Informatie

Hoe fosforylatieverschuiving door western blot te analyseren?


Ik wil de fosforylatieverschuiving in mijn interessante eiwit zien. Ik heb een puntmutatie in mijn eiwit gecreëerd. zodat het niet in staat zal zijn om voor de fosforylering te gaan in vergelijking met mijn controle. ik wil controleren door westerse analyse. Ik zie een heel kleine verschuiving. is het mogelijk om een ​​betere shift te krijgen? Een ander belangrijk ding is dat mijn eiwitgrootte ~ 150 kDa is. kun je alsjeblieft suggesties hierover delen?


De runlengte van banden in een SDS-PAGE (waar je western waarschijnlijk op is gebaseerd) hangt - althans in theorie - alleen af ​​van de grootte van het eiwit: SDS bindt aan eiwitten met een vaste grootteverhouding en geeft daardoor een op negatieve lading gebaseerde alleen op maat. Tenzij u reden hebt om aan te nemen dat uw eiwit een uitzondering is op het gebruikelijke (wat kan worden aangegeven door zaken als niet op de verwachte grootte lopen), zult u hoogstwaarschijnlijk geen bandverschuiving (verandering in runlengte) zien op basis van aanwezigheid of afwezigheid van fosforylering in een standaard western blot.

Dingen die je zou kunnen proberen om de fosforylering te detecteren:

  • Gebruik fosfo-specifieke antilichamen. Deze zijn vaak duur, lastig te gebruiken of gewoon niet beschikbaar, maar dit is het enige dat ik kan bedenken om met een standaard western blot-opstelling te werken
  • run een native-PAGE, op die manier hangt uw runlengte af van de vorm, grootte en lading van het eiwit. Ik zou nog steeds niet verwachten dat een enkele fosforylering een zichtbare verschuiving veroorzaakt voor een eiwit van 150 kDa, maar je kunt het proberen. Dit kan nodig zijn om een ​​langere looptijd van de gel te gebruiken om een ​​echt hoge resolutie te krijgen voor de maat die je zoekt

Gelverschuiving in western blot - (21 februari 2009 )

Ik heb onlangs WB op cellysaat gedaan om mijn doeleiwit te detecteren. Vreemd genoeg heb ik twee bands heel dicht bij elkaar. De verhouding van deze twee banden varieerde en ik vraag me af of de bovenste het gevolg is van een post-translationele modificatie zoals fosforylering. Heeft iemand zo'n probleem ontmoet? Welke andere modificatie kan een dergelijke gelverschuiving in SDS-PAGE veroorzaken? Ik kijk uit naar je antwoord!

robby op 21 feb 2009, 12'5854 zei:

Ik heb onlangs WB op cellysaat gedaan om mijn doeleiwit te detecteren. Vreemd genoeg heb ik twee bands heel dicht bij elkaar. De verhouding van deze twee banden varieerde en ik vraag me af of de bovenste het gevolg is van een post-translationele modificatie zoals fosforylering. Heeft iemand zo'n probleem ontmoet? Welke andere modificatie kan een dergelijke gelverschuiving in SDS-PAGE veroorzaken? Ik kijk uit naar je antwoord!


Hallo Robbie,
2 banden op WB kunnen zeker hinten naar het plaatsen van translationele modificaties.
U vermeldde niet: was het lysaat van geactiveerde cellen? zo ja, heb je een niet-geactiveerd controlecel-ysaat parallel uitgevoerd (op dezelfde gel), en heb je ze vergeleken?
Ook kunt u 2 (of meer) isovormen van dit eiwit hebben met een vergelijkbaar maar niet identiek MW.

robby op 21 februari 2009, 11'5854 AM zei:

Ik heb onlangs WB op cellysaat gedaan om mijn doeleiwit te detecteren. Vreemd genoeg heb ik twee bands heel dicht bij elkaar. De verhouding van deze twee banden varieerde en ik vraag me af of de bovenste het gevolg is van een post-translationele modificatie zoals fosforylering. Heeft iemand zo'n probleem ontmoet? Welke andere modificatie kan een dergelijke gelverschuiving in SDS-PAGE veroorzaken? Ik kijk uit naar je antwoord!

Deze band zou heel goed een achtergrondband kunnen zijn.

Het is mogelijk. Ook een andere isovorm, of post-translationele modificatie.

Hoewel fosforylering de meest voorkomende modificatie is die door SDS-PAGE wordt gedetecteerd, zijn er nog vele andere die ook verschuivingen kunnen veroorzaken (glycosylering, acetylering, alkylering). Bovendien is er altijd de mogelijkheid van een alternatieve spliceoform. De verschuiving van eiwitten wordt echter vaak gebruikt om specifieke cellulaire activiteiten aan te tonen. Van specifieke eiwitten is bekend dat ze op een specifieke manier verschuiven tijdens de voortgang van de celcyclus, dus u kunt dit gebruiken om de voortgang van de celcyclus aan te tonen (of te stoppen). De activering van specifieke signaalroutes resulteert in bekende verschuivingen van bepaalde eiwitten, zodat u dit kunt gebruiken om te bepalen of een route is gewijzigd (dwz: geactiveerd/geremd). De beste manier om te bepalen of een van uw banden te wijten is aan een fosforylering, is door de helft van uw lysaat te behandelen met fosfatase. Voer het behandelde uit met het onbehandelde. Als de twee banden samenvallen tot één met de behandelde, weet je dat je een gefosforyleerde vorm hebt. Trouwens, een gefosforyleerd eiwit resulteert niet altijd in een langzamere migrerende band en in sommige gevallen (hoewel zeldzaam) zal dit de snellere migrerende band zijn. Zo zorgt behandeling met fosfatase ervoor dat de onderste band van MCM2 verdwijnt.


Hoe fosforylatieverschuiving door western blot te analyseren? - Biologie

Mig1 en Hxk2 zijn twee belangrijke mediatoren van glucoserepressie in Saccharomyces cerevisiae. Het mechanisme waarmee Hxk2 deelneemt aan de signaalroute voor glucoserepressie is echter niet volledig begrepen. Onlangs is aangetoond dat Hxk2 interageert met Mig1 om een ​​repressorcomplex te genereren dat zich in de kern van S. cerevisiae. Het mechanisme waarmee Mig1 de aanwezigheid van Hxk2 in de kern bevordert, is echter niet duidelijk en de functie van Hxk2 op het niveau van het nucleaire repressorcomplex is nog onbekend. Hier melden we dat serine 311 van Mig1 een kritisch residu is voor interactie met Hxk2 en dat deze interactie wordt gereguleerd door glucose. Onze bevindingen suggereren dat Snf1 constitutief interageert met de Hxk2-component van het repressorcomplex bij hoge en lage glucose-omstandigheden. Verder laten we zien dat Snf1 bindt aan Mig1 onder lage glucose-omstandigheden en dat binding grotendeels wordt opgeheven na een verschuiving naar medium met een hoog glucosegehalte. We ontdekten dat fosforylering van serine 311 van Mig1 door Snf1-kinase essentieel is voor nucleaire export van Mig1-eiwit en derepressie van de SUC2 gen in glucosebeperkte cellen. Deze resultaten maken het mogelijk om te veronderstellen dat de Hxk2 werkt door een interactie aan te gaan met zowel Mig1 als Snf1 om de Mig1-fosforylering bij serine 311 te remmen tijdens hoge glucosegroei.

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Ministerio de Educaci'n y Ciencia, Direcci'n General de Investigaci'n (MEC-DGI), Spanje (Grant BFU2004-02855-C0202). De kosten van publicatie van dit artikel werden mede gedekt door de betaling van paginakosten. Dit artikel dient daarom gemarkeerd te worden met “advertentie” in overeenstemming met 18 U.S.C. Sectie 1734 uitsluitend om dit feit aan te geven.

Huidig ​​adres: Departamento de Ingenieri´a Bioqui´mica, Escuela Nacional de Ciencias Biologicas, Instituto Politécnico Nacional, 11340 México D.F., México.

Beide auteurs hebben in gelijke mate bijgedragen aan dit werk.

Ondersteund door de Fundacio´n Carolina (Spanje).

Ondersteund door de MEC-DGI (Spanje).

Ondersteund door de FICYT (Fundaci´n para el Fomento en Asturias de la Investigaci´n Cienti´fica Aplicada y la Tecnologi´a), Spanje.


Phos-tag Western blotting voor het detecteren van stoichiometrische eiwitfosforylering in cellen

Om de fysiologische rollen van eiwitfosforylering te onderzoeken, is het belangrijk om locaties en stoichiometrie van fosforylering in cellen te analyseren. Het genereren van fosforyleringsplaatsspecifieke antilichamen is nuttig om gerichte fosforyleringsplaatsen te detecteren en hun intracellulaire distributie te visualiseren (1). Het is echter moeilijk om de stoichiometrie van fosforylering te bepalen met behulp van deze antilichamen. Fosfaataffiniteit polyacrylamidegelelektroforese is nuttig om stoichiometrische eiwitfosforylering te detecteren (2). De fosfaataffiniteitsplaats is een aan polyacrylamide gebonden dinucleair Mn2+-complex (Mn2+-Phos-tag) dat de mobiliteitsverschuivingen van gefosforyleerde vormen van veel eiwitten kan versterken. Fosforylatieniveaus van cellulaire eiwitten van belang kunnen worden bepaald door daaropvolgende Western-blotting.

Reagentia

  1. HBS: 20 mM Hepes-NaOH, pH 7,4 en 150 mM NaCl
  2. RIPA-buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 tot 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, PhosSTOP-fosfataseremmers (Roche) en volledig EDTA-vrij proteaseremmers (Roche)
  3. 5 mM acrylamide-hanger Phos-tag ligand (AAL-107 NARD Institute, Amagasaki, Japan) in H2O
  4. 10 mM MnCl2 in H2O
  5. Overdrachtbuffer A: 300 mM Tris en 5% MeOH
  6. Overdrachtbuffer B: 25 mM Tris en 5% MeOH
  7. Transferbuffer C: 25 mM Tris, 40 mM 6-amino-n-capronzuur en 5% MeOH

Apparatuur

  1. Verticale elektroforese-eenheid (BE-S27 Bio Craft, Tokyo, Japan)
  2. Semi-droge elektroblotting-apparaat (Trans-Blot SD Cell, Bio-Rad)
  3. Luminescerende beeldanalysator (LAS-3000, Fujifilm)

Procedure

A. Bereiding van extracten van hele cellen

  1. Spoel na stimulatie cellen tweemaal met ijskoude HBS.
  2. De volgende stappen moeten op ijs of bij 4oc worden gedaan.
  3. Voeg 1,0 ml RIPA-buffer toe aan een celkweekschaal van 100 mm en incubeer gedurende 15 minuten.
  4. Oogst gelyseerde cellen met een celschraper.
  5. Verzamel supernatanten na centrifugeren bij 20.000 g gedurende 15 minuten.
  6. Voeg Laemmli-monsterbuffer toe, meng en verwarm gedurende 10 minuten op 95 °C.
  7. Bewaar monsters bij -80 oc tot gebruik.

B. Fosfaataffiniteit polyacrylamidegelelektroforese

  1. Bereid de scheidingsgel met Mn2+-Phos-tag voor. We gebruiken routinematig 7,5% polyacrylamidegel met 25 micro M Phos-tag en 50 micro M MnCl2. Deze omstandigheden moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor eiwitten van belang.
  2. Bereid de normale stapelgel voor.
  3. Laad monsters op de gel. Merk op dat lanen die grenzen aan voorgekleurde molecuulgewichtmarkers sterk verstoord zijn tijdens elektroforese.
  4. Voer de gel uit op 5 tot 15 mA. Fosforyleringsafhankelijke mobiliteitsverschuivingen van sommige eiwitten worden dramatisch verbeterd door de stroom te verlagen, zoals eerder gemeld (3), hoewel de banden wazig worden.

C. Elektroforetische overdracht:

  1. Incubeer de gel onder zacht roeren in overdrachtsbuffer B aangevuld met 1 mM EDTA gedurende 10 minuten.
  2. Incubeer de gel onder zacht roeren in overdrachtsbuffer B zonder EDTA gedurende nog 10 minuten.
  3. Bereid het PVDF-membraan voor door het gedurende 30 seconden in MeOH te bevochtigen en het vervolgens gedurende meer dan 30 minuten in overdrachtsbuffer B te laten weken.
  4. Breng eiwitten in de gel elektroforetisch over op het membraan met behulp van een semi-droog blotapparaat bij 20 V gedurende 90 minuten volgens de methode van Kyhse-Andersen (4). In het kort, monteer de gel, het PVDF-membraan en het filterpapier in de volgende volgorde: de anode, twee lagen filterpapier gedrenkt in overdrachtsbuffer A, één laag filterpapier gedrenkt in overdrachtsbuffer B, PVDF-membraan, de gel, drie lagen van filtreerpapier gedrenkt in overdrachtsbuffer C, en de kathode.

