Informatie

7.16A: Detectie van niet-gecultiveerde micro-organismen - biologie


Met behulp van metagenomica kunnen de microbiële bestanddelen van de wereld worden geïdentificeerd door elke individuele soort te kweken.

LEERDOELEN

Herken de methoden die worden gebruikt om niet-gecultiveerde micro-organismen te detecteren

Belangrijkste punten

  • Veel organismen die ziekten kunnen veroorzaken, zijn niet kweekbaar, dus een eencellige kweek kan niet worden verkregen.
  • Eerste studies van microbiële fauna toonden aan dat ze diverser zijn dan verwacht en veel microben bevatten die niet kweekbaar waren.
  • Vooruitgang in moleculair biologische technieken maakt het mogelijk om alle of ten minste veel van de genomen van microben in een monster te sequensen.

Sleutelbegrippen

  • shotgun-sequencing: Een techniek voor DNA-sequencing waarbij een groot aantal kleine fragmenten van een lange DNA-streng willekeurig wordt gegenereerd, de sequentie wordt bepaald en opnieuw wordt samengesteld om een ​​sequentie van de oorspronkelijke streng te vormen.
  • kweekbaar: Kweekbaar (gekweekt in een geschikte omgeving).
  • sequentiëring met hoge doorvoer: Technologieën die het sequencingproces parallelliseren en duizenden of miljoenen sequenties tegelijk produceren.

Identificatie van bacteriën in het laboratorium is met name relevant in de geneeskunde, waar de juiste behandeling wordt bepaald door de bacteriesoort die een infectie veroorzaakt. Bijgevolg was de noodzaak om menselijke pathogenen te identificeren een belangrijke stimulans voor de ontwikkeling van technieken om bacteriën te identificeren.

Vroege studies hebben aangetoond dat het microbiële leven om ons heen in de lucht, de zee en de bodem zeer divers is en dat slechts een klein deel van de soorten bekend is. Een beperking van het identificeren van menselijke pathogenen of conventionele sequencing begint met een kweek van identieke cellen als een bron van DNA. Vroege metagenomische studies hebben echter aangetoond dat er waarschijnlijk grote groepen micro-organismen in veel omgevingen zijn die niet kunnen worden gekweekt en dus niet kunnen worden gesequenced. Deze vroege studies waren gericht op 16S-ribosomale RNA-sequenties die relatief kort zijn, vaak binnen een soort geconserveerd en over het algemeen verschillend tussen soorten. Er zijn veel 16S-rRNA-sequenties gevonden die tot geen enkele bekende gekweekte soort behoren, wat aangeeft dat er talrijke niet-geïsoleerde organismen zijn. Deze onderzoeken naar ribosomale RNA- (rRNA)-genen die rechtstreeks uit de omgeving zijn genomen, onthulden dat op kweek gebaseerde methoden minder dan 1% van de bacteriële en archaeale soorten in een monster vinden.

De ontdekking van een dergelijke diversiteit leidde tot het gebied van metagenomics, dat is de studie van metagenomen, genetisch materiaal dat rechtstreeks uit omgevingsmonsters wordt gewonnen. In plaats van een microbe te kweken, neemt deze benadering een monster en identificeert de verschillende soorten erin door alle soorten tegelijkertijd te sequencen. Het terugwinnen van DNA-sequenties langer dan een paar duizend basenparen uit omgevingsmonsters was echter erg moeilijk tot recente vooruitgang in moleculair biologische technieken. Meer specifiek zorgde de constructie van bibliotheken in bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC's) voor betere vectoren voor moleculaire klonering.

Vooruitgang in bio-informatica, verfijningen van DNA-amplificatie en de verspreiding van rekenkracht hebben de analyse van DNA-sequenties die zijn teruggevonden uit omgevingsmonsters enorm geholpen. Deze vooruitgang heeft de aanpassing van shotgun-sequencing aan metagenomische monsters mogelijk gemaakt. De benadering, die wordt gebruikt om veel gekweekte micro-organismen en het menselijk genoom te sequensen, schuift willekeurig DNA af, sequentieert vele korte sequenties en reconstrueert ze tot een consensussequentie.

Shotgun-sequencing en schermen van kloonbibliotheken onthullen genen die aanwezig zijn in omgevingsmonsters. Dit kan nuttig zijn bij het begrijpen van de ecologie van een gemeenschap, vooral als meerdere monsters met elkaar worden vergeleken. Dit werd verder gevolgd door high-throughput-sequencing die hetzelfde proces deed als de shotgun-sequencing, maar op een veel grotere schaal in termen van de hoeveelheid DNA die uit één monster kon worden gesequenced. Dit geeft informatie over zowel welke organismen aanwezig zijn als welke metabolische processen mogelijk zijn in de gemeenschap. Met behulp van metagenomica en de resulterende sequencing van niet-gecultiveerde microben, heeft metagenomics het potentieel om kennis op een groot aantal verschillende gebieden te vergroten. Het kan ook worden toegepast om praktische uitdagingen op het gebied van geneeskunde, techniek, landbouw en duurzaamheid op te lossen.


Katabolisme en interacties van niet-gecultiveerde organismen gevormd door eco-thermodynamica in methanogene bioprocessen

Het huidige begrip van de koolstofcyclus in methanogene omgevingen omvat trofische interacties zoals interspecies H2 overdracht tussen organotrofen en methanogenen. Veel metabole processen zijn echter thermodynamisch gevoelig voor H2 accumulatie en kan worden geremd door H2 geproduceerd door gelijktijdig optredende metabolismes. Strategieën voor het aansturen van thermodynamisch concurrerende metabolismes in methanogene omgevingen blijven onontgonnen.

Resultaten

Om te ontdekken hoe anaëroben deze H . bestrijden2 conflict in situ, gebruiken we metagenomica en metatranscriptomics om een ​​model-ecosysteem opnieuw te bekijken dat tot veel fundamentele ontdekkingen in de anaërobe ecologie heeft geleid: methanogene bioreactoren. Door analyse van 17 anaërobe vergisters hebben we 1343 hoogwaardige metagenoom-geassembleerde genomen en overeenkomstige genexpressieprofielen voor niet-gecultiveerde lijnen die 66 phyla omvatten, hersteld en hun metabolische capaciteiten gereconstrueerd. We ontdekten dat diverse niet-gecultiveerde populaties H . kunnen aandrijven2-gevoelige metabolismes door (i) metabole koppeling met gelijktijdige H2-tolerant katabolisme, (ii) afzien van H2 generatie ten gunste van interspeciesoverdracht van formaat en elektronen (cytochroom- en pili-gemedieerd) om thermodynamische conflicten te voorkomen, en (iii) integratie van lage concentratie O2 metabolisme als een aanvullende thermodynamica-verbeterende elektronenput. Archaeale populaties ondersteunen deze processen door unieke methanogene metabolismes - zeer gunstige H2 oxidatie gedreven door methyl-reducerende methanogenese en tripartiete opname van formiaat, elektronen en acetaat.

Conclusie

Integratie van omics en eco-thermodynamica onthulde over het hoofd gezien gedrag en interacties van niet-gecultiveerde organismen, inclusief het koppelen van gunstige en ongunstige metabolismes, verschuiving van H2 om overdracht te formatteren, ademen lage concentratie O2, het uitvoeren van directe interspecies elektronenoverdracht en interactie met hoge H2-affiniteit methanogenese. Deze bevindingen werpen licht op hoe micro-organismen een kritiek obstakel overwinnen in methanogene koolstofcycli die we tot nu toe buiten beschouwing hadden gelaten en bieden fundamenteel inzicht in anaërobe microbiële ecologie.


Abstract

Openbaar beschikbare sequentiedatabases van het kleine subeenheid ribosomale RNA-gen, ook bekend als 16S-rRNA in bacteriën en archaea, groeien snel en het aantal inzendingen bedraagt ​​momenteel meer dan 4 miljoen. Er bestaat echter nog geen uniform classificatie- en nomenclatuurkader voor alle bacteriën en archaea. In dit analyse-artikel stellen we rationele taxonomische grenzen voor hoge taxa van bacteriën en archaea voor op basis van 16S rRNA-gensequentie-identiteiten en suggereren we een reden voor de omschrijving van niet-gecultiveerde taxa die compatibel is met de taxonomie van gekweekte bacteriën en archaea. Onze analyses laten zien dat alleen bijna volledige 16S rRNA-sequenties nauwkeurige metingen van taxonomische diversiteit geven. Bovendien suggereren onze analyses dat de meeste van de 16S-rRNA-sequenties van de hoge taxa tegen het einde van het huidige decennium zullen worden ontdekt in milieuonderzoeken.


