Informatie

3.8.3: Intermediaire filamenten en microtubuli - biologie


Microtubuli maken deel uit van het cytoskelet van de cel en helpen de cel om compressie te weerstaan, blaasjes te verplaatsen en chromosomen te scheiden bij mitose.

leerdoelen

  • Beschrijf de rollen van microtubuli als onderdeel van het cytoskelet van de cel

Belangrijkste punten

  • Microtubuli helpen de cel weerstand te bieden aan compressie, zorgen voor een spoor waarlangs blaasjes door de cel kunnen bewegen en zijn de componenten van trilharen en flagella.
  • Cilia en flagella zijn haarachtige structuren die helpen bij de voortbeweging in sommige cellen, en ook verschillende structuren omlijnen om deeltjes op te vangen.
  • De structuren van cilia en flagella zijn een "9 + 2-array", wat betekent dat een ring van negen microtubuli wordt omringd door nog twee microtubuli.
  • Microtubuli hechten zich tijdens celdeling aan gerepliceerde chromosomen en trekken ze uit elkaar naar tegenovergestelde uiteinden van de pool, waardoor de cel zich kan delen met een complete set chromosomen in elke dochtercel.

Sleutelbegrippen

  • microtubuli: Kleine buisjes gemaakt van eiwit en gevonden in cellen; onderdeel van het cytoskelet
  • flagellum: een flagellum is een zweepachtig aanhangsel dat uitsteekt uit het cellichaam van bepaalde prokaryotische en eukaryote cellen
  • cytoskelet: Een cellulaire structuur zoals een skelet, ingesloten in het cytoplasma.

Microtubuli

Zoals hun naam al aangeeft, zijn microtubuli kleine holle buisjes. Microtubuli, samen met microfilamenten en intermediaire filamenten, vallen onder de klasse van organellen die bekend staat als het cytoskelet. Het cytoskelet is het raamwerk van de cel dat de structurele ondersteunende component vormt. Microtubuli zijn het grootste element van het cytoskelet. De wanden van de microtubuli zijn gemaakt van gepolymeriseerde dimeren van -tubuline en β-tubuline, twee bolvormige eiwitten. Met een diameter van ongeveer 25 nm zijn microtubuli de breedste componenten van het cytoskelet. Ze helpen de cel compressie te weerstaan, zorgen voor een spoor waarlangs blaasjes door de cel bewegen en trekken gerepliceerde chromosomen naar tegenovergestelde uiteinden van een delende cel. Net als microfilamenten kunnen microtubuli snel oplossen en opnieuw vormen.

Microtubuli zijn ook de structurele elementen van flagella, trilhaartjes en centriolen (de laatste zijn de twee loodrechte lichamen van het centrosoom). In dierlijke cellen is het centrosoom het microtubule-organiserende centrum. In eukaryote cellen zijn flagella en trilharen structureel heel anders dan hun tegenhangers in prokaryoten.

Intermediaire filamenten

Intermediaire filamenten (IF's) zijn cytoskeletcomponenten die in dierlijke cellen worden aangetroffen. Ze zijn samengesteld uit een familie van verwante eiwitten die gemeenschappelijke structurele en sequentiekenmerken delen. Intermediaire filamenten hebben een gemiddelde diameter van 10 nanometer, wat tussen die van 7 nm actine (microfilamenten) en die van 25 nm microtubuli ligt, hoewel ze aanvankelijk werden aangeduid als 'intermediair' omdat hun gemiddelde diameter tussen die van smallere microfilamenten (actine) ligt. en bredere myosinefilamenten in spiercellen. Intermediaire filamenten dragen bij aan cellulaire structurele elementen en zijn vaak cruciaal bij het bij elkaar houden van weefsels zoals de huid.

Flagella en Cilia

Flagella (enkelvoud = flagellum) zijn lange, haarachtige structuren die zich uitstrekken vanaf het plasmamembraan en worden gebruikt om een ​​hele cel (bijvoorbeeld sperma, Euglena). Indien aanwezig, heeft de cel slechts één flagellum of enkele flagella. Wanneer trilhaartjes (enkelvoud = cilium) aanwezig zijn, strekken veel ervan zich echter uit langs het gehele oppervlak van het plasmamembraan. Het zijn korte, haarachtige structuren die worden gebruikt om hele cellen (zoals paramecia) of stoffen langs het buitenoppervlak van de cel te verplaatsen (bijvoorbeeld de trilharen van cellen die de eileiders bekleden die de eicel naar de baarmoeder verplaatsen, of trilhaartjes die de cellen van de luchtwegen bekleden die fijnstof vangen en naar uw neusgaten verplaatsen).

Ondanks hun verschillen in lengte en aantal, delen flagella en trilharen een gemeenschappelijke structurele rangschikking van microtubuli, een "9 + 2-array" genaamd. Dit is een toepasselijke naam omdat een enkele flagellum of cilium is gemaakt van een ring van negen microtubuli-doubletten die een enkele microtubuli-doublet in het midden omringen.


3.3 Eukaryotische cellen

Op dit punt moet het duidelijk zijn dat eukaryote cellen een complexere structuur hebben dan prokaryotische cellen. Organellen zorgen ervoor dat verschillende functies tegelijkertijd in de cel kunnen plaatsvinden. Voordat we de functies van organellen in een eukaryote cel bespreken, laten we eerst twee belangrijke componenten van de cel onderzoeken: het plasmamembraan en het cytoplasma.

Visuele verbinding

Welke structuren heeft een plantencel die een dierlijke cel niet heeft? Welke structuren heeft een dierlijke cel die een plantencel niet heeft?

Het plasmamembraan

Net als prokaryoten hebben eukaryote cellen een plasmamembraan (Figuur 3.8) dat bestaat uit een fosfolipide dubbellaag met ingebedde eiwitten die de interne inhoud van de cel scheidt van zijn omgeving. Een fosfolipide is een lipidemolecuul dat bestaat uit twee vetzuurketens, een glycerolruggengraat en een fosfaatgroep. Het plasmamembraan reguleert de doorgang van sommige stoffen, zoals organische moleculen, ionen en water, waardoor de doorgang van sommige wordt voorkomen om de interne omstandigheden te handhaven, terwijl andere actief worden binnengebracht of verwijderd. Andere verbindingen bewegen passief over het membraan.

De plasmamembranen van cellen die gespecialiseerd zijn in absorptie, worden gevouwen tot vingerachtige uitsteeksels die microvilli worden genoemd (enkelvoud = microvillus). Deze vouwing vergroot het oppervlak van het plasmamembraan. Dergelijke cellen worden meestal aangetroffen langs de dunne darm, het orgaan dat voedingsstoffen uit verteerd voedsel opneemt. Dit is een uitstekend voorbeeld van een vorm die overeenkomt met de functie van een constructie.

Mensen met coeliakie hebben een immuunrespons op gluten, een eiwit dat voorkomt in tarwe, gerst en rogge. De immuunrespons beschadigt microvilli en dus kunnen getroffen personen geen voedingsstoffen opnemen. Dit leidt tot ondervoeding, krampen en diarree. Patiënten met coeliakie moeten een glutenvrij dieet volgen.

Het cytoplasma

Het cytoplasma omvat de inhoud van een cel tussen het plasmamembraan en de nucleaire envelop (een structuur die binnenkort wordt besproken). Het bestaat uit organellen die zijn gesuspendeerd in het gelachtige cytosol, het cytoskelet en verschillende chemicaliën (Figuur 3.7). Hoewel het cytoplasma voor 70 tot 80 procent uit water bestaat, heeft het een halfvaste consistentie, die afkomstig is van de eiwitten erin. Eiwitten zijn echter niet de enige organische moleculen die in het cytoplasma worden aangetroffen. Glucose en andere eenvoudige suikers, polysachariden, aminozuren, nucleïnezuren, vetzuren en derivaten van glycerol worden daar ook gevonden. Ionen van natrium, kalium, calcium en vele andere elementen worden ook opgelost in het cytoplasma. Veel stofwisselingsreacties, waaronder eiwitsynthese, vinden plaats in het cytoplasma.

Het cytoskelet

Als je alle organellen uit een cel zou verwijderen, zouden het plasmamembraan en het cytoplasma dan de enige componenten zijn die nog over zijn? Nee. Binnen het cytoplasma zouden er nog steeds ionen en organische moleculen zijn, plus een netwerk van eiwitvezels dat helpt de vorm van de cel te behouden, bepaalde organellen op specifieke posities vastzet, cytoplasma en blaasjes in de cel laat bewegen en het mogelijk maakt eencellige organismen zelfstandig kunnen bewegen. Gezamenlijk staat dit netwerk van eiwitvezels bekend als het cytoskelet. Er zijn drie soorten vezels in het cytoskelet: microfilamenten, ook bekend als actinefilamenten, intermediaire filamenten en microtubuli (Figuur 3.9).

