Informatie

Hoe wordt de juiste hoeveelheid nucleotiden gesynthetiseerd tijdens homologe recombinatie?


Ik lees over homologe recombinatie in de context van dubbelstrengs breukherstel. Het lijkt erop dat de truc is dat rond de breuk, homologe recombinatie een sjabloonduplex gebruikt om enige overlap tussen de gebroken delen te genereren, zodat de strengen gewoon complementair kunnen worden gerepareerd. Bij het lezen van de sjabloon, ongebroken duplex, lijkt het echter vrij belangrijk te zijn hoeveel nucleotiden er precies worden gegenereerd om de overlap tussen de twee gebroken strengen te vormen. Te weinig en er wordt geen overlap gevormd omdat de gebroken strengen nog steeds twee onsamenhangende sequenties vormen. Te veel, en de kapotte stukken passen niet meer in elkaar, er zijn delen verdubbeld. Het is als een puzzel waarbij sommige stukjes overlappende gebieden beschrijven.

Hoe weet de polymerase precies de juiste hoeveelheid nucleotiden toe te voegen?


Initiatie van homologe recombinatie op DNA-nicks

Discontinuïteiten in slechts een enkele streng van de DNA-duplex komen vaak voor, als gevolg van DNA-schade of als tussenproduct in essentiële nucleaire processen en DNA-herstel. Nicks zijn de eenvoudigste van deze laesies: ze dragen schone uiteinden met 3′-hydroxylgroepen die ligatie kunnen ondergaan of nieuwe DNA-synthese kunnen starten. Daarentegen onderbreken enkelstrengige breuken ook slechts één DNA-streng, maar ze dragen beschadigde uiteinden die moeten worden schoongemaakt voordat de volgende reparatiestappen plaatsvinden. Ondanks hun ogenschijnlijke eenvoud kunnen nicks aanzienlijke gevolgen hebben voor de stabiliteit van het genoom. De beschikbaarheid van enzymen die bijna overal in een groot genoom een ​​nick kunnen introduceren, maakt het nu mogelijk om herstel van nicks systematisch te analyseren. Recente experimenten tonen aan dat inkepingen recombinatie kunnen initiëren via routes die verschillen van die welke actief zijn bij dubbelstrengs breuken (DSB's). Recombinatie op gerichte DNA-nicks kan zeer efficiënt zijn, en omdat nicks intrinsiek minder mutageen zijn dan DSB's, is nick-geïnitieerde gencorrectie nuttig voor genoom-engineering en gentherapie. Deze review herbekijkt enkele fysiologische voorbeelden van recombinatie bij inkepingen en schetst experimenten die hebben aangetoond dat inkepingen homologiegericht herstel initiëren via onderscheidende routes, waarbij de nadruk wordt gelegd op onderzoek dat heeft bijgedragen aan ons huidige mechanistische begrip van recombinatie bij inkepingen in zoogdiercellen.


Homologe nucleotidesequenties aan de 5'-uiteinden van boodschapper-RNA's gesynthetiseerd uit de gistenolase- en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase-genfamilies. De primaire structuur van een derde gistglyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenasegen.

Genomisch DNA dat een derde structureel gen voor glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase van gist bevat, is geïsoleerd op een bacterieel plasmide dat pgap11 wordt genoemd. De volledige nucleotidesequentie van dit structurele gen werd bepaald. Het gen bevat geen tussenliggende sequenties, het codongebruik is sterk bevooroordeeld en de nucleotidesequentie van het coderende deel van dit gen is voor 90% homoloog aan de andere twee glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenasegenen (Holland, JP en Holland, MJ (1980) ) J. Biol. Chem. 255, 2596-2605). Op basis van de mate van divergentie van de nucleotidesequentie tussen de drie glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenasegenen, is het waarschijnlijk dat ze zijn ontstaan ​​als gevolg van twee duplicatiegebeurtenissen en het gen in het hybride plasmide dat pgap11 wordt genoemd, is een product van de eerste duplicatiegebeurtenis . Alle drie de structurele genen delen uitgebreide homologie van de nucleotidesequentie in de 5'x27-niet-coderende regio's die grenzen aan de drie respectieve translatie-initiatiecodons. Het gen op pgap11 is echter niet homoloog aan de andere stroomafwaarts van het respectievelijke translationele terminatiecodon. De 5'-uiteinden van boodschapper-RNA's die zijn gesynthetiseerd uit de drie glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase- en twee gist-enolase-genen zijn in kaart gebracht op plaatsen variërend van 36 tot 82 nucleotiden stroomopwaarts van de respectievelijke translatie-initiatiecodons. In elk geval wordt de 5'-terminus van het mRNA toegewezen aan een regio met sterke nucleotidesequentiehomologie die wordt gedeeld door alle vijf structurele genen. Deze laatste gegevens bevestigen dat alle vijf structurele genen tot expressie worden gebracht tijdens vegetatieve celgroei en ondersteunen verder de hypothese dat een deel van het 5'-niet-coderende flankerende gebied van de gist-glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase- en enolase-genen is geëvolueerd uit een gemeenschappelijke voorlopersequentie .


Hoofdstuk 15 - Mechanismen van horizontale genoverdracht en DNA-recombinatie

Vergelijkende genomica onthult een grote diversiteit binnen veel bacteriesoorten. Het pan-genoom van een soort is samengesteld uit kerngenen die aanwezig zijn in alle stammen en overbodige genen die onder specifieke omstandigheden een selectief voordeel bieden. Verplaatsing van deze overbodige genen tussen soorten, geslachten en koninkrijken staat bekend als horizontale genoverdracht (HGT). Er zijn drie primaire mechanismen van HGT in bacteriën. Transformatie: opname van naakt DNA uit de omgeving door natuurlijk competente cellen. Transductie: overdracht van bacterieel DNA tussen cellen met bacteriofagen als vectoren. Conjugatie: innig cel-tot-cel contact met overdracht van enkelstrengs DNA door een type IV-achtig secretiesysteem.