Nieuw perspectief op ongecultiveerde bacteriële fylogenetische deling OP11

Organismen die behoren tot de OP11 kandidaat-fylogenetische divisie van bacteriën zijn alleen gedetecteerd in op rRNA gebaseerde sequentie-onderzoeken van omgevingsmonsters. Voorlopige studies gaven aan dat dergelijke organismen die door de sequenties worden vertegenwoordigd, overvloedig en wijdverbreid van aard zijn en fylogenetisch zeer divers zijn. Om de fylogenetische omvang en verspreiding van deze diverse groep organismen in het milieu grondiger te documenteren, hebben we verdere moleculaire analyses uitgevoerd op milieu-DNA's. Met behulp van PCR-technieken en primers gericht op elk van de vijf beschreven onderverdelingen van OP11, hebben we 17 omgevings-DNA's onderzocht en rRNA-gensequenties geanalyseerd in 27 klonale bibliotheken uit 14 omgevingen. Negenennegentig nieuwe en unieke sequenties werden volledig bepaald en ongeveer 200 extra klonen werden onderworpen aan gedeeltelijke sequentiebepaling. Uitgebreide fylogenetische vergelijkingen van de nieuwe sequenties met die welke andere bacteriële divisies vertegenwoordigen, losten de fylogenie van de bacteriële kandidaat-divisie OP11 verder op en identificeerden twee nieuwe kandidaat-bacteriële divisies, OP11-afgeleid 1 (OD1) en Sulphur River 1 (SR1). De wijdverbreide verspreiding in het milieu van vertegenwoordigers van de bacteriële afdelingen OD1, OP11 en SR1 suggereert potentieel opvallende biogeochemische rollen voor deze organismen in hun respectievelijke omgevingen. De informatie over milieudistributie biedt aanwijzingen voor pogingen om historische vertegenwoordigers van deze nieuwe bacteriële divisies te kweken, en de sequenties zijn specifieke moleculaire handtekeningen die zorgen voor hun identificatie in andere contexten.

Figuren

Bootstrap-consensusboom met de ...

Bootstrap-consensusboom met de goed ondersteunde fylogenetische relaties voor de bacteriële divisies OP11, ...


Sulfide-gedreven denitrificatie: detectie van actieve micro-organismen in fed-batch verrijkingsculturen door DNA-stabiele isotopenonderzoek

Een microbiële gemeenschap werd verrijkt in het anoxische compartiment van een bioreactor op pilootschaal die 180 dagen in bedrijf was, werd gevoed met rioolwater en was ontworpen voor verwijdering van organisch materiaal, stikstof en sulfide door anaërobe vergisting, nitrificatie en mixotrofe denitrificatie te koppelen. Denitrificatie vond plaats met endogene elektronendonoren, voornamelijk sulfide en resterende organische stof, afkomstig uit het anaërobe compartiment. De micro-organismen die betrokken zijn bij denitrificatie met sulfide als elektronendonor werden geïdentificeerd door DNA-stabiele isotopenonderzoek met [U-13C]-gelabeld CO2 en NaHCO3. Volledige denitrificatie vond om de twee dagen plaats en de toegepaste NO3 −/S2−-verhouding was 1,6. Bacteriën die behoren tot de Sulfurimonas denitrificans werd geïdentificeerd als een chemoautotrofe denitrifier, en die gerelateerd aan Georgfuchisa toluolica, Geothrix fermentans en Ferritrophicum radicicola waren hoogstwaarschijnlijk geassocieerd met heterotrofe denitrificatie met behulp van endogene cellen en/of intermediaire metabolieten. Deze studie toonde aan dat DNA-SIP een geschikte techniek was om de actieve microbiota te identificeren die betrokken zijn bij door sulfide aangedreven denitrificatie in een complexe omgeving, wat kan bijdragen aan het verbeteren van het ontwerp en de werking van bioreactoren die gericht zijn op verwijdering van koolstof-stikstof-zwavel.


DISCUSSIE

Cultuuronafhankelijke moleculaire studies hebben een verband gesuggereerd tussen darmflora en inflammatoire darmaandoeningen 7, 11, allergieën 8, 10 en obesitas 9, 12. Omdat de functies van veel genen die aanwezig zijn in sequentiedatabases ongedefinieerd of onjuist geannoteerd zijn, vertegenwoordigen metagenomische gegevens alleen niet alle gekweekte darmbacteriën. Het kweken van tot nu toe niet-gecultiveerde bacteriën, die meer dan 70% van de darmbacteriën uitmaken 4 , zal onze mogelijkheden uitbreiden om uitgebreidere microbiologische studies uit te voeren (bijv. analyse van de bioactiviteit van individuele soorten en studies met isolaten in gnotobiotische dieren). Deze studies zullen meer gedetailleerde informatie opleveren over de relaties tussen de darmflora en ziekten bij de mens. Daarom is het ontwikkelen van kweekmethoden die elke beperking van conventionele kweekmethoden overwinnen, van cruciaal belang voor het bevorderen van microbieel onderzoek.

Cocultivering met andere bacteriën met behulp van een membraanfilter kan leiden tot toevoer van verschillende onbekende groeifactoren die van cruciaal belang zijn voor celgroei 25 .

Vergeleken met 1,5% agarmedium draagt ​​zachte agar bij aan het handhaven van ideale groeiomstandigheden omdat moleculen sneller diffunderen in de laatste. Methyleenblauw kleurstof diffundeert bijvoorbeeld sneller in 0,4% agar medium dan in 1,5% agar (gegevens niet getoond). Daarom kunnen groeifactoren die worden verschaft door een ondersteunende stam de doelstam sneller bereiken in zachte agar dan in vast plaatmedium. Verder kunnen metabolische producten en uitgescheiden stoffen sneller worden verwijderd, wat de door de metaboliet geïnduceerde remming van de groei en activiteit van bacteriën vermindert 26 . Bovendien kunnen bacteriën in zacht agarmedium afzonderlijke kolonies vormen en zijn ze gemakkelijker te isoleren.

Dit systeem is eenvoudig en kan gemakkelijk en economisch worden toegepast op conventionele instrumentatie en verschillende kweekomstandigheden (bijvoorbeeld aërobe en anaërobe culturen).

De nutriëntensamenstelling van TYG-medium is eenvoudiger dan die van conventionele kweekmedia. Voedingsrijke media kunnen metabolische onbalans veroorzaken en een deel van de bacteriën doden 27 . Daarentegen bevatten de meest conventionele kweekmedia (bijv. EG-medium) die worden gebruikt om darmbacteriën te isoleren meerdere suikers, rundvleesextract, bloed, vitamines en vetzuren om de celgroei te bevorderen 19, 28, 29 . De dunne darm absorbeert echter de meeste voedingsstoffen uit verteerd voedsel, terwijl de resterende voedingsstoffen slechts ongeveer 6-7% van de inhoud van de dikke darm uitmaken. Daarom zijn de feitelijke voedingscondities die worden geboden door verteerd voedsel in de menselijke darm waarschijnlijk onvoldoende om de darmmicrobiota te laten gedijen zonder symbiose, mutualisme, commensalisme of een combinatie van al deze factoren. Meer dan 70% van de kolonietellingen van een 14 dagen durende ontlastingscultuur op EG-agar werden bijvoorbeeld verkregen na 2 dagen incubatie. Hoewel dit medium de groei van bepaalde bacteriën versnelt, kan het kunstmatig de stoffen aanvullen die oorspronkelijk door andere bacteriën in de menselijke darm werden geleverd. Dus niet-gedetecteerde interbacteriële interacties van isolaten van EG-agar zijn waarschijnlijk toe te schrijven aan aangevulde stoffen die nodig zijn voor symbiose.

