Informatie

Wat is de rol van pyrofosfatase bij RNA-polymerisatie?


In Molecular Cell Biology (8e editie) staat een fragment in hoofdstuk 5.2 dat zegt:

De energetische eigenschappen van de polymerisatiereactie zijn sterk voorstander van de toevoeging van ribonucleotiden aan de groeiende RNA-keten omdat de hoogenergetische binding tussen de - en -fosfaten van rNTP-monomeren wordt vervangen door de laagenergetische fosfodiesterbinding tussen nucleotiden. Het evenwicht voor de reactie wordt verder gedreven in de richting van ketenverlenging door pyrofosfatase, een enzym dat de splitsing van het vrijgekomen PPi in twee moleculen anorganisch fosfaat katalyseert.

Hoe maakt de pyrofosfatase de reactie gunstiger? Maakt het "moeilijker" voor trifosfaten om weer terug te vormen (nu moet je fosfaten één voor één hechten, niet twee tegelijk)? Zo ja, is één extra fosfaat dan niet net zo slecht als twee? Om een ​​van beide te verwijderen, moet je één binding verbreken (tussen het eerste fosfaat en het tweede), en je hebt een gespecialiseerd enzym om er twee te verwijderen (het RNA-polymerase). Is het vormen van een difosfaat (dat moet worden gevormd om later trifosfaat te maken) eigenlijk niet erger? Of misschien "hergebruikt" het op de een of andere manier energie die is opgeslagen in de binding tussen de twee overgebleven fosfaten?

Sorry als ik niet de juiste woordenschat heb gebruikt, ik ben nieuw in biologie.


Deze vraag kan worden beantwoord door overwegingen van chemisch evenwicht. Voor elke chemische reactie:

$$ce{A + B <=> C + D}$$

Het is een eigenschap van de natuur dat verwijdering van product ($C$ of $D$) uit het reactiemengsel drijft de reactie in voorwaartse richting. Dit is een voorbeeld van het principe van le Chatelier en kan als volgt worden uitgelegd:

In een reactiemengsel met $A$, $B$, $C$ en $D$, de snelheid van voorwaartse reactie ($A + B echterpijl C + D$) hangt af van de frequentie van botsing van $A$ en $B$ moleculen. Evenzo is de snelheid van achterwaartse reactie ($C + D echts A + B$) hangt af van de botsingssnelheid van $C$ en $D$ moleculen. De aanvaringsfrequenties nemen op hun beurt toe met de concentratie van de betreffende soorten. Een abrupte vermindering van de concentratie van $C$ belemmert de achterwaartse reactie terwijl de voorwaartse reactie ongewijzigd blijft. Zo begint de voorwaartse reactie te domineren.

De reactie die wordt gekatalyseerd door RNA-polymerase is:

$$ce{RNA + NTP <=> Langer RNA + PP_i}$$

Door te verwijderen $ ext{PP}_i$ uit het reactiemengsel doet pyrofosfatase precies dat en stimuleert de reactie in het voordeel van RNA-polymerisatie. Merk op dat hydrolyse van pyrofosfaat de voorkeur heeft vanwege de negatieve verandering in vrije energie die ermee gepaard gaat (dank aan David voor het erop wijzen).


Meerdere facetten van H+-pyrofosfatase en verwante enzymen

Pyrofosfaat (PPi) wordt gegenereerd in biosynthetische reacties zoals de synthese van UDP-glucose, het substraat voor glycogeensynthese bij dieren en cellulose in planten. Andere anabole reacties zoals polymerisatie van DNA, RNA en aminozuuractivering voor eiwitsynthese maken ook PPi vrij. Bij planten, .

