Informatie

Hoe randeffecten verminderen in celgebaseerde experimenten met hoge doorvoer?


In experimenten met hoge doorvoer waarbij cellen worden gekweekt, behandeld, gekleurd en afgebeeld in microplaten met 384 putjes, zie ik vaak significante randeffecten. De volgende grafiek toont bijvoorbeeld het aantal cellen (zoals gemeten door CellProfiler van afbeeldingen) voor elk putje op een dergelijke plaat:

Hoe kan ik deze effecten verminderen? Ik kan proberen ze statistisch te corrigeren, maar het zou zoveel leuker zijn om ze in de natte werkfase te verminderen.


Lundholt et al. beschrijf een heel eenvoudige truc: laat de platen een paar uur bij kamertemperatuur in de lucht liggen voordat ze in de incubator worden geplaatst. We hebben het uitgeprobeerd, en hoewel de kleurschalen in de volgende plots anders zijn, is het gemakkelijk te zien dat het echt helpt:

(Met dank aan Sigrun Gustafsdottir en Kate Madden voor het testen hiervan.)

Ik heb gezien dat sommige mensen de plaat "opvullen" door alleen de 308 binnenputten te gebruiken en de 76 randputten te vullen met alleen vloeistof, maar ik heb geen gegevens over hoe goed dat werkt.

Allison Tanner van Corning heeft een compendium van technieken verzameld om het optreden van onregelmatige patronen van celadhesie of "randeffect" in microtiterplaten te verminderen. Kort samengevat:

  1. Vermijd bellenvorming in de media bij het zaaien van cellen.
  2. Gebruik methoden voor het oogsten van cellen die een adequate vermenging van de cellen in de media bevorderen en volledige dissociatie van de monolaag in afzonderlijke cellen.
  3. Zaadcellen met een dichtheid die hechting en groei ondersteunt.
  4. Sta celhechting toe in media met de juiste formulering voor het specifieke celtype.
  5. Doseer cellen in een geschikt mediumvolume.
  6. Volg strikte aseptische technieken volgens gerespecteerde microbiologische praktijken.
  7. Culturen moeten routinematig worden gecontroleerd op mycoplasmale contaminatie.
  8. Minimaliseer de toegang tot couveuses om fluctuaties in de interne omgeving te helpen verminderen.
  9. Laat cellen in de microplaten bezinken terwijl de microplaten op het werkblad staan.
  10. Kweek cellen in een omgeving die de vorming van statische elektrische ladingen vermindert.

Randeffectdetectie voor realtime cellulaire analysator met behulp van statistische analyse

Yinghao Chen a , Shan Chen a , Tianhong Pan /> * a en Xiaobo Zou /> b
een school voor elektrische en informatietechnologie, Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu 212013, China. E-mail: [email protected] Tel: +86-15805298357b
b School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu 212013, China

Voor het eerst gepubliceerd op 11 april 2017

Realtime cellulaire analysers (RTCA) worden veel gebruikt om de cytotoxiciteit van chemicaliën te testen. Er zijn echter enkele oncontroleerbare factoren, die nadelig zijn voor de experimentele kwaliteit. Een van de fundamentele problemen is het randeffect. Abnormale tijdafhankelijke cellulaire responscurven (TCRC's) worden waargenomen wanneer de putjes zich aan de rand van de E-plaat bevinden. In dit artikel werd de Smirnov-test gebruikt om het randeffect te detecteren. De gemiddelde genormaliseerde celindex (NCI) van de negatieve controle die zich in de binnenste putjes bevond, werd als standaard genomen. Daarna werden alle TCRC's verdeeld in verschillende intervallen en werden hun overeenkomstige empirische distributiefuncties (EDF's) van de gemiddelde NCI en NCI aan de randputten berekend, en hypothesetesten werden gebruikt om de verschillen van de EDF's te bepalen. De experimentele resultaten evalueerden de prestaties van het voorgestelde algoritme. Dit raamwerk bood een systematische methode voor detectie van randeffecten.


Stabiliteitskamer voor microplaten

Indien geplaatst in een standaard of CO2 incubator, deze stabiliteitskamer werkt om de variaties van celgebaseerde testen die vaak worden ervaren in microwellplaten te verminderen. De kamer gebruikt de hitte en atmosfeer van de incubator om een ​​homogene micro-omgeving voor microwell-platen te creëren in plaats van de heterogene omgevingen die in traditionele incubators worden gecreëerd. Hoge vochtigheid in de kamer elimineert verdamping van de platen die het randeffect veroorzaakt. De dikke geanodiseerde aluminium plank verdeelt de warmte gelijkmatig over maximaal zes platen voor een uitstekende temperatuuruniformiteit. De kamer is voorzien van een ventilator aangedreven door een 120V of 230V omvormer.

De Microplate Stability Chamber is ontstaan ​​uit jarenlange frustratie over het werken met celcultuur in platen met 96 putjes. In ons laboratorium (zoals bij vele andere) werd gemakkelijk waargenomen dat de putjes aan de rand en vooral de hoekputten van platen allemaal gegevens genereerden die statistisch verschillend waren van de putjes die zich aan de binnenkant van de plaat bevonden. Door dit 'quotedge-effect' kunnen 26 van de 96 putten onbruikbaar worden. We besloten dit probleem op te lossen en begonnen met het onderzoeken van incubators en hoe ze cellen aantasten. We ontdekten dat alle incubators onvoldoende waren ontworpen om verdamping van de randputten te voorkomen en dat binnen een incubator de omstandigheden varieerden tussen planken en zelfs tussen locaties op dezelfde plank. Deze variatie binnen de kamer heeft direct invloed op de celcultuur voor celgebaseerde testen, soms meer dan een verdubbeling van de CV's van de testen. De kamer creëert ook stabiliteit voor algemene soorten weefselkweek.

De Microplate Stability Chamber pakt de tekortkomingen van incubators aan door een omgeving met een hoge luchtvochtigheid en temperatuur te creëren. Een zware aluminium plank met zes verzonken gebieden voor borden zorgt voor een gelijkmatige warmteverdeling over de kamer. Een ventilator blaast lucht over een waterreservoir dat vervolgens de atmosfeer verzadigt. Dit voorkomt verdamping en creëert een homogene temperatuur die vooral waardevol is bij het uitvoeren van celgebaseerde testen. Het deksel op de kamer is niet luchtdicht, waardoor gassen uit de incubator, zoals 5% kooldioxide, in de kamer kunnen diffunderen. Evenzo kan vochtigheid voor de kamer de algehele vochtigheid van de incubator verhogen.