Daarentegen bleef het aantal kolonies in TYG-agar gedurende 14 dagen toenemen. Hiaten in bacteriegroei treden naar verluidt op in symbiotische kruisvoedingsstudies van Bifidobacterie soorten en boterzuurproducerende bacteriën 17, 18 . In een medium dat fructo-oligosachariden als enige energiebron bevat, Bifidobacterie stammen fungeren als substraatgebruikers, groeien eerst en worden vervolgens vervangen door butyraatproducerende bacteriën die substraten, metabolieten of beide afbreken (bijv. lactaat). Gezien deze rapporten en de overgang van kolonietellingen op EG- en TYG-platen, vermoeden we dat de discrepantie in bacteriële groeitijd die hier wordt gedetecteerd, kan duiden op interbacteriële interacties die vergelijkbaar zijn met de waargenomen kruisvoeding tussen stammen die snel of langzaam groeien op TYG-agar. In het bijzonder kan de minder complexe voedingsstofsamenstelling van TYG-agar de detectie van interbacteriële interacties vergemakkelijken en bacteriële dood door metabole onbalans voorkomen.

Om deze hypothese te beoordelen, hebben we naburige kolonies op TYG-agarplaten gecocultiveerd. Met behulp van filtercocultivatie, Parabacteroïden sp. BL157, dat moeilijk te subculturen is, groeide en werd geïsoleerd. Verder hebben we interacties gedetecteerd tussen Parabacteroïden sp. BL157 en K. pneumoniae BL175 evenals tussen Sutterella sp. BL252 en B. fragilis BL539. In het bijzonder vonden we dat de groei van Parabacteroïden sp. BL157 werd versneld door de groei van naburige K. pneumoniae BL175 en dat de groei van B. fragilis BL539 was gedeeltelijk afhankelijk van de aanwezigheid van Sutterella sp. BL252.

De groei van Parabacteroïden sp. BL157 en B. fragilis BL539 werd ondersteund door: K. pneumoniae BL175 en Sutterella sp. BL252 echter, de details van de interactie tussen Parabacteroïden sp. BL157 en K. pneumoniae BL175, en tussen B. fragilis BL539 en Sutterella sp. BL252 zijn niet definitief, verder onderzoek is vereist. Bepaalde interbacteriële interacties worden gemedieerd door bacteriële metabolieten. Bijvoorbeeld supernatanten van a Bacil stam versnelt de groei van S. thermophilum 15 . Verder supernatanten van Sfingomonas spp. ondersteuning van de groei van Catellibacterium nectariphilum 30 . Bovendien, Porphyromonas gingivalis groeit in de mondholte terwijl het barnsteenzuur gebruikt dat wordt gegenereerd door Treponema denticola, en T. denticola maakt gebruik van isoboterzuur gegenereerd door P. gingivalis 31 . Hier een Parabacteroïden sp. BL157/B. fragilis BL539 kolonie groeide dichtbij maar overlapte niet a K. pneumoniae BL175/Sutterella sp. BL252-kolonie, wat suggereert dat ze communiceren via stof(fen) die worden gegenereerd door ondersteunende stammen. Bovendien is gemeld dat zowel B. fragilis en K. pneumoniae produceren autoinducer-2, een interspecifiek signaalmolecuul dat gerelateerd is aan quorumdetectie en vorming van biofilmkolonies 32, 33 . Daarom kan interspecifieke signalering ook verband houden met de interbacteriële interacties die in deze onderzoeken zijn gedetecteerd.

Phascolarctobacterium sp. BL377, dat aanvankelijk in deze studie werd gekoloniseerd, kan niet worden gesubkweekt in monocultuur in aanwezigheid van een sterk groeistimulerend medium (d.w.z. EG-medium). Hier vonden we dat B. dorei BL376 en andere Bacteriën stammen ondersteunden de groei van Phascolarctobacterium sp. BL377. De Bacteriën stammen die in deze studie werden onderzocht, bleken barnsteenzuur als metaboliet te genereren (gegevens niet getoond). Daarnaast zijn sommige van Phascolarctobacterium soorten gebruiken naar verluidt barnsteenzuur 34, 35. Daarom worden veel voorkomende stof(fen) gegenereerd door de Bacteriën soorten die hier worden bestudeerd (bijv. succinaat) kunnen ook de groei van BL377 beïnvloeden.

Hoewel complexe interbacteriële communicatie tussen darmbacteriën is gesuggereerd door een genomisch onderzoek waarbij geen kweek betrokken was 16 , is er weinig informatie over de meervoudige groeiafhankelijkheid van levensvatbare darmbacteriën. In de huidige studie is de groei van B. fragilis, die de groei van Phascolarctobacterium sp. BL377, werd gestimuleerd door Sutterella sp. BL252, wat suggereert dat meerstaps interbacteriële interacties van levensvatbare darmbacteriën plaatsvonden in het hier beschreven co-cultuursysteem.

Hoewel de naam van isolaten in deze onderzoeken werd geselecteerd op basis van homologie van 16S-rRNA-sequenties, suggereert de homologie van 16S-rRNA-gensequenties dat stammen BL157, BL252 en BL377 waarschijnlijk nieuwe geslachten of soorten vertegenwoordigen. Daarom moet de naam van deze isolaten worden gewijzigd om nieuwe soorten aan te duiden. Het voorstel om deze isolaten systematisch aan te merken als nieuwe soorten is dus in ontwikkeling.

Met behulp van de hier ontwikkelde cocultivatietechniek zijn we erin geslaagd verschillende groeiafhankelijke darmbacteriën te isoleren. Deze techniek vereist echter verdere optimalisatie, mogelijk met behulp van meerlaagse cultuur, multi-well cultuur met hoge doorvoer en het repliceren van het complexe ecosysteem van de darm. Een aanwijzing voor het oplossen van deze problemen kan worden gevonden in andere innovatieve kweekmethoden 21-24. Een combinatie van dit filtersysteem en andere geavanceerde methoden zal dus resulteren in een krachtige benadering van de teelt en het begrijpen van de ecologie van tot nu toe niet-gecultiveerde bacteriën.


Voetnoten

Auteursbijdragen: Y.H. en V.K.S. hebben in gelijke mate bijgedragen aan dit werk Y.H., Y.S., A.T., M.H. en M.O. ontworpen onderzoek Y.H. en AT deed onderzoek Y.H., V.K.S., T.P., S.N., en A.T. geanalyseerde gegevens en Y.H., T.D.T., T.K., M.H. en M.O. schreef de krant.

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Gegevensdepositie: De sequenties die in dit artikel worden vermeld, zijn gedeponeerd in de DNA-databank van Japan [toetredingsnummers. AP009510 (chromosoom), AP009511-3 (plasmiden) en AB360878-AB360905 (andere)].


2. materialen en methoden

2.1 Bemonsteringsprocedure

De bemonsteringslocatie, de regio Diyarbakır, bevindt zich op de grens van de Anatolische plaat en het oliegebied in het Midden-Oosten in het zuidoosten van Turkije. In totaal 20 ruwe oliemonsters (B1, B6, B8, B14, B23, B32, B56, GK8, GS6, GS15, M3, K2, K3, K32, K35, K44, S4, S15, Y18 en Y30) bestaande uit een olie/watermengsel werd verzameld uit de productieputten van de olievelden van Diyarbakır (Figuur 1). Deze putten produceerden oliën die werden onttrokken aan de oliezandsteenafzettingen (dieptes van 1600 m tot 2620 m, API-dichtheid van 24,3° tot 42,3°, watergehalte rond 94%, een gemiddelde pH van 7,0 en zoutgehalte van 2966 mg l -1 tot 26.961 mg l 1 ). De monsters werden aseptisch genomen bij de putmond en in steriele serumflessen van 500 ml gedaan, afgesloten met rubberen stoppen en aluminium doppen. De monsters werden verzonden bij omgevingstemperatuur. Bij aankomst in het laboratorium werden de monsters direct geanalyseerd. Alle monsters werden binnen 48 uur na afname behandeld. Decanteren werd gebruikt om het geproduceerde water te scheiden van het olie/watermengsel.

Figuur 1.

Bemonsteringslocaties in de regio Diyarbakır. Geproduceerde watermonsters werden verzameld uit 20 verschillende oliebronnen © Maphill / Creative Commons Attribution-NoDerivatives (CC BY-ND)

2.2 DNA-extractie

Bacteriën in de geproduceerde watermonsters werden verzameld door filtratie over 0,20 m poriegrootte polyamidefilters (Sartolon®, Sartorius AG, Duitsland). Genomisch DNA werd geëxtraheerd met de UltraClean ® Microbial DNA-isolatiekit (MO BIO Laboratories Inc, VS) volgens het protocol van de fabrikant.

2.3 Polymerasekettingreactieamplificatie

Geëxtraheerd DNA werd gebruikt als de matrijs voor PCR-amplificatie van gedeeltelijke 16S-rRNA-fragmenten. Primerpaar bestaande uit 341F met een GC-klem en 907R werd gebruikt voor DGGE-analyse (26). Een GC-klem met 40 basen werd gebruikt om volledige denaturatie van het fragment tijdens DGGE te voorkomen (27).