D. Blokkering, incubatie met antilichamen en detectie

Kritieke stappen

Was cellen niet met een fosfaatbevattende buffer zoals PBS. Laad alle rijstroken van elke gel met alleen gelijktijdig bereide monsters. Omdat de overdracht van gefosforyleerde eiwitten van een gel met Mn2+-Phos-tag moeilijk is, moet de gel eerst worden geweekt in EDTA-bevattende overdrachtsbuffer B en moet de oorspronkelijke semi-droge overdrachtsmethode (4) met behulp van drie overdrachtsbuffers worden uitgevoerd.

Verwachte resultaten

We hebben meer dan 10 eiwitten getest waarvan bekend is dat ze in cellen worden gefosforyleerd op een ligand-afhankelijke manier en hebben opgemerkt dat fosforylatie-afhankelijke mobiliteitsverschuivingen van ongeveer tweederde daarvan duidelijk worden versterkt door Mn2+-Phos-tag toe te voegen aan acrylamidegels. Van sommige grote eiwitten werd gemeld dat ze meer gescheiden waren tussen gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde vormen door de Phos-tag-concentraties te verlagen (3,5 tot 5 micro M)3. We ontdekten echter dat dit niet effectief was in de gevallen van Nup153 en Nup214 (zie figuur 1).

Referenties

  1. Goto, H. & Inagaki, M. Productie van een plaats- en fosforyleringstoestandspecifiek antilichaam. nat. Protocollen 2, 2574-2581 (2007).
  2. Kinoshita-Kikuta, E., Aoki, Y., Kinoshita, E. & Koike, T. Label-vrije kinaseprofilering met behulp van polyacrylamidegelelektroforese met fosfaataffiniteit. Mol. Cel. Proteomics 6, 356-366 (2007).
  3. Tomida, J., Kitao, H., Kinoshita, E. & Takata, M. Detectie van fosforylering op grote eiwitten door western blotting met behulp van Phos-tag-bevattende gel. nat. Protocollen doi:10.1038/nprot.2008.232 (2008).
  4. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting van meerdere gels: een eenvoudig apparaat zonder buffertank voor snelle overdracht van eiwitten van polyacrylamide naar nitrocellulose. J. Biochem. Biofysica. Methoden: 10, 203-209 (1984).

Dankbetuigingen

We danken Hitomi Suzuki voor experimentele hulp.

Figuren

Figuur 1: Detectie van fosforylering van nucleoporines en ERK2 door Phos-tag Western blotting.

Met serum uitgehongerde HeLa-cellen werden gedurende de aangegeven tijden gestimuleerd met 100 ng/ml TPA met of zonder een voorbehandeling van 30 minuten met U0126 (U). De lysaten werden onderworpen aan SDS-PAGE in aanwezigheid (rechts) of afwezigheid (links) van Mn2+-Phos-tag gevolgd door immunoblotting met mAb414 (boven) en anti-ERK2 mAb (onder). De mAb414 reageert met FG-herhalingen in verschillende nucleoporines, waaronder Nup358, Nup214 en Nup153.

Bijbehorende publicaties

Phosphoproteomics onthult nieuwe ERK MAP-kinase-doelen en koppelt ERK aan nucleoporine-gemedieerd nucleair transport, Hidetaka Kosako, Nozomi Yamaguchi, Chizuru Aranami, Masato Ushiyama, Shingo Kose, Naoko Imamoto, Hisaaki Taniguchi, Eisuke Nishida en Seisuke Hattori, Nature Structural & Molecular Biology 16 (10) 1026 - 1035 20/09/8/2009 doi:10.103 nsmb.1656

Auteurs informatie

Hidetaka Kosako, Afdeling Ziekte Proteomics, Instituut voor Enzymonderzoek, De Universiteit van Tokushima

Correspondentie met: Hidetaka Kosako ( [email protected] )

Bron: Protocol Exchange (2009) doi:10.1038/nprot.2009.170. Oorspronkelijk online gepubliceerd 22 september 2009.


3. Resultaten en discussie

3.1. ERK1/2-fosforylering wordt gewijzigd door experimentele temperatuuromstandigheden

De best beschreven, en meest vatbaar voor stress, MAPK-signaleringsroute in zoogdiercellen is de ERK1/2-route (Lee et al., 2005). Om de rol van ERK1/2 in de hitteverschuivingsreactie te onderzoeken, analyseerden we de fosforyleringstoestand van ERK1/2 van verschillende cellijnen onder drie verschillende omstandigheden: 's nachts volledige mediumincubatie (serum), uithongering met het juiste medium zonder serum voor 1 h (Starv 37ଌ), en gedurende 15 min (25ଌ) op kamertemperatuur gehouden. Zoals getoond in figuur 1 veroorzaakte serumdeprivatie in het algemeen een afname in ERK1/2-fosforylering (42� kDa-banden). De hoeveelheid gefosforyleerde toestand in verschillende cellijnen is echter strikt afhankelijk van de experimentele temperatuuromstandigheden. Inderdaad, βTC- en INS-1-cellijnen vertoonden een significante afname van p-ERK1/2 indien behandeld bij kamertemperatuur, terwijl in 3T3- en CHO-cellijnen dezelfde behandeling een toename van de hoeveelheid p-ERK1/2 veroorzaakte. Hoewel er enkele fluctuaties kunnen worden waargenomen, werden er geen grote veranderingen waargenomen in de niveaus van p-ERK1/2 door hoge of lage temperaturen in GH3-, HeLa-, CGC-, PC12- of N38-cellen.

Bovenste paneel: schema met experimentele omstandigheden voor celkweek. Cellen werden onder normale omstandigheden (met serum) gedurende de nacht bij 37°C gekweekt, gedurende 1 uur bij 37°C (zonder serum) uitgehongerd en vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (25°C) gehouden. Onderste panelen: representatieve Western-blots van ten minste drie experimenten, in tweevoud uitgevoerd, die ERK1/2-fosforylering van verschillende cellijnen tonen die zijn onderworpen aan de beschreven experimentele omstandigheden. Om gelijke belading van monsters te beoordelen, werden blots gekleurd met Ponceau S en onderzocht met een antilichaam tegen α-tubuline (gegevens niet getoond).

3.2. Activering van verschillende kinasen na heat-shift en milde HS

Met het oog op de waargenomen temperatuurgeïnduceerde veranderingen in de gefosforyleerde toestand van ERK1/2, hebben we de rol van andere kinasen in de temperatuurstressreacties onderzocht, aangezien farmacologische toedieningen gewoonlijk worden uitgevoerd onder een afzuigkap bij kamertemperatuur (25 °C). x000b0C) voordat de platen in de incubator worden vervangen, terwijl overeenkomstige controlecellen over het algemeen in de incubator worden gelaten (bij 37ଌ).

We analyseerden, naast p-ERK1 / 2, de fosforyleringstoestand van PKC, AMPK, Akt, JNK en p38 in verschillende cellijnen die werden behandeld zoals gerapporteerd in het schema dat wordt getoond in figuur 2 . Na 60 minuten uithongering werden de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (25°C) op de werktafel overgebracht, waarbij de experimentele conditieprocedures werden nagebootst (zoals het veranderen van medium of medicijntoedieningen). Na deze tijd werden de cellen op verschillende temperaturen gehouden: (i) kamertemperatuur 25°C, (ii) in een warme kamer bij 37°C om een ​​warmteverschuiving teweeg te brengen, of (iii) op ​​een hete plaat ingesteld op 42°x000b0 (interne temperatuur van 40 ° C) om een ​​milde HS te induceren, en de cellen werden na 5, 15 en 30 minuten geoogst.

Bovenste paneel: schema met experimentele omstandigheden voor celkweek. Cellen werden onder normale omstandigheden (met serum) overnacht bij 37°C gekweekt, gedurende 1 uur bij 37°C (zonder serum) uitgehongerd en vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (25°C) gehouden. Na deze tijd werden de cellen 5, 15 of 30 minuten bij verschillende temperaturen gehouden (kamertemperatuur 25 ° C, 37 ° C om een ​​warmteverschuiving te induceren of 40 ° C om een ​​milde HS te induceren). Onderste panelen: representatieve Western-blots van ten minste drie experimenten, die fosforylering van verschillende kinasen tonen door verschillende cellijnen die zijn onderworpen aan de beschreven experimentele omstandigheden. Temperatuuromstandigheden worden boven de blots aangegeven, terwijl blootstellingstijden onder de blots worden aangegeven. Om vast te stellen dat er in elke baan gelijke hoeveelheden eiwit aanwezig waren, werden dezelfde blots onderzocht met een antilichaam tegen α-tubuline. Om uiteindelijk verschillende ladingen te verifiëren, werden gelblots gekleurd met Ponceau S of onderzocht met een antilichaam tegen tubuline (gegevens niet getoond).

Zoals getoond in figuur 2 vertoonden fosfokinasebanden die na 5, 15 en 30 minuten bij kamertemperatuur (25°) werden verkregen, zoals verwacht, geen significante veranderingen in de tijd en kunnen worden beschouwd als een basaal niveau van fosforylering. De overdracht naar de warme kamer (37ଌ), die de gebruikelijke werktemperatuur vertegenwoordigt en een warmteverschuiving kan induceren, veroorzaakte over het algemeen een toename van ERK1/2-fosforylering, vooral duidelijk in GH3, INS-1, βTC en 3T3-L1-cellijnen. Hoewel er enkele oscillaties te zien zijn, werden er geen grote veranderingen waargenomen in de niveaus van p-ERK1/2 geïnduceerd door warmteverschuiving in PC12-, HeLa-, CGC-, CHO-, CGC- of N38-cellen.

Naast ERK1/2 bleek een ander kinase significant te worden gereguleerd door temperatuurvariaties. De temperatuur van 37°C (warmteverschuiving) was inderdaad in staat om de JNK-fosforylering in GH3-, PC12- en βTC-cellijnen te verhogen, zonder duidelijke veranderingen in de andere cellijnen.

Zoals in dezelfde figuur te zien is, toonde een verdere stijging van de temperatuur (40°x000b0C), in staat om een ​​milde HS te induceren, een strikte toename van de ERK1/2- en JNK-fosforyleringstoestand in alle onderzochte cellijnen, terwijl HS anders gereguleerd werd. de andere kinasen in verschillende cellijnen.

Er werd inderdaad een significante toename van p-p38 aangetoond in N38-, CHO-, HeLa- en βTC-cellen en van p-AMPK in GH3-, N38-, CHO-, HeLa-, INS-1- en βTC-cellen. Daarentegen bleek p-AMPK neerwaarts gereguleerd te zijn in PC12-, CGC- en 3T3-L1-cellen. Bovendien was na HS p-Akt-activering duidelijk in N38-, CHO-, HeLa- en CGC-cellen, terwijl er geen significante veranderingen werden waargenomen in de andere cellijnen. PKC-fosforylering nam af in PC12-, N38-, HeLa-, INS-1- en βTC-cellen. In 3T3-L1-cellen werd na een vroege toename (5 en 15 min) een neerwaartse regulatie van p-PKC waargenomen.

Bovendien nam in sommige cellijnen (PC12-, INS-1-, βTC- en 3T3-L1-cellen) het α-tubulinesignaal, dat wordt gebruikt om de belasting te normaliseren, in de loop van de tijd af tijdens milde blootstelling aan HS (Figuur 2 40ଌ voor 30 minuten). Om dit resultaat te verifiëren, werden PVDF-blots gekleurd met Ponceau S (Figuur 2) en vervolgens onderzocht met anti-actine (gegevens niet getoond). We merkten een normale eiwitlading op voor PC12-, βTC- en 3T3-L1-cellen, terwijl een afname van het eiwitgehalte werd waargenomen in INS-1-cellen die gedurende 30 minuten bij 40°C waren behandeld. Deze bevindingen geven aan dat α-tubuline ook kan worden onderworpen aan een snelle omzet in HS-omstandigheden.

De resultaten van de huidige studie laten zien dat er geen homogene respons is bij het activeren van specifieke intracellulaire routes om te herstellen van hitteschade, en dat deze activering specifiek is voor elke cellijn. Bovendien kan het eenvoudigweg verplaatsen van celculturen van de incubator (37 ° C) naar de werkbank bij kamertemperatuur (25 ° C), zoals procedures die gewoonlijk worden gebruikt om te testen verbindingen toe te voegen, het fosforyleringsniveau van sommige kinasen aanzienlijk veranderen.

