Informatie

13.6F: Antimicrobiële peptiden - Biologie


Antimicrobiële peptiden vertonen cytotoxische activiteit tegen alle microben.

leerdoelen

  • Bespreek de structuur, het mechanisme en de doelen van antimicrobiële peptiden

Belangrijkste punten

  • Antimicrobiële peptiden (AMP's) zijn een unieke en geassorteerde groep moleculen geproduceerd door alle soorten levende organismen, die worden beschouwd als onderdeel van de aangeboren immuniteit van een gastheer.
  • Deze peptiden vertonen een krachtige antimicrobiële activiteit en worden snel gemobiliseerd om een ​​breed scala aan microben, zoals virussen, bacteriën, protozoa en schimmels, te neutraliseren.
  • Het vermogen van deze natuurlijke moleculen om multiresistente micro-organismen te doden heeft hen veel aandacht en klinische belangstelling opgeleverd.

Sleutelbegrippen

  • neutropenie: Een hematologische aandoening die wordt gekenmerkt door een abnormaal laag aantal neutrofielen.
  • atopische dermatitis: Een atopische, erfelijke en niet-besmettelijke huidziekte die wordt gekenmerkt door chronische ontsteking van de huid.

Een eerste verdedigingslinie tegen pathogene aanvallen wordt het aangeboren immuunsysteem genoemd, dat wordt gevolgd door verworven immuunresponsen die verband houden met de activering van T- en B-cellen gericht tegen specifieke antigenen. In tegenstelling tot de klonale, verworven adaptieve immuniteit, bieden endogene peptide-antibiotica of antimicrobiële peptiden een snel en energie-effectief mechanisme als frontlinieverdediging.

Antimicrobiële peptiden (AMP's) zijn eiwitten met een klein molecuulgewicht met een breed spectrum antimicrobiële activiteit tegen bacteriën, virussen en schimmels. Ze worden geclassificeerd op basis van hun structuur en aminozuurmotieven. Peptiden van de klassen defensine, cathelicidine en histatine worden bij mensen aangetroffen. Deze evolutionair geconserveerde peptiden zijn meestal positief geladen en hebben zowel een hydrofobe als hydrofiele kant waardoor het molecuul oplosbaar is in waterige omgevingen en toch ook lipiderijke membranen kan binnendringen. Eenmaal in een microbieel doelwitmembraan doodt het peptide doelwitcellen via verschillende mechanismen. AMP's scheiden lytische enzymen af, voedingsstoffen-bindende eiwitten of bevatten plaatsen die gericht zijn op specifieke microbiële macromoleculen.

Cathelicidins en defensines zijn belangrijke groepen van epidermale AMP's. Verlaagde niveaus van deze peptiden zijn waargenomen bij patiënten met atopische dermatitis en het syndroom van Kostmann, een aangeboren neutropenie. AMP's zijn effectief gebleken tegen multiresistente microben. Naast belangrijke antimicrobiële eigenschappen, geeft groeiend bewijs aan dat AMP's de immuunrespons van de gastheer veranderen door receptorafhankelijke interacties. Van AMP's is aangetoond dat ze belangrijk zijn in zulke uiteenlopende functies als angiogenese, wondgenezing, cytokine-afgifte, chemotaxis en regulatie van het adaptieve immuunsysteem. Deze peptiden kwalificeren als innovatieve geneesmiddelen die kunnen worden gebruikt als antibiotica, anti-lipopolysaccharidegeneesmiddelen of modificatoren van ontstekingsreacties.


Antimicrobiële peptiden van het aangeboren immuunsysteem van amfibieën als krachtige antidiabetica: een literatuuroverzicht en bio-informatica-analyse

Antimicrobiële peptiden, als een belangrijk lid van het aangeboren immuunsysteem, hebben naast antimicrobiële activiteit verschillende biologische activiteiten. Er zijn enkele AMP's met antidiabetische activiteit, vooral die geïsoleerd uit amfibieën. Deze peptiden kunnen insulineafgifte induceren via verschillende mechanismen op basis van het peptidetype. In deze reviewstudie verzamelden we alle gerapporteerde AMP's met antidiabetische activiteit. We analyseren ook de sequentie en structuur van deze peptiden voor evaluatie van het sequentie- en structuureffect op hun antidiabetische activiteit. Op basis van deze review is de grootste peptidefamilie met antidiabetische activiteit: temporinen met negen antidiabetische peptiden. Kikkers zijn de meest voorkomende bron van antidiabetische peptiden. Bioinformatica-analyse toonde aan dat een toename van de positieve nettolading en een afname van de hydrofobiciteit het insulinotrope effect van peptiden kan verbeteren. Peptiden met een hogere positieve nettolading en Boman-index vertoonden een hogere activiteit. Op basis van dit overzichtsartikel kunnen AMP's met antidiabetische activiteit, vooral die geïsoleerd uit amfibieën, worden gebruikt als nieuw antidiabetisch geneesmiddel voor diabetes type 2. Amfibieën zijn dus potentiële bronnen voor actieve peptiden die verdere evaluatie verdienen als nieuwe insulinesecretagogen. Er moet echter een strategie worden overwogen voor het verhogen van de stabiliteit en positieve activiteit en het verminderen van negatieve bijwerkingen.

1. Inleiding

Diabetes, als een stofwisselingsziekte, wordt gekenmerkt door een hoge bloedsuikerspiegel. Typen 1 en 2 zijn de twee belangrijkste typen van deze aandoening. Tussen deze twee typen komt diabetes type 2 vaker voor dan type 1 [1, 2]. Type 2-diabetes, als een chronische ziekte, wordt gekenmerkt door een hoge bloedsuikerspiegel. De prevalentie van deze ziekte neemt in de wereld toe als gevolg van veranderingen in levensstijl [2, 3]. Ontwikkeling van effectieve strategieën voor de behandeling en het beheer van diabetes type 2 is noodzakelijk [4]. Voor deze behandeling en behandeling kunnen glucoseverlagende middelen van natuurlijke oorsprong worden overwogen [5, 6]. Antimicrobiële peptiden worden getoond als belangrijke leden van het aangeboren immuunsysteem van dieren met brede antimicrobiële activiteiten. Naast antimicrobiële activiteit hebben deze interessante peptiden verschillende biologische activiteiten, zoals anti-endotoxine, antiparasitair, antikanker, wondgenezing, zaaddodend, insecticide en antioxidant [7-11]. De huid van amfibieën produceert peptiden met remmende effecten op de groei van bacteriën en schimmels [11]. Deze peptiden werden uitgescheiden als reactie op stress en infectie. Deze peptiden fungeren als het eerste verdedigingssysteem tegen pathogenen [12]. Een van de interessante activiteiten van sommige van deze peptiden is de antidiabetische activiteit [13]. Antidiabetische peptiden werden voor het eerst gerapporteerd en geïdentificeerd uit huidafscheidingen van amfibieën. Deze peptiden hebben het vermogen om in vitro de afgifte van insuline door BRIN-BD11-ratklonaal te stimuleren β cellen in lage concentraties met een lage celtoxiciteit. Ongeveer meer dan 99% van de antidiabetische peptiden is geïsoleerd uit de huidsecretie van amfibieën, vooral uit de soorten Anura. In dit overzichtsartikel hebben we alle gerapporteerde antidiabetische peptiden beoordeeld op bron, sequentie, structuur en mechanisme. We evalueerden deze peptiden ook voor voorspelling en ontwerp van nieuwe geneesmiddelen voor de verbetering van diabetische symptomen.

2. Methoden:

Alle kwalitatieve en kwantitatieve originele artikelen in het Engels over antidiabetische peptiden werden ingevoerd. Belangrijke databases, waaronder Iran Medex, MEDLINE/PubMed, Google Scholar en CINAHL en andere relevante referenties op websites, werden beoordeeld voor artikelselectie. De gebruikte zoekprofielen waren als volgt: peptide/antidiabeticum/amphibain, AMPs/anti-diabeticum/amphibain, peptide/antidiabetic/amphibain, AMPs/antidiabetic/amphibain, peptide/diabet/amphibain, AMPs/diabet/amphibain, peptide/ antidiabetes/kikker, AMPs/antidiabetes/kikker, peptide/antidiabetes/kikker, AMPs/antidiabetes/kikker, peptide/diabetes/kikker, AMPs/diabetes/kikker, peptide/antidiabetes/pad, AMPs/anti- diabeticus/pad, peptide/antidiabeticum/pad, AMP's/antidiabetes/pad, peptide/diabetes/pad, AMP's/diabetes/pad.

Artikelen die niet direct relevant zijn voor het onderwerp zijn uitgesloten. Voor het afhandelen van de juiste referenties is gebruik gemaakt van de EndNote software.

Voor bioinformatica-analyse (analyse van aminozuursamenstelling, uitlijning, structuurvoorspelling, enz.) van verworven peptiden werd de CLC-software gebruikt.

3. Resultaten en discussie

Zevenenveertig AMP's met antidiabetische activiteit werden verkregen door te zoeken in de database. Van deze peptiden werden slechts twee peptiden geïdentificeerd van insecten, sociale wesp, Agelaia pallipes pallipes. Andere peptiden werden geïsoleerd uit verschillende amfibieën. De eigenschappen van deze 45 peptiden zijn samengevat in Tabel 1.

3.1. Brevinin-1CBb, Brevinin-1Pa, Brevinin-1E, Brevinin-2GUb en Brevinin-2EC

Deze brevininepeptiden vertoonden een significant effect op de verhoging van de insulineafgifte bij een concentratie van 100 nM op de BRIN-BD11 klonale bètacellijn van de rat. Deze peptiden hadden geen effect op intracellulair calcium. Deze peptiden hebben een zwakke hemolytische activiteit op menselijke erytrocyten. Het voorgestelde mechanisme voor het antidiabetische effect van deze peptiden is de mogelijke betrokkenheid van zowel cyclische AMP-eiwitkinase A- als C-afhankelijke G-eiwitgevoelige routes. Het insulinotrope effect van deze peptiden is ook toegeschreven aan hun effect op Rho G-eiwitten [14-17].

3.2. Esculentin-1, Esculentin-1b en Esculentin-2Cha

Net als bij brevinine-peptiden vertoonden de meeste esculentine-peptiden een significante insuline-afgevende activiteit. Er zijn cyclische AMP-eiwitkinase A- en C-afhankelijke G-eiwitgevoelige routes voorgesteld voor de antidiabetische werking van esculentine-peptiden [16, 18].

3.3. Temporin-DRa, Temporin-DRb, Temporin-Oe, Temporin-CBa, Temporin-Va, Temporin-Vb, Temporin-Vc, Temporin-CBf en Temporin-TGb

Verschillende temporinen, met verschillende bronnen van amfibieën, vertoonden significante stimulerende effecten op de insulineafgifte uit BRIN-BD11-cellen van de klonale rat. Deze peptiden hadden geen effect op de afgifte van lactaatdehydrogenase. Temporin-Oe en Temporin-TGb vertoonden ook significante toxiciteit bij optimale concentratie voor stimulatie van insulineafgifte. Deze peptiden hadden geen effect op intracellulair calcium. Het voorgestelde mechanisme voor deze peptiden is een KATP-kanaalonafhankelijke route [17, 19].