Vanwege de lage DNA-opbrengst werd een tweestaps PCR-strategie gebruikt. Bij de eerste stap werd een real-time PCR-benadering (kwantitatieve PCR, qPCR) toegepast op de geproduceerde watermonsters. Het reactiemengsel in een eindvolume van 22,5 l bevatte 0,2 l van elke primer, 12,5 l iQ TM SYBR ® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc, VS), 9,6 l RNase-vrij water (Qiagen, Duitsland) en 0,5 l DNA sjabloon. qPCR werd uitgevoerd in iCycler iQ TM Real-Time PCR-detectiesysteem (Bio-Rad Laboratories Inc, VS) onder de volgende omstandigheden: 5 min bij 95°C 40 cycli van 95°C gedurende 30 s, 57°C gedurende 40 s, 72 °C gedurende 40 s en 80 °C gedurende 25 s en uiteindelijk 72 °C gedurende 10 minuten. Bij de qPCR-methode werd na elke cyclus een signaal gevormd. Door de signalen voor elk monster te observeren, konden PCR-producten worden gedetecteerd. De reactie werd beëindigd toen de gewenste hoeveelheid product was bereikt. Bij de tweede stap werd een conventionele PCR-benadering toegepast op de qPCR-producten. Reactiemengsel in een eindvolume van 25 l bevatte 0,2 l van elke primer, 12,5 l Taq PCR Master Mix (Qiagen, Duitsland), 9,6 l RNase-Free Water (Qiagen, Duitsland) en 0,5 l DNA-template. De PCR werd uitgevoerd in TGradient thermocycler (Biometra, Duitsland) onder de volgende omstandigheden: 5 min bij 95°C 12 cycli van 95°C gedurende 30 s, 57°C gedurende 40 s en 72 °C gedurende 40 s en een laatste 74 ° C gedurende 30 minuten.

2.4 Denaturerende gradiëntgelelektroforese

Het DCode TM-systeem (Bio-Rad Laboratories, VS) werd gebruikt voor DGGE-analyse. 25 l van elk PCR-product (200-300 ng) werd geladen op 6% polyacrylamidegels (w/v) met gradiënten van 20% tot 70% denaturatiemiddelen (ureum/formamide). De gels werden 16 uur bij 100 V en 60 ° C in 1 x Tris-acetaat-EDTA-buffer gelopen. Na voltooiing van elektroforese werden de gels gedurende 20 minuten gekleurd met SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen TM, Thermo Fisher Scientific, VS), gevisualiseerd en gefotografeerd. Geselecteerde overheersende DGGE-banden werden uitgesneden, geëlueerd in 40 μl 1 x Tris-buffer (pH 8) gedurende 2 dagen bij 4 ° C en opnieuw geamplificeerd met 25 cycli zoals hierboven beschreven. Reactiemengsel in een eindvolume van 25 l bevatte 0,125 l primer 341F, 0,125 l primer 907R, 12,5 l primer Taq PCR Master Mix, 9,75 ul ultrazuiver water en 0,5 ul sjabloon. De PCR-producten werden gekwantificeerd op een 1,5% (w/v) agarosegel en vervolgens gesequenced door Macrogen Inc (Seoul, Zuid-Korea).

2.5 Vergelijkende sequentieanalyse

De resulterende sequenties werden eerst uitgelijnd en bewerkt met behulp van CodonCode Aligner-software (CodonCode Corp, VS). Daarna werden ze vergeleken met sequenties die waren opgeslagen in de database GenBank® met behulp van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST®) (28, 29). Alle verkregen gedeeltelijke 16S-rRNA-gensequenties werden gedeponeerd in de GenBank®-database onder de volgende toegangsnummers: KF720792 - KF720796, KF720798, KF720801 - KF720802, KF720804, KF720806 - KF720808, KF720810 - KF720811, KF7220084, KF720872, KF720872 , KF720828, KF720830 - KF720832, KF720839, KF720844, KF720852, KF720855, KF720858, KF720872, KF720877, KF720882 - KF720884, KF720886 - KF720889, KF720891 - KF7208720894


Dankbetuigingen

We danken Dr. Nikolai Chernych voor zijn technische assistentie tijdens de isolatie en zuivering van metagenomics-DNA. We danken ook het Department of Energy Joint Genome Institute voor het sequencen van de metanomen.

Financiering

CDV en GM werden ondersteund door de ERC Advanced Grant PARASOL (nr. 322551). A-SA en RG werden ondersteund door de onderzoeksbeurs 17-04828S van de Grant Agency of the Czech Republic. MM werd ondersteund door de Tsjechische Academie van Wetenschappen (Postdoc-programma PPPLZ-aanvraagnummer L200961651). DYS werd ondersteund door het SIAM/Gravitation Program (Nederlands Ministerie van Onderwijs en Wetenschappen, subsidie ​​24002002) en door de Russian Science Foundation (subsidie ​​16-14-00121). Sequencing werd uitgevoerd door het U.S. Department of Energy Joint Genome Institute, een DOE Office of Science User Facility, als onderdeel van het Community Sequencing Program (contract nr. DE-AC02-05CH11231).

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De onbewerkte sequentielezingen van de vijf metanomen zijn gedeponeerd in het NCBI Sequence Read Archive (zie aanvullend bestand 1: Tabel S6 voor toegangsnummers en lees- en contigstatistieken). De laatste 871 MAG's die in dit artikel worden beschreven, zijn gedeponeerd als Whole Genome Shotgun-projecten bij DDBJ/EMBL/GenBank en de toegangsnummers staan ​​vermeld in aanvullend bestand 4 (BioProject ID PRJNA434545). Alle versies die in dit document worden beschreven, zijn versie XXXX01000000. De opgeschoonde en gederepliceerde datasets van de ampliconsequentie zijn beschikbaar in FigShare (https://figshare.com/s/7684627445e3621aba24). Maximale waarschijnlijkheidsbomen op basis van de aaneengeschakelde uitlijning van 16 ribosomale eiwitten, basis voor Fig. 2 en 3, in newick-formaat (.tre-bestand) en complementaire datasets (gebruikt om volledigheid, contaminatie, genoomherstelgrootte, G + C mol% en RPKG in iTOL te plotten), evenals K nummertoewijzingen voor de voorspelde eiwitten van alle MAG's (KEGG-orthologen, Ghost Koala) en de volledig geannoteerde CPR MAG's die de conclusies van dit artikel ondersteunen, zijn ook beschikbaar in FigShare (https://figshare.com/s/7684627445e3621aba24).


Integratieve HMP. (iHMP) Onderzoeksnetwerkconsortium. Het integratieve menselijke microbioomproject. Natuur. 2019569:641–8.

Integratieve HMP. (iHMP) Onderzoeksnetwerkconsortium. Wat volgt er na het Integrative Human Microbiome Project voor de microbioomgemeenschap? Natuur. 2019569:599.

Proctor L. Prioriteiten voor de komende 10 jaar onderzoek naar het menselijk microbioom. Natuur. 2019569:623–5.

Douillard FP, de Vos WM. Biotechnologie van gezondheidsbevorderende bacteriën. Biotechnologie Adv. 2019. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.03.008.

Stenman LK, Burcelin R. Een causaal verband leggen tussen darmmicroben, lichaamsgewichtstoename en glucosemetabolisme bij mensen - naar behandeling met probiotica. Benef Microben. 2016 http://www.wageningenacademic.com/doi/abs/10.3920/BM2015.0069.

Brunkwall L, Orho-Melander M. Het darmmicrobioom als doelwit voor preventie en behandeling van hyperglykemie bij type 2 diabetes: van huidig ​​menselijk bewijs tot toekomstige mogelijkheden. Diabetologie. 2017. https://doi.org/10.1007/s00125-017-4278-3.

Morotomi M, Nagai F, Watanabe Y. Beschrijving van Christensenella minuta gen. nov., sp. nov., geïsoleerd uit menselijke uitwerpselen, die een aparte tak vormt in de orde Clostridiales, en voorstel van Christensenellaceae fam. nov. Int J Syst Evol Microbiol. 201162:144–9.