Men moet er rekening mee houden dat farmacologische behandelingen gewoonlijk bij kamertemperatuur onder een afzuigkap worden uitgevoerd, voordat celculturen in de incubator worden teruggeplaatst, terwijl de overeenkomstige controlecellen over het algemeen na verloop van tijd in de incubator worden gehouden. Deze resultaten suggereren de noodzaak om zorgvuldig parallel-gematchte controlepunten van kinasefosforyleringsniveaus te overwegen met cellen die onder dezelfde experimentele omstandigheden zijn behandeld.

De huidige resultaten kunnen van technisch belang zijn en wijzen op mogelijke foutenbronnen in de interpretatie van het resultaat als gevolg van de invloed van verschillende experimentele temperatuuromstandigheden.


Conclusie

Onze resultaten geven aan dat een gefosforyleerde vorm van Borealin bestaat in mitotische cellen. Het genereren van deze mitotische gefosforyleerde vorm van Borealin vereist geen Aurora B-kinase-activiteit of de residuen S165 of T106 van Borealin. Zowel de interfasevorm als de mitotische vorm van Borealin kan een complex vormen met INCENP, maar er is een voorkeur voor de mitotische vorm. Een gefosforyleerde vorm van Borealin kan ook in interfasecellen worden geïnduceerd door behandeling met cyclohexamide of NaF. Borealin reist naar de middenzone van de spil wanneer actine/myosine-gemedieerde samentrekking van de splitsingsgroef wordt geremd, en blijft gehecht aan de overblijfselen van de spil in cellen die niet delen. Borealin wordt gedefosforyleerd wanneer cellen de mitose verlaten, ongeacht of ze in staat zijn om een ​​functionele splitsingsgroef te vormen.


Analyse van de western blot

Eenmaal zichtbaar, is het tijd om uw eiwit van belang te analyseren. Analyse begint typisch door te bevestigen dat het eiwit de verwachte grootte heeft in vergelijking met de eiwitstandaarden.

Eiwit overvloed

Bovendien geeft de dikte van de band informatie over de relatieve abundantie van het eiwit in het monster. Meer eiwit zorgt voor een dikkere band, terwijl minder eiwit leidt tot een dunnere band. Het is echter belangrijk op te merken dat u een laadcontrole moet opnemen bij het beoordelen van de eiwitovervloed of het vergelijken van monsters over rijstroken.

Voor een typische laadcontrole wordt het membraan gesondeerd met een antilichaam dat een alomtegenwoordig tot expressie gebracht eiwit detecteert, zoals actine. Actineniveaus moeten consistent zijn in alle monsters op de gel en moeten worden waargenomen als een band van consistente grootte en dichtheid die in alle monsters aanwezig is. Ongelijke monsterbelading of onvolledige eiwitoverdracht veroorzaakt inconsistente niveaus van de laadcontrole. In deze gevallen moet de western worden herhaald.

Ten slotte, hoewel westerns een nuttige manier zijn om de eiwitovervloed te meten, bieden ze kwalitatieve metingen. Als u nauwkeurige kwantificering van een eiwit nodig heeft, overweeg dan om een ​​alternatieve methode te gebruiken, zoals een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Aydin et al., 2015).

Post-translationele modificaties

Naast eiwitovervloed detecteren westerns veranderingen in de post-translationele modificaties van een eiwit, zoals fosforylering, acetylering, methylering en ubiquitinatie. Als u bijvoorbeeld wilt testen of een eiwit gefosforyleerd is na een specifieke experimentele conditie, kunt u voor en na de behandeling kijken naar een kleine verschuiving in de grootte van de eiwitband.

Westerns zijn ook een nuttige uitlezing voor een aantal cellulaire testen. Ze kunnen eiwitinteracties bepalen na immunoprecipitatie en zijn een gebruikelijke uitlezing voor subcellulaire fractioneringen, een procedure die eiwitten isoleert uit verschillende cellulaire compartimenten zoals de mitochondriën, het cytoplasma en de kern.

We hopen dat deze blog je een goed overzicht heeft gegeven van de western blot. Wanneer u een western plant, zorg er dan voor dat u de juiste positieve en negatieve controles opneemt, kies antistoffen die gevalideerd zijn voor uw toepassing en test de antistof in uw specifieke systeem. Als je deze blog nuttig vond, bekijk dan zeker de blog van Addgene voor overzichten van andere antilichaamonderwerpen.


Western Blot-protocollen (deel 1) - Monster- en gelvoorbereiding

Algemene tips voor monstervoorbereiding: Wees zachtaardig! Blijf kalm! ? Gebruik extractieprocedures die zo mild mogelijk zijn. Bescherm de eiwitten om te voorkomen dat ze denatureren. ? Extraheer eiwitten snel, indien mogelijk op ijs en gebruik buffer om een ​​geschikte pH te behouden om eiwitafbraak te voorkomen.

Hier geven we een aantal aanbevolen methoden voor monsterextractie voor verschillende soorten materialen in tabel 1.

Tabel 1. Overzicht van extractiemogelijkheden voor verschillende cellen en weefsels

Steekproef Typische lysis-opties
Weefselkweek Wasmiddel lysis
celsuspensies Ultrasone trillingen
De meeste plantaardige en dierlijke weefsels Mechanische homogenisatie:
Zachte dierlijke weefsels en cellen Handmatige of mechanische homogenisatie
Bacteriële en zoogdiercellen Lyse invriezen/ontdooien
Bacteriën, erytrocyten, gekweekte cellen Osmotische shock lysis
Vaste weefsels en plantencellen Handmatig malen met vijzel en stamper
Celsuspensies, gistcellen Slijpen met schurende component
Bacteriën, gisten, plantenweefsels, schimmelcellen Enzymatische spijsvertering
Bacteriën, gist, plantencellen Stikstof cavitatie
Micro-organismen met celwanden Franse media
Plantenweefsels, schimmelcellen Glaskralen frezen

Het geëxtraheerde eiwit moet worden opgelost en bewaard in lysisbuffer om het volgende elektroforeseproces verder uit te voeren. Er zijn veel recepten voor lysisbuffers, maar een paar zullen dienen voor de meeste western blotting-experimenten. Kortom, ze verschillen in hun vermogen om eiwitten op te lossen, waarbij die met natriumdodecylsulfaat en andere ionische detergentia als de meest agressieve worden beschouwd en daarom waarschijnlijk de hoogste opbrengst opleveren. Deze detergenten kunnen echter in meer of mindere mate eiwitdenaturatie veroorzaken. Dus als uw gebruikte antilichaam geen gedenatureerde eiwitten kan herkennen, moet u het detergens in buffer zoals SDS, deoxycholaat, Triton X-100 en NP-40 vermijden of proberen relatief milde niet-ionische detergentia te gebruiken.

Protease- en fosfataseremmers

Proteaseremmers moeten in lysisbuffers worden opgenomen om afbraak van eiwitten na het vrijkomen van endogene proteasen tijdens het cellysisproces te voorkomen. Zodra lysis optreedt, beginnen proteolyse, defosforylering en denaturatie. Deze gebeurtenissen kunnen enorm worden vertraagd als monsters te allen tijde op ijs of bij 4 ° C worden bewaard en geschikte remmers vers aan de lysisbuffer worden toegevoegd. Cocktails van remmers van verschillende leveranciers zijn verkrijgbaar, maar toch kun je je eigen remmersmengsel maken. Hier vermelden we een aantal remmerformules in tabel 2.

Tabel 2. Remmerformule

remmer Protease/fosfatase geremd Eindconcentratie in lysisbuffer Voorraad (bewaren bij -20°C)
aprotinine Trypsine, chymotrypsine, plasmine 2 g/ml Verdun in water, 10 mg/ml. Eenmaal ontdooid niet opnieuw gebruiken.
Leupeptin Lysosomaal 5-10 g/ml Verdunnen in water. Eenmaal ontdooid niet opnieuw gebruiken.
Pepstatine A Asparagineproteasen 1 g/ml Verdun in methanol, 1 mM.
PMSF Serine, cysteïne proteasen 1 mM Verdun in ethanol. U kunt hetzelfde aliquot opnieuw gebruiken.
EDTA Metalloproteasen die Mg2+ en Mn2+ . nodig hebben 5 mM Verdun in H2O, 0,5 M. Stel de pH in op 8,0.
EGTA Metalloproteasen die Ca2+ . nodig hebben 1 mM Verdunnen in H2O, 0,5 M.
Stel de pH in op 8,0.
Na fluoride Serine/threonine fosfatasen 5-10 mM Verdunnen in water. Eenmaal ontdooid niet opnieuw gebruiken.
Na Orthovanadaat Tyrosinefosfatasen 1 mM Verdunnen in water. Eenmaal ontdooid niet opnieuw gebruiken.

Bereiding van lysaat uit celcultuur:

Plaats de celkweekschaal in ijs en was de cellen met ijskoude PBS.

Giet de PBS af en voeg vervolgens ijskoude lysisbuffer toe (1 ml per 107 cellen/100 mm2 schaal/150 cm2 kolf 0,5 ml per 5x106 cellen/60 mm2 schaal/75 cm2 kolf).

Schraap hechtende cellen van de schaal met behulp van een koude plastic celschraper en breng de celsuspensie voorzichtig over in een voorgekoelde microcentrifugebuis.

Handhaaf constant roeren gedurende 30 minuten bij 4°C.

Spin bij 16.000 x g gedurende 20 minuten in een voorgekoelde microcentrifuge van 4°C.

Verwijder de buisjes voorzichtig uit de microcentrifuge en plaats ze op ijs. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis die op ijs wordt bewaard en gooi de pellet weg.

Bereiding van lysaat uit weefsels:

Ontleden het weefsel van belang met schone gereedschappen, bij voorkeur op ijs, en zo snel mogelijk om afbraak door proteasen te voorkomen.

Plaats het weefsel in microcentrifugebuisjes met ronde bodem of Eppendorf-buisjes en dompel het onder in vloeibare stikstof om "snap freeze". Bewaar monsters bij -80°C voor later gebruik of bewaar op ijs voor onmiddellijke homogenisatie.

300 ml lysisbuffer snel in de buis, homogeniseer met een elektrische homogenisator, spoel het mes tweemaal met nog eens 2 x 300 ml lysisbuffer en blijf dan constant roeren gedurende 2 uur bij 4°C. Volumes lysisbuffer moeten worden bepaald in verhouding tot de aanwezige hoeveelheid weefsel. Eiwitextract mag niet te verdund zijn, om te voorkomen dat er grote hoeveelheden per gelbaan moeten worden geladen. De minimale eiwitconcentratie is 0,1 mg/ml, de optimale concentratie is 1-5 mg/ml.

Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 16.000 rpm bij 4°C in een microcentrifuge gedurende 20 minuten. Verwijder de buisjes voorzichtig uit de centrifuge en plaats ze op ijs. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis die op ijs wordt bewaard en gooi de pellet weg.

Na het extraheren van cellen of weefsellysaat, moeten eiwitmonsters worden gekwantificeerd, zodat om de hoeveelheid eiwit van monsters die in verschillende banen binnen dezelfde gel of tussen gels lopen, te vergelijken en alle banen met dezelfde totale hoeveelheid eiwit zijn geladen. Verschillende spectrofotometrische methoden worden routinematig gebruikt om de eiwitconcentratie in een oplossing te bepalen. Deze omvatten meting van de intrinsieke ultraviolet (UV) absorptie van het eiwit, evenals methoden die zijn gebaseerd op een eiwitafhankelijke kleurverandering, zoals de klassieke, op koper gebaseerde Lowry-assay, de Smith koper/bicinchoninic-assay (BCA) en de Bradford kleurstof bepaling.

Tabel 3 vergelijkt drie verschillende methoden voor eiwitkwantificering.

