Informatie

Wat zou ervoor zorgen dat banden lager lijken op een niet-gereduceerde SDS-PAGE-gel?


Ik heb een eiwitgel en ik vergelijk de gereduceerde met de niet-gereduceerde gel. Op de gereduceerde gel heb ik een paar kortere banden, maar deze banden verschijnen met een lage intensiteit. In de niet-gereduceerde gel, zie ik meer van het kortere product? Wat zou het geval zijn om het eiwit "kleiner" te laten lopen in de niet-gereduceerde omstandigheden?


Het belangrijkste effect van het veranderen van de redoxomgeving van een eiwit is de vorming of breuk van disulfidebindingen. Onder voldoende reducerende omstandigheden zullen er geen disulfidebruggen aanwezig zijn, terwijl onder oxiderende omstandigheden uw eiwit disulfidebruggen zal vormen als het daartoe in staat is.

Disulfidebruggen kunnen de tertiaire structuur van een eiwit aanzienlijk veranderen en op die manier het gedrag van het eiwit op een gel veranderen. Over het algemeen moeten disulfidebruggen het eiwit compacter maken en sneller laten lopen op een gel.

Het is daarom aannemelijk dat je snellere band het eiwit met disulfidebruggen is, dat lijkt te lopen als een kleiner eiwit omdat het compacter is. De langzamere band is dan het eiwit zonder disulfidebruggen dat een meer uitgebreide conformatie kan aannemen.

Ik neem aan dat je het hier hebt over natuurlijke gels, aangezien denaturerende gels meestal DTT of bèta-mercapto-ethanol in de monsterbuffer bevatten om eventuele disulfidebindingen te verminderen en dit effect helemaal te vermijden.


Gids voor het oplossen van problemen met restrictie-enzymen

De volgende gids kan worden gebruikt voor het oplossen van problemen met de vertering van restrictie-enzymen. Mogelijk bent u ook geïnteresseerd in aanvullende tips voor het optimaliseren van spijsverteringsreacties.

We zijn verheugd om aan te kondigen dat we bezig zijn om alle reactiebuffers BSA-vrij te maken. Vanaf april 2021 zal NEB onze huidige BSA-bevattende reactiebuffers (NEBuffer&trade 1.1, 2.1, 3.1 en CutSmart ® Buffer) overschakelen naar recombinante albumine (rAlbumin)-bevattende buffers (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 en rCutSmart&trade-buffer). We verwachten dat deze omschakeling wel zes maanden in beslag zal nemen. We zijn van mening dat het afstappen van dierlijke producten een stap in de goede richting is en kunnen deze verbetering voor dezelfde prijs aanbieden. Meer details vindt u op www.neb.com/BSA-free.

Tijdens deze overgangsperiode kunt u producten ontvangen met BSA- of rAlbumine-bevattende buffers. NEB heeft beide rigoureus getest en heeft geen enkel verschil in enzymprestaties gezien bij gebruik van beide buffers. Beide buffers kunnen met uw enzym worden gebruikt. Alle website-inhoud wordt in april gewijzigd om de wijzigingen weer te geven, hoewel u de nieuwe buffer mogelijk niet onmiddellijk bij uw product ontvangt.

Videos

Beperking Enzymverteringsprobleem: DNA-uitstrijkje op agarosegel

Lees meer over de oorzaak van dit veelvoorkomende probleem en hoe de enzymen van NEB QC worden uitgevoerd om DNA-smering te voorkomen.

Waarom snijdt mijn restrictie-enzym het DNA niet af?

Krijgt u niet het decolleté dat u verwachtte? Laat een NEB-wetenschapper u helpen bij het oplossen van uw reactie.

Beperking Enzym Digest Probleem: Te veel DNA-banden

Vind je onverwachte banden in je spijsverteringsreactie? Hier zijn enkele tips om u te helpen de oorzaak te achterhalen.

Restrictie Enzyme Digest-protocol: dicht bij het DNA-einde snijden

Wanneer u dicht bij het uiteinde van een DNA-molecuul knipt, moet u ervoor zorgen dat u weet hoeveel basen u aan de uiteinden van uw PCR-primers moet toevoegen.

TIJDBESPAREND & handelsprotocol voor restrictie-enzymdigesten

Een protocol nodig om snel en volledig te verteren? Probeer dit protocol voor Time-Saver&trade gekwalificeerde enzymen van NEB.

Verminder steractiviteit met hifi-restrictie-enzymen

NEB heeft HF®-enzymen ontwikkeld om steractiviteit te elimineren. Lees hoe en wat dit betekent voor uw samenvattingen.