3.4. Ranatuerin-1CBa, Ranatuerin-2CBc en Ranatuerin-2CBd

Deze peptiden werden geïsoleerd uit brulkikker Lithobates catesbeianus. Deze peptiden kunnen de afgifte van insuline door de rat BRIN-BD11-klonaal stimuleren β cellijn. Van deze peptiden vertoonde Ranatuerin-2CBd de hoogste stimulatie van insulineafgifte. Aan de andere kant is van deze peptiden Ranatuerin-2CBd bij een optimale concentratie cytotoxischer dan andere peptiden. Op basis van studies hebben deze drie peptiden geen effect op lactaatdehydrogenase. Deze status gaf aan dat deze peptiden de integriteit van het plasmamembraan behouden [17].

3.5. Dermaseptin B4 en Dermaseptin-LI1

Dermaseptins worden beschouwd als multifunctionele AMP's. Tussendoor vertoonden Dermaseptin B4 en Dermaseptin-LI1 antidiabetische activiteit. Dermaseptin B4 en Dermaseptin-LI1 werden geïsoleerd uit Phyllomedusa trinitatis en Agalychnis litodryas, respectievelijk. In glucose-responsieve BRIN-BD11-cellen leidden beide peptiden tot de stimulatie van insulineafgifte. Het mogelijke mechanisme voor inductie van insulinesecretie door deze peptiden is niet vastgesteld [20, 21].

3.6. Bombesin en Bombesin-gerelateerde peptiden

Bombesin is een AMP die is geïsoleerd uit padden, Bombina variegata. Drie bombesine- en bombesine-gerelateerde peptiden met antidiabetische activiteit werden geïsoleerd uit Bombina bonte. Het voorgestelde mechanisme van antidiabetische activiteit van bombesine en bombesine-gerelateerde peptiden is de betrokkenheid van een cAMP-afhankelijke, G-eiwit-ongevoelige route [22].

3.7. Xenopsin en Xenopsin-AM2

Xenopsine en xenopsine-AM2 (met de substitutie Lys (3) ⟶ Arg in xenopsine) werden geïsoleerd uit X. laevis en X. amieti afscheidingen, respectievelijk. Deze twee peptiden leiden tot significante stimulatie van de insulineafgifte door de BRIN-BD11-klonale rat β cellijn. Deze peptiden hebben geen effect op de afgifte van lactaatdehydrogenase [23].

3.8. Palustrin-2CBa en Palustrin-1c

Palustrin-2CBa en Palustrin-1c werden geïdentificeerd aan de hand van huidsecreties van Lithobates catesbeianus en Lithobates palustris, respectievelijk. Deze peptiden leiden tot een significante stimulatie van de insulineafgifte uit BRIN-BD11-cellen bij lage concentraties [17, 24].

3.9. Fylloseptine-L2

Een lid van de phylloseptine-familie, Phylloseptin-L2, heeft een krachtige activiteit voor het verhogen van de insulineafgifte uit de BRIN-BD11 klonale bètacellijn van de rat. Dit peptide stimuleerde de afgifte van het cytosolische enzym lactaatdehydrogenase niet. Deze activiteit werd gehandhaafd in de afwezigheid van extracellulair Ca(2+). Het voorgestelde mechanisme voor dit peptide voor insulineafgifte is onafhankelijk van de primaire betrokkenheid van de instroom van Ca(2+) of sluiting van ATP-gevoelige K(+)-kanalen [25].

3.10. RK-13

RK-13 ​​is een 13-aminozuurinsulineotroop peptide geïsoleerd uit huidafscheidingen van Agalychnis calcarifer. Dit peptide stimuleerde insulineafgifte op een dosisafhankelijke, glucosegevoelige manier en oefende zijn effecten uit via een cyclische AMP-eiwitkinase A-route onafhankelijk van pertussistoxine-gevoelige G-eiwitten [26].

3.11. Pseudin-2

Pseudine-2 is een kationisch peptide dat wordt geïsoleerd uit de huid van Pseudis paradoxa. Dit peptide leidt tot insulineafgifte uit de BRIN-BD11 klonale bètacellijn zonder een toename van lactaatdehydrogenaseafgifte. Er is een mechanisme waarbij Ca2+-onafhankelijke routes betrokken zijn voor deze werking van peptiden [27].

3.12. GM-14

GM-14 is een insuline-tropisch peptide dat afkomstig is van Bombina bonte. Dit peptide verhoogt de insulineafgifte via betrokkenheid van een cAMP-afhankelijke, G-eiwit-ongevoelige route [22].

3.13. IN-21

IN-21 stond bekend als een insulinotroop peptide geïsoleerd uit huidafscheidingen van Bombina bonte. Dit peptide verhoogt de insulineafgifte via betrokkenheid van een cAMP-afhankelijke, G-eiwit-ongevoelige route [22].

3.14. Ocellatine-L2

Ocellatine-L2 is een glycine-leucine-rijk peptide. Dit peptide werd geïdentificeerd aan de hand van door noradrenaline gestimuleerde huidafscheidingen van Leptodactylus laticeps. In een hogere concentratie dan 1 mM kan dit peptide een significante toename van de snelheid van insulineafgifte door klonale BRIN-BD11-bètacellen van ratten induceren zonder significante effecten op lactaatdehydrogenase [28].

3.15. Plasticine-L1

Plasticine-L1 is een glycine-leucine-rijk peptide. Dit peptide heeft een krachtig stimulerend effect op de afgifte van insuline uit klonale BRIN-BD11-bètacellen van ratten. Plasticine-L1 heeft geen effect op lactaatdehydrogenase [28].

3.16. Tigerinin-1R

Tigerinin-1R is een cyclisch dodecapeptide dat wordt geïsoleerd uit de huidsecretie van Hoplobatrachus rugulosus. Dit peptide heeft een lage cytotoxiciteit en hemolytische activiteit. Tigerinin-1R zou de insulineafgifte uit BRIN-BD11-cellen aanzienlijk kunnen stimuleren. Een studie in een muismodel toonde aan dat dit peptide de insulineafgifte verhoogt en de glucosetolerantie verbetert [29].

3.17. Caerulein-B1

Een caeruleïne-gerelateerd peptide, Caerulein-B1, werd geïdentificeerd uit de huidsecretie van Xenopus borealis. Dit peptide heeft een extra Gly-aminozuur in vergelijking met caeruleïne en caeruleïne-B2. Dit peptide vertoonde een krachtig effect op de stimulatie van insulineafgifte door de BRIN-BD11-klonale rat β cellijn bij lage concentratie [23].

3.18. Amolopin

Amolopin is een AMP met de grootste gelijkenis met temporinen en wesppid chemotactische peptiden. Dit peptide vertoonde een stimulerend effect op de insulineafgifte in INS-1-cellen. Evaluatie van het mechanisme gaf aan dat het stimulerende effect geen effect had op de toename van de instroom van Ca2+ [30].

3.19. Alyteserin-2a

Alyteserin-2a, een peptide geïsoleerd uit Alytes verloskundigen, heeft een hoge antidiabetische activiteit en een lage toxiciteit voor menselijke bloedcellen. Membraandepolarisatie en verhoogde intracellulaire Ca2+-concentratie zijn beschouwd als betrokken mechanismen bij het stimuleren van insulineafgifte [31].

3.20. Magainin-AM1 en Magainin-AM2

Magaine-AM1 en Magainin-AM2 zijn twee AMPS geïsoleerd van Xenopus amieti. Deze peptiden hebben antidiabetische activiteit. Het voorgestelde werkingsmechanisme van deze peptiden is betrokkenheid van celmembraandepolarisatie en verhoging van de intracellulaire calciumconcentratie. Studies toonden ook aan dat Magainin-AM1 en Magainin-AM2 een significante verbetering in glucosetolerantie, insulinegevoeligheid en verbeterde bètacelfuncties produceerden bij HFD-gevoede muizen [32, 33].

3.21. Hymenochirine-1B

Hymenochirine-1B heeft een antidiabetisch effect in BRIN-BD 11-cellen. Dit peptide leidt tot de stimulatie van insulineafgifte uit de bètacellen van de pancreas via de KATP-kanaalonafhankelijke route. Dit peptide kan de plasma-insulinespiegel verhogen na intraperitoneale toediening in HFD-gevoede muizen [34].

Op basis van literatuuronderzoek zijn alle voorgestelde werkingsmechanismen voor antidiabetische peptiden samengevat in figuur 1.

3.22. Pseudhymenochirine-2Pa en Pseudhymenochirine-1Pb

Pseudhymenochirin-1Pb en Pseudhymenochirin-2Pa zijn AMP's met een stimulerende werking op de insulineafgifte in BRIN-BD11 klonale β cellen in lage concentraties. De KATP-kanaalonafhankelijke route wordt beschouwd als het voorgestelde mechanisme voor deze peptiden [35].