Horizontaal verworven DNA dat niet autonoom kan repliceren, moet in het genoom van de ontvanger worden geïntegreerd om het te behouden. Binnenkomend DNA met significante gelijkenis met het ontvangende genoom kan worden geïntegreerd door homologe recombinatie. Mobiele genetische elementen, zoals integratieve en conjugatieve elementen, die een beperkte homologie hebben met het gastheergenoom, gebruiken plaatsspecifieke recombinatie om op doelsequenties te integreren. Het begrijpen van deze processen geeft inzicht in de evolutie van bacteriën en opkomende pathogenen.


Abstract

Het humaan immunodeficiëntievirus type 1 nucleocapside-eiwit 7 (HIV-1 NCp7) is een belangrijk onderdeel van het reverse transcriptiecomplex. Het effect op reverse transcriptie en homologe recombinatie is onderzocht in vitro onder strikt identieke experimentele omstandigheden. Voor hoge enzymconcentraties stimuleerde NCp7 de DNA-synthese niet. Het tijdsverloop voor het voltooien van reverse transcriptie, evenals de processiviteit en het pauzepatroon waren vergelijkbaar in de aanwezigheid of afwezigheid van NCp7. De toevoeging van NCp7 had echter een significante invloed op de opbrengst van de reactie, een afname verergerde naarmate de lengte van het gekopieerde RNA toenam. We schrijven dit fenomeen toe aan een destabilisatie van de RNA/DNA-duplex in tussenliggende stadia van reverse transcriptie.

Daarentegen versterkte NCp7 homologe recombinatie tijdens synthese gemedieerd door HIV-1 RT (reverse transcriptase), zoals het deed voor Moloney muizenleukemievirus RT. Op naakt RNA was het proces van recombinatie afhankelijk van de concentratie van RT, wat suggereert dat binding van RT aan een intermediair van strengoverdracht de beperkende stap was. Deze afhankelijkheid werd verlicht in aanwezigheid van NCp7. Dit effect impliceert geen directe interactie tussen RT en NCp7, aangezien vergelijkbare resultaten werden verkregen wanneer NCp7 werd vervangen door de bacteriële RNA-chaperon StpA. Het dominante effect van NCp7 wordt daarom hoogstwaarschijnlijk uitgeoefend op het niveau van condensatie van de RNA-templates, wat leidt tot de vorming van productieve interacties tussen het ontluikende DNA en de acceptortemplate.


Hoe wordt de juiste hoeveelheid nucleotiden gesynthetiseerd tijdens homologe recombinatie? - Biologie

1. Welke van de volgende beweringen over DNA-polymerase I zijn correct?

a) Het voegt deoxyribonucleotide-eenheden toe aan de 3'-hydroxyl van een primer.

b) Het gebruikt de matrijsstreng om de deoxyribonucleotide-eenheid te selecteren om toe te voegen aan de groeiende DNA-keten.

c) Het bevat een 3' Õ 5'-nuclease dat fosfodiesterbindingen splitst om 3'-dNMP's en 3'-fosfaat-getermineerd DNA op te leveren. 3'-OH-uiteinden opleveren.

d) Het bevat twee nuclease-activiteiten in dezelfde polypeptideketen die de actieve plaats van polymerase bevat.

e) Het kan met een protease worden gesplitst in twee fragmenten, die elk een nuclease-activiteit hebben.

OPMERKINGEN: In tegenstelling tot DNA pol I heeft DNA pol III geen 5'-exonuclease en kan het dus geen RNA-primers uit Okazaki-fragmenten verwijderen. pol III is echter meer "processief" dan pol I en kan interageren met andere eiwitten die nodig zijn voor replicatie, zoals het primase-helicase-complex.

2. Welke eigenschap van DNA maakt het mogelijk om bepaalde resten te herstellen die beschadigd zijn door de werking van mutagenen? Complementariteit van de twee strengen zorgt ervoor dat informatie kan worden teruggewonnen door de onbeschadigde streng als sjabloon te gebruiken.

3.&9Hoe identificeert de reparatiemachine van E. coli een DNA-streng die onlangs een niet-complementaire nucleotide verkeerd heeft opgenomen tijdens replicatie om deze te repareren? Via de door methyl gerichte herstelroute voor mismatches.

4. Welke van de volgende enzymen of processen kunnen betrokken zijn bij het herstel van DNA in E. coli dat is beschadigd door door UV-licht geïnduceerde vorming van een thyminedimeer?

a) DNA-ligase sluit de nieuw gesynthetiseerde streng af aan onbeschadigd DNA om het intacte molecuul te vormen.

b) Het UvrABC-enzym (excinuclease) hydrolyseert fosfodiesterbindingen aan beide zijden van het thyminedimeer.

c) DNA-polymerase I vult de leemte op die is ontstaan ​​door de verwijdering van het oligonucleotide dat het thyminedimeer draagt.

d) Het UvrABC-enzym herkent een vervorming in de DNA-helix die wordt veroorzaakt door het thyminedimeer.

e) A fotoreactiverend enzym absorbeert licht en splitst het thyminedimeer om twee aangrenzende thymineresiduen opnieuw te vormen.

OPMERKINGEN: Ik heb fotoreactivering niet besproken in de colleges. Dit enzymsysteem, dat zeer efficiënt is in bacteriën, lijkt afwezig te zijn bij mensen, behalve misschien voor sommige lymfocyten. De aanwezigheid van efficiënt DNA-herstel in lymfocyten kan de schadelijke effecten op het immuunsysteem helpen verminderen door de UV-A-stralen van de zon (325-400nM), die dieper in de huidlagen doordringen dan UV-B- en UV-C-stralen (<325nM).

5. Mensen die lijden aan xeroderma pigmentosum ontwikkelen huidkanker wanneer ze worden blootgesteld aan zonlicht, omdat ze een tekort hebben aan:

d) een enzym van de excisieherstelroute.

e) een enzym van de mismatch-reparatieroute.