Standaardprotocol voor restrictie-enzymdigesten

Laat een van de restrictie-enzymexperts van NEB u helpen uw techniek te verbeteren en veelvoorkomende fouten bij het instellen van de spijsvertering te voorkomen.

  • Controleer de methyleringsgevoeligheid van het enzym(en) om te bepalen of het enzym wordt geblokkeerd door methylering van de herkenningssequentie
  • Gebruik de aanbevolen buffer die bij het restrictie-enzym wordt geleverd
  • Ruim het DNA op om eventuele verontreinigingen te verwijderen die het enzym kunnen remmen
  • Zorg er bij het verteren van een PCR-fragment voor dat er ten minste 6 nucleotiden zijn tussen de herkenningsplaats en het einde van het DNA-molecuul
  • Verlaag het aantal eenheden
  • Voeg SDS (0,1&ndash0,5%) toe aan de laadbuffer om het enzym van het DNA te scheiden of gebruik Gel Loading Dye, Purple (6X) (NEB #B7024)
  • Gebruik verse, schone loopbuffer
  • Gebruik een verse agarosegel
  • Ruim het DNA op (NEB #T1030)
  • Controleer de methyleringsgevoeligheid van het enzym(en) om te bepalen of het enzym wordt geblokkeerd door methylering van de herkenningssequentie
  • DNA geïsoleerd uit een bacteriële bron kan worden geblokkeerd door Dam- en Dcm-methylatie
  • Als het enzym wordt geremd door Dam- of Dcm-methylatie, laat het plasmide dan groeien in a dam-/dcm- stam (NEB # C2925)
  • DNA geïsoleerd uit eukaryote bron kan worden geblokkeerd door CpG-methylering
  • Enzymen die een lage activiteit hebben in zoutbevattende buffers (NEBuffer r3.1) kunnen zoutgevoelig zijn, dus ruim het DNA op (NEB #T1030) voorafgaand aan de spijsvertering
  • DNA-zuiveringsprocedures die spinkolommen gebruiken, kunnen resulteren in hoge zoutniveaus, die de enzymactiviteit remmen. 1 Om dit te voorkomen, mag de DNA-oplossing niet meer dan 25% van het totale reactievolume uitmaken.
  • Ruim het PCR-fragment op voorafgaand aan restrictiedigest (NEB #T1030)
  • Gebruik de aanbevolen buffer die bij het restrictie-enzym wordt geleverd
  • Gebruik minstens 3&ndash5 eenheden enzym per &mok DNA
  • Verhoog de incubatietijd:
  • Sommige enzymen hebben een lagere activiteit op supercolied DNA. Verhoog het aantal enzymeenheden in de reactie.
  • Sommige enzymen kunnen een langzamere splitsing naar specifieke plaatsen vertonen. Verhoog de incubatietijd, 1&ndash2 uur is meestal voldoende.
  • Sommige enzymen hebben de aanwezigheid van twee herkenningsplaatsen nodig om efficiënt te kunnen snijden
  • Test substraat-DNA in aanwezigheid van een controle-DNA. Controle-DNA zal niet splitsen als er een remmer aanwezig is. Mini prep DNA is bijzonder gevoelig voor verontreinigingen.
  • Reinig DNA met een spinkolom (NEB #T1030) of verhoog het volume om de verontreiniging te verdunnen
  • Verlaag het aantal eenheden in de reactie
  • Voeg SDS (0,1 & ndash 0,5%) toe aan de laadbuffer om het enzym van het substraat te scheiden
  • Gebruik de aanbevolen buffer die bij het restrictie-enzym wordt geleverd
  • Verlaag het aantal enzymeenheden in de reactie
  • Zorg ervoor dat de hoeveelheid toegevoegd enzym niet groter is dan 10% van het totale reactievolume. Dit zorgt ervoor dat de totale glycerolconcentratie niet hoger is dan 5% v/v
  • Verlaag de incubatietijd. Door de minimale reactietijd te gebruiken die nodig is voor een volledige vertering, wordt steractiviteit voorkomen.
  • Probeer een High-Fidelity (HF) restrictie-enzym te gebruiken. HF-enzymen zijn ontwikkeld voor verminderde steractiviteit.
  • Enzymen met een lage activiteit in zoutbevattende buffers (bijv. NEBuffer r3.1) kunnen zoutgevoelig zijn. Zorg ervoor dat u het DNA (NEB # T1030) opruimt voorafgaand aan de spijsvertering.
  • DNA-zuiveringsprocedures die spinkolommen gebruiken, kunnen resulteren in hoge zoutniveaus, die de enzymactiviteit remmen. 1 Om dit te voorkomen, mag de DNA-oplossing niet meer dan 25% van het totale reactievolume uitmaken.
  • Ruim het PCR-fragment op voorafgaand aan restrictiedigestie (NEB #T1030)
  • Gebruik de aanbevolen buffer die bij het restrictie-enzym wordt geleverd
  • Gebruik minstens 5&ndash10 eenheden enzym per &mok DNA
  • Verteren het DNA voor 1&ndash2 uur


1 Monarch Kits (NEB #T1010, NEB #T1020 en NEB #T1030) gebruiken kolommen die zijn ontworpen om zoutoverdracht naar het geëlueerde DNA te minimaliseren, dus het gebruik ervan kan dit probleem minimaliseren.