Microfilamenten zijn de dunste van de cytoskeletvezels en functioneren in bewegende cellulaire componenten, bijvoorbeeld tijdens celdeling. Ze behouden ook de structuur van microvilli, de uitgebreide vouwing van het plasmamembraan dat wordt aangetroffen in cellen die zich toeleggen op absorptie. Deze componenten komen ook veel voor in spiercellen en zijn verantwoordelijk voor de samentrekking van spiercellen. Intermediaire filamenten hebben een gemiddelde diameter en hebben structurele functies, zoals het behouden van de vorm van de cel en het verankeren van organellen. Keratine, de verbinding die haar en nagels versterkt, vormt een soort intermediair filament. Microtubuli zijn de dikste van de cytoskeletvezels. Dit zijn holle buizen die snel kunnen oplossen en hervormen. Microtubuli leiden de beweging van organellen en zijn de structuren die chromosomen naar hun polen trekken tijdens celdeling. Ze zijn ook de structurele componenten van flagella en trilharen. In cilia en flagella zijn de microtubuli georganiseerd als een cirkel van negen dubbele microtubuli aan de buitenkant en twee microtubuli in het midden.

Het centrosoom is een gebied nabij de kern van dierlijke cellen dat fungeert als een microtubuli-organiserend centrum. Het bevat een paar centriolen, twee structuren die loodrecht op elkaar staan. Elke centriol is een cilinder van negen tripletten van microtubuli.

Het centrosoom repliceert zichzelf voordat een cel zich deelt, en de centriolen spelen een rol bij het trekken van de gedupliceerde chromosomen naar tegenovergestelde uiteinden van de delende cel. De exacte functie van de centriolen bij celdeling is echter niet duidelijk, aangezien cellen waarvan de centriolen zijn verwijderd, zich nog steeds kunnen delen, en plantencellen, die geen centriolen hebben, zijn in staat tot celdeling.

Flagella en Cilia

Flagella (enkelvoud = flagellum) zijn lange, haarachtige structuren die zich uitstrekken vanaf het plasmamembraan en worden gebruikt om een ​​hele cel te verplaatsen (bijvoorbeeld sperma, Euglena). Indien aanwezig, heeft de cel slechts één flagellum of enkele flagella. Wanneer trilhaartjes (enkelvoud = cilium) aanwezig zijn, zijn ze echter talrijk en strekken ze zich uit over het gehele oppervlak van het plasmamembraan. Het zijn korte, haarachtige structuren die worden gebruikt om hele cellen te verplaatsen (zoals paramecium) of om stoffen langs het buitenoppervlak van de cel te verplaatsen (bijvoorbeeld de trilharen van cellen die de eileiders bekleden die de eicel naar de baarmoeder verplaatsen, of trilhaartjes die de cellen van de luchtwegen bekleden die deeltjes naar de keel verplaatsen die door slijm zijn opgesloten).

Het endomembraansysteem

Het endomembraansysteem (endo = binnen) is een groep membranen en organellen (Figuur 3.13) in eukaryote cellen die samenwerken om lipiden en eiwitten te modificeren, te verpakken en te transporteren. Het omvat de nucleaire envelop, lysosomen en blaasjes, het endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat, die we binnenkort zullen bespreken. Hoewel technisch niet binnenin de cel, het plasmamembraan is opgenomen in het endomembraansysteem omdat het, zoals je zult zien, interageert met de andere endomembraneuze organellen.

De kern

Meestal is de kern het meest prominente organel in een cel (Figuur 3.7). De kern (meervoud = kernen) herbergt het DNA van de cel in de vorm van chromatine en stuurt de synthese van ribosomen en eiwitten aan. Laten we het in meer detail bekijken (Figuur 3.10).

De nucleaire envelop is een dubbelmembraanstructuur die het buitenste deel van de kern vormt (Figuur 3.10). Zowel de binnen- als buitenmembranen van de nucleaire envelop zijn fosfolipide dubbellagen.

De nucleaire envelop is doorspekt met poriën die de doorgang van ionen, moleculen en RNA tussen het nucleoplasma en het cytoplasma regelen.

Om chromatine te begrijpen, is het nuttig om eerst naar chromosomen te kijken. Chromosomen zijn structuren in de kern die bestaan ​​uit DNA, het erfelijk materiaal en eiwitten. Deze combinatie van DNA en eiwitten wordt chromatine genoemd. In eukaryoten zijn chromosomen lineaire structuren. Elke soort heeft een specifiek aantal chromosomen in de kern van zijn lichaamscellen. Bij mensen is het aantal chromosomen bijvoorbeeld 46, terwijl bij fruitvliegen het aantal chromosomen acht is.

Chromosomen zijn alleen zichtbaar en van elkaar te onderscheiden als de cel zich gaat delen. Wanneer de cel zich in de groei- en onderhoudsfase van zijn levenscyclus bevindt, lijken de chromosomen op een afgewikkelde, verwarde bos draden.

We weten al dat de kern de synthese van ribosomen stuurt, maar hoe doet hij dit? Sommige chromosomen hebben stukjes DNA die coderen voor ribosomaal RNA. Een donker kleurend gebied in de kern, de nucleolus (meervoud = nucleoli) genoemd, aggregeert het ribosomale RNA met bijbehorende eiwitten om de ribosomale subeenheden samen te stellen die vervolgens door de kernporiën naar het cytoplasma worden getransporteerd.

Het endoplasmatisch reticulum

Het endoplasmatisch reticulum (ER) (Figuur 3.13) is een reeks onderling verbonden vliezige tubuli die gezamenlijk eiwitten modificeren en lipiden synthetiseren. Deze twee functies worden echter uitgevoerd in afzonderlijke gebieden van het endoplasmatisch reticulum: respectievelijk het ruwe endoplasmatisch reticulum en het gladde endoplasmatisch reticulum.

Het holle gedeelte van de ER-tubuli wordt het lumen of de cisternale ruimte genoemd. Het membraan van het ER, een fosfolipide dubbellaag ingebed met eiwitten, is continu met de nucleaire envelop.

Het ruwe endoplasmatisch reticulum (RER) wordt zo genoemd omdat de ribosomen die aan het cytoplasmatische oppervlak zijn bevestigd, het een bezaaid uiterlijk geven wanneer het door een elektronenmicroscoop wordt bekeken.

De ribosomen synthetiseren eiwitten terwijl ze aan het ER zijn gehecht, wat resulteert in de overdracht van hun nieuw gesynthetiseerde eiwitten naar het lumen van het RER waar ze modificaties ondergaan, zoals vouwen of toevoeging van suikers. Het RER maakt ook fosfolipiden voor celmembranen.

Als de fosfolipiden of gemodificeerde eiwitten niet bestemd zijn om in het RER te blijven, worden ze verpakt in blaasjes en vanuit het RER getransporteerd door uit het membraan te ontluiken (Figuur 3.13). Aangezien het RER betrokken is bij het modificeren van eiwitten die door de cel worden uitgescheiden, is het overvloedig aanwezig in cellen die eiwitten afscheiden, zoals de lever.

Het gladde endoplasmatisch reticulum (SER) loopt door met het RER, maar heeft weinig of geen ribosomen op het cytoplasmatische oppervlak (zie figuur 3.7). De functies van de SER omvatten de synthese van koolhydraten, lipiden (inclusief fosfolipiden) en steroïde hormonen, ontgifting van medicijnen en vergiftigt het alcoholmetabolisme en opslag van calciumionen.

Het Golgi-apparaat

We hebben al vermeld dat blaasjes uit de ER kunnen ontluiken, maar waar gaan de blaasjes heen? Voordat ze hun eindbestemming bereiken, moeten de lipiden of eiwitten in de transportblaasjes worden gesorteerd, verpakt en gelabeld, zodat ze op de juiste plaats terechtkomen. Het sorteren, labelen, verpakken en distribueren van lipiden en eiwitten vindt plaats in het Golgi-apparaat (ook wel het Golgi-lichaam genoemd), een reeks afgeplatte vliezige zakjes (Figuur 3.11).

Het Golgi-apparaat heeft een ontvangend vlak nabij het endoplasmatisch reticulum en een vrijgevend vlak aan de kant weg van het ER, in de richting van het celmembraan. De transportblaasjes die zich vanuit het ER vormen, reizen naar het ontvangende vlak, smelten ermee samen en lozen hun inhoud in het lumen van het Golgi-apparaat. Terwijl de eiwitten en lipiden door de Golgi reizen, ondergaan ze verdere modificaties. De meest voorkomende wijziging is de toevoeging van korte ketens van suikermoleculen. De nieuw gemodificeerde eiwitten en lipiden worden vervolgens gelabeld met kleine moleculaire groepen zodat ze naar hun juiste bestemming kunnen worden geleid.

