Informatie

Hoe vaak springen retrotransposons in menselijke cellen?


Als ik het leven van een typische cel in mijn lichaam zou volgen, hoeveel retrotransposon-sprongen zou ik dan per dag waarnemen? Ik ben alleen geïnteresseerd in een ruwe schatting van de orde van grootte: moet ik het zien als een veelvoorkomende gebeurtenis die vrijwel altijd in de meeste van mijn cellen plaatsvindt, of is het een zeldzame gebeurtenis die slechts af en toe in mijn lichaam voorkomt?


Probeer deze referentie voor een ruwe orde van grootte. Hun experimentele ontwerp lijkt de transposities te maximaliseren, dus het zou een redelijke bovengrens moeten zijn.

Er is veel variabiliteit, maar sommige retrotransposons sprongen in ~ 1000 cellen per miljoen, andere slechts een paar per miljoen zodat ze moeilijk te detecteren waren, na ongeveer 1 maand in HeLa-cellen.

Dezelfde referentie geeft een schatting van 10.000 retrotransposon-elementen in een zoogdiergenoom, hoewel hun transpositiefrequenties opnieuw aanzienlijk variëren.


Supereffectief 'springgen' gemaakt

Wetenschappers van Johns Hopkins hebben een gemeenschappelijk "springgen" dat in het menselijk genoom wordt gevonden, getransformeerd in een gen dat honderden keren vaker beweegt dan normaal in muizen- en menselijke cellen.

In het Nature-nummer van 20 mei schrijven de wetenschappers dat hun kunstmatige springgen de weg vrijmaakt voor het creëren van muizen die - willekeurig - ten minste één gen missen, zonder van tevoren te weten welk gen wordt "uitgeschakeld". " Dergelijke willekeurige knock-outs zijn van cruciaal belang geweest bij het bestuderen van de genetica van andere beestjes en zullen licht werpen op de effecten van springgenen - vroeger en nu - op de menselijke gezondheid en ziekte, zeggen de onderzoekers.

"Het maken van dit synthetische springgen was het zelfgemaakte experiment waarvan we nooit dachten dat het zou werken", zegt Jef Boeke, Ph.D., hoogleraar moleculaire biologie en genetica en directeur van het High Throughput Biology Center in Hopkins' Institute for Basic Biomedische wetenschappen.

Springgenen, ook wel retrotransposons genoemd, zijn stukjes genetisch materiaal die zichzelf kopiëren en zich verplaatsen in het genoom van wezens. Ze hebben het potentieel om de genen waarin ze 'landen' te verstoren en men denkt dat ze bijdragen aan de geleidelijke - en misschien af ​​en toe grote - genetische verschuivingen die de evolutie aandrijven. Terwijl organismen zoals gist slechts enkele tientallen springgenen in hun genoom hebben, bevatten de genomen van zoogdieren honderdduizenden kopieën van het DNA van hun springgenen, waardoor het moeilijk is om te weten waar of wanneer - of zelfs als - een sprong heeft plaatsgevonden .

In een tweede artikel in hetzelfde nummer van Nature, M.D./Ph.D. kandidaat Jeffrey Han en Boeke melden dat het menselijke springgen relatief lethargisch is omdat de instructies moeilijk te lezen zijn voor cellen. Door enkele instructies van het gen te vervangen door alternatieve cellen die de voorkeur hebben, maakten de onderzoekers het eerste zeer actieve, kunstmatige springgen dat potentieel efficiënt genoeg is om bij muizen te gebruiken.

Door het kunstmatige springgen in cellen van een muizenembryo in te voegen, zouden wetenschappers in staat moeten zijn muizen te ontwikkelen waarin willekeurige genen ofwel volledig tot zwijgen worden gebracht of gewoon "rustig" worden gemaakt door de inbraak van het springgen. Het bestuderen van deze muizen zou de functie en identiteit van het verstoorde gen moeten onthullen - in die volgorde.

"Het vermogen om genetica "achterwaarts" te bestuderen - om een ​​willekeurig gen te verstoren, de rol ervan in het dier te bepalen en het vervolgens te identificeren - is cruciaal geweest bij het begrijpen van genen in fruitvliegen en gist, en nu zouden we het moeten kunnen doen redelijk efficiënt in muizen", zegt Boeke, wiens lab al begint met het ontwikkelen van de benodigde technologie.

Op basis van zijn onderzoek suggereert Boeke dat het DNA van de genen veel meer is dan alleen "rommel" in ons genoom. In plaats daarvan stelt hij voor dat, lang geleden, de meervoudige inserties van springgenen waarschijnlijk een belangrijke rol speelden bij het vaststellen van de evolutionaire verschuivingen die nu muizen van mannen onderscheiden, en dat zelfs nu hun DNA invloed heeft op hoe andere genen worden gebruikt.

Zowel muizen als mannen delen springgenen die bekend staan ​​als L1-retrotransposons, waarvan sommige "jong" en nog steeds actief zijn, maar de meeste "roestende hulken" zijn die meer dan 30 procent van ons respectieve DNA uitmaken. Maar zelfs de "jonge" muizen zijn niet actief genoeg om op efficiënte wijze genetische veranderingen in muizen te introduceren die van generatie op generatie kunnen worden doorgegeven.

De reden, zo melden de onderzoekers, is dat de instructies van het menselijke springgen bestaan ​​uit te veel van één DNA-bouwsteen, en niet genoeg van de drie andere, een onbalans die de machinerie van de cel verzandt terwijl het probeert het DNA in RNA te transcriberen. In plaats van door te ploeteren, geeft de machine het gewoon op.

Om deze genetische instructies te "verbeteren", maakte Han gebruik van het feit dat meerdere sets van drie DNA-bouwstenen dezelfde eiwitbouwsteen of hetzelfde aminozuur vereisen. Door de meeste originele DNA-"tripletten" van het gen te verwisselen met alternatieven die de cel verkiest, bracht Han de bouwstenen van het gen in evenwicht zonder de instructies voor het maken van eiwitten te veranderen. De onderzoekers hebben een voorlopig patent aangevraagd op het kunstmatige gen.

Han ontdekte dat zoogdiercellen het kunstmatige gen gemakkelijk gebruikten, de genetische informatie ervan vertaalden in RNA en vervolgens in de eiwitten die het gen helpen springen. In een standaardtest van de activiteit van springgenen sprong het kunstmatige gen meer dan 200 keer vaker dan natuurlijke springgenen.

De ontdekkingen hebben ertoe geleid dat de onderzoekers een nieuwe manier hebben voorgesteld waarop retrotransposons kunnen bijdragen aan evolutionaire veranderingen en aan ziekte, naast het volledig verstoren van een gen. De conclusie van de onderzoekers: de prevalentie van moeilijk te lezen springgen-DNA in een gen kan de mate waarin het door de cel wordt gebruikt op subtiele wijze veranderen.

"Ongeveer 70 procent van de menselijke genen bevat een beetje van het DNA van het natuurlijke springgen, en grote genen hebben meerdere stukjes of zelfs complete retrotransposons", zegt Boeke. "Deze stukjes verminderen waarschijnlijk de hoeveelheid RNA die van deze genen wordt gemaakt, en in sommige gevallen veranderen ze zelfs de boodschap van het gen en veranderen de eiwitcoderende regio's van het gen."

Om de waarschijnlijkheid van hun model te testen, onderzocht postdoctoraal onderzoeker Suzanne Szak, Ph.D., duizenden van de meest en minst gebruikte menselijke genen. Genen die meer van het moeilijk leesbare DNA van het springgen bevatten, werden aanzienlijk minder gebruikt dan die met kortere en minder springende genbits, ontdekte ze.

"De aanwezigheid van springend gen-DNA in genen vertegenwoordigt kleine experimenten in het genoom - als de veranderingen de cel of de persoon ten goede komen of niet schaden, worden ze van cel op cel of van generatie op generatie doorgegeven", voegt Boeke toe. . "Als dat niet het geval was, zouden ze geleidelijk uit het genoom verdwijnen."

De onderzoeken werden gefinancierd door het National Cancer Institute en het Medical Scientist Training Program van Johns Hopkins. Auteurs van het kunstmatige springgenpapier zijn Han en Boeke. Auteurs die het moeilijk leesbare DNA van het springgen rapporteren zijn Han, Szak en Boeke. Szak is nu bij Biogen Inc.

Verhaalbron:

Materialen geleverd door Johns Hopkins medische instellingen. Opmerking: inhoud kan worden bewerkt voor stijl en lengte.


Remming van ‘springgenen’ bevordert gezond ouder worden

Bennett Childs is werkzaam op de afdeling Kindergeneeskunde en Adolescentiegeneeskunde, Mayo Clinic, Rochester, Minnesota 55905, VS.

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

Jan van Deursen is werkzaam op de afdeling Kindergeneeskunde en Adolescentiegeneeskunde, Mayo Clinic, Rochester, Minnesota 55905, VS.

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

Oude 1 en zieke 2 weefsels bevatten vaak cellen die een staat zijn binnengegaan die senescentie wordt genoemd, waarin ze stoppen met delen en resistent worden tegen doodinducerende paden. Deze cellen scheiden een verzameling factoren uit, gezamenlijk bekend als het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP), die inflammatoire, eiwitafbrekende en andere biologisch actieve eigenschappen hebben en de weefselfunctie kunnen aantasten. Er is dan ook belangstelling om de SASP te richten op de bestrijding van leeftijdsgebonden ziekten. De samenstelling van de SASP varieert en kan veranderen gedurende de levensduur van de senescente cel 3 . De moleculaire drijfveren die bij deze evolutie betrokken zijn, zijn echter onvolledig begrepen. Inschrijven Natuur, De Cecco et al. 4 identificeren een belangrijke bijdrage aan de 'late' SASP: de reactivering van slapende DNA-sequenties die retrotransposons worden genoemd.

Lees de krant: L1 drijft IFN aan in senescente cellen en bevordert leeftijdsgerelateerde ontstekingen

Retrotransposons worden vaak 'springgenen' genoemd, omdat het boodschapper-RNA dat ervan wordt getranscribeerd een proces kan ondergaan dat reverse transcriptie wordt genoemd om een ​​identieke DNA-sequentie te produceren die vervolgens op een andere plaats in het genoom wordt ingevoegd. Hoewel retrotransposons ongeveer 42% van het menselijk genoom uitmaken, dragen de meeste mutaties die ze functioneel inactief maken 5 . Transcriptie van degenen die functioneel blijven, moet worden voorkomen door op eiwit of RNA gebaseerde regulerende mechanismen om het springen van retrotransposons te voorkomen, wat genetische mutaties of genomische instabiliteit kan veroorzaken en tot kanker kan leiden 6 . Retrotransposons kunnen echter tijdens het ouder worden opnieuw worden geactiveerd 7 .

De Cecco et al. ontdekte dat één type retrotransposon, LINE-1, sterk werd geactiveerd in verouderde menselijke cellen binnen 16 weken nadat ze waren gestopt met delen - een stadium dat de auteurs late veroudering noemen. De groep toonde aan dat hoge niveaus van het transcriptionele repressoreiwit RB1 en lage niveaus van het transcriptionele activatoreiwit FOXA1 normaal gesproken LINE-1 onder controle houden. Deze eiwitten worden abnormaal tot expressie gebracht in laat-senescente cellen, waardoor LINE-1-reactivering mogelijk wordt (Fig. 1).

Figuur 1 | Van vroege tot late veroudering. Senescente cellen zijn gestopt met delen en scheiden inflammatoire eiwitten uit, gezamenlijk bekend als het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP). De Cecco et al. 4 rapporteer wijzigingen in de SASP in de loop van de tijd. een, Tijdens de vroege veroudering wordt de expressie van DNA-sequenties die retrotransposons worden genoemd (zoals LINE-1) onderdrukt door lage niveaus van het transcriptionele activator-eiwit FOXA1 en hoge niveaus van de transcriptionele repressor RB1. De lage niveaus van geproduceerd boodschapper-RNA komen het cytoplasma binnen en ondergaan een proces dat reverse transcriptie wordt genoemd om DNA te produceren. Dit DNA wordt afgebroken door het eiwit TREX1 - als gevolg daarvan hebben retrotransposons geen effect op de vroege SASP, die de expressie en uitscheiding van eiwitten omvat die IL-1β bevatten. B, In de late veroudering nemen de RB1- en TREX1-niveaus af en stijgen de FOXA1-niveaus, wat leidt tot verhoogd cytoplasmatisch LINE-1-DNA. Het DNA wordt gedetecteerd door een pad waarbij de eiwitten cGAS en STING betrokken zijn, wat leidt tot transcriptie van IFN genen die coderen voor de eiwitten interferon-α en interferon-β. Deze interferon-eiwitten dragen bij aan de late SASP en ondersteunen de expressie van vroege SASP-factoren.

