Informatie

Welke implicaties heeft de ontbrekende 2'-OH op het vermogen van DNA om 3D-structuren te vormen?


Het chemische verschil tussen RNA en DNA is de ontbrekende 2'-hydroxylgroep in de nucleotiden die DNA bouwen. Het belangrijkste effect van die verandering die ik ken, is de hogere stabiliteit van DNA in vergelijking met RNA. Maar ik vraag me af of dit verschil significante implicaties heeft voor het vermogen van DNA om complexe, driedimensionale structuren te vormen.

Van RNA is bekend dat het in staat is om uit complexe tertiaire structuren te komen en als ribozymen te functioneren. Het heeft duidelijk het vermogen om een ​​breed scala aan structuren te vormen en kan een verscheidenheid aan chemische reacties katalyseren.

Voor zover ik weet, zijn er geen natuurlijk voorkomende katalytische DNA's bekend. Maar in het laboratorium zijn een aantal synthetische DNA-enzymen gemaakt, dus het is over het algemeen mogelijk dat DNA katalytische structuren vormt (zie Breaker en Joyce 1994 voor het eerste gecreëerde DNA-enzym).

Ik vraag me af of de ontbrekende 2'-OH betekent dat DNA minder potentieel heeft om complexe structuren te vormen in vergelijking met RNA? Ik stel me voor dat het het vermogen om waterstofbruggen te maken verandert, maar ik weet niet of het de potentiële structuren die DNA zou kunnen aannemen, aanzienlijk zou verminderen.


Breker RR, Joyce GF; (december 1994). "Een DNA-enzym dat RNA splitst". Chem Biol. 1 (4): 223-9


Om er zeker van te zijn dat ik geen appels en peren vergelijk, zal mijn (poging tot) antwoord op de vraag in twee delen worden opgesplitst: vergelijking van enkelstrengs nucleïnezuren en dubbelstrengs nucleïnezuren.

Enkelstrengs DNA en RNA

Zowel DNA als RNA kunnen enkelstrengs complexe tertiaire structuren vormen waarin de secundaire structuurelementen zijn geassocieerd via van der Waals-contacten en waterstofbruggen. De aanwezigheid van een 2'-hydroxylgroep zorgt ervoor dat de ribosering de voorkeur geeft aan andere conformaties dan deoxyribose in DNA. Omdat de 2'-OH-groep zowel een waterstofdonor als een acceptor is, geeft het RNA een grotere flexibiliteit om complexe 3D-structuren te vormen en stabiliteit om in een van deze conformaties te blijven. Zoals Aleadam opmerkt, laat dit artikel zien dat tRNA en zijn DNA-analoog vergelijkbare tertiaire structuren vormen, hoewel tDNA niet zo stabiel is als tRNA:

Daarom stellen we dat de globale conformatie van nucleïnezuren voornamelijk wordt bepaald door de interactie van purine- en pyrimidinebasen met atomen en functionele groepen die zowel RNA als DNA gemeen hebben. In deze visie is de 2-hydroxylgroep, in ieder geval in tRNA, een hulpstructureel kenmerk waarvan de rol beperkt is tot het bevorderen van lokale interacties, die de stabiliteit van een gegeven conformatie verhogen.

Deze auteurs laten ook zien dat ten minste één lus in het tDNA-analogon gevoeliger is voor splitsing door een restrictie-endonuclease. In dit gebied heeft het tRNA een watermolecuul dat waterstof gebonden is aan de 2'-hydroxylgroep.

Meer van dergelijke interessante vergelijkingen heb ik in de literatuur niet kunnen vinden.

Dubbelstrengs DNA en RNA

Zowel DNA als RNA kunnen dubbelstrengs structuren vormen. Nogmaals, suikerconformatie bepaalt de vorm van de helix: voor DNA-helix is ​​het meestal de B-vorm, terwijl helixvormig RNA onder bijna alle omstandigheden de A-geometrie vormt. In RNA-helix vinden we de ribose voornamelijk in de C3'-endo-conformatie, aangezien 2'-OH de C2'-endo-conformatie, die nodig is voor de B-vormgeometrie, sterisch afkeurt.

Fysiologische betekenis

dsRNA en ssDNA geven vaak een signaal aan de cel dat er iets mis is. dsRNA wordt natuurlijk gezien in normale processen zoals RNA-interferentie, maar het kan ook de eiwitsynthese stoppen en virale infecties signaleren (vgl. dubbelstrengs RNA-virussen). Evenzo is ssDNA veel vatbaarder voor afbraak dan dsDNA, het signaleert vaak schade aan DNA of infecties door enkelstrengs DNA-virussen en induceert celdood. Daarom is de 3D-structuur van DNA, vanwege hun functies, onder normale omstandigheden meestal een dubbelstrengs helix, terwijl RNA een enkelstrengs, "eiwitachtige", complexe 3D-structuur heeft.


Dit is niet mijn vakgebied, dus ik riskeer hier een verkeerd/onvolledig antwoord, maar ik zou zeggen dat het cruciale verschil het bijna volledige voorkomen van dubbelstrengs DNA is dat de vorming van de tertiaire structuren in enkelstrengs RNA uitsluit. in plaats van het 2'OH-verschil. In feite, en na de link die je hebt gepost, zeggen de auteurs zelfs in de inleiding dat:

"Het is algemeen bekend dat enkelstrengs DNA interessante tertiaire structuren kan aannemen. Een tRNA en zijn DNA-analoog vormen zeer vergelijkbare structuren [9]".

Ik heb het citaat 9 [Paquette et al (1990), Eur. J. Biochem. 189.259-265], maar ze lijken uw vraag met die zin te beantwoorden. In wezen heeft het waarschijnlijk geen grote implicatie.


Het antwoord ligt geheel in de thermodynamische stabiliteit die wordt geboden door het hebben van een 2'-OH. Zoals vermeld door Aleksandra, zal RNA alleen de C3'-endo-conformatie aannemen, terwijl DNA zowel het C2'-endo als het C3'-endo overneemt. In feite maakt dit de DNA-streng flexibeler, niet RNA. Door dit te doen, zal een enkelstrengs DNA-oligomeer meer toestanden kunnen aannemen.

DNA/RNA-helixvorming is dominant enthalpisch gedreven. Wanneer een helix wordt gevormd, zal RNA alleen een A-vorm helix aannemen, terwijl DNA zowel een A-vorm als een B-vorm zal aannemen. Hoewel er meer mogelijke conformaties voor DNA zijn, is de reductie in de entropisch bijdragen maken het aanzienlijk ongunstiger. Interessant is dat dit de reden is waarom RNA-analogen zoals PNA en morfolinos goede bindingseigenschappen hebben, omdat ze een meer entropisch stabiele basenparing met hun doelsequentie zullen vormen.

Om deze redenen komt het veel vaker voor, dus zie gestructureerde Ribozymen en niet-coderende RNA's in de natuur, ook al is het fysiek mogelijk om DNAzymen te produceren. Nogmaals, een van de vele redenen waarom de RNA-wereldhypothese zinvol is.


de OH-groep op de twee posities werkt als een nucleofiele katalysator voor de splitsing van RNA of van DNA als het een dergelijke groep had. Omdat DNA gedurende het hele leven van een cel intact moet blijven, zou het desastreus zijn als het vanwege de 2'OH-groep zou worden gesplitst. RNA daarentegen wordt snel door de cel gesplitst als dat nodig is zonder nadelige gevolgen voor de genetische code van de cel, zodat het een OH-groep kan hebben.-chem major


Welke implicaties heeft de ontbrekende 2'-OH op het vermogen van DNA om 3D-structuren te vormen? - Biologie

Structurele DNA-nanotechnologie bestaat uit het combineren van ongebruikelijke DNA-motieven door specifieke structureel goed gedefinieerde samenhangende interacties (voornamelijk plakkerige uiteinden) om doelmaterialen te produceren met voorspelbare 3D-structuren. Deze inspanning heeft DNA polyedrische catenanen, robuuste nanomechanische apparaten en een verscheidenheid aan periodieke arrays in twee dimensies gegenereerd. Het systeem is gebruikt om specifieke patronen op mesoschaal te produceren door specifieke DNA-strengen te ontwerpen en te combineren, die vervolgens worden onderzocht met atoomkrachtmicroscopie. De combinatie van deze constructies met andere chemische componenten zal naar verwachting bijdragen aan de ontwikkeling van nano-elektronica, nanorobotica en slimme materialen. De organisatorische mogelijkheden van structurele DNA-nanotechnologie zijn nog maar net begonnen te worden onderzocht, en het veld zal naar verwachting uiteindelijk in staat zijn om een ​​verscheidenheid aan soorten te organiseren die zullen leiden tot opwindende en mogelijk revolutionaire materialen.


MATERIALEN EN METHODES

Sequentieanalyse van de accessoire-subeenheid van Drosophila polγ.

De SwissProt-eiwitsequentiedatabase werd doorzocht met behulp van het blastalgoritme (11) via de webserver van het National Center for Biotechnology Information (//www.ncbi.nlm.nih.gov/) voor homologen met de sequentie van de accessoire subeenheid van polγ (7). Sequentie-uitlijningen werden verkregen met de gap- en bestfit-programma's van het University of Wisconsin Genetics Computer Group-softwarepakket (GCG) (12) met behulp van het Needleman- en Wunsch-algoritme (met gap-gewicht = 5 en lengtegewicht = 4). Residuen 254� van de accessoire subeenheid van polγ (polγ-β) werden uitgelijnd met behulp van gap naar residuen 288� van de sequentie van de kristalstructuur van de Thermus thermophilus prolyl-tRNA-synthetase (Pro-RS genereus geleverd door S. Cusack van European Molecular Biology Laboratory, Grenoble, Frankrijk) (13), overeenkomend met een onafhankelijk vouwdomein in Escherichia coli pro-RS geïdentificeerd door de explosie-zoekopdracht als vergelijkbaar met de polγ-β-reeks. Kleine modificaties van deze uitlijning werden gemaakt zodat invoegingen en deleties in gebieden tussen secundaire structuren vielen.

Structurele modellering van de accessoire-subeenheid.

De eerste voorspelling van de driedimensionale (3D) vouw van de accessoire subeenheid werd verkregen van de Protein Fold Recognition-server (//www.doe-mbi.ucla.edu/people/frsvr/preds.html) op basis van het algoritme van Fischer en Eisenberg (14). Deze benadering gebruikt zowel de secundaire structuur die aan de sequentie is toegewezen door phdsec (15) (//www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html) als de Gonnet-aminozuursubstitutiematrix om de overeenkomst tussen de probesequentie te beoordelen (bijv. de accessoire subeenheid) en sequenties van de Protein Data Bank (PDB) (16, 17) van 3D-eiwitstructuren. Het gebruik van zowel primaire als voorspelde secundaire structuren bij het zoeken verhoogt de gevoeligheid ervan bij het identificeren van het eiwit met de 3D-vouw die het meest lijkt op die van de probe. Wanneer getest op een set van 68 eiwitten waarvan de 3D-structuren bekend waren maar genegeerd, kan de server voor vouwherkenning in 71 van de gevallen (14) met succes de 3D-vouw van een nieuwe sequentie herkennen.

3D-modellering werd uitgevoerd met behulp van Molecular Simulations'x02019 (Waltham, MA) InsightII en biopolymeersoftware op een Silicon Graphics (Mountain View, CA) Indigo2 grafisch werkstation. Door gebruik te maken van de sequentie-uitlijning tussen de accessoire subeenheid van Drosophila melanogaster polγ en de 2,4-Å kristalstructuur van residuen 288� van T. thermophilus pro-RS, de ruggengraat van pro-RS werd gebruikt als een structurele mal, en zijketens die verschilden in polγ-β werden afzonderlijk gesubstitueerd. Voor twee van de drie korte lussen tussen reguliere secundaire structuren die verschillen tussen polγ-β en pro-RS, werd de zoeklusfunctie in biopolymeer gebruikt om een ​​lus met een bekende structuur te identificeren met de juiste lengte, geometrie en pakking om te gebruiken als een structurele sjabloon voor de derde lus, tussen β-strengen 4 en 5, de overeenkomstige lus in de structuur van T. thermophilus histidyl-RS (VOB-invoer 1adj) (18) werd gebruikt als een sjabloon, waar nodig gevolgd door zijketensubstitutie. Wanneer zijketensubstituties resulteerden in sterische botsingen, werden deze opgelost door minimale torsiehoekaanpassingen in inzicht II, gevolgd door energieminimalisatie op alleen de lusregio's, door 100 stappen van steilste afdalingen minimalisatie met het CVFF consistente valentiekrachtveld met behulp van Discover-software (Moleculaire simulaties, Waltham, MA). De stereochemie van het uiteindelijke structurele model van het C-terminale domein van polγ-β werd gevalideerd met behulp van procheck (19, 20), en de gunstigheid van aminozuuromgevingen binnen deze structuur werd beoordeeld met behulp van de 3D Profile-methode (21) via de verifieer3D-server (http://www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Verify3D.html). 3D structurele vergelijkingen tussen het accessoire subeenheidmodel en de beschikbare kristallografische structuren van thioredoxine en de δ′ subeenheid van DNA-polymerase III werden uitgevoerd met de dali-server (22) (http://www.embl-ebi.ac.uk /dali).