Herstel van vocht in de kamer nadat het apparaat is geopend, is snel, vooral in vergelijking met de incubator. De volgende grafiek laat zien dat 90% relatieve vochtigheid kan worden bereikt binnen een minuut na het sluiten van de kamer, en bijna verzadigende relatieve vochtigheid in 2 minuten. De incubator alleen herstelt langzaam, terwijl een incubator met een kamer in ongeveer 10 minuten verzadiging bereikt.


Hoe randeffecten verminderen in celgebaseerde experimenten met hoge doorvoer? - Biologie

Bijdragen van auteurs-S. AW, MN en BAK formele analyse SAW, ND, ML, YZ, LG en BAK onderzoek SAW, ND, YZ, MP en BAK methodologie SAW schrijven-origineel concept DL en BAK middelen DL en MN software LG, MN, MP , en BAK schrijven-recensie en redactie MP en BAK conceptualisatie BAK datacuratie BAK supervisie BAK financiering acquisitie BAK visualisatie BAK projectadministratie.

Financiering en aanvullende informatie—Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grant R01MH119336 en door GlaxoSmithKline. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Belangenverstrengeling—De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben met de inhoud van dit artikel.


2 METHODEN

SbacHTS-software gebruikt Kriging-interpolatie om ruimtelijke ruispatronen te passen en ruis te corrigeren in screeninggegevens met hoge doorvoer. Voor elk afzonderlijk bord, bij well s, laten de waargenomen intensiteit zijn (bijv. uitlezing van de levensvatbaarheid van de cellen uit de put), die zowel signaal () en ruimtelijk gecorreleerde achtergrondruis (). Wij nemen aan komt uit een normale verdeling , waar is het gemiddelde effect van siRNA in put? s, en komt uit een multivariate Gauss-verdeling , waar . Hier, is een functie van de afstand tussen putplaten l en J, , met parameters , en modelleert de onafhankelijke witte Gauss-ruis. Met behulp van dit model kunnen we de ruimtelijke achtergrondruis schatten en het signaal op elke locatie s van de waargenomen waarde . De software exporteert de geschatte signalen als een datamatrix. Voor details over statistische gevolgtrekking en schatting van parameters, kan de lezer verwijzen naar Banerjee et al. (2003).


Materialen en methodes

Fabricage van microkanaalarrays

Microkanalen met kanaalafmetingen van 5,75 L × 0,75 W × 0,25 H (mm) en een volume 𢏁 μL werden vervaardigd in polydimethysiloxaan (PDMS) uit een SU-8-mastermatrijs met behulp van standaard meerlaagse rapid prototyping-technieken. 14 - 15 Microkanaalpoorten waren van hart tot hart op een afstand van 4,5 mm geplaatst om te voldoen aan een standaard met 384 putjes met een invoerpoortdiameter van 0,75 mm en een uitvoerpoortdiameter van 1,5 mm (verschil in grootte vergemakkelijkt passief pompen). Kanalen werden uit de mastermatrijs verwijderd, geautoclaveerd en in een OmniTray (Nunc) gelegd. De kanalen werden aanvankelijk via vacuümvulling gevuld met Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco). 1

Cel cultuur

Cellen werden vóór gebruik in de microkanalen in kolven gekweekt. Een normale muriene borstklierepitheelcellijn (NMuMG, ATCC) werd gehandhaafd in kweekmedium (CM): DMEM, met 10% foetaal runderserum (FBS) en 10 µg/ml insuline. Voorafgaand aan gebruik in de microkanalen werden de NMuMG's getrypsiniseerd, geteld, afgedraaid bij 1000 rpm gedurende 5 minuten (5417C, Eppendorf) en opnieuw gesuspendeerd tot een eindconcentratie van 1,7 miljoen cellen/ml (wat een celzaaiende oppervlaktedichtheid van 's opleverde. x0223c400 cellen/mm 2 ).

Vloeistofbehandeling

Voor elk experiment werden de volgende voorbereidingsstappen genomen. De ALH werd 20 minuten onder UV gesteriliseerd, terwijl de punt (roestvrij staal) en slang (gefluoreerd ethyleenpropyleen - niet-reactief en UV-bestendig) werden gespoeld met 70% EtOH voordat met levende cellen werd gewerkt. Een plaat met 96 putjes werd bereid met drie putjes die kweekmedium bevatten en twee putjes met celsuspensie (op de ALH gehouden via een microroerstaaf). 3 , 16 Een stijve cirkelvormige transparante film met een centraal gat voor de ALH-tip werd gebruikt als afdekking voor de microkanaalplaat om verdamping op de ALH te beperken.

Elke fluïdische manipulatie van de microkanalen werd uitgevoerd met een enkele pipet ALH (223 Sample Changer en 402 spuitpomp met een 250 μL spuit, Gilson). Fluïdische manipulaties zijn samengevat in figuur 2 . Voor het zaaien van cellen geeft de ALH eerst 4 μL kweekmedium af aan de uitgang van elk kanaal om te fungeren als een reservoirdruppel voor passief pompen. Dan resulteert de plaatsing, door de ALH, van een druppel celsuspensie van 2 μL aan de ingang van het kanaal in de vervanging van de kanaalinhoud via passief pompen – waardoor cellen worden gezaaid. 8 Ten slotte zuigt de ALH 2 μL uit de output om de druppelgrootte van de 4μ L-output te behouden. De microkanaalplaat werd vervolgens in een BioAssay-schaal (Corning) geplaatst die fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevat om verdamping en osmolariteitsverschuivingen te beperken en vervolgens bij 37 ° C met 5% CO2 geïncubeerd2 (CM werd elke 24 uur vervangen met behulp van de ALH).

Stroomdiagram dat de opeenvolging van robotmanipulaties tijdens het geheel van een experiment weergeeft.

Eindpuntkleuring werd ook uitgevoerd via de ALH. Het volgende is samengevat in figuur 2 . De duur van elke stap is � minuten. Cellen werden tweemaal gewassen met PBS, gefixeerd via 4% paraformaldehyde (PFA), gepermeabiliseerd via 0,1% TritonX-100, tweemaal gewassen met blokkerende buffer (BB, Licor), (waar antilichaamkleuring werd gedaan: overnacht geïncubeerd bij 4°C met primaire antilichaam, tweemaal gewassen met PBS en 60 minuten geïncubeerd met secundair antilichaam), tweemaal gewassen met diH2O, gekleurd met 1:500 verdunning TO-PRO-3 in 0,1% Tween-20 (Sigma) in PBS voor nucleaire vlek, en vervolgens tweemaal gewassen met diH2O. Voor alle kleuringsexperimenten werden 90 microkanalen gebruikt, waarvan 10 controles (geen cel en geen primair antilichaam).

