Informatie

Wat betekent het als een eiwit andere excitatiespectra heeft dan wildtype, maar dezelfde emissiespectra?


We hebben een GFP-mutant die een ander excitatiespectra vertoont met emissie bij 510 nm dan de WT. Hun emissieprofielen met excitatie bij 490 nm zijn echter hetzelfde en we zien niet dezelfde trend.

We zijn in de war over wat er zou kunnen gebeuren.


Laat ik beginnen met een korte beschrijving van fluorescentie (aangezien we er hier over praten).

Fluorescentie is een van de processen waardoor het opgewonden molecuul kan ontspannen, zijn overmatige energie verliezen. Dat wil zeggen, kwantuminteractie tussen atomen in moleculen (organische kleurstof of complexe GFP) creëert toegestane energieniveaus. Er is bijvoorbeeld "grondtoestand" $S_0$ en aangeslagen toestand $S_1$. Je "pompt" je molecuul met excitatielicht van $S_0$ naar $S_1$. Dit alles kan mooi worden geïllustreerd als absorptie in het Jablonski-diagram (kijk naar: een voor nu):

via http://micro.magnet.fsu.edu/

"Verlies van energie" is hier een proces waarbij het molecuul terugkeert naar de grondtoestand. Bij GFP komt energie vrij als emissiefoton. De aard van fluoroforen is dat ze de neiging hebben om terug te keren naar de grondtoestand als de toestand van minder energie, en bijna alle systemen hebben de neiging om naar een toestand met minder energie te gaan.

Nu, op uw vraag. Waarom heeft GFP een ander excitatieprofiel maar dezelfde emissie? Merk op, hoe in (een) molecuul wordt gepompt naar de hoogste staat, dan een beetje ontspant naar de laagste van $S_1$ toestanden en dan helemaal naar $S_0$ gaat? Die initiële relaxatie is thermische relaxatie. Er gaat in wezen wat energie verloren aan watermoleculen rond GFP. Daarom is emissie altijd "meer rood", d.w.z. heeft een lagere energie dan excitatie. Aanvankelijke ontspanning is de reden waarom uw GFP-spectra ook breed zijn. Er zijn veel niveaus waar GFP van kan zenden, maar ook enthousiast over kan zijn. In kristallen van GFP zullen de overgangen erg smal zijn, omdat veel minder excitatie-energie niet in fluorescentie gaat.

Mijn punt is dus het volgende. Niemand verhindert iemand om een ​​gemuteerd GFP-molecuul te construeren dat naar een nog hoger niveau $S_2$ zou kunnen worden gepompt, dat vervolgens ontspant tot $S_1$ via een niet-bestralingsproces (geeft bijvoorbeeld energie aan water, maar niet in fluorescentie!). Enige vereiste is dat voor mutant direct pad van $S_0$ naar $S_1$ verboden zou zijn (zie B en C).

Een ander punt is dat of je spectra nu verschillend van vorm zijn of alleen intensiteit. Verschillende vorm van spectra betekent dat er verschillen zijn in die niveaus en overgangen.


Fluorescentie versus fosforescentie

  • Scheikunde
    • Basis
    • Chemische wetten
    • Moleculen
    • Periodiek systeem
    • Projecten en experimenten
    • Wetenschappelijke methode
    • Biochemie
    • Fysische chemie
    • Medische chemie
    • Chemie in het dagelijks leven
    • Beroemde scheikundigen
    • Activiteiten voor kinderen
    • Afkortingen en acroniemen
    • Ph.D., Biomedische Wetenschappen, Universiteit van Tennessee in Knoxville
    • BA, Natuurkunde en Wiskunde, Hastings College

    Fluorescentie en fosforescentie zijn twee mechanismen die licht uitstralen of voorbeelden van fotoluminescentie. De twee termen betekenen echter niet hetzelfde en komen niet op dezelfde manier voor. Bij zowel fluorescentie als fosforescentie absorberen moleculen licht en zenden ze fotonen uit met minder energie (langere golflengte), maar fluorescentie treedt veel sneller op dan fosforescentie en verandert de spinrichting van de elektronen niet.

    Hier is hoe fotoluminescentie werkt en een blik op de processen van fluorescentie en fosforescentie, met bekende voorbeelden van elk type lichtemissie.

    Belangrijkste afhaalrestaurants: fluorescentie versus fosforescentie

    • Zowel fluorescentie als fosforescentie zijn vormen van fotoluminescentie. In zekere zin zorgen beide verschijnselen ervoor dat dingen oplichten in het donker. In beide gevallen absorberen elektronen energie en geven ze licht af wanneer ze terugkeren naar een stabielere toestand.
    • Fluorescentie treedt veel sneller op dan fosforescentie. Wanneer de excitatiebron wordt verwijderd, houdt de gloed vrijwel onmiddellijk op (fractie van een seconde). De richting van de elektronenspin verandert niet.
    • Fosforescentie duurt veel langer dan fluorescentie (minuten tot enkele uren). De richting van de elektronenspin kan veranderen wanneer het elektron naar een lagere energietoestand gaat.

    Regelgevers en effectoren van kleine GTPases

    Kirill Alexandrov, . Roger S. Goody, in Methods in Enzymology, 2001

    Fluorescentie metingen.

    Fluorescentiespectra en fluorescentiemetingen op basis van lange tijd worden uitgevoerd met een Aminco SLM 8100-spectrofotometer (Aminco, Silver Spring, MD). Alle reacties werden gevolgd bij 25° in buffer C [25 mm HEPES, pH 7,2, 40 mm NaCl, 2 mm MgCl2, 2 mm dithioerythritol (DTE), en 10 M BBP]. De fluorescentie van mantGDP en dansyl-gelabeld Rab7 wordt geëxciteerd via tryptofaan-FRET bij 295 nm en gemeten bij 440 nm. Voor de meting van het directe fluorescentiesignaal wordt met dansyl gelabeld Rab7 geëxciteerd bij 333 nm en worden gegevens verzameld bij 440 nm. Gestopte stromingsexperimenten worden uitgevoerd in een High-Tech Scientific SF61-apparaat (Salisbury, Engeland). De fluorescentie van de mant- of dansylgroep wordt geëxciteerd via FRET bij 290 of direct bij 333 nm en gedetecteerd door een f-filter van 389 nm. Gegevensverzameling en primaire analyse van snelheidsconstanten worden uitgevoerd met het pakket van High-Tech Scientific, de secundaire analyse wordt uitgevoerd met de programma's Grafit 3.0 (Erithacus Software) en Scientist 2.0 (MicroMath Scientific Software).