3.23. Statistische, structurele en bioinformatica-analyse

De meest voorkomende bron van deze peptiden waren de verschillende soorten kikkers. Het bereik van de netto lading voor deze 45 peptiden is +2-6. Behalve één peptide met 39% hydrofobiciteit, hebben de andere gerapporteerde peptiden meer dan 48% hydrofobiciteit. Het groottebereik van deze peptiden is 8 tot 46 aminozuren. Onder de Rana soorten, de meeste antidiabetische peptiden werden geëxtraheerd uit Aziatische kikker Hylarana guentheri. Onder de Hylidae soorten, vier kikkersoorten hebben krachtige antidiabetische peptiden: Phyllomedusa trinitatis, Agalychnis calcarifer, Agalychnis litodryas, en Hylomantis-maki. Onder de Bombinatoridae soorten, zes soorten padden (genus Bombina) hebben krachtige peptiden met insuline-afgevende eigenschappen. Bij andere soorten volgt de distributie van antidiabetische peptiden geen specifieke regel. Korte halfwaardetijd, stimulatie van het immuunsysteem, hemolyse en toxiciteit zijn beperkingen voor het gebruik van peptiden als antidiabetica. Ocellatin-L2 heeft bijvoorbeeld een hoge hemolytische activiteit naast een hoge activiteit bij het stimuleren van de afgifte van insuline [28]. De verandering van het aminozuurgehalte kan leiden tot een verbeterd peptidevermogen. Aanverwant onderzoek toonde aan dat een toename van de positieve nettolading het vermogen tot insulineafgifte kan vergroten [25]. Deze verandering van de nettolast leidt echter niet altijd tot hetzelfde resultaat. Het verhogen van de nettolading van peptide Pseudin-2 had bijvoorbeeld geen significant stimulerend effect op de insulineafgifte [27]. Aan de andere kant is hydrofobiciteit de belangrijkste eigenschap van antimicrobiële peptiden. Studies toonden aan dat de vermindering van hydrofobiciteit geen effect had op het insulinotrope effect van peptide, maar de hemolytische activiteit verminderde. Dus de afname van hydrofobiciteit kan worden beschouwd als een krachtige strategie voor het verminderen van hemolytische activiteit zonder verandering van de antidiabetische activiteit van peptiden [36]. Van alle gerapporteerde antidiabetische peptiden vertoonde Magaine-AM2, met de laagste hydrofobiciteit (39%), de laagste hemolytische activiteit. In sommige peptiden, α-amidering in het C-terminale gebied leidt tot de versterking van de antidiabetische potentie. Dit α-amidering verbetert het mogelijke werkingsmechanisme, waaronder peptide-betrokken membraandepolarisatie en een toename van de intracellulaire Ca2+-concentratie [37]. Owolabi et al. gaf aan dat een toename van de positieve nettolading van AMP's door toevoeging van kationische aminozuren de potentie van de insulinotrope activiteit verbeterde [34]. Deze groep toonde ook aan dat een toename van hydrofobiciteit leidt tot een afname van de potentie van de insulinotrope activiteit. De gemiddelde lengte van alle 45 peptiden is 27,81 residuen. De gemiddelde nettolading van alle 45 peptiden is 3,50. In Figuur 2 wordt de sequentie-uitlijning van de gerapporteerde antidiabetische peptiden getoond. Op basis van deze figuur zijn Ala, Gly, Lys en Leu consensus-aminozuren in alle peptiden. Bioinformatica-analyse toonde ook aan dat Leu, Gly en Ala de hoogste frequentie hebben in alle gerapporteerde antidiabetische peptiden. De frequentie van aromatische aminozuren (Trp, Tyr en Phe), His, Met en Cys is laag in deze 45 peptiden (Tabel 2). De Boman-index wordt gedefinieerd als de som van de oplosbaarheidswaarden voor alle aminozuren in volgorde van peptide. Deze index voorspelt het vermogen van een peptide om aan andere eiwitten te binden. De Boman-index die hoger is dan 2,48 gaf een hoog bindingspotentieel aan. Van de gerapporteerde antidiabetische AMP's hebben peptiden met een hogere Boman-index een hogere antidiabetische activiteit. Deze relatie is niet bekend. Maar het kan te wijten zijn aan een hoger peptidevermogen om betrokken enzymen te binden bij de insulinesecretie en glucoseopname. Een andere strategie voor de verhoging van de halfwaardetijd van antidiabetische peptiden is substitutie van L-aminozuur door D-aminozuur. Vanwege de kleine afmetingen en snelle eliminatie via de nieren, is deze strategie er niet goed voor om de beperking van het peptidegebruik op te lossen [38]. Bescherming van peptide met verschillende polymeercoatings kan worden gebruikt voor de versterking van de therapeutische index van antidiabetische peptiden [39]. Deze methode wordt beschouwd als een succesvolle strategie voor de verbetering van de werking van peptiden, vooral bij het verhogen van hun stabiliteit en het verminderen van hun immunogeniciteit [40]. Toename van stabiliteit houdt verband met de toename van peptidegroottes die snelle renale klaring verminderen. Conjugatie met polyethyleenglycol (PEGylering) [41, 42], anionische polypeptide-XTEN (864 aminozuur-peptiden die A, E, G, P, S en T bevatten) [43, 44] en hyaluronzuur (HAylering) [ 45, 46] worden meestal gebruikt voor fysieke afscherming van antidiabetische peptiden. Covalente en niet-covalente interactie van peptide met serumalbuminen wordt ook overwogen voor modificatie van antidiabetische peptiden [47-49].

3.24. Dierstudies

Er zijn enkele studies over antidiabetische evaluatie van de genoemde AMP's in diermodellen. Evaluatie van deze studies laat zien dat alle artikelen lage concentraties peptiden (nmol/kg lichaamsgewicht) gebruikten in diermodellen [50, 51]. Uit het literatuuronderzoek bleek dat de significante toxiciteit van AMP's (IC50) kan optreden in hogere concentraties (micromol/kg lichaamsgewicht) [10, 52, 53]. Deze geteste peptiden hadden dus antidiabetische activiteit bij concentraties die niet toxisch zijn voor de cellen en het diermodel. Op basis van in vivo studies hadden de bovengenoemde AMP's echter een lage in vivo activiteit vanwege de korte bloedcirculatietijd. Verhoging van de plasmastabiliteit en bloedcirculatietijd kan de in vivo activiteit van AMP's verbeteren. Fysieke afscherming en aanhechting van albumine of antilichaam zijn de twee belangrijkste voorgestelde strategieën voor het verhogen van de plasmastabiliteit en de bloedcirculatietijd van AMP's [54].

4. Conclusies

Op basis van deze reviewstudie kunnen antimicrobiële peptiden die afkomstig zijn van huidafscheidingen van kikkers en padden de insulineafgifte stimuleren. Deze natuurlijke peptiden kunnen nuttig zijn voor de behandeling van type 2 diabetes als complementaire geneesmiddelen. Voor verbetering van antidiabetische activiteit, verhoging van de halfwaardetijd, vermindering van toxiciteit voor bloedcellen en andere normale cellen, verandering van nettolading en hydrofobiciteit via verandering van aminozuursamenstelling, fysieke afscherming van peptide met verschillende polymeren, en covalente of niet-covalente conjugatie met albumine kan worden beschouwd als een model voor de bereiding van synthetische peptiden met antidiabetische activiteit. Anderzijds kunnen deze natuurlijke peptiden worden beschouwd als een model voor de bereiding van synthetische peptiden met antidiabetische activiteit.

Belangenverstrengeling

Geen van de auteurs heeft belangenverstrengeling.

Bijdragen van auteurs

Hossein Soltaninejad en Hadi Zare-Zardini zijn co-eerste auteurs.