Pyrofosfaat (PPi) wordt gegenereerd in biosynthetische reacties zoals de synthese van UDP-glucose, het substraat voor glycogeensynthese bij dieren en cellulose in planten. Andere anabole reacties zoals polymerisatie van DNA, RNA en aminozuuractivering voor eiwitsynthese maken ook PPi vrij. In planten katalyseren H+-translocerende pyrofosfatasen (H+-PPasen) een gekoppelde reactie van PPi-hydrolyse en actief protontransport door membranen. Als eerste rol is PPi-hydrolyse belangrijk om anabole biochemische reacties te bevorderen. PPi wordt gehydrolyseerd en de adequate concentraties ervan in de verschillende cellulaire compartimenten worden gehandhaafd door H+-PPasen en andere organel- of cytosol-gelokaliseerde oplosbare pyrofosfatasen. Als tweede rol verzuurt H+-PPase het vacuolaire lumen samen met het vacuolaire H+-ATPase. Deze rol is belangrijk om het actieve transport van voedingsstoffen en ionen door het vacuolaire membraan te stimuleren en ook om te voorzien in zure omstandigheden die essentieel zijn voor enzymatische activiteiten in de vacuole. Hoewel de biochemische eigenschappen van deze twee sleutelenzymen (H+-PPase en H+-ATPase) in eerdere rapporten zijn ontleed, is onze kennis over hun bijdrage aan plantengroei en -ontwikkeling in vivo onder verschillende omgevingen en in verschillende ontwikkelingsstadia en organen fragmentarisch.
Daarom is het waardevol om de recente vooruitgang en concepten over de relatie tussen PPi, H+-PPase, pyrofosfatase van het oplosbare type en vacuolaire H+-ATPase te bekijken. Het onderzoeksonderwerp "Meerdere facetten van H+-pyrofosfatase en verwante enzymen" heeft tot doel niet alleen licht te werpen op de individuele en verschillende eigenschappen van elk van de bovengenoemde enzymen, maar ook op hun samenwerkende rol in vivo bij organisme, orgaan, weefsel, cel en organel niveaus. We hopen dat dit onderzoeksonderwerp ook een platform zal zijn om de onderliggende mechanismen en principes te communiceren en te bespreken waarmee deze protonpompen bijdragen aan de ontwikkeling van planten en adaptieve processen. We verwelkomen artikelen die inzicht geven in, maar niet beperkt zijn tot de volgende aspecten: - Biochemie. - Moleculaire biologie. – Fysiologie. - Elektrofysiologie. - Stressrespons en weerstand. - Cellenbiologie. - Ontwikkeling. Daarom is dit onderzoeksonderwerp bedoeld om inzendingen van wereldklasse te verzamelen, waaronder origineel onderzoek, recensies, minirecensies, methoden, commentaren en perspectief en mening die doorbraken communiceren over de bovengenoemde enzymen, niet alleen in modelorganismen, maar in een breed scala aan plantensoorten .

Belangrijke notitie: Alle bijdragen aan dit onderzoeksonderwerp moeten vallen binnen de reikwijdte van de sectie en het tijdschrift waaraan ze worden voorgelegd, zoals gedefinieerd in hun missieverklaringen. Frontiers behoudt zich het recht voor om een ​​manuscript dat buiten het bereik valt in elk stadium van peer review naar een meer geschikte sectie of tijdschrift te leiden.


Overgangsmetaalgroepen 7 en 8

5.1.8.2.4 Anorganische pyrofosfatase

Anorganische pyrofosfatasen (PP lase) komen voor in bijna alle levende cellen, waar ze de hydrolyse van P . katalyseren2O7 4− tot fosfaat. Alle bekende PPlassen vereisen een tweewaardig metaalion voor katalyse, Mg2+ heeft gewoonlijk de hoogste activiteit. Kristalstructuren van de Mg 2+-geactiveerde enzymen van een aantal organismen, Sulfolobus acidocaldarius, 644 S. cerevisiae 645–647 en E coli 648–650 zijn bepaald met Mn2+ gebonden in de actieve plaats en deze structurele onderzoeken zijn beoordeeld. 651 De actieve plaatsstructuur gevormd door ∼15 aminozuurresiduen en de drie of vier metaalionen zijn sterk geconserveerd in deze verschillende enzymen. De liganden van de metaalionen in deze structuren zijn aspartaat- en glutamaatzijketens, watermoleculen en fosfaatzuurstoffen.