De aangepaste methode die is ontworpen met behulp van het ALH-programma (Trilution 1.2, Gilson) heeft drie belangrijke parameters die een cruciale rol spelen bij de celgebaseerde analysekarakterisering in de microkanaalarray: 1) 𠇊ir gap”, 2) 𠇎xtra volume' x0201d, en 3) �ntal kanalen”. De eerste twee parameters, de 𠇊ir gap” (AG) en 𠇎xtra volume” (EV), zijn standaardvariabelen voor het afzien van dit systeem. Alvorens de te doseren oplossing te verkrijgen, zal de ALH een luchtspleet aanzuigen die de vloeistof scheidt (diH2O of EtOH) altijd in de buis van de te doseren oplossing (luchtspleet te groot: resulteert in onnauwkeurig pompen door compressie van de lucht en luchtspleet te klein: kan leiden tot vermenging tussen de oplossingen in de buis). Vervolgens zuigt de ALH vloeistof uit een put. Het opgezogen volume is het volume dat nodig is om een ​​bepaald volume een bepaald aantal keren plus een extra volume af te geven. Omdat de ALH-pomp een nauwkeurigheid heeft van ଐ,5%, zorgt het extra volume ervoor dat elke dosering de oplossing bevat. De derde parameter, een aangepaste variabele, is gemaakt, �ntal kanalen” (n), die bepaalt hoeveel kanalen opeenvolgend zullen worden behandeld vanuit één putaspiratie. Het gebruikte bereik was 1-15, waarbij voor een waarde van vijf (aangeduid als: x5), de ALH de luchtspleet zal opzuigen, uit de plaat met 96 putjes het volume zal opzuigen dat nodig is voor vijf kanalen plus het extra volume, zal doseren aan elk van de vijf kanaalingangen, ga onmiddellijk terug en zuig datzelfde volume op uit de uitgang van de vijf kanalen, en voer vervolgens een tipwassequentie uit (laat het volume/de lucht in de tip leeglopen en zuig/doseer 70% EtOH door de hele buis/tip). Het proces begint dan opnieuw voor de volgende vijf kanalen, totdat alle kanalen zijn behandeld. Deze volgorde minimaliseert celbezinking in de tip/buis, zorgt ervoor dat tijdens fixatie en kleuring elk kanaal gedurende dezelfde tijd is behandeld wanneer verschillende omstandigheden worden gebruikt, en minimaliseert diffusie van de output terug in het kanaal.

Data-acquisitie en analyse

Relatieve celaantalanalyse werd uitgevoerd met behulp van twee methoden, fasecontrastbeeldvorming en ICW IR-scanning. Fasecontrastbeelden vormden een standaard voor het vergelijken van de resultaten van de IR-gescande nucleaire intensiteit voor validatiedoeleinden. Over de lengte van het microkanaal werden drie beelden genomen met een vergroting van 10°x000d7. Een aangepaste ImageJ-macro is ontworpen om de reeks afbeeldingen voor elk microkanaal naadloos te naaien. Een tweede macro heeft elke afbeelding zo bijgesneden dat alleen het kanaalgebied overbleef. Er zijn twee methoden gebruikt om het aantal cellen per kanaal te kwantificeren, handmatig en geautomatiseerd. Handmatige celtellingen leverden het exacte aantal cellen per kanaal op. Deze tellingen werden verkregen uit de gestikte / bijgesneden afbeeldingen met hulp van een aangepaste ImageJ-macro die door de afbeeldingen loopt en een raster op elk tekent, vergelijkbaar met een hemacytometer. Geautomatiseerde celtelling werd ook gedaan met behulp van vaste cellen gekleurd met DAPI en een aangepaste ImageJ-macro. Geautomatiseerde celsamenvloeiingsmetingen werden genomen uit analyse van fasebeelden die zijn verwerkt met een aangepast MatLAB-entropiefilter om de gestikte / bijgesneden afbeeldingen te drempelen, waardoor het gebied dat door cellen wordt bedekt naar wit wordt omgezet en het gebied dat niet door cellen wordt ingenomen naar zwart. Een aangepaste ImageJ-macro werd vervolgens gebruikt om de samenvloeiing van de cellen te meten (het gebied dat door de cellen wordt bestreken, gedeeld door het totale gebied). Alle drie de analysemethoden (samenvloeiing, handmatige celtellingen en geautomatiseerde DAPI-kernentellingen) correleerden met elkaar wanneer ze genormaliseerd waren, daarom werden confluentiemetingen uitsluitend gebruikt in latere analyse voor de eenvoud.

ICW IR-scanning (Odyssey, LiCOR) biedt snelle geautomatiseerde analyse. 2, 17 - 18 Hier werd nucleaire kleuring met behulp van TO-PRO-3 (het 700-kanaal op de scanner) vergeleken met fasecontrastcelaantal en confluentiemetingen. Cellen werden ook gekleurd voor E-cadherine primair antilichaam (BD Biosciences) en een secundair antilichaam (Rockland Immunochemicals) voor het 800-kanaal op de scanner. Geen primaire antilichaamcontroles verschaften een basislijn voor niet-specifieke secundaire antilichaamkleuring. Er werden geen celcontroles gebruikt voor achtergrondaftrekking. Intensiteiten van de scannerkanalen werden afgetrokken van hun respectieve achtergrondniveaus. E-cadherine-intensiteit per microkanaal werd vervolgens gedeeld door nucleaire intensiteit voor dat microkanaal om een ​​relatief E-cadherine-niveau per cel te verkrijgen. Alle analyses zijn uitgevoerd over het gehele kanaalgebied.


Zeer reproduceerbare geautomatiseerde Proteomics-monstervoorbereiding op Biomek i-Series

Eiwitvertering en analyse door massaspectrometrie is een essentieel proces in tal van proteomische benaderingen zoals het ontdekken van biomarkers. De monstervoorbereiding kan echter vervelend en foutgevoelig zijn. Automatisering kan de last van monstervoorbereiding verlichten en tegelijkertijd de variabiliteit tussen gebruikers en tussen experimenten verminderen. We hebben eerder de automatisering van een proteomische monstervoorbereiding beschreven met behulp van een Biomek NXP Span-8 Workstation1,2. Hier laten we zien hoe deze workflow is gestroomlijnd en overgebracht naar het Biomek i7-werkstation (afbeeldingen 1 en 2).