Ten slotte worden de gemodificeerde en gelabelde eiwitten verpakt in blaasjes die ontluiken aan de andere kant van de Golgi. Terwijl sommige van deze blaasjes, transportblaasjes, hun inhoud in andere delen van de cel afzetten waar ze zullen worden gebruikt, smelten andere, secretoire blaasjes, met het plasmamembraan en laten hun inhoud buiten de cel vrij.

De hoeveelheid Golgi in verschillende celtypen illustreert opnieuw dat vorm de functie binnen cellen volgt. Cellen die veel secretoire activiteit uitoefenen (zoals cellen van de speekselklieren die spijsverteringsenzymen afscheiden of cellen van het immuunsysteem die antilichamen afscheiden) hebben een overvloedig aantal Golgi.

In plantencellen heeft de Golgi een extra rol bij het synthetiseren van polysachariden, waarvan sommige in de celwand worden opgenomen en waarvan sommige in andere delen van de cel worden gebruikt.

Lysosomen

In dierlijke cellen zijn de lysosomen de "vuilnisverwijdering" van de cel. Spijsverteringsenzymen in de lysosomen helpen bij de afbraak van eiwitten, polysachariden, lipiden, nucleïnezuren en zelfs versleten organellen. In eencellige eukaryoten zijn lysosomen belangrijk voor de vertering van het voedsel dat ze binnenkrijgen en het recyclen van organellen. Deze enzymen zijn actief bij een veel lagere pH (zuurder) dan die in het cytoplasma. Veel reacties die in het cytoplasma plaatsvinden, kunnen niet plaatsvinden bij een lage pH, dus het voordeel van het compartimenteren van de eukaryote cel in organellen is duidelijk.

Lysosomen gebruiken ook hun hydrolytische enzymen om ziekteverwekkende organismen te vernietigen die de cel zouden kunnen binnendringen. Een goed voorbeeld hiervan komt voor in een groep witte bloedcellen, macrofagen genaamd, die deel uitmaken van het immuunsysteem van uw lichaam. In een proces dat bekend staat als fagocytose, dringt een deel van het plasmamembraan van de macrofaag naar binnen (vouwt zich in) en overspoelt een pathogeen. Het geïnvagineerde deel, met de ziekteverwekker erin, knijpt zichzelf af van het plasmamembraan en wordt een blaasje. Het blaasje versmelt met een lysosoom. De hydrolytische enzymen van het lysosoom vernietigen vervolgens de ziekteverwekker (Figuur 3.12).

Blaasjes en vacuolen

Blaasjes en vacuolen zijn membraangebonden zakjes die functioneren bij opslag en transport. Vacuolen zijn iets groter dan blaasjes en het membraan van een vacuole versmelt niet met de membranen van andere cellulaire componenten. Blaasjes kunnen fuseren met andere membranen in het celsysteem. Bovendien kunnen enzymen in plantenvacuolen macromoleculen afbreken.

Visuele verbinding

Waarom doet de cis gezicht van de Golgi niet naar het plasmamembraan gericht is?

Ribosomen

Ribosomen zijn de cellulaire structuren die verantwoordelijk zijn voor de eiwitsynthese. Wanneer bekeken door een elektronenmicroscoop, verschijnen vrije ribosomen als clusters of enkele kleine stippen die vrij in het cytoplasma zweven. Ribosomen kunnen ofwel aan de cytoplasmatische zijde van het plasmamembraan ofwel aan de cytoplasmatische zijde van het endoplasmatisch reticulum worden bevestigd (Figuur 3.7). Elektronenmicroscopie heeft aangetoond dat ribosomen bestaan ​​uit grote en kleine subeenheden. Ribosomen zijn enzymcomplexen die verantwoordelijk zijn voor de eiwitsynthese.

Omdat eiwitsynthese essentieel is voor alle cellen, worden ribosomen in praktisch elke cel aangetroffen, hoewel ze kleiner zijn in prokaryotische cellen. Ze zijn bijzonder overvloedig aanwezig in onrijpe rode bloedcellen voor de synthese van hemoglobine, dat fungeert bij het transport van zuurstof door het lichaam.

Mitochondriën

Mitochondriën (enkelvoud = mitochondrion) worden vaak de "krachtcentrales" of "energiefabrieken" van een cel genoemd omdat ze verantwoordelijk zijn voor het maken van adenosinetrifosfaat (ATP), het belangrijkste energiedragende molecuul van de cel. De vorming van ATP door de afbraak van glucose staat bekend als cellulaire ademhaling. Mitochondriën zijn ovale, dubbelmembraan organellen (Figuur 3.14) die hun eigen ribosomen en DNA hebben. Elk membraan is een fosfolipide dubbellaag ingebed met eiwitten. De binnenste laag heeft plooien, cristae genaamd, die het oppervlak van het binnenmembraan vergroten. Het gebied omgeven door de plooien wordt de mitochondriale matrix genoemd. De cristae en de matrix hebben verschillende rollen bij cellulaire ademhaling.

In overeenstemming met ons thema van vormvolgende functie, is het belangrijk erop te wijzen dat spiercellen een zeer hoge concentratie mitochondriën hebben, omdat spiercellen veel energie nodig hebben om samen te trekken.

Peroxisomen

Peroxisomen zijn kleine, ronde organellen omsloten door enkele membranen. Ze voeren oxidatiereacties uit die vetzuren en aminozuren afbreken. Ze ontgiften ook veel vergiften die het lichaam kunnen binnendringen. Alcohol wordt ontgift door peroxisomen in levercellen. Een bijproduct van deze oxidatiereacties is waterstofperoxide, H2O2, die zich in de peroxisomen bevindt om te voorkomen dat de chemische stof schade toebrengt aan cellulaire componenten buiten het organel. Waterstofperoxide wordt veilig afgebroken door peroxisomale enzymen in water en zuurstof.

Dierlijke cellen versus plantencellen

Ondanks hun fundamentele overeenkomsten zijn er enkele opvallende verschillen tussen dierlijke en plantaardige cellen (zie tabel 3.1). Dierlijke cellen hebben centriolen, centrosomen (besproken onder het cytoskelet) en lysosomen, terwijl plantencellen dat niet hebben. Plantencellen hebben een celwand, chloroplasten, plasmodesmata en plastiden die worden gebruikt voor opslag, en een grote centrale vacuole, terwijl dierlijke cellen dat niet hebben.

De celwand

In figuur 3.7B, het diagram van een plantencel, zie je een structuur buiten het plasmamembraan die de celwand wordt genoemd. De celwand is een stijve omhulling die de cel beschermt, structurele ondersteuning biedt en vorm geeft aan de cel. Schimmel- en protistencellen hebben ook celwanden.

Terwijl het hoofdbestanddeel van prokaryotische celwanden peptidoglycaan is, is het belangrijkste organische molecuul in de plantencelwand cellulose, een polysacharide die bestaat uit lange, rechte ketens van glucose-eenheden. Wanneer voedingsinformatie verwijst naar voedingsvezels, verwijst dit naar het cellulosegehalte van voedsel.

Chloroplasten

Net als mitochondriën hebben chloroplasten ook hun eigen DNA en ribosomen. Chloroplasten werken bij de fotosynthese en zijn te vinden in eukaryote cellen zoals planten en algen. Bij fotosynthese worden koolstofdioxide, water en lichtenergie gebruikt om glucose en zuurstof te maken. Dit is het grote verschil tussen planten en dieren: planten (autotrofen) kunnen hun eigen voedsel maken, zoals glucose, terwijl dieren (heterotrofen) voor hun organische verbindingen of voedselbron op andere organismen moeten vertrouwen.

Net als mitochondriën hebben chloroplasten buiten- en binnenmembranen, maar binnen de ruimte die wordt ingesloten door het binnenmembraan van een chloroplast, bevindt zich een reeks onderling verbonden en gestapelde, met vloeistof gevulde membraanzakjes die thylakoïden worden genoemd (Figuur 3.15). Elke stapel thylakoïden wordt een granum genoemd (meervoud = grana). De vloeistof die wordt omsloten door het binnenmembraan en de grana omgeeft, wordt het stroma genoemd.

De chloroplasten bevatten een groen pigment genaamd chlorofyl, dat de energie van zonlicht opvangt voor fotosynthese. Net als plantencellen hebben fotosynthetische protisten ook chloroplasten. Sommige bacteriën voeren ook fotosynthese uit, maar ze hebben geen chloroplasten. Hun fotosynthetische pigmenten bevinden zich in het thylakoïde membraan in de cel zelf.

Evolutie verbinding

Endosymbiose

We hebben vermeld dat zowel mitochondriën als chloroplasten DNA en ribosomen bevatten. Heb je je afgevraagd waarom? Sterk bewijs wijst op endosymbiose als de verklaring.