Invoering Voordelen: nadelen:
De Lowry-methode Vertrouwt op de reactie van koper met eiwitten, maar het monster wordt ook geïncubeerd met het Folin-Ciocalteu-reagens. Reductie van het Folin-Ciocalteu-reagens onder alkalische omstandigheden resulteert in een intense blauwe kleur (heteropolymolybdeenblauw) die absorbeert bij 750 nm. De Lowry-methode kan het beste worden gebruikt met eiwitconcentraties van 0,01-1,0 mg/ml. Makkelijk te gebruiken
Zeer reproduceerbaar
Goedkoop
Gevoelig en breed lineair bereik
Moet voor elke test een standaardcurve maken
Timing en menging van reagentia moeten nauwkeurig zijn
Bradford-test Binding van Coomassie Brillant Blue G-250 aan eiwitten, veroorzaakt een verschuiving van de kleurstof van rood (465 nm) naar blauw (595 nm) onder zure omstandigheden. Het is compatibel met meer gebruikelijke reagentia, hoewel reinigingsmiddelen interferentie kunnen veroorzaken. Eiwitten met een concentratie van 20-2000 g/mL kunnen worden gemeten met behulp van de Bradford-assay. Makkelijk te gebruiken
Gevoelig en breed lineair bereik
Snel
Compatibel met veel buffers
Moet voor elke test een standaardcurve maken
Reagens kleurt cuvetten
Moeten vaak monsters verdunnen voorafgaand aan analyse
Hangt sterk af van aminozuursamenstelling
Bicinchoninezuurtest (BCA) Na reductie van Cu2+-ionen cheleren twee BCA-moleculen met elk Cu+-ion, wat resulteert in de vorming van een intens paarse kleur die absorbeert bij 560 nm. BCA is net zo gevoelig als de Lowry-methode en werkt goed bij eiwitconcentraties van 0,5 μg/ml tot 1,5 mg/ml. Makkelijk te gebruiken
Zeer reproduceerbaar
Goedkoop
Gevoelig en breed lineair bereik
Moet voor elke test een standaardcurve maken
Kleur blijft zich in de loop van de tijd ontwikkelen, maar is stabiel voor meting na 30 minuten bij 37°C

Zodra de concentratie van elk monster is bepaald, kunt u ze invriezen bij -20°C of -80°C voor later gebruik of ze voorbereiden om op een gel of ander gebruik te worden geladen.

Polyacrylamidegels zijn inerte, verknoopte structuren. De poriegroottes in deze gels zijn vergelijkbaar met de moleculaire straal van veel eiwitten. Omdat moleculen in een elektrisch veld door de gel worden gedwongen, worden grotere moleculen meer vertraagd door de gel dan kleinere moleculen. Wanneer gescheiden op een polyacrylamidegel, wordt de procedure afgekort als SDS-PAGE (voor natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese). De techniek is een standaardmiddel voor het scheiden van eiwitten op basis van hun molecuulgewicht. Polyacrylamidegels worden gevormd door de polymerisatie van twee verbindingen acrylamide en N,N-methyleenbis-acrylamide (kortweg Bis). Bis is een verknopingsmiddel voor de gels. De polymerisatie wordt gestart door de toevoeging van ammoniumpersulfaat samen met ofwel DMAP of TEMED. De gels zijn neutrale, hydrofiele, driedimensionale netwerken van lange koolwaterstoffen verknoopt door methyleengroepen. De scheiding van moleculen in een gel wordt bepaald door de relatieve grootte van de poriën die in de gel worden gevormd. De poriegrootte van een gel wordt bepaald door twee factoren: de totale hoeveelheid acrylamide die aanwezig is en de hoeveelheid crosslinker. Naarmate het percentage acrylamide toeneemt, neemt de poriegrootte af. Bij verknoping geeft 5% de kleinste poriegrootte. Elke toename of afname van het verknopingspercentage verhoogt of verlaagt de poriegrootte. Gels worden aangeduid als procentuele oplossingen en hebben twee noodzakelijke parameters. Het totale acrylamide wordt gegeven als een percentage (w/v) van het acrylamide plus het bis-acrylamide. De gemiddelde poriegrootte wordt bepaald door het percentage van de hoeveelheid crosslinker en de totale hoeveelheid acrylamide die wordt gebruikt. Polyacrylamide wordt gebruikt om de meeste eiwitten te scheiden, variërend in molecuulgewicht van Mr >5000 tot <200.000.

Tabel 4 Aanbevolen acrylamideconcentratie voor eiwitdoelwit binnen gedefinieerde groottebereiken.

Beoogd eiwitgroottebereik (Mr) Aanbevolen acrylamideconcentratie
36 000 tot 205 000 5%
24 000 tot 205 000 7.5%
14 000 tot 205 000 10%
14 000 tot 66 000 12.5%
14 000 tot 45 000 15%

Het percentage polyacrylamide dat in de gel wordt gebruikt, samen met het buffersysteem, zal de mobiliteit van de eiwitten door de gel beïnvloeden wanneer stroom wordt toegepast. De verwachte grootte van het doeleiwit kan worden gebruikt om het beste gel/buffersysteem te selecteren om optimale scheiding en resolutie te bereiken (Figuur 2).

Figuur 2. Migratie van eiwit door molecuulgewicht varieert per geltype, concentratie en loopbuffer. Gebruik de geschatte migratiepatronen die hier worden gegeven om te helpen bij de selectie van het geltype en de lopende buffer op basis van het voorspelde MW van het doeleiwit en de gewenste scheiding

Het SDS-PAGE-systeem dat we gebruikten is meestal een discontinu systeem. Het bestaat uit twee verschillende gels: de stapelgel en de scheidende/oplossende gel (Figuur 3.). Stapelgel meestal met een lage pH (6,8) en Acr Bis-concentratie (4%), waardoor de stapelgel een hogere porositeit heeft en de beweging van eiwitten nauwelijks kan beïnvloeden. Scheidingsgel met hogere pH (8,8) en Acr Bis-concentratie (12,5%). Gebruik een gelkam om monsterlaadcellen op stapelgel te vormen. Laad het monster in de cellen en schakel de stroom in. Door de monsters eerst door een stapelgel met een lagere dichtheid te laten lopen, worden de eiwitten binnen enkele minuten geconcentreerd in een dunne startzone tegen de tijd dat de inhoud van het monster de oplossende gel bereikt door een proces dat bekend staat als isotachoforese. Het grensvlak tussen de twee geldichtheden kan dus worden beschouwd als de startlijn voor alle eiwitten in elk putje en bij het betreden van de oplossende gel beginnen de eiwitten te scheiden naar grootte. Een referentierecept van deze twee soorten gelpreparaten wordt getoond in Tabel 5 en Tabel 6.


Yang, XJ & Seto, E. Lysine-acetylering: gecodificeerde overspraak met andere posttranslationele modificaties. Mol. Cel 31, 449–461 (2008).

Vanselow, K. & Kramer, A. De rol van fosforylering in de circadiane klok van zoogdieren. Koude Lente Harb. Symp. aantal. Biol. 72, 167–176 (2007).

Strahl, BD & Allis, CD De taal van covalente histon-modificaties. Natuur 403, 41–45 (2000).

Jenuwein, T. & Allis, C.D. Het vertalen van de histoncode. Wetenschap 293, 1074–1080 (2001).

Aletta, JM, Cimato, TR. & Ettinger, MJ Eiwitmethylering: een signaalgebeurtenis bij post-translationele modificatie. TrendsBiochem. Wetenschap. 23, 89–91 (1998).

Chin, HG et al. Sequentiespecificiteit en rol van proximale aminozuren van de histon H3-staart op katalyse van muizen G9A-lysine 9 histon H3-methyltransferase. Biochemie 44, 12998–13006 (2005).

Rea, S. et al. Regulatie van de chromatinestructuur door plaatsspecifieke histon H3-methyltransferasen. Natuur 406, 593–599 (2000).

Jeong, Y.S., Cho, S., Park, J.S., Ko, Y. & Kang, Y.K. Fosforylering van serine-10 van histon H3 beschermt selectief gemodificeerd lysine-9 tijdens mitose. Genen Cellen 15, 181–192 (2010).

Kouzarides, T. Chromatin-modificaties en hun functie. Cel 128, 693–705 (2007).

Chuikov, S. et al. Regulering van p53-activiteit door lysinemethylering. Natuur 18, 353–360 (2004).

Jansson, M. et al. Arginine-methylering reguleert de p53-respons. nat. Cel Biol. 10, 1431–1439 (2008).

Huang, J. et al. P53 wordt gereguleerd door het lysinedemethylase LSD1. Natuur 449, 105–108 (2007).

Subramanian, K. et al. Regulatie van oestrogeenreceptor-alfa door de SET7-lysinemethyltransferase. Mol. Cel 30, 336–347 (2008).

Kim, H. et al.Vereiste van histonmethyltransferase SMYD3 voor oestrogeenreceptor-gemedieerde transcriptie. J. Biol. Chem. 284, 19867–19877 (2009).

Estève, P.O. et al. Regulering van DNMT1-stabiliteit door SET7-gemedieerde lysinemethylering in zoogdiercellen. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 106, 5076–5081 (2009).

Dephore, N. et al. Een kwantitatieve atlas van mitotische fosforylering. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 105, 10762–10767 (2008).

Wang, J. et al. De lysinedemethylase LSD1 (KDM1) is vereist voor het in stand houden van de globale DNA-methylatie. nat. Genet. 41, 125–129 (2009).

Fischle, W., Wang, Y. & Allis, C.D. Binaire schakelaars en modificatiecassettes in histonbiologie en daarbuiten. Natuur 425, 475–479 (2003).

Pradhan, S. & Estève, P.O. Allosterisch activatordomein van onderhoud van menselijk DNA (cytosine-5) methyltransferase en zijn rol bij de verspreiding van methylering. Biochemie 42, 5321–5332 (2003).

Alessi, DR. et al. Mechanisme van activering van proteïnekinase B door insuline en IGF-1. EMBO J. 15, 6541–6551 (1996).

Couture, JF, Collazo, E., Hauk, G. & Trievel, R.C. Structurele basis voor de methyleringsplaatsspecificiteit van SET7/9. nat. structuur. Mol. Biol. 13, 140–146 (2006).

Franke, T.F. et al. Het eiwitkinase dat wordt gecodeerd door het Akt-proto-oncogen is een doelwit van het PDGF-geactiveerde fosfatidylinositol 3-kinase. Cel 81, 727–736 (1995).

Fischle, W. Talk is goedkope overspraak bij het vaststellen, onderhouden en uitlezen van chromatine-modificaties. Genen Dev. 22, 3375–3382 (2008).

Yang, XD et al. Negatieve regulatie van NF-KB-actie door Set9-gemedieerde lysinemethylering van de RelA-subeenheid. EMBO J. 28, 1055–1066 (2009).

Chuang, LS et al. Humaan DNA-(cytosine-5)-methyltransferase-PCNA-complex als doelwit voor p21 WAF1. Wetenschap 277, 1996–2000 (1997).

Pradhan, S. & Kim, G.D. Het retinoblastoma-genproduct interageert met onderhoud menselijk DNA (cytosine-5) methyltransferase en moduleert de activiteit ervan. EMBO J. 21, 779–788 (2002).

Robertson, KD et al. DNMT1 vormt een complex met Rb, E2F1 en HDAC1 en onderdrukt de transcriptie van op E2F reagerende promoters. nat. Genet. 25, 338–342 (2000).

Estève, P.O. et al. Directe interactie tussen DNMT1 en G9a coördineert DNA- en histonmethylering tijdens replicatie. Genen Dev. 20, 3089–3103 (2006).

Hideshima, T. et al. Remming van Akt induceert significante neerwaartse regulatie van survivine en cytotoxiciteit in menselijke multipele myeloomcellen. Br. J. Haematol. 138, 783–791 (2007).

Hill, KM et al. De rol van PI 3-kinase p110beta in AKT-signaal, celoverleving en proliferatie in menselijke prostaatkankercellen. Prostaat 70, 755–764 (2010).

Lin, HJ et al. Borstkanker-geassocieerde fibroblasten verlenen AKT1-gemedieerde epigenetische silencing van Cystatine M in epitheelcellen. Kanker onderzoek. 68, 10257–10266 (2008).

Andrews, NC & Faller, D.V. Een snelle micropreparatietechniek voor extractie van DNA-bindende eiwitten uit een beperkt aantal zoogdiercellen. Nucleïnezuren Res. 19, 2499 (1991).

Kim, GD, Ni, JW, Stark, N., Roberts, R.J. & Pradhan, S. Samenwerking en communicatie tussen het menselijk onderhoud en de novo DNA (cytosine-5) methyltransferasen. EMBO J. 21, 4183–4195 (2002).

Pradhan, S., Bacolla, A., Wells, RD & Roberts, R.J. Recombinant humaan DNA (cytosine-5) methyltransferase. I. Expressie, zuivering en vergelijking van de novo en onderhoudsmethylering. J. Biol. Chem. 274, 33002–33010 (1999).

Ehrlich, M. DNA-hypomethylering, kanker, de immunodeficiëntie, instabiliteit van het centromeergebied, syndroom van gezichtsanomalieën en chromosomale herschikkingen. J. Nutr. 132, 2424–2429 (2002).