Wat is het verschil tussen constante stroom, constante spanning en constant vermogen?

Omdat de omstandigheden van de gel, buffer en monster tijdens de elektroforesestappen kunnen veranderen, bieden de meeste moderne powerpacks een verscheidenheid aan opties voor het handhaven van een constante spanning, constante stroom (ampère) en constant vermogen (watt). Voordat we naar enkele aanbevolen instellingen gaan, volgt hier een korte opfriscursus over de basisprincipes van elektrische circuits:

Spanning (V) — het verschil in elektrische potentialen tussen twee ladingen — is de belangrijkste parameter voor het bepalen van de snelheid waarmee uw eiwit tijdens SDS-PAGE door een gel zal bewegen. Als je aan elektriciteit denkt als een watertoren, is spanning de waterdruk die wordt gecreëerd door het water op enige hoogte te plaatsen. Hoe hoger de spanning, hoe hoger de elektrische "druk" en hoe sneller je eiwitten zullen lopen.

Stroom (I) verwijst naar de stroom van elektrische lading langs een punt in een circuit. Met dezelfde wateranalogie als hierboven, is de stroom de snelheid waarmee water door de pijp stroomt.

Vermogen (P) - over het algemeen gedefinieerd als werk dat per tijdseenheid wordt gedaan - is eenvoudigweg gelijk aan de spanning vermenigvuldigd met de stroom, die als zodanig kan worden geschreven:

Een extra parameter om te overwegen is de weerstand (R), die (zoals de naam al aangeeft) een maat is voor hoe moeilijk het is voor de lading om door een geleider te gaan. Bij Western-blotting is weerstand de maatstaf voor hoe efficiënt de ionen in uw SDS-PAGE-buffer lading door de gel laten "stromen".

Weerstand is gerelateerd aan spanning en stroom door de wet van Ohm:


Hoe krijg je duidelijke banden in Western Blot? Blijf streperige eiwitten krijgen. Help alstublieft!

Hallo allemaal, ik ben nu aan het leren hoe ik western blots moet doen en ik probeer problemen op te lossen omdat ik steeds blots krijg die lijken op degene die ik hierboven heb gelinkt. De eiwitten lijken niet in heldere banden te migreren. Ik denk dat ik misschien te veel eiwitten laad? Hieronder heb ik een aantal stappen/meer info opgesomd, dus misschien kan iemand me helpen:

Ik maak mijn eigen 10% acrylamide SDS-PAGE gel, waarbij ik het recept voor de stapel- en scheidingsgels nauwgezet volg. De scheidingsgel begint 1 cm onder de bodem van elk putje.

Als ik eiwitmonsters meng met eiwitkleurstof, incubeer ik ze gedurende 5 minuten bij 95 ° C in een droogbad.

Ik laadde 120 microgram eiwit in elk putje. Elk monster bevat ook 5 microliter eiwitkleurstof.

Ik laat de elektroforese 2 uur draaien op een constante 100 Volt.

Tijdens het overbrengen plaats ik mijn nitrocellulosemembraan rechtstreeks op de gel zonder het te verplaatsen, omdat ik weet dat eiwitten onmiddellijk beginnen te blotten wanneer het membraan en de gel contact maken.

Ik blokkeer het membraan met 1 g melkpoeder in 20 ml (5% blokkerende oplossing) TBS gedurende 1 uur.


Meerdere banden in Western Blots - Oorzaken en oplossingen

De Western-blot-assay biedt waardevolle informatie over een eiwit, waaronder overvloed, de schijnbare moleculaire massa, post-translationele modificaties en splitsingsvarianten. Analyse van het eiwit kan echter moeilijk zijn als er meerdere banden op de vlek verschijnen. Bij het omgaan met meerdere banden op Western-blots, is het belangrijk om te bepalen of ze te wijten zijn aan technische artefacten of dat ze echte varianten van het eiwit van belang vertegenwoordigen. Deze gids beschrijft verschillende oorzaken van meerdere banden als gevolg van technische artefacten en hoe te bepalen of meerdere banden echte varianten van het eiwit van belang vertegenwoordigen.