Symbiose is een relatie waarin organismen van twee afzonderlijke soorten in nauwe samenwerking leven en typisch specifieke aanpassingen aan elkaar vertonen. Endosymbiose (endo-= binnen) is een relatie waarin het ene organisme in het andere leeft. Endosymbiotische relaties zijn er in de natuur. Microben die vitamine K produceren, leven in de menselijke darm. Deze relatie is gunstig voor ons omdat we geen vitamine K kunnen synthetiseren. Het is ook gunstig voor de microben omdat ze worden beschermd tegen andere organismen en een stabiele habitat en overvloedig voedsel krijgen door in de dikke darm te leven.

Wetenschappers hebben lang gemerkt dat bacteriën, mitochondriën en chloroplasten qua grootte vergelijkbaar zijn. We weten ook dat mitochondriën en chloroplasten DNA en ribosomen hebben, net als bacteriën. Wetenschappers zijn van mening dat gastheercellen en bacteriën een wederzijds voordelige endosymbiotische relatie vormden wanneer de gastheercellen aerobe bacteriën en cyanobacteriën binnenkrijgden, maar ze niet vernietigden. Door evolutie werden deze opgenomen bacteriën meer gespecialiseerd in hun functies, waarbij de aerobe bacteriën mitochondriën werden en de fotosynthetische bacteriën chloroplasten.

De centrale vacuole

Eerder noemden we vacuolen als essentiële componenten van plantencellen. Als je naar figuur 3.7 kijkt, zie je dat plantencellen elk een grote, centrale vacuole hebben die het grootste deel van de cel in beslag neemt. De centrale vacuole speelt een sleutelrol bij het reguleren van de waterconcentratie van de cel in veranderende omgevingscondities. In plantencellen zorgt de vloeistof in de centrale vacuole voor turgordruk, de uitgaande druk die wordt veroorzaakt door de vloeistof in de cel. Is het je ooit opgevallen dat als je een plant een paar dagen vergeet water te geven, hij verwelkt? Dat komt omdat naarmate de waterconcentratie in de bodem lager wordt dan de waterconcentratie in de plant, het water uit de centrale vacuolen en het cytoplasma de bodem in gaat. Naarmate de centrale vacuole krimpt, verlaat deze de celwand niet ondersteund. Dit verlies van steun aan de celwanden van een plant resulteert in het verwelkte uiterlijk. Bovendien heeft deze vloeistof een zeer bittere smaak, wat consumptie door insecten en dieren ontmoedigt. De centrale vacuole fungeert ook om eiwitten op te slaan in zich ontwikkelende zaadcellen.

Extracellulaire matrix van dierlijke cellen

De meeste dierlijke cellen geven materialen af ​​in de extracellulaire ruimte. De primaire componenten van deze materialen zijn glycoproteïnen en het eiwit collageen. Samen worden deze materialen de extracellulaire matrix genoemd (Figuur 3.16). Niet alleen houdt de extracellulaire matrix de cellen bij elkaar om een ​​weefsel te vormen, maar het zorgt er ook voor dat de cellen in het weefsel met elkaar kunnen communiceren.

Bloedstolling geeft een voorbeeld van de rol van de extracellulaire matrix in celcommunicatie. Wanneer de cellen die een bloedvat bekleden beschadigd zijn, vertonen ze een eiwitreceptor die weefselfactor wordt genoemd. Wanneer weefselfactor bindt met een andere factor in de extracellulaire matrix, zorgt het ervoor dat bloedplaatjes aan de wand van het beschadigde bloedvat hechten, stimuleert aangrenzende gladde spiercellen in het bloedvat om samen te trekken (waardoor het bloedvat wordt vernauwd), en initieert een reeks van stappen die de bloedplaatjes stimuleren om stollingsfactoren te produceren.

Intercellulaire knooppunten

Cellen kunnen ook met elkaar communiceren door direct contact, intercellulaire verbindingen genoemd. Er zijn enkele verschillen in de manier waarop plantaardige en dierlijke cellen dit doen. Plasmodesmata (enkelvoud = plasmodesma) zijn verbindingen tussen plantencellen, terwijl dierlijke celcontacten tight en gap junctions en desmosomen omvatten.

Over het algemeen kunnen lange stukken plasmamembranen van naburige plantencellen elkaar niet raken omdat ze worden gescheiden door de celwanden die elke cel omringen. Plasmodesmata zijn talrijke kanalen die tussen de celwanden van aangrenzende plantencellen passeren, hun cytoplasma verbinden en ervoor zorgen dat signaalmoleculen en voedingsstoffen van cel naar cel worden getransporteerd (Figuur 3.17een).

Een tight junction is een waterdichte afsluiting tussen twee aangrenzende dierlijke cellen (Figuur 3.17B). Eiwitten houden de cellen stevig tegen elkaar aan. Deze hechte hechting voorkomt dat materialen tussen de cellen lekken. Strakke kruispunten worden meestal aangetroffen in het epitheelweefsel dat de interne organen en holtes bekleedt en het grootste deel van de huid vormt. De tight junctions van de epitheelcellen die de urineblaas bekleden, voorkomen bijvoorbeeld dat urine in de extracellulaire ruimte lekt.

Ook worden alleen in dierlijke cellen desmosomen gevonden, die werken als puntlassen tussen aangrenzende epitheelcellen (Figuur 3.17C). Ze houden cellen bij elkaar in een velachtige formatie in organen en weefsels die zich uitstrekken, zoals de huid, het hart en de spieren.

Gap junctions in dierlijke cellen zijn als plasmodesmata in plantencellen in die zin dat het kanalen zijn tussen aangrenzende cellen die het transport van ionen, voedingsstoffen en andere stoffen mogelijk maken die cellen in staat stellen te communiceren (Figuur 3.17NS). Structureel verschillen gap junctions en plasmodesmata echter.

celcomponent Functie Aanwezig in Prokaryoten? Aanwezig in dierlijke cellen? Aanwezig in plantencellen?
Plasma membraan Scheidt de cel van de externe omgeving regelt de doorgang van organische moleculen, ionen, water, zuurstof en afvalstoffen in en uit de cel Ja Ja Ja
Cytoplasma Biedt structuur aan de celplaats van veel metabole reacties, medium waarin organellen worden gevonden Ja Ja Ja
nucleoïde Locatie van DNA Ja Nee Nee
Kern Celorganel dat DNA herbergt en de synthese van ribosomen en eiwitten aanstuurt Nee Ja Ja
ribosomen Eiwitsynthese Ja Ja Ja
mitochondriën ATP-productie/cellulaire ademhaling Nee Ja Ja
peroxisomen Oxideert en breekt vetzuren en aminozuren af ​​en ontgift gifstoffen Nee Ja Ja
Blaasjes en vacuolen Opslag en transport spijsverteringsfunctie in plantencellen Nee Ja Ja
Centrosoom Niet-gespecificeerde rol bij celdeling in dierlijke cellen die het centrum van microtubuli in dierlijke cellen organiseren Nee Ja Nee
lysosomen Vertering van macromoleculen recycling van versleten organellen Nee Ja Nee
celwand Bescherming, structurele ondersteuning en behoud van celvorm Ja, voornamelijk peptidoglycaan in bacteriën, maar niet in Archaea Nee Ja, voornamelijk cellulose
Chloroplasten Fotosynthese Nee Nee Ja
Endoplasmatisch reticulum Wijzigt eiwitten en synthetiseert lipiden Nee Ja Ja
Golgi-apparaat Wijzigt, sorteert, labelt, verpakt en distribueert lipiden en eiwitten Nee Ja Ja
cytoskelet Behoudt de vorm van de cel, zet organellen vast op specifieke posities, laat cytoplasma en blaasjes in de cel bewegen en stelt eencellige organismen in staat onafhankelijk te bewegen Ja Ja Ja
Flagella Cellulaire voortbeweging Sommige Sommige Nee, behalve wat plantensperma.
trilhaar Cellulaire voortbeweging, beweging van deeltjes langs het extracellulaire oppervlak van plasmamembraan en filtratie Nee Sommige Nee

Deze tabel geeft de componenten van prokaryotische en eukaryote cellen en hun respectieve functies.