Lau SKP, McNabb A, Woo GKS, Hoang L, Fung AMY, Chung LMW, et al. Catabacter hongkongensis gen. nov., sp. nov., geïsoleerd uit bloedkweken van patiënten uit Hong Kong en Canada. J Clin Microbiol. 200745:395-401.

Rajilić-Stojanović M, de Vos WM. De eerste 1000 gekweekte soorten van de menselijke gastro-intestinale microbiota. FEMS Microbiol Rev. 201438:996-1047.

Part AC. LPSN - Lijst van prokaryotische namen met status in nomenclatuur (bacterio.net), 20 jaar later. Int J Syst Evol Microbiol. 201868:1825–9.

Parken DH, Chuvochina M, Waite DW, Rinke C, Skarshewski A, Chaumeil PA, et al. Een gestandaardiseerde bacteriële taxonomie op basis van genoomfylogenie herziet de levensboom aanzienlijk. Nat Biotechnologie. 201836:996-1004.

Alonso BL. Irigoyen von Sierakowski A, Sáez Nieto JA, Rosel AB. Eerste rapport van menselijke infectie door Christensenella minuta, een Gram-negatieve, streng anaërobe staaf die de menselijke darm bewoont. Anaëroob. 201744:124–5.

Yang Y, Gu H, Sun Q, Wang J. Effecten van Christensenella minuta lipopolysaccharide op de activering van RAW264.7-macrofagen. Microb Pathog. 2018. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2018.10.005.

Rosa BA, Hallsworth-Pepin K, Martin J, Wollam A, Mitreva M. Genoomsequentie van Christensenella minuta DSM 22607T. Genoom Aankondiging. 20175. https://doi.org/10.1128/genomeA.01451-16.

Choi YJ, Won EJ, Kim SH, Shin MG, Shin JH, Suh SP. Eerste casusrapport van bacteriëmie als gevolg van Catabacter hongkongensis bij een Koreaanse patiënt. Ann Lab Med. 201737:84–7.

Lau SKP, Fan RYY, Lo H-W, Ng RHY, Wong SSY, Li IWS, et al. Hoge mortaliteit geassocieerd met Catabacter hongkongensis bacteriëmie. J Clin Microbiol. 201250:2239–43.

Elsendoorn A, Robert R, Culos A, Roblot F, Burucoa C. Catabacter hongkongensis Bacteriëmie met fatale septische shock. Emerg Infect Dis. 201117: 1330-1.

Lau SKP, Teng JLL, Huang Y, Curreem SOT, Tsui SKW, Woo PCY. Ontwerp-genoomsequentie van Catabacter hongkongensis-type stam HKU16T, geïsoleerd uit een patiënt met bacteriëmie en darmobstructie. Genoom Aankondiging. 20153. https://doi.org/10.1128/genomeA.00531-15.

Ndongo S, Khelaifia S, Fournier PE, Raoult D. Christensenella massiliensis, een nieuwe bacteriesoort geïsoleerd uit de menselijke darm 2016. https://doi.org/10.1016/j.nmni.2016.04.014.

Ndongo S, Dubourg G, Khelaifia S, Fournier PE, Raoult D. Christensenella timonensis, een nieuwe bacteriesoort geïsoleerd uit de menselijke darm. Nieuwe microben Nieuwe infecteren. 201613:32-3.

Goodrich JK, Waters JL, Poole AC, Sutter JL, Koren O, Blekhman R, et al. Menselijke genetica vormt het darmmicrobioom. Cel. 2014159. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.09.053.

Upadhyaya B, McCormack L, Fardin-Kia AR, Juenemann R, Nichenametla S, Clapper J, et al. Impact van voedingsresistent zetmeel type 4 op de menselijke darmmicrobiota en immunometabolische functies. Wetenschappelijke Rep. 20166:28797.

Hansen EE, Lozupone CA, Rey FE, Wu M, Guruge JL, Narra A, et al. Pan-genoom van de dominante menselijke darm-geassocieerde archaeon, Methanobrevibacter smithii, bestudeerd bij tweelingen. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011108 (Suppl 1):4599-606.

Bennett DC, Tun HM, Kim JE, Leung FC, Cheng KM. Karakterisering van de cecale microbiota van de emoe (Dromaius novaehollandiae). Dierenarts Microbiol. 2013166:304-10.

Crisol-Martínez E, Stanley D, Geier MS, Hughes RJ, Moore RJ. Sorghum en tarwe hebben een verschillende invloed op de darmflora en de bijbehorende prestatiekenmerken van vleeskippen. PeerJ. 20175:e3071.

Wilkinson N, Hughes RJ, Aspden WJ, Chapman J, Moore RJ, Stanley D. De microbiota van het maagdarmkanaal van de Japanse kwartel. Coturnix japonica. Appl Microbiol Biotechnol. 2016100:4201–9.

Videvall E, Song SJ, Bensch HM, Strandh M, Engelbrecht A, Serfontein N, et al. De ontwikkeling van darmmicrobiota bij struisvogels en de associatie met jeugdgroei. bioRxiv. 2018:270017. https://doi.org/10.1101/270017.

Youngblut ND, Reischer GH, Walters W, Schuster N, Walzer C, Stalder G, et al. Gastheerdieet en evolutionaire geschiedenis verklaren verschillende aspecten van de diversiteit van het darmmicrobioom bij gewervelde clades. Nat Comm. 201910:2200.

Zhang J, Shi H, Wang Y, Li S, Cao Z, Ji S, et al. Effect van voer-tot-concentraatverhoudingen op dynamische profielveranderingen en interacties van pensmicrobiota en metabolieten bij Holstein-vaarzen. Microbiol aan de voorkant. 20178:2206.

Wang X, Martin GB, Wen Q, Liu S, Zhang J, Yu Y, et al. Lijnzaadolie en supplementen met verwarmde lijnzaadkorrels hebben verschillende effecten op de pensbacteriële gemeenschapsstructuren en vetzuurprofielen bij kasjmierkinderen. J Anim Sci. 2019. https://doi.org/10.1093/jas/skz079.

Kamke J, Kittelmann S, Soni P, Li Y, Tavendale M, Ganesh S, et al. Pensmetagenoom en metatranscriptoomanalyses van schapen met een lage methaanopbrengst onthullen een Sharpea-verrijkt microbioom dat wordt gekenmerkt door vorming en gebruik van melkzuur. Microbioom. 20164:56.

He J, Yi L, Hai L, Ming L, Gao W, Ji R. Characterizing the bacterial microbiota in different gastrointestinal tract segments of the Bactrian camel. Sci Rep. 20188:654.

Samsudin AA, Evans PN, Wright A-DG, Al JR. Molecular diversity of the foregut bacteria community in the dromedary camel (Camelus dromedarius). Environ Microbiol. 201113:3024–35.

Li Z, Si H, Nan W, Wang X, Zhang T, Li G. Bacterial community and metabolome shifts in the cecum and colon of captive sika deer (Cervus nippon) from birth to post weaning. FEMS Microbiol Lett. 2019. https://doi.org/10.1093/femsle/fnz010.

Quan J, Cai G, Ye J, Yang M, Ding R, Wang X, et al. A global comparison of the microbiome compositions of three gut locations in commercial pigs with extreme feed conversion ratios. Sci Rep. 20188:4536.

Lu C, Zhou J, Li Y, Zhang D, Wang Z, Li Y, et al. Structural modulation of gut microbiota in Bama minipigs in response to treatment with a “growth-promoting agent”, salbutamol. Appl Microbiol Biotechnol. 2017. https://doi.org/10.1007/s00253-017-8329-y.

Gebreselassie EE, Jackson MI, Yerramilli M, Jewell DE. Anti-aging food that improves markers of health in senior dogs by modulating gut microbiota and metabolite profiles. bioRxiv. 2018:324327. https://doi.org/10.1101/324327.

Ramadan Z, Xu H, Laflamme D, Czarnecki-Maulden G, Li QJ, Labuda J, et al. Fecal microbiota of cats with naturally occurring chronic diarrhea assessed using 16S rRNA gene 454-pyrosequencing before and after dietary treatment. J Vet Intern Med. 201428:59–65.

Shiffman ME, Soo RM, Dennis PG, Morrison M, Tyson GW, Hugenholtz P. Gene and genome-centric analyses of koala and wombat fecal microbiomes point to metabolic specialization for Eucalyptus digestion. PeerJ. 20175:e4075.

Wang C, Zhu Y, Li F, Huang L. The effect of Lactobacillus isolates on growth performance, immune response, intestinal bacterial community composition of growing Rex Rabbits. J Anim Physiol Anim Nutr. 2017. https://doi.org/10.1111/jpn.12629.

