in petrischalen in aanwezigheid of afwezigheid van 50 nM NAA. Statistische analyse toont aan dat planten die worden gekweekt in aanwezigheid van NAA gemiddeld een kortere primaire wortel hebben (NCNT = 20 en NNAA = 18) (A) en langere wortelharen (NCNT = 23 en NNAA = 29) (B). Waarden zijn gemiddelden ± SD.

Vergelijking van de wortelhaargroeisnelheid en de calciumoscillatiefrequenties van het wortelhaar die aanwezig zijn in wildtype Arabidopsis-zaailingen die zijn gekweekt onder controleomstandigheden of in een medium aangevuld met 50 nM NAA. Ontkiemde zaailingen (36-40 uur na vernalisatie) werden overgebracht van MS/2-standaardplaten naar FEP-buizen, al dan niet aangevuld met 50 nM NAA, en zaailingen werden na 6 dagen zichtbaar gemaakt door de opstelling van het lichte vel. (A) statistische analyse van de groeisnelheid van wortelhaar. Waarden zijn gemiddelden ± SD (NCNT = 43 en NNAA = 31). De twee belangrijkste pieken in de PSD van de controle (B) en NAA-behandelde monsters (C) (NCNT = 43 en NNAA = 31) werden uitgezet en geclusterd via a k-gemiddeld algoritme met k = 2. Het laagfrequente cluster wordt weergegeven door blauwe cirkels, terwijl het hoogfrequente cluster wordt weergegeven door oranje driehoeken. Zwarte kruisen worden gebruikt om de berekende zwaartepunten te visualiseren. Het gemiddelde en de SE van de twee hoofdfrequenties (LF, lage frequentie HF, hoge frequentie) van de twee populaties wordt weergegeven in (D).

Vergelijking van de wortelhaargroeisnelheid en de calciumoscillatiefrequenties van het wortelhaar die aanwezig zijn in wildtype Arabidopsis-zaailing die is gekweekt onder controleomstandigheden of in een medium dat is aangevuld met 50 nM NAA. Ontkiemde zaailingen (36-40 uur na vernalisatie) werden overgebracht van MS/2-standaardplaten naar FEP-buizen, al dan niet aangevuld met 50 nM NAA, en zaailingen werden na 6 dagen zichtbaar gemaakt door de opstelling van het lichte vel. (A) statistische analyse van de groeisnelheid van wortelhaar. Waarden zijn gemiddelden ± SD (NCNT = 43 en NNAA = 31). De twee belangrijkste pieken in de PSD van de controle (B) en NAA-behandelde monsters (C) (NCNT = 43 en NNAA = 31) werden uitgezet en geclusterd via a k-gemiddeld algoritme met k = 2. Het laagfrequente cluster wordt weergegeven door blauwe cirkels, terwijl het hoogfrequente cluster wordt weergegeven door oranje driehoeken. Zwarte kruisen worden gebruikt om de berekende zwaartepunten te visualiseren. Het gemiddelde en de SE van de twee hoofdfrequenties (LF, lage frequentie HF, hoge frequentie) van de twee populaties wordt weergegeven in (D).


PB en TB hebben het onderzoeksproject bedacht en vormgegeven. PB voerde alle computationele experimenten uit. EL leverde hoogwaardige segmentaties van 3D-gegevens en voerde analyses uit van de kwaliteit van 3D-resultaten. SC voerde diSPIM-experimenten uit met Dictyostelium cellen. PB, TB en EL schreven de krant.

We danken BBSRC voor de financiering van dit werk (verleent BB/M01150X en BB/R004579/1 aan TB en BB/M01228X/1 aan de Warwick Advanced Bioimaging RTP), en Evgeny Zatulovskiy en Rob Kay (MRC LMB, Cambridge) voor het delen van experimentele gegevens.


6 CONCLUSIES EN TOEKOMSTIGE AANWIJZINGEN

ChimeraX 1.0 combineert nieuwe functies met verbeteringen in prestaties, visualisatie en bruikbaarheid. ChimeraX is echter verre van compleet en er zijn verschillende gebieden waar we aan werken voor toekomstige releases.

Momenteel wordt een groot deel van de ChimeraX-functionaliteit aangestuurd door opdrachten. We zullen doorgaan met het ontwikkelen van gelijkwaardige grafische interfaces, het verbeteren van onze menu's en het voorzien van meer panelen voor snelle toegang tot functies en nuttige informatie over structuren en beeldgegevens.

We zullen ook nieuwe analytische tools toevoegen. Segmentatieanalyse, cryoEM-modelverfijning en bouwen met VR staan ​​bijvoorbeeld op de roadmap en ISOLDE zal ondersteuning voor modelbouw toevoegen. We werken ook aan de integratie van enkele van de webservices die worden ondersteund door UCSF Chimera 38 en aan de integratie van nieuwe ter vervanging van services die zijn stopgezet. Een ander gebied met veel ontwikkelingspotentieel is 3D-medische beeldanalyse en verwerking van DICOM-bestanden (Digital Imaging and Communications in Medicine), inclusief het lezen en presenteren van de bijbehorende metadata.

De verbeterde ontwikkelomgeving en de beschikbaarheid van de Toolshed betekenen dat andere ontwikkelaars ChimeraX zullen verbeteren op manieren die we niet voor ogen hadden. De Toolshed zal ook verbeteringen aanbrengen aan ingebouwde tools die onmiddellijk beschikbaar zijn voor gebruikers, ongeacht de timing van de releasecyclus. We hopen meer pakketten zoals ISOLDE te zien die aanzienlijke functionaliteit toevoegen aan ChimeraX.

Ten slotte zal de ontwikkeling van specifieke functies in ChimeraX inspelen op de behoeften van gebruikers en medewerkers, dus probeer het alstublieft en stel wijzigingen voor! We staan ​​open voor nieuwe ideeën.


Belangenverstrengeling

Dr. Riss is een werknemer van Promega Corporation en dhr.Trask is een werknemer van PerkinElmer, Inc.

Verificatieverklaring voor mobiele lijnen

De HCT116-cellen die in dit manuscript zijn gefotografeerd, zijn verkregen van de American Type Culture Collection. Een tussenliggende bank van de cellijn werd geauthenticeerd bij Promega met behulp van het GenePrint® 10-systeem om acht kern-STR-loci plus Amelogenin te amplificeren. Er was een overeenkomst van 88,89% tussen het ingediende monster en de ATCC STR Profile-database, wat aangeeft dat het ingediende monster vergelijkbaar is met de menselijke cellijn van ATCC: HCT116 (CCL-247). Werkcelbanken werden echter niet routinematig geverifieerd of gecontroleerd op mycoplasmabesmetting

Mensen- en dierenrechten en geïnformeerde toestemming

Er werden geen dieren rechtstreeks in dit werk gebruikt, maar in de handel verkrijgbare van dieren afgeleide extracten zoals foetaal runderserum en Matrigel® werden als reagentia gebruikt.