Meerdere banden veroorzaakt door technische artefacten

Technische artefacten kunnen ervoor zorgen dat er banden verschijnen met een hoger of lager molecuulgewicht dan het eigenlijke eiwit. De soorten banden die worden waargenomen, kunnen helpen bij het bepalen van de oorzaak van het artefact.

Banden voor lager en hoger molecuulgewicht

Concentratie van primair of secundair antilichaam te hoog

Als de concentratie van het primaire of secundaire antilichaam te hoog is, kan het antilichaam niet-specifiek binden aan andere eiwitten dan het eiwit van belang. Niet-specifieke binding kan met elk eiwit voorkomen, dus banden met een hoger en lager molecuulgewicht kunnen worden waargenomen.

Titreer antilichaam

Titreer de antilichamen om te bepalen of hoge antilichaamconcentraties resulteren in meerdere banden. Beide antilichamen kunnen gelijktijdig worden getitreerd met behulp van een dot-blot op een schaakbordachtige manier.

Geen primaire antilichaamcontrole

Om snel te bepalen of het primaire antilichaam verantwoordelijk is voor het produceren van meerdere banden op de vlek, voert u de gehele Western blot-procedure uit, maar laat u het primaire antilichaam weg. Als er nog steeds meerdere banden worden waargenomen, is het secundaire antilichaam verantwoordelijk voor de artefacten.

Overmatige hoeveelheid lysaat geladen op gel

Als er te veel lysaat op een gel wordt geladen, kunnen antilichamen niet-specifiek binden aan eiwitten van overmatige overvloed, wat resulteert in meerdere banden.

Verminder de hoeveelheid gebruikt lysaat

Om de juiste hoeveelheid lysaat te bepalen die op de gel moet worden geladen, laadt u afnemende verdunningen van lysaat op de gel.

Wassen verhogen

Als het gewenste eiwit niet erg overvloedig is, kan het nodig zijn om grote hoeveelheden eiwit te laden om het eiwit te detecteren. Om niet-specifieke binding aan eiwitten van grotere overvloed te verminderen, verhoogt u het aantal en de duur van wasbeurten.

Antilichaam is "vuil"

Polyklonale sera of ongezuiverde antilichamen kunnen ook minder overvloedige antilichamen bevatten die binden aan overvloedige, veel voorkomende cellulaire eiwitten.

Gebruik affiniteit gezuiverd antilichaam

Koop indien mogelijk affiniteitsgezuiverde antilichamen. Als alternatief kunnen polyklonale antisera door affiniteit worden gezuiverd met behulp van geïmmobiliseerd Proteïne A, G of L om IgG-moleculen te zuiveren of kan geïmmobiliseerd antigeen worden gebruikt om antigeenspecifieke antilichamen te zuiveren. Commerciële kits zijn beschikbaar voor affiniteitszuivering van antilichamen.

Banden voor lager molecuulgewicht

Afbraak van doeleiwit

Meerdere banden met een lager molecuulgewicht komen gewoonlijk voort uit slechte behandeling van de lysaten/monsters voorafgaand aan analyse en kunnen indicatief zijn voor degradatie van het monster.

Proteaseremmers

Om de afbraak van eiwitten door cellulaire proteasen te verminderen, moet u proteaseremmers opnemen in de lysisoplossing die wordt gebruikt voor de voorbereiding van het monster.

Houd monsters koud

Bewaar monsters op ijs tijdens de bereiding en tijdens alle manipulaties om protease-activiteit te beperken.

Beperk bevriezen/ontdooien

Aliquot monsters in meerdere buizen en bevries/ontdooi elke buis slechts 1-2 keer om degradatie veroorzaakt door temperatuurveranderingen te beperken.

Banden met hoger molecuulgewicht

Banden met een hoger molecuulgewicht alleen kunnen ook te wijten zijn aan technische artefacten.

Doeleiwit kan multimeren vormen

Onopgeloste eiwitmultimeren kunnen resulteren in molecuulgewichtsbanden die hoger zijn dan het voorspelde molecuulgewicht van het doeleiwit.

Kook in SDS-PAGE-buffer gedurende 10 minuten

Om eiwitten volledig te verminderen, kookt u het monster gedurende 10 minuten in plaats van de gebruikelijke 5 minuten in SDS-PAGE-buffer met een denaturerend middel zoals dithiothreitol of β-mercapto-ethanol.

Vergelijk reducerende versus niet-reducerende gel

Om te bepalen of het eiwit van belang multimeren vormt, bereidt u de monsters voor onder reducerende en niet-reducerende omstandigheden voordat ze op de gel worden geladen.