Referenties

  1. M. Ordooei, G. Malekzadeh, M. Ordooei en S. M. Mohammadi, "Hypothyreoïdie en coeliakie bij patiënten met diabetes mellitus type I in Yazd, Iran een beschrijvende studie," Iraans tijdschrift voor diabetes en obesitas, vol. 6, nee. 3, blz. 131-135, 2014. Bekijk op: Google Scholar
  2. M. Ordooei, A. Shojaoddiny-Ardekani, S. H. Hoseinipoor, M. Miroliai en H. Zare-Zardini, "Effect van vitamine D op HbA1c-spiegels van kinderen en adolescenten met diabetes mellitus type 1", Minerva kindergeneeskunde, vol. 69, nee. 5, blz. 391-395, 2014. Bekijk op: Google Scholar
  3. A. B. Olokoba, O. A. Obateru en L. B. Olokoba, "Type 2 diabetes mellitus: een overzicht van de huidige trends," Oman medisch tijdschrift, vol. 27, nee. 4, pp. 269-273, 2012. Bekijk op: Uitgeverssite | Google geleerde
  4. J.E.B. Reusch en J.A.E. Manson, "Beheer van diabetes type 2 in 2017: het doel bereiken", JAMA, vol. 317, nee. 10, pp. 1015-1016, 2017. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  5. P. K. Prabhakar en M. Doble, "Werkmechanisme van natuurlijke producten die worden gebruikt bij de behandeling van diabetes mellitus", Chinees tijdschrift voor integratieve geneeskunde, vol. 17, nee. 8, pp. 563-574, 2011. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  6. Z. Yazdanpanah, A. Ghadiri-Anari, AV Mehrjardi, A. Dehghani, HZ Zardini en A. Nadjarzadeh, "Effect van Ziziphus jujube fruitinfusie op lipidenprofielen, glycemische index en antioxidantstatus bij type 2 diabetespatiënten: een gerandomiseerde gecontroleerde klinische proef,” Onderzoek naar fytotherapie, vol. 31, nee. 5, blz. 755–762, 2017. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  7. S. Khani, S. S. Seyedjavadi, H. Zare-Zardini et al., "Isolatie en functionele karakterisering van een antischimmel hydrofiel peptide, Skh-AMP1, afgeleid van _Satureja khuzistanica_ bladeren," fytochemie, vol. 164, pp. 136-143, 2019. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  8. S. S. Seyedjavadi, S. Khani, A. Eslamifar et al., "Het antischimmelpeptide MCh-AMP1 afgeleid van Matricaria chamomilla remt de groei van Candida albicans door het induceren van ROS-generatie en het veranderen van de doorlaatbaarheid van het schimmelcelmembraan," Grenzen in de microbiologie, vol. 10, blz. 3150, 2020. Bekijk op: Uitgeverssite | Google geleerde
  9. H. Zare-Zardini, F. Fesahat, I. Halvaei et al., "Evaluatie van de zaaddodende activiteit van een antimicrobieel peptide uit de Bufo kavirensis, MaximinBk: in vitro onderzoek," Turks tijdschrift voor biochemie, vol. 42, nee. 3, pp. 299–305, 2017. Bekijken op: Google Scholar
  10. H. Zare-Zardini, M. Salehvarzi, F. Ghanizadeh et al., "Antimicrobiële peptiden van het aangeboren immuunsysteem als een geschikte verbinding voor de behandeling van kanker en vermindering van de gerelateerde infectieziekte," Iraans tijdschrift voor pediatrische hematologie en oncologie, vol. 8, nee. 1, pp. 62-70, 2018. Bekijk op: Google Scholar
  11. Z.H. Zareh, A. Hashemi, B. Tooloeinia en A. Bitaraf, Zuivering en karakterisering van een nieuw antimicrobieel peptide uit huidafscheidingen van Bufo kavirensis, 2014.
  12. N. Mookherjee, M.A. Anderson, H.P. Haagsman en D.J. Davidson, "Antimicrobiële gastheerverdedigingspeptiden: functies en klinisch potentieel," Natuurrecensies Medicijnontdekking, vol. 19, nee. 5, pp. 311-332, 2020. Bekijk op: Uitgeverssite | Google geleerde
  13. H. Khan, S. M. Nabavi en S. Habtemariam, "Anti-diabetisch potentieel van peptiden: toekomstperspectieven als therapeutische middelen," Levenswetenschappen, vol. 193, blz. 153-158, 2018. Bekijk op: Google Scholar
  14. J. M. Conlon, G. J. Power, Y. H. Abdel-Wahab et al., "Een krachtig, niet-toxisch insuline-afgevend peptide geïsoleerd uit een extract van de huid van de Aziatische kikker, _Hylarana guntheri_ (Anura:Ranidae)," Regulerende peptiden, vol. 151, nee. 1-3, pp. 153-159, 2008. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  15. L. Marenah, P.R. Flatt, D.F. Orr, C. Shaw en Y.H. Abdel-Wahab, "Karakterisatie van natuurlijk voorkomende peptiden in de huidafscheiding van Rana pipiens-kikker onthullen pipinine-1 als het nieuwe insuline-afgevende middel," The Journal of peptide-onderzoek, vol. 66, nee. 4, pp. 204-210, 2005. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  16. L. Marenah, P.R. Flatt, D.F. Orr, C. Shaw en Y.H. Abdel-Wahab, "Huidafscheidingen van Rana saharica-kikkers onthullen antimicrobiële peptiden esculentins-1 en -1B en brevinins-1E en -2EC met nieuwe insuline-afgevende activiteit," Het tijdschrift voor endocrinologie, vol. 188, nee. 1, pp. 1–9, 2006. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  17. M. Mechkarska, O. O. Ojo, M. A. Meetani et al., "Peptidomische analyse van huidafscheidingen van de brulkikker _Lithobates catesbeianus_ (Ranidae) identificeert meerdere peptiden met een krachtige insuline-afgevende activiteit,” Peptiden, vol. 32, nee. 2, pp. 203-208, 2011. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  18. S. Vasu, OO Ojo, RC Moffett, JM Conlon, PR Flatt en YH Abdel-Wahab, "Anti-diabetische acties van esculentin-2CHa (1-30) en zijn stabiele analogen in een door voeding geïnduceerd model van obesitas-diabetes ” Aminozuren, vol. 49, nee. 10, pp. 1705–1717, 2017. Bekijk op: Uitgeverssite | Google geleerde
  19. Y. H. Abdel-Wahab, L. Marenah, P.R. Flatt en J.M. Conlon, "Insuline-afgevende eigenschappen van de temporin-familie van antimicrobiële peptiden," Eiwit- en peptideletters, vol. 14, nee. 7, blz. 702–707, 2007. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  20. L. Marenah, M.C. Stephen, P.R. Flatt, D.F. Orr, C. Shaw en Y.H.A. Abdel-Wahab, "Nieuwe insuline-afgevende peptiden in de huid van Phyllomedusa trinitatis-kikker bevatten peptide van 28 aminozuren uit dermaseptine BIV-precursor." Alvleesklier, vol. 29, nee. 2, pp. 110-115, 2004. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  21. L. Marenah, C. Shaw, D.F. Orr, M.C. Stephen, P.R. Flatt en Y.H.A. Abdel-Wahab, "Isolatie en karakterisering van een onverwachte klasse van insulinotrope peptiden in de huid van de kikker _Agalychnis litodryas_," Regulerende peptiden, vol. 120, nee. 1-3, pp. 33-38, 2004. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  22. L. Marenah, P.R. Flatt, D.F. Orr, S. McClean, C. Shaw en Y.H.A. Abdel-Wahab, "Huidafscheiding van de pad Bombina variegata bevat meerdere insuline-afgevende peptiden, waaronder bombesine en geheel nieuwe insulinotrope structuren," Biologische Chemie, vol. 385, nee. 3-4, pp. 315-321, 2004. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  23. O. K. Zahid, M. Mechkarska, O. O. Ojo et al., "Caerulein- en xenopsine-gerelateerde peptiden met insuline-afgevende activiteiten van huidafscheidingen van de klauwkikkers, _Xenopus borealis_ en _Xenopus amieti_ (Pipidae)," Algemene en vergelijkende endocrinologie, vol. 172, nee. 2, pp. 314-320, 2011. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  24. Y. H. A. Abdel-Wahab, "Brevinin-1 en meerdere insuline-afgevende peptiden in de huid van de kikker Rana palustris," Tijdschrift voor Endocrinologie, vol. 181, blz. 347-354, 2004. Bekijk op: Google Scholar
  25. YH Abdel-Wahab, GJ Power, PR Flatt, DC Woodhams, LA Rollins-Smith en JM Conlon, "Een peptide van de phylloseptin-familie uit de huid van de kikker _Hylomantis lemur_ (Phyllomedusinae) met krachtige _in vitro_ en _in vivo_ insuline- activiteit vrijgeven,” Peptiden, vol. 29, nee. 12, pp. 2136-2143, 2008. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  26. Y. H. A. Abdel-Wahab, L. Marenah, D.F. Orr, C. Shaw en P.R. Flatt, "Isolatie en structurele karakterisering van een nieuw 13-aminozuur insuline-afgevend peptide uit de huidsecretie van Agalychnis calcarifer," Biologische Chemie, vol. 386, nee. 6, pp. 581-587, 2005. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  27. Y. H. Abdel-Wahab, G. J. Power, M. T. Ng, P. R. Flatt en J. M. Conlon, "Insuline-afgevende eigenschappen van het kikkerhuid-peptide pseudin-2 en zijn [Lys18]-gesubstitueerde analoog," Biologische Chemie, vol. 389, nee. 2, pp. 143-148, 2008. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  28. J. M. Conlon, Y. H. A. Abdel-Wahab, P. R. Flatt et al., "Een glycine-leucine-rijk peptide dat structureel verwant is aan de plasticines uit huidafscheidingen van de kikker _Leptodactylus laticeps_ (Leptodactylidae)," Peptiden, vol. 30, nee. 5, pp. 888–892, 2009. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  29. O. O. Ojo, Y. H.A. Abdel-Wahab, P.R. Flatt, M. Mechkarska en J.M. Conlon, "Tigerinin-1R: een krachtig, niet-toxisch insuline-afgevend peptide geïsoleerd uit de huid van de Aziatische kikker, Hoplobatrachus rugulosus," Diabetes, obesitas en metabolisme, vol. 13, nee. 12, pp. 1114-1122, 2011. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  30. G.-X. Mo, X.-W. Bai, Z.-J. Li, X.-W. Yan, X.-Q. Hij, en M.-Q. Rong, "Een nieuw insulinotroop peptide uit de huidafscheidingen van amolops loloensis-kikker," Natuurlijke producten en bioprospectie, vol. 4, nee. 5, pp. 309-313, 2014. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  31. J. M. Conlon, A. Demandt, P. F. Nielsen, J. Leprince, H. Vaudry en D. C. Woodhams, "De alyteserins: twee families van antimicrobiële peptiden uit de huidafscheidingen van de verloskundige pad _Alytes obstetricans_ (Alytidae)," Peptiden, vol. 30, nee. 6, pp. 1069-1073, 2009. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  32. J. M. Conlon en M. Mechkarska, "Host-defensie-peptiden met therapeutisch potentieel van huidafscheidingen van kikkers uit de familie Pipidae," Geneesmiddelen, vol. 7, nee. 1, blz. 58-77, 2014. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  33. OO Ojo, JM Conlon, PR Flatt en YHA Abdel-Wahab, "Kikkerhuidpeptiden (tigerinine-1R, magainin-AM1, -AM2, CPF-AM1 en PGla-AM1) stimuleren de afscheiding van glucagon-achtig peptide 1 (GLP) -1) door GLUTag-cellen,” Biochemische en biofysische onderzoekscommunicatie, vol. 431, nee. 1, blz. 14–18, 2013. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  34. B. O. Owolabi, O. O. Ojo, D.K. Srinivasan, J.M. Conlon, P.R. Flatt en Y.H.A. Abdel-Wahab, "In vitro en in vivo insulinotrope eigenschappen van het multifunctionele kikkerhuidpeptide hymenochirine-1B: een structuur-activiteitsonderzoek," Aminozuren, vol. 48, nee. 2, pp. 535-547, 2016. Bekijk op: Uitgeverssite | Google geleerde
  35. G. Manzo, M.A. Scorciapino, D. Srinivasan et al., "Conformationele analyse van de gastheerverdedigingspeptiden pseudhymenochirine-1Pb en -2Pa en ontwerp van analogen met insuline-afgevende activiteiten en verminderde toxiciteiten," Dagboek van natuurlijke producten, vol. 78, nee. 12, pp. 3041–3048, 2015. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  36. Y. Chen, M.T. Guarnieri, A.I. Vasil, M.L. Vasil, C.T. Mant en R.S. Hodges, "De rol van peptide-hydrofobiciteit in het werkingsmechanisme van α-helix antimicrobiële peptiden,” Antimicrobiële middelen en chemotherapie, vol. 51, nee. 4, blz. 1398-1406, 2007. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  37. L. Albertsen, A.C. Shaw, J.C. Norrild en K. Strømgaard, "Recombinante productie van peptide C-terminaal α-amiden met behulp van een gemanipuleerde inteïne,” Bioconjugaatchemie, vol. 24, nee. 11, pp. 1883-1894, 2013. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  38. M. Werle en A. Bernkop-Schnürch, "Strategieën om de plasmahalfwaardetijd van peptide- en eiwitgeneesmiddelen te verbeteren," Aminozuren, vol. 30, nee. 4, pp. 351-367, 2006. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  39. W. Li, M.D. Joshi, S. Singhania, K.H. Ramsey en A.K. Murthy, "Peptidevaccin: vooruitgang en uitdagingen", Vaccins, vol. 2, nee. 3, pp. 515-536, 2014. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  40. M.K. Marschütz en A. Bernkop-Schnürch, "Orale toediening van peptiden: polymeerremmerconjugaten die insuline beschermen tegen enzymatische afbraak in vitro," Biomaterialen, vol. 21, nee. 14, blz. 1499-1507, 2000. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  41. A.R. Mezo, S.C. Low, T. Hoehn en H. Palmieri, "PEGylatie verbetert het therapeutisch potentieel van peptide-antagonisten van de neonatale Fc-receptor, FcRn," Brieven over bio-organische en medicinale chemie, vol. 21, nee. 21, pp. 6332-6335, 2011. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  42. F. M. Veronese en A. Mero, "De impact van PEGylatie op biologische therapieën," BioDrugs, vol. 22, nee. 5, pp. 315-329, 2008. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  43. V.N. Podust, S. Balan, B.-C. Sim et al., "Uitbreiding van de in vivo halfwaardetijd van biologisch actieve moleculen door XTEN-eiwitpolymeren", Tijdschrift voor gecontroleerde afgifte, vol. 240, pp. 52-66, 2016. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  44. V. Schellenberger, C.-w. Wang, N.C. Geething et al., "Een recombinant polypeptide verlengt de in vivo halfwaardetijd van peptiden en eiwitten op een afstembare manier", Natuur biotechnologie, vol. 27, nee. 12, pp. 1186-1190, 2009. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  45. J.-H.Kong, O. Eun Ju, S. Y. Chae, K.C. Lee en S.K. Hahn, "Langwerkend hyaluronaat - exendine 4-conjugaat voor de behandeling van type 2 diabetes," Biomaterialen, vol. 31, nee. 14, pp. 4121–4128, 2010. Bekijk op: Publisher Site | Google geleerde
  46. A. Mero, A. Grigoletto, G. Martinez en G. Pasut, "Recente ontwikkelingen in op hyaluronzuur gebaseerde nanogeneeskunde," Recente ontwikkelingen in de biotechnologie, vol. 3, blz. 102-129, 2016. Bekijk op: Google Scholar
  47. J. T. Andersen, B. Dalhus, D. Viuff et al., "Verlenging van de serumhalfwaardetijd van albumine door de neonatale Fc-receptor (FcRn) binding te construeren

Auteursrechten

Copyright © 2021 Hossein Soltaninejad et al. Dit is een open access-artikel dat wordt gedistribueerd onder de Creative Commons Attribution-licentie, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, op voorwaarde dat het originele werk correct wordt geciteerd.