Resultaten

Vouwen van het RODE subdomein

Eerder hebben we aangetoond dat het DNA-bindende domein van SB-transposase geen stabiele structuur vormt onder fysiologische omstandigheden.17 De reactie van transpositie vindt echter plaats in de celkern, in een extreem drukke omgeving. Daarom hebben we eerst onderzocht of de crowding vouwing van het RED-subdomein induceert. Er zijn twee middelen gebruikt om het effect van crowding na te bootsen: polyethyleenglycol (PEG 6000) en Ficoll'x0201070. Van deze verdringingsmiddelen wordt verwacht dat ze de compactheid van een eiwit vergroten vanwege uitgesloten volume-effecten. subdomein in aanwezigheid van toenemende concentraties van PEG 6000 (paneel A) of Ficoll� (paneel B). CD-spectra tonen aan dat het RED-subdomein alleen geen significante secundaire structuur heeft. Bovendien verhoogt de aanwezigheid van PEG 6000 of Ficoll'x0201070 de secundaire structuur in het RED-subdomein niet merkbaar bij de concentraties die in dit onderzoek zijn gebruikt. Figuur ​ Figuur1(C,D) 1 (C,D) toont 2D [ 1 H,15N]‐HSQC spectra van het RODE subdomein. De smalle verdeling van kruisende pieken in de protonendimensie geeft aan dat alleen het RODE subdomein ongeordend is (paneel C). De pieken zijn verbreed, wat kan worden veroorzaakt door de conformationele uitwisseling tussen verschillende ongeordende toestanden of door associatie. In aanwezigheid van Ficoll� worden pieken in het [ 1 H,15N]‐HSQC-spectrum van het RED-subdomein aanzienlijk scherper. Een dergelijke spectrale verandering suggereert dat de conformationele ruimte die wordt bemonsterd door het RED-subdomein (tussen verschillende ongeordende of oligomere toestanden) wordt verminderd in de aanwezigheid van crowding. Het merendeel van de kruispieken blijft echter in hun oorspronkelijke positie en de verdeling van de chemische verschuivingen blijft smal. Samen geven de CD- en NMR-gegevens aan dat het RED-subdomein ongeordend blijft onder drukke omstandigheden.

Folding van het RODE subdomein in aanwezigheid van crowding. Far UV-CD en [1H,15N]‐HSQC NMR-spectra van het RED-subdomein in aanwezigheid van PEG 6000 (A,B) en Ficoll� (C,D) werden verzameld in 20 mM waterige MES-buffer bij pH 5,0 . Het verhogen van de concentratie van crowders veroorzaakt geen significante hoeveelheid alfa‐helische structuur. Pijlen geven toenemende concentraties crowders aan.

Vervolgens is het effect van zouten op de vouwing van het RED-subdomein onderzocht. Het is bekend dat kosmotrope ionen de neiging hebben om eiwitten neer te slaan en hun structuur te stabiliseren, terwijl chaotropen de neiging hebben de eiwitoplosbaarheid te verbeteren en denaturatie te bevorderen.20 Dit gedrag is meer uitgesproken voor anionen dan voor kationen, en de typische volgorde voor de anionen Hofmeister-reeks is CO 3 2 −  > SO4 2– > H2PO4 2– >𠂟 −  >𠂜l −  >  NEE 3 −  > I −  >'s x02009 ClO 4 − en voor de kationreeks is K +  > Na +  > Mg 2+  >� 2+ (kosmotropen aan de linkerkant), waar chloride is meestal beschouwd als de scheidslijn tussen deze twee soorten gedrag. Dienovereenkomstig hebben we het effect van Na . getest2DUS4, KCl, NaCl en NaClO4 op het vouwen van het RODE subdomein. Figuur 2 toont de resultaten van titratie-experimenten met deze zouten. Verre UV-CD-spectra van het RED-subdomein laten zien dat de karakteristieke kenmerken van de alpha‐helical secundaire structuur naar voren komen bij de toevoeging van alle zouten, d.w.z. twee negatieve banden bij 208 nm en 222 nm en een positieve band bij 193 nm. Spectrale veranderingen komen overeen met de waarneming dat positief geladen eiwitten de directe Hofmeister-reeks volgen bij hoge zoutconcentraties (boven 200� mM eenwaardig zout),21 dat wil zeggen, de toevoeging van NaClO4 heeft het minste effect op de structuur van het RED subdomein. De toevoeging van Na2DUS4 leidt tot de grootste hoeveelheid alfa'x02010helische secundaire structuur, zoals beoordeeld aan de hand van de grootte van de ellipticiteit bij 222 nm (Fig. ​ (Fig. 2). 2). Bovendien, in tegenstelling tot Na2DUS4, wordt enige vermindering van de intensiteit van het CD-spectrum waargenomen na de toevoeging van KCl, NaCl en NaClO4, wat kan worden opgevat als het indirecte bewijs van zelf-associatie van het RED-subdomein. Daarom, Na2DUS4 werd geselecteerd voor NMR-experimenten.

Vouwen van het RODE subdomein in aanwezigheid van verschillende zouten. Verre UV-CD-spectra van het RED-subdomein verzameld in 20 mM waterige MES-buffer bij pH 5,0 in aanwezigheid van maximaal 800 mM NaClO4 (A), NaCl (B), KCl (C) en Na2DUS4 (NS). Pijlen geven toenemende zoutconcentraties aan. Het grootste gehalte aan alpha‐helical wordt waargenomen in aanwezigheid van Na2DUS4.

NMR-oplossingsstructuur van het RED-subdomein

2D [1H,15N]‐HSQC-spectrum met NMR-signaaltoewijzingen wordt weergegeven in figuur ​ figuur3. 3 . Resonantie-opdrachten werden uitgevoerd zoals beschreven in de sectie Materialen en methoden. Residunummers weergegeven in figuur 3 3 komen overeen met posities in de oorspronkelijke, volledige SB-transposasesequentie.7 De aminozuursequentie van het RED-subdomein wordt ter referentie weergegeven in figuur 3 3. De secundaire structuurelementen van het RED-subdomein werden geïdentificeerd met behulp van de TALOS22- en CSI23-software. Beide methoden voorspellen drie α‐helices (residuen 67�, 84� en 100� volgens TALOS en 67�, 84�, 100� volgens CSI) voor het RED subdomein (Fig. S1 ), in overeenstemming met CD-experimenten [Fig. ​ [Fig.2 2 (D)].

NMR-oplossingsstructuur van het RED-subdomein. (A) Toegewezen [15N‐ 1 H]‐HSQC-spectrum van het RED-subdomein. Het spectrum werd opgenomen in 20 mM waterig (5% D2O/95% H2O) MES-buffer bij pH 5,0 in aanwezigheid van 650 mM Na2DUS4. De aminozuursequentie van het RED-subdomein, die residuen 63� van de oorspronkelijke SB-transposasesequentie7 bevat, wordt ter referentie onder het spectrum getoond. (B) NMR-oplossingsstructuur van het RED-subdomein. Cα sporen van over elkaar heen geplaatste 10 structuren met de laagste energie (links) en de cartoonrepresentatie van de representatieve structuur van ROOD (rechts) worden getoond. De geïdentificeerde alfa-helices worden aangeduid als H1, H2 en H3.

Het geheel van over elkaar heen geplaatste 10 minimale energiestructuren die voor de uiteindelijke analyse zijn geselecteerd, wordt getoond in figuur ​ figuur3(B). 3 (B).Deze structuren hebben RMSD's van de coördinaten van Cα backbone-atomen voor goed geordende residuen (d.w.z. residuen die zijn opgenomen in drie secundaire structuurelementen) van 0,8 ±𠂐.2 Å. Coördinaten voor de 10 laagste energiestructuren werden gedeponeerd in de Protein Data Bank onder de pdb toegangscode 5UNK. BMRB ID voor dit item is 30239. Afbeelding ​ Afbeelding3(B) 3 (B) toont ook een representatieve, laagste energiestructuur van het RODE subdomein in cartoonweergave aan de rechterkant. Experimentele structuur van het RED-subdomein toont de aanwezigheid van drie α‐helices. De helices overspannen de residuen R67‐I78 (helix H1), A84‐T94 (helix H2) en I100‐L112 (helix H3), waar helices H1 en H2 bijna evenwijdig aan elkaar zijn gerangschikt, en helix H3 er bovenop vouwt . De helices zijn iets langer dan voorspeld door TALOS en CSI. Het totale helixgehalte van het RED-subdomein is �%. De helices H1 en H2 zijn verbonden door een winding van vier resten (resten N79‐T83), waarbij proline P80 de tweede rest vormt. Helix H2 van het voorspelde helix'x02010turn'x02010helix-motief eindigt met een glycineresidu en is gekoppeld aan helix H3 door een lange lus van zes'2010residuen. Deze lus vormt geen strakke canonieke bèta-turn, maar vormt een bocht-achtige uitgebreide conformatie. De berekende structuur onthult de aanwezigheid van een C3′�/C′G helix H2 capping-motief dat wordt gevormd door residuen L91�TGTK‐V98 die een hxxx‐Gpxh-patroon vertegenwoordigen (h = hydrophobic, x =  indifferent, G = glycine en p = polaire residuen).24 Cβ chemische verschuivingen kunnen helix capping voorspellen en bèta‐turn structurele motieven in eiwitten met hoge nauwkeurigheid.25 In het geval van het RODE subdomein, Cβ chemische verschuivingen van het traject van residuen tussen L91 en V98 volgen het verwachte patroon voor alpha‐helix capping-motief. Residuen K97‐I100 zijn in verlengde conformatie, in de aanloop naar helix H3.

De structuur van het RODE subdomein lijkt op structuren van het overeenkomstige subdomein van nauw verwante Tc1/mariner-transposasen Mos1 en Tc3,15, 26, maar het heeft langere helices H2 en H3 en lussen die de helices verbinden (Fig. ​ (Fig.4). 4). De H2-helix in het RED-subdomein omvat 11 residuen, terwijl deze in Tc3- en Mos1-transposasen respectievelijk 9 en 5 residuen omvat. De H3-helix in het RED-subdomein omvat 14 residuen versus 12 residuen in Tc3 en 11 residuen in Mos1-transposase. De lus die de helices H1 en H2 in het RED-subdomein verbindt, is 5 residuen lang, terwijl het in Tc3- en Mos1-transposasen respectievelijk slechts 3 en 2 residuen is. De lus die de helices H2 en H3 verbindt, is 6 residu's lang in het RED-subdomein en slechts 4 residu's lang in Tc3- en Mos1-transposasen. Sequentie-uitlijning volgens de overeenkomst van de drie structuren gedaan met PROMALS3D meervoudige sequentie- en structuuruitlijningsserver27 weerspiegelt deze verschillen (Fig. ​ (Fig. 4 4).

Structurele uitlijning van het RED-subdomein van de SB-transposase en C‐terminale DNA‐-bindende subdomeinen van Tc3 (pdb-code 1U78 26 ) en Mos1 (pdb-code 3HOS 15 ) transposases. Eiwitstructuren werden over elkaar heen gelegd en vervolgens alleen maar verschoven x (horizontale as. Structurele uitlijning werd gedaan met behulp van de PROMALS3D-server voor meervoudige sequentie- en structuuruitlijning.27 De RMSD over backbone Cα-atomen tussen het RED-subdomein en de corresponderende Tc3- of Mos1-subdomeinstructuren is respectievelijk 3,5 Å en 3,7 Å. De drie alfa-helices worden aangeduid als H1, H2 en H3. Het helix‐turn-helixmotief in de subdomeinen Tc3 en Mos1 wordt gevormd door helices H2 en H3. De uitlijning van de aminozuursequentie volgens de overeenkomst van de drie structuren toont een lage aminozuursequentieovereenkomst tussen het RED-subdomein en de overeenkomstige subdomeinen van Tc3- en Mos1-transposasen, en de enige drie residuen in geconserveerde posities zijn onderstreept. Resten die alfa-helices vormen, worden in rood weergegeven. De positie van helices in het RODE subdomein wordt ook aangegeven door rode rechthoeken boven de aminozuursequentie.