Achtergrond

De epitheliale-naar-mesenchymale overgang (EMT) vindt plaats wanneer nauw verbonden epitheelcellen een migrerend mesenchymaal fenotype krijgen tijdens embryonale ontwikkeling, wondgenezing en ziekte [1, 2]. Historisch gezien is EMT in verband gebracht met een grondige reorganisatie van het cytoskelet om cel-celaanhechting te verzwakken en cel-matrixadhesie te versterken [3], en werd voor het eerst waargenomen door Elizabeth Hay als reactie op leerzame aanwijzingen uit de extracellulaire matrix [4] . Tumorinvasie en resistentie tegen geneesmiddelen zijn inderdaad geassocieerd met ontregelde extracellulaire matrix, met afwijkende matrixafzetting en hermodellering resulterend in verhoogde stijfheid [5]. Cytoskeletelementen zijn goed ingeburgerd als EMT-biomarkers, met name intermediaire filamenten zoals keratine (in epitheelcellen) en vimentine (in mesenchymale cellen) [6]. Desalniettemin blijft het functionele belang van EMT en bijbehorende veranderingen in het cytoskelet slecht begrepen, met name voor de progressie van kanker bij mensen [7]. Recente innovaties op het gebied van bio-engineering hebben biomimetische testen en meetinstrumenten met een hogere resolutie mogelijk gemaakt om EMT op het niveau van een enkele cel in ruimte en tijd op te helderen.

Klassieke celmigratie-assays zijn gebaseerd op experimentele omstandigheden die kunstmatig kunnen leiden tot epitheliale of mesenchymale toestanden [8]. Zo vinden bijvoorbeeld "wondgenezing"-assays plaats op harde weefselkweekkunststof, gebaseerd op de collectieve migratie van nauw verbonden epitheliale monolaaglagen [9]. Als alternatief zijn Transwell (Boyden) -assays gebaseerd op een plastic microporeus membraan, dat cellen als individuele cellen moeten doorlopen, waardoor collectieve migratie wordt belemmerd [10]. Driedimensionale (3D) kweekomstandigheden, gebaseerd op het inbedden van cellen in een conform biomateriaal, vormen een veelbelovend alternatief voor het onderzoeken van invasie en EMT [11, 12]. Met name borstepitheelcellen gekweekt in gereconstitueerd basaalmembraan (d.w.z. Matrigel) recapituleren gedifferentieerde weefselachtige architecturen met lumen en cel-celverbindingen, die progressief desorganiseren en verspreiden als reactie op afwijkende micro-omgevingssignalen [13]. Meer recentelijk hebben gemanipuleerde biomaterialen [14] en microgefabriceerde apparaten [15] gezorgd voor meer controle over materiaalstijfheid, afbreekbaarheid en architectuur. Deze gecontroleerde micro-omgevingsomstandigheden kunnen nieuwe inzichten verschaffen in hoe cel-matrix-interacties collectieve en individuele migratiefenotypes mediëren.

Fenotypische heterogeniteit en plasticiteit zijn bepalende kenmerken van kankercellen en blijven een uitdaging om te onderzoeken met behulp van bulkanalyses op eindpunten [16]. Er wordt aangenomen dat EMT zelden voorkomt in een kleine subpopulatie van cellen, wat over het hoofd kan worden gezien zonder uitgebreide metingen van één cel. Live-celbeeldvorming met hoge ruimtelijke en temporele resolutie kan nieuwe inzichten mogelijk maken in moleculaire en cellulaire dynamiek tijdens invasie en EMT [17]. Uitsteeksels van het cytoskelet zijn bijvoorbeeld bijzonder belangrijk voor gerichte migratie, en cellen kunnen hun omringende ECM aanzienlijk vervormen [18]. Op hun beurt kunnen cellen substantiële vervormingen ondergaan om ECM te doorkruisen, wat kan worden vergemakkelijkt door een meer meegaand cytoskelet. Verder is de hypothese geopperd dat kankercellen significant zachter zijn dan hun niet-getransformeerde tegenhangers, vooral in de context van stamachtige toestanden die vimentine tot expressie brengen [19]. Over het algemeen is er een verhoogde interesse in subcellulaire resolutie van cel-matrix-adhesies [20], evenals collectief gedrag dat wordt gemedieerd door cel-celverbindingen [21].

Hier bespreken we recente ontwikkelingen in EMT en het cytoskelet bij kanker (met name intermediaire filamenten) mogelijk gemaakt door biomimetische materialen en meettechnologieën met een hogere resolutie. We richten ons op publicaties van de afgelopen 5 jaar en leggen de nadruk op mogelijke verbanden tussen de mechanobiologie van het intracellulaire cytoskelet en de extracellulaire matrix. Voor uitgebreidere behandelingen van EMT bij kanker verwijzen we lezers naar andere recente recensies over dit onderwerp [1,2,3, 7, 22]. We geven eerst een korte inleiding in de biochemie en mechanica van het cytoskelet, evenals operationele definities voor EMT. Vervolgens beschouwen we EMT-achtig gedrag tijdens collectieve en individuele migratie op vlakke substraten. We beschouwen verder de dynamiek van vimentine en EMT in 2D-monolaag- en 3D-matrixcultuur. Vervolgens gaan we in op het effect van submicron-topografieën ("2.5D") en een conforme 3D-matrix op migratie en EMT. Ten slotte geven we ons perspectief op EMT en kankermetastase, evenals toekomstige richtingen voor het veld.


Het cytoplasma

Het cytoplasma omvat de inhoud van een cel tussen het plasmamembraan en de nucleaire envelop (een structuur die binnenkort wordt besproken). Het bestaat uit organellen die zijn gesuspendeerd in het gelachtige cytosol, het cytoskelet en verschillende chemicaliën. Hoewel het cytoplasma voor 70 tot 80 procent uit water bestaat, heeft het een halfvaste consistentie, die afkomstig is van de eiwitten erin. Eiwitten zijn echter niet de enige organische moleculen die in het cytoplasma worden aangetroffen. Glucose en andere eenvoudige suikers, polysachariden, aminozuren, nucleïnezuren, vetzuren en derivaten van glycerol worden daar ook gevonden. Ions of sodium, potassium, calcium, and many other elements are also dissolved in the cytoplasm. Many metabolic reactions, including protein synthesis, take place in the cytoplasm.


Achtergrond

Mechanoreceptors contain compliant elements, termed “gating springs,” that transfer macroscopic stimuli impinging on the cells into microscopic stimuli that open the mechanosensitive channels. Evidence for gating springs comes from mechanical experiments they have not been identified molecularly or ultrastructurally.

Resultaten

We show that the filamentous structures that connect the plasma membrane to the microtubules are compliant structural elements in the mechanoreceptive organelle of fly campaniform receptors. These filaments colocalize with the ankyrin-repeat domain of the transient receptor potential (TRP) channel NOMPC. In addition, they resemble the purified ankyrin-repeat domain in size and shape. Most importantly, these filaments are nearly absent in nompC mutants and can be rescued by the nompC gen. Finally, mechanical modeling suggests that the filaments provide most of the compliance in the distal tip of the cell, thought to be the site of mechanotransduction.

Conclusies

Our results provide strong evidence that the ankyrin-repeat domains of NOMPC structurally contribute to the membrane-microtubule connecting filaments. These filaments, as the most compliant element in the distal tip, are therefore good candidates for the gating springs.


Discussie

The flattened nucleus is a common feature of cultured cells, but the mechanisms by which it is flattened have remained obscure. There is mounting evidence that the cytoskeleton exerts forces on the nucleus to position it (20,46�). In this study, however, we show that as long as the cell was able to spread, inhibiting actomyosin forces, microtubule-based forces and intermediate filaments, as well as the LINC complex, did not prevent nuclear flattening. Remarkably, nuclear height correlated tightly with the degree of cell spreading. Independent of the type of cytoskeletal force perturbed, the nucleus is flat unless the perturbation prevents initial cell spreading, or rounds a spread cell.

This robust feature of nuclear shaping suggests that it is the dynamic deformation of the cell shape itself that causes nuclear flattening consistent with our previous results reporting reversible nuclear deformation caused by proximal cell protrusions in migrating cells (49). The fact that the nuclear apex collapses during the nuclear flattening, opening up a significant distance between the cell apex and the nuclear apex (on the order of a few microns), argues against the cell cortex directly compressing the nucleus downward. The near complete absence of apical actomyosin bundles argues against any explanation for flattening that requires a downward compressive force on the nuclear apex by large actomyosin bundles (see, for example, (50)). That apical fibers do not participate in the flattening process does not argue against later distortion of the nucleus by fully developed actomyosin bundles as reported by others (51).

Neither intermediate filaments nor microtubules are required for flattening. Finally, disruption of the LINC complex via KASH4 overexpression failed to prevent nuclear flattening. It slowed the rate of cell spreading, suggesting perhaps that a coupled nuclear-cytoskeleton is required for rapid F-actin polymerization, but it did not prevent flattening over longer times. Given that myosin activity, microtubules and vimentin intermediate filaments are not required, that the LINC complex is dispensable is perhaps not surprising. We have shown before that KASH4 overexpression results in rounded nuclear shapes in cells on polyacrylamide gels (52). This difference may be because of possibly different cell spreading dynamics on gels versus glass. We note that the cell spreading area in KASH4 cells was lower on gels, suggesting that the relationship between nuclear flattening and cell spreading is conserved on other types of surfaces.