MINI REVIEW artikel

Van de mens afgeleide antimicrobiële peptiden (AMP's), zoals defensines en cathelicidine LL-37, maken deel uit van het aangeboren immuunsysteem en spelen een cruciale rol in de vroege pulmonale verdediging tegen virussen. Deze AMP's bereiken virale remming via een verscheidenheid aan mechanismen, waaronder, maar niet beperkt tot, directe binding aan virionen, binding aan en moduleren van gastheerceloppervlakreceptoren, blokkering van virale replicatie en aggregatie van virale deeltjes en indirect door te functioneren als chemokinen om adaptieve immuunreacties afremmen. Gezien het feit dat we ons in een pandemie van ongekende ernst bevinden en de dringende behoefte aan therapeutische opties om het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus-2 (SARS-CoV-2) te bestrijden, hebben natuurlijk tot expressie gebrachte AMP's en hun derivaten het potentieel om de coronavirusziekte 2019 te bestrijden (COVID-19) en de virale besmettelijkheid op verschillende manieren belemmeren. Op voorwaarde dat de ontwikkeling van effectieve behandelingen een dringende prioriteit voor de volksgezondheid is, worden AMP's en hun derivaten onderzocht als potentiële profylactische en therapeutische kandidaten. Bovendien laten celgebaseerde platforms zoals humane mesenchymale stamceltherapie (hMSC) zien dat ze succesvol zijn in het redden van de levens van ernstig zieke patiënten die besmet zijn met SARS-CoV-2. Dit kan gedeeltelijk te wijten zijn aan AMP's die vrijkomen uit hMSC's die ook fungeren als immunologische reostaten om de ontstekingsreactie van de gastheer te moduleren. Deze recensie benadrukt het gebruik van AMP's in strategieën die kunnen worden geïmplementeerd als nieuwe therapieën, alleen of in combinatie met andere platforms, om met CoV-2 geïnfecteerde personen te behandelen.


Inhoud

RiPP's bestaan ​​uit alle peptiden (d.w.z. met een molecuulgewicht van minder dan 10 kDa) die ribosomaal worden geproduceerd en een zekere mate van enzymatische post-translationele modificatie ondergaan. Deze combinatie van peptidetranslatie en -modificatie wordt "post-ribosomale peptidesynthese" (PRPS) genoemd, analoog aan niet-ribosomale peptidesynthese (NRPS).

Historisch gezien werden de huidige subklassen van RiPP's afzonderlijk bestudeerd en de gangbare praktijken in de nomenclatuur varieerden dienovereenkomstig in de literatuur. Meer recentelijk, met de komst van brede genoomsequencing, is men zich gaan realiseren dat deze natuurlijke producten een gemeenschappelijke biosynthetische oorsprong hebben. In 2013 werd een reeks uniforme nomenclatuurrichtlijnen overeengekomen en gepubliceerd door een grote groep onderzoekers in het veld. [1] Voorafgaand aan dit rapport werden RiPP's aangeduid met verschillende benamingen, waaronder: post-ribosomale peptiden, ribosomale natuurlijke producten, en ribosomale peptiden.

De afkorting "RiPP" staat voor "ribosomaal gesynthetiseerd en Post-translationeel gewijzigd Pepide".

RiPP's vormen een van de belangrijkste superfamilies van natuurlijke producten, zoals alkaloïden, terpenoïden en niet-ribosomale peptiden, hoewel ze meestal groot zijn, met molecuulgewichten die gewoonlijk hoger zijn dan 1000 Da. [1] De komst van next-generation sequencing-methoden heeft genoommining van RiPP's tot een algemene strategie gemaakt. [2] Gedeeltelijk vanwege hun toegenomen ontdekking en het veronderstelde gemak van engineering, neemt het gebruik van RiPP's als medicijn toe. Hoewel ze van oorsprong ribosomale peptiden zijn, worden RiPP's doorgaans gecategoriseerd als kleine moleculen in plaats van biologische vanwege hun chemische eigenschappen, zoals een matig molecuulgewicht en relatief hoge hydrofobiciteit.

Het gebruik en de biologische activiteiten van RiPP's zijn divers.

RiPP's in commercieel gebruik omvatten nisine, een conserveermiddel voor levensmiddelen, thiostrepton, een diergeneeskundig actueel antibioticum, en nosiheptide en duramycine, die additieven voor diervoeding zijn. Phalloidin gefunctionaliseerd met een fluorofoor wordt in microscopie gebruikt als een vlek vanwege de hoge affiniteit voor actine. Anantin is een RiPP die in de celbiologie wordt gebruikt als een atriale natriuretische peptidereceptorremmer. [3]

Een gederivatiseerde RiPP in klinische onderzoeken is LFF571. LFF571, een derivaat van het thiopeptide GE2270-A, voltooide klinische fase II-onderzoeken voor de behandeling van Clostridium difficile infecties, met een vergelijkbare veiligheid en werkzaamheid als vancomycine. [4] [5] Ook recentelijk in klinische onderzoeken was NVB302 (een derivaat van het lantibioticum actagardine) dat wordt gebruikt voor de behandeling van Clostridium difficile infectie. [6] Duramycin heeft klinische fase II-onderzoeken afgerond voor de behandeling van cystische fibrose. [7]

Andere bioactieve RiPP's zijn de antibiotica cyclothiazomycine en bottromycine, het ultrasmalspectrum antibioticum plantazolicine en het cytotoxine patellamide A. Streptolysin S, de toxische virulentiefactor van Streptococcus pyogenes, is ook een RiPP. Bovendien is menselijk schildklierhormoon zelf een RiPP vanwege zijn biosynthetische oorsprong als thyroglobuline.

Amatoxinen en fallotoxinen Bewerken

Amatoxinen en fallotoxinen zijn respectievelijk 8- en 7-ledige natuurlijke producten die worden gekenmerkt door N-naar-C-cyclisatie naast een tryptathionine-motief dat is afgeleid van de verknoping van Cys en Trp. [8] [9] De amatoxinen en phallotoxinen verschillen ook van andere RiPP's op basis van de aanwezigheid van een C-terminale herkenningssequentie naast het N-terminale leiderpeptide. α-Amanitin, een amatoxine, heeft een aantal posttranslationele modificaties naast macrocyclisatie en vorming van de tryptathioninebrug: oxidatie van het tryptathionine leidt tot de aanwezigheid van een sulfoxide en talrijke hydroxylaties sieren het natuurlijke product. Als amatoxine is α-amanitine een remmer van RNA-polymerase II. [10]

Bottromycinen Bewerken

Bottromycinen bevatten een C-terminaal gedecarboxyleerd thiazool naast een macrocyclisch amidine. [11]

Er zijn momenteel zes bekende bottromycineverbindingen, die verschillen in de mate van zijketenmethylering, een bijkomend kenmerk van de bottromycineklasse. De totale synthese van bottromycine A2 was nodig om de structuur van de eerste bottromycine definitief te bepalen. [11]

Tot nu toe zijn in het geslacht genclusters geïdentificeerd waarvan voorspeld is dat ze bottromycinen produceren Streptomyces. Bottromycinen verschillen van andere RiPP's doordat er geen N-terminaal leiderpeptide is. In plaats daarvan heeft het voorloperpeptide een C-terminale verlenging van 35-37 aminozuren, waarvan verondersteld wordt dat het werkt als een herkenningssequentie voor posttranslationele machines. [12]

Cyanobactines Bewerken

cyanobactinen zijn diverse metabolieten van cyanobacteriën met N-naar-C macrocylization van een 6-20 aminozuurketen. Cyanobactinen zijn natuurlijke producten die zijn geïsoleerd uit cyanobacteriën, en men denkt dat bijna 30% van alle cyanobacteriën stammen cyanobacteriële genclusters bevatten. [13] Hoewel tot dusver alle cyanobactinen worden toegeschreven aan cyanobacteriën, bestaat er echter de mogelijkheid dat andere organismen soortgelijke natuurlijke producten kunnen produceren.

Het voorloperpeptide van de cyanobactinefamilie wordt traditioneel aangeduid als het "E"-gen, terwijl voorloperpeptiden in de meeste RiPP-genclusters worden aangeduid als gen "A". "A" is een serineprotease dat betrokken is bij splitsing van het leiderpeptide en daaropvolgende macrocyclisatie van het natuurlijke peptideproduct, in combinatie met een extra serineproteasehomoloog, het gecodeerde door gen "G". Leden van de cyanobactine-familie kunnen thiazolinen/oxazolinen, thiazolen/oxazolen en methyleringen dragen, afhankelijk van aanvullende modificatie-enzymen. De bekendste cyanobactine is bijvoorbeeld patellamide A, dat twee thiazolen bevat, een methyloxazoline en een oxazoline in zijn uiteindelijke toestand, een macrocyclus die is afgeleid van 8 aminozuren.

Lanthipeptiden Bewerken

Lanthipeptiden zijn een van de best bestudeerde families van RiPP's. De familie wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van lanthionine (Lan) en 3-methyllanthionine (MeLan) residuen in het uiteindelijke natuurlijke product. Er zijn vier hoofdklassen van lanthipeptiden, afgebakend door de enzymen die verantwoordelijk zijn voor de installatie van Lan en MeLan. De dehydratase en cyclase kunnen twee afzonderlijke eiwitten of één multifunctioneel enzym zijn. Voorheen stonden lanthipeptiden bekend als "lantipeptiden" voordat een consensus in het veld werd bereikt. [1]

Lantibiotica zijn lanthipeptiden die een bekende antimicrobiële activiteit hebben. Het oprichtende lid van de lanthipeptide-familie, nisine, is een lantibioticum dat al meer dan 40 jaar wordt gebruikt om de groei van door voedsel overgedragen pathogenen te voorkomen. [14]

Lasso-peptiden Bewerken

Lasso-peptiden zijn korte peptiden die een N-terminale macrolactam macrocyclische "ring" bevatten waardoor een lineaire C-terminale "staart" wordt gestoken. [15] [16] Vanwege deze topologie met schroefdraad lijken deze peptiden op lasso's, waardoor hun naam is ontstaan. Ze zijn lid van een grotere klasse van op aminozuren gebaseerde lassostructuren. Bovendien zijn lasso-peptiden formeel rotaxanen.

De N-terminale "ring" kan 7 tot 9 aminozuren lang zijn en wordt gevormd door een isopeptidebinding tussen het N-terminale amine van het eerste aminozuur van het peptide en de carboxylaatzijketen van een aspartaat- of glutamaatresidu. De C-terminale "staart" varieert van 7 tot 15 aminozuren lang. [15]

Het eerste aminozuur van lasso-peptiden is bijna altijd glycine of cysteïne, waarbij mutaties op deze plaats niet worden getolereerd door bekende enzymen. [16] Op bio-informatica gebaseerde benaderingen voor de ontdekking van lasso-peptiden hebben dit dus als een beperking gebruikt. [15] Onlangs zijn echter enkele lasso-peptiden ontdekt die ook serine of alanine als eerste residu bevatten. [17]

De draad van de lasso-staart wordt gevangen door disulfidebindingen tussen ring- en staartcysteïneresiduen (klasse I lasso-peptiden), door sterische effecten als gevolg van omvangrijke residuen op de staart (klasse II lasso-peptiden), of beide (klasse III lasso-peptiden) . [16] De compacte structuur maakt lasso-peptiden vaak resistent tegen proteasen of thermische ontvouwing. [16]

Lineaire azol(in)e-bevattende peptiden

Lineaire azool(in)e-bevattende peptiden (LAP's) bevatten thiazolen en oxazolen, of hun gereduceerde thiazoline- en oxazolinevormen. Thiazol(in)es zijn het resultaat van cyclisatie van Cys-residuen in het voorloperpeptide, terwijl (methyl)oxazol(in)es worden gevormd uit Thr en Ser. Azool- en azolinevorming wijzigt ook het residu op de -1-positie, of direct C-terminal aan de Cys, Ser of Thr. Een dehydrogenase in het LAP-gencluster is vereist voor de oxidatie van azolinen tot azolen.

