Informatie

Hoe worden primaire monoklonale antilichamen voor het screenen van mutante cellen fysiek gemaakt?


Ik werk met een vrij algemeen eiwit dat tot expressie wordt gebracht in een groot aantal organismen, laten we zeggen een keratine-geassocieerd bèta-eiwit. Ik probeer een proces te ontwikkelen dat primaire-secundaire antilichaamscreening vereist voor het keratine-geassocieerde bèta-eiwit. Het probleem is dat het duur is. Heel erg.

Ik kan het antilichaam niet vinden voor minder dan $ 778 / ml, en nadat ik rekening heb gehouden met de verdunning en het volume dat nodig is voor het aanbevolen protocol, kan ik me niet voorstellen dat ik het ontwerp van het proces met minder dan 20 ml zal kunnen voltooien. Het eiwit kan niet veranderen als een ontwerpbeperking, dus er is geen reden waarom ik ooit mijn antilichaam zou moeten veranderen, maar als ik zoveel nodig heb... is er een manier om het zelf te maken?

Hoe worden deze antilichamen eigenlijk vervaardigd? Moet ik echte B-cellen in handen krijgen en die gebruiken, of kan ik de cellulaire machinerie die de antilichamen produceert, isoleren en die gebruiken?


Monoklonale antilichamen worden typisch vervaardigd uit een hybridomacellijn. Als je hybridoma's kunt krijgen die al voor je antilichaam zijn gemaakt (niet erg waarschijnlijk), of een ander antilichaam tegen je eiwit, dan is het vrij eenvoudig om het antilichaam zelf te produceren. De hybridoma's scheiden de antilichamen af ​​in de media, dus nadat je een aantal cellen hebt gekweekt, kun je het antilichaam uit de media zuiveren met een proteïne G-kolom.

Er zijn echter niet veel hybridomacellijnen beschikbaar. Het is een langdurig en duur proces om het zelf te maken (enkele maanden en duizenden dollars), zelfs met de hulp van een kernfaciliteit/bedrijf. Je zou de faciliteit enkele milligrammen van je eiwit geven, ze zouden het gebruiken om muizen te immuniseren, en na 1-3 screeningsrondes zou je hybridoma-klonen kunnen krijgen.

Er zijn enkele banken met hybridoma's beschikbaar voor onderzoek, bijvoorbeeld:

http://dshb.biology.uiowa.edu/

http://www.cellbankaustralia.com/ecacc-hybridoma/


Auranofin onthult therapeutisch antikankerpotentieel door verschillende moleculaire celdoodmechanismen en aangeboren immuniteit te activeren bij gemuteerde p53 niet-kleincellige longkanker

Auranofin (AF) is een door de FDA goedgekeurd antireumatisch geneesmiddel met eigenschappen tegen kanker dat werkt als een thioredoxine-reductase 1 (TrxR) -remmer. De exacte mechanismen waarmee AF ​​kankercellen target, blijven ongrijpbaar. Om licht te werpen op het werkingsmechanisme, biedt deze studie een diepgaande analyse van de moleculaire mechanismen en immunogeniciteit van AF-gemedieerde cytotoxiciteit in de niet-kleincellige longkanker (NSCLC) cellijn NCI-H1299 (p53 Null) en zijn twee isogene derivaten met ophoping van mutant p53 R175H of R273H.

TrxR komt in hoge mate tot expressie in een panel van 72 NSCLC-patiënten, waardoor het een geldig medicamenteus doelwit is in NSCLC voor AF. De aanwezigheid van mutante p53-overexpressie werd geïdentificeerd als een belangrijke sensibilisator voor AF in (isogene) NSCLC-cellen omdat het gecorreleerd was met verlaagde thioredoxine (Trx) niveaus in vitro. Transcriptoomanalyse onthulde ontregeling van genen die betrokken zijn bij oxidatieve stressrespons, DNA-schade, granzyme A (GZMA) -signalering en ferroptosis. Hoewel functioneel AF een krachtige remmer van GPX4 leek in alle NCI-H1299-cellijnen, was de inductie van lipideperoxidatie en bijgevolg ferroptose beperkt tot de p53 R273H tot expressie brengende cellen. In de p53 R175H-cellen induceerde AF voornamelijk grootschalige DNA-schade en replicatiestress, wat leidde tot de inductie van apoptotische celdood in plaats van ferroptose. Belangrijk is dat alle celdoodtypes immunogeen waren aangezien de afgifte van gevaarsignalen (ecto-calreticulin, ATP en HMGB1) en dendritische celrijping plaatsvond ongeacht (mutante) p53-expressie. Ten slotte laten we zien dat AF kankercellen sensibiliseerde voor caspase-onafhankelijke door natuurlijke killercellen gemedieerde doding door downregulatie van verschillende belangrijke doelen van GZMA.

Onze gegevens bieden nieuwe inzichten over AF als een krachtig, klinisch beschikbaar, niet-gepatenteerd kankermedicijn door zich te richten op mutante p53-kankercellen via verschillende celdoodmechanismen (apoptose en ferroptose). Bovendien verbetert AF de aangeboren immuunrespons bij zowel cytostatische (natural killer cel-gemedieerde doding) als cytotoxische concentraties (dendritische celrijping).


Hoe worden primaire monoklonale antilichamen voor het screenen van mutante cellen fysiek gemaakt? - Biologie

Spectrines zijn alomtegenwoordige steigercomponenten van het membraanskelet die microdomeinen organiseren en stabiliseren op zowel het plasmamembraan als de intracellulaire organellen. Door hun talrijke interacties met diverse eiwitfamilies zijn ze betrokken bij verschillende cellulaire functies. Met behulp van een kleine interfererende RNA-strategie in de WM-266-cellijn afgeleid van humaan melanoom, ontdekten we dat αII-spectrinedeficiëntie geassocieerd is met een defect in celproliferatie, dat gerelateerd is aan een stopzetting van de celcyclus op de G1 fase (eerste gap-fase), zoals geëvalueerd door DNA-analyse en Rb-fosforylering. Deze waarnemingen vielen samen met verhoogde expressie van de cycline-afhankelijke kinaseremmer, p21Cip. Tegelijkertijd verminderde spectrineverlies de celadhesie en -verspreiding. Deze celadhesiedefecten waren geassocieerd met modificaties van het actine-cytoskelet, zoals verlies van stressvezels, veranderingen van focale adhesies en gewijzigde expressie van sommige integrines. Onze resultaten bieden nieuwe inzichten in spectrinefuncties door de betrokkenheid van αII-spectrine bij celcyclusregulatie en actine-organisatie aan te tonen.


Detectie en visuele lokalisatie van individuele cellulaire eiwitten met behulp van een Proximity Ligation Assay


Auteur: Paul Held Ph.D., laboratoriummanager, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT

De complexiteit van het proteoom creëert een behoefte aan preciezere en nauwkeurigere manieren om doelen te detecteren. Proximity ligation assays (PLA) combineren de specificiteit van op antilichamen gebaseerde detectie met een signaalversterking die de visualisatie van componenten door middel van fluorescentiemicroscopie mogelijk maakt. Hier beschrijven we het gebruik van de Cytation&trade 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader, een goedkope, hoogwaardige combinatie van celbeeldsensor en microplaatlezer, voor het snel afbeelden en analyseren van weefselkweekcellen die zijn gekleurd met Duolink®-sondes in microplaten.

Invoering

Met het in kaart brengen van het menselijke proteoom wordt het begrip van eiwitinteracties en lokalisatie in zoogdiercellen steeds complexer. De complexiteit van het proteoom en het begrip van zijn innerlijke werking creëren een behoefte aan preciezere en nauwkeurigere manieren om doelen te detecteren. Naast algemene detectie en lokalisatie van een eiwit, is het noodzakelijk om zijn interactiepartners, posttranslationele modificaties of zijn rol in eiwitcomplexen te onderzoeken om de volledige functionele rol van een bepaald eiwit te begrijpen.

Figuur 1. Specificiteit van Duolink ®-kleuring. MDA-MB-175-cellen uitgeplaat in microplaten met 96 putjes en een nacht gekweekt (A) Controleputjes waar 1° antilichaam was weggelaten en (B) primair muis-anti-TK1-monoklonaal antilichaam werd toegevoegd voorafgaand aan de daaropvolgende verwerking. Cellen voor beide figuren werden behandeld met Duolink® anti-muis PLUS en MINUS secundaire antilichamen en het signaal werd geamplificeerd met het Red Detection System. Cellen werden tegengekleurd met de DAPI en AlexaFluor 488-phalloidin. Beelden zijn gemaakt met een 60x objectief.

Proximity ligation assay (PLA) is een technologie die de mogelijkheden van traditionele immunoassays uitbreidt met directe detectie van eiwitten, eiwitinteracties en modificaties met een hoge specificiteit en gevoeligheid. Eiwitdoelen kunnen worden gedetecteerd en gelokaliseerd met een resolutie van één molecuul en gekwantificeerd in ongewijzigde cellen en weefsels. De Duolink® In Situ reagentia zijn gebaseerd op in situ PLA®. Twee primaire antilichamen die in verschillende soorten zijn opgewekt, herkennen het doelantigeen of de antigenen van belang. Soortspecifieke secundaire antilichamen, PLA-probes genaamd, elk met een unieke korte DNA-streng (PLUS en MIN) eraan vastgemaakt, binden aan de primaire antilichamen. Wanneer de PLA-probes zich dicht bij elkaar bevinden (<40 nm), kunnen de DNA-strengen interageren door een daaropvolgende toevoeging van twee andere cirkelvormende DNA-oligonucleotiden. Na het samenvoegen van de twee toegevoegde oligonucleotiden door enzymatische ligatie, worden ze geamplificeerd via rollende cirkelamplificatie met behulp van een polymerase. Nadat de amplificatiereactie (ongeveer 700x) van de DNA-cirkel heeft plaatsgevonden, verlichten gelabelde complementaire oligonucleotideprobes het gerepliceerde product. Dit resulteert in een hoge fluorescentieconcentratie in elk amplificatieproduct met één molecuul dat zichtbaar is als een duidelijke heldere stip wanneer bekeken met een fluorescentiemicroscoop (Figuur 2).

Figuur 2. Duolink®-technologie. De Duolink® In Situ reagentia zijn gebaseerd op in situ PLA®.

Materialen en methodes

Cel cultuur

MDA-MD-175 en U-2 OS-cellen werden gekweekt in Advanced DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en penicilline-streptomycine bij 37°C in 5% CO2. Kweken werden routinematig getrypsiniseerd (0,05% trypsine-EDTA) bij 80% confluentie. Voor experimenten werden cellen uitgeplaat in Corning 3904 zwartzijdige, heldere bodem 96-putjes microplaten met 2500 tot 10.000 cellen per putje, afhankelijk van het experiment.

Primaire antilichamen in combinatie met de Duolink® secundaire PLA-geconjugeerde antilichamen en het Red Duolink-detectiesysteem werden gebruikt om specifieke cellulaire doelen te detecteren. Muis anti-TK-1 monoklonaal antilichaam (cat. # WH0007083M2) werd gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), terwijl muis anti-elF4E monoklonaal antilichaam (cat. #ab171091) en konijn anti-elF4E (phospho S209) monoklonaal antilichaam (cat. # ab76256) werden verkregen van Abcamé (Cambridge, MA). Duolink anti-muis PLUS (cat.# DUO92001), anti-muis MINUS (cat. DUO92004), anti- Rabbit MINUS (cat.# DUO92005) secundaire antilichamen en de rode detectiereagentia (cat.# DUO92008), werden verkregen van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Experimenten werden afgebeeld met behulp van een Cytation & trade 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek Instruments, Winooski, VT) geconfigureerd met DAPI-, GFP- en Texas Red-lichtkubussen. De imager gebruikt een combinatie van LED-lichtbronnen in combinatie met banddoorlaatfilters en dichroïsche spiegels om licht met een geschikte golflengte te leveren. De DAPI-lichtkubussen gebruiken een 337/50-excitatiefilter en een 447/60-emissiefilter, de GFP-lichtkubus gebruikt een 469/35-excitatiefilter en een 525/39-emissiefilter, terwijl de Texas Red-lichtkubus een 585/29-excitatie- en 624/40 emissiefilters.

Foto analyse

Meerdere tegels van driekleurige overlay-afbeeldingen werden digitaal genaaid met behulp van Gen5&trade-software. Typisch werden monsters afgebeeld door een montage van afbeeldingen vast te leggen en een gestikt composietbeeld met een breder gezichtsveld te creëren. Objectceltelling van het DAPI-kanaal werd gebruikt om celkernen te identificeren. Subpopulatieanalyse werd gebruikt om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het Texas Red-kanaal te bepalen als een middel om TK-1-positieve cellen te beoordelen.

Resultaten

Het effect van de primaire antilichaamconcentratie op het PLA-signaal werd getest. Gefixeerde MDA-MB-175-cellen werden behandeld met verschillende concentraties muis-antithymidinekinase primair antilichaam en vervolgens behandeld met Duolink® anti-muis PLUS en MINUS secundaire antilichamen. Onder deze omstandigheden worden toenemende percentages cellen positief voor de aanwezigheid van het TK-signaal met toenemend primair antilichaam totdat verzadiging is bereikt. Zoals te zien is in figuur 3, neemt het percentage TK-positieve cellen toe met antilichaamconcentraties tot 10 &mug/ml. Bij deze concentratie zijn de enzymepitopen verzadigd en elke verdere verhoging van de antilichaamconcentratie resulteert niet in meer positieve cellen.

Figuur 3. Effect van primaire antilichaamconcentratie op Duolink & reg-signaal. MDA-MB-175-cellen werden gezaaid in microplaten met 96 putjes en overnacht gekweekt bij 37 ° C, in een bevochtigde 5% CO2 omgeving. Cellen werden vervolgens gefixeerd met 4% paraformaldehyde en getest met behulp van een muis anti-Thymidine kinase monoklonaal antilichaam met Duolink® rode detectietechnologie. Drie kleurenmontages (40x) werden verkregen door meerdere overlappende afbeeldingen aan elkaar te naaien. Beeldanalyse identificeerde het aantal cellen met behulp van objecttelling van DAPI-gekleurde celkernen. Subpopulatieanalyse van kernen die een drempel (11.000) overschrijden voor gemiddelde RFP-fluorescentie identificeerde TK-positieve cellen. De gegevens werden uitgedrukt als een percentage van het totaal. Gegevenspunten vertegenwoordigen het gemiddelde van 4 bepalingen bij elke serumconcentratie.

Met behulp van verzadigende niveaus van primair antilichaam werd het effect van serumconcentratie op thymidinekinase-eiwitniveaus in U-2 OS-cellen onderzocht. Cellen werden gezaaid en men liet ze 16 uur hechten in 10% serum. Cellen werden vervolgens overgeschakeld naar media die verschillende serumconcentraties bevatten variërend van 0,1% tot 10%. Zoals getoond in Figuur 4, resulteren toenemende hoeveelheden serum in een afname van het percentage cellen waarvan wordt waargenomen dat ze positief zijn voor thymidinekinase. Ongeveer 60% van de kernen in cellen die zijn behandeld met laag (0,1%) serum is positief voor TK, terwijl minder dan 5% van de cellen in 10% serum positief is.

Figuur 4. Effect van serumstimulatie op thymidinekinase-eiwitniveaus. U-2OS-cellen werden gedurende 24 uur in serum uitgehongerd, waarna verschillende concentraties serum werden toegevoegd. Cellen werden vervolgens gefixeerd met 4% paraformaldehyde en getest met behulp van Duolink®-technologie met behulp van een anti-thymidinekinase-antilichaam. Beeldanalyse identificeerde het aantal cellen met behulp van objecttelling van DAPI-gekleurde celkernen. Subpopulatieanalyse van kernen die een drempel (20.000) overschrijden voor gemiddelde RFP-fluorescentie identificeerde TK-positieve cellen. De gegevens werden uitgedrukt als een percentage van het totaal. Gegevenspunten vertegenwoordigen het gemiddelde van 4 bepalingen bij elke serumconcentratie.

Cellulaire lokalisatie als gevolg van post-translationele modificatie van eiwitten kan worden onderscheiden met Duolink®-technologie. Eukaryote translatiefactor 4E (elF4E) is een translatiefactor die betrokken is bij het sturen van ribosomen naar de cap-structuur van mRNA's en wordt beschouwd als de snelheidsbeperkende determinant van eiwitsynthese [3]. Het eiwit is gefosforyleerd op positie 209 en het is de gefosforyleerde versie die als actief wordt beschouwd [4]. Figuur 5 toont verschillen in de lokalisatie van de elF4E van fosf-elF4E. Wanneer U-2 OS-cellen worden gesondeerd met een primair monoklonaal muisantilichaam tegen elF4E, dat alle elF4E detecteert, wordt het eiwit gevonden verspreid over het cytoplasma, wanneer het wordt gereageerd met anti-muis PLUS en anti-muis MINUS Duolink secundaire antilichamen. Wanneer dezelfde cellen echter worden onderzocht met zowel een primair anti-elF4E-antilichaam als een konijn-anti-fosfo-elF4E-antilichaam en worden behandeld met conjugaten tegen muizen PLUS en secundair anti-konijn MINUS-antilichaam (zie tabel 1), wordt het gefosforyleerde eiwit voornamelijk waargenomen in het perinucleaire gebied van het cytoplasma. Dit suggereert een migratie van het post-translationeel gemodificeerde eiwit naar dit gebied of dat alleen die eiwitten in dit gebied beschikbaar zijn voor modificatie.