Het RODE subdomein dat bindt aan het transposon-DNA

Eerder hebben we vastgesteld dat het RED-subdomein, wanneer het deel uitmaakt van het volledige DNA-bindingsdomein, bindt aan de buitenste bindingsplaats op de omgekeerde terminale herhaling van het SB-transposon, zij het zwak.17 Echter, vanwege ernstige verbreding van vrijwel alle NMR-signalen afkomstig van het RED-subdomein kon de DNA-bindingsplaats niet worden bepaald. Om de DNA-bindingsplaats op het RED-subdomein te lokaliseren, onderzochten we de interactie van het geïsoleerde RED-subdomein met de DNA-sequentie die overeenkomt met de buitenste bindingsplaats die zich op de linker omgekeerde terminale herhaling van het transposon-DNA, Lo, bevindt door veranderingen in de chemische verschuiving te volgen. in het RODE [ 1 H,15N]‐HSQC-spectrum in aanwezigheid van toenemende concentraties DNA. Deze experimenten werden uitgevoerd bij 650 mM Na2DUS4, omdat bij een lagere zoutconcentratie veel signalen afkomstig van residuen in helices significante verbreding vertoonden als gevolg van intermediair tot langzaam conformationeel uitwisselingsregime tussen gevouwen en ongevouwen conformaties, en daarom niet waarneembaar of gemakkelijk te onderscheiden waren in het spectrum. De aanwezigheid van 650 mM zout verminderde de elektrostatische bijdrage aan de binding gedeeltelijk, maar de zoutonafhankelijke niet-elektrostatische component, afkomstig van dehydratatie-effecten, van der Waals-interacties en waterstofbinding, werd niet beïnvloed.28 Kleine veranderingen werden waargenomen in de [ 1 H‐ 15 N]‐HSQC-spectrum van het RED-subdomein na toevoeging van een molverhouding tot 1:1 van Lo, consistent met het beeld verkregen uit eerdere analyse dat de interactie tussen het RED-subdomein en het transposon-DNA zwak en dynamisch.17 Door kleine spectrale veranderingen is het niet mogelijk om een ​​dissociatieconstante te bepalen voor de RED‐Lo interactie. Afbeelding ​ Afbeelding 5(A) 5 (A) illustreert signaalveranderingen die worden veroorzaakt door binding aan de Lo-sequentie. Zowel de chemische verschuiving als de intensiteit van sommige signalen veranderen, wat aangeeft dat de binding zich in het intermediaire langzame uitwisselingsregime bevindt, gekenmerkt door matige verschuiving en significante verbreding van de [ 1 H,15N] ‐HSQC-signalen vanuit hun ongebonden positie. Resonanties van amiden die de grootste chemische verschuivingsverandering ondergaan bij DNA-binding, ervaren de meest uitgebreide lijnverbreding in het [1H,15N]‐HSQC-spectrum. Het volledige spectrum wordt gegeven in figuur S2. Chemische verschuivingsveranderingen en signaalintensiteitsverliezen werden waargenomen voor amiden door het hele eiwit. De residuen die worden beïnvloed door de aanwezigheid van Lo hebben een blauwe kleurcode op de structuur van het RODE subdomein [Fig. ​ [Fig.5(B)]. 5 (B)]. Het effect was echter het meest uitgesproken voor residuen die zich clusteren rond helices H3 en de lus die helices H3 en H2 verbindt, in overeenstemming met de voorspellingen dat de helix H3 de belangrijkste plaats is voor de interactie met DNA in een variatie van het helix‐turn‐helix-motief .29, 30 Dit resultaat komt overeen met de verwachte locatie van de bindingsplaats van het RED-subdomein op basis van de vergelijking met de bekende X‐ray-structuren van Tc3- en Mos1-transposasen opgelost in de DNA-gebonden vorm15, 26 en met de recentelijk voorgestelde structureel model van het SB-transposase'x02010DNA-complex.14 Het is ook consistent met de locatie van de DNA''x02010-bindingsplaats op het C''x02010terminale domein van andere bipartiete DNA''x02010-bindende PAIRED-domeinen, waarmee het DNA''x02010-bindende domein van SB-transposase gelijkenis vertoont .31, 32, 33, 34 Verder is de helix H3 amfipathisch met de zijketens van polaire en positief geladen residuen (S101, T102, K104, R105, Y108 en R109) uitsteken van het oppervlak, in staat om contact te maken met DNA.

Binding van het RED subdomein aan DNA. (A) Sectie van het [15N,1H]‐HSQC-spectrum van het pure RED-subdomein (blauw) en van het RED-subdomein in aanwezigheid van 1:0,5 (cyaan) en 1:1 (rood) molaire verhouding van de DNA-sequentie overeenkomend met de buitenste transposase-bindingsplaats op de linker ITR (Lo). De spectra werden verzameld in waterig (5% D2O/95% H2O) 20 mM MES-buffer bij pH 5,0 in aanwezigheid van 650 mM Na2DUS4. (B) Cartoonstructuur van het RED-subdomein toont in blauw residuen die worden beïnvloed door de binding aan de Lo-sequentie. De helices H2 en H3 en de linker daartussen die een turn‐-achtige conformatie vormen, komen overeen met het helix‐turn'x02010helix-motief dat is geïdentificeerd in verwante transposasen Tc3 en Mos1. (C) Elektrostatische oppervlakken uitgezet op een representatieve structuur van het rode subdomein. Elektrostatische potentiaal is berekend met behulp van de adaptieve Poisson'x02010Boltzmann-oplosser (APBS)52 en gevisualiseerd met PYMOL.51 Oppervlakken worden gekleurd door lading (rood is negatief, blauw is positief, wit is ongeladen of hydrofoob). De schaal wordt weergegeven onder de vlakken. Het RODE subdomein wordt weergegeven in twee oriëntaties die 180° rond zijn verticale as zijn gedraaid.

Sommige residuen buiten de helix H3, bijvoorbeeld op de helix H1, vertoonden ook veranderingen na toevoeging van DNA. Om meer inzicht te krijgen in de DNA-bindingseigenschappen van het RED-subdomein, hebben we het elektrostatische oppervlak van het RED-subdomein geanalyseerd. Afbeelding ​ Afbeelding5(C) 5 (C) toont elektrostatische potentiaal afgebeeld op het oppervlak van het RODE subdomein in twee oriëntaties, één is vergelijkbaar met de oriëntatie in afbeelding ​ Afbeelding5(B) 5 (B) en een andere is 180° gedraaid om de verticale as. Het RED-subdomein is een zeer positief geladen molecuul dat 9 arginine- en 7 lysine-residuen bevat. Vijf van deze residuen bevinden zich op helix H3, vier op helix H1 en twee lysines bevinden zich op helix H2 met zijketens naar buiten gericht in de richting van helix H3. Het elektrostatische oppervlak toont een groot positief geladen gebied gevormd door residuen op helices H3 en H2 en op de C‐terminus, consistent met dit gebied dat een DNA‐-bindingsplaats vormt. Er is echter nog een ander positief geladen gebied gevormd door helix H1 aan de andere kant van het molecuul. Aangezien de interactie tussen het RED-subdomein en DNA zwak is, zou dit stukje positieve lading ook kunnen deelnemen aan voorbijgaande interacties tussen het RED-subdomein, in ieder geval geïsoleerd, en Lo-DNA. Dit zou consistent zijn met niet-specifieke DNA-bindingsactiviteit van het RED-subdomein dat eerder is opgemerkt.9 Dienovereenkomstig zijn een aantal redenen voor de verandering in chemische verschuiving en intensiteit voor residuen weg van helix H3 aannemelijk. Ten eerste, aangezien de chemische verschuiving zeer gevoelig is voor elk type structurele variatie, is het waarschijnlijk dat deze residuen indirect worden beïnvloed door mogelijke conformationele veranderingen in het eiwit bij binding aan DNA. Inderdaad, zijketens van sommige van deze residuen zijn gericht op het binnenste van het eiwit (bijv. D68, E69 en V76). Ten tweede kunnen tijdelijke interacties met DNA via de tweede positief geladen patch gevormd door helix H1 ook een bijdrage leveren die leidt tot signaalveranderingen (bijv. R70, R74 en K75).


Discussie

We hebben de oplossingsstructuur van apo p63-DBD bepaald met behulp van NMR-spectroscopie (Fig. 1) en de interactie gekarakteriseerd met verschillende DNA-bindingsplaatsen (Fig. 3 en 4) en het anti-apoptotische Bcl2-familielid BclxL (Fig. 5). p63-DBD heeft een bijna identieke structuur als p53-DBD (figuur 2b). Er zijn echter verschillen in DNA-bindingsspecificiteit en in thermodynamische stabiliteit die p63 een aantrekkelijk doelwit maken om de structurele basis van DNA-bindingsspecificiteit en eiwitstabiliteit bij de p53-eiwitfamilie te begrijpen.

Ondanks de beschikbaarheid van structurele informatie en DNA-bindingsgegevens, is de doelgenspecificiteit van p63 nog niet duidelijk. Transactivatie van p53-doelgenen die het stoppen van de celcyclus door p63 reguleren, is aangetoond door in vivo DNA-bindingsassays 58 en ChIP-experimenten met E1A tot expressie brengende muizenembryofibroblasten onthulden p63-binding aan pro-apoptotische p53-doelgenen evenals MDM2, waarvan de expressie leidt tot p53-afbraak 59 . Een andere factor is het voorkomen van afgeknotte p63-varianten die hun N-terminale transactivatie (TA) domein (ΔNp63) missen. Deze varianten nemen een transcriptie-repressieve rol aan 4 en zijn in staat om transcriptie van p53-doelgenen te remmen. Verder bevatten p63 en p73 een C-terminaal SAM 26 en regulerend domein 25 die hun vermogen om doelwitgenen te transcriberen beïnvloeden. Een andere laag van complexiteit wordt toegevoegd door de aanwezigheid van 13 verschillende oligomere toestanden, waarbij het dimeer de transcriptie-inactieve lijkt te zijn en het tetrameer de actieve soort. De vorming van tetrameren en de resulterende p63 DNA-bindingsactivering wordt bevorderd door fosforylering 13 .

Er is aangetoond dat de knock-out van p63 en p73 geen invloed heeft op de transcriptie van genen die het stoppen van de celcyclus reguleren, zoals: p21 59 . P63 en p73 lijken echter vereist te zijn voor efficiënte inductie van pro-apoptotische p53-afhankelijke genen. Deze resultaten geven aan dat apoptose-gerelateerde genen specifiek worden gereguleerd binnen de gehele p53-familie. Aan de andere kant wordt p63-gemedieerde epitheliale ontwikkeling niet beïnvloed door p53 knock-out. Onze DNA-bindingsassays (Fig. 3) geven in verschillende mate interactie aan van p53 en p63 met DNA-responselementen die betrokken zijn bij het stoppen van de celcyclus, apoptose en ontwikkeling. Eerder is gemeld dat DNA-binding van p53 afhankelijk is van de oprichting van een dubbele zoutbrug 41, een specifiek kenmerk van p53. We hebben daarom een ​​dubbele zoutbrug in p63-DBD geïntroduceerd en de verandering in bindingsaffiniteit vergeleken met wildtype p63. De veronderstelling is dat p63-DBD dat in staat is een zoutbrug te vormen, bindt aan p53-afhankelijke genen met hogere affiniteit, terwijl minder p53-afhankelijke genen zwakker of geen afhankelijkheid zouden vertonen van de aanwezigheid van de dubbele zoutbrug. In lijn met gepubliceerd in vivo gegevens 59 de grootste verandering in affiniteit kon worden waargenomen voor p21 RE, wat een minder dominante rol van p63 bevestigt bij de inductie van arrestatie van de celcyclus. Een p53-specifieke consensussite (con2 × 5) vertoonde een vergelijkbare afhankelijkheid van de aanwezigheid van de dubbele zoutbrug. De betrokkenheid van de dubbele zoutbrug bij coöperatieve DNA-binding met hoge affiniteit zou ook kunnen worden bevestigd door NMR-onderzoek naar verstoring van de chemische verschuiving met p53-DBD versus wt-p63-DBD (Fig. 4). Deze gegevens tonen aan dat p53 is geëvolueerd voor binding met hoge affiniteit aan DNA en dus strak moet worden gereguleerd door een zorgvuldig uitgebalanceerd eiwitproductie en afbraak-evenwicht. Daarentegen binden aan de Bax RE wordt niet significant beïnvloed door de dubbele zoutbrug, wat bevestigt dat pro-apoptotische genen mogelijk minder p53-specifiek zijn. De p63-afhankelijke RE van Jag-1 48, een gen dat betrokken is bij celdifferentiatie en proliferatie, vertoont een vergelijkbaar zoutbrugonafhankelijk affiniteitspatroon als Bax. Recente onderzoeken hebben aangetoond dat p63 minder vatbaar is voor afbraak via de ubiquitine-proteasoomroute 60 , vanwege een lagere affiniteit tussen Mdm2 en p63. Het is daarom waarschijnlijk dat de cellulaire concentratie van p63 hoger is dan die van p53, waardoor p63 efficiënt kan binden aan DNA-elementen en zelfs kan concurreren met p53.