Figuur 1. Biomek i7 hybride werkstation

Figuur 2. Proteomic-monstervoorbereidingsstappen worden beschreven (links) en de deklay-out van het i7 hybride werkstation

Zoals eerder beschreven in Fu et al (2017), gebruikten we plasmamonsters als het uitgangsmateriaal van de workflow. De workflow voor monstervoorbereiding omvatte denaturatie, reductie, cysteïneblokkering,
Trypsine spijsvertering en blussen (Figuur 2). De lengte van de oorspronkelijke Biomek NXP Span-8-workflow werd teruggebracht van 9 transfers naar 6 transfers door de combinatie van reagentia (Figuur 3). Wanneer
de reagentia voorbereiden De Guided Labware Setup van de Biomek Method Launcher berekent de reagensvolumes op basis van het monsternummer en geeft de instructies voor de voorbereiding van de reagens weer in een gebruiksvriendelijke grafische interface (Figuur 4). Overdrachten werden uitgevoerd met behulp van de verbeterde selectieve tippipetter van de Multichannel 96-kop. Dit biedt flexibiliteit om de monsterdoorvoer te verhogen zonder de tijd die nodig is om de overdrachten uit te voeren. Bovendien zijn de pipetteertechnieken voor de reagentia geoptimaliseerd voor de meerkanaalskop, die in de hele workflow werd gebruikt.

Figuur 3. Verbetering van de Biomek i7 hybird proteomics-workflow (A) in vergelijking met de Biomek NXp-workflow (B)

Figuur 4. Begeleide laboratoriumsetup met reagenslocaties en -volumes voor 24 monsters

Voorheen werden denaturatie- en trypsine-digestincubaties op het dek uitgevoerd op een schuddend Peltier-apparaat en werd de verdamping gecontroleerd door het gebruik van een Slit-plaatafdichting (BioChromato, VS) 1, 2. Voor optimale verwarming heeft de Peltier echter een adapter nodig specifiek voor een bepaald plaattype, en de gearceerde afdichtingen of de plaat zelf kunnen omhoog worden getrokken wanneer de plaat door alle 96 kanalen wordt bereikt bij afwezigheid van een klemmechanisme. In de huidige workflow zijn we overgestapt op een gesloten ondeck Incubator Shaker DWP (Inheco, Duitsland), waardoor er geen plaatafdichtingen meer nodig zijn en het systeem flexibeler is om met verschillende platen te werken.

Met behulp van deze verbeterde geautomatiseerde methode hebben we gerichte LC-MS/MS gebruikt om toegang te krijgen tot de reproduceerbaarheid en robuustheid van de proteomische monstervoorbereiding. Eerst hebben we de workflow uitgevoerd met behulp van kolom 1 en kolom 3 van de diepe putplaat om de mogelijke randeffecten te identificeren. (Figuur 5) toont de goede reproduceerbaarheid (10-20% CV) verkregen binnen en tussen kolommen, ongeacht de kolomlocatie. Vervolgens werd de gehele spijsverteringswerkstroom gedurende drie dagen elke dag geëvalueerd (Figuur 6). In alle drie de dagen zagen we een hoge reproduceerbaarheid, het gemiddelde totale %CV (i7 %CV + LCMS %CV) lag in het bereik van 10-20% en i7 %CV tussen 5-10%.

Figuur 5.Reproduceerbaarheid van Biomek i7 hybird proteomics monstervoorbereidingsworkflow tussen en binnen monsterputkolommen

Figuur 6. Meerdaagse precisie van de Biomek i7 hybride proteomics-monstervoorbereidingsworkflow

Samenvattend: demonstreer met succes de automatisering van een gestroomlijnde workflow voor eiwitvertering op het Biomek i7 hybride werkstation. Reproduceerbare kwantificering van peptiden werd waargenomen over monsterputjes, replica's en dagen, wat de brede toepasbaarheid van deze benadering aangeeft. De hoge dekcapaciteit van Biomek i7, het gebruik van apparaten op het dek en de selectieve tipfunctie van de meerkanaalskop geeft de flexibiliteit voor toepassingen met zowel lage als hoge doorvoer en verhoogt de efficiëntie van de vertering.


Grafisch abstract

Insecten vertrouwen op hun vermogen om vluchtige chemische verbindingen te detecteren om waardplanten en soortgenoten te vinden voor reproductie. Om deze vluchtige stoffen te detecteren, gebruiken insecten gespecialiseerde olfactorische sensorische neuronen die zijn ondergebracht in hun antennes die leden van de olfactorische receptor en ionotrope receptor multigenfamilies tot expressie brengen. Olfactorische receptoren zijn bestudeerd in een grote verscheidenheid aan insecten in een poging om hun aantal in een soort te schatten, de vluchtige verbindingen waarop ze reageren, en of ze specifiek zijn voor een klein aantal liganden of in het algemeen zijn 'afgestemd' op klassen van vluchtige verbindingen (Benton, 2006, Leal, 2013). Sequentietechnieken van de volgende generatie hebben het relatief eenvoudig gemaakt om OR's en andere reukgerelateerde genen van een interessant insect te identificeren (Bengtsson et al., 2012, Groβe-Wilde et al., 2011, Heliconius Genome Consortium, 2012, International Silkworm Genome Consortium, 2008, Poivet et al., 2013, You et al., 2013, Zhan et al., 2011), en er zijn experimentele systemen ontwikkeld waarin OR's tot expressie kunnen worden gebracht en getest op gevoeligheid voor verschillende liganden. Een in vivo systeem is ontwikkeld in Drosophila dat vereist het genereren van transgene vliegen die de OR tot expressie brengen in een specifiek 'leeg' neuron voor daaropvolgende elektrofysiologische karakterisering (Dobritsa et al., 2003, Ha en Smith, 2006, Hallem et al., 2004). Hoewel dit systeem is gebruikt om veel dipteran OR's functioneel te karakteriseren, is aangetoond dat maar weinig OR's van andere insectenorden functioneren in vliegenantennes (Montagne et al., 2012, Syed et al., 2006, Ueira-Vieira et al., 2014 ). Alternatief, in vitro expressiesystemen zijn ontwikkeld waardoor OR's van insecten zijn ontwennen, waaronder Sf9-cellen, Xenopus eicellen en HEK293-cellen (Groβe-Wilde et al., 2006, Kiely et al., 2007, Sakurai et al., 2004). Naast de identificatie van liganden bieden deze systemen de mogelijkheid om te screenen op verbindingen die de detectie van vluchtige stoffen op het receptorniveau beïnvloeden, door de receptor te remmen of te overstimuleren. De belangrijkste vereiste voor de identificatie van dergelijke verbindingen is een praktisch, robuust en consistent OK-assaysysteem met hoge doorvoer.