In 1998 de al lang bekende Bacillus subtilis anorganische pyrofosfatase werd gekarakteriseerd en bleek een veel grotere activiteit te hebben dan de bovenstaande enzymen, een geheel andere aminozuursequentie te hebben, niet te worden geremd door Fe en te worden geactiveerd door Mn2+. 652–656 Deze vorm van het enzym is sindsdien erkend als aanwezig in veel meer bacteriesoorten. Kristalstructuren van de enzymen uit Streptococcus mutans 657 en van Streptococcus gordonii 658 zijn bepaald. De geometrie van de actieve site wordt weergegeven in Afbeelding 26 . De voorkeur voor Mn2+ boven Mg2+ wordt verklaard door de histidineliganden.

Afbeelding 26 . Schematische voorstelling van de Mn2+-coördinatiesfeer in anorganische mangaanpyrofosfatase.


Een vereenvoudigd model voor de RNAi-route

Een vereenvoudigd model voor de RNAi-route is gebaseerd op twee stappen, waarbij elk ribonuclease-enzym betrokken is. In de eerste stap wordt het trigger-RNA (ofwel dsRNA of miRNA primair transcript) verwerkt tot een kort, interfererend RNA (siRNA) door de RNase II-enzymen Dicer en Drosha. In de tweede stap worden siRNA's geladen in het effectorcomplex RNA-geïnduceerde silencing-complex (RISC). Het siRNA wordt afgewikkeld tijdens RISC-assemblage en het enkelstrengs RNA hybridiseert met mRNA-doelwit. Gen-uitschakeling is het resultaat van nucleolytische afbraak van het beoogde mRNA door het RNase H-enzym Argonaute (Slicer). Als de siRNA/mRNA-duplex mismatches bevat, wordt het mRNA niet gesplitst. Gene silencing is eerder een gevolg van translationele remming.


Fysische principes en bestaande biologie onthullen rollen voor RNA-bevattende membraanloze compartimenten in Origins of Life Chemistry

Dit perspectief richt zich op RNA in biologische en niet-biologische compartimenten als gevolg van vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS), met de nadruk op de oorsprong van het leven. In bestaande cellen zorgen intracellulaire vloeibare condensaten, waarvan er vele rijk zijn aan RNA's en intrinsiek ongeordende eiwitten, voor ruimtelijke regulatie van biomoleculaire interacties die kunnen leiden tot veranderde genexpressie. Gezien de diversiteit van biogene en abiogene moleculen die LLPS ondergaan, kunnen dergelijke membraanloze compartimenten ook een sleutelrol hebben gespeeld in prebiotische chemie die relevant is voor de oorsprong van het leven. De RNA World-hypothese stelt dat RNA tijdens het ontstaan ​​van het leven zowel als genetische informatiedrager als katalysator heeft gediend. Vanwege de polyanionische ruggengraat kan RNA LLPS ondergaan door complexe coacervatie in aanwezigheid van polykationen. Fasescheiding zou een mechanisme kunnen bieden voor het concentreren van monomeren voor RNA-synthese en het selectief verdelen van langere RNA's met enzymatische functies, waardoor de prebiotische evolutie wordt gestimuleerd. We introduceren verschillende soorten LLPS die kunnen leiden tot compartimentering en bespreken mogelijke rollen in template-gemedieerde niet-enzymatische polymerisatie van RNA en andere gerelateerde biomoleculen, functies van ribozymen en aptameren, en voordelen of sancties die worden verleend door vloeistofontmenging. We concluderen dat kleine vloeibare druppeltjes kostbare biomoleculen kunnen hebben geconcentreerd en als bioreactoren in de RNA-wereld hebben gewerkt.

Figuren

Fasescheiding in bestaande biologie ...

Fasescheiding in bestaande biologie (links) en prebiotische chemie (rechts). Regio's met een lage complexiteit...

Niet-associatieve en associatieve fasescheiding.…

Niet-associatieve en associatieve fasescheiding. Bij niet-associatieve fasescheiding, oplossingen die rijk zijn aan twee...

Structuren van moleculen besproken in ...

Structuren van moleculen die in dit perspectief worden besproken en die betrokken zijn bij de associatieve fase ...