In dit late stadium is bekend dat de SASP twee verwante inflammatoire eiwitten bevat, interferon-α en interferon-β genaamd. Dit signaaleiwit maakt deel uit van een oud antiviraal mechanisme, de cGAS-STING-route genaamd, die wordt geactiveerd door de aanwezigheid van DNA in het celcytoplasma. Wanneer viraal DNA aanwezig is in het cellulaire cytoplasma, activeert het cGAS-STING-systeem de productie van interferon-eiwitten en verwante eiwitten die samen een geïnfecteerde cel langs een celdoodroute, apoptose genaamd, drijven, waardoor de verspreiding van infectie wordt voorkomen. De cGAS-STING-route is eerder in verband gebracht met veroudering 8 , 9 - cytoplasmatisch DNA hoopt zich op in ouder wordende cellen omdat ze abnormaal lage niveaus van het DNA-verterende enzym TREX1 10 produceren. De bron van het DNA dat zich ophoopt in het cytoplasma van senescente cellen is echter niet helemaal duidelijk.

Omdat retrotransposons oorspronkelijk zijn afgeleid van oude virussen, kunnen ze cGAS-STING 11 activeren. De Cecco et al. toonde aan dat het cytoplasmatische DNA in senescente cellen, althans gedeeltelijk, wordt geproduceerd door gereactiveerde LINE-1-elementen. De auteurs bevestigden dat abnormaal lage niveaus van TREX1 het mogelijk maken dat LINE-1-afgeleid DNA zich in de late veroudering in het cytoplasma ophoopt. Als ze LINE-1-transcriptie blokkeerden met behulp van remmende RNA-moleculen, of reverse transcriptie blokkeerden met het medicijn lamivudine, werd de interferonrespons niet geactiveerd in de late veroudering. Een dergelijke LINE-1-remming had geen effect op het 'vroege' SASP-eiwit IL-1β, of op de celcyclusstilstand geassocieerd met senescentie, maar veroorzaakte verlies van andere SASP-factoren (inclusief de eiwitten CCL2, IL-6 en MMP3) laat in het senescente celleven. Dit suggereert dat de late interferonrespons nodig is om de SASP op de lange termijn in stand te houden, maar dat deze overbodig is voor de vroege SASP.

Volgende, De Cecco et al. toonde aan dat retrotransposon-transcriptie de late SASP . bevordert in vivo bij ouder wordende muizen. Door lamivudine te gebruiken om de omgekeerde transcriptie van retrotransposons bij muizen van 20 tot 26 maanden oud te blokkeren, konden de auteurs bovendien voorkomen dat de dieren verschillende leeftijdsgerelateerde aandoeningen ontwikkelen, waaronder degeneratie van het bloedfiltratiesysteem in de nieren, atrofie van skeletspiervezels en kenmerken van chronische ontsteking.

In een laatste reeks experimenten toonden de onderzoekers aan dat ORF1, een eiwit dat wordt gecodeerd door LINE-1-elementen, specifiek tot expressie wordt gebracht in verouderende cellen in de verouderde menselijke huid, maar dat niet alle verouderende cellen ORF1 tot expressie brengen. Gecombineerd met in vivo experimenten die aantonen dat de expressie van LINE-1 later piekt dan de expressie van andere senescentiemarkers bij muizen, en in vitro gegevens die aantonen dat muizencellen nog steeds veroudering kunnen ingaan in de aanwezigheid van lamivudine, suggereren deze gegevens dat reactivering van LINE-1 eerder een gevolg dan een oorzaak is van veroudering.

De implicaties van deze studie voor de menselijke biologie zijn speculatief maar bemoedigend. Het belang van de interferonrespons voor het doden van met virus geïnfecteerde cellen verhoogt bijvoorbeeld de mogelijkheid dat het een centrale rol speelt in het natuurlijke vermogen van het lichaam om verouderde cellen te verwijderen. Er zal echter een grondiger onderzoek van verouderd of ziek menselijk weefsel nodig zijn om te bepalen of het late-SASP-mechanisme in het algemeen van toepassing is op mensen.

Senescente cellen zijn zeldzaam, zelfs op hoge leeftijd 2, 3 . Desalniettemin voorkomt het elimineren van deze cellen en hun SASP aan leeftijd gerelateerde achteruitgang van de gezondheid 1 . Als gevolg hiervan hebben strategieën voor het doden of wijzigen van senescente cellen (respectievelijk senolytische en senomorfe benaderingen genoemd) veel aandacht gekregen. De eerste senolytische verbindingen, die het anti-apoptose-eiwit Bcl remmen, worden algemeen als effectief beschouwd 12 . Het werk van De Cecco en collega's toont aan dat lamivudine kan werken als een senomorfe verbinding.

Omdat een senomorfe verbinding continu aanwezig zou moeten zijn om de SASP te onderdrukken, kan het een frequentere toediening vereisen dan een senolytische verbinding, die senescente cellen regelrecht verwijdert, zodat geen verdere behandeling nodig is totdat er meer ophopen. Het is bemoedigend dat lamivudine bij mensen is gebruikt als een langdurige antiretrovirale therapie zonder grote bijwerkingen - in tegenstelling tot andere senomorfe verbindingen zoals rapamycine, dat de SASP 13 afstompt, maar een krachtig immunosuppressivum is. Er zijn echter nog geen meldingen dat lamivudine de gezonde levensduur van de mens verbetert of aanwijzingen dat het retrotransposons bij mensen onderdrukt.

Een potentieel risico van senomorfe verbindingen is de ontwikkeling van kanker, omdat veroudering een gunstige, tumoronderdrukkende rol kan spelen bij het voorkomen van de proliferatie van zieke of beschadigde cellen. De celcultuurexperimenten van De Cecco en collega's suggereren dat lamivudine de celcyclusstilstand niet verstoort, wat de sleutel is tot dit gunstige effect van senescentie. Ze volgden echter slechts zes maanden lang met lamivudine behandelde dieren. Langere termijn in vivo follow-up is nodig om te bewijzen dat deze therapie het risico op kanker niet zou verhogen. Als dit kan worden bevestigd, zou de huidige studie de deur kunnen openen voor het gebruik van reverse-transcriptieremmers en, misschien, remmers van de cGAS-STING-route, als een manier om ziekten zoals osteoartritis en atherosclerose te bestrijden, die in verband zijn gebracht met de ophoping van senescente cellen.


B. Samengestelde transposons: Tn-elementen

Als een paar IS-elementen dicht bij elkaar zou liggen, gescheiden door een kort stuk genomisch of plasmide-DNA, kunnen ze samen transponeren en het DNA tussen hen in dragen als onderdeel van een samengestelde transposon, of Tn-element. Als een deel van het DNA tussen IS-elementen in een Tn-element antibioticaresistentiegenen bevat, kan de transpositie deze genen dragen en verspreiden naar ander DNA in de cel. Tn-elementen (zoals IS-elementen) zijn aanwezig in een laag aantal exemplaren. Hieronder is een generiek Tn-element getekend.

Antibioticaresistentiegenen maken de medische gemeenschap bezorgd dat hun verspreiding heeft geleid tot antibioticaresistente pathogenen die ziekten veroorzaken die steeds moeilijker en zelfs onmogelijk te behandelen zijn. Eerder zagen we genetische &lsquo-transformatie&rsquo van streptokokkencellen die virulentiegenen in DNA van dode cellen oppikken. We transformeren routinematig cellen met plasmiden als onderdeel van recombinant-DNA-experimenten. Maar bacteriën kunnen op een heel natuurlijke manier plasmide-DNA onderling overdragen. Tijdens bacteriële conjugatie kan een F (vruchtbaarheid) plasmide draagt ​​normaal gesproken DNA over tussen compatibele bacteriële paringstypen (bekijk bacteriële conjugatie elders in deze tekst voor meer details). Een F-plasmide dat een Tn-element bevat dat een antibioticumresistentiegen herbergt, kan dus tijdens conjugatie van donor naar ontvanger worden doorgegeven. Het Tn-element kan worden omgezet in het bacteriële genoom van de ontvanger. Op deze manier is transpositie een belangrijke route voor de overdracht en verspreiding van antibioticaresistentie.


Retro-design

In 2005, met een vers geslagen doctoraat in moleculaire genetica, kreeg Nels Elde een baan als research fellow in Seattle en kreeg hij de taak om de evolutie van het immuunsysteem van gibbons, een soort aap, te bestuderen. Elke ochtend als hij naar het laboratorium in de stad fietste, passeerde hij de dierentuin van de stad en hoorde de gibbons elkaar roepen. Af en toe ging hij naar de dierentuin om ze te bekijken, maar hij had toen geen idee dat de doodshoofdaapjes die hij daar ook zag, zo'n grote rol zouden spelen in zijn toekomstig onderzoek. Op het werk richtte Elde's onderzoek naar primaten zich op het gibbon-DNA dat hij verantwoordelijk was voor het extraheren en analyseren met behulp van sequencing-machines.

Toen, zes jaar geleden, kreeg Elde zijn eerste eigen lab om te runnen, aan de Universiteit van Utah. Hij had niet verwacht dat de eerste ontdekking van zijn team daar zo snel zou komen, of dat er transponeerbare elementen aan te pas zouden komen. Elde was naar de universiteit gekomen met de bedoeling te leren hoe cellen binnendringende virussen, zoals hiv, herkennen en verslaan. Maar hij had nog niet de apparatuur gekregen die hij nodig had om experimenten uit te voeren, ondanks het feit dat hij al twee medewerkers had die graag wilden werken, waaronder zijn labmanager, Diane Downhour. Gezien het gebrek aan laboratoriumhulpmiddelen, brachten de twee laboratoriummedewerkers hun tijd door op hun computers, zoekend in databases naar interessante patronen in DNA.Na slechts twee weken hiervan kwam Downhour het kantoor van Elde binnen en vertelde hem dat ze een paar extra exemplaren van een bepaald gen hadden gevonden bij apen uit de Nieuwe Wereld en specifiek bij doodshoofdaapjes.

Elde wuifde aanvankelijk het inzicht van Downhour weg. &ldquoIk zei:'Waarom ga je niet terug naar het lab en maak je je er geen zorgen over?'', herinnert hij zich. Maar een paar dagen later keerde ze met het idee terug naar zijn kantoor. &ldquoIk was gewoon in een soort paniekmodus om een ​​laboratorium te openen, vriezers te bestellen, apparatuur te installeren en mensen aan te nemen,&rdquo, legt Elde uit. &ldquoDiane moest zeker terugkomen en zeggen: 'Kom op, word hier wakker. Let op.'&rdquo

Het gen waarvan ze meerdere kopieën hebben gedetecteerd bij doodshoofdaapjes, wordt geladen multivesiculair lichaamseiwit 3 genoemd, of CHMP3. Elke doodshoofdaap lijkt drie varianten van het gen te hebben. Ter vergelijking: mensen hebben slechts de ene, originele variant van CHMP3. Het gen wordt verondersteld in meerdere versies te bestaan ​​in het genoom van de doodshoofdaap dankzij transponeerbare elementen. Op een bepaald moment, ongeveer 35 miljoen jaar geleden, in een voorouder van de doodshoofdaap, wordt gedacht dat LINE-1 retrotransposons uit het genoom in de celkern zijn gesprongen en het cytoplasma van de cel zijn binnengekomen. Na het associëren met CHMP3 RNA in het cytoplasma, de transponeerbare elementen brachten de code voor CHMP3 terug in de kern en re-integreerden het in het genoom. Wanneer de extra versies van CHMP3 werden gekopieerd in het genoom, ze werden niet perfect gekopieerd door de cellulaire machinerie, en dus werden veranderingen in de sequenties geïntroduceerd. Bij een eerste blik op de gegevens leken deze onvolkomenheden ze niet-functionele 'pseudogenen' te maken. Maar terwijl het team van Elde zich verdiepte in het mysterie waarom doodshoofdaapjes zoveel exemplaren hadden van... CHMP3, ontstond er een intrigerend verhaal.

Verstopt in het zicht: doodshoofdaapjes dragen extra kopieën van het CHMP3-gen bij zich. Krediet: Ariadne Van Zandbergen Alamy

De ontdekking van pseudogenen is niet geheel ongewoon. Er zijn meer dan 500.000 LINE-1-retrotransposons in het menselijk genoom11, en deze elementen hebben de codes voor andere eiwitten in de cel opgeraapt en opnieuw ingebracht. In tegenstelling tot de endogene retrovirale elementen in het genoom, die duidelijk terug te voeren zijn op oude virussen, is de oorsprong van LINE-1 retrotransposons duister. Beide typen transponeerbare elementen bevatten echter de code voor een enzym dat reverse transcriptase wordt genoemd, waardoor ze in theorie de genetische code opnieuw in het genoom in de celkern kunnen inbrengen. Dit enzym is precies wat LINE-1-activiteit toestond om te kopiëren CHMP3 terug in het genoom van de voorouder van de eekhoorn-aap.

Elde bleef maar denken aan het mysterie waarom doodshoofdaapjes meerdere varianten hadden van... CHMP3. Hij wist dat bij mensen de functionele variant van de CHMP3 gen maakt een eiwit dat HIV gebruikt om van het celmembraan te ontluiken en naar andere cellen van het lichaam te reizen en deze te infecteren. Een decennium geleden gebruikte een team van wetenschappers een gemanipuleerde vector om menselijke cellen in een schaal ertoe aan te zetten een afgeknotte, niet-werkende versie van het CHMP3-eiwit te produceren en toonde aan dat het afgeknotte eiwit verhinderde dat hiv uit de cellen ontkiemde12. Er was hoop dat dit inzicht een nieuwe manier zou opleveren om hiv-infectie te behandelen en zo aids te voorkomen. Helaas speelt het eiwit ook een rol bij het mogelijk maken van andere belangrijke moleculaire signalen om de vorming van pakketjes die van het celmembraan afkomen te vergemakkelijken. Als zodanig zorgde het gebroken CHMP3-eiwit dat de wetenschappers de cellen hadden laten produceren al snel ervoor dat de cellen stierven.