Bepalen of meerdere banden wetenschappelijk relevant zijn

Meerdere banden die wetenschappelijk relevant zijn, kunnen worden waargenomen tijdens Western-blot-analyse. Banden met een hoger molecuulgewicht worden gezien wanneer eiwitten aan modificatoren worden gebonden, terwijl banden met een lager molecuulgewicht worden waargenomen wanneer eiwitten worden gesplitst.

Bepaal of banden specifiek worden herkend door het antilichaam

Een van de criteria om te bepalen of meerdere banden te wijten zijn aan technische artefacten of wetenschappelijk relevant zijn, is om te bepalen of de banden specifiek worden herkend door het primaire antilichaam. Dit kan worden bereikt door gebruik te maken van controlemonsters en/of door specifiek de interactie van het antilichaam met het eiwit te remmen.

Controlemonsters

Omvatten controles op de gel die het eiwit van belang bevatten of missen. Neem bijvoorbeeld cellijnen op die in alle opzichten identiek zijn, behalve wat betreft de expressie van het eiwit, om banden te identificeren die verschijnen als gevolg van niet-specifieke interacties.

Blokkerende peptiden

Indien beschikbaar, kunnen blokkerende peptiden (die overeenkomen met de epitoop die door het antilichaam wordt herkend) worden gebruikt om te bepalen welke banden specifiek door het antilichaam worden herkend. Pre-incubeer primair antilichaam met toenemende concentraties van blokkerende peptiden voorafgaand aan incubatie van de vlek met het antilichaam. Het blokkerende peptide voorkomt interactie van het antilichaam met het eiwitdoelwit en de band zal op de blot "verdwijnen".

Banden met hoger molecuulgewicht

Banden met een hoger molecuulgewicht worden vaak gezien wanneer het doeleiwit post-translationeel wordt gemodificeerd. Acetylering, methylering, myristoylering, fosforylering, glycosylering en ubiquitinatie zijn allemaal modificaties die het molecuulgewicht van een eiwit verhogen. Er kunnen verschillende technieken worden gebruikt om te bepalen of een eiwit posttranslationeel is gemodificeerd.

Eiwitanalysesoftware

Gebruik eiwitanalysesoftware om de soorten modificaties te voorspellen die een eiwit posttranslationeel kan verwerven. Gebruik de software om het molecuulgewicht van het eiwit met en zonder aanpassingen te voorspellen.

Antilichamen specifiek voor modificatie

Er zijn in de handel verkrijgbare primaire antilichamen beschikbaar die specifieke posttranslationele modificaties herkennen (bijv. antilichamen die specifiek zijn voor tyrosinefosforylering). Deze antilichamen kunnen worden gebruikt om posttranslationele modificaties te bevestigen. Om deze antilichamen te gebruiken, moet u het eiwit van belang immunoprecipiteren met behulp van het eiwitspecifieke primaire antilichaam. Voer de immunoprecipitated-fractie uit op een gel en voer vervolgens een Western-blot uit met behulp van het modificatie-specifieke primaire antilichaam.

Chemische behandelingen om wijzigingen te verwijderen

Eiwitten en eiwitextracten kunnen worden behandeld met chemicaliën die modificaties verwijderen (bijv. PNGase F wordt gebruikt om glycosylaties te verwijderen). Volledige verwijdering van alle modificaties zou moeten resulteren in een enkele band van het voorspelde molecuulgewicht in Western-blot-analyse. Bij het behandelen met chemicaliën om modifiers te verwijderen, is het belangrijk om ook niet-behandelde monsters op dezelfde gel op te nemen om de veranderingen in het bandpatroon te observeren.

Banden met lager molecuulgewicht

Banden met een lager molecuulgewicht kunnen worden waargenomen als aanvullende vormen van het eiwit van belang worden gegenereerd door alternatieve splitsing of splitsing van het eiwit posttranslationeel. RNA- en eiwitanalysesoftware kan worden gebruikt om deze gebeurtenissen te voorspellen, maar deze wijzigingen zullen voor elk eiwit empirisch moeten worden bepaald.

Splice varianten

Alternatieve splicing van een mRNA kan meerdere eiwitproducten genereren. Als het epitoop dat het antilichaam herkent, wordt gedeeld tussen de eiwitten, zullen meerdere banden worden waargenomen.

Eiwit wordt gesplitst

Banden met een lager molecuulgewicht kunnen worden waargenomen als het eiwit post-translationeel wordt gesplitst. Polyklonale antilichamen kunnen meerdere banden met een lager molecuulgewicht herkennen vanwege hun vermogen om meerdere epitopen te herkennen. Monoklonale antilichamen zullen slechts één band van het/de splitsingsproduct(en) herkennen.