Sf9-cellen zijn een cellijn afgeleid van eierstokweefsel van de mot Spodoptera frugiperda. Deze cellijn is gebruikt om de OR-functie van verschillende soorten insecten te bestuderen (Anderson et al., 2009, Claudianos et al., 2014, Jordan et al., 2009, Kiely et al., 2007). Omdat is aangetoond dat Sf9-cellen een endogene OR-co-receptor (Orco) ortholoog tot expressie brengen (Smart et al., 2008), moet een plasmide dat alleen het OR-gen van belang bevat, in de cellijn worden getransfecteerd voordat de cellen worden geladen met een calciumgevoelige fluorofoor en het meten van reacties op verbindingen in individuele cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. De 'Xenopus oöcytensysteem, waarbij gebruik wordt gemaakt van eieren van de Afrikaanse klauwkikker, Xenopus laevis, is op grote schaal gebruikt om OK's uit te drukken voor functionele karakterisering (Leary et al., 2012, Liu et al., 2013, Mitsuno et al., 2008, Miura et al., 2009, Miura et al., 2010, Nakagawa et al. ., 2005, Sakurai et al., 2004, Wang et al., 2011, Wanner et al., 2010, Xu et al., 2012, Zhang en Löfstedt, 2013). In dit systeem worden oöcyten mede geïnjecteerd met cRNA dat codeert voor Orco en de OR van belang en later elektrofysiologisch gevolgd op ligand-geïnduceerde depolarisatie. Terwijl de Sf9-cel en Xenopus oöcytassays zijn waardevol gebleken voor het verwijderen van weesinsecten, ze hebben kenmerken die ze niet geschikt maken voor screening met hoge doorvoer. Sf9-cellen die met OR-genen zijn getransfecteerd, hebben bijvoorbeeld meestal een zeer laag aantal responsieve cellen in functionele tests die hun gebruik in op plaatlezer gebaseerde formaten uitsluiten. De Xenopus systeem vertrouwt op elektrofysiologische opnames van individuele kikkereieren, wat te tijdrovend is om als een echte screeningstest met hoge doorvoer te worden beschouwd, ondanks recente technologische vooruitgang in experimentele opstelling (Papke en Smith-Maxwell, 2009). Bovendien leveren beide systemen relatief hoge intra- en inter-assayvariatie van responsprofielen van OR's op liganden op, vermoedelijk vanwege de aard van hun voorbijgaande en heterogene expressie van recombinante eiwitten.

Human Embryonic Kidney 293 (HEK293)-cellen zijn een onsterfelijk gemaakte zoogdiercellijn (Graham et al., 1977) die vaak wordt gebruikt in de biotechnologische en farmaceutische industrie om receptor-ligand-interacties te bestuderen en om moleculen te identificeren die deze interacties kunnen beïnvloeden (Miller et al. , 2011). Inderdaad, HEK293-cellen werden gebruikt om de eerste OR's van nematoden (Wellerdieck et al., 1997), zebravissen (Wellerdieck et al., 1997), muizen (Krautwurst et al., 1998) en mensen (Wetzel et al., 1999). HEK293-cellen kunnen genetisch worden gemodificeerd om heterologe recombinante eiwitten stabiel tot expressie te brengen op een isogene en gereguleerde manier (Abu-Hamad et al., 2006, Jones et al., 2005). Het vermogen van HEK293-cellen om recombinante eiwitten stabiel en isogeen tot expressie te brengen en hun vermogen om te worden ingevroren en ontdooid, creëert een testsysteem met relatief lage intra- en inter-assayvariatie. Deze kenmerken, evenals andere celeigenschappen (d.w.z. groeisnelheid, hechting aan oppervlakken) maken HEK293-cellen een ideale high-throughput-optie voor het karakteriseren van OK's en voor het identificeren van nieuwe moleculen die OR-ligandinteracties kunnen beïnvloeden.

Menselijke embryonale niercellen werden voor het eerst gebruikt om OR's van insecten te karakteriseren in 2006 toen PR-genen van Bombyx mori werden getransfecteerd in een HEK293-cellijn die een Gα15-gen tot expressie brengt, waardoor OR-activering kan worden gedetecteerd met behulp van fluorescerende calciumgevoelige kleurstoffen en fluorescentiemicroscopen (Forstner et al., 2009, Groβe-Wilde et al., 2007, Groβe-Wilde et al., 2006). Meer recentelijk werd een gemodificeerde, in de handel verkrijgbare expressievector gebruikt om HEK293-cellijnen te genereren met stabiele en induceerbare expressie van insecten Orco en OR's. De gemodificeerde pcDNA™5/FRT-expressievector maakt de expressie mogelijk van twee genen van hetzelfde plasmide, wat theoretisch een isogene cellijn produceert met gelijke expressie van beide receptoren (Bohbot et al., 2011, Jones et al., 2011, Kumar et al. al., 2013, Pask et al., 2011, Pask et al., 2013b). Met behulp van dit systeem werd een plaatformaat met 384 putjes gebruikt om verbindingen te identificeren die de reacties van Orco op agonistische verbindingen beïnvloeden of remmen met fluorescente spectrofotometers met hoge doorvoer (Jones et al., 2012, Pask et al., 2013a, Rinker et al., 2012 ). Hoewel deze onderzoeken duidelijk hebben aangetoond dat HEK293-cellen kunnen worden gebruikt om OR's van insecten functioneel te karakteriseren in een formaat met hoge doorvoer, zijn er nog maar weinig gepubliceerde onderzoeken die het gebruik ervan beschrijven om de OR-functie van insecten te bestuderen. Hier kunnen verschillende factoren aan bijdragen, waaronder: 1) Er is geen gedetailleerde beschrijving gepubliceerd van een methode om HEK293-cellijnen te genereren die zijn geoptimaliseerd voor screening met hoge doorvoer van insecten-OR's. 2) De kritische component van het gepubliceerde systeem is een sterk gewijzigde versie van een in de handel verkrijgbare expressievector, die mogelijk niet verkrijgbaar of wenselijk is voor andere onderzoekers. 3) Huidig ​​onderzoek naar OR's voor insecten die dit systeem gebruiken, is gericht op het karakteriseren van OR's van diptera (Bohbot et al., 2011) en de identificatie van hulpmiddelen voor ongediertebestrijding die gericht zijn op Orco (Jones et al., 2011) de functionele karakterisering van OR's van andere insectenorden. het gebruik van HEK293-cellen in een op een plaatlezer gebaseerd formaat is nog niet aangetoond.