OPMERKINGEN: Verwijs naar de lezingen van Dr. Hamori.

6. Als cytosine in DNA wordt gedeamineerd, is de resulterende base:

a) verwijderd door een endonuclease.

b) verwijderd door een exonuclease.

c) verwijderd door een glycosylase.

d) niet verwijderd, maar uiteindelijk vervangen door cytosine in daaropvolgende DNA-replicatie.

e) wordt niet herkend door DNA-polymerase en remt dus DNA-replicatie.

ANTWOORD: C specifiek de Uracil-N-glycosylase.

7. Eukaryoot DNA is sterk gemethyleerd op de C-5-positie van cytosine. De mate van methylering is omgekeerd evenredig met genexpressie. Hoewel de exacte rol van C-5-methylering bij genexpressie niet bekend is, is het bekend dat deze C-5-gemethyleerde cytosines een bron van mutaties zijn. Leg uit waarom

ANTWOORD: Omdat wanneer 5-methylcytosine oxidatief wordt gedeamineerd, het "thymine" wordt, wat een normale DNA-base is en niet wordt verwijderd door glycosylasen. Het leidt uiteindelijk tot transitie (C naar T) mutaties (Me-C:G ® T :G ® T:A & C:G)

8. Leg de principes van foutgevoelige DNA-reparatie uit.

ANTWOORD: Foutgevoelige reparatie vindt plaats wanneer "niet-getemperde" DNA-synthese plaatsvindt via een gewijzigde of een abasische (verloren base) nucleotidepositie in het DNA. Tweederde van de tijd zijn de mutaties transversies.

DNA-herschikkingen: recombinatie en transpositie.

1. Welke van de volgende uitspraken over genetische herschikkingen zijn correct?

a)&9Ze genereren nieuwe combinaties van genen.

b) Ze kunnen een DNA-segment van het ene chromosoom naar het andere verplaatsen.

c) Ze worden gemedieerd door het breken van DNA en het weer samenvoegen van de resulterende fragmenten.

d) Ze genereren genoomsequentievariabiliteit, waarop natuurlijke selectie kan inwerken.

e) Ze kunnen genexpressie reguleren.

f) Ze hebben altijd uitgebreide regio's van sequentieovereenkomst nodig tussen de op elkaar inwerkende DNA-moleculen om de recombinerende plaatsen naast elkaar te plaatsen. Noch plaatsspecifieke noch transpositionele recombinatie vereist uitgebreide gelijkenis tussen de recombinerende DNA-moleculen

2.&9Beschrijf de stappen van homologe recombinatie.

Zie pagina 802 in Leerboek. U moet het type enzymen en andere activiteiten kennen die door dit proces worden gebruikt.

3. Welke van de volgende beweringen over het RecA-eiwit van E. coli zijn correct?

a) Het is een ATP-afhankelijk nuclease dat enkelstrengs DNA genereert. De nuclease-activiteit is in Rec B C D

b) Het katalyseert een ATP-afhankelijke strengassimilatiereactie waarbij een enkelstrengs DNA-molecuul associeert met duplex-DNA.

c) Het hydrolyseert ATP om de migratie van takken te bevorderen.

d) Het bindt aan enkelstrengs DNA om een ​​filament te vormen.

e) Het vergemakkelijkt het zoeken van duplex-DNA naar regio's met sequentieovereenkomst met het binnendringende enkelstrengs DNA.

4. Welke van de volgende is waarschijnlijk vereist voor Homologe recombinatie?

a) DnaB eiwit g) Enkelstrengs bindend eiwit

b) Topoisomerase I h) DNA-afhankelijke RNA-polymerase

c) RecA eiwit i) DNA polymerase I

d) RecBCD-complex j) DNA-ligase

Homologe recombinatie omvat enige DNA-reparatiesynthese tussen recombinerende moleculen. Het vereist ook enkele van de eiwitten die worden gebruikt voor DNA-replicatie. DnaB is niet vereist.

5. Welke van de volgende uitspraken over transposons is/zijn juist?

a) Ze bevatten invoegsequenties.

b) Ze bevatten omgekeerde terminale herhalingsreeksen.

c) Ze bevatten een of meer genen die een of meer enzymen specificeren die de transpositie katalyseren.

d) Ze hebben de rec-genproducten nodig om hun bewegingen tussen of binnen genomen te voltooien. Deze zijn vereist voor homologe recombinatie

e) Ze kunnen leiden tot de verdubbeling van korte DNA-sequenties in het ontvangende genoom. Aan weerszijden van het ingevoegde DNA.

6. Het soort recombinatie dat wordt vertoond door transposons, soms RecA-onafhankelijke recombinatie genoemd, wordt beschouwd als een veel grotere evolutionaire betekenis dan algemene of RecA-afhankelijke recombinatie. Waarom denk je dat dit het geval kan zijn?

ANTWOORD: Omdat het horizontale overdracht van nieuwe gencassettes mogelijk maakt, bijvoorbeeld groepen genen die resistentie tegen geneesmiddelen specificeren. Homologe recombinatie speelt een grotere rol bij het herschikken van de allelen van homologe genen in paren chromosomen.

7. Beschrijf vier verschillende manieren waarop een antibioticumresistentiegen zich van het genomische DNA van de ene bacterie naar het genomische DNA van een andere kan verplaatsen.

ANTWOORD: Via plasmideoverdracht in bacteriële conjugatie, via een virus door transductie, door opname van DNA dat vrijkomt uit stervende cellen (d.w.z. transformatie) of door transpositie (die gepaard kan gaan met conjugatie, transductie of transformatie).

8. Transposasen herkennen voldoende uitgebreide sequenties rond de integratieplaatsen zodat de transposon vermijdt te worden geïntegreerd in het midden van een gen, omdat genverstoring dodelijk kan zijn voor de cel. vals. Transposons integreren vaak binnenin en inactiveren ("knock-out") genen.