    Excitatiebereik en maximum

    Een opgewonden fluorofoormolecuul straalt licht met een lagere energie uit dan het licht dat het absorbeert. Daarom is er altijd een verschuiving langs het spectrum tussen de kleur van het licht dat tijdens de excitatie door de fluorofoor wordt geabsorbeerd en de kleur die wordt uitgezonden.

    Een fluorescerende kleurstof absorbeert licht over een reeks golflengten - en elke kleurstof heeft een karakteristiek excitatiebereik. Sommige golflengten binnen dat bereik zijn echter effectiever voor excitatie dan andere golflengten. Dit golflengtebereik weerspiegelt het bereik van mogelijke aangeslagen toestanden die de fluorofoor kan bereiken. Dus voor elke fluorescerende kleurstof is er een specifieke golflengte - het excitatiemaximum - die het meest effectief fluorescentie induceert.

    Typische weergave van hoe fluorofoor-excitatiebereik (balken) en fluorofoor-excitatiemaximum (sterren) worden weergegeven.


    Invoering

    Borstkanker is wereldwijd een van de meest voorkomende vormen van kanker. Elk jaar worden 1,38 miljoen nieuwe gevallen ontdekt, terwijl 458 000 mensen aan deze oorzaak overlijden. 1 Borsttumoren kunnen worden opgespoord en gelokaliseerd met behulp van verschillende gevestigde niet-invasieve methoden zoals echografie, mammografie, computertomografie, magnetische resonantiebeeldvorming en positronemissietomografie. 1 𠄳 Niettemin is een invasieve biopsie en een daaropvolgende histopathologische analyse vereist voor de classificatie van de tumor als goedaardig of kwaadaardig. 1 Bovendien vereisen de grenzen tussen normaal borstparenchym en kwaadaardige tumoren van verwijderde weefsels uitgebreide histopathologische analyse van vele locaties om de resectiestatus te bepalen, en daarom is het tijdrovend. Dit toont duidelijk het belang aan van het ontwikkelen van snelle en objectieve methoden voor de diagnose van borsttumoren. De vorming van een tumor verandert de structuur en samenstelling van weefsel aanzienlijk, zoals het gehalte aan koolhydraten, lipiden, eiwitten en nucleïnezuren. 4 Deze veranderingen treden al op voordat de klinische symptomen zich voordoen. 4

    Biologisch materiaal zoals eiwitten, koolhydraten, lipiden, nucleïnezuren en DNA hebben verschillende moleculaire structuren 5 met deze verschillende Raman-spectra. 6 𠄸 Zo kan de samenstelling van biologische weefsels worden geïdentificeerd op basis van hun Raman-spectrum. 9 Wanneer een fysiologische verandering of pathologisch proces de biochemie van het weefsel verandert, leidt dit tot een verandering in het Raman-spectrum. 10 Dit biedt de mogelijkheid om ziekten, zoals borsttumoren, in een vroeg stadium te classificeren.

    Manoharan et al 11 onderzocht borstweefsel met behulp van nabij-infrarood (NIR) Raman-spectroscopie. Ze stelden dat het Raman-spectrum van normaal weefsel wordt bepaald door lipidebanden, terwijl het spectrum van het kwaadaardige weefsel wordt bepaald door eiwitbanden. Terwijl normale cellen hun energie opslaan in de vorm van lipiden, synthetiseren pathologische cellen grote hoeveelheden eiwit voor de modulatie en instandhouding van cellulaire activiteiten van hun ongecontroleerde groei. 12 Door Raman-signaalpieken of -banden toe te wijzen aan moleculaire trillingen, bevestigden ze de histopathologisch verkregen kennis dat de meerderheid van de eiwitten in de tumor collageen is.

    Li et al 4 ontdekte dat de ruwe Raman-spectra van normaal borstweefsel duidelijk waarneembare Raman-signaalpieken vertonen, terwijl de spectra van tumoren, ongeacht of ze kwaadaardig of goedaardig zijn, worden gedomineerd door een sterke en breedbandige autofluorescentie-interferentie, wat de identificatie van het Raman-signaal mogelijk maakt. pieken uitdagend. De toename van de fluorescentie in het tumorweefsel kan verband houden met het genereren van voorlopers van fluorescerende verbindingen tijdens de uitputting van lipiden. 13

    Haka et al 14 toonde aan dat Raman-spectroscopie een veelbelovend nieuw hulpmiddel is voor real-time diagnose van borstweefselafwijkingen. Door een diagnostisch model toe te passen op basis van fit-coëfficiënten voor collageen en vet, maakten ze onderscheid tussen normaal weefsel en kwaadaardige en goedaardige tumoren.

    Verschillende technieken op basis van Raman-verstrooiing zoals conventionele NIR Raman-spectroscopie, oppervlakte-enhanced Raman-spectroscopie (SERS), 1,2,21,22 en resonantie Raman-spectroscopie 13,23,24 zijn gebruikt om borsttumoren te analyseren. Ze hebben allemaal gemeen dat ze zijn geoptimaliseerd voor de versterking van de gewenste Raman-signalen met betrekking tot de ongewenste autofluorescentie-interferenties of voor de onderdrukking of verzwakking van de ongewenste autofluorescentie-interferenties. Conventionele Raman-spectroscopie geeft optimale prestaties voor de karakterisering van borstweefsel bij excitatiegolflengte in het NIR-spectrale gebied 25 vanwege de relatief lage excitatie van de autofluorescentie-achtergrond. Desalniettemin interfereert de ongewenste fluorescentieachtergrond nog steeds met de gewenste Raman-signalen, vooral in de spectra die zijn verkregen uit tumorweefsels. De zuivering van de Raman-spectra uit de autofluorescentie-interferentie-spectra met behulp van wiskundige basislijncorrectiemethoden 26 � brengt het risico met zich mee dat niet alleen de interfererende fluorescentie wordt geëlimineerd, maar ook dat Raman-signaturen worden geëlimineerd of beïnvloed.