Figuur 5. Lokalisatie van totaal versus fosfo-elF4-eiwit. U-2OS-cellen uitgeplaat in microplaten met 96 putjes en een nacht gekweekt bij 37°C, 5% CO2 in Advanced DMEM, aangevuld met in 10% FBS-serum, 2 mM glutamine. Cellen werden vervolgens overgeschakeld naar 0,1% serum en serum werd gedurende 24 uur uitgehongerd. Cellen werden vervolgens gedurende 15 minuten behandeld met 100 ng/ml EGF en vervolgens gefixeerd in 4% paraformaldehyde, gepermeabiliseerd en geblokkeerd voorafgaand aan antilichaambinding en Duolink-verwerking. (A) Duolink-kleuring met behulp van een muis-anti-lF4-monoklonaal 1 & deg-antilichaam in combinatie met anti-muis PLUS en MINUS secundaire antilichamen. (B) Duolink-kleuring met behulp van een muis-anti-elF4-monoklonaal en een konijn-antifosfo-elF4 1 & deg-antilichamen in combinatie met anti-muis PLUS en een anti-konijn MINUS secundaire antilichamen. Beide reacties werden behandeld met het Red-detectiesysteem.

Tafel 1. Primaire en secundaire antilichaamcombinaties gebruikt voor elF4E-onderzoeken. De soort en het doelwit voor de primaire antilichamen die worden gebruikt om de lokalisatie van elF4E en fosfor-elF4E af te bakenen, zijn aangegeven. Daarnaast wordt het soortdoel voor PLUS en MINUS Duolink secundaire antilichaamconjugaten vermeld.

Discussie

Deze gegevens tonen aan dat de Duolink®-technologie geschikt is voor het 96-wells-formaat. Deze technologie wordt meestal uitgevoerd op kleine aantallen monsters met behulp van microscoopglaasjes of dekglaasjes als substraat. Hier hebben we aangetoond dat grote aantallen experimentele monsters kunnen worden getest met behulp van microplaten en, nog belangrijker, de processtappen kunnen worden geautomatiseerd als gevolg van het gebruik van een gestandaardiseerd formaat.

Door gebruik te maken van Duolink-technologie in combinatie met beeldgebaseerde analyse kunnen zowel kwantitatieve als kwalitatieve cellulaire veranderingen worden waargenomen. Initiële experimenten toonden het belang aan van verzadiging van het epitoopdoel door het primaire antilichaam voorafgaand aan amplificatie. Bij verzadigende hoeveelheden primair antilichaam werd waargenomen dat het effect van de serumconcentratie op de hoeveelheid thymidinekinase-eiwit concentratieafhankelijk was. Kwalitatieve veranderingen in eiwitlokalisatie werden ook aangetoond met behulp van antilichamen die onderscheid maakten tussen elF4E en fosfo-elF4E. Het gefosforyleerde eiwit wordt gevonden in het perinucleaire deel van het cytoplasma, terwijl het niet-gefosforyleerde eiwit door het hele cytoplasma wordt waargenomen.

Proximity Ligation-assays zoals Duolink® werken heel goed met doelen met een laag aantal kopieën. De technologie produceert een geamplificeerd fluorescerend signaal dat fysiek aan het doelwit is gekoppeld via antilichaambinding en geconjugeerde nucleïnezuurversterkers. Het resultaat is een lichtpuntje dat representatief is voor een enkele epitoopbindingsgebeurtenis door het primaire antilichaam. Omdat de cellulaire doelen zijn gefixeerd met een verknopingsmiddel, kan hun locatie binnen de cel worden geïdentificeerd.

Deze technologie kan worden gebruikt om specifieke eiwitten in de cel te identificeren of om specifieke eiwit-eiwit-interacties te identificeren. Duolink gebruikt twee verschillende secundaire antilichaamconjugaten (PLUS en MINUS) die dicht bij elkaar moeten zijn om de interactie van hun nucleïnezuurconjugaatstaarten met de oligonucleotiden die als onderdeel van de ligatiereactie zijn toegevoegd, te bewerkstelligen. Door gebruik te maken van primaire antilichaamparen van verschillende soorten en hun overeenkomstige secundaire antilichamen, kunnen twee afzonderlijke epitopen, die zich op een enkel eiwit of op verschillende eiwitten bevinden, worden geïdentificeerd. Alleen wanneer de twee verschillende eiwitten zelf dicht bij elkaar zijn, wordt het versterkte signaal gegenereerd. Als de epitopen zich op afzonderlijke eiwitten bevinden, zou de productie van het PLA-signaal eiwit-eiwit-interactie suggereren.

De EL406&trade Washer Dispenser is een ideaal hulpmiddel om de testprocesstappen uit te voeren die nodig zijn voorafgaand aan beeldvorming. De EL406 biedt volledige plaatwassing (96- of 384-wells) met behulp van een gepatenteerd Dual-Action&trade-spruitstuk dat is geoptimaliseerd voor het wassen van losjes hechtende celmonolagen. De wasmachinedispenser heeft ook twee spuitpompen en één perpompspuit voor het doseren van reagens. Goedkope bulkreagentia, zoals fixatief of permeabilisatiebuffer, kunnen worden toegevoegd met behulp van de spuitpompdispensers, terwijl duurdere reagentia zoals antilichamen kunnen worden toegevoegd met behulp van de peripumpdispenser. Behalve dat het een laag dood volume heeft, maakt het ontwerp van de peripump het mogelijk om de leidingen in omgekeerde richting te spoelen, waardoor ongebruikte reagens die in de leidingen is achtergebleven, kan worden teruggewonnen.

De Cytation&trade 5 heeft een aantal functies die Duolink®-beeldvorming mogelijk maken. Vier afzonderlijke LED-posities maken multiplex fluorescentiebeeldvorming mogelijk met behulp van een aantal verschillende vergrotingsmicroscoopobjectieven. Naast identificatie van het eiwit (de eiwitten) van belang, biedt tegenkleuring voor cytoplasmatische markers of kernen cellulaire locatie-informatie. Daarnaast bevat de imager 6 objectieven met een vergroting tot 60x. Gen5&trade-software biedt autofocussering van cellen in microplaten, het vastleggen van beelden met zowel automatische als door de gebruiker gedefinieerde parameters (LED-intensiteit, CCD-versterking, integratietijd, enz.) en algoritmen voor celanalyse die celsegmentatie en celtelling mogelijk maken. De Gen5-software die wordt gebruikt om de leesfunctie te regelen, is ook in staat om geautomatiseerde beeldanalyse uit te voeren, zoals het tellen van cellen die voldoen aan de fluorescentiedrempel- en groottecriteria.

Door Duolink (PLA)-detectie te combineren met een gestandaardiseerd formaat, zoals microplaten, kan automatisering worden toegepast op het monsterbehandelingsproces en op beeldvorming gebaseerde detectie. De EL406 Washer Dispenser en de Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader zijn ideale voorbeelden van geautomatiseerde apparaten waarmee deze technologie met grote aantallen monsters kan worden uitgevoerd.


Resultaten

HEK293T-cellen hebben een constitutief hoge celoppervlakte-expressie van HLA-A maar lage expressie van HLA-B

De celoppervlakte-expressies van HLA-A en -B op HEK293T-cellen werden gemeten door kwantitatieve flowcytometrie met behulp van allelspecifieke primaire monoklonale antilichamen tegen ofwel HLA-A3 of -B7, aangezien de cellen homozygoot zijn voor beide (Fig. 1). We vonden dat HLA-A3 constitutief in hoge mate tot expressie werd gebracht met een mediaan van 71.204 moleculen per cel (Fig. 1B en 2A). Dat was 9,2 maal hoger dan die van HLA-B7 (Fig. 1B en 2A). Zowel de expressie van HLA-A3 als HLA-B7 nam toe na stimulatie met IFN-γ. HLA-A3-expressie was 1,8-voudig verhoogd (P = 0,0022) en HLA-B7 3,0-voudig (P = 0,0022).

Gegevens zijn representatief voor alle flowcytometrie-experimenten. (A) Forward scatter vs. side scatter dot plot. (B) Histogram dat de expressie van HLA-A3 en -B7 op het celoppervlak toont met behulp van allel-specifieke antilichamen, hetzij niet-gestimuleerd, hetzij na IFN-γ-stimulatie.

Horizontale lijnen geven mediaanwaarden aan. (A) Kwantitatieve metingen van HLA klasse I celoppervlakte-expressie bepaald door indirecte flowcytometrie. (B) HLA klasse I gentranscripten niveaus bepaald door kwantitatieve real-time PCR. * Geeft significante P-waarde aan (P < 0,05).

IFN-γ verhoogt de celoppervlakte-expressie, maar niet de mRNA-niveaus van HLA-A en -B in HEK293T

Vervolgens werd de hoeveelheid HLA-A*03 en -B*07 mRNA-transcripten bepaald met behulp van kwantitatieve real-time PCR om te onderzoeken of het verschil in expressie gemeten op het celoppervlak een direct gevolg zou kunnen zijn van verschillende transcriptniveaus. Het transcriptniveau van A*03 was inderdaad 4,3 maal hoger dan dat van B*07. Verrassend genoeg werd er geen significante toename gezien in reactie op IFN-γ (Fig 2B, A*03: P = 0,94, B*07: P = 0,31) wat aangeeft dat de toename in celoppervlakte-expressie onafhankelijk was van mRNA-niveaus in deze cellijn en moet bijgevolg worden gereguleerd door een post-transcriptioneel mechanisme.

Verschillen in coderende sequentie tussen HLA-A en -B hebben een groot effect op de HLA-expressie van het celoppervlak

Om het verschil in expressie tussen HLA-A en -B op te helderen, hebben we plasmiden geconstrueerd die alleen de coderende sequentie van HLA-A*02:01:01 of HLA-B*08:01:01 bevatten (Fig. 3). Deze plasmiden werden afzonderlijk getransfecteerd in HEK293T-cellen, stabiel getransfecteerde klonen werden geïsoleerd en de celoppervlakte-expressie werd gemeten door kwantitatieve flowcytometrie met gebruikmaking van HLA-A2- en -B8-specifieke monoklonale antilichamen (Fig. 4A).

Identieke aminozuren worden weergegeven als stippen. Pijlen geven plaatsen van overgang tussen chimere constructies aan. GenBank-toetredingsnummers voor HLA-A*02:01:01:01, HG794376.1 en voor HLA-B*08:01:01, HG794374.1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank /).

(A) Kwantitatieve meting uitgevoerd door indirecte flowcytometrie van HLA klasse I celoppervlakte-expressie. Horizontale lijnen geven mediaanwaarden aan. * Geeft significante P-waarde aan (P < 0,05). (B) Celoppervlakte-eiwitexpressie van A2 en B8 als een functie van het aantal mRNA-kopieën ten opzichte van het aantal kopieën van het referentiegen.

De resulterende constitutieve mediane expressieniveaus weerspiegelden die van de endogene moleculen wanneer ze locussgewijs werden vergeleken (A2: 54.031 moleculen per cel versus 71.204 voor A3 in niet-getransfecteerde cellen 2.466 en 7.778 voor respectievelijk B8 en B7) (Fig. 2 en 4A). De constitutieve expressie van HLA-B8 was dus significant lager dan die van HLA-A2 met een 15-voudig verschil in mediane expressie. Wanneer gestimuleerd met IFN-γ, stegen de mediane expressieniveaus 1,9-voudig (P<0,0001) voor HLA-A2 en evenzo, maar niet significant, 2,7-voudig (P = 0,13) voor HLA-B8, wat leidde tot een 22-voudig verschil in relatieve expressie niveau van HLA-A2 en -B8 (Fig. 4A).

De gentranscriptniveaus van de HLA-A2- en -B8-transgene klonen werden gemeten tijdens basale niet-geïnduceerde en IFN-γ-geïnduceerde omstandigheden met behulp van HLA-allel-specifieke kwantitatieve real-time PCR, en vergeleken met hun celoppervlakte-eiwitexpressie (Fig. 4B). ). De niet-geïnduceerde mRNA-niveaus waren vergelijkbaar voor HLA-A*02 en -B*08 (P = 1) en veranderden niet door IFN-γ-stimulatie (A*02: P = 0,60 B*08: P = 0,73). Dit werd verwacht omdat alleen de coderende sequenties van HLA-A*02 en -B*08 in de vector aanwezig waren zonder hun natuurlijke regulerende componenten.

Interessant genoeg vonden we geen correlatie tussen celoppervlakte-eiwitexpressie en transcriptniveaus, wat aantoont dat de beschikbaarheid van mRNA geen beperkende factor was voor HLA-expressie (HLA-A2 geen IFN-γ: P = 0,29, IFN-γ gestimuleerd: P = 0,4 HLA- B8 geen IFN-γ: P = 0,27, IFN-γ gestimuleerd: P = 0,46). Deze bevinding toont aan dat de grote variatie in celoppervlakte-expressie van de overeenkomstige HLA-A- en -B-moleculen werd veroorzaakt door verschillen in de coderende sequenties en ofwel het gevolg was van verschillen in translatiesnelheid of in post-translationele verwerking van de eiwitten.

Het terminale deel van het alfa 2-domein en het alfa 3-domein zijn vooral belangrijk voor HLA-expressie op het celoppervlak

Om de bijdrage van de individuele domeinen van het HLA-molecuul aan HLA-expressie op het celoppervlak te onderzoeken, werden verschillende chimere constructies gemaakt waarbij sequenties die coderen voor functionele domeinen van HLA-B8 werden vervangen door de overeenkomstige domeinen van HLA-A2 en vice versa (Fig. 3). Elk van de fusieconstructen werd getransfecteerd in HEK293T-cellen en chimere HLA-eiwitexpressie werd gemeten met behulp van anti-HLA-A2- en -B8-specifieke monoklonale antilichamen (Fig. 5).

Kwantitatieve meting bepaald door indirecte flowcytometrie, horizontale lijnen geven mediane waarden aan. (A) Cellen die zijn getransfecteerd met ofwel B8 ofwel chimere constructies die N-terminaal beginnen als B8 en C-terminaal eindigen als A2. (B) Cellen die zijn getransfecteerd met A2- of chimere constructies die N-terminaal beginnen als A2 en C-terminaal eindigen als B8. * Geeft significante P-waarde aan na Bonferroni-correctie (P < 0,017).

Het vervangen van ofwel het cytoplasmatische domein of zowel het cytoplasmatische en transmembraan (TM) domein van HLA-B8 door de overeenkomstige HLA-A2-domeinen had geen significant effect op de celoppervlakte-expressie van de fusie-eiwitten (Fig 5A, constructen HLA-B81-308/A2309-341 en -B81-284/A2285-341). Wanneer de uitwisseling tussen HLA-B8 en -A2 echter in het terminale deel van het alfa 2-domein (construct B81-176/A2177-341), was de expressie van het chimere construct 8-voudig hoger dan die van HLA-B8 (Fig. 5A). De expressie van de HLA-B8 . vergelijken1-176/A2177-341 en -B81-284/A2285-341 chimere eiwitten (Fig 5A) met die van HLA-A2 (Fig 5B) gaven aan dat de aminozuren 177-284 die de zes terminale aminozuren van het alfa 2-domein en het gehele alfa-3-domein (Fig 3) omvatten, 65% zouden kunnen verklaren ( 33.434 moleculen per cel) van het absolute verschil in celoppervlakte-expressie van HLA-A2 en -B8 (51.565 moleculen per cel).

Vergelijkbare chimere constructies werden gemaakt waarbij HLA-A2 werd vervangen door HLA-B8 van het terminale deel van alfa 2, net voor het cytoplasmatische gebied of voor het TM-gebied inclusief het cytoplasmatische gebied (Fig. 5B). Nogmaals, er was geen significant effect van het vervangen van het cytoplasmatische gebied of zowel het TM- als het cytoplasmatische gebied (constructen A21-308/B8309-338 en A21-284/B8285-338). Wanneer daarentegen de sequentie van het HLA-A2-construct werd uitgewisseld met de overeenkomstige sequentie van HLA-B8 dichtbij het einde van het alfa 2-domein (construct HLA-A21-176/B8177-338), resulteerde dit in een 11-voudig lagere expressie (Fig. 5B), waardoor de substantiële invloed van dit deel van het molecuul werd bevestigd.

De expressieniveaus van het celoppervlak werden ook gemeten na IFN-γ-stimulatie, waarbij een vergelijkbare opwaartse regulatie tussen gestimuleerde en niet-gestimuleerde getransfecteerde cellen werd gevonden voor alle chimere constructies (S1 Fig).