Aangezien virussen zoals HIV een ontluikende route gebruiken die afhankelijk is van normaal CHMP3-eiwit, vroeg Elde zich af of de extra, veranderde CHMP3 kopieën die doodshoofdaapjes bij zich hebben, bieden enige bescherming tegen virussen op cellulair niveau. Hij coördineerde met onderzoekers over de hele wereld, die eekhoorn-apenbloed stuurden van primatencentra zo verreikend als Bastrop, Texas, naar Frans-Guyana. Toen het team van Elde het bloed analyseerde, ontdekten ze dat de doodshoofdaapjes daadwerkelijk een van de gewijzigde versies van CHMP3 produceerden die ze bij zich hadden. Deze bevinding gaf aan dat bij deze soort een van de CHMP3 exemplaren was een functioneel pseudogen, waardoor het beter bekend staat als een 'retrogeen'. In een ander experiment gebruikte de groep van Elde een genetisch hulpmiddel om menselijke niercellen in een schaaltje te coaxeren om deze retrogene versie van CHMP3. Vervolgens lieten ze HIV de cellen binnendringen en ontdekten dat het virus dramatisch minder in staat was om de cellen te verlaten, waardoor het op zijn sporen bleef. Daarentegen kon HIV in cellen die niet waren gemanipuleerd om het retrogen te produceren de cellen verlaten, wat betekent dat het in theorie nog veel meer zou kunnen infecteren.

In een afzonderlijk deel van het experiment toonde de groep van Elde aan dat terwijl menselijke cellen werden aangepast om de giftige, afgeknotte versie van CHMP3 (de soort die oorspronkelijk tien jaar geleden werd ontwikkeld) te laten sterven, cellen die werden overgehaald om de retrogene eekhoorn-aap-versie van CHMP3 te maken, kunnen overleven. En door een verdere vergelijking met de ingekorte versie uit te voeren, ontdekte Elde dat het retrogen&mdash wat hij retroCHMP3&mdashin noemt, deze kleine primaten op de een of andere manier mutaties hadden verkregen die resulteerden in een CHMP3-eiwit dat twintig aminozuurveranderingen bevat. Het is een combinatie van deze twintig punten van verschil in het eiwit dat door het retrogen wordt gemaakt, waarvan hij denkt dat het niet-toxisch is voor de cel zelf, maar nog steeds in staat is om de pogingen van HIV om cellen af ​​te breken, te saboteren. Elde presenteerde de bevindingen, die hij van plan is te publiceren, in februari op de Keystone Symposia on Viral Immunity in New Mexico.

Het idee dat retroCHMP3 van doodshoofdaapjes misschien kan voorkomen dat virussen zoals HIV zich verspreiden, is interessant, zegt Michael Emerman, een viroloog bij het Fred Hutchinson Cancer Research Center. &ldquoHet hebben van een procesremmer helpt je altijd om te begrijpen wat er belangrijk voor is,&rdquo, legt Emerman uit. Hij voegt eraan toe dat het ook opmerkelijk is dat retroCHMP3 niet giftig was voor de cellen, omdat deze bevinding een nieuw antiviraal geneesmiddel zou kunnen inspireren: &ldquo dan het deel van de route dat door gastheercellen wordt gebruikt.&rdquo

Akiko Iwasaki, een immunoloog aan de Yale School of Medicine in New Haven, Connecticut, is ook optimistisch dat de bevinding vooruitgang zal opleveren. "Wat zo cool is aan dit mechanisme van hiv-beperking, is dat hiv niet rechtstreeks bindt aan retroCHMP3, waardoor het moeilijker wordt voor het virus om de blokkade van retroCHMP3 te overwinnen", zegt Iwasaki. &ldquoHoewel mensen geen retroCHMP3-gen hebben, kan men, door te begrijpen hoe retroCHMP3 werkt bij andere primaten, strategieën ontwerpen om de activiteit van retroCHMP3 in menselijke cellen na te bootsen om HIV-replicatie te blokkeren.&rdquo

Elde hoopt dat, als de bevindingen kloppen, cellen van patiënten met een HIV-infectie op een dag kunnen worden geëxtraheerd en bewerkt om kopieën van retroCHMP3 te bevatten, en vervolgens opnieuw in deze patiënten te introduceren. Wetenschappers hebben in klinische onderzoeken al een vergelijkbare benadering van celbewerking gebruikt om cellen uit te rusten met een variant van een ander gen, genaamd CCR5, dat voorkomt dat HIV cellen binnendringt. In deze experimenten hebben patiënten infusies van hun eigen cellen ontvangen en aangepast om de zeldzame CCR5 variant. Maar hoewel voorlopige resultaten aangeven dat de aanpak veilig is, is er nog niet genoeg bewijs over de werkzaamheid ervan. (Een ander punt van zorg is dat mensen met de zeldzame, aangepaste versie van de CCR5 gen is mogelijk wel 13 keer vatbaarder om ziek te worden door het West-Nijlvirus dan die met de normale versie van dit gen13.) Door zowel retroCHMP3 als de versie van CCR5 die voorkomt dat HIV in cellen komt, suggereert Elde, deze combinatie van genbewerkingen zou een krachtigere manier kunnen bieden om patiëntencellen aan te passen om HIV-infectie te behandelen.

"Je zou je een soort genetische cocktailtherapie kunnen voorstellen om hiv te blokkeren op een manier waarop het virus zich er niet aan kan aanpassen", zegt Elde. Zijn team is ook van plan om te testen of retroCHMP3 antivirale activiteit heeft tegen andere virussen, waaronder ebola.

Retro gaan: menselijke cellen die zijn ontworpen om retroCHMP3 te maken (getoond in groen). Krediet: Diane Downhour

Het onderzoek naar hoe pseudogenen en retrogenen de gezondheid kunnen beïnvloeden, is aan de gang. En er is steeds meer bewijs dat de LINE-1-elementen die ze creëren, actiever zijn dan eerder werd gedacht. In 2015 rapporteerden wetenschappers van het Salk Institute in Californië bijvoorbeeld een voorheen niet-geïdentificeerde regio van LINE-1 retrotransposons die op een bepaalde manier supercharged zijn. Het gebied dat de onderzoekers identificeerden, codeert voor een eiwit dat de retrotransposons uiteindelijk helpt om stukjes DNA in het celcytoplasma op te pikken om ze opnieuw in het genoom te plaatsen14. Dezelfde regio verbetert ook het vermogen van LINE-1-elementen om rond het genoom te springen en zo variatie te creëren, wat gewicht toevoegt aan het idee dat deze elementen een ondergewaardeerde rol kunnen spelen in de menselijke evolutie en bij het creëren van diversiteit onder verschillende populaties van mensen.

De actieve functie van transponeerbare elementen is belangrijker dan veel mensen beseffen, aldus John Coffin, een retrovirusonderzoeker die zijn tijd verdeelt tussen zijn werk aan het Amerikaanse National Cancer Institute in Frederick, Maryland, en Tufts University in Boston. "Ze kunnen een belangrijke bijdrage hebben geleverd aan onze biologie", zegt hij. &ldquoIk denk dat hun rol bij het vormgeven van onze evolutionaire geschiedenis ondergewaardeerd wordt door veel evolutionaire biologen.&rdquo


Plant retrotransposons

AbstractRetrotransposons zijn mobiele genetische elementen die transponeren door middel van reverse transcriptie van een RNA-tussenproduct. Retrotransposons zijn alomtegenwoordig in planten en spelen een belangrijke rol in de evolutie van plantengenen en -genen. In veel gevallen omvatten retrotransposons meer dan 50% van het nucleaire DNA-gehalte, een situatie die zich in slechts een paar miljoen jaar kan voordoen. Plantaardige retrotransposons zijn structureel en functioneel vergelijkbaar met de retrotransposons en retrovirussen die in andere eukaryote organismen worden aangetroffen. Er zijn echter belangrijke verschillen in de genomische organisatie van retrotransposons in planten in vergelijking met sommige andere eukaryoten, waaronder hun vaak hoge kopie-aantallen, hun sterk heterogene populaties en hun chromosomale dispersiepatronen. Recente studies bieden waardevolle inzichten in de mechanismen die betrokken zijn bij het reguleren van de expressie en transpositie van retrotransposons. Deze review beschrijft de structuur, genomische organisatie, expressie, regulatie en evolutie van retrotransposons, en bespreekt zowel hun bijdragen aan de evolutie van het plantengenoom als hun gebruik als genetische hulpmiddelen in de plantenbiologie.


MECHANISTISCHE STUDIES VAN LINE-1 RETROTRANSPOSITIE

Een test om LINE-1 retrotranspositie te bestuderen

Bijna 20 jaar geleden werd een functionele test ontwikkeld om het retrotranspositiepotentieel van LINE-1's in gekweekte zoogdiercellen te beoordelen (60). De test bouwt voort op een grondgedachte die is ontwikkeld door Boeke en Fink om aan te tonen dat de gist Tyl retrotransposon mobiliseert via een RNA-tussenproduct (6). Daaropvolgende verbeteringen van de test door de Heidmann- en Curcio-laboratoria leidden vervolgens tot de ontwikkeling van retrotranspositie-indicatorcassettes die alleen voor expressie konden worden geactiveerd na een succesvolle retrotranspositieronde (190, 191).

In het kort, de 3’ UTR-sequenties van kandidaat-line-1's van volledige lengte zijn gelabeld met een retrotranspositie-indicatorcassette die bestaat uit een achterwaartse kopie van een neomycinefosfotransferase-reportergen uitgerust met zijn eigen promotor- en polyadenyleringssignalen (d.w.z., de mneoI cassette Afbeelding 2 ). Belangrijk is dat het reportergen wordt verstoord door een intron dat zich in dezelfde transcriptionele oriëntatie bevindt als de LINE-1 (60, 192, 193). Deze opstelling zorgt ervoor dat de expressie van het neomycine-fosfotransferase-gen alleen plaatsvindt na een succesvolle ronde van LINE-1-retrotranspositie, wat uiteindelijk leidt tot het genereren van klonale foci die groeien in de aanwezigheid van het neomycine-analogon G418. Kortom, de test maakt een eenvoudige, maar krachtige manier mogelijk om de efficiëntie van de retrotranspositie van LINE-1 te controleren door G418-resistente foci te tellen (60).

De LINE-1-expressievector bestaat uit een retrotranspositie-competente LINE-1 die is gesubkloneerd in pCEP4 (geflankeerd door een CMV-promoter en een SV40-polyadenyleringssignaal). De pCEP4-vector is een episomaal plasmide met eiwitcodering (EBNA-1) en cis-werkende sequenties (OriP) die nodig zijn voor replicatie in zoogdiercellen het heeft ook een hygromycineresistentiegen (HYG) dat de selectie van zoogdiercellen die de vector bevatten mogelijk maakt, evenals een bacteriële oorsprong van replicatie (Ori) en een ampicillineselectiemarker ( Amp) voor plasmide-amplificatie in bacteriën. De mneoI reportercassette, die zich in de LINE-1 3’ UTR bevindt, bevat het gen voor neomycinefosfotransferase (neo, paarse doos, met zijn eigen promotor- en polyadenyleringssignalen, respectievelijk paarse pijl en lolly) in de tegenovergestelde transcriptionele oriëntatie van LINE-1-transcriptie. Het reportergen wordt onderbroken door een intron (lichtpaarse doos) met splitsingsdonor (SD) en acceptor (SA) plaatsen in dezelfde transcriptionele oriëntatie van de LINE-1. Deze opstelling van de reportercassette zorgt ervoor dat het reportergen pas tot expressie wordt gebracht na een succesvolle retrotranspositie. nieuw retrotranspositie van de mneoI reportercassette zal resulteren in G418-resistente kolonies die kunnen worden gekwantificeerd (Genetisch testpanel met pJM101/L1.3 (wildtype (WT)) en pJM105/L1.3 (RT-mutant (RT−)) LINE-1-constructen) . Alternatieve verslaggevers kunnen worden gebruikt in plaats van: mneoI om verschillende resistentie tegen geneesmiddelen, fluorescerende of luminescente uitlezingen mogelijk te maken (alternatief verslaggeverspaneel, met blasticidine-S-deaminase (BLAST), verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) of luciferase (LUC)) retrotranspositie-indicatorcassettes. De toevoeging van de ColE1 bacteriële oorsprong van replicatie (herstel van het insertiepaneel, groene doos) aan een aangepaste versie van de mneoI reportercassette maakt het herstel mogelijk van genomisch DNA van gekweekte cellen van gemanipuleerde LINE-1 retrotranspositiegebeurtenissen als autonoom replicerende plasmiden in E coli. De inserties kunnen ook worden gekarakteriseerd door inverse PCR met behulp van divergente oligonucleotide-primers (herstel van het insertiepaneel, zwarte pijlen: 1 en 2) die aan het reportergen annealen. Het gebruik van epitoop-tags (T7-tag in carboxyl-terminus van ORF1, gele doos en TAP-tag in carboxyl-terminus van ORF2, blauwe doos) maakt de immunoprecipitatie (niet getoond) en detectie van LINE-1-eiwitten door western blot mogelijk en immunofluorescentie (IF) (detectiepaneel, met Western-blot-gegevens verkregen met pAD2TE1, een vector die ORF1-T7p en ORF2-TAPp tot expressie brengt, vergeleken met niet-getransfecteerde (UT) HeLa-cellen (82)). De toevoeging van de RNA-stamlussen die het bacteriofaag MS2 manteleiwit (409) (oranje doos) binden in de 3’ UTR van LINE-1 kan worden gebruikt om de cellulaire lokalisatie van LINE-1 RNA te detecteren door middel van fluorescerende ter plaatse hybridisatie (FISH). Zowel IF- als FISH-strategieën kunnen worden gecombineerd om de subcellulaire lokalisatie van ORF1p, ORF2p en LINE-1 RNA te detecteren (paneel voor cellokalisatie, met pAD3TE1-vector met ORF1-T7p, ORF2-TAPP en LINE-1 RNA-MS2 (82)) . De afbeeldingen die werden getoond in de cellulaire lokalisatie en de detectiebox werden oorspronkelijk gepubliceerd in (82). Aanvullende verwijzingen worden in de tekst gegeven.