Het belang van p63 bij de inductie van apoptose wordt onderstreept door zijn interactie met het anti-apoptotische eiwit BclxL (Fig. 5). Het interactieoppervlak tussen beide eiwitten bestaat uit het positief geladen DNA-bindende grensvlak in p53/p63-DBD (aanvullende figuur 3) en een negatief geladen oppervlak in BclxL 50,57. Zoals eerder aangetoond voor p53, induceert directe interactie met Bcl2-eiwitten snelle mitochondriale apoptose 49,50,54,55,56 op een transcriptie-onafhankelijke manier. Om zijn rol in de ontwikkeling van ledematen en epitheliale ontwikkeling te vervullen, zou p63 zowel directe als indirecte apoptose-routes kunnen gebruiken. Het apoptotische potentieel van p63 is ook in overeenstemming met zijn rol in de bescherming van vrouwelijke kiemlijn en zijn sterke expressiepatroon in oöcyten 13 , waar het betrokken is bij door DNA-schade geïnduceerde oöcytdood, onafhankelijk van p53.

Vergeleken met p53 vertoont p63-DBD een meer dan 20 ° C verhoogde thermische stabiliteit (figuur 2c). Een verscheidenheid aan kankergerelateerde p53-DBD-puntmutaties leiden tot een significante destabilisatie van het toch al kwetsbare eiwit, waardoor een goede vouwing en gentransactivering wordt verhinderd. De basis voor de lage stabiliteit van p53-DBD is een ongunstige pakking van de hydrofobe kern, veroorzaakt door geïsoleerde polaire zijketens en interne holtes (figuur 2f). Er zijn enorme inspanningen geleverd om p53-DBD-varianten met verhoogde stabiliteit te ontwerpen voor structurele studies 31,32,33,43,44 die uiteindelijk zouden kunnen worden gebruikt voor gentherapeutische benaderingen 61 . Voor een van deze onderzoeken diende onze p63-DBD-oplossingsstructuur als een sjabloon voor het semi-rationele ontwerp van p53-varianten 44 . Verder zijn kleine moleculen die de actieve conformatie stabiliseren gerapporteerd voor p53 34,35. De hydrofobe pakkingskwaliteit is aanzienlijk verbeterd in p63-DBD (Fig. 2e) en geoptimaliseerde p53-varianten vertonen bijgevolg hetzelfde aminozuurtype op kritieke posities als gevonden in p63 of stabielere p53-orthologen. Vanwege de hoge thermodynamische stabiliteit is het minder waarschijnlijk dat p63-DNA-bindingsactiviteit wordt verminderd door enkele puntmutaties in de eiwitkern, zoals aangetoond voor het p53-geval. Verder zijn er geen destabiliserende mutaties binnen p63-DBD gevonden in kankerweefsels 19 . Er is daarom gesuggereerd dat p63 werkt als een oncogen en niet als een tumorsuppressor. De oncogene vorm van p63 is de ΔN-variant die zijn N-terminale transactiveringsdomein mist. Deze variant kan nog steeds binden aan DNA-elementen en concurreren met p53 en p63 van volledige lengte om apoptose te onderdrukken 62 . Mutaties in p63 zijn geïdentificeerd bij ontwikkelingsziekten, zoals EEC 63 en ADULT 64 , die het DNA-bindingsvermogen beïnvloeden en niet de eiwitstabiliteit. Tot nu toe is het niet duidelijk welke factoren de bindingsspecificiteit en cellulaire functies van de individuele leden van de p53-familie bepalen. Hoewel er veel informatie beschikbaar is voor p53, zijn p63 en in het bijzonder p73 veel minder goed onderzocht. Toekomstige structurele en functionele studies zijn nodig om deze open vragen te verhelderen.


Tools om MD populair te maken

Voorbereiding voor simulatie impliceert het volgen van een reeks bewerkingen die verre van gewoon routine zijn. Ten eerste komt de initiële structuur uit het experiment. Verwachte problemen zijn onder meer niet-gestructureerde of ontbrekende regio's of residuen, niet-standaard liganden of zelfs structuren die fouten bevatten bij de interpretatie van experimentele gegevens. Wanneer een enkel systeem wordt gesimuleerd, is alle inspanning bij de voorbereiding van het systeem de moeite waard, omdat het de kwaliteit van het simulatieresultaat garandeert. Een dergelijke instelling wordt meestal handmatig gedaan, met een aanzienlijke menselijke inspanning. Een standaardprocedure om een ​​systeem op te zetten impliceert een aantal bekende procedures: structuurfouten fixeren ionisatie van titreerbare aminozuren toevoeging van structurele watermoleculen, tegenionen, en oplosmiddel- en energieminimalisatie en equilibratie van het systeem op de gewenste temperatuur. Een deskundige modelleur voert deze procedures normaal gesproken uit met behulp van een set hulpprogramma's. Zo'n deskundige heeft de nodige kennis om specifieke problemen die zich kunnen voordoen op te lossen. De workflow die in het MoDEL-project84 werd gebruikt, was bijvoorbeeld geprogrammeerd om automatisch te werken, maar een niet te verwaarlozen fractie van meer dan 1500 bereide eiwitten faalde op een bepaald punt van het proces. Met dit scenario kan voor nieuwkomers in MD-simulatie zelfs een enkele systeemconfiguratie een onbetaalbaar probleem vormen. Erger nog, niet-deskundige gebruikers hebben de neiging om blindelings standaardprocedures te gebruiken die gemakkelijk leiden tot kunstmatige trajecten, die moeilijk te onderscheiden zijn van de juiste. Dit draagt ​​sterk bij aan het gebrek aan populariteit van biomoleculaire simulaties onder de bioinformatica of de biochemische gemeenschap. MD-simulaties zijn beperkt gebleven tot die onderzoeksgroepen die over de nodige expertise beschikken. Om dit probleem op te lossen, is een automatische instelling van het simulatiesysteem vereist. We zouden op zoek zijn naar een slimme zwarte doos voor de niet-experts, maar ook naar een robuuste softwaresuite die een groot aantal niet-gerelateerde eiwitstructuren kan verklaren. Alle belangrijke MD-codes56� worden geleverd met een set bijbehorende programma's, die de meeste stappen van de voorbereiding uitvoeren. Daarnaast zijn er een aantal initiatieven ontstaan ​​die deze tools combineren met een gebruiksvriendelijke interface om dit probleem aan te pakken. CHARMM-Gui85 en CHARMMing,86 voor CHARMM, of Guimacs,87 Gromita,88 en jSimMacs,89 voor GROMACS, bieden automatische instellingsfunctionaliteit. VMD90 biedt een aantal plug-ins waarmee simulaties met NAMD kunnen worden gestart. De meeste van deze tools bieden een vriendelijke omgeving om systemen voor te bereiden op simulatie zonder dat een diepgaande kennis van de onderliggende operaties nodig is, waardoor de toegang tot het veld voor nieuwkomers wordt vergemakkelijkt. Helaas, vanwege het ontbreken van een standaard voor de weergave van moleculaire simulatiegegevens, zijn de meeste hulptoepassingen beperkt tot een enkel MD-pakket en zijn gegevens niet gemakkelijk uitwisselbaar. Trouwens, hoewel de meeste een soort van embedded scripttaal gebruiken, is het automatiseren van procedures geen eenvoudige taak. De lessen die door onze groep werden geleerd bij de voorbereiding van de MoDEL-database, leidden tot het genereren van een nieuwe set tools, MDMoby en MDWeb91, die beide aspecten van het probleem proberen te dekken. Aan de ene kant biedt MDMoby een volledige set webservices, die alle setup-, simulatie- en analysebewerkingen omvatten. Het modulaire karakter van een dergelijke verzameling webservices maakt het mogelijk ze op te nemen als een toolkit voor het ontwerpen van complexe setup-protocollen en om ze programmatisch uit te voeren. Op zijn beurt biedt MDWeb, een webgebaseerde interface, een gebruiksvriendelijke bank waar de gebruiker de kwaliteit van de invoerstructuur kan controleren, zijn eigen configuratieprotocollen kan aanpassen of een verzameling vooraf gedefinieerde protocollen kan gebruiken.


CONCLUSIES/PERSPECTIEF

Ondanks de enorme vooruitgang op het gebied van i-motief structurele biologie in de afgelopen jaren, vereisen veel aspecten nog nader onderzoek. De huidige gegevens suggereren sterk dat i-motieven zich tijdelijk in de cel vormen. Maar meer in vivo studies zijn absoluut nodig om de vorming van i-motief in verschillende fasen van de celcyclus te bevestigen. Daarnaast verder onderzoek naar i-motiefherkenning door eiwitten en kleine liganden in vitro en in vivo zijn essentieel om de rol van i-motieven in verschillende biologische processen op te helderen. Door het dynamische karakter van i-motieven worden deze studies met name bemoeilijkt in vivo, door de moeilijkheid om onderscheid te maken tussen herkenning van C-rijke sequenties of herkenning van de feitelijke i-motiefstructuur. Synthetische i-motiefconstructies gestabiliseerd door chemische modificaties (bijv. 2′F-ANA) kunnen deze onderzoeken vergemakkelijken door deze intrinsiek dynamische sequenties te 'bevriezen' in de potentieel actieve i-motiefconformatie. Chemisch gemodificeerde i-motieven, stabiel over een breed scala van omstandigheden in vergelijking met hun ongemodificeerde tegenhangers, kunnen ook worden gebruikt voor screeningsexperimenten om nieuwe eiwitten en kleine liganden te identificeren die deze structuur specifiek herkennen.

Er is nog veel te weten over i-motiefstructuren. In vergelijking met G4's zijn er slechts enkele i-motiefstructuren bepaald met NMR of kristallografische methoden. Op dit moment is het niet mogelijk om de stabiliteit van een i-motief te voorspellen op basis van de volgorde ervan. Daarom is er meer structurele informatie nodig om het effect van capping-interacties en de lussen die de C-kanalen verbinden op de stabiliteit van het i-motief volledig te begrijpen. Ondanks de recente bevindingen van i-motief-liganden, is het aantal bekende i-motief-specifieke binders zeer beperkt in vergelijking met G4-liganden. Er is nog geen driedimensionale structuur van een i-motief/ligand-complex bepaald. Dit zal een belangrijke prestatie zijn voor de ontwikkeling van potentiële medicijnen op basis van i-motiefherkenning.

Sinds de eerste jaren van de eeuw hebben verschillende aspecten van G4's aanzienlijke onderzoeksinteresse gekregen, voornamelijk vanwege hun thermodynamische stabiliteit onder fysiologische omstandigheden. De i-motiefstructuur is echter al jaren het lelijke eendje in de familie van niet-canonieke DNA-structuren. De recente resultaten werpen een nieuw licht op het i-motiefveld, dat de komende jaren tot bloei zal komen.