    Resonantie Raman-spectroscopie is een variant van conventionele Raman-spectroscopie waarbij de excitatielaserenergie zorgvuldig wordt geselecteerd om bijna samen te vallen met een elektronische overgang van het doelmolecuul. Als gevolg hiervan kunnen de detectielimieten en meettijden aanzienlijk worden verlaagd. 29 Alleen de resonant aangeslagen overgangen kunnen echter worden onderzocht, wat detectie van meerdere soorten en analyse van weefselsamenstelling een uitdaging maakt.

    Oppervlakte-verbeterde Raman-spectroscopie is een andere variant van Raman-spectroscopie met een bijzonder hoge gevoeligheid. Hier moet een materiaal, meestal metalen nanodeeltjes, dat de versterking van het Raman-signaal ondersteunt dat afkomstig is van de moleculen in de buurt van het oppervlak, aan het onderzochte monster worden toegevoegd. 30,31 SERS toepassen, Vargas-Obieta et al 1 rapporteerde een sterke Raman-signaalversterking en het onderscheid tussen patiënten met borstkanker en gezonde patiënten met een hoge sensitiviteit en specificiteit. Er zijn biocompatibele en niet-toxische nanodeeltjes ontwikkeld, waardoor SERS toepasbaar wordt in een in vivo instelling. 32,33 De signaalversterking hangt echter af van verschillende factoren, waaronder de eigenschappen van het metaal, de vorm en grootte van het nanodeeltje en de excitatiegolflengte. SERS vereist dus een intensieve monstervoorbereiding en een complexe experimentele opstelling.

    We hebben hier Raman-verschilspectroscopie met verschoven excitatie (SERDS) toegepast voor de zuivering van Raman-signalen van sterk door fluorescentie gestoorde spectra van invasief borstcarcinoom (kwaadaardige borsttumoren) en fibroadenoom (goedaardige borsttumoren). Voor zover wij weten, is dit het eerste rapport over het gebruik van SERDS voor identificatie van borsttumoren. Deze techniek is een nuttig hulpmiddel gebleken voor het toepassen van Raman-spectroscopie op monsters met sterke fluorescentie-interferentie. 34 � Shreve et al 34 waren de eersten die de SERDS-techniek voor fluorescentie-afstoting voorstelden. Het is gebaseerd op Kasha-regel 37 dat het fluorescentiesignaal bijna ongevoelig is voor kleine veranderingen in fotonenergie-excitatie in tegenstelling tot het Raman-spectrum, dat verschuift volgens de excitatiefoton-energieverandering. Door dus 2 onbewerkte spectra af te trekken, elk geëxciteerd met een iets andere fotonenergie, kan de fluorescentie-achtergrond worden geëlimineerd, terwijl een Raman-verschilspectrum overblijft. da Silva Martins et al 38 beschreef SERDS als een zeer systematische en reproduceerbare methode voor het elimineren van ongewenste fluorescentie-interferenties. De SERDS-techniek is zeer effectief, omdat het geen enkele vorm van monstervoorbereiding of een complexe experimentele opstelling vereist en in staat is om zowel fluorescentie-interferenties als systematische ruis uit spectra te elimineren. 39 De charme van de SERDS-techniek is dat de fluorescentie voornamelijk wordt geëlimineerd door fysieke benadering. Dus, in tegenstelling tot puur wiskundig gebaseerde basislijncorrectiebenaderingen, heeft het geen invloed op de Raman-kenmerken van het spectrum.


    Inhoud

    Twee-foton-excitatie maakt gebruik van twee-fotonabsorptie, een concept dat voor het eerst werd beschreven door Maria Goeppert Mayer (1906-1972) in haar proefschrift in 1931, [3] en voor het eerst werd waargenomen in 1961 in een CaF2:Eu 2+ kristal met behulp van laserexcitatie door Wolfgang Kaiser. [4] Isaac Abella toonde in 1962 in cesiumdamp aan dat twee-foton-excitatie van enkele atomen mogelijk is. [5]

    Twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie heeft overeenkomsten met andere confocale lasermicroscopie technieken zoals laser scanning confocale microscopie en Raman microscopie. Deze technieken maken gebruik van gefocusseerde laserstralen die in een rasterpatroon worden gescand om afbeeldingen te genereren, en beide hebben een optisch snij-effect. In tegenstelling tot confocale microscopen, bevatten multiphoton-microscopen geen gaatjes die confocale microscopen hun optische snijkwaliteit geven. De optische coupes die wordt geproduceerd door multifotonmicroscopen is het resultaat van de puntspreidingsfunctie van de excitatie: de multifotonpuntspreidingsfunctie is typisch haltervormig (langer in het xy-vlak), vergeleken met de rechtopstaande rugbybalvormige puntspreidingsfunctie van confocale microscopen. Het concept van twee-foton-excitatie is gebaseerd op het idee dat twee fotonen, met een vergelijkbaar lagere foton-energie dan nodig is voor één foton-excitatie, ook een fluorofoor kunnen exciteren in één kwantumgebeurtenis. Elk foton draagt ​​ongeveer de helft van de energie die nodig is om het molecuul te exciteren. Excitatie resulteert in de daaropvolgende emissie van een fluorescentiefoton met dezelfde kwantumopbrengst die zou resulteren uit conventionele enkelvoudige fotonabsorptie. Het uitgezonden foton heeft typisch een hogere energie (kortere golflengte) dan een van de twee opwindende fotonen. De kans op de bijna gelijktijdige absorptie van twee fotonen is extreem laag. Daarom is typisch een hoge piekflux van excitatiefotonen vereist, meestal gegenereerd door femtoseconde gepulseerde laser. Het doel van het gebruik van het twee-fotoneffect is dat de axiale spreiding van de puntspreidingsfunctie aanzienlijk lager is dan voor enkelfotonexcitatie. Als resultaat wordt de omvang langs de z-dimensie verbeterd, waardoor dunne optische secties kunnen worden gesneden. Daarnaast kan in veel interessante gevallen de vorm van de spot en de grootte worden ontworpen om specifieke gewenste doelen te realiseren. [6] De excitatielasers met langere golflengte en lagere energie (meestal infrarood) van multifoton-microscopen zijn zeer geschikt voor gebruik bij het afbeelden van levende cellen, aangezien ze minder schade aanrichten dan de kortegolflengtelasers die doorgaans worden gebruikt voor excitatie met één foton, dus cellen kunnen langere perioden worden waargenomen met minder toxische effecten.