Verschillen in de coderende sequenties van HLA-A*02 en -B*08 vanaf het startcodon tot positie 176 in het alfa 2-domein verklaren een klein deel van het verschil in celoppervlakte-expressie

Bij het vergelijken van de expressie van HLA-B8 (Fig 5A) met die van de HLA-A21-176/B8177-338 chimeer construct (Fig. 5B) vonden we een 2,1-voudig (P = 0,045) hogere expressie van het chimere construct dat de HLA-A2-sequentie bevat. Een soortgelijk verschil werd waargenomen bij het vergelijken van de expressie van HLA-A2 met de HLA-B81-176/A2177-341 constructie (2,6-voudig, P = 0,0015). Nogmaals, het hebben van de voor HLA-A2 coderende sequentie resulteerde in hogere expressieniveaus dan het hebben van HLA-B8 in hetzelfde gebied.

Samenvattend leidden plasmiden die coderen voor HLA-A2-sequenties tot veel hogere celoppervlakte-expressie dan voor HLA-B8-coderende plasmiden, en het hebben van HLA-A2-sequenties in het terminale deel van alfa-2 en in het alfa-3-domein was verantwoordelijk voor het grootste deel van dit effect. , terwijl een kleiner, maar significant effect kan worden toegeschreven aan stroomopwaartse sequenties. Daarentegen werden geen consistente effecten gezien wanneer alleen de TM en/of cytoplasmatische regio's werden uitgewisseld.


Discussie

Het ontwikkelen van een veilig en effectief vaccin om RSV-infectie of ziekte te voorkomen heeft hoge prioriteit, en een aantal kandidaat-vaccins wordt momenteel preklinisch en klinisch geëvalueerd [37]. Het merendeel van de RSV-neutraliserende antilichaamrespons in herstellend humaan serum is gericht op epitopen die specifiek zijn voor de prefusievorm van het RSV F-oppervlakteglycoproteïne, wat suggereert dat een prefusie F-gestabiliseerd subeenheidvaccin, zoals DS-Cav1, beschermende immuniteit zou opwekken tegen de ziekte [16, 20]. Rationeel ontworpen mutaties stabiliseren DS-Cav1 in de prefusieconformatie, en DS-Cav1-reactiviteit op het prefusiespecifieke, plaats-Ø-bindende D25-antilichaam wordt grotendeels gehandhaafd na incubatie gedurende één week bij 4°C [20]. Onlangs werd echter gemeld dat prefusie-specifieke antilichaambinding aan DS-Cav1 die tot 50 dagen bij 4 ° C was bewaard, was verminderd, wat aangeeft dat de structurele integriteit ervan was aangetast [38]. Met behulp van een nieuw geïdentificeerd anti-RSV F-antilichaam, 4D7, samen met transmissie-elektronenmicroscopie en differentiële scanningfluorimetrie, probeerden we de stabiliteit op lange termijn van DS-Cav1 bij 4 ° C verder te karakteriseren.

Het 4D7-epitoop werd in kaart gebracht op de eerder gedefinieerde antigene plaats I met behulp van shotgun-mutagenese, en drie residuen op het F-eiwit dat cruciaal is voor 4D7-binding (V384, D385 en F387) werden geïdentificeerd. Hoewel de 4D7-bindingsplaats een vergelijkbare conformatie aanneemt in zowel de prefusie- als postfusie-RSV F-structuren, onthulden SPR-experimenten dat 4D7 bindt aan postfusie F en niet reageert op de plaats-Ø-bevattende prefusievorm van het eiwit. De 4D7-bindingsplaats lijkt volledig te zijn blootgesteld aan het uiteinde van postfusie F, terwijl de beschikbaarheid van epitoop beperkt kan zijn in de prefusieconformatie waar de 4D7-bindingsplaats is gelokaliseerd aan de basis van het hoofddomein (Fig. 1). Sterische hindering, in plaats van een verschil in de epitoopconformatie tussen prefusie- en postfusie-F-vormen, kan de reden zijn waarom veel plaats I-reactieve antilichamen, zoals 4D7, specifiek binden aan postfusie F [18, 32, 33].

Naast de reeds beschreven primaire kritische residuen, identificeerden epitoop mapping-experimenten ook twee secundaire kritische residuen, R235 en P246 (gegevens niet getoond). Deze residuen zijn begraven in de kern van de postfusie F-structuur en daarom is het onwaarschijnlijk dat ze rechtstreeks in contact komen met 4D7 [13]. In de postfusie, maar niet de prefusie, F-trimeerstructuur, vormen R235-residuen zoutbruggen met E232-residuen op aangrenzende monomeren [13, 21], wat waarschijnlijk bijdraagt ​​aan de structurele stabiliteit van postfusie F en de binding van postfusie-reactieve antilichamen zoals 4D7 mogelijk maakt . In overeenstemming met deze interpretatie verminderde de R235A-mutatie de reactiviteit van een ander plaats I-bindend postfusiespecifiek antilichaam, 3B1, tegen F-eiwit, maar had geen significant effect op de binding van prefusiespecifieke monoklonale antilichamen zoals D25 [39].

Naast het binden van de postfusieconformatie van RSV F, toonden we aan dat 4D7 reageert op een subset van het eiwit dat wordt aangetroffen in preparaten van gezuiverd DS-Cav1. Deze eiwitsubset was niet in staat om D25 te binden, wat aangeeft dat de mix van eiwitconformaties gevonden in DS-Cav1-preparaten kon worden onderscheiden door hun vermogen om ofwel 4D7 of D25 te binden. Bovendien leidde langdurige opslag van DS-Cav1 bij 4°C tot een toename van 4D7-reactieve vormen met een parallelle afname van D25-reactiviteit. Deze gegevens suggereerden dat na verloop van tijd bij 4°C de conformatie van ten minste een subset van het DS-Cav1-eiwit verschuift van een plaats-O-bevattende prefusieconformatie naar een vorm waarin het 4D7-epitoop wordt blootgesteld. Onze experimenten toonden aan dat D25- en 4D7-epitopen niet beide aanwezig zijn op hetzelfde eiwitmolecuul, daarom moet het bij 4 ° C opgeslagen DS-Cav1-preparaat een mengsel zijn van ten minste twee verschillende eiwitisovormen.

Transmissie-elektronenmicroscopie was niet in staat om meerdere eiwitconformaties te onderscheiden in het DS-Cav1-monster dat langdurig bij 4 ° C was bewaard, hoewel het bij 4 ° C opgeslagen eiwit heterogener leek dan het eiwit dat onmiddellijk voorafgaand aan de analyse werd ontdooid. Het was echter duidelijk uit de TEM-beeldvorming dat het bij 4 ° C opgeslagen DS-Cav1-eiwit geen postfusie-achtige structuur aannam, waarschijnlijk omdat de prefusie-stabiliserende mutaties die in DS-Cav1 zijn geïntroduceerd het hoofddomein vergrendelen en de grote conformationele voorkomen. herschikking vereist om de postfusie-achtige "lolly" -structuur aan te nemen [20].

Daarentegen was analyse door labelvrije differentiële scanningfluorimetrie in staat om de bij 4 ° C opgeslagen DS-Cav1 biofysisch te onderscheiden van zowel vers ontdooide DS-Cav1 als postfusie F. De tussenliggende smelttemperatuur gemeten voor DS-Cav1 opgeslagen bij 4 ° C suggereerde dat, bij opslag bij 4°C, DS-Cav1 verschuift naar een meer thermostabiele conformatie. SPR- en ELISA-analyse suggereerde dat ten minste twee eiwit-isovormen aanwezig waren in de bereiding van DS-Cav1 die langdurig bij 4°C werd bewaard. Er werd echter slechts één enkele Tm waargenomen toen deze monsters werden geanalyseerd met DSF. Gezien de breedte van de overgangspieken die zijn gemeten voor de RSV F-preparaten en de waargenomen overlap, is er mogelijk niet voldoende resolutie om verschillende isovormen te onderscheiden binnen het bij 4 ° C opgeslagen DS-Cav1-monster. Als alternatief is het mogelijk dat het grootste deel van het DS-Cav1-preparaat, na opslag bij 4°C gedurende 3 maanden, een aantal alternatieve conformaties had aangenomen, die allemaal een vergelijkbare toename in thermostabiliteit vertoonden.

Vergeleken met die van postfusie F of DS-Cav1 opgeslagen bij 4 ° C, was de ontvouwende overgang van vers ontdooid DS-Cav1 breed, met een bereik van meer dan 30 ° C (Fig. 6A). Hoewel smalle ontvouwende overgangen, zoals die waargenomen voor postfusie F of 4 ° C-opgeslagen DS-Cav1, indicatief zijn voor meer rigide structuren [40], suggereert de brede overgang waargenomen voor het vers ontdooide DS-Cav1-monster dat er conformationele flexibiliteit is in de prefusie-achtige structuur. Dit komt overeen met de atomaire mobiliteit die eerder is beschreven voor DS-Cav1 [20].

De thermische smeltcurve van vers ontdooide 15 μM DS-Cav1, maar niet bij 4 ° C opgeslagen DS-Cav1 of postfusie F, onthulde een tweede, minder uitgesproken, overgangstemperatuur met bij Tm van ongeveer 60 ° C (Fig 6A en 6C) . De bijdrage van deze vroege overgang nam toe naarmate de eiwitconcentratie afnam (S3A Fig). Aangezien monomeer in het monomeer:trimeer-evenwicht overvloediger wordt bij lage eiwitconcentratie [41], is een mogelijke verklaring voor deze vroege, lage temperatuurovergang dat het de ontvouwing van monomeer, in plaats van trimeer, DS-Cav1 vertegenwoordigt. De thermische smeltcurve van 1 μM bij 4 ° C opgeslagen DS-Cav1 kan ook een vergelijkbare vroege overgang vertonen (Fig 6B), wat opnieuw suggereert dat, terwijl de DS-Cav1 opgeslagen bij 4 ° C stabieler is dan vers ontdooide DS-Cav1 , het is waarschijnlijk niet zo stabiel als postfusie F, waarvoor geen tweede overgangstemperatuur werd gedetecteerd bij een van de geteste eiwitconcentraties. Dit is misschien niet verrassend, aangezien de prefusie-stabiliserende mutaties die DS-Cav1 definiëren, voorkomen dat het eiwit wordt omgezet in de lage energieconformatie die is aangenomen door postfusie F.

Samenvattend benadrukken deze gegevens het nut van het nieuw geïdentificeerde 4D7-muis monoklonale antilichaam als reagens voor het volgen van conformationele veranderingen van DS-Cav1 en mogelijk andere gestabiliseerde prefusie-F-antigenen die optreden bij langdurige opslag bij 4 ° C. De gegevens beschrijven ook het bestaan ​​van ten minste, maar niet beperkt tot, twee verschillende DS-Cav1-isovormen, een die bindt aan het prefusie-specifieke D25-antilichaam maar niet aan 4D7 en een andere die bindt aan 4D7 maar niet aan D25. Bij bewaring bij 4°C neemt de hoeveelheid D25-bindende isovormen af, in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten die aantonen dat DS-Cav1 bewaard bij 4°C in de loop van de tijd minder reactief is op een ander prefusiespecifiek antilichaam, CR9501 [38]. Parallel aan de waargenomen afname in prefusie-achtige conformatie, neemt de hoeveelheid 4D7-reactieve vormen toe.Deze toename wordt echter niet veroorzaakt door een verschuiving naar een postfusie-achtige conformatie, maar naar een alternatieve structuur die thermostabieler is dan de prefusievorm.

Het is niet duidelijk of de hierin beschreven biofysische veranderingen de functionele immuunrespons van het vaccinantigeen zouden verminderen. De superieure potentie van site Ø-gerichte monoklonale antilichamen suggereert echter dat een vermindering van de hoeveelheid site Ø-bevattend F-eiwit een negatief effect zou kunnen hebben op de werkzaamheid van het vaccin [20]. Het is dus van belang om manieren te onderzoeken om DS-Cav1 verder te stabiliseren, hetzij door formulering, met de toevoeging van eiwitstabiliserende hulpstoffen, of door rationeel ontwerp, met de toevoeging van andere prefusie-stabiliserende mutaties, met name die welke regio's in de buurt van antigene plaats Ø en plaats I, waarvan hierin is aangetoond dat ze detecteerbaar zijn veranderd door langdurige opslag bij 4°C. Bovendien zou 4D7 kunnen worden gebruikt om bepaalde subsets van DS-Cav1-eiwit te isoleren en verder te karakteriseren, waardoor een begrip ontstaat dat zou helpen bij het rationele ontwerp van prefusie-F-moleculen met verbeterde stabiliteit.


Een interview met Susan Strome

Susan Strome is Distinguished Professor of Molecular, Cell and Developmental Biology aan de University of California, Santa Cruz, VS. Onlangs aangesteld als redacteur bij Development, bestudeert haar laboratorium de regulatie van kiemcelontwikkeling in C. elegans, met een bijzondere focus op de epigenetische overdracht van chromatinetoestanden. We spraken met Susan over haar vroege carrièreswitch van prokaryoten naar wormen, haar ervaringen met kleine en grote wetenschap en waarom lesgeven zo belangrijk voor haar is.

Laten we bij het begin beginnen: was er iets waardoor je in de eerste plaats geïnteresseerd raakte in wetenschap, en biologie in het bijzonder?

Toen ik jong was, waren wetenschap en wiskunde mijn comfortzones. Mijn vader was een ingenieur, en hoewel ik het niet leuk vind als mensen hersentypes categoriseren, denk ik dat mijn hersenen zo leken te werken. Op de universiteit studeerde ik scheikunde, al weet ik niet meer waarom ik voor scheikunde koos. Nadat ik mijn bachelor in scheikunde had behaald, dacht ik erover om een ​​medische opleiding of een graduate school te gaan volgen. Ik koos gedeeltelijk voor geneeskunde omdat dat carrièrepad inhield dat ik voortdurend met mensen omging, en ik zag mezelf meer als een solo-persoon, me natuurlijk niet realiserend dat naar de middelbare school gaan en een laboratorium runnen erg mensgericht zou zijn en dat ik dat aspect van mijn uiteindelijke carrière geweldig zou vinden. Ik dacht ook dat dokter zijn en verantwoordelijk zijn voor het leven van mensen een heel goed geheugen vereist, en ik wist niet zeker of ik op mijn geheugen kon vertrouwen. Met de medische school uit, was het normaal om naar de graduate school te trekken. Ik besloot over te stappen naar meer biologisch georiënteerde chemie (d.w.z. biochemie) en schreef me in voor een PhD-programma in biochemie aan de Universiteit van Washington in Seattle.

Van uw doctoraat kwamen in 1978 en 1980 drie publicaties in de Journal of Molecular Biology, die zich richtten op een T7-bacteriofaaggen. Hoe ben je in dit werk beland?

Ik selecteerde een onderzoekslab en project dat me een goede trainingservaring zou bieden. Naar mijn mening is het doel van promotieonderzoek niet om het systeem of de vraag te kiezen die je de rest van je leven wilt bestuderen, maar om te leren vragen te identificeren, hypothesen te formuleren, experimenten te ontwerpen om je hypothesen te testen, je resultaten te interpreteren en ontwerp de volgende experimenten. Prokaryote systemen zijn hier geweldig voor omdat alles zo snel gaat - ik had veel oefening om de wetenschappelijke methode steeds opnieuw te doorlopen in plaats van weken of maanden te moeten wachten om de resultaten te zien. Mijn adviseur Ted Young was een geweldige mentor en ik heb mijn studie in vierenhalf jaar afgerond, wat tegenwoordig relatief zeldzaam is. Er was één heel ingrijpende gebeurtenis: Ted ging een jaar op sabbatical in Zwitserland en liet alleen mij en de technicus in het lab achter. Dit was pre-e-mail, dus we schreven brieven heen en weer. Op een dag schreef ik hem om hem te vertellen dat ik erover dacht een bepaald experiment te proberen. Ik verzond mijn brief en begon het experiment te doen. Drie weken later kreeg ik zijn antwoord en zei: 'Ik denk niet dat dat experiment zal werken en om deze redenen informatief zal zijn...' PhD papers. Die ervaring gaf kracht omdat ik me realiseerde dat ik er zelf over kon nadenken – ik hoefde niet van mijn adviseur te eisen wat ik moest doen of hoe ik het moest doen.

Mijn promotieonderzoek was een geweldige opleiding, maar mijn onderzoeksgebied was niet wat ik decennialang wilde nastreven. Ik was meer geïnteresseerd in cellen, organen, weefsels en dieren, en wat ik op de graduate school deed was erg reductionistisch, reageerbuisdingen. Ik begon lessen fysiologie te volgen op de verpleegafdeling om te leren hoe cellen en weefsels en organen werken, hoe het metabolisme werkt, enzovoort, en dat bracht me op ontwikkelingsbiologie. Toen moest ik mijn niche binnen het vakgebied vinden. Ik heb het gevonden en sinds 1979 bestudeer ik hetzelfde soort vragen in hetzelfde organisme, terwijl ik met de tijd meeging en nieuwe technologieën overnam.