Subramanian, K. et al. Regulatie van oestrogeenreceptor-alfa door de SET7-lysinemethyltransferase. Mol. Cel 30, 336–347 (2008).

Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. & Minor, W. Multiparametrische schaling van diffractie-intensiteiten. Acta Crystallogr. EEN 59, 228–234 (2003).

Navaza, J. Implementatie van moleculaire vervanging in AMoRe. Acta Crystallogr. NS 57, 1367–1372 (2001).

Jones, TA, Zou, J.Y., Cowan, S.W. & Kjeldgaard, M. Verbeterde methoden voor het bouwen van eiwitmodellen in elektronendichtheidskaarten en de locatie van fouten in deze modellen. Acta Crystallogr. EEN 47, 110–119 (1991).

Brünger, A.T. et al. Kristallografie & NMR-systeem: een nieuwe softwaresuite voor macromoleculaire structuurbepaling. Acta Crystallogr. NS 54, 905–921 (1998).

Birktoft, J.J. & Breddam, K. Glutamyl-endopeptidasen. Methoden Enzymol. 244, 114–126 (1994).


Resultaten

Ena/VASP-fosfomimetische mutanten imiteren `vergrendelde' fosforyleringspatronen

Humaan VASP is een substraat voor PKA, PKG en AMPK, die respectievelijk de residuen S157, S239 en T278 fosforyleren. De eerste twee fosforylatieplaatsen zijn geconserveerd in Mena (S236 en S376 in het muizeneiwit), terwijl EVL alleen de eerste plaats bevat (S160 in het menselijke eiwit) (Fig. 1A,C,E). We hebben fosfomimetische Ena / VASP-mutanten gegenereerd door fosforylatieplaatsen systematisch uit te wisselen voor zure aminozuren om een ​​constitutief gefosforyleerd residu te imiteren. Substitutie met alanine stopte de resterende fosforyleringsplaatsen in een niet-gefosforyleerde toestand. Voor VASP werden constructen aangeduid met een drielettercode volgens de aminozuren op posities 157, 239 en 278 (met A, alanine D, asparaginezuur E, glutaminezuur). DAA is bijvoorbeeld een VASP-mutant die substituties S157D, S239A en T278A draagt. De fosfomimetische mutanten omvatten alle VASP-fosforylatiepatronen, variërend van niet-gefosforyleerde (AAA), enkelvoudig gefosforyleerde (DAA, ADA, AAE), dubbel gefosforyleerde (DDA, DAE, ADE), tot drievoudig gefosforyleerde (DDE) eiwitten, elk in een vaste staat van fosforylering (Fig. 1A). Mena- en EVL-constructen werden dienovereenkomstig genoemd, met behulp van een twee- of eenlettercode voor respectievelijk Mena of EVL (Fig. 1C,E).

Eerder werd aangetoond dat fosforylering van VASP op S157, maar niet S239 of T278, leidt tot een elektroforetische mobiliteitsverschuiving van 46 naar 50 kDa in SDS PAGE (Butt et al., 1994 Krause et al., 2003 Kwiatkowski et al., 2003 ). We transfecteerden microvasculaire endotheelcellen van VASP-null-muizen (EC_VASP –/– ) met cDNA's die coderen voor fosfomimetische mutanten of wildtype eiwitten en analyseerden de migratie van VASP-varianten door middel van western blotting. Hexahistidine-tag-specifieke antilichamen detecteerden het karakteristieke doublet van S157 gefosforyleerd en niet-gefosforyleerd wildtype VASP (Fig. 1B, baan 1). Fosfomimetische mutanten met een negatieve ladingssubstitutie op positie 157 (DDE, DDA, DAE, DAA Fig. 1B, banen 6-9) migreerden met een hogere schijnbare molecuulmassa (49-50 kDa) vergeleken met mutanten met alanine op deze positie (46 kDa AAA, ADA, AAE, ADE Fig. 1B, banen 2-5). Net als bij de fosforylering van S239 en/of T278 in wildtype VASP (Blume et al., 2007), werd de migratie van VASP-mutanten niet veranderd door de aanwezigheid van zure residuen op de tweede of derde fosforyleringsplaats. Fosforylering van Mena en EVL op hun eerste fosforyleringsplaatsen leidt ook tot een kleine verschuiving in de schijnbare molecuulmassa in SDS-PAGE (Gertler et al., 1996 Lambrechts et al., 2000). Fosfomimetische Mena- en EVL-mutanten met een asparaginezuur op de eerste fosforyleringsplaats (Mena: DD en DA EVL: D), migreerden met een iets hogere schijnbare molecuulmassa dan overeenkomstige mutanten met alanine op deze positie (Mena: AA en AD EVL: A ) (Fig. 1D en F). Expressieniveaus van alle Ena/VASP-mutanten waren grotendeels onafhankelijk van de puntmutaties, zoals aangegeven door signaalintensiteiten in de western blots.

VASP-translocatie naar de celperiferie hangt af van S157-fosforylering. Wildtype endotheelcellen (EC_VASP +/+) werden geïncubeerd met forskoline (5 M) of buffer en geanalyseerd met behulp van antilichamen tegen S157-P–VASP en totaal-VASP. (A) Western-blots van cellysaten genormaliseerd voor GAPDH. (B-G) Immunofluorescentiebeelden van vaste en gepermeabiliseerde cellen. De samenvoeging van totaal-VASP (rood B,E) en S157-P–VASP (groen C,F) wordt gegeven in geel (D,G). Zwarte pijlpunten geven spanningsvezels aan, zwarte pijlen geven focale verklevingen aan en witte pijlpunten geven plasmamembranen aan. Beelden zijn gemaakt met een objectief van 100× en zijn representatief voor een reeks van acht experimenten. Schaalbalk: 15 m. (H) Vergelijking van VASP-, Mena- en EVL-expressie in EC_VASP –/– en EC_VASP +/+ cellen door western blotting. De cellysaten zijn genormaliseerd voor GAPDH.

VASP-translocatie naar de celperiferie hangt af van S157-fosforylering. Wildtype endotheelcellen (EC_VASP +/+) werden geïncubeerd met forskoline (5 M) of buffer en geanalyseerd met behulp van antilichamen tegen S157-P–VASP en totaal-VASP. (A) Western-blots van cellysaten genormaliseerd voor GAPDH. (B-G) Immunofluorescentiebeelden van vaste en gepermeabiliseerde cellen. De samenvoeging van totaal-VASP (rood B,E) en S157-P–VASP (groen C,F) wordt gegeven in geel (D,G). Zwarte pijlpunten geven spanningsvezels aan, zwarte pijlen geven focale verklevingen aan en witte pijlpunten geven plasmamembranen aan. Beelden zijn gemaakt met een objectief van 100× en zijn representatief voor een reeks van acht experimenten. Schaalbalk: 15 m. (H) Vergelijking van VASP-, Mena- en EVL-expressie in EC_VASP –/– en EC_VASP +/+ cellen door western blotting. De cellysaten zijn genormaliseerd voor GAPDH.

VASP-targeting op het endotheliale plasmamembraan en focale adhesies hangt af van S157-fosforylering

Om de impact van S157-fosforylering op de lokalisatie van endogene VASP te analyseren, werden microvasculaire endotheelcellen van VASP-wildtype muizen (EC_VASP +/+ ) behandeld met de PKA-activator forskoline (5 M) of buffercontrole. Forskolin verhoogde de S157-fosforylering, zoals aangegeven door fosfo-S157 (S157-P ook bekend als pS157)-VASP-specifieke antilichamen (Fig. 2A, bovenste paneel S157-P) en anti-VASP-antilichamen (Fig 2A, middelste paneel S157-P–VASP is het bovenste en S157-VASP het onderste signaal van het doublet) bij western blotting. We vergeleken de lokalisatie van totaal-VASP en S157-P-VASP in buffer- (Fig. 2B-D) en met forskolin behandelde EC_VASP +/+ (Fig. 2E-G). In niet-gestimuleerde cellen was totaal-VASP (Fig. 2B) voornamelijk gelokaliseerd in stressvezels (zwarte pijlpunten) en kleine porties van totaal cellulair eiwit verrijkt op onderbroken structuren, die waarschijnlijk focale verklevingen vertegenwoordigen (zwarte pijlen). VASP bij focale adhesies was sterk S157-gefosforyleerd en gemakkelijk gekleurd door fosforylatie-specifieke antilichamen (Fig. 2C, zwarte pijlen). Beide antigenen waren co-gelokaliseerd op deze plaatsen (Fig. 2D). PKA-stimulatie sterk verhoogd S157-P signaalintensiteit en veranderde de subcellulaire VASP-distributie aanzienlijk. Na een forskolinebehandeling van 10 minuten verdween totaal-VASP uit stressvezels (vergelijk totale-VASP-kleuring in gestimuleerde versus niet-gestimuleerde cellen) en gelokaliseerd in focale adhesies (zwarte pijlen) en het plasmamembraan (witte pijlpunten, Fig. 2E). VASP op deze plaatsen was S157-gefosforyleerd (Fig. 2F,G).

Naast S157 kan PKA-activering ook S239 en T278 fosforyleren (Butt et al., 1994) of VASP-lokalisatie via andere routes moduleren. Daarom hebben we de bijdrage van S157-fosforylering aan subcellulaire VASP-targeting bevestigd met een kinase-onafhankelijke benadering. VASP-deficiënte endotheelcellen (EC_VASP –/– ) werden gereconstitueerd met fosfomimetische mutanten. Met uitzondering van VASP-eiwitniveaus, zijn EC_VASP -/- niet te onderscheiden van EC_VASP +/+ en hebben ze vergelijkbare Mena- en EVL-expressie (Fig. 2H).

Om de lokalisatie van fosfomimetische VASP-mutanten in EC_VASP –/– te analyseren, werden cellen tijdelijk getransfecteerd met cDNA's die coderen voor de acht VASP-mutanten AAA (Fig. 3A-C), DAA (Fig. 3D-F), ADA (Fig. 3G-I ), DDA (Fig. 3J-L), AAE (Fig. 3M-O), DAE (Fig. 3P-R), ADE (Fig. 3S-U) en DDE (Fig. 3V-X). 24 uur na transfectie werden de cellen getrypsiniseerd en gedurende 3 uur opnieuw uitgeplaat voordat ze werden gefixeerd. Polyklonale anti-VASP-antilichamen werden gebruikt voor het visualiseren van fosfomimetische mutanten (groen) en fluorescerende phalloidin om te kleuren voor F-actine (rood). Voor een semi-kwantitatieve analyse van pseudofosforylering-gemedieerde VASP-lokalisatie bepaalden twee onafhankelijke onderzoekers de lokalisatie van mutanten aan de voorrand van lamellipodia of de accumulatie bij focale verklevingen. VASP-accumulatie op deze plaatsen werd gescoord als zwak (–), matig (o) of sterk (+) in >40-cellen met mutante expressieniveaus vergelijkbaar met endogene VASP in EC_VASP +/+ (Tabel 1). De VASP-accumulatiescore was consistent met de lengteverhouding van VASP-positieve voorranden ten opzichte van de celomtrek. Mutanten DAA, DDA, DAE en DDE (die op de eerste plaats een negatieve lading delen) waren grotendeels verrijkt aan de voorrand van lamellipodia-achtige structuren in vergelijking met overeenkomstige mutanten met een alanine op deze specifieke positie (vergelijk DAA versus AAA, DDA vs ADA, DAE vs AAE en DDE vs ADE Tabel 1 en Fig. 3, pijlpunten). Een zuur residu op positie S157 accumuleerde ook fosfomimetische mutanten bij focal-adhesie-achtige structuren (vergelijk DAA vs AAA, DDA vs ADA en DAE vs AAE Tabel 1) en verhoogde het aantal en de grootte van focale adhesies.

Subcellulaire lokalisatie van fosfomimetische VASP-mutanten in EC_VASP –/– cellen

VASP-mutant. Lamellipodia. Focale verklevingen.
AAA O
DAA + +
ADA O
DDA + +
AAE O
DAE + +
ADE O
DDE + O
VASP-mutant. Lamellipodia. Focale verklevingen.
AAA O
DAA + +
ADA O
DDA + +
AAE O
DAE + +
ADE O
DDE + O

In EC_VASP –/–-cellen werd subcellulaire lokalisatie van tijdelijk tot expressie gebrachte VASP-mutanten aan de voorrand van lamellipodia en focale adhesies gescoord als zwak (–), matig (o) of sterk (+). 40 cellen elk met mutante expressieniveaus vergelijkbaar met endogene VASP in EC_VASP –/– werden willekeurig geselecteerd en geanalyseerd

Subcellulaire lokalisatie van fosfomimetische VASP-mutanten in EC_VASP –/– cellen. Confocale immunofluorescentiebeelden van EC_VASP –/– tijdelijk getransfecteerd met fosfomimetische VASP-mutanten AAA (AC), DAA (DF), ADA (GI), DDA (JL), AAE (MO), DAE (PR), ADE (SU) en DDE (VX). 24 uur na transfectie werden de cellen getrypsiniseerd en opnieuw uitgeplaat op gegelatineerde kamerslides gedurende 3 uur voor fixatie en kleuring. Gereconstitueerde VASP-mutanten werden immunogelokaliseerd met anti-VASP-antilichamen (groen) en F-actine met fluorescerende phalloidin (rood). Pijlpunten geven de voorrand van lamellipodia aan. Schaalbalk: 15 m.