Coacervaten concentreren monomeren en polymeren...

Coacervaten concentreren monomeren en polymeren A) (links) Centrifugatie scheidt de gecondenseerde fase van de…

Meerdere mechanismen voor RNA-partitionering...

Meerdere mechanismen voor RNA-partitionering in membraanloze compartimenten (A) Ddx4-eiwit condenseert differentieel...

Ribozym katalyse in niet-associatieve fase...

Ribozyme-katalyse in niet-associatief fasegescheiden systeem en Mg 2+-partitionering in associatieve...

Moleculaire en ecologische afstemming van…

Moleculaire en omgevingsafstemming van coacervaten (A) en (B) Fosfatase-enzym verhogen de…

Potentiële bijdragen van coacervaatcomponenten...

Potentiële bijdragen van coacervaatcomponenten aan prebiotische katalyse en evolutie. (A) Verschillende katalytische ...


Inhoud

Thermostabiel oplosbaar pyrofosfatase was geïsoleerd uit het extremofiel Thermococcus litoralis. De 3-dimensionale structuur werd bepaald met behulp van röntgenkristallografie en bleek te bestaan ​​uit twee alfa-helices, evenals een antiparallel gesloten bèta-blad. De vorm van anorganische pyrofosfatase geïsoleerd uit Thermococcus litoralis bleek in totaal 174 aminozuurresiduen te bevatten en een hexamere oligomere organisatie te hebben (Afbeelding 1). [10]

Mensen bezitten twee genen die coderen voor pyrofosfatase, PPA1 en PPA2. [11] PPA1 is toegewezen aan een genlocus op humaan chromosoom 10, [12] en PPA2 aan chromosoom 4. [13]

Hoewel het precieze mechanisme van katalyse via anorganische pyrofosfatase in de meeste organismen onzeker blijft, zijn plaatsgerichte mutagenesestudies in Escherichia coli hebben de analyse van de actieve plaats van het enzym en de identificatie van de belangrijkste aminozuren mogelijk gemaakt. In het bijzonder heeft deze analyse 17 residuen onthuld die mogelijk van functioneel belang zijn bij katalyse. [14]

Verder onderzoek suggereert dat de protoneringstoestand van Asp67 verantwoordelijk is voor het moduleren van de omkeerbaarheid van de reactie in Escherichia coli. Het is aangetoond dat de carboxylaat-functionele groep van dit residu een nucleofiele aanval op het pyrofosfaatsubstraat uitvoert wanneer vier magnesiumionen aanwezig zijn. Er is aangetoond dat directe coördinatie met deze vier magnesiumionen en waterstofbindingsinteracties met Arg43, Lys29 en Lys142 (alle positief geladen residuen) het substraat aan de actieve plaats verankeren. Er wordt ook gesuggereerd dat de vier magnesiumionen betrokken zijn bij de stabilisatie van de trigonale bipyramide-overgangstoestand, die de energetische barrière voor de bovengenoemde nucleofiele aanval verlaagt. [14]

Verschillende onderzoeken hebben ook aanvullende substraten geïdentificeerd die kunnen werken als allosterische effectoren. Met name de binding van pyrofosfaat (PPi) aan de effectorplaats van anorganische pyrofosfatase verhoogt de hydrolysesnelheid op de actieve plaats. [15] Van ATP is ook aangetoond dat het functioneert als een allosterische activator in Escherichia coli, [16] terwijl is aangetoond dat fluoride de hydrolyse van pyrofosfaat in gist remt. [17]

De hydrolyse van anorganisch pyrofosfaat (PPi) tot twee fosfaationen wordt in veel biochemische routes gebruikt om reacties effectief onomkeerbaar te maken. [18] Dit proces is zeer exergoon (goed voor een verandering van ongeveer −19kJ in vrije energie), en verhoogt daarom de energetische gunstigheid van het reactiesysteem aanzienlijk wanneer het wordt gekoppeld aan een typisch minder gunstige reactie. [19]