Dat organisme was C. elegans, die je voor het eerst tegenkwam als postdoc met Bill Wood in Boulder, Colorado - hoe zag het wormenveld eruit toen je erbij kwam?

Het is interessant om op te merken dat het vrij gebruikelijk was voor de vroege C. elegans onderzoekers zijn begonnen als prokaryotische onderzoekers - Sydney Brenner is een duidelijk voorbeeld, veel van de andere beroemdheden van ons vakgebied zijn daar ook begonnen, en ik ook. Eind jaren zeventig studeerde C. elegans ontwikkeling was een ontluikend, jong veld. Ik had waarschijnlijk elk wormontwikkelingspapier in een middag kunnen lezen! Er waren geen garanties dat het het beste systeem zou worden dat Drosophila was, maar ik wilde op de begane grond beginnen met wormenwerk. Er waren toen niet veel wormengemeenschappen. Het mekka was Cambridge in het Verenigd Koninkrijk. Boulder had met name twee laboratoria - die van David Hirsh en Bill Wood - gericht op C. elegans, en het lab van Dick McIntosh deed ook wat wormwerk. Er waren veel geweldige postdocs en afgestudeerde studenten in Boulder, en we hadden geweldige wormbijeenkomsten - ik leerde mensen kennen met wie ik al tientallen jaren contact heb.

Ik voelde me ook erg aangetrokken tot Bill Woods manier van wetenschap bedrijven. Hij was een prokaryotische onderzoeker en stond bekend om zijn invloedrijke werk op het gebied van T4-faagassemblage. Ik stelde me voor en hoopte dat hij zou brengen naar C. elegans – en help me om naar C. elegans – het soort denken dat het veld vooruit zou helpen, en dat bleek waar te zijn. Hij was een geweldige mentor voor mij.

Ik realiseerde me dat ik er zelf over kon nadenken - ik hoefde niet van mijn adviseur te zeggen wat ik moest doen of hoe ik het moest doen

Welke vraag wilde je beantwoorden in je postdoc?

Ik wilde testen of de plaats van binnenkomst van het sperma de polariteit van het embryo dicteert, en ik wilde begrijpen hoe cellen hun lot verkrijgen. Werk van het lab had aangetoond dat verschillende cellen zich ontwikkelen tot verschillende weefsels, en destijds werd gedacht dat het embryo veel meer 'mozaïek' was dan latere analyses lieten zien (we wisten niet dat er zoveel celsignalering was als we weet nu). Dus ik was geïnteresseerd in hoe het embryo aanvankelijk anterieur van posterior leert en zich vervolgens zodanig deelt dat de kleinere dochtercel kiemlijn zal genereren en de grotere dochtercel somatische celtypes zal genereren.

Ik begon met het opwekken van antilichamen tegen spermacomponenten, om te zien of ze het ingangspunt van het sperma markeren en misschien dicteren welk uiteinde van het embryo posterieur wordt. Ik nam een ​​onelegante, brute-force benadering om sperma te verzamelen of te vermalen C. elegans embryo's, ze in muizen te injecteren, monoklonale antilichamen te maken en ze te screenen op interessante kleurpatronen - zou ik iets kunnen vinden dat specifiek was voor het anterieure, posterieure of cellot?

Ik screende antilichaam-voor-antilichaam op een interessant kleurpatroon en ik had een paar screeningsrondes doorlopen zonder iets opmerkelijks te zien. En toen begon ik aan een nieuw experiment. Het was laat in de nacht en ik screende veel objectglaasjes met acht putjes, elk putje met een ander antilichaam erin. Ik ging de donkere microscoopkamer in en in mijn eerste monster op mijn eerste objectglaasje zag ik heldere kleine korrels, maar alleen in bepaalde cellen van het embryo - ze waren in één cel van het tweecellige embryo, één cel van het viercellige embryo embryo, één cel van het achtcellige embryo, enz. Ik dacht, wauw, de kleine korrels zijn uniek in de kiemcel van elk embryo! De korrels waren duidelijk een afstammingsspecifieke marker. Ik was zo opgewonden dat ik het lab in rende om het een labgenoot te vertellen, maar er was niemand (het was 11.30 uur 's nachts), dus rende ik de gang in, pakte de conciërge en liet hem door de microscoop kijken bij mijn mooie korrels. Ik wilde dat hij zou zeggen: 'Oh, dat is geweldig!', maar hij zei gewoon 'Oh, dat is leuk', natuurlijk niet echt begrijpend waarom ik zo opgewonden was. Na mijn superspannende monster 1 ging ik naar monster 2 - en zag dezelfde kleine kiembaanspecifieke korrels. Dan monster nummer 3 – weer kleine korreltjes in de kiemcellen. Toen ging ik naar mijn 'geen primaire antilichaam'-controle en zag hetzelfde! Het was het secundaire antilichaam dat die korrels kleurde – het was niet de antilichaambron die ik wilde, maar het vertelde me wel dat de korrels bestonden, en dankzij de antilichamen kon ik ze zien.

Bill Wood en ik kochten de hele partij van dat secundaire antilichaam om als reagens te gebruiken, en ik begon met het screenen op primaire monoklonale antilichamen die op dezelfde manier de korrels zouden kleuren, en ik vond er enkele. Dat zette me op een pad van het nastreven van kiemkorrels - die we P-korrels in wormen noemden omdat ze gescheiden zijn tot de P-lijn. De korrels waren waargenomen door elektronenmicroscopie in Drosophila en kikkers en zelfs wormen, maar je kunt de samenstelling en rol van een korrel niet bestuderen met alleen microscopie. De antilichamen maakten de weg vrij voor de vragen die ik zou aanpakken toen ik mijn eigen laboratorium aan de Indiana University begon. Waar zijn kiemkorrels van gemaakt? Hoe worden ze naar de kiemlijn gestuurd? Wat doen ze? Zijn ze nodig voor de vruchtbaarheid?

Je hebt 30 jaar aan kiemcellen gewerkt - wat houdt je zo lang geïnteresseerd en wat zijn de belangrijkste onbeantwoorde vragen in het veld?

Ik zou zeggen dat P-korrels me naar kiemcellen wezen. Wat mijn aandacht verder op kiemcellen richtte, was het doen van massale voorwaartse genetische screenings voor steriele mutanten met maternale-effectgenetica, met als doel mutanten te identificeren die defect zijn in P-korrels. We hebben geen P-granule-mutanten gevonden, om redenen die we nu begrijpen, maar destijds mysterieus waren. In plaats daarvan identificeerden we een kleine set genen die we maternale effect steriele (MES) genen noemden wanneer de moeder homozygote mutant is voor een MES-gen, ze genereert nakomelingen die allemaal steriel zijn. De MES-genen bleken histonmodificatoren te zijn: drie vormen polycomb repressive complex 2 (PRC2), dat een aminozuur methyleert in de staart van histon H3, en een ander (MES-4) methyleert een ander histon H3-staartaminozuur in de buurt van waar PRC2 wel. Plots zaten we in chromatine, we waren in epigenetica - de MES-eiwitten zijn epigenetische regulatoren die nodig zijn voor de ontwikkeling van kiemcellen, en niet nodig voor de ontwikkeling van het somatische lichaam.

Interessant is dat vanaf het begin het nastreven van de MES-chromatineregulatoren een gemakkelijker pad was dan het nastreven van P-korrels. P-korrels waren een uitdaging om biochemisch en functioneel te ontleden. Een keerpunt kwam toen Dustin Updike, die nu zijn eigen lab runt, als postdoc bij mijn lab kwam. Hij bracht veel verbeeldingskracht, vastberadenheid en uitstekende technische vaardigheden met zich mee voor zijn project en publiceerde verschillende baanbrekende artikelen over P-korrels. Toen hij mijn lab verliet om zijn eigen lab te beginnen, zei ik zo'n beetje 'jij neemt P-korrels en ik zal me concentreren op chromatine'. Dus P-granules hebben me gelanceerd en zijn al 30 jaar een belangrijk onderdeel van het laboratorium, en nu volgt Dustin ze op. Momenteel bestudeert mijn lab voornamelijk chromatineregulatie - het was een heel spannend verhaal. We moeten op de vloedgolf springen die epigenetica is, die David Allis en anderen een paar decennia geleden lanceerden, en die nog steeds een heel hot veld is.

We publiceerden in 2014 een artikel dat zeer invloedrijk is geweest - het toonde aan dat chromosomen met repressieve tekens die door PRC2 zijn afgegeven, worden overgebracht naar het eencellige embryo van beide gameten (sperma en ei) en dat de repressieve tekens vervolgens worden doorgegeven cis aan dochterchromatiden tijdens DNA-replicatie. We hebben aangevoerd dat de MES-factoren een herinnering sturen van genexpressiepatronen die geschikt zijn voor geslachtscellen van ouderkiemcellen naar nageslachtkiemcellen. We gaan dit nu verder bestuderen. We hopen dat het ons zal helpen een van de belangrijkste vragen in epigenetica te beantwoorden: hoe wordt epigenetische informatie van generatie op generatie doorgegeven? Het kanaal voor het doorgeven van informatie tussen generaties zijn geslachtscellen. Een brandende vraag is of en hoe een herinnering aan ouderervaringen – omgeving, voeding, stress – via de geslachtscellen naar het nageslacht kan worden gestuurd. Mijn lab is goed gepositioneerd om die vraag in wormen aan te pakken.

Een brandende vraag is of en hoe een herinnering aan ouderlijke ervaringen – omgeving, voeding, stress – via de geslachtscellen naar het nageslacht kan worden gestuurd.

Wat dragen modelorganismen zoals wormen bij aan de epigenetica als geheel?

Degenen onder ons die gedurende hun hele loopbaan ongewervelde modelorganismen hebben bestudeerd, waren nerveus dat NIH-studiesecties de deur voor onze financiering zouden sluiten ten gunste van financiering van studies bij zoogdieren. Maar mijn laatste subsidieaanvraag bij de NIH die experimenten voorstelt in C. elegans kreeg een perfecte score! Er wordt erkend dat we in modelorganismen echt gedetailleerde mechanistische vragen kunnen stellen, terwijl we ook proberen te controleren voor alle variabelen die epigenetische overerving zouden kunnen beïnvloeden. Edith Heard en Ruth Lehmann organiseerden in 2015 een prachtige bijeenkomst die werd gefinancierd door The Company of Biologists in Sussex. Tijdens die bijeenkomst zat ik in een break-outgroep met Marcus Pembrey en anderen om te bespreken hoe moeilijk het is om alles te controleren dat de overdracht van informatie van muisouders naar hun nakomelingen, zoals de lichten in de dierenkamer, wie voor de muizen zorgt en of de plastic waterflessen giftige stoffen uitlogen. Zelfs bij wormen vragen we ons af of we voor alle mogelijke variabelen controleren. Zoals ik al zei, bieden modelorganismen de mogelijkheid om in te zoomen op gedetailleerde mechanistische vragen. De meeste epigenetische overerving - niet alles - komt neer op DNA-methylatie, histonmodificaties en RNA's. We kunnen de epigenetische dragers identificeren en ontleden hoe ze in verschillende systemen werken, en die informatie dan doorgeven aan de zoogdieren. Wormen, vliegen, kikkers, vissen en gisten leveren een enorme bijdrage op het gebied van epigenetica en onthullen hoe epigenetica de ontwikkeling en gezondheid van meer gecompliceerde organismen kan beïnvloeden.

Je maakte deel uit van de wormeenheid van modENCODE - wat was je ervaring met het project?

modENCODE was gericht op vliegen en wormen en volgde op het ENCODE-project, dat voornamelijk van mensen was. Ik zat in een consortium van acht laboratoria – Jason Lieb was de primaire onderzoeker en de co-PI's waren ikzelf, Abby Dernburg, Julie Ahringer, Arshad Desai, Eran Segal en Shirley Liu (de laatste twee zijn bio-informatici). We hebben een voorstel ingediend om histon-modificaties en de verdeling van chromatine-regulatoren over het wormgenoom te karakteriseren. Interessant is dat we werden belast met karakteriseren en catalogiseren - niet met experimenten. Dit was heel anders dan de meeste NIH-financiering, die geen catalogi zou financieren, maar onze missie was om de gegevens te catalogiseren en beschikbaar te stellen voor de gemeenschap. Het was een interessante les in grote wetenschap, en werken in grote groepen – we moesten goed georganiseerd en zeer coöperatief zijn. Toen we begonnen, wisten we niet eens hoe we ChIP in wormen moesten doen, dus dat moesten we eerst uitzoeken. De NIH wilde gegevens van hoge kwaliteit, dus elk antilichaam dat we voor ChIP gebruikten, moest op verschillende manieren worden gevalideerd, wat op zichzelf natuurlijk veel werk was, maar nuttig voor de gemeenschap (wanneer mensen analyses uitvoeren met slechte antilichamen, kan het modderig worden het veld en een slechte dienst zijn).

Ik denk dat er enige wrevel was in de wormengemeenschap over de hoeveelheid geld die hierin ging - maar als ik erover nadenk om hetzelfde bedrag te nemen en het te verdelen onder vele laboratoria om te proberen hetzelfde te bereiken, doe ik dat niet' denk niet dat er zoveel zou zijn bereikt. Dus over het algemeen denk ik dat het modENCODE-consortiummodel succesvol was - het was een ander soort wetenschap, mijn groep heeft veel geleerd en ik denk dat de gemeenschap een mooie hoeveelheid gegevens heeft geërfd om mee te werken.

In 2013 ontving u de UCSC Excellence in Teaching Award - hoe belangrijk is lesgeven voor u?

Net als veel van mijn favoriete wetenschappers ben ik er vast van overtuigd dat een groot deel van ons werk bestaat uit het opleiden van studenten. We bereiken relatief weinig studenten in het lab, ook al laten we regelmatig bachelorstudenten onderzoeksprojecten doen. Als ik naar een klas van 300 personen ga om genetica te onderwijzen, kan ik een impact hebben op veel studenten. Als ik ze een echt solide basis kan geven in de chromosomale basis van meiose, mitose, overerving en genetische ziekten, is dat een echt geschenk. Ik wil niet dat ze onthouden, uit het hoofd geleerde 'feiten' in het examen uitspugen en dan de belangrijke concepten vergeten als de les voorbij is. Ik wil dat ze de universiteit verlaten met een diep begrip van de concepten die we behandelen, als geïnformeerde burgers die iets als een kankerdiagnose of behandeling met hun familie en vrienden kunnen bespreken. Mijn strategie was om te proberen uit te zoeken waar de leerlingen echt mee worstelen, en dan te proberen een lesactiviteit te ontwerpen, iets dat hen meer oefening geeft, om er meer vertrouwd mee te raken. Mijn grote ding zijn chromosomen, deels omdat ik aan het einde van een genetica-cursus kwam en de studenten nog steeds niet echt het verschil begrepen tussen homologen en zusterchromatiden. We pakken dat echt aan en komen er vanuit veel verschillende richtingen op af. We gebruiken bijvoorbeeld pijpreinigers en kralen, zwembadnoedels en vingers om chromosomen te modelleren, met als doel een blijvende herinnering te vormen in plaats van een tijdelijke.Ik laat studenten ook in groepen werken - ze brengen verschillende perspectieven met zich mee en kunnen concepten anders uitleggen dan ik zou doen, op een manier die zou kunnen resoneren met andere studenten.

Hoe ziet u, bijna een jaar na de nieuwe regering, de vooruitzichten voor wetenschap, en in het bijzonder fundamenteel onderzoek, in de VS?

Ik denk dat wetenschappers bang zijn - hoeveel schade zal er optreden in de loop van de termijn van vier jaar van Trump? Trump en de Republikeinen dumpen de wetenschap. Ze stelden bijvoorbeeld een belastingwet voor die afgestudeerde studenten zou belasten op het collegegeld en de kosten die hun universiteiten namens hen betalen, wat verwoestend zou zijn geweest. Afgestudeerde studenten komen financieel nauwelijks rond en die rekening zou voor hen een enorme financiële klap zijn geweest. Gelukkig werd de voorgestelde belasting op collegegeld en collegegeld voor afgestudeerden niet aangenomen. Een lichtpuntje is dat de huidige politieke situatie in de VS veel mensen ertoe aanzet proactiever te zijn en zoveel mogelijk te doen om zich tegen slechte wetgeving te verzetten. Maar we vragen ons allemaal af wat vier jaar Trump-regering met de wetenschap zal doen. Ik en mijn collega's maken zich grote zorgen!

U bent onlangs als redacteur bij Development gekomen, nadat u voor het eerst bij ons publiceerde in 1986. Wat hoopt u in uw nieuwe functie te bereiken en waar ziet u de toekomst van het tijdschrift?