Sinds het begin van de retrotranspositietest van gekweekte cellen, is een batterij retrotranspositie-indicatorcassettes ontwikkeld om de retrotranspositie van LINE-1 te beoordelen door ofwel gebruik te maken van medicijnselectie (d.w.z., een blasticidineresistentiecassette) of screening op reportergenactivatie (d.w.z., groen fluorescerend eiwit en luciferasecassettes) (194�) (Figuur 2). Bovendien hebben gemanipuleerde LINE-1-elementen, die epitooptags bevatten op de carboxyl-termini van ORF1p en ORF2p en een MS2-bindingsplaats in het LINE-1-mRNA, de directe detectie van de door LINE-1 gecodeerde eiwitten en mRNA in gekweekte cellen mogelijk gemaakt met behulp van zowel biochemische benaderingen als fluorescentiemicroscopie (82, 198�) (Figuur 2). Ten slotte zijn er retrotranspositie-indicatorcassettes ontwikkeld die het directe herstel van gemanipuleerde LINE-1 retrotranspositie-gebeurtenissen mogelijk maken als autonoom replicerende plasmiden in E coli (156, 202, 203) (Figuur 2).

Samengevat heeft de retrotranspositietest van gekweekte cellen, in combinatie met complementaire moleculair genetische en biochemische studies: 1) de identificatie van actieve LINE-elementen van het genoom van zoogdieren en gewervelde dieren mogelijk gemaakt (58�, 86, 90, 91, 204, 205) 2) toonde aan dat allelische heterogeniteit de retrotranspositie van LINE-1 beïnvloedt (162, 206) 3) faciliteerde experimentele verlichting van het LINE-1 retrotranspositiemechanisme (besproken in (11)) 4) toonde aan dat retrotranspositie van LINE-1 genome structurele variatie genereert (156, 202, 203) 5) onthulde dat de LINE-1-gecodeerde eiwitten (ORF1p en/of ORF2p) in trans om SINE-retrotranspositie en verwerkte pseudogenvorming (92�) en 6) te bemiddelen, maakten de identificatie mogelijk van gastheerfactoren die retrotranspositie kunnen beperken en/of bevorderen (zie hieronder). Het is duidelijk dat de gekweekte celtest een hulpmiddel is geweest en nog steeds is om een ​​dieper mechanistisch begrip van de LINE-1-biologie mogelijk te maken.

Functionele studies van LINE-1 retrotranspositie

De LINE-1 5’ UTR

Hoewel de promotorstructuren van LINE-1's van mens en muis verschillen (Figuur 1), is het duidelijk dat de verwerving van een interne RNA-polymerase II-promotor ervoor heeft gezorgd dat retro-getransponeerde LINE-1's van volledige lengte het potentieel behouden om daaropvolgende amplificatie in het genoom te ondergaan . De menselijke LINE-1 5’ UTR is ongeveer 910 bp lang en bevat een interne RNA-polymerase II-promotor die de transcriptie van LINE-1-mRNA op of nabij het eerste nucleotide van het element stuurt (75, 207). Experimentele studies hebben aangetoond dat een YY1-bindingsplaats aan het 5’-uiteinde van de 5’ UTR van cruciaal belang is voor nauwkeurige transcriptionele initiatie en dat de meeste LINE-1-mRNA's een 7-methylguanosine-kapstructuur bevatten, wat hun translatie vergemakkelijkt (208 , 209). De 5’ UTR-havens cis-werkende bindingsplaatsen voor de volgende transcriptiefactoren: Runx3-, Sp1- en SRY-gerelateerde (Sox) eiwitten (75, 207, 210, 211). Studies in gekweekte cellen hebben aangetoond dat mutaties hierin cis-werkende sequenties verminderen LINE-1 transcriptie en retrotranspositie. Bovendien is het waarschijnlijk dat andere gastheerfactoren de 5’ UTR binden en LINE-1-expressie reguleren (zie hieronder).

De humane LINE-1 5’ UTR bevat niet alleen een sense-strengpromotor, maar ook een geconserveerde RNA-polymerase II-antisense (AS)-promotor (76). Transcriptie van de LINE-1 AS-promoter kan leiden tot het genereren van chimere transcripten die LINE-1-sequenties omvatten die zijn samengevoegd met sequenties die zijn afgeleid van de 5’ genomische flank van een gegeven LINE-1-locus (76, 212).Deze chimere transcripten zijn gebruikt als een proxy om transcriptioneel actieve LINE-1-elementen in menselijke embryonale stamcellen te identificeren (213). Terwijl bidirectionele promotors van zoogdieren zijn geïdentificeerd als de bron van sommige niet-coderende RNA's (214), vereist de functie van de menselijke LINE-1 AS chimere transcripten, indien aanwezig, opheldering.

De muis LINE-1 5’ UTR bestaat uit een reeks van maximaal 7 2/3e monomere herhalingen die worden gevolgd door een niet-vertaalde linkersequentie onmiddellijk stroomopwaarts van ORF1 ((90), (besproken in (87))). Reporter-genassays hebben aangetoond dat 5’ UTR's van de A, TF, en GF LINE-1-subfamilies blijven transcriptioneel actief (90, 215, 216), terwijl 5’ UTR's van de V- en F LINE-1-subfamilies over het algemeen geen transcriptie-activiteit hebben (89). Op celcultuur gebaseerde en biochemische testen hebben aangetoond dat mRNA's afgeleid van de A, TF, en GF subfamilies zijn verrijkt met ribonucleoproteïnedeeltjes (RNP's) en die LINE-1-elementen selecteren blijven retrotranspositie-competent (86, 90, 91). Het lijkt er dus op dat het vermogen van muis LINE-1's om nieuwe promotorsequenties te vangen, gedeeltelijk heeft geleid tot hun evolutionaire succes.

Mouse LINE-1's bevatten een transcriptioneel actieve antisense RNA-polymerasepromotor (217, 218). In tegenstelling tot menselijke LINE-1's, bevindt de antisense-promotor zich in ORF1. Transcriptie van de AS-promoter van de muis leidt tot het genereren van chimere transcripten die LINE-1-sequenties bevatten die zijn samengevoegd met genomische sequenties die het uiteinde van de LINE-1-locus flankeren. Bovendien zou de overexpressie van LINE-1 AS-mRNA kunnen leiden tot een vermindering van retrotranspositie in gekweekte cellen (218). Het is dus intrigerend om te speculeren dat LINE-1 AS-mRNA een rol kan spelen bij het reguleren van muis LINE-1 retrotranspositie in vivo.

Recente onderzoeken geven aan dat een groot deel van de lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) van zoogdieren retrotransposon-afgeleide sequenties bevatten en dat sommige worden getranscribeerd van LTR-retrotransposon-afgeleide promoters ((219, 220), besproken in (221)). Intrigerend genoeg zijn geselecteerde lncRNA's betrokken bij het in stand houden van de pluripotentie van embryonale stamcellen door nog niet-geïdentificeerde mechanismen (222). Het zal interessant zijn om te bepalen of de LINE-1 antisense-promoter bijdraagt ​​aan het transcriptionele regulerende netwerk dat stamcelidentiteit reguleert (besproken in (223)).

ORF1p

40 kDa-eiwit (ook bekend als p40 voor menselijke LINE-1's) dat wordt getranslateerd uit LINE-1-mRNA door een traditioneel cap-afhankelijk mechanisme (77, 209, 224). Vroege biochemische studies hebben aangetoond dat ORF1p van muis en mens zich in cytoplasmatische ribonucleoproteïnedeeltjes bevindt en enkelstrengs RNA bindt op een sequentie-onafhankelijke manier (78, 225�). Biochemische en genetische analyses tonen duidelijk aan dat ORF1p vereist is voor LINE-1 RNP-vorming, en dat LINE-1 RNP-vorming een noodzakelijke stap is in het retrotranspositieproces (198).

Structurele studies hebben aangetoond dat het N-uiteinde van LINE-1 ORF1p een coiled-coil-domein bevat, dat trimerisatie van ORF1p-moleculen vergemakkelijkt (79, 229�). Het centrale gebied van ORF1p bevat een niet-canoniek RNA-herkenningsmotief (RRM) dat, met hulp van zijn C-terminale domein (CTD), vereist is voor ORF1p-RNA-binding (79, 231, 233). Met name missense-mutaties in sterk geconserveerde aminozuurresiduen in zowel de RRM als CTD doen ofwel de LINE-1-retrotranspositie in gekweekte cellen teniet of beïnvloeden deze negatief (60, 231).

ORF1p van mens en muis bevat nucleïnezuur-chaperonne-activiteiten die het opnieuw annealen van enkelstrengige DNA's kunnen vergemakkelijken in vitro (80, 234�). Met name hebben verschillende onderzoeken aangetoond dat, ondanks het ontbreken van sequentiehomologie, eiwitten die worden gecodeerd door niet-zoogdier-LINE's ook nucleïnezuur-chaperonactiviteit bevatten (237, 238). ORF1p van een zebravis-LINE (ZfL2-1) heeft bijvoorbeeld nucleïnezuur-chaperonactiviteit (239). Er wordt verondersteld dat deze chaperonne-activiteit van nucleïnezuur de eerste stappen van LINE-1-integratie vergemakkelijkt in vivo. Enigszins onverwacht doet de deletie van ORF1 de retrotranspositie-activiteit van ZfL2-1 in gekweekte menselijke cellen niet teniet (240). Deze gegevens, gekoppeld aan het feit dat Alu-retrotranspositie alleen het eiwit vereist dat wordt gecodeerd door LINE-1 ORF2 (92), roepen vragen op over hoe ORF1p-nucleïnezuurchaperonactiviteit deelneemt aan LINE-1-retrotranspositie. De ontwikkeling van celvrije systemen om LINE-1-retrotranspositie te volgen, zou een meer rigoureus onderzoek mogelijk maken van welke ORF1p-functies vereist zijn voor retrotranspositie.

ORF2p

150 kDa eiwit (81, 82, 200, 241) dat endonuclease (L1 EN) (83) en reverse transcriptase (L1 RT) (84) activiteiten bevat die essentieel zijn voor retrotranspositie (60, 83). Het L1 EN-domein bevindt zich in de buurt van het N-uiteinde van het eiwit en vertoont gelijkenis met apurine/apyrimidinische endonucleasen (APE) (242�). In vitro en bioinformatica-analyses (71, 83, 99, 196, 245) suggereren dat L1 EN een enkelstrengs endonucleolytische inkeping maakt op een losjes gedefinieerde consensussequentie in genomisch DNA (5’-TTTT/AA-3’ waar de schuine streep aangeeft het deelbare fosfaat), waardoor een 5’ fosfaat en 3’-hydroxylgroep (83) bloot komt te liggen. Kristallografische studies suggereren dat L1 EN een extra spiraalvormig adenineresidu 3 van de splitsbare binding herkent om splitsing te bemiddelen met behulp van een mechanisme dat vergelijkbaar is met dat van andere APE-eiwitten (244). Bovendien is het waarschijnlijk dat epigenetische modificaties van doel-DNA (bijv., nucleosoomtoegankelijkheid) kan de ORF2p-toegankelijkheid en L1 EN-splitsingsactiviteit beïnvloeden (246).