Deel 2: In een RNA-splicingmachine

00:00:07.19 Ik ben Anna Marie Pyle van Yale University
00:00:09.27 en vandaag ga ik je vertellen over de structuur
00:00:12.20 en de functie van een RNA-splicingmachine,
00:00:15.10 wat een RNA-molecuul is dat katalytisch kan knippen
00:00:18.15 en religate stukjes RNA, en hecht het aan elkaar.
00:00:24.28 De machine waar ik me vandaag op ga concentreren, wordt het zelfsplitsende intron van Groep II genoemd.
00:00:29.03 en dit molecuul is een zeer groot ribozym, of katalytisch RNA,
00:00:33.19 die zijn eigen splitsing en zijn eigen omzetting kan katalyseren,
00:00:37.02 wat betekent dat je terug moet springen naar eerdere splitsingsplaatsen.
00:00:41.09 En dit zijn hele, hele grote enzymen
00:00:44.01 en ze behoren tot de grootste ribozymen in de natuur.
00:00:47.27 En zoals je hier kunt zien,
00:00:49.09 dit is de reactie die ze katalyseren - het gaat door twee stappen.
00:00:52.21 In de eerste stap vouwt het intron zich op tot een structuur
00:00:56.11 die de splitsingsreactie kan katalyseren,
00:00:59.18 dat wordt gemedieerd door water,
00:01:01.12 of de 2'-hydroxylgroep (2'-OH) van een adenosine in het intron.
00:01:05.15 Na die stap krijg je een lariat intermediate en,
00:01:09.00 in de tweede stap van het splitsen,
00:01:10.16 valt de 3'-OH-groep van de 5'-splitsingsplaats opnieuw aan,
00:01:14.22 vrijgeven van een lasso-intron en geligeerde exons.
00:01:19.07 Dit zou je bekend moeten voorkomen
00:01:20.13 omdat het dezelfde soort reactie is die wordt gekatalyseerd
00:01:23.12 door je nucleaire spliceosoom,
00:01:25.06, de splitsingsmachine die belangrijk is voor het verwerken van al onze RNA's.
00:01:30.14 Om dit in perspectief te plaatsen,
00:01:32.10 realiseer je dat de meeste van je pre-mRNA's, of voorloperberichten,
00:01:37.15 hebben maar liefst 10 introns en soms meer.
00:01:40.29 En deze moeten worden verwijderd door de functie van je spliceosoom.
00:01:44.16 Het is dus erg belangrijk dat we de specificiteit begrijpen
00:01:47.02 en het mechanisme van deze reactie.
00:01:50.02 Als modelsysteem,
00:01:50.25 Ik heb me gefocust op het Groep II intron zelfsplitsend systeem.
00:01:55.03 Het verschil tussen deze systemen is dat de gevouwen structuur
00:01:58.07 van het intron zelf katalyseert deze reactie
00:02:01.25 bij afwezigheid van eiwitten,
00:02:03.25 terwijl het spliceosoom honderden eiwitten nodig heeft
00:02:07.23 en een reeks zeer sterk geconserveerde RNA-moleculen
00:02:09.28 om dezelfde reactie te katalyseren.
00:02:12.08 Het zijn dus nuttige parallelle systemen om de mechanica van splicing te begrijpen.
00:02:19.21 Dus laten we ons wat meer concentreren op hoe Groep II-introns eruit zien:
00:02:23.02 hun domeinarchitectuur en secundaire structuur bestaat uit zes stammen of domeinen
00:02:27.27 die uitstralen vanuit een centraal wiel zoals dit.
00:02:31.13 Domein 1, of het grootste domein,
00:02:33.14 wordt altijd eerst getranscribeerd en gevouwen
00:02:36.23 en het is een soort steigerdomein waar alle andere domeinen in aanmeren.
00:02:40.28 Het bevat ook sequenties voor het herkennen van doelen
00:02:44.08 dat het zal aanvallen en splijten,
00:02:46.02 vooral zijn eigen 5'-exon.
00:02:49.10 De andere domeinen zijn niet kritisch voor katalyse,
00:02:52.03 maar het belangrijkste onderdeel van een Groep II-intron
00:02:54.20 is deze kleine haarspeldlus hier genaamd Domein 5.
00:02:58.16 Het is het enige deel van een Groep II-intron dat is
00:03:00.29 bijna onveranderlijk tussen de verschillende soorten
00:03:03.25 en dit is interessant omdat Groep II-intronen enorme moleculen zijn.
00:03:07.20 Ze zijn 400-1000 nucleotiden groot
00:03:10.23 en het is ironisch dat alleen dit 34 nucleotide kleine beetje hier
00:03:14.20 is de meest geconserveerde functie.
00:03:17.16 Een ander belangrijk onderdeel van een Groep II-intron is domein 6,
00:03:20.12 en dit is het domein dat de adenosine bevat
00:03:22.28 die de nucleofiel draagt ​​voor de eerste stap van splitsing.
00:03:26.15 Veel Groep II-introns gebruiken echter water als nucleofiel voor de eerste stap.
00:03:31.11 Dus dat is het basisorganisatieplan voor een Groep II-intron.
00:03:36.03 Wat is hun reactiemechanisme?
00:03:38.03 Nou, ze katalyseren een heel eenvoudige SN2-reactie,
00:03:41.11 wat een in-line nucleofiele aanval is,
00:03:43.18 waarbij een alcohol, ofwel de 2'-OH-groep aan
00:03:48.23 nog een ribose, of water,
00:03:50.27 aanvallen in-line op dit fosfaat,
00:03:53.05 waardoor je een trigonaal bipyramidaal tussenproduct krijgt
00:03:57.07 en het vrijkomen van deze fosfaat- en 3'-OH-groep
00:04:01.06 met inversie van configuratie.
00:04:03.29 Met behulp van technieken van chemische biologie,
00:04:05.27 Joe Piccirilli ontdekte dat dit een reactie is
00:04:09.28 dat wordt gekatalyseerd door metaalionen in de kern van het Groep II-intron.
00:04:14.26 En dus Groep II-introns, zoals veel ribozymen,
00:04:17.07 maar niet allemaal,
00:04:17.22 is een metallo-enzym en gebruikt metalen op de volgende manier.
00:04:23.25 Hij toonde aan dat magnesium de vertrekkende groep coördineert
00:04:26.26 en de nucleofiel
00:04:27.28 om de opbouw van negatieve lading te stabiliseren
00:04:30.23 in deze overgangstoestand.
00:04:33.03 Dus het is een relatief simpele reactie
00:04:34.27 en het is bijna dezelfde reactie in zowel de eerste als de tweede stap
00:04:37.26 van splitsing.
00:04:42.10 Dus we kenden het basislichaamsplan van deze RNA's
00:04:44.20 en we wisten wat voor soort reactie ze aan het katalyseren waren,
00:04:47.12 maar we begrepen het precieze mechanisme van chemische katalyse niet echt.
00:04:51.19 En we wisten ook dat dit RNA waarschijnlijk was
00:04:53.22 om allerlei interessante tertiaire structurele motieven te hebben.
00:04:57.24 Dus als we de architectuur van dit molecuul wilden begrijpen
00:05:00.27 en het precieze mechanisme,
00:05:03.00 we hadden een kristalstructuur met hoge resolutie nodig.
00:05:06.18 Dus eigenlijk moesten we van de secundaire structuur af,
00:05:10.25 of roadkill-kaart van het molecuul, zoals ik het graag noem,
00:05:14.06 naar de tertiaire structuur.
00:05:16.12 En ik ga je wat vertellen over die reis
00:05:18.15 en hoe we de kern van een lasmachine begonnen te visualiseren.
00:05:25.01 Het begon allemaal met de identificatie van een Groep II-intron
00:05:28.02 die gemakkelijk zou kristalliseren.
00:05:29.28 En we hebben ongeveer 10 jaar naar dit molecuul gezocht,
00:05:32.24 kijkend naar veel, veel verschillende soorten Groep II-introns
00:05:35.08 en proberen er een te vinden die uitzonderlijk stabiel en kristalliseerbaar was.
00:05:39.09 We hebben er eindelijk een gevonden die gemakkelijk kristalliseerde
00:05:42.29 in de sequentie van de eubacterium Oceanobacillus iheyensis.
00:05:47.07 En toen we dit molecuul transcribeerden,
00:05:49.01 we ontdekten dat het zichzelf splitste en stabiliseerde
00:05:51.20 bij zeer lage magnesium fysiologische ionen en temperaturen.
00:05:56.08 En dus was het een veelbelovende kandidaat.
00:05:59.27 We gingen toen verder met het maken van ongeveer 120 verschillende constructies van dit molecuul
00:06:04.20 om te proberen het in te pakken
00:06:07.11 en maak mooie kristallen
00:06:09.01 waaruit we de structuur konden oplossen.
00:06:12.07 En nummer 87, van al deze constructies,
00:06:14.27 uiteindelijk uitgekristalliseerd tot een resolutie van 3,1 Angstrom,
00:06:18.11 wat in het doelbereik ligt voor het oplossen van de structuur.
00:06:21.04 En om je te laten zien hoe we dit molecuul hebben aangepast
00:06:23.23 om de kristallisatie geleidelijk te verbeteren,
00:06:25.17 je moet weten dat we de lengtes van al deze verschillende stelen hebben aangepast,
00:06:29.00 de lussamenstelling,
00:06:30.25 veranderde veel, veel verschillende dingen
00:06:32.12 om de verpakking en kristalliseerbaarheid van het molecuul te optimaliseren.
00:06:37.10 Dus eindelijk, bij het bereiken van dat kwaliteitsniveau van het kristal,
00:06:43.03 konden we de structuur ervan oplossen met behulp van röntgenkristallografie.
00:06:47.07 En de reden waarom ik je deze figuur graag laat zien,
00:06:49.07 die de elektronendichtheid van het Oceanobacillus-intron illustreert,
00:06:53.28 is om je te laten zien dat,
00:06:55.03 als je voor het eerst een glimp opvangt van de elektronendichtheid,
00:06:58.09 of de output van het kristallografische experiment,
00:07:00.22 je kunt de prachtige helices zien die zichtbaar zijn
00:07:04.06 en je kunt het algemene plan van het molecuul heel goed zien
00:07:07.22 in het geval van RNA.
00:07:09.07 In eiwitten is het vaak moeilijker te zien
00:07:11.19 de secundaire structurele kenmerken dan in een RNA.
00:07:16.18 Dus dit was de illustratie van onze eerste glimp van dit molecuul.
00:07:21.14 Toen we eindelijk in staat waren om alle nucleotiden in deze kaart te modelleren,
00:07:26.08 we waren in staat om in principe de volledige structuur van dit intron op te lossen.
00:07:32.00 En je kunt meteen zien dat dit een opmerkelijk bolvormige vorm is.
00:07:37.01 Dit is geen simpele dubbele helix
00:07:38.14 en het is geen ongeordende reeks strengen,
00:07:40.26 het is een zeer compact bolvormig molecuul,
00:07:43.09 zoals je zou denken aan een bolvormig eiwit.
00:07:46.03 En er zijn een aantal architecturale kenmerken die het vermelden waard zijn
00:07:49.10 en ik zal me er zo op concentreren.
00:07:51.24 Maar je kunt zien dat er hier bovenaan een soort steiger staat,
00:07:56.13 en het creëert een holte waarin de actieve site wordt ingevoegd.
00:08:00.26 De actieve site is deze rode duplex,
00:08:03.26 en dat is Domein 5 waar ik het eerder met je over had.
00:08:06.27 Het zeer, zeer sterk geconserveerde RNA
00:08:09.06 dat we al een tijdje weten, is waarschijnlijk de actieve site.
00:08:12.21 En, interessant genoeg, deze helices die hier de uiteinden uitsteken,
00:08:18.16 deze bevatten vaak spaties waarin Groep II-introns kunnen coderen
00:08:21.28 open leeskaders voor eiwitten die in de intronsequentie zelf worden gedragen.
00:08:27.00 En het is interessant omdat je kunt zien dat als dit RNA veel groter was
00:08:31.19 het zou zich uitstrekken en het zou niet in de weg staan ​​van
00:08:34.04 de actieve site van ribozym zoals hij hier is opgevouwen.
00:08:42.17 Dus als we goed naar dit molecuul kijken,
00:08:44.23 we hebben veel dingen kunnen leren,
00:08:46.09 en het eerste soort dingen waar ik je over ga vertellen
00:08:49.05 is hoe het ons informeerde over tertiaire interacties
00:08:52.08 en tertiaire structurele kenmerken in RNA.
00:08:54.26 Er zijn veel nieuwe concepten onthuld door deze molecule
00:08:57.11 en de meeste waren binnen intron Domain 1.
00:09:01.20 Bedenk dat ik zei dat dat 5'-meeste domein van een Groep II-intron
00:09:05.04 vouwt eerst en vouwt autonoom
00:09:07.16 in een specifieke tertiaire structuur.
00:09:10.14 Binnen de structuur van het Groep II-intron,
00:09:12.22 we kunnen dit hier zien.
00:09:14.24 De rest van het intron heb ik vervaagd tot grijs
00:09:17.04 zodat u zich kunt concentreren op domein 1 in al deze kleuren.
00:09:22.11 Binnen dit domein zijn een aantal zeer interessante motieven
00:09:24.11 en ik zal je er een paar laten zien.
00:09:27.25 Bijvoorbeeld, twee van hen waarop ik me graag concentreer, worden hier getoond.
00:09:32.09 En om je te laten zien waar ze zich in de structuur bevinden,
00:09:35.07 en deze regio hier in de secundaire structuur is een vijfrichtingskruising,
00:09:38.25 die, zoals je je misschien kunt voorstellen,
00:09:40.01 moet een behoorlijk complexe architectuur aannemen voor al deze helices
00:09:44.03 om in de goede richting te wijzen en om de tertiaire vouw te vormen.
00:09:48.02 Dus, laat me je deze vijfwegverbinding in de driedimensionale ruimte laten zien.
00:09:52.11 Dat is deze structuur hier.
00:09:55.00 Het is een opmerkelijke reeks tertiaire interacties
00:09:57.16 en aaneengeschakelde motieven.
00:10:00.18 Mijn favoriete, hier boven, heet een T-lusmotief,
00:10:03.23 en wat je ziet is dat deze blauwe bocht hier
00:10:07.09 doet denken aan een motief dat we vaak zien in structuren,
00:10:11.21 een GNRA-tetraloop genoemd,
00:10:15.21 maar het is bijna alsof er een gat in zit:
00:10:18.01 er ontbreekt een basis op deze positie
00:10:20.07 en het is gevuld met een adenosine die komt
00:10:23.00 van dit grijze deel van het molecuul.
00:10:25.02 Dus veel van dit RNA wordt op dezelfde manier bij elkaar gehouden
00:10:28.16 een ouderwetse tafel zou zijn gebouwd,
00:10:30.25 met pinnen die in groeven passen en bij elkaar houden
00:10:34.00 de hele steiger op die manier,
00:10:35.27 en voornamelijk gestabiliseerd door basisstapelingsinteracties.
00:10:40.04 En je kunt meer van de geconserveerde stapelinteracties zien
00:10:43.14 en netwerken die hier in deze positie worden gevormd.
00:10:47.16 Een ander soort favoriet onderdeel van het molecuul voor mij is het Z-anker.
00:10:52.01 En in de secundaire structuur,
00:10:54.08 we kunnen zien dat dit het mechanisme is
00:10:57.03 waardoor de groene helix eigenlijk perfect parallel wordt
00:11:02.09 met de oranje helix, hier, zoals je kunt zien in deze structuur.
00:11:05.18 Dus deze twee helices moeten naast elkaar worden.
00:11:09.00 Hoe werkt dat?
00:11:10.24 Twee lussen erin smelten op de volgende manier samen.
00:11:14.25 Dus hier is de oranje helix, hier is een deel van de groene helix,
00:11:19.01 en wat er gebeurt als de oranje helix ontstaat,
00:11:22.09 je ziet dat je hier normale basenparen hebt,
00:11:25.20 en dan klapt een van de honken uit
00:11:27.29 en in plaats van een basenpaar te vormen met een andere oranje streng,
00:11:31.06 het vormt een basenpaar met de groene streng.
00:11:34.00 Zijn volgende buurman komt langs en vormt een basenpaar
00:11:36.24 met nog een oranje streng,
00:11:38.14 en dan klapt het volgende honk er weer uit,
00:11:41.14 vormen deze zigzag van verbindingen tussen basen en twee strengen,
00:11:46.02 in plaats van één enkele streng.
00:11:49.03 Dus deze structuur met drie strengen is een heel interessante manier
00:11:51.27 dat RNA's de herkenning van een centrale streng kunnen diversifiëren.
00:11:59.09 Een ander soort concept voor de moeren en bouten
00:12:01.29 voor het samenstellen van RNA dat werd onthuld
00:12:04.08 en geïllustreerd door de Groep II intron
00:12:09.11 is het ribose ritsmotief.
00:12:11.03 Dit werd eigenlijk voor het eerst beschreven door Cate en Doudna in 1996
00:12:14.09 in een van de eerste kristallografische structuren met hoge resolutie
00:12:17.16 van een complex RNA-molecuul.
00:12:20.16 En wat ze lieten zien is dit belangrijke concept:
00:12:24.11 dat de 2'-OH-groep van de ribosesuiker erg plakkerig is
00:12:27.07 en kan vertakte waterstofbruggen vormen
00:12:29.28 die RNA-strengen aan elkaar kunnen breien.
00:12:32.23 Dus als je hier één RNA-streng hebt,
00:12:34.25 en een RNA-streng hier,
00:12:36.19 ze kunnen samenkomen
00:12:39.06 door interdigitatie van hun 2'-OH-groepen.
00:12:42.23 En dat is precies wat we op veel locaties binnen het Groep II-intron zien.
00:12:47.05 Specifiek, hier bovenaan,
00:12:49.16 er is een lange-afstand kuslus-interactie genaamd alfa-alfa',
00:12:53.25 en ik laat je deze basenparen zien in deze weergave hier,
00:12:58.15 aan het einde van die interactie,
00:13:00.07 de RNA-strengen komen heel, heel dicht bij elkaar, zoals je hier kunt zien.
00:13:04.19 En als ze dat doen,
00:13:05.21 ze ritsen dicht en de ribosen en de 2'-OH-groepen vormen dit netwerk
00:13:11.20 die dient om het hele ensemble aan elkaar te lijmen.
00:13:18.21 Dus we hebben het gehad over de tertiaire interacties
00:13:20.25 die werden onthuld door deze complexe structuur.
00:13:23.14 Nu wil ik wat meer met je praten over wat er aan de hand is
00:13:25.24 in de actieve plaats van het intron
00:13:28.02 en hoe het de chemie katalyseert.
00:13:30.29 Dus een van de dingen die me lange tijd in verwarring brachten
00:13:33.00 toen ik naar de secundaire structuur staarde
00:13:36.13 en de conserverende kenmerken van het Groep II-intron waren dat,
00:13:39.11 hoewel domein 5 zeer goed geconserveerd was,
00:13:42.16 er was een vreemd en hoog niveau van instandhouding
00:13:45.10 op deze kruising tussen domein 2 en 3.
00:13:48.24 En ik vroeg me af, waarom zijn die paar nucleotiden in die kruising?
00:13:52.16 net zo geconserveerd als domein 5.
00:13:55.15 En het antwoord kwam van de structuur, die onthulde:
00:13:57.01 dat de reden dat ze op hetzelfde niveau zijn bewaard
00:13:59.29 is dat ze deel uitmaken van dezelfde structurele entiteit.
00:14:03.12 Je kunt zien dat die kruising binnenkomt
00:14:05.08 en binden in de grote groef van die rode helix.
00:14:10.05 Van dichtbij ziet het er ongeveer zo uit:
00:14:12.09 het vormt een prachtige drievoudige helix,
00:14:14.17 dus deze junctie nucleotiden komen binnen
00:14:18.01 en waterstofbruggen vormen met de hoofdgroefrand
00:14:21.17 van de onderste stam van domein 5