Ik ben erg enthousiast dat ik aan deze functie ben begonnen. Geraldine Seydoux, mijn zeer gewaardeerde collega, trad af en vroeg of ik wilde inspringen, aangezien we expertise hebben op veel van dezelfde gebieden. Ik was bereid en enthousiast om het te doen, omdat ik mijn rol wil spelen om ervoor te zorgen dat er in Development nog steeds kwalitatief hoogwaardige artikelen worden gepubliceerd - terwijl tijdschriften zich haasten om artikelen te werven, wil ik niet dat de lat lager wordt gelegd. Nu ik al een paar maanden bezig ben, leer ik veel van het kijken naar de vroege versies van artikelen, het selecteren van recensenten en het lezen van recensies. Naarmate ik een beter gevoel voor het tijdschrift krijg, kan ik een bijdrage leveren om erachter te komen wat er in de toekomst voor ontwikkeling staat – waar moeten we heen? Zoals ik al zei, denk ik dat epigenetica een fascinerend en snel evoluerend onderwerp is op het gebied van ontwikkeling, en er is veel verbazingwekkende technologie die ons begrip bevordert. Met single-cell RNA-sequencing kunnen we bijvoorbeeld genexpressie analyseren in afzonderlijke cellen in plaats van populaties van cellen. Single-cell sequencing opent een hele grens waarvan ik denk dat we de komende jaren, zo niet decennia, zullen mijnen. Daarnaast is er verbazingwekkende beeldvorming, zoals microscopie met superresolutie, die wordt toegepast om vragen op nieuwe en informatieve manieren te beantwoorden. Ik ben verheugd om met Development samen te werken om erachter te komen waar ik heen moet.

Heb je advies voor jonge wetenschappers die denken aan een carrière in het onderzoek?

Ik heb twee kinderen die allebei zeiden dat ze niet zouden doen wat mama en papa doen (mijn man is ook een onderzoeker), en die vervolgens een diploma behaalden in vrijwel wat mama en papa doen, en toen besloten dat ze dat wilden doen. naar de middelbare school gaan. Papa en mama adviseerden hen om twee jaar technicus te zijn om ervoor te zorgen dat fulltime onderzoek is wat ze graag doen en dat ze het temperament hebben om de ups en downs te doorstaan. Beiden volgden ons advies op en solliciteerden na een fulltime onderzoek naar de graduate school. Dat zou mijn eerste advies zijn: proef intensief onderzoek voordat je de sprong naar een PhD-programma maakt.

Ik zou ook nieuwe studenten aanraden om je passie te volgen – een graduate training kan spannend, opwindend en stimulerend zijn, maar het kan ook vermoeiend zijn, en als studenten geen succes ervaren, kan dat ontmoedigend en teleurstellend zijn. Je moet de ups en downs kunnen doorstaan ​​- de ups en je fascinatie voor je project moeten je op de been houden. Ik denk dat het cruciaal is om een ​​goede mentor, een goed laboratorium en een systeem te kiezen waarin je lessen leert, en ik denk niet dat het systeem het systeem hoeft te zijn waaraan je op lange termijn wilt werken. We hebben studenten die binnenkomen en zeggen: 'Ik wil aan XYZ werken' - ze hoeven niet per se hun afstudeerwerk aan XYZ te doen. Studenten moeten laboratoria kiezen waarin ze een goede training krijgen, waar zij en hun mentor geweldige vragen hebben geïdentificeerd om aan te pakken, waar ze op zijn minst enkele geavanceerde technologieën kunnen leren en waar ze klaar zullen zijn om verder te gaan naar wat ze decennialang willen studeren, hun XYZ-gebied.

Tot slot, is er iets dat de lezers van Development verrast zouden zijn om over u te weten te komen?

Ik heb niet het gevoel dat ik een deel van mijn leven heb dat bijzonder wild of verrassend is – ik heb niet al te veel buitenschoolse activiteiten ontwikkeld, omdat ik voornamelijk bezig werd gehouden en bevredigd door familie en wetenschap. Ik kom uit een familie van wetenschappers – getrouwd met één en met twee kinderen op het wetenschappelijke pad. Dat is niet zo verwonderlijk, aangezien wetenschappers elkaar vaak vinden en kinderen vaak in de voetsporen van hun ouders treden. Wat mensen misschien niet weten, is dat ik een aspirant-balletdanser was, zelfs tijdens mijn afstuderen, maar het was nooit serieus, alleen mijn uitlaatklep om iets fysieks en esthetisch aantrekkelijks te doen. Misschien is dat iets om na mijn pensionering weer op te pakken, hoewel ik niet denk dat ik terug wil gaan!


Invoering

De nucleaire envelop bestaat uit twee lipide dubbellagen. Het buitenmembraan is continu met het endoplasmatisch reticulum (ER) en is verbonden met het binnenmembraan door nucleaire poriecomplexen (NPC's), die moleculaire handel tussen het cytoplasma en de kern bemiddelen. De nucleaire lamina, een dynamische, vezelachtige structuur die zich onder het binnenste kernmembraan bevindt, bestaat uit A-type en B-type lamines. Lamines zijn intermediaire filamenteiwitten en hebben een gemeenschappelijke structuur, bestaande uit een klein N-terminaal bolvormig domein, een centraal spiraalvormig staafdomein van constante lengte en een bolvormig staartdomein van variabele grootte. Ze komen de kern binnen via NPC's en assembleren tot filamenten en dikkere vezels, waarbij de assemblage-demontagecyclus wordt gereguleerd door laminfosforylering. Lamines interageren rechtstreeks met chromatine en verschillende integrale membraaneiwitten, waaronder lamina-associated proteines (LAP's), emerine en de lamin B-receptor (Stuurman et al., 1998 Gruenbaum et al., 2001 Hutchison et al., 2001 Morris, 2001 Wilson et al. al., 2001).

De A-type lamines, A en C, worden geproduceerd uit alternatief gesplitste mRNA-producten van het gen op chromosoom 1q21.3, waarbij lamin C een kortere vorm van lamin A is (Lin en Worman, 1993). Het emerine-gen op chromosoom Xq28 (Bione et al., 1994) codeert voor een type II integraal membraaneiwit van 254 aminozuren dat aan het binnenste kernmembraan is verankerd door zijn hydrofobe C-terminale staart (Manilal et al., 1996 Nagano et al. ., 1996) en heeft een directe wisselwerking met laminaat A/C (Clements et al., 2000). Deze interactie omvat het globulaire staartgebied dat gemeenschappelijk is voor lamines A en C (Vaughan et al., 2001) en een centraal gebied (aminozuren 70-164) van het emerinemolecuul (Lee et al., 2001). Een soortgelijk gebied van emerine (aminozuren 107-175) is vereist voor de lokalisatie naar de nucleaire rand (Tsuchiya et al., 1999 Östlund et al., 1999), wat duidt op betrokkenheid van laminaat A/C, en dit werd bevestigd door de locatie van emerine in de ER in de laminaat A / C knock-out muis (Sullivan et al., 1999). Gedeeltelijke lokalisatie van emerine aan de nucleaire rand werd echter nog steeds waargenomen in sommige knock-out muizenweefsels, wat suggereert dat andere factoren dan lamin A/C een rol kunnen spelen (Sullivan et al., 1999).

De interactie tussen emerine en laminaat is van bijzonder belang omdat mutaties in beide eiwitten Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD) veroorzaken (Bione et al., 1994 Bonne et al., 1999). Bij X-gebonden EDMD resulteren de meeste emerine-mutaties in volledige afwezigheid van emerine-eiwit (Manilal et al., 1998), hoewel verminderde emerine-niveaus veroorzaakt door veranderde RNA-splitsing ook kunnen resulteren in EDMD (Holt et al., 2001b). Er zijn enkele missense-mutaties bekend en deze produceren emerines die gemakkelijker uit de kern kunnen worden geëxtraheerd (Fairley et al., 1999). Bij autosomaal dominante EDMD zijn de meeste mutaties mis-sense en gelijkmatig verspreid over de helixvormige staaf- en bolvormige staartdomeinen die gemeenschappelijk zijn voor lamines A en C. Het lijkt waarschijnlijk dat deze mutaties een dominant-negatief effect uitoefenen op de functie van de multisubunit laminfilamenten ( Morris, 2001). Beide vormen van EDMD hebben dezelfde klinische kenmerken van vroege gewrichtscontracturen, selectieve spierafbraak en hartgeleidingsdefecten, en ze zijn beide extreem variabel in ernst, wat suggereert dat in beide gevallen een specifieke functie van het emerin-lamin A/C-complex wordt aangetast. (Morris, 2001). Mutaties in laminaat A/C zijn ook verantwoordelijk voor één vorm van gedilateerde cardiomyopathie (CMD1A) (Fatkin et al., 1999) en voor een limb-girdle spierdystrofie met geleidingsdefecten (type 1B) (Muchir et al., 2000). Omdat deze twee ziekten fenotypisch nauw verwant zijn aan EDMD, is hun moleculaire pathogenese waarschijnlijk vergelijkbaar, met variabiliteit veroorzaakt door genetische achtergrond (Morris, 2001). Bij drie andere ziekten kunnen de moleculaire effecten van lamin A/C-mutaties anders zijn, omdat hun fenotypes behoorlijk verschillen van EDMD. Dit zijn Dunnigan-type familiale partiële lipodystrofie (FPLD) (Cao en Hegele, 2000 Shackleton et al., 2000), autosomaal recessieve Charcot-Marie-Tooth-stoornis type 2 (De Sandre-Giovannoli et al., 2002) en erfelijke mandibuloacrale dysplasie (Novelli et al., 2002). In deze gevallen kunnen de mutaties winst of verlies veroorzaken van specifieke laminaat-airco-functies die geen betrekking hebben op de emerine-interactie. In FPLD kan bijvoorbeeld de binding aan lamin A/C van een specifieke transcriptiefactor in vetweefsel worden beïnvloed (Lloyd et al., 2002).

Immunohistochemische analyse van wildtype muizenembryofibroblasten (MEF's) toonde aan dat emerine geconcentreerd was in de nucleaire envelop, terwijl MEF's van lamin-A-knockout (lmna -/-) muizen vertoonden een afname van emerine geassocieerd met de kernenvelop en een meer algemene distributie van emerine in het perifere ER. transfectie van lmna -/- MEF's met mens lamin A cDNA corrigeerde de lokalisatie van emerine naar de nucleaire envelop. Deze resultaten suggereerden dat A-type lamine-expressie vereist is voor de juiste lokalisatie van emerine (Sullivan et al., 1999). In een recentere studie, lmna -/- MEF's werden getransfecteerd met drie lamin A cDNA's die pathogene mis-sense-mutaties bevatten (Raharjo et al., 2001). Wildtype lamin A en lamin A met een lipodystrofie-mutatie waren in staat om de lokalisatie van de nucleaire envelop van emerine te herstellen. Twee lamin A / C-mutanten die CMD1A veroorzaken en één die EDMD veroorzaakte, waren echter defect in het verplaatsen van emerine van het perifere ER naar de nucleaire rand (Raharjo et al., 2001). Een transfectie-onderzoek met een breder scala aan lamin A/C-mutanten (Östlund et al., 2001) toonde aan dat sommige EDMD- en cardiomyopathie-mutanten de vorming van nucleaire foci of aggregaten veroorzaakten en de assemblage van endogene lamines in HeLa en muizenmyoblast verstoorden cel lijnen.

In de huidige studie hebben we deze eerdere studies gevorderd door te transfecteren lmna -/- MEF's met een veel breder scala aan lamin A/C-mutanten, met bijzondere aandacht voor de effecten op de lokalisatie van emerine. Als resultaat kunnen we nu voor het eerst de biologische effecten van lamin A/C-mutaties rationaliseren met de bekende functies van verschillende domeinen in het lamin A/C-molecuul. In het nieuwe model beïnvloeden EDMD-mutaties in het bolvormige staartdomein rechtstreeks de interactie van emerine. Staafmutaties beïnvloeden de assemblage van de A-type lamina en we veronderstellen dat eventuele effecten op de lokalisatie van emerine aan de nucleaire rand hier indirect het gevolg van zijn.


2. Methoden:

Aanvullende tabel 1 bevat alle relevante informatie met betrekking tot de bron en identificatie van de antilichamen, reagentia, testen, enz. die in dit onderzoek zijn gebruikt.

2.1. Cellijnen en celcultuur

Een panel van acht NSCLC- en pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC) cellijnen met verschillende p53-status werd in deze studie gebruikt om een ​​grote subset van patiënten te dekken (zie tabel 2). De menselijke pancreascellijnen omvatten Mia-PaCa-2, Panc-1, Capan-2 en BxPC-3. De menselijke NSCLC-cellijnen omvatten NCI's 2013H1975, NCI's 2013H2228, NCI's 2013H596 en A549. Al deze cellijnen werden gekocht van de American Type Culture Collection, met uitzondering van Mia-PaCa-2 (DSMZ-Duitse verzameling van micro-organismen en celculturen).

Een extra mutant p53ꃎllijnpaneel werd gebruikt voor de meeste experimenten die in deze studie werden uitgevoerd en bestond uit de ouderlijke NSCLC NCI–H1299ꃎllen (homozygote gedeeltelijke p53-deletie, Null) en de isogene derivaten ervan die stabiel getransfecteerd waren om ofwel mutant p53 R175H tot expressie te brengen. of R273H-eiwit, volgens vastgestelde protocollen [30] (geleverd door prof. Dr. Haupt van het Peter MacCallum Cancer Center, Australië). Mutant p53 R175H en R273H brengen mutant p53 tot overexpressie in vergelijking met p53 Null-ouderlijn waarvoor geen eiwit werd gedetecteerd door Western-blotting. Mia-PaCa-2 en Panc-1 werden gekweekt in het vereiste medium, namelijk DMEM (Life Technologies) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS, Life Technologies), 1% penicilline/streptomycine (Life technologies) en 2 mM l - glutamine (Life-technologieën). Capan-2, BxPC-3, NCI'x02013H1975, NCI'x02013H2228, NCI'x02013H596 en de isogene NCI'x02013H1299'x000a0 cellijnen werden gekweekt in RPMI (Life Technologies) aangevuld zoals hierboven beschreven. Om verschillen in gevoeligheid voor AF als gevolg van variaties in seleniumconcentratie [31] uit te sluiten, werden alle experimenten uitgevoerd met dezelfde leverancier van FBS (Gibco, 10270-106) en drievoud van de RNA-sequencing, TrxR-activiteit, GSH-gehalte en Western blot validatie-experimenten op eiwitniveau (Fig. 3 A𠄾) werden uitgevoerd met dezelfde batch behandelde cellen en groeimedium. Cellen werden gekweekt als monolagen en in exponentiële groeifase gehouden in 5% CO2/95% lucht in een bevochtigde incubator bij 37 ଌ. Een afzonderlijke batch van de isogene mutante p53 NCI'x02013H1299'x000a0-cellijnen werd stabiel getransduceerd met het Incucyte'sx000ae NucLight Red Lentivirus-reagens met een puromycine-gen om celtracking op het IncuCyte ZOOM-systeem (Sartorius) mogelijk te maken. Alle cellijnen werden bevestigd als mycoplasma-vrij met behulp van de MycoAlert Mycoplasma Detection Kit.

Effect van AF op mRNA- en eiwitdoelen gerelateerd aan antioxidantmechanismen, ferroptose en DNA-schade. (EEN) TrxR-activiteit in μMol/Minute/mgEiwit na behandeling van de isogene NCI–H1299ꃎllijnen met een cytostatische (1 μM) en cytotoxische (5 μM) AF-concentratie gedurende zes en 24 uur. (B) Relatief GSH-eiwitgehalte na behandeling van de isogene NCI–H1299ꃎllen met een cytostatische (1 μM) en cytotoxische (5 μM) AF-concentratie gedurende zes en 24 uur, ten opzichte van onbehandeld. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. *p ≤਀.05 significante verschillen in vergelijking met onbehandelde controle. (C) Vindingrijkheid analyse van de aangetaste paden na behandeling met 1 μM AF gedurende 24 uur in de isogene NCI–H1299ꃎllijnen. Kleursleutellegenda vertegenwoordigt -log (p-waarde). (NS) Differentieel tot expressie gebrachte genen na AF-behandeling, in vergelijking met onbehandeld, in de isogene NCI–H1299 -cellijnen. Kleursleutellegenda vertegenwoordigt expressielogboek2 verhouding (rood = upregulatie groen =਍ownregulation). (E) Western blot werd gebruikt om de eiwitniveaus van NRF2, HMOX1, GPX4, SOD1 en Trx in de isogene NCI–H1299ꃎllen te bepalen na behandeling met 1 μM AF gedurende 24 uur van twee onafhankelijke replica's (REP1 en REP2). β-actine werd gebruikt als interne controle. Molecuulgewichten van de eiwitten worden weergegeven in kilodalton (kDa). (FG) Boxplot met γ H2AX-plekbezetting (F) en pRPA32 nucleaire intensiteit (G) berekend met behulp van een algoritme op Image J-software, in de isogene NCI–H1299ꃎllijnen die 24 uur lang zijn behandeld met PBS, 1 μM en 2 μM AF. Representatieve afbeeldingen worden weergegeven in aanvullende figuur 8. Boxgrenzen vertegenwoordigen de bovenste en onderste kwartielen en de zwarte lijn binnenin vertegenwoordigt de mediaan. De snorharen geven het 95%-betrouwbaarheidsinterval weer, terwijl de stippen buiten de snorharen uitbijters vertegenwoordigen. Experimenten werden ten minste in drievoud uitgevoerd. *p ≤਀.05, **p ≤਀.01, ***p ≤਀.001. (Voor interpretatie van de verwijzingen naar kleur in deze figuurlegenda wordt de lezer verwezen naar de webversie van dit artikel.)