Het L1 RT-domein bevindt zich stroomafwaarts van het EN-domein in ORF2p en deelt sequentieovereenkomst met de RT-domeinen die worden gecodeerd door telomerase, Penelope-achtige retrotransposons, groep II-introns, andere niet-LTR-retrotransposons, LTR-retrotransposons en retrovirussen (247's). x02013249). Biochemische en genetische tests werden oorspronkelijk gebruikt om aan te tonen dat Ty1/LINE-1 ORF2p-fusie-eiwitten reverse transcriptase-activiteit bezitten in vitro (84, 250). De daaropvolgende zuivering van recombinant ORF2p geproduceerd in een baculovirus-expressiesysteem onthulde dat ORF2p van volledige lengte efficiënt reverse transcripten van poly rA/oligo dT kon genereren12 primertemplaatcomplexen, dat L1 RT-activiteit een voorkeur vertoonde voor Mg2+ boven Mn2+, en dat L1 RT zowel RNA- als DNA-afhankelijke polymerase-activiteiten vertoonde (251). Aanvullende onderzoeken hebben aangetoond dat, net als de RT die wordt gecodeerd door het R2Bm-retrotransposon (252), L1 RT zeer processief is (in vergelijking met Moloney-muizenleukemievirus (MMLV)-RT) en geen detecteerbare RNase H-activiteit (253).

L1 RT-activiteit is gedetecteerd in LINE-1 RNP-preparaten die zijn afgeleid van cellen die zijn getransfecteerd met gemanipuleerde LINE-1-expressievectoren (199). Belangrijk is dat dit werk bevestigde dat ORF2p bij voorkeur zijn eigen mRNA-template reverse transcribeert (d.w.z., het vertoont cis-voorkeur voor zijn coderende RNA) en dat puntmutaties in ORF1 en het L1 EN-domein, die de retrotranspositie van LINE-1 nadelig beïnvloeden, reverse transcriptase-activiteit behouden (199). Ten slotte bevestigden deze en daaropvolgende onderzoeken eerdere conclusies (156) dat L1 RT terminaal niet-overeenkomende primer-sjablooncomplexen kan verlengen (199, 254). De laatste eigenschap onderscheidt L1 RT van MMLV en andere retrovirale reverse transcriptase-enzymen.

Hoewel LINE-1 ORF1p- en L1 RT-activiteit gemakkelijk detecteerbaar waren in RNP-preparaten, was de detectie van de LINE-1 ORF2p notoir moeilijk. Epitoop-tagging-strategieën hebben de detectie van ORF2p mogelijk gemaakt in extracten van hele cellen en RNP-preparaten die zijn afgeleid van cellen die zijn getransfecteerd met gemanipuleerde LINE-1-expressievectoren (82, 200, 241). Met behulp van een vergelijkbare strategie onthulden immunofluorescentiemicroscopie-onderzoeken dat gemanipuleerde ORF2p co-lokaliseert in cytoplasmatische foci met zowel ORF1p als LINE-1-mRNA (82, 200, 241) (Figuur 2). Ondanks vooruitgang bij het detecteren van ORF2p in gekweekte cellen, gaat het debat over de stoichiometrie van ORF1p en ORF2p gebonden aan LINE-1-mRNA door (82, 200, 241). Het lijkt erop dat ORF1p veel meer voorkomt in LINE-1 RNP's dan ORF2p. Bovendien is het momenteel niet bekend hoe de overgang van translatie naar retrotranspositie plaatsvindt en wat de exacte samenstelling is van een echt functionele LINE-1 RNP. Het is duidelijk dat de ontwikkeling van gereconstitueerde in vitro target-site primed reverse transcription (TPRT) -reacties zouden het begrip van het gedetailleerde moleculaire mechanisme van LINE-1-retrotranspositie aanzienlijk bevorderen.

LINE-1 ORF2p bevat een slecht gedefinieerd cysteïnerijk domein (C-domein) aan zijn carboxyl-terminus, waarvan is gesuggereerd dat het functioneert als een zinkknokkeldomein (85). In overeenstemming met het biologische belang ervan, interfereren cysteïne-naar-serine-mutaties in het C-domein met de vorming van LINE-1 RNP en remmen ze de retrotranspositie van LINE-1 in gekweekte cellen sterk (60, 82). Recente onderzoeken geven aan dat een recombinant eiwit dat de laatste 180 aminozuren van ORF2p bevat, niet-sequentiespecifieke RNA-binding vertoont in vitroen dat cysteïne-naar-serine-mutaties in het C-domein de RNA-binding niet nadelig beïnvloeden (255). Toekomstige studies zijn dus nodig om de exacte functie van het C-domein in LINE-1 retrotranspositie op te helderen.

Er zullen waarschijnlijk extra functionele domeinen bestaan ​​binnen LINE-1 ORF2p. Inderdaad, PCNA, het glijdende klemeiwit dat essentieel is voor DNA-replicatie, bleek onlangs een directe interactie aan te gaan met ORF2p via een geconserveerde sequentie die bekend staat als een PCNA-interactie-eiwitdomein (PIP-box), dat zich tussen de L1 EN- en L1 RT-domeinen bevindt. (200). Het muteren van de PIP-box schafte LINE-1-retrotranspositie af (200), maar hoe PCNA functioneert in LINE-1-retrotranspositie vereist verdere opheldering.

Hoe ORF2p wordt vertaald uit bicistronisch LINE-1-mRNA blijft een actief onderzoeksgebied en recente rapporten suggereren dat LINE-1 ORF2p van mens en muis door verschillende mechanismen kan worden vertaald (256, 257). In menselijke LINE-1's scheidt een 63-nucleotide spacer die twee in-frame stopcodons bevat, ORF1 en ORF2. Genetische studies in gekweekte cellen suggereren dat ORF2p-translatie plaatsvindt door een onconventioneel terminatie-/herstartmechanisme waarbij een vertalend ribosoom moet kunnen scannen van het stopcodon van ORF1 naar het startcodon van ORF2 (256). Opmerkelijk is dat onderzoeken aantonen dat humaan ORF2 op een AUG-onafhankelijke manier kan worden vertaald (256). Ter vergelijking: bewijs van luciferase-reporter-assays suggereert dat de aanwezigheid van een interne ribosoominvoersequentie (IRES), die zich nabij het 3’-uiteinde van muis-ORF1 bevindt, wordt gebruikt om de translatie van muis-ORF2 te vergemakkelijken (257). Bovendien hebben celkweektesten onthuld dat ORF2 van muis op een AUG-onafhankelijke manier kan worden getranslateerd (256, 257). Het is met name onwaarschijnlijk dat het 3’ einde van menselijke ORF1 IRES-activiteit heeft (256). Er is inderdaad aangetoond dat de sequentie van de ORF's die worden gecodeerd door LINE-1's van mensen en muizen, kan worden onderworpen aan substantiële sequentieveranderingen door codonoptimalisatie zonder retrotranspositie in gekweekte cellen te beïnvloeden (258, 259), wat suggereert dat strikte cis-werkende sequenties zijn niet vereist voor ORF2-translatie.

Het is onwaarschijnlijk dat LINE-1's een nieuw mechanisme hebben ontwikkeld om ORF2-translatie te bemiddelen. In plaats daarvan veronderstellen we dat LINE-1's zijn geëvolueerd om vertaalmechanismen te benutten die inherent zijn aan hun gastheren om ORF2-vertaling te bemiddelen (256). Interessant is dat recente ribosomale profileringsstudies een toenemend aantal niet-geannoteerde leesframes hebben blootgelegd die zich bevinden in geannoteerde ORF's (260). Sommige korte ORF's kunnen ook worden vertaald via een AUG-onafhankelijk mechanisme (261). Het is duidelijk dat aanvullende studies nodig zijn om het ORF2-translatiemechanisme op te helderen en om te bepalen of ORF2-translatie verschilt tussen LINE-1's van zoogdieren.

De LINE-1 3’ UTR

206 bp lang en bevat een geconserveerd polypurinekanaal waarvan wordt voorspeld dat het een G-quadruplex-structuur vormt (262). Intrigerend genoeg is het polypurinekanaal niet vereist voor LINE-1 retrotranspositie in gekweekte cellen (60), maar het polypurinekanaal kan LINE-1 RT-activiteit remmen in in vitro biochemische testen (253). Ondanks zijn evolutionaire instandhouding, blijft hoe het polypurine-kanaal functioneert in de LINE-1-biologie onbekend.

LINE-1 3’ UTR's bevatten een functioneel RNA-polymerase II-polyadenylatiesignaal nabij hun 3’-uiteinden. Experimenten in gekweekte cellen hebben aangetoond dat het LINE-1 poly(A)-signaal relatief zwak is, vaak wordt omzeild door RNA-polymerase II, en dat RNA-polymerase II vaak canonieke polyadenylatieplaatsen gebruikt die toevallig aanwezig zijn in flankerende genomische DNA-sequenties (263 ). Het gebruik van deze genomische polyadenylatiesequenties kan leiden tot het genereren van chimere LINE-1-transcripten die genomische DNA-sequenties aan hun 3’-uiteinde bevatten (zie hieronder). Ten slotte suggereren recente gegevens dat de UTR's van mens en muis promotoractiviteit hebben die leidt tot het genereren van alternatieve LINE-1-transcripten in verschillende weefsels (264). Het veld wacht op een betere definitie van deze promotoractiviteit en de rol van de resulterende transcripten in de LINE-1-biologie.

Een overzicht van de LINE-1-replicatieroute

LINE-1-retrotranspositie vindt plaats via een proces van kopiëren en plakken dat target-site-primed reverse transcriptie wordt genoemd (TPRT Figuur 3 ), een mechanisme dat oorspronkelijk is beschreven door het Eickbush-laboratorium voor het gerelateerde plaatsspecifieke niet-LTR-retrotransposon, R2Bm, van de zijderups Bombyx mori genoom (265). Na transcriptie van een chromosomale locus wordt een bicistronisch LINE-1-mRNA van volledige lengte naar het cytoplasma geëxporteerd. Bij translatie vertonen ORF1p en ORF2p een sterke cis-voorkeur (97, 98) en binden aan hun respectievelijke coderende mRNA, waardoor een ribonucleoproteïnedeeltje (RNP) (78, 82, 198, 227, 228) wordt gevormd. De RNP bestaat minimaal uit LINE-1-mRNA, meerdere ORF1p-trimeren en slechts één ORF2p-molecuul (82, 256), maar bevat waarschijnlijk ook talrijke cellulaire eiwitten en RNA's (200, 201, 266) (Figuur 3).

Een actieve kopie van LINE-1 is aanwezig op één chromosomale locus (lichtblauwe doos in donkergrijs chromosoom) en bestaat uit een 5’ UTR (lichtgrijze doos) met een interne promotor (dunne zwarte pijl), twee ORF's (ORF1, gele doos en ORF2, blauwe doos), een 3’ UTR (lichtgrijze doos) gevolgd door een poly (A)-darmkanaal (AN) en wordt geflankeerd door TSD's (dikke zwarte pijlen). Transcriptie van LINE-1 vindt plaats in de kern en produceert een bicistronisch RNA (golvende lijn). Na translatie in het cytoplasma binden ORF1p en ORF2p (respectievelijk gele cirkel en blauwe ovaal) terug aan hun coderende RNA (cis-voorkeur) om een ​​RNP-complex te vormen. ORF1p en/of ORF2p kunnen ook cellulaire RNA's retrotransponeren (mRNA, SVA en Alu, respectievelijk in rode, groene en oranje golvende lijnen). De retrotranspositie van Alu-RNA vereist alleen ORF2p (92). Er is enige discussie over de vraag of ORF1p Alu-retrotranspositie (410) vergroot en of SVA-retrotranspositie zowel ORF1p als ORF2p vereist (94, 95). De LINE-1 RNP gaat de kern binnen waar de novo insertie vindt plaats door een mechanisme dat TPRT wordt genoemd. De ORF2p-endonuclease-activiteit maakt een enkelstrengs endonucleolytische inkeping bij het genomische DNA-doel (L1 EN-splitsing), op een losjes gedefinieerde consensusplaats (5’-TTTT/A-3’, met “/” aangeeft het splitsbare fosfaat). De ORF2p RT-activiteit gebruikt vervolgens de blootgestelde 3’-OH-groep om de eerste-strengs LINE-1 cDNA-synthese te initiëren met behulp van het gebonden RNA als een sjabloon. De laatste stappen van TPRT (d.w.z., splitsing van de bovenste streng, synthese van tweede streng LINE-1 cDNA en herstel van de DNA-uiteinden) leiden tot de insertie van een de novo LINE-1 kopie op een nieuwe chromosomale locus (lichtgele doos in lichtgrijs chromosoom). De nieuwe LINE-1 kopie is vaak 5’ afgekapt, bevat een poly (A) traktaat van variabele grootte (A)N), en wordt in het algemeen geflankeerd door duplicaties van doelwitplaatsen (dikke grijze pijlen). Aanvullende verwijzingen worden in de tekst gegeven.

Intrigerend genoeg onthulden latere studies dat ORF1p, ORF2p en LINE-1 RNA zich ophopen in dichte cytoplasmatische foci, die nauw verbonden zijn met stressgranule-eiwitten (82, 197). In gist zijn eiwitten die worden gecodeerd door Tyl- en Ty3-retrotransposons geassocieerd met cytoplasmatische foci die verwerkingslichamen (P-lichamen) worden genoemd en experimenten suggereren dat P-lichaamlokalisatie belangrijk is voor RNP-assemblage en een gastheermechanisme kan vertegenwoordigen dat retrotranspositie reguleert (267�) .