00:14:24.05 en een andere wordt gevormd uit een andere sector van domein 5.
00:14:30.04 Dus deze drievoudige helix,
00:14:32.28 samen met een scherpe knik in de RNA-ruggengraat op deze positie,
00:14:37.14 creëren een zeer sterk metaalionplatform binnen de Groep II-intronkern.
00:14:43.15 En de reden dat dit gebeurt, is dat je je hier kunt voorstellen,
00:14:46.27 dat er vele, vele fosfaten zijn die samenkomen
00:14:50.02 in een heel, heel kleine ruimte,
00:14:51.24 dus de elektrostatische potentiaal in dit gebied van het molecuul
00:14:55.02 wordt extreem
00:14:56.28 en het wordt heel, heel bevorderlijk
00:14:58.23 op de binding van metaalionen op specifieke punten.
00:15:02.00 En inderdaad, zie je
00:15:03.14 dat twee tweewaardige kationen op deze positie binden
00:15:06.17 precies 3,9 Angstrom uit elkaar.
00:15:10.13 En dit is vaak een handtekening voor enzymen
00:15:14.01 die ribose- of deoxyribosebindingssplitsing katalyseren
00:15:18.14 via een mechanisme met twee metalen ionen.
00:15:23.12 Dus, door dat werk en extra werk dat we deden,
00:15:26.03 kwamen we te weten dat metalen 1 en 2 op die posities
00:15:30.01 zijn inderdaad de katalytische metaalionen die nodig zijn voor splitsing,
00:15:33.26 precies zoals Joe Piccirilli had voorspeld op basis van chemische biologie-experimenten.
00:15:37.29 En ze staan ​​precies boven de deelbare koppeling
00:15:40.13 om die binding op een doelsubstraat te splitsen.
00:15:45.10 Dus dit was zeer bevredigend omdat het duidelijk was
00:15:47.07 dat we een metallo-enzym hadden dat in sommige opzichten op andere enzymen leek
00:15:51.28 en toch wisten we dat dit niet het hele verhaal was.
00:15:55.05 En dat is omdat, bij de kristallografische resolutie
00:15:59.01 die we gebruikten om dit molecuul te bestuderen,
00:16:01.02 zagen we een extra elektronendichtheid die consistent was met andere metaalionen.
00:16:05.21 Maar de gegevens waren niet goed genoeg om hun standpunt eenduidig ​​te interpreteren.
00:16:09.22 Dus we hebben hier harder aan gewerkt,
00:16:11.26 resolutie verhogen en afwijkende verstrooiing gebruiken,
00:16:14.15 wat een hulpmiddel is om de positie van metaalionen vast te spijkeren.
00:16:19.25 Specifiek, toen we de resolutie van onze kristallen verbeterden,
00:16:24.07 we zagen dat het zeer waarschijnlijk was dat er metaalionen waren
00:16:27.06 ook op deze positie en deze positie.
00:16:30.18 En vanwege de manier waarop het omringende RNA met hen in wisselwerking stond,
00:16:34.03 was het zeer waarschijnlijk dat dit kaliumionen waren.
00:16:37.09 Dus dit was verrassend voor ons,
00:16:38.26 dat een eenvoudig eenwaardig kation zou kunnen verschijnen
00:16:41.10 om zo'n belangrijke rol te spelen in de actieve site.
00:16:45.02 Om hier echt een krachtig statement over te maken,
00:16:46.26 moesten we hun positie ondubbelzinnig identificeren,
00:16:49.21 en dit werd gedaan door ze te vervangen door een zwaar ion
00:16:52.26 die röntgenstralen uitzonderlijk goed buigt
00:16:56.20 en dat is een goede nabootsing van kalium.
00:16:58.28 Dus we hebben nog 14 kristalstructuren opgelost
00:17:02.08 van het intron in al deze verschillende combinaties van metalen.
00:17:06.09 En ik zal in het bijzonder uw aandacht vestigen op deze toestand,
00:17:09.01 waarin kalium werd vervangen door thallium
00:17:12.18 en het magnesium bleef hetzelfde.
00:17:15.06 En in deze structuur,
00:17:16.16 je kunt zien op een verschilkaart
00:17:18.16 dat thallium de exacte posities inneemt
00:17:22.23 waarvan we hadden aangenomen dat ze werden ingenomen door kalium.
00:17:25.25 En vanwege hun gelijkenis in ionische straal en functie
00:17:29.23 en ook de gelijkenis met parallelle rubidium-gegevens,
00:17:32.23 die hetzelfde doet,
00:17:34.16 we kregen het vertrouwen dat we kalium hadden gevonden
00:17:37.09 als een belangrijk bestanddeel van de actieve site.
00:17:43.00 Dus, in deze specifieke reeks structuren,
00:17:46.00 we keken naar het vrije intron,
00:17:48.05 zonder enige ondergrond gebonden,
00:17:50.06 met een redelijk goede resolutie.
00:17:52.09 En we konden in dit geval de volgende afbeelding zien:
00:17:55.08 konden we zien dat er twee tweewaardige metaalionen waren
00:18:00.16 (bij afwezigheid van een substraat werden ze gecoördineerd met water)
00:18:01.14 en het was duidelijk dat er kalium was die heel, heel dicht bij hen was.
00:18:05.18 En we noemden de naasten K1 en K2.
00:18:09.12 Nadere inspectie onthulde dat K1 bijna een sluitsteen is
00:18:13.08 voor de vorming van de Metal 2 (M2)-site.
00:18:16.03 Dus dit katalytische metaalion, dat absoluut nodig is voor chemie,
00:18:19.20 wordt op zijn plaats gehouden door de rangschikking van liganden
00:18:22.25 die door dit kalium worden gepositioneerd.
00:18:25.16 En latere structuren toonden,
00:18:27.03 zoals ik je straks zal vertellen,
00:18:28.29 als je deze site verprutst door mutatie
00:18:33.00 of vervanging door een metaalion van de verkeerde maat,
00:18:35.14 Metaal 2 bindt niet en doodt het ribozym.
00:18:41.14 Dus dit was slechts een controle-experiment om ons te vertellen
00:18:43.17 dat in al deze vreemde, afwijkende verstrooiende ionen,
00:18:46.29 of we nog steeds ribozymchemie kregen.
00:18:50.26 Dus dit is de normale toestand,
00:18:52.23 waar je een voorloper-RNA ziet dat wordt gesplitst in het intronfragment en exonische fragmenten.
00:18:58.24 En hier kun je dat zien in thallium,
00:19:01.02 het is bijna gelukkiger: je ziet de voorloper naar de intron- en exonische componenten gaan,
00:19:06.17 en zelfs door een tussentoestand,
00:19:08.06 sneller dan in het geval van kalium.
00:19:10.18 Dus zelfs in thallium en magnesium alleen,
00:19:12.28 dit is een heel gelukkig enzym,
00:19:14.21 dus is het logisch dat thallium de kaliumplaatsen vervangt.
00:19:20.11 Dus alles wat ik je tot nu toe heb laten zien, heeft betrekking op de productstatus van het intron.
00:19:25.27 Dit is een biologisch relevante toestand
00:19:28.09 omdat dat vrije intron in staat is tot reverse splicing
00:19:32.16 in RNA's van vergelijkbare sequentie en zelfs in DNA.
00:19:36.14 Dus het maakt wel uit,
00:19:37.29 maar tegelijkertijd was ik erg nieuwsgierig naar
00:19:39.29 de rol van de actieve site bij splitsing,
00:19:42.20 en ik wilde de eerste stap van het splitsen visualiseren.
00:19:45.21 Om naar splicing te kijken, moet je een 5'-exon hebben
00:19:48.04 die verbonden is met het eerste domein van het intron.
00:19:51.19 Dus terwijl dit de constructie was
00:19:52.24 die werd gebruikt voor de informatie waar ik je eerder over vertelde,
00:19:56.29 we moesten een nieuwe maken
00:19:58.13 en los een geheel nieuw ensemble van structuren op
00:20:01.25 met het 5'-exon eraan vast.
00:20:03.18 En dat hebben we gedaan.
00:20:06.07 Ook in de aanwezigheid van al die ongewone metaalionen.
00:20:09.28 En je ziet het volgende interessante:
00:20:11.29 als je het 5'-exon hebt bevestigd:
00:20:14.20 je kunt de deelbare verbinding zien, waar chemie zal plaatsvinden,
00:20:17.20 recht over de katalytische magnesiumionen ingebracht
00:20:21.18 en je kunt zien dat het deelbare fosfaat klaar is
00:20:23.13 om te worden aangevallen door een nucleofiel water,
00:20:25.29 die we ook konden waarnemen.
00:20:28.24 En je kunt de twee kaliumsoorten zien
00:20:30.13 spelen hun belangrijke rol bij het ondersteunen van de actieve site.
00:20:33.24 We hebben deze structuur verkregen in aanwezigheid van calcium
00:20:36.22 en in deze specifieke staat is het fosfaat niet gesplitst.
00:20:40.03 Maar als je magnesium toevoegt,
00:20:42.12 zie je decolleté
00:20:43.25 en je ziet het gespleten fosfaat migreren
00:20:46.05 van deze positie naar kalium 2.
00:20:49.27 Dit vertelt ons dus dat kalium 2 een sleutelrol speelt in het mechanisme:
00:20:53.26 het is belangrijk voor stabilisatie
00:20:55.18 het product van de eerste stapreactie.
00:20:58.12 Dus elk metaalion speelt een belangrijke rol in het hele proces.
00:21:06.05 Dus ik heb je net verteld over K1 en K2,
00:21:07.29 M1 en M2,
00:21:09.09 maar laat dat je niet aan het denken zetten
00:21:11.18 dat dit de enige belangrijke metalen in de structuur zijn.
00:21:14.13 Dat zijn degenen die erg belangrijk zijn voor scheikunde,
00:21:16.21 maar verder werk dat we hebben gedaan aan de bezetting van metaalionen
00:21:20.22 in dit hele RNA laat ons zien dat er vele, vele metaalionen zijn
00:21:24.29 die een hoge bezettingsgraad hebben in dit RNA
00:21:27.24 en die de verschillende tertiaire structuurmotieven ondersteunen.
00:21:31.28 Metaalionen spelen een essentiële rol bij de organisatie van RNA-moleculen
00:21:36.28 en dus blijven we die ook onderzoeken.
00:21:43.12 Wat hebben we tot nu toe geleerd?
00:21:46.05 Het intron heeft ons geleerd over het pre-mRNA-splitsingsmechanisme op chemisch niveau,
00:21:50.07 maar het heeft ook nieuwe ideeën onthuld over RNA als katalysator.
00:21:54.18 Het heeft ons de volgende concepten getoond:
00:21:57.03 dat niet alleen tweewaardige ionen belangrijk zijn voor ribozymchemie,
00:22:01.19 eenwaardige ionen kunnen ook een rol spelen,
00:22:04.13 en kalium is bijzonder belangrijk, zowel in structuur als katalyse.
00:22:09.29 Tijdens Groep II intron-splitsing,
00:22:11.14 zien we dat kalium 1 en 2 elk een rol spelen
00:22:14.24 in het mechanisme dat belangrijk is.
00:22:16.26 Dit betekent dus dat Groep II introns,
00:22:18.00 en mogelijk andere ribozymen,
00:22:19.22 zijn geen eenvoudige twee metaalion-enzymen.
00:22:23.00 In feite, net als eiwitenzymen,
00:22:24.18 misschien gebruiken ze metalen clusters,
00:22:26.26 wat een heel, heel veel voorkomend geval is in de eiwitwereld.
00:22:30.23 Dus heteronucleaire metaalclusters samengesteld uit verschillende soorten ionen,
00:22:34.13 kan een belangrijk thema zijn.
00:22:37.19 En dit brengt ons ook bij het feit dat wanneer je superponeert
00:22:40.01 de actieve plaats van het Groep II-intron met eiwitenzymen,
00:22:43.07 je kunt belangrijke parallellen zien
00:22:44.13 zoals ze scheikunde doen.
00:22:49.13 Dus nu ga ik je wat vertellen over
00:22:51.11 wat we hebben geleerd van de natriumvorm van deze structuur,
00:22:54.23 omdat het ons voor het eerst onthulde dat er een
00:22:57.26 alternatieve conformatie binnen de actieve site van Groep II intron.
00:23:01.14 En ik zal je vertellen hoe we dat interpreteren.
00:23:05.00 Dus we weten al heel lang dat als je per ongeluk je buffers hebt gemaakt,
00:23:08.18 of natrium toegevoegd aan een reactie waarbij:
00:23:11.22 elk van de Groep II-introns waarmee we hebben gewerkt,
00:23:14.05 je ziet geen reactiechemie.
00:23:15.24 Je ziet geen splitsing.
00:23:17.17 Dus dit is logisch omdat natrium niet dezelfde ionische straal heeft als kalium
00:23:21.16 en het past niet in kaliumsites.
00:23:24.12 En ja hoor, we zien dat de natriumvorm van het intron
00:23:27.11 neemt een alternatieve actieve site conformatie aan.
00:23:32.14 We zien wat lijkt op een conformationele schakelaar
00:23:35.01 tussen de twee stappen van splitsing waarbij twee basen worden geroteerd,
00:23:39.11 een hier en een hier.
00:23:42.14 Wat we zien is dat in de vorige vorm van het intron,
00:23:44.24 je hebt hier een major groove triplex
00:23:47.29 en je hebt die strakke draai in de RNA-ruggengraat,
00:23:50.20 en in de natriumvorm zijn twee van die basen omgedraaid.
00:23:54.22 In één geval 70 graden
00:23:56.05 en in één geval een van de katalytische guanosinemoleculen
00:23:59.21 beweegt van deze positie helemaal naar hier,
00:24:02.17 nu interactie met een heel ander domein: domein 3.
00:24:06.26 Wanneer dit soort architecturale herschikking optreedt,
00:24:10.02 de metaalionen in de actieve site gaan eigenlijk weg
00:24:13.02 en het creëert een groot open gat in de actieve site.
00:24:17.02 Dat is echt nodig
00:24:18.08 omdat tussen de stappen van het splitsen
00:24:21.02 de reactanten voor de eerste stap moeten uit de weg gaan
00:24:23.24 en de reactanten voor de tweede stap moeten binnenkomen.
00:24:26.10 En dus hebben we verondersteld dat dit zou kunnen zijn
00:24:29.10 de herschikking die moet plaatsvinden tussen de stappen
00:24:32.03 zodat u de benodigde veranderingen kunt ondergaan
00:24:34.04 om de tweede stap van het splitsen te stimuleren en het proces te voltooien.
00:24:38.15 Dus, als je je die Groep II-intronsplitsing voorstelt...
00:24:40.29 vindt plaats met deze twee stappen, zoals ik eerder heb uitgelegd,
00:24:44.11 van dichtbij kan het op de volgende manier gebeuren.
00:24:47.14 We weten dat de opstelling van de actieve site, voorafgaand,
00:24:51.00 en net na de eerste stap van het splitsen,
00:24:52.29 ziet er ongeveer zo uit,
00:24:54.11 met de twee katalytische metaalionen en de ondersteunende kalium.
00:24:58.19 En we veronderstelden dat in een tussenliggende
00:25:01.05 tussen de twee staten omvat de rotatie van twee bases.
00:25:06.18 Nadat dat is gebeurd en de tweede stap van het splitsen is ingesteld,
00:25:09.22 je krijgt een hervorming van de actieve site
00:25:13.05 en de metaalionen, en keer terug naar de begintoestand.
00:25:20.16 Dus als we nadenken over de organisatie van de actieve site
00:25:24.22 voor de eerste stap van het splitsen,
00:25:26.08 dat wil zeggen de site die bevoegd is voor chemie,
00:25:30.10 we hebben die informatie kunnen nemen
00:25:33.12 en leer veel over de evolutie van splicing
00:25:37.18 in eukaryoten.
00:25:40.03 En de reden daarvoor is dat de intronstructuur van Groep II
00:25:43.02 diende als een soort routekaart om na te denken over hoe de architectuur
00:25:46.16 van het eukaryote spliceosoom kan worden georganiseerd.
00:25:50.21 En de reden waarom ik dat denk is de volgende.
00:25:53.14 Domein 5, dit sterk geconserveerde motief dat alle actieve site-elementen bevat,
00:25:58.10 wordt hier getoond in een secundaire structuur zoals deze.
00:26:01.16 En deze, in stippellijnen,
00:26:03.11 gaf de tertiaire interacties aan die werden onthuld door onze kristalstructuur.
00:26:08.01 En we weten toevallig dat een van de echt geconserveerde RNA-moleculen
00:26:12.05 in je spliceosoom,
00:26:13.13 genaamd U6 klein nucleair RNA,
00:26:16.00 heeft een secundaire structuur die altijd erg deed denken aan Domein 5 in Groep II introns,
00:26:22.05 en jarenlang veronderstelden mensen dat er een overeenkomst tussen hen was.
00:26:25.11 Ze bonden zelfs twee metaalionen op vergelijkbare plaatsen.
00:26:29.11 Maar de structuur die we hebben opgelost
00:26:31.17 suggereerde dat een deel van U6
00:26:33.19 zou dezelfde moleculaire interacties kunnen maken
00:26:36.03 die we hadden waargenomen in het Groep II-intron.
00:26:39.14 En recent werk van de laboratoria van Joe Piccirilli
00:26:42.18 en John Stahley aan de Universiteit van Chicago,
00:26:45.08 met behulp van spliceosomale RNA's,
00:26:48.02 hebben inderdaad aangetoond dat de spliceosomale actieve site
00:26:50.26 lijkt heel erg op die van Groep II.
00:26:53.24 En in feite, die M1 en M2 van het spliceosoom
00:26:57.02 zijn op dezelfde manier gepositioneerd,
00:26:58.28 en door de voorspelde bases,
00:27:00.12 zoals waargenomen in het Groep II-intron.
00:27:03.08 Dus dit is opwindend omdat het betekent dat,
00:27:05.19 zoals lang geleden voorspeld,
00:27:07.29 dat Groep II-introns en het spliceosoom
00:27:09.20 kan een gemeenschappelijke evolutionaire voorouder delen.
00:27:15.04 Dus, om af te sluiten,
00:27:17.28 door middel van studies van de Oceanobacillus Groep II introns,
00:27:20.17 we hebben de structuur en de actieve plaats van een RNA-splitsingsmachine gevisualiseerd,
00:27:24.21 we hebben de metaalionen in de kern van Groep II geïdentificeerd,
00:27:27.21 belangrijke rollen vinden voor zowel monovalenten als divalenten
00:27:30.18 in structuur en chemie.
00:27:32.24 Dit ribozym gebruikt een nieuwe metaalionencluster,
00:27:35.25 wat betekent dat RNA-chemie niet zo verschilt van eiwitchemie.
00:27:40.02 Het metalen cluster is intact, zelfs zonder het substraat,
00:27:42.21 wat betekent dat het bijna is alsof dit enzym tanden heeft
00:27:45.08 wat logisch is omdat Groep II-introns retro-elementen zijn die DNA kunnen aanvallen.
00:27:51.04 En we geloven dat we een structurele wissel hebben gezien
00:27:53.06 tussen de twee stappen van splitsing
00:27:55.02 en dat we de kenmerken ervan kunnen gaan karakteriseren.
00:27:58.25 En dankzij het werk van anderen,
00:28:00.11 het is nu duidelijk dat Groep II introns en het spliceosoom
00:28:03.03 hebben een bijna identieke actieve site.
00:28:06.15 Dus de structuur van Groep II is erg nuttig geweest
00:28:07.27 omdat het ons geleerd heeft over scheikunde, structuur en evolutie.
00:28:12.29 Dus al dit werk werd gedaan door drie zeer getalenteerde mensen:
00:28:16.19 Nav Toor,
00:28:17.29Marcia Marcia,
00:28:19.09 en Kevin Keating,
00:28:20.11 met grote hulp van Raj Rajashankar
00:28:22.12 en Olga Fedorova.
00:28:23.09 En ik ben deze mensen veel dank verschuldigd voor hun harde werk en toewijding.
00:28:26.26 En heel erg bedankt voor het luisteren naar deze presentatie.