Hansen NCK, Avershina E, Mydland LT, Næsset JA, Austbø D, Moen B, et al. High nutrient availability reduces the diversity and stability of the equine caecal microbiota. Microb Ecol Health Dis. 201526:27216.

McKenzie VJ, Song SJ, Delsuc F, Prest TL, Oliverio AM, Korpita TM, et al. The effects of captivity on the mammalian gut microbiome. Integr Comp Biol. 2017. https://doi.org/10.1093/icb/icx090.

Zhang X, Yasuda K, Gilmore RA, Westmoreland SV, Platt DM, Miller GM, et al. Alcohol-induced changes in the gut microbiome and metabolome of rhesus macaques. Psychofarmacologie. 2019. https://doi.org/10.1007/s00213-019-05217-z.

Yuan C, Graham M, Subramanian S. Microbiota-metabolites interactions in non-human primate gastrointestinal tract. bioRxiv. 2018:454496. https://doi.org/10.1101/454496.

Allan N, Knotts TA, Pesapane R, Ramsey JJ, Castle S, Clifford D, et al. Conservation implications of shifting gut microbiomes in captive-reared endangered voles intended for reintroduction into the wild. Microorganisms. 20186. https://doi.org/10.3390/microorganisms6030094.

Connor KL, Chehoud C, Altrichter A, Chan L, DeSantis TZ, Lye SJ. Maternal metabolic, immune, and microbial systems in late pregnancy vary with malnutrition in mice. Biol Reprod. 201898:579–92.

Tillmann S, Abildgaard A, Winther G, Wegener G. Altered fecal microbiota composition in the Flinders sensitive line rat model of depression. Psychofarmacologie. 2018. https://doi.org/10.1007/s00213-018-5094-2.

Tsukinowa E, Karita S, Asano S, Wakai Y, Oka Y, Furuta M, et al. Fecal microbiota of a dugong (Dugong dugong) in captivity at Toba Aquarium. J Gen Appl Microbiol. 200854:25–38.

Suzuki A, Ueda K, Segawa T, Suzuki M. Fecal microbiota of captive Antillean manatee Trichechus manatus manatus. FEMS Microbiol Lett. 2019. https://doi.org/10.1093/femsle/fnz134.

Baldo L, Riera JL, Mitsi K, Pretus JL. Processes shaping gut microbiota diversity in allopatric populations of the endemic lizard Podarcis lilfordi from Menorcan islets (Balearic Islands). FEMS Microbiol Ecol. 201894. https://doi.org/10.1093/femsec/fix186.

Kohl KD, Brun A, Magallanes M, Brinkerhoff J, Laspiur A, Acosta JC, et al. Gut microbial ecology of lizards: insights into diversity in the wild, effects of captivity, variation across gut regions, and transmission. Mol Ecol. 2016. https://doi.org/10.1111/mec.13921.

Yuan ML, Dean SH, Longo AV, Rothermel BB, Tuberville TD, Zamudio KR. Kinship, inbreeding and fine-scale spatial structure influence gut microbiota in a hindgut-fermenting tortoise. Mol Ecol. 201524:2521–36.

Huang S, Zhang H. The impact of environmental heterogeneity and life stage on the hindgut microbiota of Holotrichia parallela larvae (Coleoptera: Scarabaeidae). PLoS Een. 20138:e57169.

Ayayee PA, Keeney G, Sabree ZL, Muñoz-Garcia A. Compositional differences among female-associated and embryo-associated microbiota of the viviparous Pacific Beetle cockroach. Diploptera punctata. FEMS Microbiol Ecol. 201793. https://doi.org/10.1093/femsec/fix052.

Richards C, Otani S, Mikaelyan A, Poulsen M. Pycnoscelus surinamensis cockroach gut microbiota respond consistently to a fungal diet without mirroring those of fungus-farming termites. PLoS Een. 201712:e0185745.

Zakrzewski M, Simms LA, Brown A, Appleyard M, Irwin J, Waddell N, et al. IL23R-protective coding variant promotes beneficial bacteria and diversity in the ileal microbiome in healthy individuals without inflammatory bowel disease. J Crohns Colitis. 2018. https://doi.org/10.1093/ecco-jcc/jjy188.

Huang YJ, Kim E, Cox MJ, Brodie EL, Brown R, Wiener-Kronish JP, et al. A persistent and diverse airway microbiota present during chronic obstructive pulmonary disease exacerbations. OMICS. 201014:9–59.

Burns MB, Montassier E, Abrahante J, Priya S, Niccum DE, Khoruts A, et al. Colorectal cancer mutational profiles correlate with defined microbial communities in the tumor microenvironment. PLoS Genet. 201814:e1007376.

Moreno-Indias I, Sánchez-Alcoholado L, García-Fuentes E, Cardona F, Queipo-Ortuņo MI, Tinahones FJ. Insulin resistance is associated with specific gut microbiota in appendix samples from morbidly obese patients. Am J Transl Res. 20168:5672–84.

Brooks AW, Priya S, Blekhman R, Bordenstein SR. Gut microbiota diversity across ethnicities in the United States. PLoS Biol. 201816:e2006842.

Turnbaugh PJ, Hamady M, Yatsunenko T, Cantarel BL, Duncan A, Ley RE, et al. A core gut microbiome in obese and lean twins. Natuur. 2009457:480–4.

Turpin W, Espin-Garcia O, Xu W, Silverberg MS, Kevans D, Smith MI, et al. Association of host genome with intestinal microbial composition in a large healthy cohort. Nat Genet. 201648:1413–7.

Obregon-Tito AJ, Tito RY, Metcalf J, Sankaranarayanan K, Clemente JC, Ursell LK, et al. Subsistence strategies in traditional societies distinguish gut microbiomes. Nat Commun. 20156:6505.

Escobar JS, Klotz B, Valdes BE, Agudelo GM. The gut microbiota of Colombians differs from that of Americans, Europeans and Asians. BMC Microbiol. 201414:311.

Org E, Blum Y, Kasela S, Mehrabian M, Kuusisto J, Kangas AJ, et al. Relationships between gut microbiota, plasma metabolites, and metabolic syndrome traits in the METSIM cohort. Genome Biol. 201718:70.

Lim MY, You HJ, Yoon HS, Kwon B, Lee JY, Lee S, et al. The effect of heritability and host genetics on the gut microbiota and metabolic syndrome. Gut. 2016. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2015-311326.

Oki K, Toyama M, Banno T, Chonan O, Benno Y, Watanabe K. Comprehensive analysis of the fecal microbiota of healthy Japanese adults reveals a new bacterial lineage associated with a phenotype characterized by a high frequency of bowel movements and a lean body type. BMC Microbiol. 201616:284.

Ayeni FA, Biagi E, Rampelli S, Fiori J, Soverini M, Audu HJ, et al. Infant and adult gut microbiome and metabolome in rural Bassa and urban settlers from Nigeria. Cell Rep. 201823:3056–67.

Gomez A, Petrzelkova KJ, Burns MB, Yeoman CJ, Amato KR, Vlckova K, et al. Gut microbiome of coexisting BaAka Pygmies and Bantu reflects gradients of traditional subsistence patterns. Cell Rep. 201614:2142–53.

Morton ER, Lynch J, Froment A, Lafosse S, Heyer E, Przeworski M, et al. Variation in rural African gut microbiota is strongly correlated with colonization by Entamoeba and Subsistence. PLoS Genet. 201511:e1005658.

Barrett HL, Gomez-Arango LF, Wilkinson SA, McIntyre HD, Callaway LK, Morrison M, et al. A vegetarian diet is a major determinant of gut microbiota composition in early pregnancy. voedingsstoffen. 201810. https://doi.org/10.3390/nu10070890.

Deschasaux M, Bouter KE, Prodan A, Levin E, Groen AK, Herrema H, et al. Depicting the composition of gut microbiota in a population with varied ethnic origins but shared geography. Nat Med. 2018. https://doi.org/10.1038/s41591-018-0160-1.

Chi L, Mahbub R, Gao B, Bian X, Tu P, Ru H, et al. Nicotine alters the gut microbiome and metabolites of gut-brain interactions in a sex-specific manner. Chem Res Toxicol. 201730:2110–9.