9. Het vermogen van plasmiden om oneindig te repliceren zonder deel uit te maken van een gastheerchromosoom onderscheidt ze van transponeerbare elementen. Waar

1. Welke van de volgende nucleotidesubstituties zijn overgangsmutaties?

2. Welke van de substituties in vraag 1 zijn transversiemutaties?

3. Leg uit waarom de meeste nucleotiden die tijdens de DNA-synthese in E. coli verkeerd zijn opgenomen, niet leiden tot gemuteerd nageslacht. Omdat het bewerken van 3'-exonuclease van DNA-polymerase III en de Methyl-directed Mismatch Repair-route meestal de fouten verwijderen, waardoor vervanging door correct ingebouwde nucleotiden mogelijk is.

4. Match het type mutatie of fysiologische consequentie in de rechterkolom met het juiste mutageen in de linkerkolom. Mogelijk moet u enkele van deze verbindingen opzoeken.

d) Acridines 4,5 _____________

4) Translationele frameshift.

e) Salpeterigzuur ________ 2 _______

f) Benza[a]pyrine ________ 4,5 _ ____

VERKLARING: Base-analogen zoals 5-broomuracil en 2-aminopurine worden opgenomen in plaats van de overeenkomstige natuurlijke basen en leiden gewoonlijk tot overgangsmutaties wanneer ze bestaan ​​in geïoniseerde of natieve toestanden die andere basenparende eigenschappen hebben dan de natuurlijke basen. De verbinding 5-broomuracil neemt vrij goed op in plaats van thymine (5-methyluracil) en codeert als thymine (dwz paren met adenine in daaropvolgende replicaties), maar het komt vaker voor in de geïoniseerde vorm dan thymine en als gevolg daarvan, creëert meer A:C en C:A verkeerde opnames tijdens replicatie. Bij daaropvolgende replicaties worden deze verkeerde opnames overgangsmutaties. De verbinding 2-aminopurine bevat, in lage concentraties, in plaats van ofwel guanine (2-amino, 6-oxypurine) en is een zeer krachtig mutageen dat G:T- en T:G-misicorporaties veroorzaakt, dwz het is ook een overgangsmutageen .

Verbindingen die leiden tot oxidatieve deaminering (door te reageren met de NH2-groepen van A, G en C) leiden tot overgangen. Ze veranderen in wezen de H-donerende zijgroep (NH2) in een H-accepterende (=O) zijgroep. Hydroxylamine en salpeterigzuur behoren tot deze categorie mutagenen.

Vlakke, hydrofobe verbindingen zoals acridinekleurstoffen en Benza[a]pyrine intercalleren in DNA en verhogen de frequentie van slippen tijdens DNA-replicatie, wat leidt tot frameshift-mutaties. De aanwezigheid van een intercalerend middel in dubbelstrengs DNA kan een pauze in de replicatie veroorzaken die gewoonlijk wordt overwonnen door de slip die tot frameshifts leidt.

5. Als DNA-polymerase een fout maakt, waardoor een paar onjuist waterstofgebonden basen ontstaat, wordt de fout gecorrigeerd door een speciaal _mismatch repair____ systeem dat methylering gebruikt om nieuwe strengen van oude te onderscheiden.

6. Het enzym dat het HIV-virus repliceert, is ____reverse transcriptase, dat geen 3'-exonuclease-activiteit (editing)_ heeft en bijgevolg een slechte betrouwbaarheid heeft.

7. Als het inwerkt op gerepliceerd DNA, kan het door methyl gerichte herstelsysteem voor mismatches in E. coli de ouderstreng van de nageslachtstreng onderscheiden zolang een of beide strengen gemethyleerd zijn, maar niet als beide strengen niet-gemethyleerd zijn. Waar of niet waar?

ANTWOORD: Onwaar. Dit reparatiesysteem werkt alleen als de ene streng gemethyleerd is op GATC-sequenties en de andere niet.

8. Welke van de volgende beweringen over DNA-polymerase III holo-enzym uit E. coli zijn correct?

a) Het verlengt een groeiende DNA-keten ongeveer 100 keer sneller dan DNA-polymerase I. Pol III is meer processief dan pol I.

b) Het associeert zich met het ouderlijke sjabloon, voegt een paar nucleotiden toe aan de groeiende keten en dissocieert vervolgens voordat een nieuwe synthesecyclus wordt gestart. Dit is wat er gebeurt met een niet-processief enzym.

c) Het handhaaft een hoge betrouwbaarheid van de replicatie, gedeeltelijk door samen te werken met een subeenheid die een 3' &213 5'-exonuclease-activiteit bevat.

d) Bij het repliceren van DNA is het een moleculair geheel dat bestaat uit minstens 10 verschillende soorten subeenheden. De b subeenheden ( b dimeer) van deze assembly is de "processivity" factor.

1. Er zijn verschillende termen die je aan je vocabulaire moet toevoegen. Deze staan ​​vermeld op pp. 842-843 van Voet & Voet. Zorg dat je er geen mist.

2. Werk "Studieoefeningen" 1-7 aan het einde van hoofdstuk 25 in Voet & Voet.

3. Werk "Problemen" 1,3 en 5 aan het einde van hoofdstuk 25 voordat je de antwoorden aan het einde van het boek opzoekt.

4. De sigma-subeenheid van E. coli RNA-polymerase

A. is onderdeel van het kernenzym.

B. bindt het antibioticum rifampicine. Het is de b subeenheid die rifampicine bindt.

C. wordt geremd door a -amanitine Dit toxine van bepaalde paddenstoelen remt eukaryote RNA-polymerase II

D. moet aanwezig zijn om transcriptie te laten plaatsvinden. s is alleen vereist voor initiatie.

Met E. kan het enzym promotorplaatsen herkennen.