Subcellulaire lokalisatie van fosfomimetische VASP-mutanten in EC_VASP –/– cellen. Confocale immunofluorescentiebeelden van EC_VASP –/– tijdelijk getransfecteerd met fosfomimetische VASP-mutanten AAA (AC), DAA (DF), ADA (GI), DDA (JL), AAE (MO), DAE (PR), ADE (SU) en DDE (VX). 24 uur na transfectie werden de cellen getrypsiniseerd en opnieuw uitgeplaat op gegelatineerde kamerslides gedurende 3 uur voor fixatie en kleuring. Gereconstitueerde VASP-mutanten werden immunogelokaliseerd met anti-VASP-antilichamen (groen) en F-actine met fluorescerende phalloidin (rood). Pijlpunten geven de voorrand van lamellipodia aan. Schaalbalk: 15 m.

In cellen vormt VASP homotetrameren maar kan ook heterotetrameren vormen met Mena en EVL (Bachmann et al., 1999 Grosse et al., 2003 Kuhnel et al., 2004 Loureiro et al., 2002 Vasioukhin et al., 2000 Zhuang et al., 2000 Zhuang et al. , 2004). Om de mogelijkheid uit te sluiten dat tetramerisatie van getransfecteerde VASP-mutanten met endogene Mena en EVL in EC_VASP –/– (zie expressie van deze familieleden in Fig. 2H) de lokalisatie zou kunnen moduleren, analyseerden we de subcellulaire distributie van VASP-mutanten in MV D7-cellen. MV D7 is een fibroblastische cellijn afgeleid van Mena/VASP dubbelgen-deficiënte muizen, die slechts sporenhoeveelheden EVL tot expressie brengt (Bear et al., 2000). MV D7-cellen werden getransfecteerd met fosfomimetische mutanten, gekleurd voor VASP en actine zoals beschreven voor EC_VASP –/–, en mutante eiwitlokalisatie naar lamellipodia of focale adhesies werd 2 uur na hechting en verspreiding gescoord. Pseudofosforylering van positie 157 verhoogde mutantlokalisatie bij lamellipodia en focale-adhesie-achtige structuren (Tabel 2 en Fig. 4 pijlpunten geven lamellipodia aan), met uitzondering van mutanten AAA en DAA die op dezelfde manier waren verrijkt bij lamellipodia. Lokalisatie van fosfomimetische VASP-mutanten was vergelijkbaar in MV D7 en EC_VASP –/– maar het effect van pseudofosforylering op positie 157 op lamellipodia-targeting was minder uitgesproken in MV D7 dan in EC_VASP –/– (vergelijk bijvoorbeeld ADA en DDA in tabellen 1 en 2 ). In EC_VASP –/– was mutantlokalisatie grotendeels onafhankelijk van de fosforyleringsstatus op de tweede en derde plaats, terwijl pseudofosforylering op deze plaatsen de lamellipodia-verrijking in het verspreiden van MV D7-cellen verbeterde (vergelijk AAA versus DAA en ADE versus DDE in tabellen 1 en 2) , wat suggereert dat celtype- of celtoestand-specifieke fijnafstemming van VASP-lokalisaties zou kunnen bestaan. Samen geven immunolokalisatie van mutant en endogeen VASP aan dat (pseudo) fosforylering van S157 VASP-targeting op lamellipodia en focale adhesies verbetert.

Subcellulaire lokalisatie van fosfomimetische VASP-mutanten in MV D7-cellen

VASP-mutant. Lamellipodia. Focale verklevingen.
AAA O O
DAA O +
ADA O O
DDA + +
AAE O O
DAE + +
ADE
DDE + O
VASP-mutant. Lamellipodia. Focale verklevingen.
AAA O O
DAA O +
ADA O O
DDA + +
AAE O O
DAE + +
ADE
DDE + O

In MV D7-cellen werd subcellulaire lokalisatie van tijdelijk tot expressie gebrachte VASP-mutanten op lamellipodia of focale adhesies gescoord als zwak (–), matig (o) of sterk (+). Per mutant werden 40 willekeurig geselecteerde cellen met vergelijkbare VASP-expressieniveaus geanalyseerd.

Subcellulaire lokalisatie van fosfomimetische VASP-mutanten in MV D7-cellen. Confocale immunofluorescentiebeelden van MV D7-cellen die tijdelijk zijn getransfecteerd met fosfomimetische VASP-mutanten AAA (AC), DAA (DF), ADA (GI), DDA (JL), AAE (MO), DAE (PR), ADE (SU) en DDE (VX). 24 uur na transfectie werden cellen getrypsiniseerd en opnieuw uitgeplaat op met fibronectine beklede kamerglaasjes gedurende 2 uur vóór fixatie en kleuring. VASP-mutanten werden immunogelokaliseerd met anti-VASP-antilichamen (groen) en F-actine met fluorescerende phalloidin (rood). Pijlpunten geven de voorrand van lamellipodia aan. Schaalbalk: 15 m.

Subcellulaire lokalisatie van fosfomimetische VASP-mutanten in MV D7-cellen. Confocale immunofluorescentiebeelden van MV D7-cellen die tijdelijk zijn getransfecteerd met fosfomimetische VASP-mutanten AAA (AC), DAA (DF), ADA (GI), DDA (JL), AAE (MO), DAE (PR), ADE (SU) en DDE (VX). 24 uur na transfectie werden cellen getrypsiniseerd en opnieuw uitgeplaat op met fibronectine beklede kamerglaasjes gedurende 2 uur vóór fixatie en kleuring. VASP-mutanten werden immunogelokaliseerd met anti-VASP-antilichamen (groen) en F-actine met fluorescerende phalloidin (rood). Pijlpunten geven de voorrand van lamellipodia aan. Schaalbalk: 15 m.

VASP-pseudofosforylering op S239 en T278 maar niet op S157 schaadt VASP-gedreven F-actine-accumulatie in vitro

Eerdere studies gaven aan dat fosforylering in vitro interfereert met VASP-gedreven actinepolymerisatie (Barzik et al., 2005 Harbeck et al., 2000). Om alle fosforyleringspatronen systematisch te analyseren op hun impact op de F-actine-assemblage, hebben we de VASP-pseudofosforyleringsmutanten uitgedrukt in Escherichia coli en testte de gezuiverde eiwitten (Fig. 5A, inzet) met behulp van in vitro actine-polymerisatie-assays. VASP initieert actine-polymerisatie niet de novo onder fysiologische zoutomstandigheden, maar in zoutarme omstandigheden kan VASP-interactie met actine worden gebruikt om actine-nucleatie te meten (Barzik et al., 2005 Bear en Gertler, 2009).Monomeer actine (1 M, 10% pyreen-gelabeld) werd gemengd met VASP (of VASP-mutant, elk 0,25 M) en actinepolymerisatie gevolgd door een toename van pyreenfluorescentie (Kouyama en Mihashi, 1981). In afwezigheid van VASP was de actinepolymerisatie traag, zoals aangegeven door een lange lag-fase en vlakke groeifase. Een steady-state niveau van actinepolymerisatie werd niet binnen 9 minuten bereikt (Fig. 5A gele curve, Actine). Toevoeging van wildtype VASP of een van de fosfomimetische VASP-mutanten verhoogde de actine-polymerisatie drastisch, zoals aangegeven door een verminderde lag-fase en steile groeifase. Voor wildtype VASP werden steady-state-niveaus bereikt in minder dan 1 minuut, en de hoeveelheid F-actine na 1 en 9 minuten was respectievelijk 5,5 en twee keer hoger dan in de afwezigheid van VASP (Fig. 5A rode curve , WT). Mutanten AAA en DAA (Fig. 5A groene en magenta curves) verbeterden actinepolymerisatie in dezelfde mate als wildtype VASP, dat niet serine/threonine-gefosforyleerd is in E coli (Blume et al., 2007). Mutanten AAE, ADA, DAE en DDA waren minder effectief in actinepolymerisatie en de hoeveelheid F-actine was na 1 en 9 minuten respectievelijk ongeveer 4,5 en 1,4 keer hoger dan zonder VASP (Fig. 5A bruin, cyaan, lichtgrijs, respectievelijk paarse curven). In overeenstemming met eerdere gegevens (Harbeck et al., 2000), overtrof de remming van actinepolymerisatie verleend door pseudofosforylering op de tweede plaats enigszins de remmende effecten als gevolg van een negatieve lading op de derde plaats (ADA versus AAE en DDA versus DAE). In de test vertoonden VASP-mutanten ADE en DDE de laagste actine-polymerisatiesnelheden en de fluorescentie was 3,5 keer hoger dan zonder VASP na 1 minuut en bijna identiek aan reacties zonder VASP na 9 minuten (Fig. 5A zwarte en grijze curven, respectievelijk) . Samen ondersteunen de resultaten eerdere onderzoeken die de effecten van VASP-fosforylering of pseudofosforylering op F-actine-niveaus in vitro analyseerden (Barzik et al., 2005 Harbeck et al., 2000).

VASP-pseudofosforylering op S239 en T278 maar niet op S157 schaadt VASP-gedreven actinepolymerisatie in vitro en in levende cellen. (A) In vitro actinepolymerisatie aangedreven door fosfomimetische VASP-mutanten. Met pyreen gemerkt G-actine (1 M) werd gemengd met 0,25 M gezuiverd recombinant wildtype (WT) of mutant VASP en de toename in fluorescentie volgde gedurende 9 minuten. De curve met het label 'Actin' geeft een reactie weer zonder VASP. Een representatief experiment van een reeks van vijf wordt getoond. De inzet toont een met Coomassie gekleurde gel van gezuiverd wildtype en mutant VASP. Links wordt een molecuulmassastandaard gegeven 1 en 3 μg BSA per baan dient om de eiwitbelasting te kalibreren. Zure substitutie op positie 157 leidt tot een mobiliteitsverschuiving van de constructen in SDS-PAGE. (B) SRE-test van HEK293-cellen die fosfomimetische VASP-mutanten tot overexpressie brengen. Aan genormaliseerde luciferase-activiteit in cellen die waren getransfecteerd met AAA of lege vector (MOCK) werden waarden van respectievelijk 100% en 0% toegekend. De genormaliseerde luciferase-activiteit van de fosfomimetische mutanten werd gegroepeerd in drie klassen: zwarte, grijze en witte balken die overeenkomen met 0, 1 en 2 negatieve ladingen op respectievelijk de tweede (S239) of derde (T278) fosforyleringsplaats. Staven vertegenwoordigen het gemiddelde ± sd. (N=9 ANOVA, ** P<0.01, *** P<0,001).

VASP-pseudofosforylering op S239 en T278 maar niet op S157 schaadt VASP-gedreven actinepolymerisatie in vitro en in levende cellen. (A) In vitro actinepolymerisatie aangedreven door fosfomimetische VASP-mutanten. Met pyreen gemerkt G-actine (1 M) werd gemengd met 0,25 M gezuiverd recombinant wildtype (WT) of mutant VASP en de toename in fluorescentie volgde gedurende 9 minuten. De curve met het label 'Actin' geeft een reactie weer zonder VASP. Een representatief experiment van een reeks van vijf wordt getoond. De inzet toont een met Coomassie gekleurde gel van gezuiverd wildtype en mutant VASP. Links wordt een molecuulmassastandaard gegeven 1 en 3 μg BSA per baan dient om de eiwitbelasting te kalibreren. Zure substitutie op positie 157 leidt tot een mobiliteitsverschuiving van de constructen in SDS-PAGE. (B) SRE-test van HEK293-cellen die fosfomimetische VASP-mutanten tot overexpressie brengen. Aan genormaliseerde luciferase-activiteit in cellen die waren getransfecteerd met AAA of lege vector (MOCK) werden waarden van respectievelijk 100% en 0% toegekend. De genormaliseerde luciferase-activiteit van de fosfomimetische mutanten werd gegroepeerd in drie klassen: zwarte, grijze en witte balken die overeenkomen met 0, 1 en 2 negatieve ladingen op respectievelijk de tweede (S239) of derde (T278) fosforyleringsplaats. Staven vertegenwoordigen het gemiddelde ± sd. (N=9 ANOVA, ** P<0.01, *** P<0,001).