Our computational model demonstrates that expansive/compressive stresses arising from movement of the cell boundaries and centripetal flow of cytoskeletal network from the cell membrane is sufficient to explain translation of the nucleus toward the substratum and subsequent flattening against the substratum. The fact that the experimentally observed flattening dynamics could be closely reproduced using one constitutive equation (Eq. 1), a simple model for cell mechanics, and one fitted parameter (veen) provides strong support for the validity of the model assumptions. Moreover, the model successfully predicts a number of experimental findings: the approach to a steady-state flattened nuclear shape despite continued cell spreading, nuclear flattening in the absence of actomyosin tension, increased nuclear flattening in the absence of lamin A/C, and the cessation of nuclear flattening upon the cessation of cell spreading.

Consistent with the assumption that the nucleus is under tension, we found that the volume of the nucleus decreased in myosin-inhibited cells. However, our experiments show that flattening is not a consequence of tension. As explained by the computational model, flattening can instead arise from the motion of the cell boundary transmitting stresses to the nuclear surface because the intervening cytoskeletal network resists expansion or compression. As a result, the nuclear shape changes tend to mimic changes in cell shape during cell spreading.

Interestingly, the presence of actomyosin contraction in normal cells does not alter the dynamics of nuclear shape changes during cell spreading. In the presence of contraction, the net stress on the nuclear surface in the absence of any F-actin assembly from the membrane (such as in serum-starved cells) is likely tensile. However, even if this stress in the network is net compressive (such as when myosin is inhibited), the differential stresses between apex and sides of the nucleus that drive nuclear shape dynamics during cell spreading are predicted to be similar ( Fig.ꀐ C).

In summary, our results point to a surprisingly simple mechanical system in cells for establishing nuclear shapes. Our computational model suggests that nuclear shape changes result from transmission of stress from the moving cell boundary to the nuclear surface because of frictional resistance to expansion/compression of the intervening cytoskeletal network. Nuclear shaping are thus driven by cell shape changes.


Discussie

The present results demonstrated that both CD and CB prevented fusion of nucleoli in activated mouse oocytes, suggesting that the microfilaments are essential for nucleolar fusion. Brangwynne et al. [ 28] showed that nucleoli in germinal vesicles (GVs) of Xenopus laevis oocytes were mostly isotropic in shape, much like liquid droplets, and that two or more of the spherical nucleoli often fused with each other. In CD-treated oocytes, however, nucleoli showed irregular shapes and did not relax to spheres, and fusion of these nucleoli was frequently incomplete. According to these authors, actin can act as a scaffold, giving both structure and stability to the nucleoli, and the disruption of actin leads to loss of liquid-like behavior. Further observations made by Feric and Brangwynne [ 29] showed that GVs contained an elastic F-actin scaffold that mechanically stabilized these large nuclei against gravitational forces, and upon actin disruption, nucleoli and histone locus bodies underwent gravitational sedimentation and fusion. Together, these data suggest that actin forms not only an intranucleolus scaffold that maintains a spherical shape of nucleoli but also an internucleoli scaffold that supports an active movement of the nucleoli both the spherical shape and the active movement of nucleoli are essential for their normal fusion. Furthermore, a number of reports have revealed nuclear localization of myosins as well as actin and actin-binding proteins [ 30], although their concentration is found lower than that in the cytoplasm [ 31]. The discovery of actin as a component of the transcription apparatus, chromatin-remodeling complexes, as well as RNA processing machines, implies important intranuclear roles for actin in the readout of genetic information [ 18].

This study demonstrated that whereas acrylamide inhibits nucleolar fusion efficiently, IDPN shows no effect when used at various concentrations (data not shown). IDPN is a neurotoxin that segregates neurofilaments from microtubules and retards neurofilament transport [ 32]. It is known that most types of intermediate filaments are cytoplasmic, but one type, the lamins, is nuclear [ 33]. A review of published papers indicated that whereas IDPN had been used mostly to destroy vimentin [ 34– 36], acrylamide was often used to disrupt not only vimentin [ 37] but also keratin [ 38]. Immunofluorescence microscopy revealed keratin but not vimentin in mouse oocytes and early embryos [ 39– 42]. Lamins were found on all pronuclei during mouse fertilization [ 43]. Furthermore, ultrastructural analyses showed that the increase in chromatin motion induced by acrylamide was associated with a significant decrease in the thickness of the nuclear lamina [ 13]. Taken together, we proposed that nuclear lamins might be the intermediate filaments that supported the fusion of nucleoli.

Newly ovulated mouse oocytes are arrested at the metaphase II stage and they resume meiosis, extrude the Pb2, and form pronuclei upon fertilization or activation stimulus. Verlhac et al. [ 44] reported that Pb2 began to extrude at about 45 min, pronuclei were clearly visible 4 h later, and 70% of the eggs reached the first mitotic metaphase by 14 h after ethanol activation of mouse oocytes. Our previous study [ 9] showed that small nucleoli began to take shape at about 4 h after activation stimulus, and it took about 1.5 h for them to fuse with each other into a single large nucleoli. The fused nucleoli (NPB) lasted for about 10 h before disappearance. The pronuclei appeared and disappeared at the same time as did the nucleoli. Furthermore, no difference in the fusion of nucleoli was observed between male and female pronuclei in fertilized zygotes. In the present study, when mouse oocytes were treated with CD or acrylamide for different times at different intervals after the onset of Sr 2+ activation, nucleolar fusion was successfully prevented only when the drugs were present from the second or third to fifth hour after the onset of Sr 2+ treatment. This drug-sensitive window fell well within the temporal window for nucleolar fusion in activated mouse oocytes reported by Li et al. [ 9]. Thus, the results further confirmed that both microfilaments and intermediate filaments were involved in the fusion of nucleoli.

The present results showed that although treatment of activated mouse oocytes with microtubule inhibitors demecolcine or nocodazole prevented pronuclear formation, it did not affect fusion of nucleoli, suggesting that microtubules are not involved in the regulation of nucleolar fusion. Despite the best efforts, we found no report on the presence of microtubules in the nucleus. According to a recent review by Simon and Wilson [ 45], the metazoan nucleoskeleton includes nuclear pore-linked filaments, A-type and B-type lamin intermediate filaments, nuclear mitotic apparatus networks, spectrins, titin, “unconventional” polymers of actin, and at least 10 different myosin and kinesin motors. It is known that microtubules function mainly in the cytoplasm, including the movement of secretory vesicles, organelles, metaphase chromosomes, and intracellular substances [ 46]. Although microtubules were found to influence gene expression, the effect was caused by their action within the cytoplasm. For example, although cold-induced depolymerization of microtubules led to I kappa B degradation and activation of NF-kappa B, the activated factor remained in the cytoplasm and translocated to the nucleus only upon warming to 37°C [ 47].

In the present study, whereas continuous incubation with demecolcine prevented pronuclear formation, normal pronuclei formed when demecolcine was excluded during the first hour of activation treatment. Xue et al. [ 48] also observed that the influence of microtubules on nuclear assembly was restricted to a limited time window. Thus, if nocodazole treatment was delayed by 30 min, microtubule depolymerization no longer rescued the effects of dppa2 depletion on nuclear shape. Although microtubule assembly was found essential for the formation of the male and female pronuclei during mouse but not sea urchin fertilization [ 22], the mechanisms are not known. Our Western analysis at 1 h of activation treatment showed that whereas the MPF activity dropped dramatically in the absence of demecolcine, it remained high in the presence of demecolcine. Previous studies had also observed a dramatic drop of MPF activity within 1 h after regular activation of mouse oocytes [ 9, 24, 25]. Taken together, the present results suggested that microtubule disruption prevented pronuclear formation in activated oocytes by maintaining their MPF activity. Many studies have demonstrated that defects in spindle assembly or spindle kinetochore attachment, or artificial depolymerization of microtubules, activate the SAC proteins such as MAD2 and BUB1, which arrest cells prior to the metaphase-anaphase transition with stable cyclin B and elevated MPF activities [ 49– 51]. Further studies have confirmed that a complex between the anaphase-promoting complexes/cyclosome (APC), Cdc20, and SAC proteins renders APC inactive and thus activates MPF by preventing cyclin B proteolysis [ 52– 55].