5. Markeer welke uitspraken "waar" zijn en welke "onwaar" over het primaire transcript in prokaryoten.

A. Het bevat een trifosfaatgroep aan het 5'-uiteinde.

B. Het bevat een AU-rijke sequentie die complementair is aan het -10-gebied van de DNA-matrijs. Dit deel van het DNA wordt niet getranscribeerd.

C. Het bevat soms informatie voor meer dan één eiwit. Bijvoorbeeld polycistronisch mRNA

D. Het bevat soms een haarspeldstructuur nabij het 3'-uiteinde. Sommige mRNA's eindigen distaal van dergelijke haarspeldstructuren.

E. Het bevat meestal een poly A-reeks nabij het 3'-uiteinde. Nee, polyA is echter gedetecteerd in veel prokaryotische mRNA's en de mogelijke fysiologische betekenis ervan wordt momenteel geëvalueerd.

ANTWOORD: A, C en D zijn waar B en E zijn onwaar, behalve zoals aangegeven.

6.&9Gebruik de uitspraken in vraag 5 om de onjuistheden over het primaire transcript in eukaryoten te markeren.

ANTWOORDEN: A = Waar B= Onwaar C= Onwaar (enkele uitzonderingen) D= Onwaar (meestal) E= Waar

REGELING VAN GENEXPRESSIE

1. Noem verschillende processen waarmee het eiwitgehalte in de cel kan worden gereguleerd.

a. DNA-replicatie, waardoor het aantal genen voor het eiwit kan toenemen. Dit type regulering is belangrijk voor de groei van virussen. Het wordt ook gezien in gevallen van "genamplificatie".

b. Transcriptie. Met name de regulatie van mRNA-synthese op het niveau van initiatie, d.w.z. zoals benadrukt in de klas

c. Post-transcriptionele mRNA-verwerking, inclusief conversie van intron-bevattend mRNA naar vertaalbaar RNA in eukaryoten. Daarnaast degradatie van mRNA, omzetting van polysistronisch mRNA naar individuele cistronische mRNA's en andere gebeurtenissen zoals "RNA-editing". Sommige van deze mechanismen zullen in andere cursussen worden besproken.

d. Vertaling. Vertaling kan, net als transcriptie, worden gereguleerd op het niveau van initiatie en elongatie. RNA-bindende eiwitten zijn een belangrijk onderdeel van genregulerende circuits in de biologie. Veel voorbeelden van translationele regulatie zullen worden besproken in de cursus van het tweede semester, Biochemistry 718.

e. Post-translationele eiwitmodificatie. Verwerking van "polyproteïnen" door proteasen, splitsing van eiwitten (zoals verwijdering van "signaal"-peptiden), fosforylering-defosforlering, acetylering en toevoeging van koolhydraat- en lipidegroepen zijn enkele van de mechanismen die de functie en stabiliteit van de eiwitproducten van genen beïnvloeden .

2. Geef voorbeelden van cis-werkende en trans-werkende genetische factoren die transcriptie controleren.

cis-acting: promotor, operator, geluiddemper, versterker

trans-acting: RNA-polymerase, repressor, TATA-bindend eiwit, TFIIB, CAP, tryptofaan.

Je zou de effecten van dergelijke factoren moeten kunnen voorspellen.

3. Leg de regulatie van het E. coli lactose-operon uit.

Je zou in staat moeten zijn om de stappen samen te vatten die betrokken zijn bij activering en onderdrukking van dit operon als reactie op het type suiker dat beschikbaar is als koolstofbron voor dit organisme.

4.&9Leg uit hoe de niveaus van tryptofaan in een E. coli-cel de biosynthese van dit aminozuur reguleren door transcriptionele repressie-derepressie en verzwakking van het tryptohan-operon.

Je zou in staat moeten zijn om de regulatie van dit operon te beschrijven en het te contrasteren met de regulatie van het lactose-operon. Is verzwakking een cis- of trans-acting fenomeen?

5. Leg de waarschijnlijke rollen uit van de (a) grote en kleine groeven, (b) zijgroepen van de purine-pyrimidine basenparen, en (c) deoxyribosefosfaatruggengraat van de promotor bij het binden van de E coli RNA-polymerase (RNAP) holo-enzym.


Materialen en methodes

Vliegenvoorraden en het maken van mutanten

Vliegen werden gekweekt bij 25°C op standaard maïsmeelagarmedium. Aandelen die in het bezit zijn van P element en Minos inserties werden verkregen van Bloomington Stock Center of van het lab van Hugo Bellen. In sommige gevallen, P elementen werden gekruist met een 㥂𠄳 transposasebron in a mus309 N1 mutante achtergrond om grote deletiemutaties te genereren, zoals beschreven in [42]. De mus309 N1 mutatie werd verwijderd voordat verder werd geëxperimenteerd.

Mutageen gevoeligheidstesten

Voor alle tests werden heterozygote mutanten gedekt in flesjes die 5 ml voedsel bevatten en lieten ze drie dagen eieren leggen voordat ze gedurende twee extra dagen werden overgebracht naar verse flesjes. Eén groep injectieflacons werd behandeld met 250 µl mutagene oplossing, terwijl de andere werd behandeld met hetzelfde volume vehikelcontrole. Voor ioniserende stralingsonderzoeken werden embryo's gedurende 12 uur verzameld op druivensap-agarplaten en men liet ze zich ontwikkelen tot larven in het derde stadium, waarna ze bestraald werden in een Gammator 1000-bestralingstoestel. Voor alle andere mutagenen werden nakomelingen behandeld als larven in het eerste stadium. Voertuig controle was H20 voor alle behandelingen behalve voor camptothecine, waarbij DMSO in een 20'00025 Tween, EtOH-oplossing werd gebruikt. Percentage overleving ten opzichte van controle werd berekend als de verhouding van het percentage homozygoten dat in de behandelingsgroep werd geëlimineerd ten opzichte van het verwachte aantal op basis van homozygote overleving in de controlegroep. Elk experiment bestond uit ten minste vijf onafhankelijke flesjes en foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties van ten minste drie onafhankelijke replica's.