Van kiembaanvariatie naar functionele variatie en implicaties voor ziekte

De meeste bekende IGHV-allelische nt-mutaties coderen voor aminozuurveranderingen, en in veel IGHV-genen komen deze niet-synonieme plaatsen onevenredig voor in de complementariteitsbepalende regio's van het IGHV-gen, 42 die als de belangrijkste worden beschouwd voor antigeenherkenning. 43, 44, 45 Dit patroon wordt echter niet waargenomen bij alle loci van het IGHV-gen, wat suggereert dat bepaalde IGHV-genen mogelijk onder verschillende selectieve druk staan. 42 Dergelijke bevindingen impliceren dat kiemlijnpolymorfismen van het IGHV-gen belangrijke functionele gevolgen kunnen hebben op eiwitniveau. Voor sommige allelen zijn inderdaad functionele rollen bekend. Het allel IGHV3-23*03 bindt bijvoorbeeld effectiever Haemophilus influenzae type b (Hib) polysacharide vergeleken met het meest voorkomende allel, IGHV3-23*01. 5 Interessant is dat ook is aangetoond dat de frequentie van het allel IGHV3-23*03 aanzienlijk varieert tussen populaties, namelijk bij 21% van de Aziaten, maar slechts bij 9% bij Afro-Amerikanen en 1,4% bij blanken. 29 Bovendien heeft Sasso et al. 29 toonden aan dat het aantal kopieën van IGHV3-23 hoger was bij zowel Aziaten als blanken dan bij Afro-Amerikanen. Het is niet bekend of geografische verschillen in IGHV3-23-polymorfismen en CNV het resultaat zijn van selectie, maar in samenhang met waargenomen functionele verschillen suggereren deze gegevens dat dergelijke polymorfismen belangrijk kunnen zijn voor ziektegevoeligheid.