2.2. NSCLC-patiëntencohort en weefselmonsters

Het onderzoekscohort bestond uit 72 patiënten met de diagnose stadium I-IV NSCLC-adenocarcinoom. Weefselmonsters van tumorresecties werden verkregen van de Tumorbank van het Universitair Ziekenhuis Antwerpen als in formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) specimens. Weefselmonsters werden bereid zoals beschreven door Deben et al. [32,33]. De belangrijkste klinische en pathologische parameters van de patiënten zijn samengevat in Suppl. Tabel 3. De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Ziekenhuis Antwerpen (referentienummer 17/30/339).

2.3. Immunohistochemie

Van FFPE-monsters werden vijf m-dikke coupes gemaakt. Secties werden onderworpen aan warmte-geïnduceerde antigeenwinning door incubatie in een buffer met lage pH (anti-TrxR) en een buffer met hoge pH (anti-p53) gedurende 20 minuten bij 97 ଌ (PT-Link) (DAKO). Vervolgens werd de endogene peroxidase-activiteit gedoofd door de objectglaasjes gedurende 5 minuten in peroxidase-blokkerende buffer (DAKO) te incuberen. Incubatie met primaire monoklonale antilichamen anti-p53 (klaar voor gebruik gedurende 30 minuten) en anti-TrxR (1:50 gedurende 40 minuten) werd uitgevoerd op een DAKO autostainer Link 48-instrument. Voor anti-TrxR en anti-p53 werd de Envision FLEX +ꃞtectiekit gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Secties werden tegengekleurd met hematoxyline, gedehydrateerd en gemonteerd. Positieve controles werden in elke kleuringsrun opgenomen en bestonden uit tonsilweefsel (anti-p53 en anti-TrxR) en A549 -cellen (anti-TrxR). De score werd uitgevoerd door twee onafhankelijke waarnemers, waaronder een ervaren patholoog. Om rekening te houden met de heterogeniteit van TrxR, werd een systeem voor het scoren van immunoreactiviteit (IRS) toegepast.Kleurintensiteit werd aangeduid als geen kleuring (0), zwakke (+), matige (++) en sterke kleuring (+++) en het percentage positieve tumorcellen werd gescoord van 1 tot 4 (㰐%, 10� %, 51�% en 㺀% van de tumorcellen gekleurd). Daarna werd de totale IRS berekend door vermenigvuldiging van deze twee parameters. Gevallen werden gegroepeerd in vier categorieën als TrxR-negatief (0, IRS 0), mild (1, IRS 1𠄳), matig (2, IRS 4𠄷) en sterk (3, IRS 8�) positief (Fig. 1C ). p53-eiwitaccumulatie werd gescoord als nul, wildtype of afwijkende overexpressie (suppl. Fig. 5).

Expressie van Trx-systeem bij NSCLC-patiënten. (EEN) Expressie van de thioredoxine-pathway-genen, thioredoxine (TXN), thioredoxine-reductase 1𠄲 (TXNRD1-2) en peroxiredoxine 1-6 (PRDX1-6) weergegeven als fragmenten per kilobase miljoen (FPKM). FPKM-waarden werden geëxtraheerd uit het LUAD-cohort van de kankergenoomatlas (TCGA) RNA-seq-dataset met behulp van de Human Protein Atlas. (B) Kaplan-Meier-overlevingscurven die de correlatie van TXN, TXNRD1-2 en PRDX4 en 6 genexpressie met de overleving van LUAD-patiënten. Curven werden uitgezet op basis van de beste grenswaarde voor expressie, d.w.z. de FPKM-waarde die een maximaal verschil oplevert met betrekking tot overleving met behulp van de Human Protein Atlas. Het aantal LUAD-patiënten met lage of hoge genexpressie werd tussen haakjes opgenomen. (C) Representatieve secties van NSCLC-tumormonsters geclassificeerd als negatief (IRS0), zwak (IRS1), matig (IRS2) en sterk (IRS3) TrxR-eiwitexpressie met behulp van immunohistochemische kleuring. (NS) Cirkeldiagram dat het percentage NSCLC-patiënten met IRS0 tot IRS3 voor TrxR-eiwitexpressie weergeeft. (E) Kaplan-Meier-overlevingscurves voor totale overleving (OS) en progressievrije overleving (PFS) op basis van IRS van TrxR-eiwit. Kruisen duiden gecensureerde gebeurtenissen aan waarbij het leven van een patiënt eindigde. Significantie werd bereikt toen p <਀.05 werd bepaald door de log-rangschikking. IRS: score voor immunoreactiviteit.

2.4. TCGA-database

Fragment per kilobase miljoen (FPKM) waarden werden geëxtraheerd uit 500 longadenocarcinoom (LUAD-cohort) patiënten van TCGA RNA-seq dataset met behulp van de Human Protein Atlas [34,35]. Kaplan-Meier-overlevingscurven werden uitgezet op basis van de beste grenswaarde voor expressie, d.w.z. de FPKM-waarde die een maximaal verschil oplevert met betrekking tot overleving met behulp van de Human Protein Atlas. Er werd een afkapwaarde van een log-rank p-waarde < 0,01 gebruikt.

2.5. Sulforhodamine B cytotoxiciteitstest

Een colometrische sulforhodamine B (SRB) test werd gebruikt om de door de behandeling geïnduceerde cytotoxiciteit van AF te meten. De optimale zaaidichtheid van elke cellijn voor elk plaattype werd bepaald om exponentiële groei gedurende de gehele duur van de test te verzekeren. De verschillende cellijnen werden uitgezaaid in platen met 96 putjes, overnacht geïncubeerd en gedurende 72 uur blootgesteld aan 0� μM AF. Celmonolagen werden vervolgens gefixeerd met 10% trichloorazijnzuur gedurende 1 uur bij 4 ଌ en gekleurd met 100  &x003bc L 0,1% SRB, zoals eerder beschreven [36]. de IC50 waarde (d.w.z. geneesmiddelconcentraties die 50% groeiremming veroorzaken) voor elke cellijn werd berekend met behulp van WinNolin® Software (Pharsight).

2.6. Western blotting

Cellen werden gezaaid bij 2,3 x 106 cellen in T175-kolven. De volgende dag werden cellen gedurende 24 uur behandeld met 1 μM AF, 5 μM AF of 0,06% DMSO. Deze batch cellen werd tijdens dit onderzoek in verschillende opstellingen gebruikt. Voor de op eiwit gebaseerde experimenten werden cellen gelyseerd in lysisbuffer (10 mM TrisHCl, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% NP40 en proteaseremmer). Na centrifugatie (10 min, 13򠀀 rpm, 4 ଌ), werden geklaarde lysaten die de geïsoleerde eiwitten bevatten geoogst en bewaard bij � ଌ. Eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van de Pierce BCA-eiwitkit, volgens de instructies van de fabrikant. Om basislijneiwitniveaus te bepalen, werden cellen verzameld na subkweken en gelyseerd zoals hierboven beschreven. Western-blot werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [37]. Blokkeren, primaire en secundaire antilichaamincubatie werden uitgevoerd met behulp van het SNAP id 2.0-eiwitdetectiesysteem, volgens de instructies van de fabrikant. Membranen werden geïncubeerd met de volgende antilichamen: anti-nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor 2 (NRF2, 1:2000), anti-p53 (1:1000), anti-glutathionperoxidase 4 (GPX4, 1:2000), anti-opgeloste stof dragerfamilie 7 lid 11 (SLC7A11, 1:1000), anti-TrxR1 (1:2000), anti-heem oxygenase-1 (HMOX1, 1:1000), anti-Trx (1:2000), anti-oxidatieve stress cocktail (catalase, superoxide dismutase 1 (SOD1), Trx en gladde spieractine, 1:350) en anti-β-actine (1:2500, interne controle). Geit-anti-konijn (1:10򠀀) of geit-anti-muis (1:10򠀀) fluorescent gelabelde secundaire antilichamen werden gebruikt. Fluorescerende detectie werd uitgevoerd met behulp van het Odyssey-beeldvormingssysteem (Li-Cor). Image Studio Lite-software (Li-Cor) werd gebruikt om pixelkwantificering van de afbeeldingen uit te voeren. Intra-run normalisatie tegen de interne actinecontrole werd voor elk monster uitgevoerd. Inter-replicate normalisatie voor elk eiwit van belang werd uitgevoerd op basis van het gemiddelde actine-genormaliseerde signaal voor elke blot.

2.7. ROS

Cellen werden uitgezaaid in platen met 96 putjes, overnacht geïncubeerd en blootgesteld aan 2'00a0'x003bcM AF of vehikel (fosfaatbufferzoutoplossing, PBS). Direct na de behandeling werd 2,5 μM CellROX Green-reagens aan de cellen toegevoegd. Daarna werd de plaat overgebracht naar de temperatuur- en CO2-gestuurde IncuCyte ZOOM (10X vergroting, Essen BioScience). ROS werd in de loop van de tijd gevolgd door foto's die om de vier uur werden genomen om fototoxiciteit te beperken. Voor analyse werd de gemiddelde groene gekalibreerde eenheid (GCU) uitgezet voor elke cellijn na 16 uur gedurende ten minste drie herhalingen.

2.8. Thioredoxine-reductase-activiteitstest

De batch van met vehikel en AF behandelde eiwitlysaten werd gebruikt om TrxR-activiteit te meten met behulp van de Thioredoxine Reductase Colorimetric Assay Kit, volgens de protocollen van de fabrikant. Absorptie werd geregistreerd bij 405 nm met een iMARK® microplaatabsorptielezer (Bio-Rad) gedurende de eerste 15 minuten van de reactie. TrxR-activiteit werd berekend met behulp van de formule van het protocol, waarbij achtergrondmetingen werden afgetrokken van alle waarden. Voor elke aandoening werd een gelijke hoeveelheid eiwit geladen, zoals bepaald door de Pierce BCA-eiwitkit.

2.9. Kwantificering van het glutathiongehalte

De batch met drager- en AF-behandelde cellen werd gebruikt om cellulaire concentraties van glutathion (GSH) te bepalen, gekwantificeerd met behulp van de GSH/GSSG-Glo™ Assay-kit, volgens de protocollen van de fabrikant. Daarom werd een gelijke hoeveelheid cellen (7500 cellen/putje) toegevoegd aan een witte plaat met 96 putjes in aanwezigheid van GSH-lysisreagens. De intensiteit van de luminescentie werd gemeten met een VICTOR'x02122 plaatlezer (PerkinElmer), die evenredig was met de hoeveelheid GSH.

2.10. RNA isolatie

Dezelfde batch van met drager en AF behandelde cellen werd verzameld en gepelleteerd om totaal RNA te isoleren met behulp van de RNA Plus Mini Kit, volgens de instructies van de fabrikant. De RNA-concentratie werd gecontroleerd met behulp van de Qubit RNA BR Assay Kit op Qubit 4 Fluorometer (ThermoFisher). De kwaliteit van de RNA-monsters werd bepaald met behulp van het Fragment Analyzer Automated CE System (Agilent, DNF-471 Standard Sensitivity RNA Analysis Kit) met de High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit. Er hoefden geen monsters te worden uitgesloten op basis van lage kwantiteit of kwaliteit.

2.11. 3’ mRNA-sequencing en gegevensverwerking

RNA-monsters werden geamplificeerd met behulp van de QuantSeq 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit FWD voor Illumina, volgens het protocol van de fabrikant voor lange fragmenten. De PCR Add-On kit voor Illumina (Lexogen GmbH, 020.96) is opgenomen om het optimale aantal PCR-cycli te bepalen. Na kwantitatieve (Qubit dsDNA HS Assay Kit) en kwalitatieve analyse werden de resulterende cDNA-bibliotheken equimolair samengevoegd. Sequentiebepaling werd uitgevoerd op een NextSeq 500 (Illumina) met behulp van een NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 cycli). RNA-sequentieanalyse werd gestart met behulp van het BlueBee-platform (www.bluebee.com). Eerst werden de vier FASTQ-bestanden per samples samengevoegd met behulp van de pijplijn 𠇋luebee FASTQ mergen (invoer: bestanden) 1.2.0”. Vervolgens werden de samengevoegde FASTQ-bestanden bijgesneden, werden de uitlezingen toegewezen aan het menselijke referentiegenoom build 38 en werd een kwaliteitscontrole uitgevoerd met behulp van de pijplijn 𠇏WD Human (GRCh38.77) Lexogen QuantSeq 2.2.3”. Vervolgens werd differentiële expressie-analyse uitgevoerd in R met het DESeq2 v1.28.1-pakket [38]. Transcriptoomprofielen werden functioneel geanalyseerd met behulp van vindingrijkheidsrouteanalyse (IPA) Core Analysis [39]. Voor de drie cellijnen werd een cut-off van de fold change van 0,5 en een cut-off van de p-waarde van 0,05 gebruikt. Vervolgens werd de kernanalyse van elke cellijn onderworpen aan een vergelijkingsanalyse op basis van -log (p-waarde) en activerings-z-score. Expressie log ratio-waarden werden geëxtraheerd uit aangetaste genen in de best gerangschikte routes en gepresenteerd in een heatmap. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) werd uitgevoerd op volledig genormaliseerde RNA-sequencinggegevens met behulp van het GSEA-softwarepakket [40], ontwikkeld door het Broad Institute (Maltham). GSEA werd uitgevoerd met de computationeel gegenereerde genenset-database die genen vertegenwoordigt die betrokken zijn bij epitheliale-mesenchymale overgang (EMT, standaardnaam: Hallmark_epithelial_mesenchymal_transition, systematische naam: M5930, Molecular Signature Database v7.1-database) [41]. Gensets met een false discovery rate (FDR) ≤ 0,05 en p-waarde ≤ 0,05 werden overwogen.

2.12. Immunocytochemie

Cellen werden uitgezaaid in een zwarte 㯌lear plaat met 96 putjes, en daarna behandeld met 1 μM en 2 μM AF gedurende 24 uur. Kweken werden gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT) gefixeerd in 2% paraformaldehyde (PFA). Vaste kweken werden gedurende 8 minuten gepermeabiliseerd met 0,3% Triton X-100 in PBS (0,1 M, pH 7,4), gevolgd door een uur incubatie met de primaire antilichamen tegen replicatiestress fosfo-RPA32 (pRPA32, 1:1000), DNA schade gamma-H2AX (γH2AX, 1:1000) en p53 (7F5, 1:600) bij kamertemperatuur in 50% FBS in PBS. Na wassen met PBS werden secundaire antilichamen GAR-Cy3 (1:400), GAM-488 (1:1000), Alexa Fluor 488 (1:400) gedurende één uur bij kamertemperatuur aan de respectieve primaire antilichamen toegevoegd. Ten slotte werd DAPI gedurende 20 minuten op de kweken aangebracht in een concentratie van 5 μg/mL. Beelden werden verkregen met een Nikon Ti-fluorescentiemicroscoop met behulp van een 20x droge lens (numerieke opening 0,75). Per putje werden 16 frames verkregen in drie kanalen (395, 470 en 555 mm excitatie). Beeldverwerking werd uitgevoerd in Fiji, een verpakte versie van ImageJ freeware [42]. Het aantal pRPA32- en γH2AX-spots werd gekwantificeerd met behulp van een eerder beschreven beeldanalysepijplijn (Cellblocks.ijm) [43]. In het kort, de analyse detecteert interessegebieden (ROI's) die overeenkomen met de volledige kernen in het gezichtsveld en detecteert vervolgens nucleaire vlekken per interessante marker en meet hun intensiteit en morfologische kenmerken. Kwantificering van p53 was gebaseerd op de meting van signaalintensiteiten binnen de nucleaire ROI's in het makerkanaal. Downstream data-analyse werd uitgevoerd in R studio.