Hoe de LINE-1 RNP de kern binnenkomt, is niet volledig begrepen. Experimenten met gemodificeerde adenovirale expressievectoren van de tweede generatie die een actieve menselijke LINE-1 bevatten, hebben aangetoond dat retrotranspositie van LINE-1 kan optreden in G1/S- gestopte cellen (270). Evenzo, LINE-achtige reeksen van Candida albicans (271, 272) en Neurospora crassa (273), die gesloten mitose ondergaan, kunnen onafhankelijk van de afbraak van de nucleaire envelop retrotransponeren. Het lijkt er dus niet op dat celdeling een vereiste is voor LINE-1 retrotranspositie. Sommige rapporten suggereren dat celdeling de retrotranspositie van gemanipuleerde LINE-1's in gekweekte cellen vergroot (274, 275). Met name vereist de retrotranspositietest van gekweekte cellen in het algemeen de detectie van retrotranspositiegebeurtenissen als een functie van reportergenexpressie. Dus, naarmate cellen zich delen, kunnen ze meer van het reportergenproduct produceren, wat leidt tot een schijnbare toename van LINE-1 retrotranspositiepotentieel, waardoor de schijnbare discrepanties tussen de bovenstaande onderzoeken worden verklaard.

Eenmaal in de kern maakt L1 EN een enkelstrengs endonucleolytische inkeping in genomisch DNA bij een gedegenereerde consensussequentie (5’-TTTT/AA: waarbij de “/” het splitsbare fosfaat aangeeft), waardoor een 3 x02019 hydroxylgroep die dient als een primer voor de omgekeerde transcriptie van het LINE-1-mRNA door de L1 RT-activiteit die wordt gecodeerd in ORF2p (83, 276) (Figuur 3). Of het LINE-1-mRNA gewoon fungeert als een sjabloon voor retrotranspositie of dat het extra rollen speelt tijdens TPRT, vereist meer onderzoek. Het is opmerkelijk dat codon-geoptimaliseerde synthetische muis en menselijke LINE-1's, waarin:

25% van de nucleotidesequentie is vervangen om het G-C-gehalte van LINE-1 RNA te verhogen terwijl de aminozuursequentie van de door LINE-1 gecodeerde eiwitten behouden blijft, en kan gemakkelijk retrotransponeren in gekweekte menselijke cellen (258, 259).

Studies in gekweekte menselijke cellen hebben aangetoond dat de LINE-1 RT een foutpercentage heeft van

1 op 6500 basen (156). Door de binominale verdeling te gebruiken, is geschat dat:

40% van de volledige LINE-1 retrotranspositie-gebeurtenissen vertegenwoordigen getrouwe kopieën van het voorloper LINE-1-element (

37% bevat één mutatie, en

16% bevat twee mutaties) (156). Daaropvolgende stappen in het retrotranspositieproces, waaronder tweede-strengs doel-plaats DNA-splitsing en tweede-strengs LINE-1 cDNA-synthese, vereisen aanvullend onderzoek. Naar analogie van het evolutionair verwante R2 retrotransposon van Bombyx mori, kan ORF2p een rol spelen in elk van de bovengenoemde processen (277). Het netto resultaat van TPRT is de integratie van een nieuwe LINE-1 kopie op een nieuwe chromosomale locatie (Figuur 3).

Genomische herschikkingen gegenereerd tijdens LINE-1 retrotranspositie

LINE-1-gemedieerde retrotranspositiegebeurtenissen gaan soms gepaard met intra-LINE-1-herschikkingen (bijv., 5’ truncaties en 5’ truncaties geassocieerd met inversie/deletiegebeurtenissen) of genomische structurele herschikkingen (Figuur 4). De kenmerken van deze gebeurtenissen suggereren dat gastheerprocessen, zoals DNA-reparatie en/of DNA-replicatie, uiteindelijk van invloed kunnen zijn op de structuur van nieuw geretrotransponeerde LINE-1's. Hieronder bespreken we enkele van deze herschikkingen.

A. LINE-1-retrotranspositiegebeurtenissen kunnen leiden tot lokale veranderingen in genomisch doelwit-DNA. nieuw insertie van LINE-1 vindt plaats op een genomisch DNA-doelwit (dikke grijze lijn). LINE-1 RNA wordt weergegeven als een blauwe golvende lijn gevolgd door een poly (A) staart (AN) LINE-1 cDNA als een blauwe pijl en een nieuwe LINE-1 kopie als een dikke blauwe lijn inclusief een poly (A)-kanaal (AN). Inserties kunnen plaatsvinden door conventionele (volledige lengte, links) of abortieve (5’ afgekapt, rechts) retrotranspositie en resulteren in het algemeen in de vorming van target-site duplicaties met variabele lengte (TSD, black boxes). “Twin-priming” genereert LINE-1 inversie/deleties of inversie/duplicaties (weergegeven door tegengestelde pijlen in de LINE-1 nieuwe kopie). De priming van LINE-1 cDNA-synthese van het gesplitste genomische DNA van de bovenste streng wordt weergegeven in lichtblauw. De transductie van genomische DNA-sequenties kan optreden wanneer ofwel 5’ of 3’ flankerende genoomsequenties worden ingebouwd in LINE-1 RNA's en worden gemobiliseerd door retrotranspositie. De transducties 5’ en 3’ worden weergegeven als respectievelijk groene of roze golvende lijnen (in RNA) en groene of roze kaders (in de nieuwe LINE-1-kopie). De 3’ transductiegebeurtenissen bevatten twee poly (A) sequenties (AN). De LINE-1 enzymatische machinerie kan ook snRNA's zoals U6 snRNA mobiliseren naar nieuwe genomische locaties. Het voorgestelde model omvat een L1 RT-template-switch van LINE-1 RNA naar het U6-snRNA (oranje golvende lijn U6 cDNA, oranje pijl) tijdens TPRT. B. LINE-1 retrotranspositiegebeurtenissen geassocieerd met genomische structurele variatie. LINE-1 RNA, cDNA en a de novo LINE-1-insertie wordt weergegeven zoals in paneel A. Kleine letters (a, b, c of d) in genomisch DNA (grijze dikke lijn) worden gebruikt om deleties of duplicaties weer te geven (door wijziging van de alfabetische volgorde). De resolutie van TPRT op de plaats van DNA-schade (linker paneel, zwarte pijlpunt stroomopwaarts van de integratieplaats) wordt verondersteld te resulteren in een grote genomische deletie (het verlies van segment 𠇋”), terwijl de resolutie van TPRT bij een enkele -streng endonucleolytische inkeping stroomafwaarts van de LINE-1 integratieplaats (linker paneel, zwarte pijlpunt) wordt verondersteld te leiden tot een grote doel-site duplicatie (de duplicatie van segment 𠇌”). De resolutie van TPRT door enkelstrengs annealing (SSA) (middelste paneel) kan leiden tot het genereren van een chimere LINE-1, waarbij een endogene LINE-1 (lichtpaarse rechthoek) wordt gefuseerd tot een nieuwe LINE-1 (donkerblauw rechthoek) resulteert de vorming van de hersenschim in het verlies van segment 𠇋”. Evenzo kan de resolutie van “twin-primingâ” tussenproducten door synthese-afhankelijke strenggloeien (SDSA) (rechterpaneel) leiden tot het genereren van een L1-chimaera met een intrachromosomale duplicatie (de duplicatie van beide segmenten 𠇊” segment en de endogene L1-sequentie). De gehele insertie wordt geflankeerd door een target-site duplicatie (zwarte dozen). Opmerkelijk is dat LINE-1-inserties die in gekweekte cellen zijn gegenereerd door “twin-priming” af en toe worden gerepareerd door SDSA (156). Details over hoe chimere LINE-1-integratiegebeurtenissen worden gevormd, zijn te vinden in (156, 202, 203). Aanvullende verwijzingen worden in de tekst gegeven.

Intra-LINE-1 wijzigingen

Uit het onderzoek van de HGR blijkt dat:

30�% van de mensspecifieke Ta-subset LINE-1 inserties zijn van volledige lengte,

40�% zijn afgekapt aan hun 5’ uiteinden, en

25% bevat interne herschikkingen die bekend staan ​​als inversie/deleties (7, 63, 71, 278). De karakterisering van gemanipuleerde LINE-1-retrotranspositiegebeurtenissen van gekweekte cellen heeft geleid tot de stelling dat er twee routes van LINE-1-retrotranspositie bestaan: conventionele en mislukte retrotranspositie (156). Conventionele retrotranspositie is verantwoordelijk voor het genereren van LINE-1-inserties van volledige lengte en kan leiden tot de vorming van nieuwe 'master-genen' die kunnen dienen als een bron van retrotranspositie-gebeurtenissen in volgende generaties (Figuur 4A). Over het algemeen worden LINE-1-inserties van volledige lengte gekenmerkt door typische LINE-1 structurele kenmerken (d.w.z., ze eindigen met een poly (A) -kanaal worden geflankeerd door duplicaties van doelwitplaatsen met variabele grootte en integreren op een LINE-1 endonuclease-consensussite) (besproken in (11)).

Het genereren van 5’ afgeknotte LINE-1-elementen wordt voorgesteld via mislukte retrotranspositie. Hier wordt de L1 RT gedissocieerd van de (−) streng LINE-1 cDNA tijdens TPRT. Gloeien van het LINE-1-cDNA met genomisch DNA van de bovenste streng kan dan de plaatsing van genomische DNA-splitsing van de bovenste streng (ook wel tweede streng genoemd) specificeren, waardoor een 3’-hydroxylgroep wordt gegenereerd die nodig is voor DNA-afhankelijke (+ ) streng LINE-1 cDNA-synthese (156, 279). Hoe de L1 RT kan worden losgekoppeld van het LINE-1-cDNA vereist opheldering, maar het is intrigerend om te speculeren dat het proces van LINE-1-integratie een slagveld vertegenwoordigt tussen LINE-1 en de gastheer, en dat het Y-tak-tussenproduct dat wordt gegenereerd tijdens (−) streng LINE-1 cDNA-synthese kan een DNA-herstelreactie(s) opwekken door de gastheer (156). Recente studies suggereren dat de ataxie telangiectasie gemuteerde (ATM) en excision repair cross-complementation group 1 (ERCC1) eiwitten LINE-1 retrotranspositie moduleren (280�). Het is dus redelijk om te speculeren dat DNA-herstelroutes de generatie van 5& #x02019 afgekapte LINE-1's.

De vorming van inversie-/deletiestructuren vertegenwoordigt een alternatieve vorm van conventionele retrotranspositie, genaamd '“twin-priming” (278). Hier hecht het LINE-1-mRNA aan enkelstrengs DNA dat is blootgesteld aan zowel de gesplitste onderste als bovenste streng genomische DNA-sequenties (Figuur 4A). Sjabloonwisseling van de L1 RT tijdens RNA-afhankelijke (−) streng LINE-1 cDNA-synthese, of misschien een tweede molecuul van ORF2p, maakt dan het gebruik mogelijk van de 3’-hydroxylgroep gegenereerd op de bovenste streng LINE- 1 mRNA/genomisch DNA-verbinding om te dienen als een primer voor convergente RNA-afhankelijke (−) streng LINE-1 cDNA-synthese. De voltooiing van cDNA-synthese kan een LINE-1 RT DNA-afhankelijke DNA-polymerase-activiteit of een door de gastheer gecodeerde DNA-polymerase omvatten. Door microhomologie gemedieerde annealing van de resulterende cDNA's kan dan leiden tot de vorming van inversie/deletiestructuren (Figuur 4A). Met name zijn vrijwel alle voorspellingen van het twin-priming-model bevestigd door het onderzoeken van gemanipuleerde LINE-1-integratiegebeurtenissen van gekweekte cellen (156). Hoe microhomologie-gemedieerde annealing plaatsvindt, moet verder worden onderzocht, hoewel men kan veronderstellen dat het wordt uitgevoerd door een alternatieve, microcomplementariteit-gemedieerde niet-homologe end-join-route van DNA-herstel (283).

De opname van niet-matrijs nucleotiden, vermoedelijk toegevoegd na de voltooiing van (−) streng LINE-1 cDNA-synthese door de LINE-1 RT, kan resulteren in korte stukken van niet-matrijs sequentie op het 5’ genomische DNA/LINE- 1-junctie (156, 203, 208, 284), wat de annealing van het LINE-1-cDNA aan enkelstrengs DNA kan vergemakkelijken dat is blootgesteld aan de bovenste streng genomische DNA-doelplaats (279, 285, 286). Als dat zo is, redeneren we dat de resulterende LINE-1 cDNA/genomisch DNA-hybride dan de plaatsing van genomische DNA-splitsing van de bovenste streng kan specificeren, waardoor de 3’-hydroxylgroep wordt gegenereerd die nodig is voor DNA-afhankelijke (+) streng-cDNA-synthese door ofwel de LINE-1 reverse transcriptase of een door de gastheer gecodeerde DNA-polymerase.