Plantazolicine is een LAP met uitgebreide cyclisatie. Twee sets van vijf heterocycli geven het natuurlijke product structurele stijfheid en ongewoon selectieve antibacteriële activiteit. [18] Streptolysine S (SLS) is misschien wel de best bestudeerde en meest bekende LAP, deels omdat de structuur nog steeds onbekend is sinds de ontdekking van SLS in 1901. Dus, hoewel de biosynthetische genencluster suggereert dat SLS een LAP is, is de structurele bevestiging ontbreekt.

Microcinen Bewerken

Microcinen zijn allemaal RiPP's geproduceerd door Enterobacteriaceae met een molecuulgewicht van < 10 kDa. Veel leden van andere RiPP-families, zoals microcine B17 (LAP) en microcine J25 (Lasso-peptide), worden ook als microcinen beschouwd. In plaats van te worden geclassificeerd op basis van posttranslationele modificaties of modificerende enzymen, worden microcinen in plaats daarvan geïdentificeerd op basis van molecuulgewicht, natieve producent en antibacteriële activiteit. Microcinen zijn ofwel plasmide- of chromosoom-gecodeerd, maar hebben specifiek activiteit tegen Enerobacteriaceae. Omdat deze organismen ook vaak microcinen produceren, bevat het genencluster niet alleen een voorloperpeptide en modificatie-enzymen, maar ook een zelfimmuniteitsgen om de producerende stam te beschermen, en genen die coderen voor de export van het natuurlijke product.

Microcinen hebben een biologische activiteit tegen Gram-negatieve bacteriën, maar vertonen gewoonlijk een smalspectrumactiviteit door het kapen van specifieke receptoren die betrokken zijn bij het transport van essentiële voedingsstoffen.

Thiopeptiden Bewerken

De meeste van de gekarakteriseerde thiopeptiden zijn geïsoleerd uit Actinobacteria. [19] Algemene structurele kenmerken van thiopeptide-macrocycli zijn gedehydrateerde aminozuren en thiazoolringen gevormd uit respectievelijk gedehydrateerde serine/threonine en gecycliseerde cysteïneresiduen.

De thiopeptide-macrocyclus wordt afgesloten met een zesledige stikstofhoudende ring. Oxidatietoestand en substitutiepatroon van de stikstofhoudende ring bepalen de reeks van het thiopeptide-natuurproduct. [1] Hoewel het mechanisme van macrocyclisatie niet bekend is, kan de stikstofring in thiopeptiden voorkomen als een piperidine, dehydropiperidine of een volledig geoxideerde pyridine. Bovendien dragen sommige thiopeptiden een tweede macrocyclus, die een quinaldinezuur- of indolzuurresidu draagt ​​dat is afgeleid van tryptofaan. Misschien wel het best gekarakteriseerde thiopeptide, thiostrepton A, bevat een dehydropiperidinering en een tweede, quinaldinezuurbevattende macrocyclische verbinding. Vier residuen worden gedehydrateerd tijdens posttranslationele modificatie en het uiteindelijke natuurlijke product bevat ook vier thiazolen en één azoline.

Andere RiPP's Bewerken

Auto-inducerende peptiden (AIP's) en quorum sensing peptiden worden gebruikt als signaalmoleculen in het proces dat quorum sensing wordt genoemd. AIP's worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een cyclische ester of thioester, in tegenstelling tot andere regelgevende peptiden die lineair zijn. Bij pathogenen binden geëxporteerde AIP's aan extracellulaire receptoren die de productie van virulentiefactoren veroorzaken. [20] In Staphylococcus aureus, AIP's worden gebiosynthetiseerd uit een voorloperpeptide dat is samengesteld uit een C-terminaal leidergebied, het kerngebied en een negatief geladen staartgebied dat, samen met het leiderpeptide, wordt gesplitst vóór AIP-export. [21]

Bacteriële kop-tot-staart gecycliseerde peptiden verwijst uitsluitend naar ribosomaal gesynthetiseerde peptiden met 35-70 residuen en een peptidebinding tussen de N- en C-termini, soms aangeduid als bacteriocines, hoewel deze term breder wordt gebruikt. Het onderscheidende karakter van deze klasse is niet alleen de relatief grote omvang van de natuurlijke producten, maar ook de modificerende enzymen die verantwoordelijk zijn voor macrocyclisatie. Andere N-naar-C gecycliseerde RiPP's, zoals de cyanobactinen en orbitiden, hebben gespecialiseerde biosynthetische machines voor macrocylisatie van veel kleinere kernpeptiden. Tot nu toe zijn deze bacteriocines alleen geïdentificeerd in Gram-positieve bacteriën. Enterocin AS-48 werd geïsoleerd uit Enterokokken en is, net als andere bacteriocines, relatief resistent tegen hoge temperatuur, pH-veranderingen en veel proteasen als gevolg van macrocyclisatie. [22] Op basis van oplossingsstructuren en sequentie-uitlijning lijken bacteriocines vergelijkbare 3D-structuren aan te nemen ondanks weinig sequentiehomologie, wat bijdraagt ​​aan de stabiliteit en weerstand tegen afbraak.

Conopeptiden en andere toxoglossan-peptiden zijn de componenten van het gif van roofzuchtige zeeslakken, zoals de kegelslakken of Conus. [23] Gifpeptiden van kegelslakken zijn over het algemeen kleiner dan die gevonden in andere dierlijke giffen (10-30 aminozuren versus 30-90 aminozuren) en hebben meer disulfide-crosslinks. [23] Een enkele soort kan 50-200 conopeptiden hebben die in zijn genoom worden gecodeerd, herkenbaar aan een goed geconserveerde signaalsequentie. [1]

Cyclotiden zijn RiPP's met een kop-staartcyclisatie en drie geconserveerde disulfidebindingen die een geknoopte structuur vormen die een cyclisch cysteïneknoopmotief wordt genoemd. [24] [25] Er zijn geen andere posttranslationele modificaties waargenomen op de gekarakteriseerde cyclotiden, die tussen 28 en 37 aminozuren groot zijn. Cyclotiden zijn natuurlijke producten van planten en de verschillende cyclotiden blijken soortspecifiek te zijn. Hoewel er veel activiteiten zijn gemeld voor cyclotiden, is de hypothese dat ze allemaal verenigd zijn door een gemeenschappelijk mechanisme van binding aan en verstoring van het celmembraan. [26]

Glycocinen zijn RiPPS die geglycosyleerde antimicrobiële peptiden zijn. Slechts twee leden zijn volledig gekarakteriseerd, waardoor dit een kleine RiPP-klasse is. [27] [28] Sublancine 168 en glycocine F zijn beide Cys-geglycosyleerd en hebben bovendien disulfidebindingen tussen niet-geglycosyleerde Cys-residuen. Hoewel beide leden S-glycosylgroepen dragen, zullen RiPP's die O- of N-gekoppelde koolhydraten dragen ook in deze familie worden opgenomen wanneer ze worden ontdekt.

Linaridinen worden gekenmerkt door C-terminale aminovinylcysteïneresiduen. Hoewel deze posttranslationele modificatie ook wordt gezien in de lanthipeptiden epidermine en mersacidine, hebben linaridinen geen Lan- of MeLan-residuen. Bovendien wordt de linaridine-eenheid gevormd door modificatie van twee Cys-residuen, terwijl lanthipeptide-aminovinylcysteïnen worden gevormd uit Cys en dehydroalanine (Dha). [29] De eerste te karakteriseren linaridine was: cypemycine. [30]

microviridinen zijn cyclisch N-geacetyleerde trideca- en tetradecapeptiden met ω-ester- en/of ω-amidebindingen. Lactonvorming door glutamaat of aspartaat -carboxygroepen en de lysine ε-aminogroep vormt macrocycli in het uiteindelijke natuurlijke product.

banen zijn van planten afgeleide N-naar-C gecycliseerde peptiden zonder disulfidebindingen. Ook wel Caryophyllaceae-achtige homomonocyclopeptiden genoemd, [31] orbitiden zijn 5-12 aminozuren lang en zijn samengesteld uit voornamelijk hydrofobe residuen. Net als de amatoxinen en fallotoxinen, suggereren de gensequenties van orbitiden de aanwezigheid van een C-terminale herkenningssequentie. In de lijnzaadvariant Linum usitatissimum, werd een voorloperpeptide gevonden met behulp van Blast-zoeken die mogelijk vijf kernpeptiden bevat, gescheiden door vermeende herkenningssequenties. [32]

proteïnen zijn vernoemd naar "Proteus", een Griekse vormveranderende zeegod. Tot nu toe worden de enige bekende leden in de familie van Proteusins ​​polytheonamiden genoemd. Ze werden oorspronkelijk verondersteld niet-ribosomale natuurlijke producten te zijn vanwege de aanwezigheid van veel D-aminozuren en andere niet-proteïnogene aminozuren. Een metagenomisch onderzoek onthulde echter dat de natuurlijke producten de meest uitgebreid gewijzigde klasse van RiPP's zijn die tot nu toe bekend zijn. [33] Zes enzymen zijn verantwoordelijk voor het installeren van in totaal 48 posttranslationele modificaties op de polytheonamide A- en B-precursorpeptiden, waaronder 18 epimerisaties. Polytheonamiden zijn uitzonderlijk groot, aangezien een enkel molecuul een celmembraan kan overspannen en een ionkanaal kan vormen. [34] [35]

Sactipeptiden bevatten intramoleculaire koppelingen tussen de zwavel van Cys-residuen en de α-koolstof van een ander residu in het peptide. Een aantal niet-ribosomale peptiden dragen dezelfde modificatie.In 2003 werd de eerste RiPP met een zwavel-naar-α-koolstofbinding gerapporteerd toen de structuur van subtilosine A werd bepaald met behulp van isotopisch verrijkte media en NMR-spectroscopie. [36] In het geval van subtilosine A, geïsoleerd uit Bacillus subtilis 168, zijn de Cα-crosslinks tussen Cys4 en Phe31, Cys7 en Thr28, en Cys13 en Phe22 niet de enige posttranslationele modificaties, de C- en N-termini vormen een amidebinding, wat resulteert in een cirkelvormige structuur die conformationeel wordt beperkt door de Cα-bindingen. Sactipeptiden met antimicrobiële activiteit worden gewoonlijk sactibiotica genoemd (szwavel naar eenlpha-Carbon entibioticum). [37]

RiPP's worden gekenmerkt door een gemeenschappelijke biosynthetische strategie waarbij genetisch gecodeerde peptiden translatie ondergaan en vervolgens chemische modificatie door biosynthetische enzymen.