NS examen 5 Biologie

II: Deze bewering is onjuist omdat insuline geen directe interactie heeft met glucose in de bloedbaan, maar werkt om de bloedglucosespiegels te verlagen door de opname van glucose in de cellen te bevorderen.

B: RN II is onjuist en RN III is correct.

I. Insuline wordt geproduceerd door de bètacellen van de pancreas.

II. Insuline werkt direct in op glucose in het bloed.

III. Insuline is een peptidehormoon.

Glucose is onder de meeste omstandigheden de belangrijkste brandstofbron van het lichaam, dus de regulering van de bloedglucosespiegels is van cruciaal belang voor het in stand houden van de algehele metabolische functie. De twee belangrijkste hormonen die verband houden met glucoseregulatie zijn insuline en glucagon.

Insuline is een peptidehormoon dat door de bètacellen van de pancreas wordt afgegeven als reactie op hoge bloedglucosespiegels. De basisfunctie is het verlagen van de bloedglucosespiegels door het transport van glucose naar de cellen te bevorderen via insulinereceptoren, die membraangebonden glucosetransporters activeren. De glucose die naar de cel wordt getransporteerd, kan onmiddellijk worden gebruikt door middel van glycolyse, of spier- en levercellen kunnen de glucose opslaan als glycogeen en adipocyten (vetcellen) kunnen vetzuren mobiliseren om stroomafwaartse bijproducten van het glucosemetabolisme op te slaan in de vorm van triglyceriden. Insuline reguleert al die processen, evenals de eiwitsynthese.

Glucagon is een peptidehormoon dat wordt afgegeven door de alfacellen van de pancreas, en het mechanisme en de functie ervan zijn in wezen het tegenovergestelde van insuline. Glucagon wordt afgegeven als reactie op lage glucosespiegels en heeft als effect dat het de bloedglucosespiegels verhoogt door glycogenolyse en gluconeogenese in levercellen te bevorderen.


Problemen oplossen: hoge achtergrond

Verhoog de concentratie van het blokkerende reagens (bijvoorbeeld van 5 tot 7%).

Verhoog de blokkeringstijd en/of temperatuur.

Voeg Tween 20 toe aan de blokkeerbuffer.

Neem het blokkerende reagens en Tween 20 op in de primaire antilichaamverdunningsbuffer.

Onvoldoende wassen
Droog membraan
Niet-specifieke binding van secundair antilichaam

Voer een secundair controle-experiment met alleen antilichaam uit (laat de primaire incubatiestap weg).

Gebruik een vooraf geadsorbeerd secundair antilichaam met verminderde kruisreactiviteit met ongewenste soorten.

Gebruik voor detectie van gefosforyleerde eiwitten geen buffers op basis van melk, zoals magere melk of caseïnebuffer. (Melk en caseïne zijn rijk aan fosfoproteïnen.)

Filmblootstelling te lang / detectiereagens te gevoelig
Hoge achtergrond (niet-specifieke banden)
Overvloed aan doeleiwit is lager dan de drempel van niet-specifieke binding

Laad meer eiwit per putje op SDS-PAGE.

Verrijk eiwitten met een lage overvloed door immunoprecipitatie, fractionering, enz.

Monsterdegradatie

Bereid elke keer verse lysaten

Gebruik een vers bereid monster dat op ijs wordt bewaard tot de monsterbuffer wordt toegevoegd en onmiddellijk 5-10 minuten wordt verwarmd tot 95 °C.

Weefselextracten hebben de neiging om meer niet-specifieke banden en afbraakproducten te produceren. Gebruik verse, gesoniceerde en geklaarde weefselextracten.

Voeg altijd proteaseremmers (en fosfataseremmers voor de detectie van gefosforyleerde doelen) toe.

Zorg ervoor dat het monster niet is aangetast.

Interferentie van andere isovormen

Controleer op de aanwezigheid van bekende isovormen in de literatuur of op uniprot.org.

Gebruik een isovorm-specifiek antilichaam.

Inefficiënte SDS-PAGE-scheiding

Wijzig het gelpercentage zodat het past bij het MW van het doeleiwit.

Voor grotere eiwitten moeten Tris-Glycine-gels met een lager percentage worden gebruikt, of op Tris-Acetate gebaseerde gels en buffers worden gebruikt. (Zie pagina 12 voor onze SDS-PAGE gelrecepten). •

Tris-Glycine-gels met een hoger percentage (tot 15%) moeten worden gebruikt voor kleinere eiwitten (<20 kDa) of gebruik Tris-Tricine-gels.