2.13. Analyse van celdoodroutes

Met NucLight Red getransduceerd isogeen NCI'x02013H1299'x000a0cell-paneel werd uitgezaaid in een plaat met 96 putjes. De volgende dag werden de cellen gedurende 1 uur voorgeïncubeerd met de gewenste remmers van de celdoodroute (5 mM n-acetyl-cysteïne (NAC), 1 μM ferrostatine-1 (Fer1), 100 μM alfa-tocoferol ( α Toco), 10 μM Z-VAD-FMK en 10 μM necrostatin-s1 (Nec1s)) of 4 uur (100 μM Deferoxamine, DFO) en daarna behandeld met 2 & #x003bcM AF in aanwezigheid van het IncuCyte Cytotox Green-reagens (50'x000a0nM) of Caspase-3/7 Green Apoptosis-reagens (2.5'x000a0'x003bcM). Daarna werd de plaat overgebracht naar de temperatuur- en CO2-gecontroleerde IncuCyte ZOOM gedurende 72 uur. Celdood werd gevolgd door foto's (10X vergroting) die elke 24 uur werden genomen om fototoxiciteit te beperken. Voor analyse, aantal groene objecten (1/mm 2 ), aantal rode objecten (1/mm 2 ), groen-rode overlappende aantal objecten (1/mm 2 ) en Caspase-3/7 Groen GCU x μm 2 /image werden bepaald met de IncuCyte basisanalysator. Het percentage celdood en Caspase-3/7 positieve cellen werd berekend met de formule: G r e e n o b j e c t c o u n t R e d o b j e c t c o u n t + G r e e n o b j e c t c o u 02 n t &#x

2.14. Lipideperoxidatie

Cellulaire lipide ROS werd gemeten met behulp van de Image-iT™ Lipid Peroxidation Kit, volgens de instructies van de fabrikant. Daarom werd het isogene NCI–H1299ꃎll panel behandeld met 2 μM AF gedurende 48 uur of de positieve controle (cumeenhydroperoxide) gedurende 2 uur. Daarna werd 10 μM van de C11-BODIPY-kleurstof aan de kweek toegevoegd en gedurende 30 minuten bij 37 ଌ geïncubeerd. Acquisitie werd uitgevoerd op een CytoFLEX (BD) en FlowJo v10.1-software (TreeStar) werd gebruikt om de verhoudingen C11-BODIPY rood over groene gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) signalen te berekenen.

2.15. Analyse van ICD-gerelateerde DAMP's

Isogene NCI–H1299ꃎllen werden gezaaid en behandeld met 2 μM AF, maar analyse van ICD-gerelateerde markers vond plaats op verschillende tijdstippen. (i) Na 24 uur behandeling in celkweekmedia aangevuld met door warmte geïnactiveerd FBS, werd supernatant verzameld. Op het vers verzamelde supernatant werden extracellulaire ATP-niveaus (nmol) beoordeeld met het ENLITEN'x000ae ATP-assaysysteem, volgens het protocol van de fabrikant. Het bioluminescente signaal werd gemeten met behulp van een VICTOR™ plaatlezer (PerkinElmer). (ii) Na 48 uur behandeling werden de cellen geoogst en geïncubeerd met 5% normaal geitenserum. Na het wassen werden de cellen gekleurd op ecto-calreticuline (CALR)-expressie met behulp van een AF488-geconugeerd anti-humaan CALR-antilichaam (1:100). Voorafgaand aan analyse werden cellen gekleurd met Annexine V APC en propidiumjodide (PI) om onderscheid te maken tussen vroege apoptotische en necrotische cellen. Celresten en necrotische cellen (PI+) werden uitgesloten van analyse. Isotypecontrole (konijnen-IgG, 1:100) werd opgenomen om te corrigeren voor aspecifieke kleuring. Flowcytometrische gegevens werden verkregen op een BD Accuri™ C6-instrument (BD Biosciences) en geanalyseerd met behulp van FlowJo v10.1-software (TreeStar). (iii) Om de afgifte van groepsbox 1 met hoge mobiliteit (HMGB1, ng/mL) te bepalen, werd supernatant verzameld na 48 uur AF-behandeling, gecentrifugeerd en bewaard bij � ଌ. Er werd een enzymgekoppelde immunosorbent (ELISA)-test uitgevoerd, volgens het protocol van de fabrikant, en de absorptie werd gemeten met behulp van een iMARK™ plaatlezer (Bio-Rad).

2.16. In vitro generatie van menselijke monocyt-afgeleide DC's

Menselijke mononucleaire cellen van perifeer bloed (PBMC) werden geïsoleerd door middel van LymphoPrep-gradiëntscheiding (Sanbio) uit buffy coats van gezonde donoren (Rode Kruis-Vlaamse Bloeddienst, België). Vervolgens werden monocyten geïsoleerd uit deze PBMC's met behulp van CD14-microbeads, volgens het protocol van de fabrikant met een zuiverheid van 90% na isolatie. CD14+-cellen werden uitgeplaat met een dichtheid van 1,25𠄱.35 x 106 ꃎllen/ml in RPMI aangevuld met 2,5% humaan albumine, 800 E/ml granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor en 50 ng/ml interleukine ( IL)-4 op dag 0, zoals eerder beschreven [44]. Onrijpe DC's werden op dag vijf geoogst.

2.17. Rijpingsstatus van DC's

Na in vitro generatie van DC's, werden isogene NCI–H1299 -cellen op dag vier uitgezaaid in platen met 6 putjes en overnacht geïncubeerd. Op dag vijf werden tumorcellen gedurende zes uur behandeld met 2 μM AF. Daarna werden onrijpe DC's gelabeld met 2 μM cytoplasmatisch violet-fluorescerende CellTracker Violet BMQC-kleurstof in een concentratie van 106 ꃎllen per ml en in co-cultuur geplaatst met een effector (E) tot doel (T) verhouding van 1:1 (E:T). Na 48 uur in co-cultuur werd supernatant bewaard bij � ଌ voor toekomstige analyse en werden DC's onmiddellijk gebruikt voor flowcytometrische detectie van DC-rijpingmarkers op dag zeven. Binding van anti-CD86 PECy7 (1:25) en anti-major histocompatibiliteitscomplexen klasse II (MHC-II) FITC (1:50) werd gemeten op de violet + viable (Live/Dead Near IR+, 1: 50) DC-bevolking. Voor elke marker werd een isotypecontrole gebruikt om aspecifieke signalen af ​​te trekken. Resultaten worden weergegeven als ΔMFI = MFI-kleuring behandeld – MFI-isotype behandeld MFI-kleuring onbehandeld – MFI-isotype onbehandeld en als het percentage DC's dubbel positief voor MHC-II en CD86. Acquisitie werd uitgevoerd op een FACSAria II (BD Biosciences) en gegevensanalyse werd uitgevoerd met behulp van FlowJo v10.1-software (TreeStar).

2.18. Cytokine- en chemokine-secretieprofiel

Een multiplex elektrochemiluminescentietest op een SECTOR3000 (MesoScale Discovery) werd gebruikt voor de detectie van IL-6, tumornecrosefactor (TNF)-α en transformerende groeifactor (TGF)-β, zoals eerder beschreven [45]. Standaarden en monsters (supernatant verzameld uit NCI–H1299:DC co-culturen) werden in duplo gemeten en de test werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. Gegevensanalyse werd uitgevoerd met behulp van de MSD Discovery workbench 4.0-software.

2.19. Isolatie en stimulatie van NK-cellen

Gecryopreserveerde PBMC's werden ontdooid en overnacht geïncubeerd in compleet RPMI-medium met 5 μL DNase. Vervolgens werden primaire NK-cellen negatief geïsoleerd uit PBMC's met behulp van een NK-isolatiekit voor negatieve selectie, volgens de instructies van de fabrikant. De zuiverheid van de NK-cellen werd gemeten met anti-CD3 FITC (1:20) en anti-CD56 PE (1:20) en was meer dan 90%.NK-cellen werden in twee gelijke porties gesplitst: één om te stimuleren met 10&#ng/ml recombinant humaan IL-15, terwijl het andere deel ongestimuleerd werd gelaten. Beide condities werden overnacht geïncubeerd bij 37 ଌ en 5% CO2.

2.20. NK-cel-gemedieerde cytotoxiciteitstest

Met NucLight Red getransduceerde isogene NCI–H1299 -cellen werden uitgezaaid in een plaat met 96 putjes. Na incubatie gedurende de nacht werden geschikte omstandigheden gedurende 1 uur voorgeïncubeerd met 50 μM Z-VAD-FMK en vervolgens behandeld met een niet-toxische dosis van 0,55 μM AF in aanwezigheid van het IncuCyte Cytotox Green-reagens (50 & #x000a0nM) of Caspase-3/7 groene apoptosereagens (2,5 μM). Na 24 uur werden de AF-geprimede doelcellen samen gekweekt met (niet) gestimuleerde effector-NK-cellen in een E:T-verhouding van 5:1. Tumorcellen geïncubeerd zonder NK-cellen dienden als controles. De plaat werd vervolgens overgebracht naar de temperatuur- en CO2- gecontroleerde IncuCyte ZOOM gedurende 48 uur. Celdood werd gevolgd door foto's die elke 24 uur werden genomen om fototoxiciteit te beperken. Voor analyse, aantal groene objecten (1/mm 2 ), aantal rode objecten (1/mm 2 ), groen-rode overlappende aantal objecten (1/mm 2 ) en Caspase-3/7 Groen GCU x μm 2 /image werden bepaald met de IncuCyte ZOOM-analysator. NK-cellen werden uitgefilterd op basis van grootte. Het percentage tumorceldood werd berekend met de formule: G r e e n o b j e c t c o u n t R e d o b j e c t c o u n t + G r e e n o b j e c t c o u n t − O v p i t − O v p i t −

2.21. GZMA-afhankelijkheid en NK-celactivering

NCI–H1299ꃎllen werden uitgezaaid in platen met 24 putjes, overnacht geïncubeerd en behandeld met 0,55 μM AF. De NK-cellen werden geïsoleerd en gestimuleerd zoals eerder beschreven. Na 24 uur behandeling werden AF-geprimede tumorcellen samen gekweekt met de (on)gestimuleerde NK-cellen in een verhouding van 5:1਎:T. Anti-CD107a-FITC-antilichamen (1:50) werden toegevoegd na 30 minuten gezamenlijk kweken. Monensin (1:1000) werd toegevoegd na nog eens 30 minuten en de co-cultuur werd nog eens 4 uur voortgezet om intracellulaire cytokinekleuring te versterken. Na het wassen werden de cellen gekleurd met de volgende antilichamen: anti-CD45 APC-Cy7 (1:50), anti-CD3 PE-Cy7 (1:100), anti-CD56 PE-CF594 (1:25), anti-CD69 PerCP-Cy5.5 (1:100) en Live/Dead Fixable Aqua (1:50) gedurende 30 minuten bij 4 ଌ. Daarna werden co-culturen gefixeerd, permeabel gemaakt en gekleurd op intracellulaire cytokines met behulp van anti-GZMA PE (1:25) en anti-interferon γ (IFNγ) APC (1:12.5) met behulp van de FOXP3 Fix/Perm Buffer Set , volgens de instructies van de fabrikant. Acquisitie werd uitgevoerd op een FACSAria II (BD BioSciences). Het percentage NK-cellen dat positief was voor een bepaalde marker werd berekend met behulp van het overton-histogram-aftrekhulpmiddel in FlowJo v10.1-software (TreeStar), waarbij het controlehistogram (bijv. NK-cellen) werd afgetrokken van het monsterhistogram (bijv. AF + NK cellen in co-cultuur).

2.22. Statistieken

Alle experimenten werden ten minste in drievoud uitgevoerd. Alle statistische berekeningen zijn uitgevoerd met SPSS versie 26, tenzij anders vermeld, en significantie voor alle statistieken werd bereikt als p ≤਀.05. Prism 8.2.1-software (GraphPad) werd gebruikt voor gegevensvergelijking en grafische gegevensrepresentaties. De associaties tussen klinisch-pathologische parameters en TrxR- of Trx-eiwitexpressieniveaus werden onderzocht door middel van χ 2-analyse voor categorische variabelen. Verschillen in totale overleving (OS) en progressievrije overleving (PFS) tussen patiëntengroepen werden bepaald met Kaplan-Meier-analyse. Een multivariate Cox Proportional Hazard-model werd gebruikt om onafhankelijke prognostische markers te identificeren, weergegeven als een hazard ratio (HR) en het 95%-betrouwbaarheidsinterval (BI). De niet-parametrische Mann-Whitney U test werd gebruikt om gemiddelden tussen twee groepen te vergelijken (onbehandeld vs. AF-behandeld). Om gemiddelden tussen verschillende behandelingsgroepen te vergelijken (bijv. NK-cel-gemedieerde doding), werd de statistische significantie bepaald door een one-way ANOVA, gevolgd door Tukey's post hoc-test. Spearman-correlatiecoëfficiënten werden berekend om de correlatie tussen de verschillende antioxidantgerelateerde eiwitten, AF IC ., te onderzoeken50 waarden en p53-eiwitniveaus in verschillende NSCLC- en PDAC-cellijnen. Analyse van γ H2AX- en pRPA32-spots werd uitgevoerd met behulp van lineaire gemengde modellen, waarna de significantie werd bepaald met behulp van meerdere vergelijkingen van gemiddelden met Tukey-contrasten.


Referenties

Altenbach, S.B., Vensel, W.H., en Dupont, F.M. (2011). Het spectrum van alfa-amylase/proteaseremmergenen met laag molecuulgewicht, uitgedrukt in de Amerikaanse broodtarwecultivar Butte 86. BMC-res. Opmerkingen: 4:242. doi: 10.1186/1756-0500-4-242

Arora, L., en Narula, A. (2017). Genbewerking en gewasverbetering met behulp van het CRISPR-Cas9-systeem. Voorkant. Plantkunde. 8:1932. doi: 10.3389/fpls.2017.01932

Baker, K.E., en Parker, R. (2004). Onzin-gemedieerd mRNA-verval: het beëindigen van foutieve genexpressie. Curr. Opin. Cel Biol. 16, 293�. doi: 10.1016/j.ceb.2004.03.003

Baltes, N.J., en Voytas, D.F. (2015). Plantsynthetische biologie mogelijk maken door middel van genoomengineering. Trends Biotechnologie. 33, 120�. doi: 10.1016/j.tibtech.2014.11.008

Battais, F., Richard, C., Jacquenet, S., Denery-Papini, S., en Moneret-Vautrin, D.A. (2008). Tarwekorrelallergieën: een update over tarweallergenen. EUR. Ann. Allergie Clin. Immunol. 40, 67�.

Behm-Ansmant, I., Kashima, I., Rehwinkel, J., Sauliere, J., Wittkopp, N., en Izaur-ralde, E. (2007). mRNA-kwaliteitscontrole: een oude machine herkent en degradeert mRNA's met onzincodons. FEBS Lett. 581, 2845�. doi: 10.1016/j.febslet.2007.05.027

Bellinghausen, I., Weigmann, B., Zevallos, V., Maxeiner, J., Reiöx000DFig, S., Waisman, A., et al. (2019). Tarwe-amylase-trypsine-remmers verergeren intestinale en luchtweg allergische immuunresponsen bij gehumaniseerde muizen. J. Allergie Clin. Immunol. 143, 201�. doi: 10.1016/j.jaci.2018.02.041

Bhowmik, P., Ellison, E., Polley, B., Bollina, V., Kulkarni, M., Ghanbarnia, K., et al. (2018). Gerichte mutagenese in tarwemicrosporen met behulp van CRISPR/Cas9. Wetenschap. vertegenwoordiger. 8:6502. doi: 10.1038/s41598-018-24690-8

Brauer, E.K., Balcerzak, M., Rocheleau, H., Leung, W., Schernthaner, J., Subramaniam, R., et al. (2020). Genoombewerking van een deoxynivalenol-geïnduceerde transcriptiefactor verleent resistentie tegen fusarium graminearum in tarwe. Mol. Plant. Microbe. 33, 553�. doi: 10.1094/MPMI-11-19-0332-R

Brinkman, E.K., Chen, T., Amendola, M., en van Steensel, B. (2014). Eenvoudige kwantitatieve beoordeling van genoombewerking door ontleding van sequentiesporen. Nucleïnezuren Res. 42:e168. doi: 10.1093/nar/gku936

Cabanillas, B. (2019). Glutengerelateerde aandoeningen: coeliakie, tarweallergie en niet-coeliakie glutengevoeligheid. Kritiek. Rev. Voedselwetenschap. Nutr. 12, 1�. doi: 10.1080/10408398.2019.1651689

Camerlengo, F., Sestili, F., Silvestri, M., Colaprico, G., Margiotta, B., Ruggeri, R., et al. (2017). Productie en moleculaire karakterisering van broodtarwelijnen met verminderde hoeveelheid α-type gliadines. BMC Plant Biol. 17:248. doi: 10.1186/s12870-017-1211-3

Capocchi, A., Muccilli, V., Cunsolo, V., Saletti, R., Foti, S., en Fontanini, D. (2013). Een heterotetramere alfa-amylaseremmer van emmer (Triticum dicoccon Schrank) zaden. fytochemie 88, 6�. doi: 10.1016/j.phytochem.2012.12.010

Carbonero, P., en Garcéx000ECa-Olmedo, F.A. (1999). 𠇊 multigene familie van trypsine/a-amylaseremmers uit granen”, in Seed Proteins eds. PR Shewry en R. Casey (Springer, Dordrecht). doi: 10.1007/978-94-011-4431-5_26

Dupont, F.M., Vensel, W.H., Tanaka, C.K., Hurkman, W.J., en Altenbach, S.B. (2011). Ontcijferen van de complexiteit van het tarwebloem-proteoom met behulp van kwantitatieve tweedimensionale elektroforese, drie proteasen en tandem-massaspectrometrie. Proteoom Sci. 9:10. doi: 10.1186/1477-5956-9-10

Garcóx000EDa-Maroto, F., Carbonero, P., en Garcóx000EDa-Olmedo, F. (1991). Plaatsgerichte mutagenese en expressie in Escherichia coli van WMAI-1, een tarwemonomeerremmer van insecten-amylase. Plant Mol. Biol. 17, 1005�. doi: 10.1007/BF00037140