    De meest gebruikte fluoroforen hebben excitatiespectra in het bereik van 400-500 nm, terwijl de laser die wordt gebruikt om de fluorescentie van twee fotonen op te wekken in de

    700-1000 nm (infrarood) bereik geproduceerd door Ti-saffierlasers. Als de fluorofoor twee infraroodfotonen tegelijk absorbeert, zal het genoeg energie absorberen om in de aangeslagen toestand te komen. De fluorofoor zendt dan een enkel foton uit met een golflengte die afhangt van het type fluorofoor dat wordt gebruikt (meestal in het zichtbare spectrum). Omdat twee fotonen worden geabsorbeerd tijdens de excitatie van de fluorofoor, neemt de kans op fluorescerende emissie van de fluoroforen kwadratisch toe met de excitatie-intensiteit. Daarom wordt veel meer twee-fotonfluorescentie gegenereerd waar de laserstraal strak is gefocust dan waar deze meer diffuus is. In feite is excitatie beperkt tot het kleine brandpuntsvolume (

    1 femtoliter), wat resulteert in een hoge mate van afstoting van onscherpe objecten. Dit lokalisatie van excitatie is het belangrijkste voordeel in vergelijking met excitatiemicroscopen met één foton, die elementen zoals gaatjes moeten gebruiken om onscherpe fluorescentie te verwerpen. De fluorescentie van het monster wordt vervolgens verzameld door een zeer gevoelige detector, zoals een fotomultiplicatorbuis. Deze waargenomen lichtintensiteit wordt één pixel in het uiteindelijke beeld, het brandpunt wordt gescand door een gewenst gebied van het monster om alle pixels van het beeld te vormen.

    Twee-fotonmicroscopie werd ontwikkeld en gepatenteerd door Winfried Denk en James Strickler in het laboratorium van Watt W. Webb aan de Cornell University in 1990. Ze combineerden het idee van twee-fotonabsorptie met het gebruik van een laserscanner. [7] [8] Bij twee-foton-excitatiemicroscopie wordt een infrarode laserstraal gefocusseerd door een objectieflens. De normaal gebruikte Ti-saffierlaser heeft een pulsbreedte van ongeveer 100 femtoseconden (fs) en een herhalingssnelheid van ongeveer 80 MHz, waardoor de hoge fotonendichtheid en flux die nodig zijn voor de absorptie van twee fotonen mogelijk is en kan worden afgestemd op een breed scala aan golflengten. Mode-locked Yb-gedoteerde fiberlasers met 325 fs-pulsen zijn ook gebruikt voor collageenbeeldvorming, wat een penetratiediepte van meer dan 320 m in collageen aantoont, wat aanzienlijk superieur is aan diepten van 250 tot 300 m die haalbaar zijn wanneer gekoppeld aan een conventionele Ti- saffier excitatie laser.

    Het gebruik van infrarood licht om fluoroforen op te wekken in lichtverstrooiend weefsel heeft extra voordelen. [9] Langere golflengten worden in mindere mate verstrooid dan kortere, wat een voordeel is voor beeldvorming met hoge resolutie. Bovendien is het minder waarschijnlijk dat deze fotonen met een lagere energie schade buiten het brandpuntsvolume veroorzaken. Vergeleken met een confocale microscoop is fotonendetectie veel effectiever omdat zelfs verstrooide fotonen bijdragen aan het bruikbare signaal. Deze voordelen voor beeldvorming in verstrooiende weefsels werden pas enkele jaren na de uitvinding van twee-foton-excitatiemicroscopie erkend. [10]

    Er zijn verschillende kanttekeningen bij het gebruik van twee-fotonenmicroscopie: de gepulseerde lasers die nodig zijn voor excitatie met twee fotonen zijn veel duurder dan de continue golf (CW) lasers die worden gebruikt in confocale microscopie. Het absorptiespectrum van twee fotonen van een molecuul kan aanzienlijk verschillen van zijn tegenhanger van één foton. Voor zeer dunne objecten zoals geïsoleerde cellen kunnen enkel-foton (confocale) microscopen beelden produceren met een hogere optische resolutie vanwege hun kortere excitatiegolflengten. Bij verstrooid weefsel daarentegen resulteren de superieure optische snij- en lichtdetectiemogelijkheden van de twee-fotonmicroscoop in betere prestaties.

    Hoofdbewerking

    Twee-fotonmicroscopie is betrokken geweest bij tal van gebieden, waaronder: fysiologie, neurobiologie, embryologie en tissue engineering. Zelfs dunne, bijna transparante weefsels (zoals huidcellen) zijn dankzij deze techniek met duidelijke details gevisualiseerd. [11] De snelle beeldvormingsmogelijkheden van twee-fotonmicroscopie kunnen ook worden gebruikt bij niet-invasieve optische biopsie. [12] In de celbiologie is twee-fotonmicroscopie heel toepasselijk gebruikt voor het produceren van gelokaliseerde chemische reacties. [ verduidelijking nodig ] [10] Met behulp van twee-fotonfluorescentie en op de tweede harmonische generatie gebaseerde microscopie, werd aangetoond dat organische moleculen van het porfyrinetype verschillende overgangsdipoolmomenten kunnen hebben voor twee-fotonfluorescentie en tweede harmonische generatie, [13] die anders worden gedacht optreden vanaf hetzelfde overgangsdipoolmoment. [14] Niet-degeneratieve excitatie met twee fotonen, of het gebruik van 2 fotonen van ongelijke golflengten, bleek de fluorescentie van alle geteste kleine moleculen en fluorescerende eiwitten te verhogen. [15]

    Kankeronderzoek Bewerken

    2PEF bleek ook zeer waardevol te zijn voor het karakteriseren van huidkanker. [16] Het was ook aangetoond dat het tumorcelarrest, tumorcel-bloedplaatjesinteractie, tumorcel-leukocytinteractie en metastatische kolonisatieprocessen onthult. [17]

    Neurowetenschappen Bewerken

    2PEF en 3PEF worden gebruikt om intacte neurale weefsels te karakteriseren. [18]

    Hersenen in-vivo beeldvorming Bewerken

    Multiphoton-fluorescentie (2PEF en 3PEF) is een nuttig middel om de hersenen in vivo af te beelden. [19]

    Door de (geschoren) schedel wordt beeldvorming van haarvaten en RBC's gepubliceerd bij muizen, wat een grotere diepte en hoge resolutie suggereert van verder weg dan microscopietoepassingen. Dit staat in de krant: "In vivo Two-Photon Imaging onthult acute cerebrale vasculaire spasmen en microtrombose na licht traumatisch hersenletsel bij muizen"

    Gelijktijdige absorptie van drie of meer fotonen is ook mogelijk, waardoor een hogere multifoton-excitatiemicroscopie mogelijk is. [20] De zogenaamde "three photons geëxciteerde fluorescentiemicroscopie" (3PEF) is de meest gebruikte techniek na 2PEF, waaraan het complementair is.