Although it is known that protein synthesis inhibition does not preclude pronuclear formation (CHX is often used in some protocols for chemical activation of oocytes), whether it affects nucleolar fusion is not known. In this study, neither rate of pronuclear formation nor rate of nucleolar fusion in activated oocytes was affected by the presence of CHX, although oocyte maturation was efficiently blocked after the same CHX treatment. This suggested that proteins required for nucleolar fusion including the microfilaments and intermediate filaments were made during oocyte maturation but not de novo synthesized after activation. It is known that following fertilization the early embryo is essentially transcriptionally silent and the early development is directed by the complement of maternally inherited mRNAs and proteins [ 56]. Because CHX inhibits protein biosynthesis by blocking translational elongation, our results suggest that the microfilaments and intermediate filaments essential for nucleolar fusion in activated oocytes were ready-made proteins that had been translated and stored before ovulation. Actin is known to be synthesized both during oogenesis and in cleavage-stage embryos in mice [ 57]. Arnault et al. [ 58] reported the presence of lamin during oogenesis and in isolated mouse oocytes.

Our observation on embryo development showed that whereas activated oocytes developed into blastocysts following CD treatment, the acrylamide-treated oocytes could not cleave, although both drugs prevent nucleolar fusion efficiently. It has been reported that slow freezing destroys intermediate filaments in mouse oocytes, leading to failure of embryo cleavage [ 59]. In addition, the result that oocytes developed into blastocysts following CD inhibition of nucleolar fusion seems contradictory with reports that the number, position, and distribution of nucleoli in human pronuclei can be used as an indicator of embryonic developmental potential [ 5, 10– 12]. However, this discrepancy may be caused by species difference, because mouse embryos are well known to be much more tolerant of in vitro culture than embryos from other species. Furthermore, whether inhibition of nucleolar fusion would affect mouse postimplantation development remains to be determined.

In summary, we have studied the role of microfilaments, microtubules, and intermediate filaments in regulating the formation and fusion of nucleoli during the M/G1 transition using the activated mouse oocyte model. Results (summarized in Table 9) suggest that 1) microfilaments and intermediate filaments but not microtubules are essential for nucleolar fusion, 2) proteins required for nucleolar fusion including microfilaments and intermediate filaments are not de novo synthesized in activated oocytes, and 3) microtubule disruption prevents pronuclear formation by maintaining high MPF activities. To our knowledge, this is the first report on the relationship between cytoskeleton and nucleolar events, which may evoke further work and provide a new avenue of investigation on nucleoskeleton and nucleologenesis. Understanding the assembly behavior of nucleoli, and what regulates their size and shape, is key to understanding the underlying causes of some human diseases [ 60] and to providing a marker for embryo developmental potential.


INVOERING

Microtubule (MT) filaments are dynamically self-organized, semiflexible polymers that permeate the cell interior, supporting numerous cellular functions and constituting major determinants of cell morphological, signaling, and mechanical properties ( Alberts etਊl., 2002 Dumont and Mitchison, 2009 Pollard and Cooper, 2009 Fletcher and Mullins, 2010 Robison etਊl., 2016 ). However, although the molecular aspects of MT functions have been intensively studied, how the global MT networks collectively contribute to the physical and biochemical attributes of the cells has not been fully understood ( Karsenti etਊl., 2006 Ando etਊl., 2015 ). Nonetheless, the potential importance of the latter is supported by emerging examples in which the physical properties of MTs directly participate in cellular physiology in a highly regulated manner ( Schaedel etਊl., 2015 Robison etਊl., 2016 ).

The architecture of the MT network is subject to complex regulatory mechanisms, interdependent with cell shape and responsive to several biochemical factors, including the classical MT-associated proteins, motor and severing proteins, MT end𠄻inding proteins ( Desai and Mitchison, 1997 Akhmanova and Steinmetz, 2015 Alfaro-Aco and Petry, 2015 ), and posttranslational modifications ( Song and Brady, 2015 ). With a subdiffraction-limit (�-nm) diameter but multimicrometer cell-spanning lengths, the complexity of the MT networks imposes major challenges for their experimental characterization and quantitative analysis ( Shariff etਊl., 2010 ). In particular, except for sparse regions near the periphery, traces of the MTs are difficult to resolve by conventional diffraction-limited fluorescence microscopy. Fortunately, the recent development of superresolution microscopy methods has enabled optical imaging with precision comparable to the MT dimension ( Kanchanawong and Waterman, 2012 ). Single-molecule localization microscopy (SMLM) methods, such as fluorescence/photoactivated localization microscopy and stochastic optical reconstruction microscopy (STORM Betzig etਊl., 2006 Hess etਊl., 2006 Rust etਊl., 2006 Fölling etਊl., 2008 Heilemann etਊl., 2008 ), have been widely used to image MTs either on their own or in conjunction with other cellular organelles, yielding highly resolved and information-rich images ( Huang etਊl., 2008a Dempsey etਊl., 2011 ). However, quantitative analysis of such superresolved images is difficult. The large-scale nature of single-molecule localization data makes it challenging for individual researchers to perform analysis and annotation in a timely manner, and thus there is a need for a tool to enable comprehensive extraction and reconstruction of the complete filament networks.

Here we present an open-source software package called SIFNE (for “SMLM image filament network extractor”), which provides a highly customizable computational tool for the global analysis of whole-cell MT networks imaged by SMLM. Our computational strategy involves two major stages: first, the iterative extraction of the global filament networks from the empirical data sets, and subsequently, the identification and assignment of every detected filament. Postextraction analysis tools for quantification of the MT network properties are also provided. Owing to the SMLM-resolvable dimension of the MTs and an unbranched filament topology, we also rigorously assessed the performance of our method by manual validation. We used the examples of the network architecture phenotypes promoted by the small GTPase Rac1 to demonstrate how SIFNE analysis can be used to quantitatively distinguish between different network architectures in fibroblasts.


1. Introduction

Photodynamic therapy (PDT) has emerged as a minimally invasive regimen for the treatment of cancers, offers an attractive alternative or complement to conventional therapies [1 2 3]. The therapeutic action of PDT is based on the generation of reactive oxygen species (ROS) that are formed upon specific wavelength-light activation of a photosensitizer (PS) such as a porphyrinic pigment. For clinical PDT applications, light in the red and infrared range is generally employed for enhanced tissue penetration. The resulting excited PS transfers its energy to molecular oxygen in tissue to generate ROS. Singlet oxygen is assumed to be the key cytotoxic ROS responsible for localized oxidative cell damage and initiation of cell death [1 3 4].

PDT for prostate cancer has not yet advanced beyond clinical trials and consequently is not yet an integral part of clinical practice [5]. The successful practice of PDT requires both the delivery of a sufficient light flux to the entire prostate and the adequate accumulation of photosensiter in tumors. While Hahn's group has developed procedures to measure and optimize light source parameters for prostate PDT [6 7 8], it is expected that improved targeting delivery and accumulation of photosensitizer molecules in prostate tumor may be additionally advantageous. Our group recently has developed a method for the selective delivery of PSs by targeting the enzyme-biomarker prostatespecific membrane antigen (PSMA) [9 10]. PSMA is a type II cell-surface glycoprotein predominantly restricted to prostatic tissue and is strongly expressed on prostate tumor cells [11]. Expression levels increase with disease progression, being highest in metastatic disease, hormone refractory cancers, and higher-grade lesions [12 13]. Endothelial-expression of PSMA in the neovasculature of a variety of non-prostatic solid malignancies has also been detected. Therefore, PSMA has attracted considerable attention as a biomarker and target for the delivery of imaging and therapeutic agents.

Microfilaments, microtubules, and intermediate filaments form the cytoskeleton systems of vertebrate cells. These fibrillar networks are composed of distinctly different proteins and exhibit unique structural and functional characteristics. The dynamic cytoskeletal networks that they form as well as their crosstalk play a critical role in the maintenance of cellular morphology and membrane integrity. They are also involved in cellular processes such as cell division, adhesion and migration, intracellular transport, and apoptosis [14 15]. Cytokeratin filaments have been found to aggregate at an early stage of the apoptotic sequence, while at later stages cytokeratin is degraded [16 17]. Reorganization of the microfilament and microtubule cytoskeleton has also been observed during the execution phase of apoptosis [18]. Cleavage of α-tubulin [19], cytokeratin 18 [20 21], and actin [22] by caspases during apoptosis has also been reported. With respect to PDT, there are characteristic changes in the cytoskeletal networks induced when phthalocyanines or 5-aminolevulinic acid are used as the PS [23 24 25 26].

We previously reported that phosphoramidate peptidomimetic PSMA inhibitors were capable of both cell-surface labeling of prostate cancer cells and intracellular delivery for targeted PDT applications [9 10]. Apoptosis of prostate cancer cells following PSMA-targeted PDT with Ppa-CTT-54 ( Fig. 1 ) was confirmed by the appearance of early chromatin condensation, poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) p85 fragment, and DNA fragmentation [10]. In this present study, we attempted to delineate the molecular mechanism by which PSMA-targeted PDT induces apoptosis and concluded that disruption of three kinds of filamentous networks and degeneration of cytoskeletal components occur at the initiation sequence of cell death or apoptosis.

Structures of Ppa and Ppa-CTT-54.