Hier demonstreren we het nut en de mogelijkheden van het gebruik van HEK293-cellen om insecten-OR's te bestuderen, en beschrijven we grondig de methoden die worden gebruikt om compatibele cellijnen met hoge doorvoer te genereren. Met behulp van een eerder gekarakteriseerde OK van de tuinbouwplaag Epiphyas postvittana (Jordan et al., 2009), onderzoeken we het vermogen van HEK293-cellen om de E. postvittana Orco en EposOR3 door western blot en confocale microscopie. Vervolgens testen we HEK293-cellijnen die EposOrco en EposOR3 tot expressie brengen op hun vermogen om te reageren op de insecten-Orco-agonist VUAA1 (Jones et al., 2011) en eerder geïdentificeerde EposOR3-agonisten (Jordan et al., 2009) met behulp van een calciumgevoelige fluorofoor in een plaatlezer-gebaseerd formaat.


4. Conclusies

We hebben het belang aangetoond van QC-statistieken en datavisualisatie per plaat bij het identificeren van systematische fouten in HTS-experimenten met een hoge hitrate. Onze resultaten laten zien dat een verspreide lay-out superieur is aan de lay-out op basis van het plaatsen van besturingselementen in de eerste en laatste kolom. Een zorgvuldige beoordeling van de impact van normalisatie is nodig, vooral wanneer de oorspronkelijke aannames over lage hitrates worden geschonden. Verder laten onze resultaten zien dat de Löss-fit methode beter presteert dan de B-scoremethode voor de meeste experimentscenario's, vooral wanneer het hitpercentage lager is dan 20%. We hebben vastgesteld dat de kwaliteit van gegevens van experimenten met platen met een slagingspercentage van meer dan 20% ernstig wordt aangetast door elke normalisatiemethode en kan leiden tot een groot aantal vals-positieve hits. De meeste normalisatiemethoden zijn ontworpen met de veronderstelling dat er maar weinig hits zijn en dat deze dun verdeeld zijn over de hele plaat (Murie et al., 2013). In het geval van medicijntesten met meerdere doses voor elk medicijn, worden platen echter vaak gemaakt van seriële verdunningen en daardoor zal de plaat met de hoogste concentratie medicijnen rijen en kolommen met veel hits bevatten. Gebruikelijke normalisatiemethoden voor het corrigeren van rij- en kolomeffecten zullen deze putjes op de plaat aanpassen, omdat ze worden gedetecteerd als binnen plaatartefacten. Onze gegevens wijzen op: BHet belangrijkste defect van de score is de aanname van een lage hitrate op elke rij en kolom voor alle platen. Om de te berekenen B-score worden de resulterende residuen binnen elke plaat gedeeld door hun mediane absolute afwijking als standaardisatiestap. De B-scoreberekening voor een bepaalde positie wordt daarom beïnvloed door een groot aantal treffers op de rij en kolom wanneer de mediaanpolijsting wordt uitgevoerd. Ook, B-score weegt niet mee voor lokale effecten die worden geïdentificeerd door verdeling van de hits die kunnen worden gevisualiseerd door oppervlakteaanpassing.

We postuleren dat de goede prestatie van de Löss-fit is omdat deze gebaseerd is op het aanpassen van een lokaal distributie-oppervlak in plaats van het aanpassen van effecten op basis van rij- en kolomsignaalintensiteiten. Het grote voordeel van de lokale procedure voor het aanbrengen van een glad oppervlak is dat het gebieden op een plaat ontdekt waar de signaalintensiteiten systematisch hoger of lager zijn en die zich in aangrenzende putjes op een plaat kunnen concentreren. We hebben vergelijkbare observaties met de ontwikkelaars van ChemBank-repository (Seiler et al., 2008) over de uitdagingen van het gebruik van de B-score op schermen met een hoge hitrate.

Samengevat zijn er op maat gemaakte benaderingen nodig voor HTS-experimenten met een hoge hit-rate en voor het testen van geneesmiddelen waarbij dosis-responscurves worden verkregen. HTS-onderzoeken en geautomatiseerde HTS-gegevensanalysesoftware die gebruikmaakt van een normalisatie- of schaalschema, moeten een optie bevatten om de kwaliteit van de onbewerkte gegevens vóór normalisatie te inspecteren en de gedetailleerde beschrijving van de gegevensverwerkingsprocedures die in de analyses worden gebruikt, te rapporteren. Door de pre- en post-normalisatie QC-resultaten voor alle HTS-drugtestexperimenten te rapporteren, zou de kwaliteit en reproduceerbaarheid van alle HTS-gegevens worden verbeterd.


 Belangrijkste diensten

NU-HTA provides researchers access to cutting edge technology for large scale screening and drug discovery.  Levels of service include the full range from walk-up instrument use to fully supported projects.

Selected services include:

  • Macromolecular binding, biochemical, and cell-based assays
  • High content screening with widefield or confocal optics
  • Nanoliter liquid handling up to 1536-well density
  • Whole-plate kinetic assays (ion currents, GPCR signaling)
  • Compound library screening
  • CRISPR/Cas9 screening (multiplexed libraries)
  • Analysis of large data sets
  • Fluorescence Thermal Shift assay (measures protein melting)
  • Complex liquid handling work flows

 Apparatuur

  • Perkin Elmer Enspire Multimode Plate Reader
  • Molecular Devices ImageXpress High Content Imager
  • BioRad IQ5 Real-Time PCR Detection System
  • BioRad CFX384 Real-Time PCR Detection System
  • Molecular Devices FLIPRtetra
  • Biotek Synergy 4 Microplate Reader
  • Tecan Infinite M1000 Microplate Reader
  • Echo 550, Acoustic Liquid Transfer System
  • Tecan Fluent Liquid Handling system
  • Formulatrix Mantis Liquid Dispenser
  • TTP Labtech Mosquito Crystal
  • Integra ViaFILL Automated Dispenser
  • Tecan HydroSpeed Plate Washers

 Erkenning

All manuscripts and grants presenting work supported by this core should include the following acknowledgement:

"This work was supported by the NorthwesternUniversity High Throughput Analysis Laboratory."


GEN Roundup: Context-Enriched Cell-Based Assays

Cells are miniature laboratories that allow scientists to study key biological processes. As a result, they may provide a more natural way to assess the in vivo effects of drugs. According to MarketsandMarkets, the global cell-based assays market is expected to reach over $18 billion by 2020, from almost $11 billion in 2015.

GEN wanted to know about some of the challenges associated with the use of cell-based assays in high-throughput drug discovery and why these types of assays might be especially appropriate for precision medicine. So we decided to talk to some experts on the topic.

GEN: What are some of the challenges of using cell-based assays in high-throughput drug discovery, and how can these challenges be addressed?