    Over het algemeen kunnen alle veelgebruikte fluorescerende eiwitten (CFP, GFP, YFP, RFP) en kleurstoffen worden opgewekt in twee-foton-modus. Twee-foton-excitatiespectra zijn vaak aanzienlijk breder, waardoor het moeilijker wordt om fluoroforen selectief te exciteren door van excitatiegolflengte te wisselen. Er zijn verschillende online databases met twee-fotonspectra, verkrijgbaar bij de Cornell University[1] en het National Institute of Chemical Physics and Biophysics in Estland. [21]

    Er zijn verschillende groene, rode en NIR-emitterende kleurstoffen (sondes en reactieve labels) met extreem hoge 2-fotonabsorptiedoorsneden gerapporteerd. [22] Vanwege de donor-acceptor-donor-type structuur, squaraine kleurstoffen zoals: Seta-670, Seta-700 en Seta-660 vertonen een zeer hoge 2-fotonabsorptie (2PA) efficiëntie in vergelijking met andere kleurstoffen, [22] [23] [24] SeTau-647 en SeTau-665, een nieuw type squaraine-rotaxaan, vertonen extreem hoge twee-foton-actiedwarsdoorsneden van maximaal 10.000 GM in het nabije IR-gebied, onovertroffen door enige andere klasse van organische kleurstoffen. [22]


    Mechanismen van tryptofaan fluorescentie verschuivingen in eiwitten

    Tryptofaan-fluorescentiegolflengte wordt veel gebruikt als een hulpmiddel om veranderingen in eiwitten te volgen en om conclusies te trekken met betrekking tot lokale structuur en dynamiek. We hebben de fluorescentiegolflengten van 19 tryptofaan in 16 eiwitten voorspeld, te beginnen met kristalstructuren en met behulp van een hybride kwantummechanisch-klassieke moleculaire dynamica-methode met de veronderstelling dat alleen elektrostatische interacties van de tryptofaan-ringelektronendichtheid met het omringende eiwit en oplosmiddel de overgang beïnvloeden energie. Met slechts één instelbare parameter, de schaal van de kwantummechanische atomaire ladingen zoals gezien door de eiwit/oplosmiddelomgeving, is de gemiddelde absolute afwijking tussen de voorspelde en waargenomen maximale fluorescentiegolflengte 6 nm. Het modelleren van elektrostatische interacties, inclusief hydratatie, in eiwitten is van vitaal belang voor het begrijpen van functie en structuur, en deze studie helpt de effectiviteit van de huidige elektrostatische modellen te beoordelen.


    Abstract

    De komst van gemakkelijke genoom-engineeringtechnologieën heeft het genereren van knock-in genexpressie- of fusie-eiwitreporters handelbaarder gemaakt. Fluorescerende eiwitlabeling van specifieke genen gecombineerd met oppervlaktemarkerprofilering kan een celpopulatie specifieker identificeren. De vraag welke fluorescerende eiwitten moeten worden gebruikt om reporterconstructen te genereren, wordt echter bemoeilijkt door het aantal kandidaat-eiwitten en het ontbreken van bijgewerkte experimentele gegevens over nieuwere fluorescerende eiwitten. Dit probleem wordt nog versterkt doordat de meeste fluorescerende eiwitten zijn ontworpen en getest voor gebruik in microscopie. Om dit aan te pakken, hebben we de detectiegevoeligheid, spectrale overlap en overloopverspreiding van 13 monomere fluorescerende eiwitten gekloond en gekarakteriseerd om het nut in veelkleurige panelen te bepalen. We identificeerden een groep van vijf fluorescerende eiwitten met een hoge signaal-ruisverhouding, minimale spectrale overlap en lage overloopspreiding, waardoor ze compatibel zijn voor meerkleurige experimenten. Specifiek zou het genereren van reporters met combinaties van drie van deze eiwitten efficiënte metingen mogelijk maken, zelfs bij lage expressie. Omdat de eiwitten monomeer zijn, zouden ze kunnen functioneren als genexpressie of als fusie-eiwitreporters. Bovendien kan deze benadering worden gegeneraliseerd naarmate nieuwe fluorescerende eiwitten worden ontwikkeld om hun bruikbaarheid in veelkleurige panelen te bepalen. © 2018 International Society for Advancement of Cytometry

    Vanaf het eerste succesvolle gebruik van Green Fluorescent Protein (GFP) als marker voor beeldvorming in 1994, hebben fluorescerende eiwitten een revolutie teweeggebracht in het onderzoek. Als gevolg van de ontwikkeling van GFP 1-3 is een groot aantal fluorescerende eiwitten ontdekt en gegenereerd, met oorsprong buiten GFP's Aequorea victoria 4-9 . De meeste natuurlijke fluorescerende eiwitten die zijn gekloond uit verschillende organismen, functioneren als dimeren of tetrameren, wat kan leiden tot aggregatie van eiwitten in de cel 10 . Eiwitaggregaten kunnen cytotoxiciteit veroorzaken, waardoor de biologische toepassingen van die fluorescerende eiwitten worden beperkt. De ontwikkeling van monomere eiwitten hielp bij het verminderen van problemen die voortvloeien uit eiwitdimerisatie 11, 12 en functioneerde nauwkeuriger als reporters op eiwitniveau voor genetisch gecodeerde fluorescerende tags 13, waardoor diversificatie van hun toepassingen mogelijk was.