Davis DJ, Hecht PM, Jasarevic E, Beversdorf DQ, Will MJ, Fritsche K, et al. Sex-specific effects of docosahexaenoic acid (DHA) on the microbiome and behavior of socially-isolated mice. Brain Behav Immun. 2016. https://doi.org/10.1016/j.bbi.2016.09.003.

Kong F, Hua Y, Zeng B, Ning R, Li Y, Zhao J. Gut microbiota signatures of longevity. Curr Biol. 201626:R832–3.

Wang F, Yu T, Huang G, Cai D, Liang X, Su H, et al. Gut microbiota community and its assembly associated with age and diet in Chinese centenarians. J Microbiol Biotechnol. 201525:1195–204.

Biagi E, Franceschi C, Rampelli S, Severgnini M, Ostan R, Turroni S, et al. Gut microbiota and extreme longevity. Curr Biol. 2016. https://doi.org/10.1016/j.cub.2016.04.016.

Kim B-S, Choi CW, Shin H, Jin S-P, Bae J-S, Han M, et al. Comparison of the gut microbiota of centenarians in longevity villages of South Korea with those of other age groups. J Microbiol Biotechnol. 2019. https://doi.org/10.4014/jmb.1811.11023.

Anand R, Song Y, Garg S, Girotra M, Sinha A, Sivaraman A, et al. Effect of aging on the composition of fecal microbiota in donors for FMT and its impact on clinical outcomes. Dig Dis Sci. 2017. https://doi.org/10.1007/s10620-017-4449-6.

Estaki M, Pither J, Baumeister P, Little JP, Gill SK, Ghosh S, et al. Cardiorespiratory fitness as a predictor of intestinal microbial diversity and distinct metagenomic functions. Microbioom. 20164:42.

Jackson MA, Bonder MJ, Kuncheva Z, Zierer J, Fu J, Kurilshikov A, et al. Detection of stable community structures within gut microbiota co-occurrence networks from different human populations. PeerJ. 20186:e4303.

Shin J-H, Park YH, Sim M, Kim S-A, Joung H, Shin D-M. Serum level of sex steroid hormone is associated with diversity and profiles of human gut microbiome. Res Microbiol. 2019. https://doi.org/10.1016/j.resmic.2019.03.003.

Goodrich JK, Davenport ER, Beaumont M, Jackson MA, Knight R, Ober C, et al. Genetic Determinants of the Gut Microbiome in UK Twins. Cell Host Microbe. 201619:731–43.

Beaumont M, Goodrich JK, Jackson MA, Yet I, Davenport ER, Vieira-Silva S, et al. Heritable components of the human fecal microbiome are associated with visceral fat. Genome Biol. 201617:189.

Xie H, Guo R, Zhong H, Feng Q, Lan Z, Qin B, et al. Shotgun metagenomics of 250 adult twins reveals genetic and environmental impacts on the gut microbiome. Cel systeem. 2016. https://doi.org/10.1016/j.cels.2016.10.004.

Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, Trehan I, Dominguez-Bello MG, Contreras M, et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Natuur. 2012486:222–7.

Goodrich JK, Davenport ER, Waters JL, Clark AG, Ley RE. Cross-species comparisons of host genetic associations with the microbiome. Wetenschap. 2016352:532–5.

Wacklin P, Tuimala J, Nikkilä J, Tims S, Mäkivuokko H, Alakulppi N, et al. Faecal microbiota composition in adults is associated with the FUT2 gene determining the secretor status. PLoS Een. 20149:e94863.

Davenport ER, Goodrich JK, Bell JT, Spector TD, Ley RE, Clark AG. ABO antigen and secretor statuses are not associated with gut microbiota composition in 1,500 twins. BMC Genomics. 201617:941.

Turpin W, Bedrani L, Espin-Garcia O, Xu W, Silverberg MS, Smith MI, et al. FUT2 genotype and secretory status are not associated with fecal microbial composition and inferred function in healthy subjects. Darm microben. 20189:357–68.

Le Gall G, Guttula K, Kellingray L, Tett AJ, Ten Hoopen R, Kemsley KE, et al. Metabolite quantification of faecal extracts from colorectal cancer patients and healthy controls. Oncotarget. 20189:33278–89.

Yazici C, Wolf PG, Kim H, Cross T-WL, Vermillion K, Carroll T, et al. Race-dependent association of sulfidogenic bacteria with colorectal cancer. Gut. 2017. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2016-313321.

Peters BA, Shapiro JA, Church TR, Miller G, Trinh-Shevrin C, Yuen E, et al. A taxonomic signature of obesity in a large study of American adults. Sci Rep. 20188:9749.

López-Contreras BE, Morán-Ramos S, Villarruel-Vázquez R, Macías-Kauffer L, Villamil-Ramírez H, León-Mimila P, et al. Composition of gut microbiota in obese and normal-weight Mexican school-age children and its association with metabolic traits. Pediatr Obes. 201813:381–8.

Ferrer M, Ruiz A, Lanza F, Haange S-B, Oberbach A, Till H, et al. Microbiota from the distal guts of lean and obese adolescents exhibit partial functional redundancy besides clear differences in community structure. Environ Microbiol. 201315:211–26.

Fu J, Bonder MJ, Cenit MC, Tigchelaar EF, Maatman A, Dekens JAM, et al. The gut microbiome contributes to a substantial proportion of the variation in blood lipids. Circa Res. 2015117:817–24.

Kummen M, Holm K, Anmarkrud JA, Nygård S, Vesterhus M, Høivik ML, et al. The gut microbial profile in patients with primary sclerosing cholangitis is distinct from patients with ulcerative colitis without biliary disease and healthy controls. Gut. 2016. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2015-310500.

Stanislawski MA, Dabelea D, Wagner BD, Sontag MK, Lozupone CA, Eggesbø M. Pre-pregnancy weight, gestational weight gain, and the gut microbiota of mothers and their infants. Microbioom. 20175:113.

Yun Y, Kim H-N, Kim SE, Heo SG, Chang Y, Ryu S, et al. Comparative analysis of gut microbiota associated with body mass index in a large Korean cohort. BMC Microbiol. 201717:151.

Alemán JO, Bokulich NA, Swann JR, Walker JM, De Rosa JC, Battaglia T, et al. Fecal microbiota and bile acid interactions with systemic and adipose tissue metabolism in diet-induced weight loss of obese postmenopausal women. J Transl Med. 201816:244.

Walters WA, Xu Z, Knight R. Meta-analyses of human gut microbes associated with obesity and IBD. FEBS Lett. 2014588:4223–33.

Hibberd AA, Yde CC, Ziegler ML, Honoré AH, Saarinen MT, Lahtinen S, et al. Probiotic or synbiotic alters the gut microbiota and metabolism in a randomised controlled trial of weight management in overweight adults. Benef Microbes. 201910(2):121–35.

Guzman-Castaneda SJ, Ortega-Vega EL, de la Cuesta-Zuluaga J, Velasquez-Mejia EP, Rojas W, Bedoya G, et al. Gut microbiota composition explains more variance in the host cardiometabolic risk than genetic ancestry. bioRxiv. 2018:394726. https://doi.org/10.1101/394726.

He Y, Wu W, Wu S, Zheng H-M, Li P, Sheng H-F, et al. Linking gut microbiota, metabolic syndrome and economic status based on a population-level analysis. Microbioom. 20186:172.

Gomez-Arango LF, Barrett HL, McIntyre HD, Callaway LK, Morrison M, Dekker Nitert M, et al. Increased systolic and diastolic blood pressure is associated with altered gut microbiota composition and butyrate production in early pregnancy. Hypertensie. 201668:974–81.

Yanai H, Tomono Y, Ito K, Furutani N, Yoshida H, Tada N. The underlying mechanisms for development of hypertension in the metabolic syndrome. Nutr J. 20087:10.

Lippert K, Kedenko L, Antonielli L, Kedenko I, Gemeier C, Leitner M, et al. Gut microbiota dysbiosis associated with glucose metabolism disorders and the metabolic syndrome in older adults. Benef Microbes. 20178(4):545–56.

Bowyer RCE, Jackson MA, Pallister T, Skinner J, Spector TD, Welch AA, et al. Use of dietary indices to control for diet in human gut microbiota studies. Microbioom. 20186:77.

Maskarinec G, Hullar MAJ, Monroe KR, Shepherd JA, Hunt J, Randolph TW, et al. Fecal microbial diversity and structure are associated with diet quality in the multiethnic cohort adiposity phenotype study. J Nutr. 2019. https://doi.org/10.1093/jn/nxz065.