Methoden:

Purification of Tubulin and Tau

Tubulin was purified from MAP-rich microtubules extracted from bovine brains. MAP-rich microtubules were obtained from crude brain extract by three polymerization/depolymerization cycles, after which tubulin was separated from MAPs with a phosphocellulose anionic exchange column. Tubulin was suspended in PEM50 (50 mM PIPES (pH 6.8), 1 mM MgSO4 and 1 mM EGTA) with protein concentration between 7 and 12 mg ml 𢄡 , as measured by bovine serum albumin concentration standard. Solution was drop-frozen in liquid nitrogen and stored in a � ଌ freezer until use.

Tau was expressed in BL21(DE3) competent cells (Life Technologies, Carlsbad, CA) that were transfected with the pRK172 expression vector, coded for the appropriate WT isoform or truncated Tau. After incubation in auto-induction media (10 g of tryptone (CAS#: 91079�𠄲), 5 g of yeast extract (CAS#: 8013�𠄲), 0.5 g of dextrose (CAS#: 50�𠄷), 2 g of α- D -lactose (CAS#: 5989�𠄱) and 5 ml of glycerol (CAS#: 56�𠄵) per litre of 25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl and 5 mM Na2DUS4 in deionized (DI) water) for 24 h, cells were collected, lysed and resuspended in BRB80 buffer (80 mM PIPES at pH 6.8, 1 mM EGTA and 1 mM MgSO4). The solution was then bound to a phosphocellulose anionic exchange column, eluted with increasing concentration of (NH4)2DUS4 in BRB80. Tau was further purified by a HiTrap hydrophobic interaction chromatography column (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA), eluted with decreasing concentration of (NH4)2DUS4 in BRB80. Tau was then concentrated and buffer exchanged through successive centrifugation cycles using Amicon Ultra-15 Centrifugal Units with MWCO=10,000 (EMD Millipore, Darmstadt, Germany). The concentration of each Tau stock was determined by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis comparison with a Tau mass standard (originally measured via amino-acid analysis).

Truncated Tau mutants were designed via the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) with appropriate introduction/deletion of start and stop codons: 3RS㥌 (truncation of the entire CTT, deleting residues 280� of 3RS), 3RΔ(N-) (truncation of the anionic component of the NTT, deleting residues 2� of 3RL) and 3RΔN (truncation of the entire NTT, deleting residues 2� of 3RL). Truncated Tau mutants were then expressed/purified, as above.

Monstervoorbereiding

After thawing frozen tubulin and Tau stocks, samples were prepared on ice, mixing tubulin, GTP and Tau such that final concentrations were 5 mg ml 𢄡 , 2 mM and appropriate molar ratio of Tau to tubulin, respectively, in a final volume of 50 μl of PEM50 buffer. Samples were then polymerized in a 37 ଌ for 40 min. If necessary, sample was brought to appropriate KCl concentration.

Osmotic pressure samples

A previous study 34 measured the osmotic pressure (in Pa), P, of an aqueous solution of varying concentrations (cg ml 𢄡 ), wt%, of poly(ethylene oxide) (mW=105,000 g mol 𢄡 ) at 35 ଌ, which was taken as an reasonable approximation of the behaviour of PEO-100k at 37 ଌ, absent further data. Data were fit to a second-order polynomial (following the mathematical form of a virial expansion) to determine a formula to relate an arbitrary PEO-100k concentration to a corresponding osmotic pressure (P, in Pa):

Alternatively, following a derivation in Rau et al. 35 , the osmotic pressure (P) on cylinders in a hexagonal lattice can be converted to a force per unit length between nearest cylinder pairs F as a function of the hexagonal lattice parameter eenH:

PEO-100k was used as the osmotic depletant of choice compared with better-characterized depletants to parameters unique to our system: as stable inter-microtubule distances of up to 41 nm were observed, the size of the depletant had to be equal or greater than that distance to create a concentration differential inside/outside the microtubule bundle. Prior work 36 measured the radius of gyration (RG) of a function of PEO molecular weight (MW):

Thus, the effective depletant radius 21 , een=2RGπ 𢄡/2 =19.95 nm, or an effective depletant diameter, NS� nm, satisfies our experimental conditions that polymer not penetrate the space between microtubules in microtubule bundles.

Small-angle X-ray scattering

After polymerization, samples are loaded into 1.5-mm diameter quartz mark tubes (Hilgenberg GmbH, Malsfeld, Germany) and subsequently spun in a capillary rotor in a Universal 320R centrifuge (Hettich, Kirchlengern, Germany) at 9,500G, 37 ଌ for 30 min to protein density suitable for synchrotron SAXS. To ensure that structures were not induced by centrifugation, samples were observed over a period of 36 h, with no major changes to scattering or extracted parameters (Supplementary Fig. 1).

After centrifugation, varying concentration of PEO-100k in PEM50 was added for SAXS samples under osmotic pressure. Samples are subsequently sealed with epoxy and placed in a custom-made sample oven (maintained at 37 ଌ) with X-ray-transparent Kapton windows for scattering measurements.

SAXS measurements are carried out at the Stanford Synchrotron Radiation Laboratory (Palo Alto, CA) beamline 4𠄲 at 9 KeV (λ=1.3776 Å) with a Si(111) monochromator. Scattering data are taken with a 2D area detector (MarUSA, Evanston, Illinois) with a sample to detector distance of 𢒃.5 m (calibrated with a silver behenate control). X-ray beam size on the sample was 150 μm in the vertical and 200 μm in the horizontal directions. To ensure reproducibility, scattering data were retaken for most samples at similar sample conditions using tubulin and Tau from different purifications and expressions/purifications, respectively.

SAXS analysis

Scattering data were azimuthally averaged and small-angle scattering was subsequently background subtracted by fitting the minima of scattering intensities to a polynomial equation. Data were then fit to the appropriate model using a custom MATLAB fitting routine using the Levenberg–Marquadt non-linear fitting routine. Microtubules were modelled as homogenous, hollow cylinders (with no expected scattering from Tau/PEO due to low electron density relative to water) with ensemble-averaged inner radius <Rin> (a fit parameter), wall thickness δ (49 Å, an input parameter 18 ) and microtubule length L (20 μm, an input parameter for Tau-stabilized microtubules 16 ), averaged all orientations in Q-space:

Waar Q˙ en Qz are wavevectors perpendicular and parallel to the tubular axis, and J1 is the Bessel function of order 1. The structure-factor peaks (at reciprocal lattice vector for a hexagonal array, |Ghk|=Q10(H 2 +k 2 +hk) 1/2 ) were modelled as squared lorentzians with peak amplitude EENhk (a fit parameter) and peak width κhk (a fit parameter, with κ10 corresponding to the average bundle width L𢒂(πln4) 1/2 /κ10) 13 :

Plastic-embedded TEM sample preparation and TEM

Samples for thin sections were centrifuged to a pellet at 9,500G in 37 ଌ for 30 min. Supernatant was removed and pellet fixed with 2% glutaraldehyde and 4% tannic acid overnight. The pellet was stained with 0.8% OsO4 in PEM50 buffer for 1 h and subsequently rinsed four times with PEM50. Another stain of 1% uranyl acetate stain was applied for 1 h and rinsed with DI water.

Fixed and stained pellets were subsequently dehydrated with 25/50/75/100% solutions of acetone in DI water for 15 min apiece. Samples were embedded in resin, then embedded in spur plastic and incubated overnight, with resin poured into flat embedding moulds and held at 65 ଌ for 48 h and cooled overnight.

Plastic-embedded samples were then cut to �-nm slices with a microtome (Ted Pella, Redding, CA) and transferred to highly stable Formvar carbon-coated copper EM grids (Ted Pella, Redding, CA). Data were taken using the JEOL 1230 Transmission Electron Microscope.

DIC Samples and DIC

A SensiCam CCD camera (Cooke, Auburn Hills, MI) mounted on a Nikon Diaphot 300 with Xenon lamp (Sutter Instrument, Novato, CA) was used for optical microscopy measurements. Samples were centrifuged to a pellet at 9,500G for 30 min in 37 ଌ and placed between two microscopic slides sealed by wax. Images were taken while slides were kept at 37 ଌ by heat stage.

Calculation of R G

Previously, the radius of gyration (RG) of WT Tau and truncated Tau domains in solution were found 20 ,37 to scale as an unstructured protein with random-coil behaviour, with RG=0.1927N 0.588  nm, which was subsequently used to calculate the RG of the PD and truncated Tau used in our experiments.

Beschikbaarheid van data

The authors declare that the data supporting the findings of this study are available within the article, and its Supplementary Information files, or from the authors on reasonable request.


Bekijk de video: Cour 3 biologie cellulaire le cytosquellette les filaments intermédiaires snv l1 (December 2021).