    Knock-in genexpressie of fusie-eiwitreporters (genetische reporters bij muizen) kunnen de identificatie van celpopulaties waar conventionele oppervlaktemarkerprofilering faalt aanzienlijk verbeteren. De ontwikkeling van meer geavanceerde fluorescerende eiwitten met een breed scala aan excitatie- en emissiespectra heeft steeds complexere flowcytometrie-assays mogelijk gemaakt 14 . Bestaande gegevens over door flowcytometrie geteste fluorescerende eiwitten raken echter snel achterhaald, aangezien er bijna elk jaar nieuwe fluorescerende eiwitten worden ontwikkeld, met ten minste 28 nieuwe eiwitten die in de afgelopen 5 jaar zijn ontwikkeld 15-40 . Review-artikelen behandelen gerapporteerde fluorescente eiwitkenmerken voor flowcytometrie en microscopie, maar uitgebreide individuele en combinatorische experimentele testen in een cytometer zijn minimaal 10, 41-43. Al deze factoren maken het kiezen van een veelkleurig paneel dat nuttig is voor knock-in genexpressie of fusie-eiwitreporters moeilijk, omdat de optimale combinatie van fluorescerende eiwitten onduidelijk is.

    Om tegemoet te komen aan de behoefte aan beknopte gegevens over de flowcytometrische eigenschappen van fluorescerende eiwitten die kunnen worden gebruikt voor knock-in genexpressie of fusie-eiwitreporters, hebben we een panel van 13 monomere fluorescerende eiwitten geselecteerd om te onderzoeken: Venus 44 , monomeer Infrared Fluorescent Protein (mIFP) 40 , Long Stokes Shift monomeer oranje (LssmOrange) 35 , Tag Red Fluorescent Protein 657 (TagRFP657) 45 , monomeer Orange2 (mOrange2) 46 , monomeer Apple (mApple) 46 , Sapphire 47 , monomeer Tag Blue Fluorescent Protein (mTagBFP2) 48 , tdTomato 11 , monomeer Cherry (mCherry) 11 , Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP) 49 , monomeer Cerulean3 (mCerulean3) 50 en Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) 51 . Deze eiwitten werden gekozen omdat ze kunnen worden geëxciteerd met gewone laserlijnen die worden gebruikt in flowcytometrie en een lage concatemerisatie hebben. Monomere fluorescerende eiwitten induceren een lagere cytotoxiciteit, zodat deze fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt voor biologische tests. Bovendien kunnen ze door hun monomere aard ook als fusie-eiwitten functioneren. Er bestaan ​​vergelijkbare beoordelingen van combinaties van fluorescerende eiwitten voor microscopie, wat de behoefte aan vergelijkbare experimenten in de context van flowcytometrie onderstreept 52 . We hebben er met name voor gekozen om EGFP in het panel op te nemen vanwege het wijdverbreide gebruik en de status als een gouden standaard fluorescerend eiwit 10 . Evenzo werd EYFP ook opgenomen omdat het een legacy-reagens is.

    Onderzoekers staan ​​​​vaak voor een dilemma bij het maken van een nieuwe reportermuis die fluorescerend eiwit moet gebruiken. Er zijn meerdere criteria om de werkzaamheid van fluorescerende moleculen in een veelkleurig paneel te bepalen en omvatten helderheid, mate van fluorescentie-spillover en spreidingsfout. In deze studie werd de prestatie van elk fluorescerend eiwit gekarakteriseerd door deze factoren te onderzoeken. We demonstreren het nut van vijf fluorescerende eiwitten met optimale kenmerken voor veelkleurige experimenten, waarvan er drie gemakkelijk tegelijkertijd kunnen worden gebruikt (EGFP of Venus, mTagBFP2 en mIFP of TagRFP657). Ze kunnen zelfs bij lage niveaus afzonderlijk worden gedetecteerd en vertonen weinig spectrale overlap wanneer ze samen worden gebruikt. Bovendien kan deze benadering worden gegeneraliseerd om nieuwe fluorescerende eiwitten te testen terwijl ze worden ontwikkeld.


    Resultaten

    Expressie en zuivering van hTyrCtr en OCA1-gerelateerde mutanten

    Eiwitexpressie van hTyrCtr en de OCA1-gerelateerde mutanten werden beoordeeld met SDS-PAGE en Western-blot van eiwitsupernatanten van larvale lysaten vertoonden allemaal redelijk vergelijkbare eiwitniveaus (aanvullende materialen, figuur S1). Bij de tweede zuiveringsfase (Sephacryl S-300 HR) werden drie pieken waargenomen: piek 1, die overeenkomt met het lege volume van de kolom (uitsluitingslimiet

    2000 kDa), piek 2, eiwitten in het 20 – 300 kDa polypeptidebereik met een zeer lage tyrosinase-activiteit, en piek 3, die overeenkomt met elutie van zuiver hTyrCtr en OCA1B-mutanten (Figuur 2). De SDS-PAGE en Western blots van de chromatografiepieken getoond in Figuur 2 (voeg lanen A, B in) en natieve gelelektroforese (voeg lanen C, D in) laat zien dat hTyrCtr en OCA1B-gerelateerde mutanten migreerden goed in de gel (niet geaggregeerd) en reageerden sterk met L-DOPA. Op basis van deze resultaten is de hTyrCtr en OCA1B-gerelateerde mutanten werden gezuiverd als oplosbare eiwitten met hoge enzymatische activiteiten.

    Bovenpaneel: Absorptiewaarden geregistreerd bij 280 nm na twee zuiveringsstappen met behulp van het ÄKTAxpress chromatografiesysteem. Chromatografie van hTyrCtr (rood) en mutantvarianten (R422W, oranje R402Q, geel R422Q, groen P406L, blauw T373K, paars en R77Q, lichtviolet) werden als drie pieken uit de Sephacryl S-300 HR-kolom geëlueerd, piek 1 (fracties A2�) , Piek 2 (B8'x02013C9) en Piek 3 (D8'x02013F9). Insert toont de SDS-PAGE (A), Western blot (B), native gel geïncubeerd met 3 mM L-DOPA (C) en native gel gekleurd met GelCode Blue-reagens (D) van hTyrCtren OCA1-gerelateerde mutanten. Van links: 1, eiwitladder 2, hTyrCtr 3, R422W 4, R402Q 5, R422Q 6, P406L 7, T373K 8, R77Q.