Site-specifieke hiaatreparatie P-assay

HR-reparatie werd gevolgd via de DSB die was gemaakt na excisie van een P-element zoals eerder beschreven ([43] en zie tekst). Een tweede bron van chromosoomtransposase (CyO, H) werd gebruikt om accijnzen P voor rev1 en pol eta enkele mutanten, terwijl alle andere experimenten werden uitgevoerd met een derde chromosoomtransposasebron (P ). Gematchte wildtype-controles met behulp van de juiste transposasebron werden voor elk experiment uitgevoerd (dezelfde representatieve controle voor elke respectieve transposasebron wordt overal aangegeven). Individuele mannen die beide bezitten P en de transposasebron werden gepaard met vrouwtjes die homozygoot waren voor P- en reparatieproducten werden teruggevonden in vrouwelijke nakomelingen. Elk flesje werd geteld als een onafhankelijk monster en de statistische significantie werd berekend met behulp van de Mann-Whitney statistische test. Genomisch DNA van vliegen met onafhankelijke reparatiegebeurtenissen werd teruggevonden [44] en PCR werd uitgevoerd om de mate van reparatiesynthese te schatten (zie tekst S1). De lengtes van het controlekanaal werden verkregen uit excisies met gebruikmaking van de derde chromosoomtransposasebron.


Materialen en methodes

Bacterie- en faagstammen

Bacteriestammen zijn: E coli K12-derivaten en staan ​​vermeld in tabel . Nieuwe genotypen werden geconstrueerd met behulp van standaard faag P1-gemedieerde transductie (Miller 1992). De aanwezigheid van recA, recG, ruvA, ruvB, en ruvC allelen werd bevestigd door de verhoogde gevoeligheid voor UV-licht fenotypes. Voor ruv recG dubbele mutanten, extreme UV-gevoeligheid (Lloyd 1991) werd geverifieerd. SMR650 werd geconstrueerd uit SMR632 door transductie van ruvC53 eda-51::Tn10 (Lloyd 1991) van CS85, toen recG258::Tn10minikan van RDK2655 (Lloyd en Buckman 1991, verkregen van R. Kolodner). SMR3124 werd op dezelfde manier geconstrueerd [RDK2641 gedoneerdruvA59::Tn10 (Shurvinton et al. 1984)]. SMR632 getransduceerd met P1 van SMR540 (labverzameling, allel van R. Maurer, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) leverde SMR4594 op. SMR4600 is SMR4594 met ruvC53 eda-51::Tn10 (Lloyd en Buckman 1991) en recG258::Tn10minikan (Lloyd en Buckman 1991). SMR4601 werd gemaakt door van SMR4594 met P1 gegroeid op SMR624 (Harris et al. 1994).

SMR3731 werd gemaakt door SMR632 te lysogeniseren metJts15 red3 gam210 Δnin5 Sam7 [λSR459 (Sawitzke en Stahl 1997)], gevolgd door transductie naar kanamycineresistentie met P1 gegroeid op een grpD55 malF::Tn10::kan stam (Bull en Hayes 1996). SMR3732 is gemaakt van SMR3731 door middel van transduceren ruvC53 eda57::Tn10::cam (verkregen uit een transductant van CS85 × P1 RM5258) en recG162 zib-636::Tn10(Storm et al. 1971).

λ-fagen komen uit de λSR-collectie of waren geschenken van F.W. Stahl (University of Oregon, Eugene) of S. Hayes (University of Saskatchewan, Saskatoon, Canada). Faaggenotypen die in kruisen worden gebruikt om de frequentie van recombinanten te meten (Fig. en ) zijn van Razavy et al. (1996) enb2 red3 gam210 cl857 Sam7(nin + )bio1 (nin +). De fagen die in figuur werden gebruikt, waren λSR27, bio1 Δnin5, en in Figuur waren MMS1816, λJts15 int4 red3 gam210 cl857 Δnin5 MMS1817,int4 red3 gam210 Δnin5 Sam7, en homo-immune profaag MMS2076,Jts15 rood3 gam210 Δnin5 Sam7, met hulpverpakkingsfuncties geleverd door MMS2084,Jts15 int4 rood3 gam210 imm 434 Δnin5 Sam7 (Sawitzke en Stahl 1997).

Groei van faagvoorraden en E coli culturen

dnaEts stammen werden gekweekt bij 28°C. ruv recGdubbele mutanten groeien langzaam en vormen kleine kolonies, zodat culturen vatbaar zijn voor accumulatie van sneller groeiende en grotere mutantkolonies die zowel suppressormutaties als echte reversies dragen (Lloyd en Buckman 1991 Harris et al. 1996). ruv recG dubbele mutante stammen werden gekweekt bij 32°C om de accumulatie van suppressors te vermijden die normaal geassocieerd zijn met het kweken van deze stammen bij hogere temperaturen (Harris et al. 1996). De fenotypes van UV- en geneesmiddelgevoeligheid van alle stammen werden bevestigd voor kweken die in elk experiment werden gebruikt (en/of voor ∼30 kolonies van een bepaalde kweek). Kweken werden ook routinematig gecontroleerd op mogelijke accumulatie van suppressors of revertanten zoals eerder beschreven (Harris et al. 1996).

faagvoorraden (die lichte isotopen dragen) werden gekweekt en plaque-assays werden uitgevoerd volgens standaardprocedures (Murray 1983). Voorraden van λ-faagdichtheid gelabeld met 13C en 15N werden gekweekt volgens procedures van Stahl et al. (1972) op prototrofe bacteriën gedurende 12-14 uur bij 32 ° C.

Recombinatie-assays

Experimenten in figuren en werden uitgevoerd zoals eerder (Razavy et al. 1996), behalve dat kweken voor gemengde infecties werden gekweekt bij 32 ° C, geïnoculeerd uit 10-30 l van de ingevroren bacterieculturen.