Klimenko NS, Tyakht AV, Popenko AS, Vasiliev AS, Altukhov IA, Ischenko DS, et al. Microbiome responses to an uncontrolled short-term diet intervention in the frame of the citizen science project. voedingsstoffen. 201810. https://doi.org/10.3390/nu10050576.

De Filippis F, Pellegrini N, Vannini L, Jeffery IB, La Storia A, Laghi L, et al. High-level adherence to a Mediterranean diet beneficially impacts the gut microbiota and associated metabolome. Gut. 201665:1812–21.

Azcarate-Peril MA, Ritter AJ, Savaiano D, Monteagudo-Mera A, Anderson C, Magness ST, et al. Impact of short-chain galactooligosaccharides on the gut microbiome of lactose-intolerant individuals. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017. https://doi.org/10.1073/pnas.1606722113.

David LA, Maurice CF, Carmody RN, Gootenberg DB, Button JE, Wolfe BE, et al. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Natuur. 2014505:559–63.

Roager HM, Hansen LBS, Bahl MI, Frandsen HL, Carvalho V, Gøbel RJ, et al. Colonic transit time is related to bacterial metabolism and mucosal turnover in the gut. Nat Microbiol. 20161:16093.

Beaumont M, Portune KJ, Steuer N, Lan A, Cerrudo V, Audebert M, et al. Quantity and source of dietary protein influence metabolite production by gut microbiota and rectal mucosa gene expression: a randomized, parallel, double-blind trial in overweight humans. Am J Clin Nutr. 2017106:1005–19.

Manor O, Zubair N, Conomos MP, Xu X, Rohwer JE, Krafft CE, et al. A multi-omic association study of trimethylamine N-oxide. Cell Rep. 201824:935–46.

Jiminez JA, Uwiera TC, Abbott DW, Uwiera RRE, Inglis GD. Impacts of resistant starch and wheat bran consumption on enteric inflammation in relation to colonic bacterial community structures and short-chain fatty acid concentrations in mice. Gut Pathog. 20168:67.

Zheng J, Cheng G, Li Q, Jiao S, Feng C, Zhao X, et al. Chitin oligosaccharide modulates gut microbiota and attenuates high-fat-diet-induced metabolic syndrome in mice. Mar Drugs. 201816. https://doi.org/10.3390/md16020066.

Ferrario C, Statello R, Carnevali L, Mancabelli L, Milani C, Mangifesta M, et al. How to feed the mammalian gut microbiota: bacterial and metabolic modulation by dietary fibers. Microbiol aan de voorkant. 20178:1749.

Mancabelli L, Milani C, Lugli GA, Turroni F, Cocconi D, van Sinderen D, et al. Identification of universal gut microbial biomarkers of common human intestinal diseases by meta-analysis. FEMS Microbiol Ecol. 2017. https://doi.org/10.1093/femsec/fix153.

Gevers D, Kugathasan S, Denson LA, Vázquez-Baeza Y, Van Treuren W, Ren B, et al. The treatment-naive microbiome in new-onset Crohn’s disease. Cell Host Microbe. 201415:382–92.

Imhann F, Vich Vila A, Bonder MJ, Fu J, Gevers D, Visschedijk MC, et al. Interplay of host genetics and gut microbiota underlying the onset and clinical presentation of inflammatory bowel disease. Gut. 2016. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2016-312135.

Palm NW, de Zoete MR, Cullen TW, Barry NA, Stefanowski J, Hao L, et al. Immunoglobulin A coating identifies colitogenic bacteria in inflammatory bowel disease. Cel. 2014158:1000–10.

Pascal V, Pozuelo M, Borruel N, Casellas F, Campos D, Santiago A, et al. A microbial signature for Crohn’s disease. Gut. 2017. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2016-313235.

Lee T, Clavel T, Smirnov K, Schmidt A, Lagkouvardos I, Walker A, et al. Oral versus intravenous iron replacement therapy distinctly alters the gut microbiota and metabolome in patients with IBD. Gut. 201766:863–71.

Wright EK, Kamm MA, Wagner J, Teo S-M, Cruz PD, Hamilton AL, et al. Microbial factors associated with postoperative Crohn’s disease recurrence. J Crohns Colitis. 201711:191–203.

Kennedy NA, Lamb CA, Berry SH, Walker AW, Mansfield J, Parkes M, et al. The impact of NOD2 variants on fecal microbiota in Crohn’s disease and controls without gastrointestinal disease. Inflamm Bowel Dis. 201824:583–92.

Pérez-Brocal V, García-López R, Nos P, Beltrán B, Moret I, Moya A. Metagenomic analysis of Crohn’s disease patients identifies changes in the virome and microbiome related to disease status and therapy, and detects potential interactions and biomarkers. Inflamm Bowel Dis. 201521:2515–32.

Papa E, Docktor M, Smillie C, Weber S, Preheim SP, Gevers D, et al. Non-invasive mapping of the gastrointestinal microbiota identifies children with inflammatory bowel disease. PLoS Een. 20127:e39242.

Rajilic-Stojanovic M, Shanahan F, Guarner F, de Vos WM. Phylogenetic analysis of dysbiosis in ulcerative colitis during remission. Inflamm Bowel Dis. 201319:481.

Jalanka-Tuovinen J, Salojärvi J, Salonen A, Immonen O, Garsed K, Kelly FM, et al. Faecal microbiota composition and host-microbe cross-talk following gastroenteritis and in postinfectious irritable bowel syndrome. Gut. 201463:1737–45.

De Palma G, Lynch MDJ, Lu J, Dang VT, Deng Y, Jury J, et al. Transplantation of fecal microbiota from patients with irritable bowel syndrome alters gut function and behavior in recipient mice. Sci Transl Med. 20179. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aaf6397.

Pozuelo M, Panda S, Santiago A, Mendez S, Accarino A, Santos J, et al. Reduction of butyrate- and methane-producing microorganisms in patients with irritable bowel syndrome. Sci Rep. 20155:12693.

Hollister EB, Cain KC, Shulman RJ, Jarrett ME, Burr RL, Ko C, et al. Relationships of microbiome markers with extraintestinal, psychological distress and gastrointestinal symptoms, and quality of life in women with irritable bowel syndrome. J Clin Gastroenterol. 2018. https://doi.org/10.1097/MCG.0000000000001107.

Tigchelaar EF, Bonder MJ, Jankipersadsing SA, Fu J, Wijmenga C, Zhernakova A. Gut microbiota composition associated with stool consistency. Gut. 201565. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2015-310328.

Jalanka J, Major G, Murray K, Singh G, Nowak A, Kurtz C, et al. The effect of Psyllium husk on intestinal microbiota in constipated patients and healthy controls. Int J Mol Sci. 201920. https://doi.org/10.3390/ijms20020433.

Pedrosa Carrasco AJ, Timmermann L, Pedrosa DJ. Management of constipation in patients with Parkinson’s disease. NPJ Parkinsons Dis. 20184:6.

Wiesel PH, Norton C, Glickman S, Kamm MA. Pathophysiology and management of bowel dysfunction in multiple sclerosis. Eur J Gastroenterol Hepatol. 200113:441–8.

Barichella M, Severgnini M, Cilia R, Cassani E, Bolliri C, Caronni S, et al. Unraveling gut microbiota in Parkinson’s disease and atypical parkinsonism. Mov Disord. 2018. https://doi.org/10.1002/mds.27581.

Hill-Burns EM, Debelius JW, Morton JT, Wissemann WT, Lewis MR, Wallen ZD, et al. Parkinson’s disease and Parkinson's disease medications have distinct signatures of the gut microbiome. Mov Disord. 2017. https://doi.org/10.1002/mds.26942.

Petrov VA, Saltykova IV, Zhukova IA, Alifirova VM, Zhukova NG, Dorofeeva YB, et al. Analysis of gut microbiota in patients with Parkinson’s disease. Bull Exp Biol Med. 2017. https://doi.org/10.1007/s10517-017-3700-7.

Tremlett H, Fadrosh DW, Faruqi AA, Zhu F, Hart J, Roalstad S, et al. Gut microbiota in early pediatric multiple sclerosis: a case-control study. Eur J Neurol. 201623:1308–21.

Chang C-J, Lin T-L, Tsai Y-L, Wu T-R, Lai W-F, Lu C-C, et al. Next generation probiotics in disease amelioration. J Food Drug Anal. 2019. https://doi.org/10.1016/j.jfda.2018.12.011.