Dr. Ferrick: Cell-based assays are considered a critical component of the golden era of drug discovery. With a return to the relevancy of living cells, also comes the fear of “black box” science, potentially leading to drugs that may not be fully adjudicated for efficacy and safety. Fortunately, today’s biological toolbox enables the better measurement and replication of human disease characteristics in the laboratory.

Cell-based assays are now able to measure and monitor multiple cellular pathways in real time, incorporate the preferred biological context for screening, and report phenotypic changes more reliably and with improved insight. Additionally, 3D cell cultures, microtissues, embryonic stem cell-derived cultures, and induced pluripotent stem cell-derived cultures are now able to better mimic the cell phenotype and microenvironment at the appropriate throughput levels.

Dr. Held: In cell-based assays, it is frequently necessary to control for environmental factors such as temperature, humidity, and gas composition (CO2 en O2) in order to maintain relevant physiological conditions. Also, assays can be lengthy, lasting days rather than hours, necessitating media exchanges or reagent additions at timed intervals. During these operations, assays must be kept free of bacterial contamination.

Such challenges have been addressed primarily with instrumentation and automation. Incubators, which maintain environmental conditions, can have built-in robotics to move microplates to and from liquid handlers and reader/imager devices to automate lengthy assay processes. Reagent additions or media exchanges are performed with liquid handlers, whereas detection (image based or quantitative) is carried out with a microplate reader. These systems are small enough to fit inside HEPA-filtered biosafety cabinets.

Dr. Stump: Cell-based assays enable one or more target-specific measurements amidst thousands of interdependent chemical reactions occurring inside each cell. The end goal is to identify a lead candidate based on a physiologically relevant response. To accomplish this goal, assay design (including the choice of a model system, endpoints specific to the drug target, protocols, and reagents) must be robust. Thus, methods beyond 2D cell culture may be the answer, but they drastically increase the complexity of the assay.

Adequate dynamic range of the assay is also a key challenge since nanomolar inhibitors require at least femtomolar detection for accurate curve generation. Highly specific antibodies can address this issue by substantially increasing the signal-to-noise raio. These and other elements combined must yield a reproducible assay that can achieve the throughputs desired.

Dr. Charrier-Savournin: Immortalized cell lines have been extensively used since they are cost effective and easy to manipulate genetically. However, they are not representative of normal cells, so their use for screening assays becomes outdated. Closer to native pathophysiology are fully differentiated primary cells, cancer cells, embryonic stem cells, or induced pluripotent stem cells, but they are less available, more difficult to maintain and differentiate, and more costly.

Thus, cell-based assays need to adapt. They can become more sensitive, use less sample, or even work on endogenous expression while keeping the characteristic advantages of high-throughput screening, which include robustness, ease of use, and miniaturization. Highly sensitive detection technologies, such as homogeneous time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) assays, have evolved to combine both requirements and are now fit to measure endogenous events in a screening environment.

Ms. Gitschier: Cell-based assays provide a biologically relevant environment, are amenable to high-throughput screening, and do not require the complexity and risk of whole-organism testing. A major challenge of cell-based assays involves choosing an ideal assay to represent the system of interest, while maintaining consistency and reproducibility. Cell culture and plating techniques, the use of automation, and microplate selection can be optimized to reduce variability.

Specifically for high-throughput screening, evaporation and small-volume use are concerning. For these assays, microplate seals, low-evaporation lids, and specialty microplates are useful. Finally, having vendors of instruments and microplates work closely together as technologies advance to ensure compatibility can help alleviate challenges customers face when adopting a new assay to meet their high-throughput drug discovery needs.

Dr. Collins: To more closely mimic disease, researchers are increasingly faced with the need to develop cell-based assays that accurately reflect the environment of the human body. Scientists are studying 3D spheroids as a biologically relevant model that accurately replicates the in vivo environment. For example, variable aperture confocal technology on the IN Cell Analyzer 6000 is instrumental in optimally imaging these challenging samples.

Another difficulty in developing better biological models is preparing samples in a miniaturized format. A common solution is round-bottom plates, which require a robust autofocus algorithm for automated imaging.

Finally, studies of living biology are critical to understanding dynamic cellular events. Recent speed improvements on the IN Cell Analyzer 6000 enable acquisition of beating cardiomyocytes at 42 frames per second, accurately representing cardiac physiology.

Dr. Mohan: Most high-throughput screening (HTS) in drug development is based on cell-based and biochemical assays. Although cell-based assays are useful for target validation and ADMET, they are not free from challenges. One of the greatest challenges is to develop stable cell lines that express reasonable quantities of target proteins. Another challenge is the decline in the expression level with each passage, which adds difficulty in data interpretation.

Immortalized cell lines, such as HEK293 and cancer cell lines, are widely used, but they can harbor mutations. They may not give true results, that is, results consistent with those obtained with primary native cells. Some of the challenges can be overcome by the use of 3D cell cultures, which emulate in vivo morphology as well as cell-cell and cell-extracellular matrix interactions.

Dr. Chandy: Some of the challenges in using cell-based assays are choosing a cell model that allows throughput and standardizing image analysis and interpretation for complex assays, such as time-lapse or 3D objects. In particular, imaging of 3D models may better predict reactions of or more closely mimic the in vivo environment. Previously, using live cell assays where 3D acquisition was required forced researchers to compromise between resolution and phototoxicity during z-sectioning.

Modern systems, such as the ImageXpress ® Micro Confocal system, enable high-resolution screening at the speed of widefield imaging through advanced illumination techniques and optics. Integrated software packages, such as MetaXpress software, allow for multiple cell types, substrates, or cell behaviors to be automatically characterized at once, reducing variability across experiments.

Dr. Khimani: Although cell-based assays offer physiologically relevant systems for drug discovery, they traditionally provide output in just one dimension. Such output may miss effects such as molecular, morphological, and other phenotypic changes that could challenge further development of a drug candidate.

Instead, cell-based strategies including multiparametric and multianalyte readouts at the subpopulation- or the single-cell level should be considered. Multimode and multianalyte analysis tools that detect changes in a spatial context are critical in determining both the efficacy and toxicity of a drug candidate as well as better downstream outcomes. Furthermore, current advances and continued development and integration of 3D cellular models, simultaneous detection, imaging, and data analysis capabilities will further enable high-content drug discovery.

Dr. Riss: In general, the biology of the high-throughput assay system contributes more to variability than the chemistry of the detection reagents. Perhaps the biggest challenge for cell-based high-throughput screening is having uniform samples of cells in assay wells at the time the measurements are made. Variability in dispensing and culturing small numbers of cells in low-volume plates often leads to edge effects that result in variability among replicate samples.