Anorganische pyrofosfatase katalyseert deze hydrolysereactie in de vroege stappen van lipideafbraak, een prominent voorbeeld van dit fenomeen. Door de snelle hydrolyse van pyrofosfaat (PPi) te bevorderen, levert anorganische pyrofosfatase de drijvende kracht voor de activering van vetzuren die bestemd zijn voor bèta-oxidatie. [19]

Voordat vetzuren kunnen worden afgebroken om aan de metabolische behoeften van een organisme te voldoen, moeten ze eerst worden geactiveerd via een thio-esterkoppeling aan co-enzym A. Dit proces wordt gekatalyseerd door het enzym acyl-CoA-synthetase en vindt plaats op het buitenste mitochondriale membraan. Deze activering wordt bereikt in twee reactieve stappen: (1) het vetzuur reageert met een ATP-molecuul om een ​​enzymgebonden acyladenylaat en pyrofosfaat (PPi) te vormen, en (2) de sulfhydrylgroep van CoA valt het acyladenylaat aan en vormt acyl CoA en een molecuul AMP. Elk van deze twee stappen is omkeerbaar onder biologische omstandigheden, behalve de extra hydrolyse van PPi door anorganische pyrofosfatase. [19] Deze gekoppelde hydrolyse levert de drijvende kracht voor de algehele voorwaartse activeringsreactie en dient als een bron van anorganisch fosfaat dat in andere biologische processen wordt gebruikt.

Onderzoek van prokaryotische en eukaryote vormen van oplosbare anorganische pyrofosfatase (sPPase, Pfam PF00719) heeft aangetoond dat ze significant verschillen in zowel aminozuursequentie, aantal residuen en oligomere organisatie. Ondanks verschillende structurele componenten, heeft recent werk een grote mate van evolutionair behoud van de actieve sitestructuur en het reactiemechanisme gesuggereerd, gebaseerd op kinetische gegevens. [20] Analyse van ongeveer een miljoen genetische sequenties van organismen in de Sargassozee identificeerde een sequentie van 57 residuen binnen de regio's die coderen voor protonpompende anorganische pyrofosfatase (H + -PPase) die sterk geconserveerd lijkt te zijn. Deze regio bestond voornamelijk uit de vier vroege aminozuurresiduen Gly, Ala, Val en Asp, wat een evolutionair oude oorsprong voor het eiwit suggereert. [21]


Abstract

We hebben de RNA-afsluitende enzymactiviteiten van blauwtongvirus (BTV) minder belangrijk kerneiwit, VP4, onderzocht. Recombinant BTV VP4-eiwit werd tot homogeniteit gezuiverd uit insectencelkweek geïnfecteerd met een baculovirus VP4 van BTV-serotype 10. We demonstreren dat het gezuiverde eiwit en VP4 ingekapseld in kernachtige deeltjes, reageren met GTP en covalent GMP binden via een fosfoamidebinding, een kenmerkend kenmerk van het guanylyltransferase-enzym. VP4 katalyseert ook een GTP-PPi-uitwisselingsreactie, wat aangeeft dat het eiwit het guanylyltransferase van het virus is. Bovendien bezit VP4 een RNA 5'-trifosfatase-activiteit die de eerste stap in de RNA-capping-sequentie katalyseert. Verder werd een anorganische pyrofosfatase-activiteit geïdentificeerd die de transcriptie-activiteit binnen het virus kan helpen door anorganisch pyrofosfaat te verwijderen dat een remmer is van de polymerisatiereactie. Ten slotte is het directe bewijs van VP4-capping-activiteit verkregen door aan te tonen: in vitro overdracht van GMP naar het 5′ einde van in vitro gesynthetiseerde BTV ssRNA-transcripten om een ​​cap-structuur te vormen.