Aanwezigheid van post-translationele modificaties
  • Ken uw eiwit van belang, bandgroottes kunnen verschuiven als gevolg van glycosylering, fosforylering, rijping van voorlopers, enz.
Gebrek aan controles

Hoewel het weglaten van controlemonsters van een Western-blot geen oorzaak is van niet-specifieke banden, kan hun opname u vertellen waarom u ze op uw membraan ziet. Besturingselementen die u zou kunnen opnemen zijn:

Positieve controles:

Negatieve controles:

Vorig

Vind uw productspecifieke protocollen voor WB, IHC, IP en meer!

Optimaliseer uw experiment met onze productspecifieke protocollen voor WB, IHC, IP, IF en FC. U kunt zoeken op catalogusnummer of antilichaamnaam.

Er zijn ook standaardprotocollen beschikbaar

Proteintech Noord-Amerika (HQ)

Belangrijke mededeling van klanten met betrekking tot de uitbraak van Covid-19

Proteintech doet er alles aan om ervoor te zorgen dat uw onderzoek doorgaat tijdens de COVID-19-situatie. We begrijpen dat veel van uw onderzoek uiterst belangrijk is voor de gezondheid van de gemeenschap. Als originele fabrikant van zijn volledige catalogus van antilichamen en eiwitten, zijn we hier om u te ondersteunen. Proteintech heeft wereldwijd vijf vestigingen met een volledige voorraadvoorraad voor levering de volgende dag. Om deze reden verwachten we geen problemen met onze toeleveringsketen en zullen ontvangen bestellingen tot nader order normaal worden verwerkt.

Bovendien hopen we dat u en uw familie, vrienden en collega's veilig en wel blijven. We houden de situatie nauwlettend in de gaten en zullen onze inspanningen dienovereenkomstig bijwerken.


Protocol

1. Bereiding van de gel

Weeg de juiste massa agarose af in een erlenmeyer. Agarosegels worden bereid onder gebruikmaking van een w/v procentuele oplossing. De concentratie van agarose in een gel zal afhangen van de grootte van de te scheiden DNA-fragmenten, waarbij de meeste gels tussen 0,5% en 2% liggen. Het volume van de buffer mag niet groter zijn dan 1/3 van de capaciteit van de kolf.

Voeg lopende buffer toe aan de kolf met agarose. Wervel om te mengen. De meest voorkomende gel-loopbuffers zijn TAE (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA) en TBE (45 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA).

Smelt het agarose/buffermengsel. Dit wordt meestal gedaan door te verwarmen in een magnetron, maar kan ook worden gedaan boven een bunsenvlam. Verwijder met tussenpozen van 30 s de kolf en draai de inhoud rond om goed te mengen. Herhaal totdat de agarose volledig is opgelost.

Voeg ethidiumbromide (EtBr) toe tot een concentratie van 0,5 μg/ml. Als alternatief kan de gel ook worden gekleurd na elektroforese in loopbuffer met 0,5 &#g/ml EtBr gedurende 15-30 min, gevolgd door ontkleuring in loopbuffer gedurende een gelijke tijdsduur.

Opmerking: EtBr is vermoedelijk kankerverwekkend en moet volgens de voorschriften van de instelling op de juiste manier worden verwijderd. Bij het hanteren van gels die EtBr bevatten, moeten altijd handschoenen worden gedragen. Alternatieve kleurstoffen voor het kleuren van DNA zijn beschikbaar, maar EtBr blijft de meest populaire vanwege de gevoeligheid en de kosten ervan.

Laat de agarose afkoelen op het werkblad of door incubatie in een waterbad van 65 °C. Als u dit niet doet, zal de geltray kromtrekken.

Plaats de gellade in het gietapparaat. Als alternatief kan men ook de open randen van een geltray afplakken om een ​​mal te maken. Plaats een geschikte kam in de gelvorm om de putjes te maken.

Giet de gesmolten agarose in de gelvorm. Laat de agarose op kamertemperatuur komen. Verwijder de kam en plaats de gel in de gelbox. Als alternatief kan de gel ook in plasticfolie worden gewikkeld en tot gebruik bij 4 ° C worden bewaard (figuur 1).

2. Opzetten van Gel Apparaten en Scheiding van DNA Fragmenten

Voeg laadkleurstof toe aan de te scheiden DNA-monsters (Figuur 2). Gelladingskleurstof wordt typisch gemaakt bij een concentratie van 6X (0,25% broomfenolblauw, 0,25% xyleencyaan, 30% glycerol). Het laden van kleurstof helpt om bij te houden hoe ver uw DNA-monster is gereisd, en laat het monster ook in de gel zinken.