Λ recombinatietest in afwezigheid van DNA-replicatie

Voorverwarmd, dichtheidslabel rode gam nin(λSR27) werden geïnfecteerd in voorverwarmde SMR4594, 4600 en 4601 (bij 43,5°C, moi = 10) die waren gegroeid bij 28°C tot 2 x 108 cellen/ml in tryptonbouillon + 1% gistextract, 0,2% maltose en 0,01 mg/ml vitamine B1 (+25 μg/ml kanamycine voor ruv recGstammen, om ophoping van recG revertanten gevormd door transposon-excisie). Geïnfecteerde cellen werden 30 min geborreld, verdund met 4 ml voorverwarmde bouillon (hierboven), 35 min geborreld bij 43,5°C, vervolgens gewassen met koude TM-buffer (10 mm, Tris Mg), opnieuw gesuspendeerd in gekoelde bouillon (hierboven), gelyseerd met lysozyme en chloroform, en gepelleteerd, en de supernatanten werden verzameld. Een dichtheidsgradiënt bereid voor elk lysaat (McMilin en Russo 1972) werd verzameld als fracties van twee druppels in 1 ml TB en getitreerd op SMR423.

Assay voor centrale en end-recombinanten gevormd onder gedeeltelijk replicatieblok

Gedeeltelijke replicatieblokkade werd bereikt door homo-immuunrepressie en hetero-immune helperfaaginfectie, zoals beschreven door Sawitzke en Stahl (1997), behalve dat onze E coli stammen droegen ook de grpD55 mutatie.grpD55 codeert voor een DnaB-helicase die geen interactie aangaat met de λ-replicatie-eiwitten (Bull en Hayes 1996). Bij afwezigheid van dit allel kon λ replicatie niet voldoende worden geblokkeerd inruv recG stammen om resolutie van ongerepliceerde fagen (HH-pieken) mogelijk te maken. Recombinanten werden getest op stammen JAS36 en JAS38 zoals beschreven (Sawitzke en Stahl 1997).


Discussie

Identification of a poxvirus-encoded primase (22) suggested that poxviruses might also encode an endonuclease that would remove RNA primers in nascent DNA. The G5 protein seemed a likely candidate as it belongs to the FEN1 nuclease family (9, 10), some members of which are flap endonucleases (11). We isolated a VACV G5R deletion mutant and found that it was defective, generating only 2–4 infectious units per cell. Isolation of a revertant virus and transcomplementation with plasmid encoding the wt G5R gene confirmed that the replication defect was specific. Moreover, mutations of predicted catalytic aspartates abrogated complementation, strongly suggesting that G5 functions as a nuclease in DNA replication. Although the level of DNA replication determined by qPCR appeared unaffected, pulsed-field gel electrophoresis showed that the viral DNA made in the absence of G5 was a mixture of fragments, with a mean of about 45 kb instead of 200-kb, full-length genomes. The DNA fragments were double-stranded and representative of the entire genome because digestion with restriction endonucleases yielded the expected pattern. Furthermore, there was an excess of mature DNA termini compared to junctions, indicating that junction resolution had occurred. The presence of numerous random nicks in the DNA or accumulation of Okazaki-size fragments was ruled out by alkaline gel electrophoresis. Therefore, it seems most likely that the subgenomic DNA fragments result from DSBs, which occur in many systems at the replication fork, and that these DSBs are not repaired in the absence of G5. Assuming that the DSBs were random (i.e., Poisson-distributed) and that the mean fragment length was 45 kb, then full-length (185 kb) genomes would be expected to comprise approximately 1% of the total viral DNA. This estimated fraction of intact genomes is compatible with the observed residual infectivity of vΔG5.

Using a quantitative plasmid recombination assay developed by the Evans laboratory (20), we found that HR was diminished by 3- to 5-fold. In a second HR DSBR assay, we found a 7- to 8-fold decrease in cells infected with the G5R deletion mutant. The deficiencies in DSBR and HR are likely to have the same mechanistic cause as the two processes are intimately related (23). In eukaryotic cells, HR-mediated DSBR involves the resection of DNA ends to produce recombinogenic 3′ single-stranded tails. This process involves multiple nucleases including Mre11, a 3′-5′ exonuclease, and Exo1, a 5′-3′ exonuclease and flap endonuclease (23). An important next step will be to characterize the putative nuclease activity of G5. Recently Gammon and Evans (21) reported that the 3′ exonuclease of VACV DNA polymerase has a role in genetic recombination. In addition, the VACV Holliday junction resolvase can cleave a variety of branched DNA structures in vitro (4, 24, 25), although it is expressed late in infection whereas G5 and the viral DNA polymerase are expressed early. Thus, two or three nucleases are potentially involved in poxvirus DSBR and HR.

Most of the DNA made in cells infected with the G5 deletion mutant was not packaged in virus particles, even though junctions were resolved to form mature termini. There might be a length requirement for packaging DNA or mature termini might be required at both ends of the genome. Still another possibility is that G5 itself is required, since it is normally present in virus cores (13). At least two other proteins are needed for packaging DNA, namely a putative ATPase encoded by the A32 gene (14) and the telomere-binding protein I6 (15). The absence of DNA probably accounted for the spherical shape of the virions because similar-shaped virions have also been found with the A32 and I6 mutants.

The herpesvirus FEN1-family member is a ribonuclease involved in host and early viral mRNA degradation (26). To determine whether G5 also possessed such an activity, we compared the steady state levels of a cellular mRNA, an early VACV mRNA and an intermediate VACV mRNA in cells infected with wt VACV and the G5 deletion mutant. No differences were found suggesting that G5 does not affect mRNA stability. This result was not surprising given that VACV and other poxviruses encode decapping enzymes, which regulate mRNA half-life (27, 28). Other nucleocytoplasmic large DNA viruses including iridoviruses, ascoviruses, mimivirus, and one of the phycodnaviruses (but not other phycodnaviruses or African Swine Fever virus) encode predicted Fen1-family nucleases. However, these proteins are no more closely related to poxvirus G5 orthologs than they are to the herpesvirus homologs, leaving the roles of these proteins in viral reproduction an open question.