F-actinebepaling in cellen die fosfomimetische VASP-mutant tot expressie brengen door FACS-analyse. HEK293-cellen werden tijdelijk getransfecteerd met cDNA's die coderen voor de aangegeven VASP-pseudofosforyleringsmutanten of lege vector. F-actine werd gekleurd met Alexa-Fluor-647-phalloidin en gekwantificeerd met behulp van FACS-analyse. (A) Het F-actinegehalte van cellen die zijn getransfecteerd met AAA of lege vector (MOCK) was ingesteld op respectievelijk 100% en 0%. Staven vertegenwoordigen gemiddelde ± sd. (N=6 ANOVA, * P<0.05, *** P<0,001). (B) Vergelijking van F-actine signalen voor ADE- (grijs) versus DDE- (zwart, bovenste histogram) en ADE- (grijs) versus AAA-getransfecteerde (zwart, onderste histogram) HEK293-cellen.

F-actinebepaling in cellen die fosfomimetische VASP-mutant tot expressie brengen door FACS-analyse. HEK293-cellen werden tijdelijk getransfecteerd met cDNA's die coderen voor de aangegeven VASP-pseudofosforyleringsmutanten of lege vector. F-actine werd gekleurd met Alexa-Fluor-647-phalloidin en gekwantificeerd met behulp van FACS-analyse. (A) Het F-actinegehalte van cellen die zijn getransfecteerd met AAA of lege vector (MOCK) was ingesteld op respectievelijk 100% en 0%. Staven vertegenwoordigen gemiddelde ± sd. (N=6 ANOVA, * P<0.05, *** P<0,001). (B) vergelijking van F-actine signalen voor ADE- (grijs) versus DDE- (zwart, bovenste histogram) en ADE- (grijs) versus AAA-getransfecteerde (zwart, onderste histogram) HEK293-cellen.

VASP-pseudofosforylering op posities 239 en 278 reguleert het globale cellulaire F-actine-gehalte

Om het effect van VASP-fosforylatiepatronen op de accumulatie van F-actine in intacte cellen systematisch aan te pakken, hebben we een serumresponsfactor (SRF) transcriptionele reportertest uitgevoerd (Fig. 5B). De test kwantificeert de verhouding van G-actine tot F-actine door stimulatie van SRF. Deze factor bindt aan het serumresponselement (SRE) en verhoogt de SRE-afhankelijke expressie van een luciferasereportergen (Sotiropoulos et al., 1999). Daarom is de gevestigde reportertest een nuttig hulpmiddel voor het kwantificeren van de effecten van actine-bindende eiwitten van de Rho-kinasen (ROCK)-Lim-kinase (LIMK)-cofiline-route en om de filamentassemblage in levende cellen te volgen (Maekawa et al., 1999 Sotiropoulos et al., 1999). Van voorbijgaande VASP-overexpressie is aangetoond dat het F-actine-assemblage en SRE-gedreven luciferase-activiteit induceert (Grosse et al., 2003). We vonden consequent dat de genormaliseerde luciferase-activiteit van HEK293-cellen die VASP-mutanten tot overexpressie brengen, duidelijk verhoogd was ten opzichte van nep-getransfecteerde cellen (controle, ingesteld op 0%). Luciferase-activiteit was maximaal in met AAA getransfecteerde cellen (ingesteld op 100%) en bereikte vergelijkbare waarden in cellen die DAA tot overexpressie brengen (98% Fig. 5B). De activiteit van cellen die DDA, ADA, DAE of AAE tot expressie brengen, was significant lager, variërend van 61 tot 71%. Binnen deze groep was de SRE-activiteit van mutanten met een enkele negatieve lading op positie 239 of 278 niet significant verschillend. Het introduceren van een tweede negatieve lading op de tweede of derde plaats verminderde de vorming van F-actine verder en de SRE-activiteit was minimaal voor de DDE- en ADE-mutanten (respectievelijk 39 en 34%, Fig. 5B). SRE-activiteit aangedreven door wildtype VASP varieerde van 49 tot 81%, waarschijnlijk als gevolg van verschillende niet-gedefinieerde fosforyleringspatronen.

Om de effecten van fosforylering op de F-actine-assemblage te bevestigen, hebben we kwantitatieve fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebruikt (Fig. 6). Het gemiddelde F-actinegehalte van de cellen die VASP-mutanten tot expressie brengen, werd gemeten ten opzichte van schijngetransfecteerde controles (waarde 0%). Het signaal van de F-actine-specifieke kleurstof, Alexa-Fluor-647-geconjugeerd phalloidin, werd genormaliseerd naar het F-actine in HEK293-cellen die de fosforylatieresistente AAA-mutant tot expressie brengen (100%). Overexpressie van mutanten DDA, ADA, DAE of AAE (die een enkele negatieve lading hebben op positie 239 of op 278) verminderde de cellulaire hoeveelheid F-actine tot respectievelijk 60, 63, 61 en 68%, terwijl DAA-expressie een klein effect had op de vorming van actinevezels (97%). Een tweede negatieve lading op posities 239 of 278 verminderde de vorming van F-actine tot 44 en 47% (DDE, ADE Fig. 6A). De F-actinesignalen in cellen die DDE of ADE tot expressie brengen waren bijna identiek (Fig. 6B, bovenste grafiek), maar ze verschilden in cellen die ADE of AAA tot expressie brachten (Fig. 6B, onderste grafiek). Samen met de resultaten van de pyreen-actine- en SRE-assays (Fig. 5A, B), tonen de gegevens aan dat pseudofosforylering op posities 239 of 278 interfereert met VASP-geïnduceerde actinefilamentnucleatie in vitro en F-actine-accumulatie in levende cellen, en dat de remmende effecten additief en maximaal zijn in de 239/278 dubbel gepseudofosforyleerde mutanten.

Pseudofosforylering van Mena S376, maar niet Mena S236 of EVL S160, verlaagt de F-actine-niveaus in vivo

VASP-pseudofosforyleringen op de tweede en derde plaats interfereren met actinefilamentassemblage in levende cellen (Fig. 5B, Fig. 6). Alleen de tweede site is geconserveerd in Mena (S376) en EVL mist equivalenten van beide sites (Krause et al., 2003) (Fig. 1). We onderzochten de functie van Mena-pseudofosforylering voor actine-assemblage met behulp van de SRE-reporter-assay (Fig. 7A). Voorbijgaande transfectie verhoogde slechts licht de hoge endogene Mena-eiwitniveaus in HEK293-cellen en afbraakproducten verschenen in cellen die tot overexpressie werden gebracht (aanvullend materiaal Fig. S1A). Daarom hebben we de SRE-assay vastgesteld in hechtende CHO-S-cellen (Suzuki et al., 2006), die geen detecteerbare endogene Mena hebben en hoge transiënte eiwitexpressieniveaus mogelijk maken (aanvullend materiaal Fig. S1B). Genormaliseerde luciferase-activiteit van CHO-S-cellen die mutant Mena tot overexpressie brachten, was duidelijk verhoogd ten opzichte van nep-getransfecteerde cellen (controle, ingesteld op 0%). Luciferase-activiteit was maximaal in mutante AA-getransfecteerde cellen (ingesteld op 100%) en bereikte vergelijkbare waarden in cellen die de DA-variant tot overexpressie brengen (96% Fig. 7A). De activiteit van cellen die mutanten AD en DD tot expressie brengen, die een negatieve lading hebben op positie 376, was significant lager en bereikte respectievelijk 39 en 38%. Luciferase-activiteit geïnduceerd door EVL A-mutant (ingesteld op 100%) in HEK293-cellen overschreed duidelijk de niveaus van schijngetransfecteerde cellen (controle, ingesteld op 0%) en was bijna identiek aan de EVL D-variant (99% Fig. 7B).

S157-fosforylering heeft geen invloed op het globale cellulaire F-actinegehalte

De eerdere bevindingen in deze studie suggereren dat de pseudofosforyleringsstatus van S157 belangrijk is voor VASP-lokalisatie in verspreidende cellen, maar geen invloed heeft op het algehele F-actine-gehalte. Daarentegen remt pseudofosforylering op posities 239 of 278 de VASP-afhankelijke F-actine-accumulatie, maar heeft een kleine invloed op subcellulaire targeting. Om dit te testen op kinase-gemedieerde VASP-fosforylering, gebruikten we gedeeltelijk gestopte mutanten SAA, ASA en AAT (Fig. 8A). De mutanten beperken fosforylering tot respectievelijk de eerste, tweede of derde plaats, terwijl de andere plaatsen geblokkeerd zijn voor fosforylering. Met behulp van niet-gestimuleerde gereconstitueerde EC_VASP -/--cellen migreerde mutant SAA maar niet ASA of AAT als een doublet in SDS-PAGE, wat aangeeft dat S157-fosforylering is geblokkeerd in ASA en AAT maar gedeeltelijk gefosforyleerd in SAA (Fig. 8B). Om de gevolgen van PKA-gemedieerde S157-fosforylering op F-actine-assemblage te onderzoeken, hebben we de op SRE gebaseerde reportertest gebruikt (Fig. 8C). Overexpressie van SAA-geïnduceerde F-actine-assemblage in niet-gestimuleerde HEK293-cellen (102%), vergelijkbaar met het niveau waargenomen in met AAA-getransfecteerde cellen. Daarentegen verminderde overexpressie van ADE het signaal tot 33% (positieve controle). Behandeling van SAA-getransfecteerde cellen met forskoline (5 M) verhoogde de S157-fosforylering grotendeels, die bijna niet detecteerbaar was in niet-gestimuleerde cellen, zoals aangetoond door S157-P-specifieke antilichamen (Fig. 8D, bovenste paneel). De relatieve signaalintensiteiten van het SAA-doublet gaven aan dat meer dan 75% van het totale SAA-eiwit was gefosforyleerd op S157 (Fig. 8D, onderste paneel, anti-VASP). De luciferase-activiteit werd echter niet significant veranderd door PKA-stimulatie gedurende maximaal 80 minuten (99-107% versus 102%, n.s. Fig. 8C), wat consistent was met cellen die DAA tot expressie brengen (98%). Hogere forskolineconcentraties of alternatieve PKA-activators, zoals 8-Br-cAMP, hadden geen invloed op SRE-signalen (niet getoond). Samen suggereren deze resultaten sterk dat PKA-gemedieerde VASP S157-fosforylering geen invloed heeft op het globale F-actinegehalte in cellen.

Effect van Mena- en EVL-pseudofosforyleringen voor actine-assemblage in cellen. (A) SRE-test van CHO-S-cellen die fosfomimetische Mena-mutanten tot overexpressie brengen. Aan genormaliseerde luciferase-activiteit in cellen die waren getransfecteerd met AA of lege vector (MOCK) werden waarden van respectievelijk 100% en 0% toegekend. Gemiddelde waarden ± sd. zijn gegeven (N=13 ANOVA, *** P<0,001). (B) SRE-assay van HEK293-cellen getransfecteerd met EVL-mutanten D en A. Genormaliseerde luciferase-activiteit in cellen getransfecteerd met A of lege vector werden waarden van respectievelijk 100% en 0% toegekend. Gemiddelde ± sd (N=8 ANOVA, P>0.05 D versus A).

Effect van Mena- en EVL-pseudofosforyleringen voor actine-assemblage in cellen. (A) SRE-test van CHO-S-cellen die fosfomimetische Mena-mutanten tot overexpressie brengen. Aan genormaliseerde luciferase-activiteit in cellen die waren getransfecteerd met AA of lege vector (MOCK) werden waarden van respectievelijk 100% en 0% toegekend. Gemiddelde waarden ± sd. zijn gegeven (N=13 ANOVA, *** P<0,001). (B) SRE-assay van HEK293-cellen getransfecteerd met EVL-mutanten D en A. Genormaliseerde luciferase-activiteit in cellen getransfecteerd met A of lege vector werden waarden van respectievelijk 100% en 0% toegekend. Gemiddelde ± sd (N=8 ANOVA, P>0.05 D versus A).