    Onderste paneel: Specifieke activiteit van tyrosinase in de drie pieken die zijn verkregen als de L-DOPA-enzymactiviteit, vermenigvuldigd met het totale monstervolume en gedeeld door het totale eiwit, worden weergegeven als de gekleurde balken. Het tyrosinasegehalte (opbrengst) van hTyrCtr and mutant variants in all three peaks calculated from the SDS-PAGE gels using UN-SCAN-IT gel ™ gel analysis software are showed as the empty bars.

    * Indicate no bands at the proper position on SDS-PAGE gel or no activity.

    The hTyrCtr protein and OCA1B-related mutants, R422W, R402Q, R422Q, and P406L. were then applied to a Superose 12 10/300 GL column and eluted as single monomeric peaks (Supplementary Materials, Figure S2A). Previously, sedimentation equilibrium was used to show that hTyrCtr was monomeric with a molecular weight of 56.63 kDa (Dolinska et al., 2014).

    The proteins were all 㺗% pure according to the SDS-PAGE ( Table 1 ). However, the proteins did exhibit broad, heterogeneous bands between 55 and 70 kDa due to glycosylation ( Figure 2 , insert, panel A). These bands all reacted strongly with the T311 human tyrosinase antibody on the Western blot ( Figure 2 , insert, panel B).

    Tafel 1

    Enzymatic properties of recombinant hTyrCtr and OCA1B-related mutant variants.

    EiwitFinal purity (%)Specific activity (U/mg)
    native% of hTyrCtrrefolded% of native
    hTyrCtr97.22 ± 1.83347,370 ± 13,497-332,553 ± 16,10295.73
    R422W98.56 ± 1.28329,499 ± 41,66294.86299,423 ± 6,80090.87
    R402Q97.54 ± 0.73236,668 ± 17,36768.13206,060 ± 10,71387.07
    R422Q97.38 ± 1.20178,611 ± 25,99151.42109,849 ± 7,50061.50
    P406L97.78 ± 0.86122,355 ± 8,07235.2257,728 ± 1,92847.18

    Protein purity for hTyrCtr and OCA1B-related mutant variants were measured from SDS-PAGE gels as 100% x tyrosinase band intensity/total protein band using UN-SCAN-IT gel ™ gel analysis software (Silk Scientific, Inc., UT). Specific activity was obtained as the diphenol oxidase activity (as described in Materials and Methods section), multiplied by the sample total volume and divided by total protein.

    In contrast, OCA1A mutant variants, T373K and R77Q, were mostly in the first, higher-molecular weight peak during gel filtration, with none present in Peak 3 these corresponded to enzymatically-inactive degraded polypeptides ( Figure 2 , insert lanes 7𠄸). Moreover, after concentration from Peak 1, the OCA1A mutant proteins were pelleted by low speed centrifugation, indicating that they were highly aggregated and, therefore, excluded from the further analysis.

    Enzymatic activity

    The specific activities of OCA1B-related mutants, R422W, R402Q, R422Q, and P406L, were 95, 68, 51, and 35 % of the hTyrCtr specific activity, respectively ( Table 1 ). Michaelis-Menten constants (Km), which show the concentration of L-DOPA resulting in half of the maximal velocity for the diphenol oxidase reaction, indicated that the binding affinity is slightly higher for the most severe OCA1B-related mutants, R422Q and P406L ( Table 2 , Figure 3 ). From the Vmax en Km values, the enzyme turnover, kkat, and enzyme efficiency, kkat/Km, were calculated and indicated that hTyrCtr has higher L-DOPA specificity (150.64) than the OCA1B-related mutants (121.82, 116.07, 107.40, and 111.55 for R422W, R402Q, R422Q, and P406L, respectively) ( Table 2 ). Km values of hTyrCtr and OCA1B mutant variants were similar, indicating similar L-DOPA binding affinities enzyme turnover was decreased for mutant variants, however.

    Michaelis-Menten plots of diphenol oxidase activity of hTyrCtr (red), R422W (orange), R402Q (yellow), R422Q (green), and P406L (blue) as a function of L-DOPA concentration measured at 37ଌ. The lines represent nonlinear fits to the Michaelis-Menten equation obtained from OriginPro software. Experiments were performed in triplicate, and error bars represent the standard deviations.

    Tafel 2

    Kinetics parameters and stability of recombinant hTyrCtr and OCA1B-related mutant variants.

    EiwitKm (mM)Vmax (mM/sec)kkat (sec 𢄡 )Kkat/Km (min 𢄡 sec 𢄡 )ΔG (kcal/mol)ΔΔG
    hTyrCtr0.85 ± 0.220.23 ± 0.01128.59 ± 6.52150.64 ± 7.641.94 ± 0.02-
    R422W0.84 ± 0.070.18 ± 0.03102.57 ± 15.14121.82 ± 17.981.93 ± 0.07𢄠.01
    R402Q0.80 ± 0.050.16 ± 0.0192.63 ± 2.37116.07 ± 2.972.29 ± 0.05+0.35
    R422Q0.73 ± 0.120.14 ± 0.0278.44 ± 9.69107.40 ± 13.262.42 ± 0.07+0.48
    P406L0.65 ± 0.170.13 ± 0.0272.17 ± 11.07111.55 ± 17.102.76 ± 0.06+0.82

    Kinetics parameters, the Michaelis-Menten constant (Km) and maximal velocity (Vmax) were obtained from SoftMax Pro software (Molecular Devices, CA) and Vmax was then converted from mOD/min to mM/sec using the rates of kinetics reactions obtained from the initial slopes. The enzyme turnover (kkat) was defined as Vmax/Et, waar Et is concentration of enzyme in mM. kkat/Km, enzyme efficiency. ΔG, the Gibbs free energy, was calculated from unfolding/refolding reactions for each protein.

    Conformational and activity changes on urea induced folding - refolding

    To test if missense mutations resulted in conformational perturbations, proteins were probed using far-UV circular dichroism, CD (secondary structure) and intrinsic protein fluorescence (tertiary structure). The similarity of the far-UV CD spectra of OCA1B-related mutants and hTyrCtr suggests little or no change in their overall secondary structure (Supplementary Materials, Figure S2B).