Abstract

De 'RNA-wereld'-hypothese stelt dat vroeg in de evolutie van het leven, vóór het verschijnen van DNA of eiwit, RNA verantwoordelijk was voor zowel het coderen van genetische informatie als voor het katalyseren van biochemische reacties. Ribo-organismen die in de RNA-wereld leven, zouden hun RNA-genomen hebben gerepliceerd met behulp van een RNA-polymerase-ribozym. Pogingen om experimentele ondersteuning te bieden voor de RNA-wereldhypothese waren gericht op het produceren van zo'n polymerase, en in vitro evolutiemethoden hebben geleid tot de isolatie van een polymerase-ribozym dat primerverlenging katalyseert, wat nauwkeurig en algemeen is, maar langzaam. Om de reactie van dit ribozym te begrijpen, hebben we een methode ontwikkeld om de polymerase-procesiviteit te meten die vooral nuttig is in het geval van een inefficiënte polymerase. Met deze methode konden we aantonen dat het polymerase-ribozym, ondanks zijn inefficiëntie, gedeeltelijk processief is. Het wordt momenteel beperkt door een lage affiniteit voor de primer-template-duplex, maar zodra het met succes de primer-template-duplex bindt in de productieve uitlijning, katalyseert het een verlengingsreactie die zo snel is dat het meerdere keren kan optreden tijdens de korte tijdspanne van een enkele bindende gebeurtenis. Deze bevinding draagt ​​bij aan het begrip van een van de meer geavanceerde activiteiten die nog moeten worden gegenereerd de novo in het laboratorium en werpt licht op de parameters die moeten worden nagestreefd voor verdere optimalisatie.


RNA-modificatie

Meemanage D. De Zoysa, Yi-Tao Yu, in The Enzymes, 2017

5.3 Het gistsysteem

In S. cerevisiae U2 snRNA, er zijn drie pseudouridines bij de BSRR. Ψ35 en Ψ44 worden gemodificeerd door respectievelijk de zelfstandige eiwitenzymen Pus7p en Pus1p. De derde plaats, Ψ42, is gemodificeerd door snR81, een box H/ACA RNP Ψ42 is de enige RNA-geleide modificatieplaats in het gist U2 snRNA [18,19,56]. De identificatie van drie enzymen die verantwoordelijk zijn voor pseudo-uridylatie op drie plaatsen in U2-snRNA, maakte het mogelijk om een ​​genetische analyse uit te voeren om de functie van U2-pseudo-uridylering in pre-mRNA-splitsing van gist te ontleden. De experimenten toonden aan dat verwijdering van pseudouridines, afzonderlijk of in combinatie, resulteerde in splitsingsdefecten (in verschillende mate), wat op zijn beurt leidde tot groeidefecten [9,65].


Remmende RNA-aptameren van Tau-oligomerisatie en hun neuroprotectieve rol tegen proteotoxische stress

Tau is een cytosolisch eiwit dat functioneert bij de assemblage en stabilisatie van axonale microtubuli-netwerken. De oligomerisatie ervan kan de snelheidsbeperkende stap zijn van de vorming van onoplosbaar aggregaat, wat een neuropathologisch kenmerk is van de ziekte van Alzheimer (AD) en een aantal andere tauopathieën. Recent bewijs geeft aan dat oplosbare tau-oligomeren de toxische soorten zijn voor door tau gemedieerde pathologie tijdens AD-progressie. Hierin beschrijven we nieuwe RNA-aptameren die gericht zijn op menselijk tau en werden geïdentificeerd door middel van een in vitro selectieproces. Deze aptameren remden significant de neiging tot oligomerisatie van tau, zowel in vitro als in gekweekte celmodellen van tauopathie zonder de halfwaardetijd van tau te beïnvloeden. Met de aptameren behandelde tauopathiemodelcellen waren minder gevoelig voor proteotoxische stress die door overexpressie van tau werd geïnduceerd. Bovendien verlichtten de tau-aptameren significant de synthetische tau-oligomeer-gemedieerde neurotoxiciteit en het verlies van dendritische wervelkolom in primaire hippocampale neuronen. Onze studie toont dus aan dat het vertragen van tau-assemblage met RNA-aptameren een effectieve strategie is voor het beschermen van cellen onder verschillende neurodegeneratieve spanningen die afkomstig zijn van pathogene tau-oligomerisatie.

trefwoorden: Ziekte van Alzheimer SELEX aggregatie aptameer remming neurotoxiciteit oligomerisatie tau tauopathie.


Bekijk de video: Transcription DNA to mRNA (Januari- 2022).