Fosforylering op S239 en T278 schaadt de cellulaire accumulatie van F-actine in vivo

Vervolgens analyseerden we de effecten van PKG-gemedieerde VASP-fosforylering met behulp van SRE-assays in HEK293-cellen (Fig. 8E,F). In de afwezigheid van getransfecteerd PKG, diende de luciferase-activiteit van cellen die ADA en ADE tot expressie brengen als respectievelijk een referentiewaarde en interne controle (69 en 35% ten opzichte van de SRE-signalen van cellen die AAA tot expressie brengen, ingesteld op 100%). Mutant ASA, met fosforylering beperkt tot positie 239, werd gecotransfecteerd met plasmiden die coderen voor wildtype (PKGwt) of een katalytisch inactieve vorm (PKGCI) van PKG. Kinase-activiteit werd afgeschaft in PKGCI door een A405K-substitutie (Smolenski et al., 2000). Western-blotting met S239-P-specifieke antilichamen onthulden dat co-expressie van PKGwt verhoogde ASA-fosforylering op een dosisafhankelijke manier gepaard gaand met een significante afname van luciferase-activiteit tot 61%, vergeleken met ASA zonder PKG (101%). Daarentegen co-expressie van PKGCI en ASA verhoogde SRE-signalen enigszins, maar niet significant (103 en 110% van AAA Fig. 8E) in getransfecteerde cellen. Om de functie van AMPK-gemedieerde fosforylering op residu T278 in F-actine-vorming aan te pakken, brachten we mutant AAT tot co-expressie met ofwel een constitutief actieve (AMPKCAα) of een dominant negatief (AMPKDNα) vorm van de AMPK α1-subeenheid (Fig. 8G,H). In overeenstemming met basaal fosfo-T278 (T278-P ook bekend als pT278)-VASP-niveaus in endotheelcellen (Blume et al., 2007), T278-P-specifieke anti-VASP-antilichamen detecteerden T278-gefosforyleerde AAT-mutanten in de afwezigheid van getransfecteerd AMPK (Fig. 8H, bovenste paneel, baan 1). De luciferase-activiteit in deze cellen was iets lager dan in AAA-controles (92 versus 100%). De co-expressie van toenemende hoeveelheden AMPKCAα met AAT verhoogde T278-P-niveaus en verminderde SRE-signalen tot 61% op een dosisafhankelijke manier, wat vergelijkbaar was met de verlaging die werd waargenomen in cellen die AAE tot expressie brengen (62%, vergelijkende waarde). Een reductie van T278-P niveaus door AMPKDNα expressie verhoogde SRE-signalen tot 133% op een dosisafhankelijke manier. De gegevens komen overeen met de verkregen resultaten

met de fosfomimetische mutanten en toont aan dat fosforylering op S239 en T278 de globale F-actine-assemblage in cellen verstoort.

Fosforylering op S239 en T278 maar niet op S157 schaadt VASP-gedreven actinepolymerisatie in levende cellen. (A) Schematische weergave van gedeeltelijk gearresteerde VASP-mutanten. Om gedefinieerde VASP-fosforylatiepatronen te analyseren, hebben we twee van de drie fosforyleringsplaatsen vervangen door alanineresiduen, waarbij we er één hebben behouden om kinase-gemedieerde fosforylering specifiek op dit residu mogelijk te maken. Zwarte en open vakjes geven respectievelijk alanine en een toegankelijke fosforyleringsplaats aan. Witte 'T' geeft de tag aan. (B) Western-blot met anti-VASP-antilichamen om de expressie van mutanten SAA, ASA of AAT in getransfecteerde EC_VASP –/–-cellen te bevestigen. (C-D) PKA-gemedieerde fosforylering van S157-VASP heeft geen invloed op het globale cellulaire F-actinegehalte. Getransfecteerde HEK293-cellen werden gedurende 5, 20, 40 en 80 minuten geïncubeerd met forskoline (FSK, 5 μM). (C) SRE-test. De luciferase-activiteiten in cellen die waren getransfecteerd met AAA of lege vector (MOCK) werden respectievelijk ingesteld op 100% en 0%. Ter vergelijking wordt de luciferase-activiteit van niet-gestimuleerde cellen die DAA tot expressie brengen gegeven (stippellijn, N=6 ANOVA, P>0.05 gestimuleerde versus niet-gestimuleerde SAA-getransfecteerde cellen). De transfectie met ADE, die de door VASP aangestuurde actine-assemblage maximaal blokkeerde (Fig. 5B), diende als een positieve controle. (D) De expressie van VASP-mutanten en fosforylering van SAA op S157 werd bevestigd door immunoblotting met behulp van antilichamen tegen S157-P (bovenste paneel) en totaal-VASP (onderste paneel). (EF) PKG-gemedieerde VASP-fosforylering op S239 vermindert de globale actine-polymerisatie. HEK239-cellen werden gecotransfecteerd met VASP-mutant ASA en de aangegeven hoeveelheden PKGwt of PKGCI. (E) Ter vergelijking: het signaal van niet-gestimuleerde cellen die ADA tot expressie brengen, wordt gegeven (stippellijn). Genormaliseerde luciferase-activiteiten worden uitgezet ten opzichte van de activiteit in cellen die zijn getransfecteerd met AAA of lege vector (MOCK) (ingesteld op respectievelijk 100% en 0% N=8 ANOVA, * P<0.05, *** P<0,001). ADE diende als een positieve controle. (F) Anti-S239-P antilichamen wezen op de fosforylering van S239-ASA (bovenste paneel) in western blots. De expressie van VASP-mutanten in getransfecteerde cellen werd bevestigd door immunoblotting met anti-VASP-antilichamen (middelste paneel). De expressie van PKG-varianten werd onderzocht met behulp van antilichamen tegen PKG (onderste paneel). (GH) AMPK-gemedieerde fosforylering van VASP op T278 interfereert met F-actine-assemblage. HEK239-cellen werden tijdelijk gecotransfecteerd met VASP-AAT en AMPKCAα of AMPKDNα. (G) Ter vergelijking wordt de activiteit van AAE-getransfecteerde cellen aangegeven (stippellijn). Genormaliseerde luciferase-activiteiten worden uitgezet ten opzichte van de activiteit in cellen die zijn getransfecteerd met AAA of lege vector (MOCK) (respectievelijk ingesteld op 100% en 0% N=8 ANOVA, * P<0,05). ADE diende als een positieve controle. (H) Western-blots met anti-T278-P (bovenste paneel) en anti-VASP-antilichamen (tweede paneel) bevestigden respectievelijk T278-fosforylering en AAT-expressie. AMPK-varianten werden onderzocht door myc-tag-specifieke antilichamen (onderste panelen).

Fosforylering op S239 en T278 maar niet op S157 schaadt VASP-gedreven actinepolymerisatie in levende cellen. (A) Schematische weergave van gedeeltelijk gearresteerde VASP-mutanten. Om gedefinieerde VASP-fosforylatiepatronen te analyseren, hebben we twee van de drie fosforyleringsplaatsen vervangen door alanineresiduen, waarbij we er één hebben behouden om kinase-gemedieerde fosforylering specifiek op dit residu mogelijk te maken. Zwarte en open vakjes geven respectievelijk alanine en een toegankelijke fosforyleringsplaats aan. Witte 'T' geeft de tag aan. (B) Western-blot met anti-VASP-antilichamen om de expressie van mutanten SAA, ASA of AAT in getransfecteerde EC_VASP –/–-cellen te bevestigen. (C-D) PKA-gemedieerde fosforylering van S157-VASP heeft geen invloed op het globale cellulaire F-actinegehalte. Getransfecteerde HEK293-cellen werden gedurende 5, 20, 40 en 80 minuten geïncubeerd met forskoline (FSK, 5 μM). (C) SRE-test. De luciferase-activiteiten in cellen die waren getransfecteerd met AAA of lege vector (MOCK) werden respectievelijk ingesteld op 100% en 0%. Ter vergelijking wordt de luciferase-activiteit van niet-gestimuleerde cellen die DAA tot expressie brengen gegeven (stippellijn, N=6 ANOVA, P>0.05 gestimuleerde versus niet-gestimuleerde SAA-getransfecteerde cellen). De transfectie met ADE, die de door VASP aangestuurde actine-assemblage maximaal blokkeerde (Fig. 5B), diende als een positieve controle. (D) De expressie van VASP-mutanten en fosforylering van SAA op S157 werd bevestigd door immunoblotting met behulp van antilichamen tegen S157-P (bovenste paneel) en totaal-VASP (onderste paneel). (EF) PKG-gemedieerde VASP-fosforylering op S239 vermindert de globale actine-polymerisatie. HEK239-cellen werden gecotransfecteerd met VASP-mutant ASA en de aangegeven hoeveelheden PKGwt of PKGCI. (E) Ter vergelijking: het signaal van niet-gestimuleerde cellen die ADA tot expressie brengen, wordt gegeven (stippellijn). Genormaliseerde luciferase-activiteiten worden uitgezet ten opzichte van de activiteit in cellen die zijn getransfecteerd met AAA of lege vector (MOCK) (respectievelijk ingesteld op 100% en 0% N=8 ANOVA, * P<0.05, *** P<0,001). ADE diende als een positieve controle. (F) Anti-S239-P antilichamen wezen op de fosforylering van S239-ASA (bovenste paneel) in western blots. De expressie van VASP-mutanten in getransfecteerde cellen werd bevestigd door immunoblotting met anti-VASP-antilichamen (middelste paneel). De expressie van PKG-varianten werd onderzocht met behulp van antilichamen tegen PKG (onderste paneel). (GH) AMPK-gemedieerde fosforylering van VASP op T278 interfereert met F-actine-assemblage. HEK239-cellen werden tijdelijk gecotransfecteerd met VASP-AAT en AMPKCAα of AMPKDNα. (G) Ter vergelijking wordt de activiteit van AAE-getransfecteerde cellen aangegeven (stippellijn). Genormaliseerde luciferase-activiteiten worden uitgezet ten opzichte van de activiteit in cellen die zijn getransfecteerd met AAA of lege vector (MOCK) (respectievelijk ingesteld op 100% en 0% N=8 ANOVA, * P<0,05). ADE diende als een positieve controle. (H) Western-blots met anti-T278-P (bovenste paneel) en anti-VASP-antilichamen (tweede paneel) bevestigden respectievelijk T278-fosforylering en AAT-expressie. AMPK-varianten werden onderzocht door myc-tag-specifieke antilichamen (onderste panelen).


Eiwitkinase A-gemedieerde fosforylering van de Broad-Complex transcriptiefactor in zijderups onderdrukt de transcriptionele activiteit ervan

De insectspecifieke transcriptiefactor Broad-Complex (BR-C) wordt transcriptioneel geactiveerd door de steroïde 20-hydroxyecdyson (20E) en reguleert de expressie van veel doelwitgenen die betrokken zijn bij de groei en ontwikkeling van insecten. Hoewel de transcriptionele regulatie van BR-C-eiwitten goed is bestudeerd, is echter slecht begrepen hoe BR-C wordt gereguleerd op post-transcriptie- en -translatieniveaus. Hiertoe hebben we met behulp van vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie-analyse residu Ser-186 geïdentificeerd als een fosforyleringsplaats van BR-C in zijderups. Plaatsgerichte mutagenese en behandeling met specifieke kinase-activatoren en -remmers gaven aan dat het Ser-186-residu in BR-C van zijderups wordt gefosforyleerd door proteïnekinase A (PKA). Immunokleuringstesten onthulden dat PKA-gemedieerde fosforylering van zijderups BR-C geen effect heeft op de nucleaire import ervan. Luciferase-reporteranalyse, elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassays en chromatine-immunoprecipitatie onthulden echter dat de PKA-fosforylering de transcriptionele activering van BR-C-doelgenen van zijderups onderdrukt en dat deze remming werd veroorzaakt door onderdrukking van BR-C-binding aan zijn DNA-doelen. Let op, beide in vitro en ex vivo experimenten onthulden dat een continu 20E-signaal de PKA-gemedieerde BR-C-fosforylering en ook de cAMP/PKA-route remt, wat aangeeft dat het remmende effect van 20E op PKA-gemedieerde fosforylering van BR-C van zijderupsen bijdraagt ​​aan het in stand houden van BR-C-transcriptieactiviteit. Concluderend geven onze bevindingen aan dat PKA-gemedieerde fosforylering de BR-C-activiteit van zijderups remt door de binding aan DNA te verstoren en dat 20E-signalering de PKA-gemedieerde fosforylering van BR-C verlicht, waardoor de transcriptionele activiteit behouden blijft.

trefwoorden: 20-hydroxyecdyson Breed-complex gentranscriptie fosforylatie post-translationele modificatie (PTM) proteïne kinase A (PKA) signaaltransductie onderdrukking.

© 2017 door The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

Belangenconflict verklaring

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben met de inhoud van dit artikel


Bekijk de video: How to analyse western blotting gel image using ImageJ (Januari- 2022).