Programmeer de voeding op de gewenste spanning (1-5V/cm tussen de elektroden).

Voeg voldoende loopbuffer toe om het oppervlak van de gel te bedekken. Het is belangrijk om dezelfde loopbuffer te gebruiken als degene die is gebruikt om de gel te bereiden.

Sluit de snoeren van de gelbox aan op de voeding. Schakel de voeding in en controleer of zowel de gelbox als de voeding werken.

Verwijder het deksel. Laad het (de) DNA-monster(s) langzaam en voorzichtig in de gel (Afb. 3). Een geschikte DNA-maatmarkering moet altijd samen met experimentele monsters worden geladen.

Plaats het deksel terug op de gelbox. De kathode (zwarte draden) moet dichter bij de putjes zijn dan de anode (rode draden). Controleer nogmaals of de elektroden in de juiste sleuven in de voeding zijn gestoken.

Schakel de stroom in. Voer de gel uit totdat de kleurstof naar een geschikte afstand is gemigreerd.

3. Gescheiden DNA-fragmenten observeren

Wanneer de elektroforese is voltooid, schakelt u de voeding uit en verwijdert u het deksel van de gelbox.

Haal de gel uit de gelbox. Tap overtollige buffer af van het oppervlak van de gel. Plaats de geltray op keukenpapier om eventuele extra loopbuffer te absorberen.

Haal de gel uit de geltray en stel de gel bloot aan uv-licht. Dit wordt meestal gedaan met behulp van een geldocumentatiesysteem (Afb. 4). DNA-banden zouden moeten verschijnen als oranje fluorescerende banden. Maak een foto van de gel (Afb. 5).

Gooi de gel en loopbuffer op de juiste manier weg volgens de voorschriften van de instelling.

4. Representatieve resultaten

Figuur 5 vertegenwoordigt een typisch resultaat na agarosegelelektroforese van PCR-producten. Na scheiding zijn de resulterende DNA-fragmenten zichtbaar als duidelijk gedefinieerde banden. De DNA-standaard of -ladder moet worden gescheiden in een mate die een bruikbare bepaling van de grootte van monsterbanden mogelijk maakt. In het getoonde voorbeeld worden DNA-fragmenten van 765 bp, 880 bp en 1022 bp gescheiden op een 1,5% agarosegel samen met een 2-log DNA-ladder.

Figuur 1. Een gestolde agarosegel na verwijdering van de kam.

Figuur 2. Een studente voegt kleurstof toe aan haar DNA-monsters.

Figuur 3. Een student laadt het DNA-monster in een putje in de gel.

Figuur 4. Een voorbeeld van een geldocumentatiesysteem.

Figuur 5. Een afbeelding van een gel na elektroforese. EtBr werd vóór elektroforese aan de gel toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5 µg/ml, gevolgd door scheiding bij 100 V gedurende 1 uur. De gel werd blootgesteld aan uv-licht en de foto werd gemaakt met een geldocumentatiesysteem.


Wanneer eiwitten worden gescheiden door elektroforese door een gelmatrix, migreren kleinere eiwitten sneller vanwege minder weerstand van de gelmatrix. Andere invloeden op de migratiesnelheid door de gelmatrix zijn onder meer de structuur en lading van de eiwitten.

In SDS-PAGE elimineert het gebruik van natriumdodecylsulfaat (SDS, ook bekend als natriumlaurylsulfaat) en polyacrylamidegel grotendeels de invloed van de structuur en lading, en eiwitten worden uitsluitend gescheiden op basis van de lengte van de polypeptideketen.

SDS is een detergent met een sterk eiwit-denaturerend effect en bindt zich met een constante molaire verhouding aan de eiwitruggengraat. In aanwezigheid van SDS en een reductiemiddel dat disulfidebindingen splitst die essentieel zijn voor een juiste vouwing, ontvouwen eiwitten zich in lineaire ketens met een negatieve lading die evenredig is aan de lengte van de polypeptideketen.

Gepolymeriseerd acrylamide (polyacrylamide) vormt een gaasachtige matrix die geschikt is voor de scheiding van eiwitten van typische grootte. De sterkte van de gel zorgt voor een gemakkelijke hantering. Polyacrylamidegelelektroforese van SDS-behandelde eiwitten stelt onderzoekers in staat om eiwitten op een gemakkelijke, goedkope en relatief nauwkeurige manier te scheiden op basis van hun lengte.


Bekijk de video: SDS PAGE experiment How to perform SDS PAGE in a lab. How to make SDS PAGE gel. How to run SDS (December 2021).