Van kiembaansequentiepolymorfismen in IG-loci is ook aangetoond dat ze de antilichaamexpressie beïnvloeden. Het meest bekende voorbeeld komt van het IGKV2-29-gen (voorheen VA2, zie correspondentie in IMGT-genentabel 10), een IG-gen voor de lichte keten dat tot expressie werd gebracht in antilichamen tegen Hib. 46 Een enkele nt-mutatie in de RS van het IGKV2D-29*02-allel op deze locus vermindert de expressie van het gen drastisch, vergeleken met het alternatieve allel IGKV2D-29*01 (refs. 47, 48) (IGKV2D-29* 01 en IGKV2D-29*02 werden eerder geïdentificeerd als VA2a en VA2b, zie correspondentie in IMGT Gene-tabel 10). Interessant is dat dit allel alleen met een hoge frequentie voorkomt in bepaalde inheemse Amerikaanse populaties en wordt geassocieerd met Hib-gevoeligheid in deze populaties. 47, 48 De effecten van RS-polymorfismen op IGHV-gengebruik zijn niet expliciet getest. In feite is de sequentie van de RS van de meeste V-genen slechts één keer bepaald9, dus informatie over allelische diversiteit in IGHV-gen RS-motieven is beperkt. Bovendien zijn de stroomopwaartse regulerende sequenties voor de meeste IGHV-genen die niet zijn weergegeven in het assemblagegenoom (tabel 1) nooit gesequenced. 2 Als gevolg hiervan hebben we geen gegevens die specifieke IGHV-genregulerende polymorfismen rechtstreeks koppelen aan tot expressie gebrachte repertoires. Echter, waargenomen allelische vooroordelen in naïeve repertoires van heterozygote individuen bij enkelvoudige kopie IGHV-genen impliceren dat polymorfismen in IGHV-genregulerende sequenties de expressie van bepaalde allelen zouden kunnen beïnvloeden, maar dit idee blijft niet getest.

De impact van structurele varianten op uitgedrukt repertoires is ook grotendeels onontgonnen. We kennen slechts één onderzoek dat direct heeft getest op effecten van CNV in het IGHV-cluster op uitgedrukt repertoire. Deze studie toonde aan dat het aantal kopieën van IGHV1-69, dat varieert van 2 tot 4 kopieën per persoon, sterk correleert met de prevalentie ervan in repertoires van tot expressie gebrachte antilichamen. 49, 50 IGHV-gendeleties leiden, in tegenstelling tot gevallen van IGHV-genduplicatie, per definitie tot de afwezigheid van deze genen in tot expressie gebrachte repertoires. Er zijn verschillende voorbeelden van homozygote deleties die functionele IGHV-genen bevatten (tabel 1). 28, 33, 38, 39, 51, 52 Bovendien bleek uit een analyse van naïeve B-cel IGHV-genrepertoires met behulp van next-generation 454-sequencing dat 15 van de 56 IGHV-genen die uit deze repertoires zijn beschreven, werden waargenomen in slechts een subset van de 12 personen gescreend. 6 Van zeven van deze vijftien genen is eerder gemeld dat ze voorkomen in insertie-/deletiepolymorfismen, en dus zijn deze waargenomen 'gaten' in het naïeve repertoire waarschijnlijk te wijten aan homozygote deleties. Het is ook interessant om op te merken dat de verhoudingen van veel genen in de tot expressie gebrachte repertoires aanzienlijk verschilden tussen individuen. 6 Het aandeel van het gen IGHV4-39 in tot expressie gebrachte repertoires varieerde bijvoorbeeld van 2-8%. Aangezien bekend is dat IGHV4-39 deel uitmaakt van een deletie-haplotype dat voorkomt met een frequentie van 17-25% bij blanken, 38, 51, 52, is het mogelijk dat interindividuele variatie in IGHV4-39-expressie verband houdt met verschillen in aantal kopieën op deze plaats. Boyd et al. 6 toonde ook scheve gebruiksverhoudingen in individuele repertoires voor meerdere allelen die tot expressie werden gebracht vanaf dezelfde locus, in sommige gevallen werden bepaalde allelen twee- tot driemaal hoger uitgedrukt dan andere allelen in hetzelfde individu. Interessant is dat twee van deze gevallen van allelische bias werden gemeld voor loci waarvan bekend is dat ze deel uitmaken van gedupliceerde haplotypes (bijvoorbeeld IGHV1-69), wat suggereert dat naast polymorfismen in regulerende regio's, zoals hierboven besproken, CNV ook ten grondslag kan liggen aan sommige van deze geconstateerde verschillen. Het is echter belangrijk op te merken dat het gebruik van next-generation sequencing (NGS) bij de analyse van uitgedrukte repertoires bepaalde kunstmatige vooroordelen kan introduceren en daarom moet de interpretatie van deze gegevens met enige voorzichtigheid worden behandeld.

Een recente studie van tot expressie gebrachte antilichamen in twee monozygote tweelingparen onthulde voor het eerst dat variatie in IGHV-gengebruik in naïeve repertoires een sterke genetische component heeft, aangezien gebruiksfrequenties verschilden tussen niet-verwante individuen, maar niet tussen genetisch identieke tweelingen 7 vergelijkbaar met voorbeelden hierboven opgemerkt, waren vier van de zes van de significante verschillen tussen niet-verwante individuen op IGHV-genloci waarvan bekend is dat ze variëren in aantal kopieën. IGHV-gengebruiksfrequenties waren ook gecorreleerd in antigeen-ervaren repertoires tussen monozygote tweelingparen, en ondanks kleine verschillen voor bepaalde IGHV-genen, weerspiegelde gengebruik in antigeen-ervaren repertoires waargenomen gebruik in de naïeve repertoires voor veel IGHV-genen. 7 Zoals besproken door Glanville et al.Deze bevinding is van cruciaal belang voor ons begrip van de rol van tot expressie gebrachte repertoires bij ziekten, aangezien er veel gevallen zijn waarin vooringenomen gengebruik in antilichaamrepertoires is geassocieerd met bepaalde infectieuze of auto-immuunziekten. Het is ook interessant om op te merken dat een recent onderzoek naar tot expressie gebrachte repertoires in foetale navelstrengbloedmonsters van twee baby's suggereert dat vooroordelen over het gebruik van IGHV-genen verschillen tussen repertoires van navelstrengbloed en repertoires van volwassenen. 53 Observaties van vooroordelen over ziektegerelateerde IGHV-gengebruiksvooroordelen, beschouwd in samenhang met het feit dat tot expressie gebrachte naïeve repertoires erfelijk zijn, belichten het potentieel van kiembaanvarianten om bij te dragen aan verschillen in tot expressie gebrachte naïeve repertoires die het toneel vormen voor verschillen tussen niet-verwante individuen in hun gevoeligheid op infectie of auto-immuunziekte, of in hun vermogen om adequaat te reageren op vaccins.

Hoewel er verschillende overtuigende voorbeelden zijn van dergelijke vooroordelen voor IGHV-genen (voor een beoordeling van vooroordelen over V-gengebruik bij auto-immuunziekten, zie Foreman et al. 54), bespreken we er een om het potentiële belang van deze effecten te illustreren. Drie onderzoeken naar anti-HIV-antilichamen (Abs) hebben een vertekend gebruik van IGHV1-69, 55, 56, 57 en 9 van de 12 Abs tegen de CD4-geïnduceerde bindingsplaats van het hiv-1-epitoop, gp120 (CD4i Abs), gebruikt dit gen. 58 Bovendien hebben verschillende onderzoeken aangetoond dat IGHV1-69 bij voorkeur wordt gebruikt bij het neutraliseren van antilichamen tegen hemagglutinine-epitopen van bepaalde influenzastammen uit gegevens in drie menselijke populaties. 59, 60, 61 De alomtegenwoordigheid van deze bevindingen heeft ertoe geleid dat sommigen veronderstellen dat IGHV1-69 mogelijk is geëvolueerd om vroeg in de immuunrespons tegen infecties te reageren, 62 hoewel andere gegevens aantonen dat IGHV1-69 ook belangrijk kan zijn bij chronische infecties. 57 Een uniek kenmerk van IGHV1-69 is dat het het enige IGHV-gen is dat codeert voor een fenylalanine (Phe, F) op aminozuurpositie 62 in de CDR2-IMGT (zie IMGT/DomainDisplay), 10 een site waarvan bekend is dat deze van cruciaal belang is voor hemagglutinine binding. 61 Ook belangrijk om op te merken is echter dat hoewel IGHV1-69 het enige IGHV-gen is dat codeert voor een fenylalanine op deze positie, deze plaats polymorf is en dat slechts een subset van de 14 beschreven IGHV1-69-allelen codeert voor dit aminozuur. Bovendien, zoals hierboven opgemerkt, maakt IGHV1-69 deel uit van een multi-allelisch kopie-aantal polymorfe regio. individuen kunnen 0-4 allelen hebben met F62 in hun CDR2-IMGT, en het aantal kopieën correleert met expressieniveaus. 49 Interessant is dat recentelijk variatie tussen individuen werd waargenomen in de niveaus van breed neutraliserende antilichamen tegen hemagglutinine van H5N1-stammen uit serum van prevaccinaties, wat een rol suggereert voor interindividuele IGHV-genkiemlijnpolymorfismen. 63 Kort voorbij dit specifieke gen zijn er onlangs ook antilichamen geïdentificeerd die gebruikmaken van andere IGHV-genen dan IGHV1-69 van personen die zijn geïnfecteerd met het 2009 H1N1-influenzavirus (IGHV4-31, IGHV4-30-4, IGHV4-39, IGHV3-21, IGHV3-30). 64 Belangrijk is dat van vier van deze vijf kiemlijn-IGHV-genen die bijdragen aan deze antilichamen, bekend is dat ze variëren in aantal kopieën. 33, 38, 40, 41, 51, 52 Samengevat vormen dergelijke waarnemingen een potentieel voorbeeld waarvoor volledige beschrijvingen van allele en genoomstructurele variatie van het IGHV-gen essentieel kunnen blijken voor het begrijpen van de gevoeligheid voor infectieziekten, en nuttig kunnen zijn bij de toediening van vaccins gericht op het opwekken van specifieke antilichamen.


Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Swedish Medical Research Council en de Swedish Cancer Society. We zijn Samir El Andaloussi, Anna Berglöf en Roger Strömberg, Karolinska Institutet Mark A. Behlke, Integrated DNA Technologies (IDT), Inc. Peter B. Dervan, California Institute of Technology Scott Henry, ISIS Pharmaceuticals Per Trolle Jørgensen, Erik dankbaar B. Pedersen en Jesper Wengel, Universiteit van Zuid-Denemarken en Rula Zain, Karolinska Universitair Ziekenhuis, voor waardevolle opmerkingen. We bieden onze excuses aan aan al diegenen die op vele manieren hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van ON-therapieën dat we hun werk niet konden noemen vanwege ruimtebeperkingen.


Bekijk de video: Natuurkunde uitleg WETENSCHAPPELIJKE NOTATIE (November 2021).