    The three amino acids give rise to intrinsic fluorescence, phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr), and tryptophan (Trp), but most is due to Trp. The 40 ns tyrosinase homology model indicates that 6 out of a total of 11 Trp are buried inside the enzyme (Supplementary Materials, Figure S3). Thus, Trp can be used to monitor changes in the tertiary structures under unfolding/refolding conditions. Native hTyrCtr has a fluorescence maximum at 340 nm, which upon unfolding with urea red shifts to 363 nm with an increase in intensity (Supplementary Materials, Figures S4 and S5). These spectral changes are consistent with protein unfolding where buried and quenched Trp(s) are solvent exposed. Similar red shifts (23� nm) were observed for OCA1B-related mutants after urea treatment (Supplementary Materials, Figure S5). When the denatured protein was refolded, the fluorescence maximum of hTyrCtr was blue-shifted to 340 nm indicating folding reversibility. The OCA1B-related mutants, R422W, R402Q, R422Q, and P406L, when refolded, also blue-shifted to varying degrees, but none reached native-like 340 nm ( Table 1 , Supplementary Materials, Figures S4 and S5). Although the emission intensity of R422Q was decreased, possibly due to protein aggregation, both mutant variants, R422Q and P406L, showed partially recovered L-DOPA activity after the refolding, 62% and 47%, respectively. Consistent with the fluorescence monitoring, the specific activities of hTyrCtr and mutants R422W and R402Q, exhibited loss and regain of activity, which confirmed the fully reversible denaturation-renaturation cycle. These results are summarized in Table 1 .

    Equilibrium unfolding and refolding

    Urea-induced equilibrium unfolding/refolding of hTyrCtr and mutants were obtained by plotting the fluorescence emission 360/320 nm ratio as a function of urea concentration. The sigmoidal curves were fitted using the Boltzmann function ( Figure 4 ). The refolded hTyrCtr, R402Q, and R422Q exhibited native-like response curves whereas the mutant variants, R422W and P406L, curves exhibited hysteresis. The stability of the proteins expressed as free energy changes (ΔG) were determined at zero urea concentration as shown in a Table 2 . These changes in protein stability show a remarkable correlation with the specific activity ( Figure 5A ), suggesting the decrease in protein specific activities in the OCA1B-related missense mutations is due to the decrease in protein stabilities.

    Intrinsic tryptophan fluorescence was measured using an excitation wavelength of 285 nm. Emission spectra were recorded in the range between 300 and 400 nm. Proteins (10 μM) were in 10 mM phosphate buffer, pH 7.4 with 0𠄸 M urea. For refolding, proteins were dialyzed against 10 mM phosphate buffer, pH 7.4 at 4ଌ for 24 h. Unfolding and refolding curves were measured as a 360/320 nm ratio and indicated by black and green points, respectively. To visualize the unfolding/refolding the experimental points were fitted with a Boltzmann function using OriginPro 2015 as indicated by black and green lines for unfolding and refolding, respectively.

    Specific activity of the hTyrCtr and R422W, R402Q, R422Q, and P406L mutant variants was obtained as the diphenol oxidase enzyme activity (as described in Materials and Methods section), multiplied by the sample total volume and divided by total protein.

    Panel A shows a negative correlation (Pearson’s r = 𢄠.992) between the experimental Gibbs free energies (ΔG) and the specific activity for each protein. Protein stability ΔG (kcal/mol) values were characterized and calculated from unfolding/refolding reactions.

    Panel B represents a positive correlation (Pearson’s r = 0.962) between Kkat, the enzyme turnover (sec 𢄡 ) and the specific activity. Enzyme turnover was defined as a ratio of Vmax/Et, waar Et is concentration of enzyme in mM.

    Panel C shows a positive correlation (Pearson’s r = 0.900) between enzyme efficiency, Kkat/Km (min 𢄡 sec 𢄡 ), and the specific activity.

    Catalytic properties of the recombinant human full length and truncated tyrosinases

    In order to compare the enzymatic properties of hTyrCtr (Dolinska et al., 2014) and full length detergent associated hTyr tyrosinase, kinetic parameters obtained from reactions with L-DOPA were measured under the same conditions in the presence of 0.1% Triton X-100. The kinetic parameters Km, Vmax, en kkat for hTyr were 0.68 ± 0.03 mM, 0.21 ± 0.04 mM/sec, and 140.04 ± 28.89 sec 𢄡 , respectively, and for hTyrCtr, were 0.64 ± 0.03 mM, 0.18 ± 0.03 mM/sec, and 103.23 ± 16.26 sec 𢄡 , respectively. Specific activity for hTyr was 238,741 ± 6370 U/mg and for hTyrCtr 439,851 ± 18,736 U/mg.


    Auteurs informatie

    Present address: Laboratory for Chemistry and Life Science, Institute of Innovative Research, Tokyo Institute of Technology, 4259 Nagatsuta-cho, Midori-ku, Yokohama, 226-8503, Japan

    Kazuki Harada and Motoki Ito contributed equally to this work.

    Voorkeuren

    Department of Life Sciences, Graduate School of Arts and Sciences, The University of Tokyo, 3-8-1 Komaba, Meguro, Tokyo, 153-8902, Japan

    Kazuki Harada & Takashi Tsuboi

    Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo, Tokyo, 113-0033, Japan

    Motoki Ito & Takashi Tsuboi

    Laboratory for Neuron-Glia Circuitry, RIKEN Brain Science Institute, Hirosawa 2-1, Wako-shi, Saitama, 351-0198, Japan

    Xiaowen Wang, Mika Tanaka & Hajime Hirase

    Cell Signaling Group, WASEDA Bioscience Research Institute in Singapore (WABIOS), 11 Biopolis Way, #05-02 Helios, Singapore, 138667, Singapore

    Devina Wongso & Tetsuya Kitaguchi

    Department of Neurophysiology and Neural Repair, Gunma University Graduate School of Medicine, Maebashi, Gunma, 371-8511, Japan

    Ayumu Konno & Hirokazu Hirai

    Comprehensive Research Organization, Waseda University, #304, Block 120-4, 513 Wasedatsurumaki-cho, Shinjuku, Tokyo, 162-0041, Japan


    Bekijk de video: Setatus WA mau balik ke pondok (November 2021).