Algemene kenmerken Bewerken

Alle RiPP's worden eerst in het ribosoom gesynthetiseerd als a voorloper peptide. Dit peptide bestaat uit a kernpeptide segment dat typisch wordt voorafgegaan (en soms gevolgd) door a leider peptide segment en is typisch

20-110 residu's lang. Het leiderpeptide is gewoonlijk belangrijk voor het mogelijk maken van enzymatische verwerking van het voorloperpeptide door te helpen bij de herkenning van het kernpeptide door biosynthetische enzymen en voor cellulaire export. Sommige RiPP's bevatten ook een herkenningsvolgorde C-terminaal van het kernpeptide deze zijn betrokken bij excisie en cyclisatie. Bovendien kunnen eukaryote RiPP's een signaal segment van het voorloperpeptide dat helpt het peptide naar cellulaire compartimenten te leiden. [1]

Tijdens RiPP-biosynthese wordt het ongemodificeerde voorloperpeptide (met een ongewijzigd kernpeptide, UCP) wordt achtereenvolgens herkend en chemisch gemodificeerd door biosynthetische enzymen (PRPS). Voorbeelden van modificaties omvatten onder andere dehydratie (d.w.z. lanthipeptiden, thiopeptiden), cyclodehydratie (d.w.z. thiopeptiden), prenylatie (d.w.z. cyanobactinen) en cyclisatie (d.w.z. lasso-peptiden). Het resulterende gemodificeerde voorloperpeptide (met a gemodificeerd kernpeptide, MCP) ondergaat vervolgens proteolyse, waarbij de niet-kerngebieden van het voorloperpeptide worden verwijderd. Dit resulteert in de volwassen RiPP. [1]

Nomenclatuur bewerken

Papers gepubliceerd voorafgaand aan een recente gemeenschapsconsensus [1] gebruiken verschillende sets van nomenclatuur. De voorloper peptide is eerder genoemd als prepeptide, prepropeptide, of structureel peptide. De leider peptide is aangeduid als een propeptide, pro-regio, of tussenliggende regio. Historische alternatieve termen voor kernpeptide inbegrepen propeptide, structureel peptide, en toxine regio (specifiek voor conopeptiden). [1]

Gezinsspecifieke kenmerken Bewerken

Lanthipeptiden Bewerken

Lanthipeptiden worden gekenmerkt door de aanwezigheid van lanthionine (Lan) en 3-methyllanthionine (MeLan) residuen. Lan-residuen worden gevormd uit een thioetherbrug tussen Cys en Ser, terwijl MeLan-residuen worden gevormd door de koppeling van Cys aan een Thr-residu. De biosynthetische enzymen die verantwoordelijk zijn voor de installatie van Lan en MeLan, dehydrateren eerst Ser en Thr tot respectievelijk dehydroalanine (Dha) en dehydrobutyrine (Dhb). Daaropvolgende thioetherverknoping vindt plaats door middel van een Michael-type toevoeging door Cys aan Dha of Dhb. [38]

Er zijn vier klassen van lanthipeptide-biosynthetische enzymen aangewezen. [39] Lanthipeptiden van klasse I hebben speciale lanthipeptide-dehydratasen, LanB-enzymen genoemd, hoewel specifiekere aanduidingen worden gebruikt voor bepaalde lanthipeptiden (bijv. NisB is de nisinedehydratase). Een aparte cyclase, LanC, is verantwoordelijk voor de tweede stap in de biosynthese van Lan en MeLan. Lanthipeptiden van klasse II, III en IV hebben echter bifunctionele lanthioninesynthetasen in hun genclusters, wat betekent dat een enkel enzym zowel dehydratatie- als cyclisatiestappen uitvoert. Klasse II-synthetasen, LanM-synthetasen genoemd, hebben N-terminale dehydratatiedomeinen zonder sequentiehomologie met andere lanthipeptide-biosynthetische enzymen. Het cyclasedomein heeft homologie met LanC. Klasse III (LanKC) en IV (LanL) enzymen hebben vergelijkbare N-terminale lyase- en centrale kinase-domeinen, maar divergeren in C-terminale cyclisatiedomeinen: het LanL-cyclasedomein is homoloog aan LanC, maar de klasse III-enzymen missen Zn-ligandbinding domeinen. [40]

Lineaire azol(in)e-bevattende peptiden

Het kenmerk van lineaire azol(in)e-bevattende peptide (LAP) biosynthese is de vorming van azol(in)e heterocycli uit de nucleofiele aminozuren serine, threonine of cysteïne. [1] [41] Dit wordt bereikt door drie enzymen die worden aangeduid als de B-, C- en D-eiwitten, het voorloperpeptide wordt het A-eiwit genoemd, zoals in andere klassen. [1]

Het C-eiwit is voornamelijk betrokken bij de herkenning en binding van leader-peptiden en wordt soms een scaffolding-eiwit genoemd. Het D-eiwit is een ATP-afhankelijke cyclodehydratase die de cyclodehydratatiereactie katalyseert, wat resulteert in de vorming van een azolinering. Dit gebeurt door directe activering van de amide-skeletcarbonyl met ATP, wat resulteert in stoichiometrische ATP-consumptie. [42] De C- en D-eiwitten zijn af en toe aanwezig als een enkel, gefuseerd eiwit, zoals het geval is voor de biosynthese van trunkamide. Het B-eiwit is een flavine-mononucleotide (FMN)-afhankelijk dehydrogenase dat bepaalde azolineringen oxideert tot azolen.

Het B-eiwit wordt meestal het dehydrogenase de C- en D-eiwitten vormen samen de cyclodehydratase, hoewel het D-eiwit alleen de cyclodehydratatiereactie uitvoert. Vroeg werk aan microcine B17 heeft een andere nomenclatuur voor deze eiwitten aangenomen, maar een recente consensus is aangenomen door het veld zoals hierboven beschreven. [1]

Cyanobactines Bewerken

Cyanobactinebiosynthese vereist proteolytische splitsing van zowel N-terminale als C-terminale delen van het voorloperpeptide. De bepalende eiwitten zijn dus een N-terminaal protease, aangeduid als het A-eiwit, en a C-terminale protease, het G-eiwit genoemd. Het G-eiwit is ook verantwoordelijk voor macrocyclisatie.

Voor cyanobactinen wordt het voorloperpeptide het E-peptide genoemd. [1] Minimaal vereist het E-peptide een leiderpeptidegebied, een kern (structureel) gebied en zowel N-terminale als C-terminale proteaseherkenningssequenties. In tegenstelling tot de meeste RiPP's, waarvoor een enkel voorloperpeptide codeert voor een enkel natuurlijk product via een eenzame kernpeptide, kunnen cyanobactine E-peptiden meerdere kernregio's bevatten. Meerdere E-peptiden kunnen zelfs aanwezig zijn in een enkel gencluster. [1] [43]

Veel cyanobactinen ondergaan ook heterocyclisatie door a heterocyclase (aangeduid als het D-eiwit), het installeren van oxazoline- of thiazoline-delen van Ser/Thr/Cys-residuen voorafgaand aan de werking van de A- en G-proteasen. [1] De heterocyclase is een ATP-afhankelijke YcaO-homoloog die zich biochemisch op dezelfde manier gedraagt ​​als YcaO-domein cyclodehydratasen in thiopeptide en lineaire azol(in)e-bevattende peptide (LAP) biosynthese (hierboven beschreven).

Een veel voorkomende modificatie is prenylering van hydroxylgroepen door een F-eiwit prenyltransferase. Oxidatie van azoline-heterocycli tot azolen kan ook worden bewerkstelligd door een oxidasedomein dat zich op het G-eiwit bevindt. Ongebruikelijk voor ribosomale peptiden, kunnen cyanobactinen D-aminozuren bevatten die kunnen voorkomen naast azool- of azolineresiduen. [1] De functies van sommige eiwitten die vaak worden aangetroffen in biosynthetische genclusters van cyanobactine, de B- en C-eiwitten, zijn onbekend.

Thiopeptiden Bewerken

Thiopeptide-biosynthese omvat een bijzonder uitgebreide modificatie van de kernpeptide-steiger. Inderdaad, vanwege de zeer complexe structuren van thiopeptiden, werd algemeen aangenomen dat deze natuurlijke producten niet-ribosomale peptiden waren. De erkenning van de ribosomale oorsprong van deze moleculen kwam in 2009 met de onafhankelijke ontdekking van de genclusters voor verschillende thiopeptiden. [1] [44] [45] [46] [47]

De standaardnomenclatuur voor thiopeptide biosynthetische eiwitten volgt die van de thiomuracine-gencluster. [1] [46] Naast het voorloperpeptide, het A-peptide genoemd, zijn voor de biosynthese van thiopeptiden ten minste zes genen nodig. Deze omvatten lanthipeptide-achtige dehydratasen, aangeduid als de B- en C-eiwitten, die dehydroalanine- en dehydrobutyrineresten installeren door Ser/Thr-precursorresiduen te dehydrateren. De synthese van azool en azoline wordt bewerkstelligd door het E-eiwit, de dehydrogenase, en het G-eiwit, de cyclodehydratase. De stikstofbevattende heterocyclus wordt geïnstalleerd door het D-eiwit cyclase via een vermeende [4+2] cycloadditie van dehydroalanineresten om de karakteristieke macrocyclus te vormen. [48] ​​Het F-eiwit is verantwoordelijk voor de binding van het leiderpeptide. [49]

De biosynthese van thiopeptiden is biochemisch vergelijkbaar met die van cyanobactinen, lanthipeptiden en lineaire azol(in)e-bevattende peptiden (LAP's). Net als bij cyanobactinen en LAP's, vindt azol- en azolinesynthese plaats via de werking van een ATP-afhankelijk YcaO-domein cyclodehydratase. In tegenstelling tot LAP's, waar cyclodehydratie plaatsvindt via de werking van twee verschillende eiwitten die verantwoordelijk zijn voor leiderpeptidebinding en cyclodehydratieve katalyse, worden deze gefuseerd tot een enkel eiwit (G-eiwit) in de biosynthese van cyanobactine en thiopeptide. [1] Echter, in thiopeptiden, een extra eiwit, genaamd de Ocin-ThiF-achtig eiwit (F-eiwit) is nodig voor de herkenning van leiderpeptiden en mogelijk voor het werven van andere biosynthetische enzymen. [49]

Lasso-peptiden Bewerken

Lasso-peptidebiosynthese vereist ten minste drie genen, de A-, B- en C-eiwitten genoemd. [1] [15] Het A-gen codeert voor het voorloperpeptide, dat door de B- en C-eiwitten wordt gemodificeerd tot het rijpe natuurlijke product. Het B-eiwit is een adenosinetrifosfaat-afhankelijk cysteïneprotease dat het leidergebied afsplitst van het voorloperpeptide. Het C-eiwit vertoont homologie met asparaginesynthetase en men denkt dat het de carbonzuurzijketen van een glutamaat- of aspartaatresidu activeert via adenylylering. Het N-terminale amine gevormd door het B-eiwit (protease) reageert vervolgens met deze geactiveerde zijketen om de macrocyclische vormende isopeptidebinding te vormen. De exacte stappen en reactietussenproducten in de biosynthese van lasso-peptiden blijven onbekend vanwege experimentele problemen die verband houden met de eiwitten. [15] Gewoonlijk wordt het B-eiwit de lasso protease, en het C-eiwit wordt aangeduid als de lasso cyclase.