Discussie

Realized recombination analyzed by nucleotide sequence data depends both on the mechanisms that transfer DNA from genome to genome and the selective forces that act on the recombined sequence. Conjugation can lead to transfer of hundreds of thousands of bases from cell to cell in a single event ( Dale and Park 2010 Bellanger et al. 2014) but requires the presence of conjugation machinery in the donor cell. Natural transformation can lead to transfer of long DNA fragments up to dozens of kilobases including transposons, integrons, and/or gene cassettes ( Domingues et al. 2012). Natural transformation of naked DNA or transfer through phage allows shorter sequence to be incorporated into a cell and furthermore, DNA is often fragmented and partially digested before integration into the recipient genome. Imported DNA is more likely to persist if it confers novel function to a lineage or replaces deleterious mutations, but long imports are also more likely to disrupt existing functional interactions.

Comparative analysis revealed similarities and differences in the chromosomal pattern of recombination of ten human pathogens. The topography of the recombination landscapes differed, even for closely related species. Several species have recombination hot regions that were typically only a few hundred bases, for example, S. enterica. Its sister species, E coli has hot regions that are more than 100 kb in length. There are other species, such as N. meningitidis, where hot regions are typically a few kilobases in length. Where there is high frequency of imports that span the same set of multiple genes, such as in E coli, it is likely to reflect both opportunities for transfer of large stretches of DNA and the functional interaction of contiguous genes. Such long imports could potentially confer more advantage than short ones, if functional interactions of the imported continuous genes were preserved.

The link between frequent recombination in certain genes and bacterial invasion and colonization of the host tissue was shown in several species however in E coli, there is also evidence for two very long hot regions. The degree of hotness varies within the long regions, implying that most of the events do not span the whole region. It is nevertheless likely that the recombination events responsible for the signal are substantially longer than those that underlie the short hotspots.

Across the ten species there was no evidence that gene boundaries determine the ends of recombination hot regions. Bijvoorbeeld in N. meningitidis, tpbB, encoding the transferrin-binding protein, is hot due to strong natural selection for new variants during epidemics, but the boundaries of the import events are often several kilobases away from the gene ( Linz et al. 2000), leading to a hot region with indistinct edges.

The ten species in this study included three pairs that were relatively closely related, including E coli en S. enterica. The other two pairs (from the genera Neisseria en Streptoccocus) did not show pronounced differences in the lengths of their hot regions. The correlation between orthologous genes was nevertheless relatively weak in the two Streptococcus species and moderate between N. meningitidis en N. gonorrhoeae. Our results therefore demonstrate that recombination hotspots and other quantitative features can change rapidly in bacteria as in mammals ( Auton et al. 2012). Such a change might reflect the divergence of the species’ ecological niches and their associated selective pressures.

There was a strong positive correlation between diversity and estimated recombination. As discussed previously ( Yahara et al. 2014), this correlation is difficult to interpret in a causal way. Our method can be more sensitive in detecting recombination where diversity is higher. Both realized recombination rates and the rate of substitution are increased by diversifying selection at particular loci. Furthermore recombination can also directly affect the amount of diversity that is observed, for example, by introducing diversity from distant taxa. Finally, sequence diversity can alter the amount of recombination that takes place due to mechanistic factors such as the suppression of recombination between divergent sequences by mismatch repair mechanisms ( Tham et al. 2013).

Parts of the mobile accessory genome can have a different GC content than the rest of the genome. However, the effect of GC content has not been related to homologous recombination in bacteria. Individual species did have significant but weak correlations between GC content and recombination but overall, we found no evidence that high or low GC regions are more likely to be transferred between genomes. Specific recombination processes such as transformation might be affected by GC content of the DNA that is being transferred, but these mechanistic factors are not consistent enough between species to leave a systematic signal in our scan. Nor did we find systematic patterns relating to other chromosomal features such as distance to origin of replication.

A feature that was consistent across all the ten species was the relationship to gene function. Ribosomal genes were, on average, recombination cold in every species and were colder than expected based on their low nucleotide diversity. These genes were conserved across species because of their central role in cellular replication and are assumed to be principally under purifying selection. Genes encoding other cellular housekeeping functions were also cold. These genes can be contrasted with the categories of genes encoding surface structures, membranes, lipoproteins and porins, and the cell envelope, all of which involve the interaction of the cell with its environment and each of which was recombination hot. This interaction has often been presumed to lead to species specific and fluctuating selection pressures. Our findings suggest that the contrast between housekeeping and cell surface function does indeed lead to a substantial difference in realized recombination rates.

Most human pathogens have emerged from harmless commensal organisms. The rapid evolution of virulence traits may be facilitated by high rates of recombination, in which case virulence genes would be expected to give a recombination hot signal. This was observed in E coli however, no consistent signal was observed across the ten species. One explanation for this is that annotation of virulence genes is not adequate, or virulence is a composite term incorporating transmission efficacy, toxin production, and other factors associated with pathogenic human infection. The genes associated with these traits may evolve in very different ways. In other words, the signature of higher realized recombination rate can be useful to detect various traits under positive selection. Using techniques, such as that employed here, it will be possible to investigate broad patterns in the localization of recombination and the mechanistic and selective features involved.


A. The leading strand is synthesized in the same direction as the movement of the replication fork, whereas the lagging strand is synthesized in the opposite direction

B. the lagging strand is synthesized continuously, whereas the leading strand is synthesized in short fragments that are ultimately stitched together

C. the leading strand is synthesized by adding nucleotides to the 3' end of the growing strand, whereas the lagging strand is synthesized by adding nucleotides to the 5' end

NS. none of the above - leading and lagging are just terms to differentiate the top from the bottom strand