Garcóx000EDa-Maroto, F., Mara༚, C., Mena, M., Garcóx000EDa-Olmedo, F., en Carbonero, P. (1990). Klonering van cDNA en chromosomale locatie van genen die coderen voor de drie typen subeenheden van de tetramere tarweremmer van insecten-amylase. Plant Mol. Biol. 14, 845�. doi: 10.1007/BF00016517

Gil-Humanes, J., Wang, Y., Liang, Z., Shan, Q., Ozuna, CV, Sánchez-León, S., et al. (2017). Hoogrenderende gentargeting in hexaploïde tarwe met behulp van DNA-replicons en CRISPR/Cas9. Plant J. 89, 1251�. doi: 10.1111/tpj.13446

Gu, A., Hao, P., Lv, D., Zhen, S., Bian, Y., Ma, C., et al. (2015). Geïntegreerde proteoomanalyse van het tarwe-embryo en het endosperm onthult centrale metabole veranderingen die betrokken zijn bij de reactie op watertekort tijdens de graanontwikkeling. J. Agric. Voedsel. Chem. 63, 8478�. doi: 10.1021/acs.jafc.5b00575

Hamada, H., Liu, Y., Nagira, Y., Miki, R., Taoka, N., en Imai, R. (2018). Op biolistische levering gebaseerde transiënte CRISPR/Cas9-expressie maakt het mogelijk om het genoom van planten in tarwe te bewerken. Wetenschap. vertegenwoordiger 8:14422. doi: 10.1038/s41598-018-32714-6

Henggeler, J.C., Verx000EDssimo, M., en Ramos, F. (2017). Niet-coeliakie gluten gevoeligheid: een overzicht van de literatuur. Trends Voedselwetenschap. technologie. 66, 84�. doi: 10.1016/j.tifs.2017.05.018

Hofinger, B.J., Jing, H.C., Hammond, K.E., en Kanyuka, K. (2009). Hoge resolutie smeltanalyse van cDNA-afgeleide PCR-amplicons voor snelle en kosteneffectieve identificatie van nieuwe allelen in gerst. Theor. Toepasselijk Genet. 119, 851�. doi: 10.1007/s00122-009-1094-2

Howells, R.M., Craze, M., Bowden, S., en Wallington, E.J. (2018). Efficiënte generatie van stabiele, erfelijke genbewerkingen in tarwe met behulp van CRISPR/Cas9. BMC Plant Biol. 18:215. doi: 10.1186/s12870-018-1433-z

Jouanin, A., Schaart, J.G., Boyd, L.A., Cockram, J., Leigh, F.J., Bates, R., et al. (2019). Vooruitzichten voor patiënten met coeliakie: naar broodtarwe met hypoimmunogene gluten door genbewerking van α- en γ-gliadine-genfamilies. BMC Plant Biol. 19:333. doi: 10.1186/s12870-019-1889-5

Junker, Y., Zeissig, S., Kim, S.J., Barisani, D., Wieser, H., Leffler, D.A., et al. (2012). Tarwe-amylase-trypsineremmers stimuleren darmontsteking via activering van toll-like receptor 4. J. Exp. Med. 209, 2395�. doi: 10.1084/jem.20102660

Kalunke, R.M., Tundo, S., Sestili, F., Camerlengo, F., Lafiandra, D., Lupi, R., et al. (2020). Vermindering van allergeen potentieel in RNAi-transgene lijnen van broodtarwe tot zwijgen gebracht voor CM3-, CM16- en 0.28 ATI-genen. Voordruk. doi: 10.20944/preprints202007.0581.v1

Kim, D., Alptekin, B., en Budak, H. (2018). CRISPR/Cas9-genoombewerking in tarwe. Functie Integreren. genomisch. 18, 31�. doi: 10.1007/s10142-017-0572-x

Kruszka, K., Barneche, F., Guyot, R., Ailhas, J., Meneau, I., Schiffer, S., et al., (2003). Plant dicistronische tRNA-snoRNA-genen: een nieuwe manier van expressie van de kleine nucleolaire RNA's verwerkt door RNase Z. EMBO J. 22, 621�. doi: 10.1093/emboj/cdg040

Kumar, R., Kaur, A., Pandey, A., Mamrutha, H. M. en Singh, G. P. (2019). Op CRISPR gebaseerde genoombewerking in tarwe: een uitgebreid overzicht en toekomstperspectieven. Mol. Biol. vertegenwoordiger 46, 3557�. doi: 10.1007/s11033-019-04761-3

Kusaba-Nakayama, M., Ki, M., Kawada, E., Sato, M., Ikeda, I., Mochizuki, T., et al. (2001). Intestinale opneembaarheid van tarweallergenen, subeenheden van een tarwe-amylaseremmer, uitgedrukt door bacteriën. Biosc. Biotechnologie. Biochem. 65, 2448�. doi: 10.1271/bbb.65.2448

Li, C., Nguyen, V., Liu, J., Fu, W., Chen, C., Yu, K., et al. (2019). Mutagenese van zaadopslageiwitgenen in soja met behulp van CRISPR/Cas9. BMC-res. Opmerkingen: 12:176. doi: 10.1186/s13104-019-4207-2

Li, S., Zhang, X., Wang, W., Guo, X., Wu, Z., Du, W., et al. (2018). Uitbreiding van de reikwijdte van CRISPR/Cpf1-gemedieerde genoombewerking in rijst. Mol. Plant 11, 995�. doi: 10.1016/j.molp.2018.03.009

Liang, Z., Chen, K. en Gao, C. (2019). 𠇋iolistische levering van CRISPR/Cas9 met ribonucleoproteïnecomplex in tarwe”, in Genoombewerking van planten met CRISPR-systemen red. Y. Qi (New York, NY: Humana Press), 327�. doi: 10.1007/978-1-4939-8991-1_24

Maccaferri, M., Harris, N.S., Twardziok, S.O., Pasam, R.K., Gundlach, H., Spannagl, M., et al. (2019). Durumtarwe-genoom belicht eerdere domesticatiesignaturen en toekomstige verbeteringsdoelen. nat. Genet. 51, 885�. doi: 10.1038/s41588-019-0381-3

Mansueto, P., Soresi, M., Iacobucci, R., La Blasca, F., Romano, G., Dɺlcamo, A., et al. (2019). Niet-coeliakie-tarwegevoeligheid: een zoektocht naar de pathogenese van een zelfgerapporteerde aandoening. Italiaans. J. Med. 13, 15�. doi: 10.4081/itjm.2019.1070

Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., en Banan, M. (2019). Mozaïek in CRISPR/Cas9-gemedieerde genoombewerking. ontwikkelaar Biol. 445, 156�. doi: 10.1016/j.ydbio.2018.10.008

Pastorello, E.A., Farioli, L., Conti, A., Pravettoni, V., Bonomi, S., Iametti, S., et al. (2007). Door tarwe IgE-gemedieerde voedselallergie bij Europese patiënten: α-amylaseremmers, lipidenoverdrachtseiwitten en gluteninen met een laag molecuulgewicht. Int. Boog. Allergie Immunol. 144, 10�. doi: 10.1159/000102609

Phizicky, E.M., en Hopper, A.K. (2010). tRNA-biologie laadt naar voren. Genen Dev. 24, 1832�. doi: 10.1101/gad.1956510

Qi, W., Zhu, T., Tian, ​​Z., Li, C., Zhang, W., en Song, R. (2016). Hoogrenderende CRISPR/Cas9 multiplex genbewerking met behulp van de op glycine tRNA-verwerkingssysteem gebaseerde strategie in maïs. BMC Biotechnologie. 16:58. doi: 10.1186/s12896-016-0289-2

Qi, X., Dong, L., Liu, C., Mao, L., Liu, F., Zhang, X., et al. (2018). Systematische identificatie van endogene RNA-polymerase III-promotors voor efficiënte op RNA-gids gebaseerde genoombewerkingstechnologieën in maïs. J. Gewas Prod. 6, 314�. doi: 10.1016/j.cj.2018.02.005

Reig-Otero, Y., Manes, J., en Manyes, L. (2018). Amylase'x02013trypsineremmers in tarwe en andere granen als mogelijke activatoren van de effecten van niet-coeliakie glutengevoeligheid. J. Med. Voedsel 21, 207�. doi: 10.1089/jmf.2017.0018

Sánchez-León, S., Gil-Humanes, J., Ozuna, C.V., Giménez, M.J., Sousa, C., Voytas, D.F., et al. (2018). Glutenarme, niet-transgene tarwe ontwikkeld met CRISPR/Cas9. Plantaardige biotechnologie. J. 16, 902�. doi: 10.1111/pbi.12837

Scherf, K.A. (2019). Immunoreactieve graaneiwitten bij tarweallergie, niet-coeliakie gluten/tarwegevoeligheid (NCGS) en coeliakie. Curr. Opin. Eten Wetenschap. 25, 35�. doi: 10.1016/j.cofs.2019.02.003

Schiffer, S., Rösch, S., en Marchfelder, A. (2002). Een functie toekennen aan een geconserveerde groep eiwitten: de tRNA 3′-verwerkende enzymen. Embos. J. 21, 2769�. doi: 10.1093/emboj/21.11.2769

Schuppan, D., Pickert, G., Ashfaq-Khan, M., en Zevallos, V. (2015). Niet-coeliakie-tarwegevoeligheid: differentiële diagnose, triggers en implicaties. Het beste. Praktijk. Onderzoek clin. Gastro-enterol. 29, 469�. doi: 10.1016/j.bpg.2015.04.002

Shan, Q., Wang, Y., Li, J., en Gao, C. (2014). Genoombewerking in rijst en tarwe met behulp van het CRISPR/Cas-systeem. nat. Protoc. 9:2395. doi: 10.1038/nprot.2014.157

Shewry, PR (2009). Tarwe. J. Exp. Bot. 60, 1537�. doi: 10.1093/jxb/erp058

Shewry, PR (2019). Wat is gluten - waarom is het speciaal? Voorkant. Nutr. 6:101. doi: 10.3389/fnut.2019.00101

Sparks, C.A., en Jones, H.D. (2014). “Genetische transformatie van tarwe via deeltjesbombardement”, in Cereal Genomics: methoden en protocollen. Methoden in moleculaire biologie, eds R.J. Henry en A. Furtado (New York, NY: Humana Press), 201�. doi: 10.1007/978-1-62703-715-0_17

Svitashev, S., Young, J.K., Schwartz, C., Gao, H., Falco, S.C., en Cigan, A.M. (2015). Gerichte mutagenese, nauwkeurige genbewerking en plaatsspecifieke geninsertie in maïs met behulp van cas9 en gids-RNA. Planten Fysiol. 169, 931�. doi: 10.1104/pp.15.00793

Tan, Y. Y., Yu, X. M., Shu, Q. Y., Zhang, H.L., Wang, S.G., Yuan, F.J., et al. (2016). Ontwikkeling van een HRM-gebaseerd, veilig en high-throughput genotyperingssysteem voor twee lage fytinezuurmutaties in soja. Mol. Ras. 36:101. doi: 10.1007/s11032-016-0529-0

Tang, X., Zhong, Z., Ren, Q., Liu, B., en Zhang, Y. (2019). 𠇊 Single transcript CRISPR-cas9-systeem voor multiplex genoombewerking in planten”, in Genoombewerking van planten met CRISPR-systemen, red. Y. Qi (Humana Press, New York, NY), 75�. doi: 10.1007/978-1-4939-8991-1_6

Tatham, A.S., en Shewry, P.R. (2008). Allergenen voor tarwe en aanverwante granen. clin. Exp. Allergie 38, 1712�. doi: 10.1111/j.1365-2222.2008.03101.x

Tundo, S., Lupi, R., Lafond, M., Giardina, T., Larré, C., Denery-Papini, S., et al. (2018). Tarwe ATI CM3, CM16 en 0.28 allergenen geproduceerd in pichia pastoris vertonen een ander uitlokkend potentieel bij voedselallergie voor tarwe. Planten 7:101. doi: 10.3390/planten7040101

Wang, J.R., Wei, Y.M., Long, X.Y., Yan, Z.H., Nevo, E., Baum, B.R., et al. (2008). Moleculaire evolutie van dimere α-amylaseremmergenen in wilde emmertarwe en de ecologische associatie ervan. BMC Evol. Biol. 8:91. doi: 10.1186/1471-2148-8-91

Wang, W., Simmonds, J., Pan, Q., Davidson, D., He, F., Battal, A., et al. (2018). Genbewerking en mutagenese onthullen inter-cultivarverschillen en additiviteit in de bijdrage van TaGW2-homeologen aan korrelgrootte en gewicht in tarwe. theorie. app. Gen. 131, 2463�. doi: 10.1007/s00122-018-3166-7

Weichel, M., Glaser, A.G., Ballmer-Weber, B.K., Schmid-Grendelmeier, P., en Crameri, R. (2006). Tarwe- en maïsthioredoxines: een nieuwe kruisreactieve graanallergenenfamilie die verband houdt met bakkersastma. J. Allergie Clin. Immunol. 117, 676�. doi: 10.1016/j.jaci.2005.11.040

Xie, K., Minkenberg, B., en Yang, Y. (2015). Verbetering van de CRISPR/Cas9-multiplexbewerkingscapaciteit met het endogene tRNA-verwerkingssysteem. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS. 112, 3570�. doi: 10.1073/pnas.1420294112

Zapatero, L., Martinez, M.I., Alonso, E., Salcedo, G., Sánchez-Monge, R., Barber, D., et al. (2003). Orale anafylaxie van tarwebloem gerelateerd aan subeenheden CM3 en CM16 van tarwe-amylaseremmer: subeenheden van tarwe-amylaseremmer gerelateerd aan voedselallergie. Allergie 58, 956�. doi: 10.1034/j.1398-9995.2003.00158.x

Zevallos, V.F., Raker, V., Tenzer, S., Jimenez-Calvente, C., Ashfaq-Khan, M., Rüssel, N., et al. (2017). Nutritionele tarwe-amylase-trypsineremmers bevorderen darmontsteking via activering van myeloïde cellen. Gastro-enterologie 152, 1100�. doi: 10.1053/j.gastro.2016.12.006

Zhang, Y., Liang, Z., Zong, Y., Wang, Y., Liu, J., Chen, K., et al. (2016). Efficiënte en transgenvrije genoombewerking in tarwe door tijdelijke expressie van CRISPR/Cas9 DNA of RNA. nat. gemeenschappelijk 7:12617. doi: 10.1038/ncomms12617

Zhang, Z., Hua, L., Gupta, A., Tricoli, D., Edwards, KJ, Yang, B., et al. (2019). Ontwikkeling van een door Agrobacterium geleverd CRISPR/Cas9-systeem voor het bewerken van het tarwegenoom. Plantaardige biotechnologie. J. 17, 1623�. doi: 10.1111/pbi.13088

Zhu, C., Bortesi, L., Baysal, C., Twyman, R.M., Fischer, R., Capell, T., et al. (2017). Kenmerken van genome editing mutaties in graangewassen. Trends. Plant. wetenschap. 22, 38�. doi: 10.1016/j.tplants.2016.08.009

Zoccatelli, G., Sega, M., Bolla, M., Cecconi, D., Vaccino, P., Rizzi, C., et al. (2012). Expressie van α-amylaseremmers in diploïde Triticum soort. Voedsel Chemie. 135, 2643�. doi: 10.1016/j.foodchem.2012.06.123

Trefwoorden: CRISPR-Cas9, durumtarwe, multiplexbewerking, tRNA-verwerkingssysteem, ATI, GM-vrij, NCWS, tarweallergieën

Visum: Camerlengo F, Frittelli A, Sparks C, Doherty A, Martignago D, Larré C, Lupi R, Sestili F en Masci S (2020) CRISPR-Cas9 Multiplex Editing van de α-Amylase/Trypsine-remmergenen om Verminder allergeenproteïnen in durumtarwe. Voorkant. Aanhouden. Voedsel Syst. 4:104. doi: 10.3389/fsufs.2020.00104

Ontvangen: 23 maart 2020 Geaccepteerd: 11 juni 2020
Gepubliceerd: 31 juli 2020.

Jitendra Paul Khurana, Universiteit van Delhi, India

Ravinder K. Goyal, Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC), Canada
Mark Paul Running, Universiteit van Louisville, Verenigde Staten

Copyright © 2020 Camerlengo, Frittelli, Sparks, Doherty, Martignago, Larré, Lupi, Sestili en Masci. Dit is een open-access artikel dat wordt verspreid onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License (CC BY). Gebruik, verspreiding of reproductie in andere fora is toegestaan, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur(s) en de auteursrechthebbende(n) worden vermeld en dat de oorspronkelijke publicatie in dit tijdschrift wordt geciteerd, in overeenstemming met de aanvaarde academische praktijk. Geen enkel gebruik, verspreiding of reproductie is toegestaan ​​die niet in overeenstemming is met deze voorwaarden.

† Huidig ​​adres: Damiano Martignago, Departement Biowetenschappen, Universiteit van Milaan, Milaan, Italië