LINE-1-gemedieerde transductiegebeurtenissen

Actieve LINE-1's mobiliseren sequenties die zijn afgeleid van hun 5’ en 3’ flankerend genomisch DNA door een proces dat LINE-1-gemedieerde transductie wordt genoemd (Figuur 4A). LINE-1's die transductiegebeurtenissen bevatten, treden op wanneer een cellulaire promotor, die zich stroomopwaarts van een actieve genomische LINE-1-kopie van volledige lengte bevindt, wordt gebruikt om LINE-1-transcriptie te initiëren. Retrotranspositie van het chimere 5’ genomische/LINE-1 mRNA-transcript leidt vervolgens tot de transductie van de 5’-afgeleide genomische DNA-sequentie naar een nieuwe chromosomale locatie. Als een conventionele RNA-polymerase II-promotor in genomisch DNA wordt gebruikt om LINE-1-transcriptie te initiëren, zal de resulterende 5’-getransduceerde LINE-1 de genomische promotor missen en in het algemeen worden getranscribeerd met behulp van de interne promotor die aanwezig is in de LINE-1 5's. x02019 UTR in opeenvolgende retrotranspositierondes. LINE-1's met volledige lengte die 5’ getransduceerde genomische DNA-sequenties bevatten, werden oorspronkelijk gedetecteerd in de HGR (7). Een transductiegebeurtenis van 5’ is relatief zeldzaam en kan alleen worden geïdentificeerd door de sequenties van LINE-1's van volledige lengte te onderzoeken. Het Nathans-laboratorium toonde met name aan dat een muis-LINE-1-insertie van volledige lengte met een transductie van 28 bp 5’ leidde tot het verkeerd splitsen van de Nr2e3 gen in een netvliesdegeneratie 7-muismodel (287).

Vanwege de aanwezigheid van inherent zwakke polyadenyleringssignalen in hun 3’ UTR's, kunnen LINE-1's ook sequenties mobiliseren die zijn afgeleid van hun 3’ flanken, inclusief exons, die in grootte variëren van tientallen basenparen tot ten minste 1,6 kb in lengte door 3’ transductie (263, 288�) (Figuur 4A). Deze klasse van insertie wordt gegenereerd wanneer RNA-polymerase II het zwakke polyadenyleringssignaal dat aanwezig is aan het 3’-uiteinde van een LINE-1 van volledige lengte omzeilt en in plaats daarvan een toevallig polyadenyleringssignaal gebruikt in het 3’ flankerende genomische DNA. Retrotranspositie van het resulterende LINE-1/genomische hybride mRNA leidt tot de insertie van het flankerende genomische DNA stroomafwaarts van de nieuwe LINE-1-kopie op een nieuwe chromosomale locatie. Vanwege de structuur van de meeste zoogdiergenen, die lange introns bevatten met een aanzienlijk aantal LINE-1- en SINE-inserties, speculeren we dat LINE-1's zijn geëvolueerd om een ​​zwak polyadenyleringssignaal te bevatten om normale expressie van intron-bevattende genen mogelijk te maken ( (263), (besproken in (291�))).

Het feit dat LINE-1's sequenties die zijn afgeleid van hun 3’ genomische flanken kunnen retrotransponeren naar nieuwe genomische locaties, werd voor het eerst gewaardeerd tijdens het karakteriseren van een mutagene LINE-1-insertie in het dystrofine-gen (290). De 3’ transductie “genomic tag” in de mutagene insertie werd vervolgens gebruikt om de waarschijnlijke voorloper LINE-1, genaamd LRE2 (290), te isoleren. Experimenten in gekweekte cellen toonden vervolgens aan dat de LINE-1 3’-transductiegebeurtenissen vaak voorkomen en in principe exons en promoters naar nieuwe genomische locaties kunnen mobiliseren, wat een mogelijk mechanisme voor exon-shuffling biedt (60, 263). Sinds die tijd is duidelijk geworden dat

20�% van de LINE-1 retrotranspositiegebeurtenissen gaan gepaard met 3’ getransduceerde sequenties (288, 289). De aanwezigheid van 3’ transducties zijn ook gebruikt als “genomic tags” om nageslacht/nakomelingen relaties tussen LINE-1 elementen te identificeren, om volledige LINE-1 elementen te stratificeren in onderverdelingen, en om clusters van LINE-1s te identificeren die actief mobiliseren in de menselijke populatie (58, 294).

De ernstige afknotting van het LINE-1/genomische mRNA op TPRT kan leiden tot het genereren van 'corfantransducties' zonder LINE-1-sequentie (263). Onlangs werd een mutagene transductie van transductie geïdentificeerd als oorzaak van Duchene spierdystrofie (295). Met name, en in overeenstemming met studies met gekweekte cellen, meldde een recente studie dat:

24% van de somatische LINE-1-retrotranspositie-gebeurtenissen in tumoren afkomstig van 244 patiënten gingen gepaard met 3-transductie-gebeurtenissen, en dat veel van deze gebeurtenissen “orphan-transducties” vertegenwoordigden (296). Ten slotte is het opmerkelijk dat transductie niet specifiek is voor LINE-1's. Zowel 5’ als 3’ transductiegebeurtenissen zijn waargenomen met SVA-retrotransposons (127, 297�). SVA-retrotransposons boden inderdaad een vehikel om het acyl-malonyl-condenserende enzym-1 te shufflen (AMAC) gen naar drie verschillende locaties in het genoom van primaten (298).

LINE-1 doellocatiewijzigingen: lokale wijzigingen op de integratielocatie

Het mechanisme van splitsing van de bovenste streng op de genomische LINE-1-integratieplaats op de genomische LINE-1-integratieplaats vereist opheldering. Het is duidelijk dat de plaatsing van tweede-strengs DNA-splitsing de structuur van de resulterende LINE-1-integratiegebeurtenissen kan beïnvloeden. Na het karakteriseren van 100 gemanipuleerde LINE-1-inserties in gekweekte cellen, stelden Gilbert en collega's een model voor dat een aantal waargenomen veranderingen op de doelwitplaats verklaart (156, 202). In dit model kan DNA-splitsing van de bovenste streng stroomopwaarts van de endonucleolytische inkeping van de onderste streng leiden tot kleine deleties van genomisch DNA op de LINE-1-integratieplaats. Evenzo kan DNA-splitsing van de bovenste streng direct tegenovergesteld aan de splitsing van de onderste streng leiden tot LINE-1-integratiegebeurtenissen die geen veranderingen in de doelplaats hebben, terwijl splitsing van de bovenste streng stroomafwaarts van de initiële endonucleolytische inkeping kan leiden tot het genereren van duplicaties van de doelplaats (Figuur 4A). interessant,

10% van de LINE-1-inserties in gekweekte cellen ging gepaard met grote duplicaties van doelwitplaatsen die zelden worden gezien in de referentiesequentie van het menselijk genoom (156, 202) (Figuur 4B). Anders recapituleert de retrotranspositie-assay van gekweekte cellen grotendeels het spectrum van structurele resultaten die zijn waargenomen bij endogene retrotranspositie-gebeurtenissen van de kiembaan. Het cellulaire milieu waarin retrotranspositie plaatsvindt, misschien bepaald door de aanwezigheid en activiteit van DNA-reparatiemachines en andere gastheerfactoren, beïnvloedt waarschijnlijk het bereik van mogelijke LINE-1-gemedieerde veranderingen in de doelplaats. Met name de hierboven beschreven mechanismen zijn waarschijnlijk ook verantwoordelijk voor lokale veranderingen op de doelwitplaats die gepaard gaan met SINE-retrotranspositie en verwerkte pseudogenvorming (besproken in (11)).

LINE-1-gemedieerde retrotranspositie-doelplaatsveranderingen: het genereren van structurele varianten

Naast kleine veranderingen aan de doelplaats, kan LINE-1 retrotranspositie leiden tot meer substantiële genomische DNA-modificaties van de doelplaats. Het onderzoek van LINE-1-integratiegebeurtenissen in gekweekte menselijke cellen heeft onthuld dat ongeveer 10% van de retrotranspositiegebeurtenissen gepaard gaan met herschikkingen van DNA op de doelwitplaats, waardoor genomische structurele variatie ontstaat (156, 202, 203) (Figuur 4B). De vergelijkingen van pre- en post-integratieplaatsen in genomisch DNA hebben onthuld dat de resolutie van TPRT-tussenproducten kan leiden tot het genereren van chimere LINE-1-sequenties (156, 202, 203). Analyses van enkelvoudig nucleotide polymorfisme onthulden dat de resulterende integratiegebeurtenissen een endogene genomische LINE-1 bevatten die gefuseerd is met de gemanipuleerde LINE-1 en bijkomende genomische veranderingen (156, 202, 203) (Figuur 4B).

De vorming van chimere LINE-1-elementen kan door verschillende mechanismen plaatsvinden. De resolutie van TPRT-tussenproducten door enkelstrengige annealing (SSA) of syntheseafhankelijke strengannealing (SDSA) kan bijvoorbeeld leiden tot de vorming van door LINE-1 retrotranspositie gemedieerde deleties of duplicaties, respectievelijk (156, 202, 203) ( Figuur 4B). Belangrijk is dat grootschalige genomische veranderingen die worden waargenomen in gekweekte cellen een afspiegeling zijn van gebeurtenissen die bij mensen plaatsvinden in vivo. Een LINE-1 retrotranspositiegebeurtenis was bijvoorbeeld verantwoordelijk voor een verwijdering van 46 kb in de PDHX gen van een menselijke patiënt, resulterend in pyruvaatdehydrogenasedeficiëntie (300).

Genomische veranderingen kunnen ook gepaard gaan met de retrotranspositie van zowel Alu- als SVA-elementen. Bijvoorbeeld een Alu-retrotranspositiegebeurtenis die plaatsvond

2,7 miljoen jaar geleden leidde tot de deletie van een intern exon van 92 bp in het CMP-Neu5Ac-hydroxylase-gen. Als gevolg hiervan hebben mensen een genetisch tekort aan N-glyconeuraminezuur (301). Evenzo leidde een SVA-retrotranspositiegebeurtenis tot een

14 kb verwijdering die resulteerde in het verlies van de HLA-A gen in een cohort van Japanse families die aan leukemie lijden (302). Ten slotte toonden recente studies aan dat twee onafhankelijke post-zygotische SVA-retrotranspositiegebeurtenissen in de NF1 gen werden geassocieerd met grote deleties van

respectievelijk 1 Mb en 867 kb (167).

Op grotere schaal hebben vergelijkende genomica-benaderingen tussen de referentiesequenties van de mens en de chimpansee geleid tot de identificatie van 50 LINE-1 retrotranspositie-gebeurtenissen die verantwoordelijk zijn voor de verwijdering van

18 kb van het menselijk genoom en

15 kb van het chimpansee-genoom (303). Vergelijkbare benaderingen brachten 33 Alu-retrotranspositiegebeurtenissen aan het licht die ongeveer 9 kb menselijk DNA elimineerden (304). Dus, hoewel relatief zeldzaam in vergelijking met conventionele retrotranspositiegebeurtenissen, blijven LINE-1 retrotranspositie-gemedieerde deletiegebeurtenissen het landschap van het menselijk genoom vormgeven.

Recombinatiegebeurtenissen na integratie tussen genomische retrotransposons

De enorme massa van LINE-1- en Alu-sequenties in het genoom kan ook substraten bieden voor recombinatie na integratie, waardoor structurele variatie in het menselijke genoom wordt gegenereerd. Niet-allelische homologe recombinatie (NAHR), niet-homologe DNA-eindverbinding (NHEJ) en andere soorten recombinatiegebeurtenissen tussen genomische LINE-1- of Alu-elementen kunnen bijvoorbeeld leiden tot genomische deleties, duplicaties en misschien translocaties, en zijn betrokken bij ziekten bij de mens (besproken in (11, 151, 305�)). Het is duidelijk dat deze voorbeelden zullen blijven groeien naarmate de DNA-sequencing van het hele genoom de komende jaren wordt voortgezet.

Endonuclease-onafhankelijke LINE-1 retrotranspositie

LINE-1 retrotranspositie door TPRT wordt gewoonlijk geïnitieerd door de splitsing van genomisch DNA door L1 EN. Het onderzoek van LINE-1 retrotranspositie in ovariumcellen van Chinese hamsters (CHO) die deficiënt zijn in componenten van de niet-homologe end-joining (NHEJ) route van DNA dubbelstrengs breukherstel, leidde tot de ontdekking van een alternatieve integratieroute genaamd endonuclease-onafhankelijk ( ENi) LINE-1 retrotranspositie (196). De ENi-route van LINE-1-retrotranspositie doet denken aan een type RNA-gemedieerde DNA-reparatie waarbij LINE-1-elementen die geen L1 EN-functie hebben, vermoedelijk genomische laesies kunnen gebruiken om TPRT te initiëren (196, 308). ENi-retrotranspositie-gebeurtenissen dragen structurele kenmerken die verschillen van canonieke TPRT-gemedieerde LINE-1-inserties in die zin dat ze vaak zowel 5’ als 3’ afgeknot zijn, niet voorkomen op typische LINE-1-endonucleaseplaatsen in genomisch DNA, en over het algemeen geen doelplaats hebben duplicaties, en gaan vaak gepaard met de deletie van genomisch DNA op de integratieplaats (196).ENi LINE-1 retrotranspositiegebeurtenissen gaan ook af en toe gepaard met de insertie van korte cDNA-fragmenten op zowel hun 5’ als 3’ LINE-1/genomische DNA-knooppunten, die lijken te zijn afgeleid van de omgekeerde transcriptie van cellulaire mRNA's (196, 309).