One way to address variability is to multiplex assays to include controls to normalize data to the total or viable number of cells in the sample.

Dr. Horton: As our understanding of complex cellular systems evolves, there is a driving force to move to more predictive cellular models for drug discovery. What was incomprehensible from a bioinformatics and screening perspective just five years ago is quickly becoming the new screening norm. Traditional workhorse cell models (such as HEK293 and CHO-K1) are taking a back seat to more complex 3D cellular systems and patient-derived disease models.

The challenge to reagent suppliers is to identify and develop robust assays readouts that will function in a range of cellular backgrounds and environments while still providing physiologically relevant information. Vast improvements to high-content systems and data analysis are enabling scientists to extract a higher density of information about the cellular response to ultimately drive better decisions during drug discovery.


GEN: Why are cell-based assays especially appropriate for precision medicine?

Dr. Ferrick: Precision medicine will work most effectively if researchers can “bucket” individuals into treatable groups, as opposed to determining the unique molecular inventory of each individual. With credible evidence suggesting that there may be significant numbers of molecular pathways that lead to the same disease phenotype, researchers can now potentially identify a common intervention intersect, allowing the same drug to be effective across a range of patients with different molecular starting points.

By segregating diseases phenotypically, such as by various proliferative, apoptotic, survival, and immune escape programs, these buckets can be determined, enabling improved use of the growing array of drugs that could selectively alter these phenotypic intersects.

Dr. Held: Cell-based assays are used because their predictive value is greater than that obtained with biochemically based assays for drug discovery and development. Likewise, the use of a cell-based assay approach in conjunction with precision personalized medicine will have even greater predictive value for treatments.

For example, a number of cancer drug treatments have been shown to have a genetic component to them, where individuals with specific genetic variants will have successful outcomes whereas others with a different gene variant will not. The use of patient-specific cell-based assays would be expected to identify more of these treatment anomalies.

Dr. Stump: Precision medicine focuses the spotlight on an individual patient’s response instead of a statistical result from a double-blinded, placebo-controlled trial. Tumors are being placed into mice with the hope that xenografts will yield actionable information on drug susceptibility. Such approaches are time-consuming, complex, and difficult to sustain and scale for precision medicine.

Cell-based assays provide the complexity required for drug-based responses, offer mechanistic insights, and are amenable to faster assay times. Simply put, timely development and testing of in vitro models has great potential for producing patient-centric data for targeted therapies. Robust reagents will be pivotal to achieving success.

Dr. Charrier-Savournin: Pathophysiologically relevant environments are a big challenge with cell-based assays, and procedures that would match the right drugs to the right patients are an option only if patient-derived samples are available. Researchers need to monitor the same readout in widely different biological backgrounds, such as synthetic lethality models in breast cancer or patient’s peripheral blood mononuclear cells.

The reliable analysis of biomarkers with cell-based assays, such as assays for cytokine quantification, enable rapid functional tests of patients’ cells that have been exposed to a panel of potential therapies. Such an approach could help identify therapies that would likely be unsuccessful in a given population.

Ms. Gitschier: As technologies emerge to make high-throughput cell-based assays more amenable for use with stem cells and patient samples, these assays are becoming increasingly important for precision medicine. These cells often elicit responses or display resistance differently during drug exposure compared to alternative cellular models and cell lines.

Further, as tools enabling 3D cell culture continue to emerge, more physiologically relevant microenvironments for high-throughput drug discovery and precision medicine are being realized.

Dr. Collins: Cell-based assays are well suited for precision medicine. They provide more pertinent in vivo results compared to biochemical assays. With recent advances in stem cell biology, induced pluripotent stem cells can now be collected from patients in high-throughput cell-based assays. These studies are ideally suited for precision medicine because genotypic variations are eliminated.

Also, image-based high-content analysis allows researchers to answer many questions using a combinatorial approach. When optimized assay design is coupled with multiparametric analysis, one can minimize genetic and environmental variations that are intrinsic to precision medicine.

Dr. Mohan: Precision medicine is based on differences in genetic and environmental makeup of individuals that can affect the outcome of therapy. Cell-based assays could provide important information on changes in expression of “biomarker” proteins as prognostic factors.

Cell-based assays can also be used to assess safety of novel experimental drugs. They can be useful in quality control testing of stem cells for cell-based therapies in regenerative medicine, as well as to test immunogenicity of therapeutic antibodies to avoid the development of antidrug antibodies, which can reduce efficacy through rapid clearance or neutralization.

Dr. Chandy: Primary cancer cells can be used in cell-based assays to identify drugs that target specific genome types or traits. Compared with adherent cells grown in 2D monolayers, 3D growth conditions are believed to more accurately model the in vivo environment. Cellular transformation/tumorigenicity assays using cultures of cells in semisolid media better correlate with tumorigenicity in animal models, for example, in mouse xenografts.

These assays were once labor-intensive and inconsistent. New tools, such as the MetaXpress 3D image analysis toolkit, enable 3D cell-based assays to be used as a screening tool to reproducibly assess more relevant compound effects, proliferation, and viability of cancer cells.

Dr. Khimani: In precision and personalized medicine, the relevance of cell-based assays to the target(s) and associated disease becomes an integral part of drug discovery. Hence, clinical relevance of the assay on a sample enables evaluation of the efficacy and toxicity of a drug on that individual.

For example, in precision medicine against cancer, functional assays performed ex vivo on tumor cells become a powerful tool to evaluate targeted therapies. In other diseases, induced pluripotent stem cells may constitute cell-based assay models for phenotypic and molecular profiling.

Dr. Riss: There is variability among individuals in a population just as there is variability between primary breast cells isolated from a patient’s tumor compared to MCF7 cells. There is much promise for using extremely sensitive viability assay technologies.

Assays such as the CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability Assay for ATP detection can enable miniaturized screening of known chemotherapeutic drugs and drug combinations using cells derived from patient biopsies. Completion of clinical trials will likely support the hypothesis that tumor cells isolated from an individual more accurately predict the in vivo therapeutic response of that individual.

Dr. Horton: With the escalating cost of healthcare, the ability to design personalized treatment options is going to be instrumental in curbing healthcare expenses while still improving patient outcomes. The ability to leverage cell-based assays on patient-derived cellular models will allow healthcare professionals to intelligently design customized treatment options that will have the greatest chance of success.

Cellular assays are never going to be a direct replacement for the real thing. They do, however, present an attractive balance between cost and speed in their ability to provide predictive treatment options in days, as opposed to the months or years necessary for animal studies.


Bekijk de video: Proefjes met groep 8! De lavalamp. (Januari- 2022).