Daaropvolgende onderzoeken in DNA-proteïnekinase-katalytische subeenheid (DNA-PKcs)-deficiënte CHO-cellen onthulden dat ENi-retrotranspositiegebeurtenissen kunnen optreden bij disfunctionele telomeren, wat overeenkomsten tussen ENi-retrotranspositie en telomerase-activiteit benadrukt (309�). Deze resultaten lopen inderdaad parallel met de situatie in Drosophila en Bdelloid raderdiertjesgenomen, waarbij gedomesticeerde retrotransposons functioneren om de telomeerlengte te behouden in plaats van een conventionele telomerase-activiteit (311, 313�).

Net als bij andere fenomenen die zijn ontdekt met behulp van gemanipuleerde LINE-1-retrotransposons in de retrotranspositietest van gekweekte cellen, zijn vermeende ENi-retrotranspositiegebeurtenissen ook geïdentificeerd in het genoom van mensen en muizen (174, 316). Inderdaad, een waarschijnlijke ENi-retrotranspositiegebeurtenis in de EYA1 gen ging gepaard met a

17 kb deletie, leidend tot een sporadisch geval van humaan oto-renaal syndroom (317). Het zal interessant zijn om te leren of tekortkomingen in andere DNA-herstelroutes leiden tot verhoogde ENi LINE-1 retrotranspositie.

Met name sommige groep II-introns missen een EN-domein en kunnen 3’-hydroxylgroepen gebruiken op ontluikende DNA-strengen die aanwezig zijn op DNA-replicatievorken om retrotranspositie te initiëren (318). Bovendien is voorgesteld dat het L1 EN-domein werd verworven na het L1 RT-domein tijdens LINE-1-evolutie (248). Samen geven deze gegevens aan dat de ENi-route van LINE-1-retrotranspositie een oud mechanisme van LINE-1-retrotranspositie kan vertegenwoordigen voorafgaand aan de verwerving van een APE-achtig endonucleasedomein.


Een familie van eiwitten die histonen worden genoemd, biedt ondersteuning en structuur aan DNA, maar al jaren puzzelen wetenschappers over incidentele uitschieters tussen deze histonen, die om specifieke, maar vaak mysterieuze redenen lijken te bestaan. Nu hebben onderzoekers een nieuw doel ontdekt voor een dergelijke histonvariant: het voorkomen van genetische mutaties door bepaalde zogenaamde "springgenen" op hun plaats te houden.

Dit onderzoek, dat begon aan de Rockefeller University en op 4 mei werd gepubliceerd in Natuur, onthult een basismechanisme waarmee epigenetica, of de controle van erfelijke eigenschappen via andere middelen dan DNA, werkt. Vanwege de nauwe relatie van histonen met DNA, weten wetenschappers al enige tijd dat ze vaak betrokken zijn bij epigenetische controle van genen. In dit geval lijkt één bepaalde histonvariant de kans op mogelijk schadelijke veranderingen in de stamcellen te verkleinen die uiteindelijk de verschillende soorten weefsel zullen genereren waaruit een levend wezen bestaat.

"Ze zeggen dat goede dingen in kleine verpakkingen komen. Nergens is dit meer waar dan bij histonvarianten. Deze studie vond de variant H3.3, die slechts in geringe mate afwijkt van de standaard H3-histonen, helpt bepaalde genetische elementen te voorkomen, die overblijfselen zijn achter door oude virale infecties, door zich in het genoom te verplaatsen", zegt studieauteur C. David Allis, Joy en Jack Fishman Professor en hoofd van het Laboratory of Chromatin Biology and Epigenetics. "Deze ontdekking is een belangrijke aanvulling op onze nog steeds evoluerende kennis van hoe epigenetica op moleculair niveau werkt."

Histonen zijn eiwitten die fungeren als spoelen voor de draad die DNA is, waardoor het ondersteuning en structuur krijgt. Chemische modificaties aan deze histonen kunnen de expressie van genen veranderen, ze meer beschikbaar maken voor expressie of ze tot zwijgen brengen door het DNA-eiwitcomplex te comprimeren. Oddball H3.3 verschilt van zijn reguliere tegenhanger H3 door slechts enkele aminozuren. Omdat het echter in het hele dierenrijk aanwezig is, vermoeden wetenschappers al enige tijd dat H3.3 een specifieke biologische rol heeft.

Studieauteurs Simon Elsasser en Laura Banaszynski, die beiden aan H3.3 werkten in het laboratorium van Allis in Rockefeller, maar sindsdien zijn overgestapt naar andere instellingen, begonnen met te kijken naar de locaties op het muizengenoom waar H3.3 werd afgezet in stamcellen. Elsasser begon het project als afgestudeerde student in het laboratorium van Allis en ging verder als postdoc aan het MRC Laboratory of Molecular Biology in het Verenigd Koninkrijk. Hij is nu een assistent-professor aan het Karolinska Instituut in Zweden. Hij had het idee om te zoeken naar H3.3 bij repetitieve sequenties, maar herhalingen worden normaal gesproken eruit gefilterd in een genoombrede studie. Dus ontwikkelde Elsasser een nieuwe aanpak om deze informatie vast te leggen.

Uit de resultaten kwam een ​​patroon naar voren: H3.3 verscheen op een bepaald type repetitieve sequentie: retrotransposons, die overblijfselen zijn van oude virale infecties. In tegenstelling tot hun voorouderlijke virussen, zitten retrotransposons gevangen in het gastheergenoom, maar ze kunnen zichzelf nog steeds kopiëren en naar nieuwe locaties erin springen. Soms vindt evolutie er een toepassing voor. Retrotransposon-afgeleide genen coderen bijvoorbeeld voor eiwitten die nodig zijn voor de placenta bij zoogdieren. Maar wanneer retrotransposons springen, kunnen ze ook schadelijke mutaties veroorzaken.

Voor studies zoals deze, waarin de rol van chromatine bij het reguleren van genexpressie wordt onderzocht, gebruiken wetenschappers vaak embryonale stamcellen van muizen. Het chromatinelandschap van stamcellen is meer plastisch dan dat van gedifferentieerde cellen, wat hun vermogen weerspiegelt om een ​​van de vele genexpressieprogramma's binnen te gaan die leiden tot de honderden verschillende celtypes in een volwassen organisme. Zodra de cellen een identiteit beginnen te kiezen, worden delen van het genoom die niet nodig zijn voor die identiteit voor altijd afgesloten. Voorafgaand aan het huidige onderzoek wisten wetenschappers dat muisstamcellen het grootste deel van het genoom toegankelijk hielden, terwijl ze retrotransposons onder controle hielden door ze te labelen met chemische markers die drie methylgroepen op histon H3 bevatten.

Vroege experimenten gedaan door Banaszynski, terwijl een postdoc in het laboratorium van Allis, suggereerde dat H3.3 noodzakelijk is voor de plaatsing van deze onderdrukkende "trimethyl"-markeringen. "Door eiwitten weg te nemen die verantwoordelijk zijn voor het plaatsen van H3.3 in chromatine, of H3.3 volledig te elimineren, hebben we bevestigd dat trimethylering afhangt van H3.3", zegt Banaszynski, die momenteel een assistent-professor is aan het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas.

"Bovendien werden retrotransposons actiever in cellen zonder H3.3, en in deze cellen zagen we chromosomale afwijkingen. Het kan zijn dat door retrotransposons tot zwijgen te brengen, H3.3 deze afwijkingen voorkomt, maar we kunnen de mogelijkheid dat verlies van H3 niet uitsluiten. 3 resulteert om andere redenen in deze genomische instabiliteit", zegt Elsasser.

Hoewel de soorten retrotransposons die in deze experimenten zijn bestudeerd, niet actief zijn bij mensen, is het waarschijnlijk dat menselijke stamcellen H3.3 gebruiken om andere soorten springgenen op hun plaats te houden, zegt Banaszynski.

Het onderzoek heeft implicaties die verder gaan dan epigenetica. "Deze studie verwijst ook naar een fascinerende vraag in de biologie: hoe balanceren cellen het potentiële evolutionaire voordeel van mobiele elementen, zoals retrotransposons, met de concurrerende noodzaak om ze het zwijgen op te leggen om het genoom te behouden?" ze zegt.


Er ontstaan ​​nieuwe rollen voor niet-coderende RNA's bij het aansturen van de embryonale ontwikkeling

Traditioneel is de rol van slechts een paar soorten RNA begrepen vanwege de belangrijke rol die ze spelen in de celbiologie. De korte lijst bevat boodschapper-RNA, transfer-RNA en ribosomaal RNA. Meer recentelijk zijn andere typen toegevoegd: mircroRNA, klein interfererend RNA en antisense RNA.

Maar daarmee is de lijst nauwelijks uitgeput. Een recenter ontdekt type RNA is groot, intergeen niet-coderend RNA (lincRNA), een bepaald subtype van lang niet-coderend RNA. LincRNA wordt zo genoemd omdat ze niet zijn afgeleid van gencoderend DNA, maar in plaats daarvan van stukken DNA die tussen genen liggen. Nieuw onderzoek suggereert dat een belangrijke functie van sommige lincRNA's is om de ontwikkeling van embryonale stamcellen in de vroegste stadia van embryonale ontwikkeling te reguleren.

Wetenschappers van het Broad Institute of MIT en Harvard hebben ontdekt dat een mysterieuze klasse van grote RNA's een centrale rol speelt in de embryonale ontwikkeling, in tegenstelling tot het dogma dat alleen eiwitten de belangrijkste regelgevers van dit proces zijn. Het onderzoek, online gepubliceerd op 28 augustus in het tijdschrift Natuur, onthult dat deze RNA's het lot van embryonale stamcellen (ES) orkestreren door ze in hun prille staat te houden of ze langs het pad naar celspecialisatie te leiden.


Functies

Centrifugeren

Bankrapport

Brief van de voorzitter

Perspectieven en meningen

Gereedschapskist

Wetenschappelijk onderwijs

Lab boek

Over het bulletin

Primaten hebben gespecialiseerde wapens ontwikkeld om in te spelen op stukjes springend DNA.
illustratie door John CW Carroll / Gladstone Institutes

Cellen hebben een snel evoluerend arsenaal om eigenzinnig DNA tegen te gaan.

Miljoenen jaren lang dupliceren en worden stukjes DNA, retrotransposons genaamd, willekeurig in het genoom van verschillende organismen, waaronder de mens, gedupliceerd. Soms ontsteken de springgenen op plaatsen die soorten helpen nieuwe eigenschappen te ontwikkelen. Andere keren doen ze niets. Maar al te vaak raken ze in het midden van een gen, waardoor de manier waarop het wordt gereguleerd verandert of het buiten werking wordt gesteld. Gelukkig, zoals HHMI-onderzoeker David Haussler onlangs aantoonde, hebben cellen een manier ontwikkeld om deze eigenzinnige sequenties onder controle te houden.

"In de loop van generaties raakt ons genoom opgeblazen met kopieën van retrotransposons", legt Haussler uit. “Ze richten schade aan door normale genetische mechanismen te verstoren. Iets moet de veiligheidspatrouille zijn om te proberen deze dingen af ​​te sluiten."

Bij mensen is één vorm van veiligheidspatrouille afkomstig van meer dan 400 snel evoluerende genen die waakhond-eiwitten produceren die KRAB-zinkvingers worden genoemd. Deze waakhonden scannen het genoom, klemmen zich vast aan retrotransposons en roepen vervolgens andere eiwitten op om ze het zwijgen op te leggen.

Om KRAB-zinkvingers in actie te zien, gebruikte het team van Haussler aan de Universiteit van Californië, Santa Cruz, muiscellijnen met een kopie van menselijk chromosoom 11, dat honderden retrotransposons bevat die vaak worden aangetroffen bij primaten zoals mensen, maar niet aanwezig zijn bij knaagdieren. Omdat muizen knaagdierspecifieke KRAB-zinkvingers hebben om hun retrotransposons onder controle te houden, konden de knaagdiercellen niet voorkomen dat de malafide menselijke retrotransposons zich uiten. Dat wil zeggen, totdat de onderzoekers twee menselijke KRAB-zinkvingers - ZNF91 en ZNF93 - toevoegden die de primaat-specifieke retrotransposons in hun spoor stopten. Het team publiceerde zijn bevindingen op 28 september 2014 online in Natuur.

Haussler legt uit dat mutaties in retrotransposons hen in staat stellen te ontsnappen aan detectie door de KRAB-zinkvingers, wat op zijn beurt de evolutie van nieuwe KRAB-zinkvingergenen stimuleert. "Door moleculaire evolutionaire geschiedenissen te reconstrueren, kunnen we zien dat deze KRAB-zinkvingergenen belangrijke spelers zijn geweest in deze strijd met de retrotransposons en dat waarschijnlijk ook zullen blijven", zegt hij.

Er is een zilveren randje in deze schijnbaar eindeloze wapenwedloop binnen ons eigen DNA. Zodra KRAB-zinkvingers niet langer nodig zijn om retrotransposons te onderdrukken, nemen veel van deze waakhond-eiwitten nieuwe rollen aan als regulerende eiwitten, waardoor de activiteit van genen in de buurt van retrotransposon-landingsplaatsen wordt gecontroleerd.


Bekijk de video: Retrotransposons (December 2021).