Sommige biosynthetische genclusters van lasso-peptiden vereisen ook een extra eiwit met onbekende functie voor biosynthese. Bovendien bevatten lasso-peptide-genclusters gewoonlijk een ABC-transporter (D-eiwit) of een isopeptidase, hoewel deze niet strikt vereist zijn voor de biosynthese van lasso-peptiden en soms afwezig zijn. [15] Er is nog geen röntgenkristalstructuur bekend voor enig biosynthetisch eiwit van lasso-peptide.

De biosynthese van lasso-peptiden is bijzonder interessant vanwege de ontoegankelijkheid van de draadlasso-topologie voor chemische peptidesynthese.


Antimicrobiële peptiden zijn effectief tegen biofilms van Pseudomonas aeruginosa

Figuur 1 . Peptoïde submonomeer chemische structuren.

Activiteiten van peptoïden tegen planktoncellen.

Biofilm vorming test.

Fig. 2 . Werkzaamheid van antimicrobiële peptoïden, AMP's en conventionele antibiotica tegen biofilmvorming (A en B) en voor het losmaken van reeds bestaande P. aeruginosa-biofilms (C en D) voor twee verschillende groepen geteste antimicrobiële verbindingen. Preventie van biofilmvorming en losraken van bestaande biofilms worden uitgezet als percentage biomassa, zoals geanalyseerd met een kristalviolette (CV) kleuringstest.

Biofilm loslating test.

Levensvatbaarheid van de cel.

Afb. 3 . Effecten van antimicrobiële stoffen (getest bij 12,5 en 100 M) op de levensvatbaarheid van cellen bij het voorkomen van de vorming van biofilms (A) en bij het verminderen van de gevestigde P. aeruginosa (PA 14) biofilms (B). Alle symbolen (∼, #, - en *) geven aan dat de waarden voor antimicrobiële stoffen bij 12,5 M statistisch significant verschillen (P < 0,001) van de waarde zonder antimicrobieel middel (blanco). Verschillende symbolen geven een statistisch significant verschil aan (P < 0,001) tussen verbindingen met twee verschillende symbolen (bijv. peptoïden 1 en 1-C134mer) maar niet tussen verbindingen met hetzelfde symbool (bijv. ciprofloxacine en tobramycine in paneel A). De afwezigheid van een symbool geeft aan dat er geen statistisch significant verschil is met de waarde zonder antimicrobiële stof. Statistische significantie bij 100 M wordt niet getoond.

13.6F: Antimicrobiële peptiden - Biologie

De microbiologische test van virtuele kolonies (VCC) wordt al meer dan tien jaar gebruikt om het effect van antimicrobiële peptiden zoals defensines en LL-37 tegen een verscheidenheid aan bacteriën te meten. (Ericksen et al., 2005 Zhao et al., 2013). Het leidt de antimicrobiële activiteit af op basis van de kwantitatieve groeikinetiek van 200 μL batchculturen van bacteriën die zijn gekweekt in platen met 96 putjes met behulp van een methode voor het tellen van levensvatbare cellen (Brouwster, 2003) die wiskundig identiek is aan de methode voor het tellen van amplicons die wordt gebruikt door kwantitatieve real-time PCR (Heid et al., 1996). De oorspronkelijk gepubliceerde plaatconfiguratie omvatte een ring van 36 putjes die niet-geïnoculeerde Mueller Hinton Broth (MHB) bevatten die kruisbesmetting kan detecteren (Ericksen, 2014b). Er waren aanwijzingen dat bacteriën tijdens de test klonten en biofilms zouden kunnen vormen, inclusief verstrooiing die detecteerbaar is door de plaatlezer en de aanwezigheid van alomtegenwoordige macroscopische klontering in tryptische sojabouillon. 10 μL-monsters van controleputjes voor kruisbesmetting die troebel waren geworden na VCC-experimenten, werden Gram-gekleurd, waarbij weinig klonten werden onthuld. Blijkbaar werden de meeste klonten niet op het glas vastgehouden tijdens de Gram-kleuringsprocedure (Gram, 1884), of ze nu op het objectglaasje waren gefixeerd door hitte of methanol. De toepassing van lactofenol katoenblauw, gewoonlijk gebruikt om schimmels zichtbaar te maken door celwandpolysachariden zoals chitine te kleuren, onthulde cirkels en ringen die consistent waren met het gekarameliseerde residu van polysachariden, waaronder vermoedelijk kapselpolysachariden en slijm dat gelijktijdig werd uitgescheiden met klonter- en biofilmvorming. Deze donkerblauwe cirkels en ringen zouden consistent kunnen zijn met een heterogene subpopulatie van E. coli of met een lichte besmetting met een tweede stam.

Materialen en methoden Virtuele kolonietelling

De VCC-test werd uitgevoerd met behulp van de 36 randputjes om verontreiniging te detecteren zoals oorspronkelijk beschreven (Ericksen et al., 2005), behalve dat een rechthoekig stuk Parafilm M (6 × 0,25 vierkanten) rond de 96-wells plaat was gewikkeld voordat de start van de 2-uurs en 12-uurs plaatlezer runs. Parafilmstrips bleven bijna volledig intact en op hun plaats gedurende de 12 uur durende run bij 37°C en resulteerde in de volledige afwezigheid van stof dat groot genoeg was om zichtbaar te zijn met een Olympus 8Z61 kristallografische microscoop op de richel tussen de 96 putjes en de rand van de plaat, behalve een enkele vlek in een experiment waargenomen in de buurt van een scheur in de Parafilm. Parafilm voorkwam ook de zichtbare afname van het volume van de randputjes als gevolg van verdamping die het oorspronkelijk noodzakelijk maakte om deze putjes uit te sluiten van het experimentele gedeelte van de test (Ericksen et al., 2005). Deze verdamping veroorzaakte ook een lichte progressieve toename van de optische dichtheid tot een maximale ΔOD 650 van 0,004 tussen de randputten in de loop van het 12-uur durende experiment naarmate de Mueller Hinton Broth meer geconcentreerd werd. Deze verdamping was te gering om experimentele (geïnoculeerde) putjes meetbaar te beïnvloeden of de lineariteit van de ijkcurve te beïnvloeden. 10 µL monsters van randputjes werden toegevoegd aan druppeltjes steriel water of media en uitgespreid op Mueller Hinton Agar, Tryptic Soy Agar en Sabouraud’s Agar-platen. Kolonies werden geanalyseerd door morfologie, natte afzettingen, Gram-kleuringen en biochemische analyse met behulp van Becton Dickinson Enteropluri Productnummer 261185.

Figuur 1. Kwantitatieve groeikinetiek (QGK) en de lactofenol katoenblauwe Gramkleuring.

Lactofenol Cotton Blue Gram-kleuringsprocedure. Nachtelijke stappen zorgden voor een evenwicht met de luchtvochtigheid tijdens de zomermaanden in het IHV-gebouw bij UMB, die varieerde van 40�%. Watergehalte en temperatuur kunnen belangrijke factoren zijn om het karamelisatieproces kwantitatief reproduceerbaar te maken.

Glasplaatjes werden geschrobd met PCMX-handzeep met behulp van een pijpreiniger. 10 µL cellen die werden bemonsterd uit platen met 96 putjes na VCC-assays met tweemaal geconcentreerde MHB in de uitgroeistap, werden aan de objectglaasjes toegevoegd en gedurende de nacht in evenwicht gebracht met omgevingsvochtigheid. De objectglaasjes werden met warmte gefixeerd door het monster op het punt in de ruimte aan de bovenste punt van de binnenste blauwe vlam van een bunsenbrander driemaal gedurende één seconde te plaatsen, waarbij het objectglaasje tussendoor één seconde werd verwijderd (Figuur 1). De relatieve vochtigheid van de omgeving was 40�%. De objectglaasjes werden gekleurd met Fluka Analytical Gram Staining Kit Productnummer 77730 en opnieuw een nacht in verticale positie geëquilibreerd met omgevingsvochtigheid. Becton Dickinson Lactophenol Cotton Blue Stain Droppers Productnummer 261188 werden aangebracht op het Gram-gekleurde monster en digitale beelden werden vastgelegd met behulp van een Amscope-lichtmicroscoop bij een vergroting van 160×, 400× en 1600× en Toupview-software. De drempelfunctie van Adobe Photoshop werd toegepast op de 400'x00d7 digitale afbeeldingen met een drempelwaarde van 100. Zwarte pixels werden geteld met behulp van de histogramfunctie.

Resultaten Er werden klonten waargenomen in E. coli-culturen en in open cuvetten

Macroscopische klonten werden waargenomen in TSB-batchculturen van 25 ml van E. coli ATCC ® 25922™ gekweekt bij 37°C in de vroege exponentiële fase tot een verwachte optische dichtheid bij 650 nm (OD 650) van ongeveer 0,3. Een onbedekt monster van 1 ml dat in een cuvet werd geplaatst en tot kamertemperatuur werd afgekoeld, vormde snel kleine macroscopische klonten (tot ongeveer 1 mm in diameter), waarvan sommige beweeglijk waren en in een gesynchroniseerde golf naar beneden zwommen om een ​​enkele grote macroscopische klont te vormen (omhoog tot 1 cm lang, gelijk aan de kuvetbreedte) aan de onderkant van de kuvet. OD 650 kelderde tot 2% per minuut en bereikte een evenwicht na een afname van 10% bij plaatsing in een HPLC-detector op kamertemperatuur, terwijl cellen in suspensie zich bij de klomp onder het lichtpad voegden. De optische dichtheidsmetingen namen zo snel af dat alleen de eerste twee cijfers van de vier gerapporteerd door de Waters 600-detector konden worden geregistreerd. Bij het observeren van cuvetten die dergelijke klonten bevatten, was het duidelijk dat cohesie, in plaats van hechting, belangrijker was, aangezien de klonten naar beneden bewogen van de ene hoek naar de andere hoek van de cuvette terwijl deze met de hand werd geroteerd.

Sanering van klontering en gebruik van een open kuvet als biosensor

Macroscopische klontering in de batchcultuur of cuvet buiten de detector werd niet langer waargenomen na vier veranderingen: 1. gebruik van een kleine HEPA-gefilterde luchtreiniger, 2. vervanging van intern gedeïoniseerd Milli-Q-water door gekocht water van moleculair biologische kwaliteit, 3.vervanging van 2×MHB die in-house is bereid en geautoclaveerd met herbruikbare potten door Teknova 2× kation-aangepaste MHB, en 4. filtersteriliserende fosfaatbuffers gemaakt in de buurt van de draagbare luchtreiniger, in plaats van autoclaveren in herbruikbare potten. Zelfs na deze herstelmaatregelen vormden onbedekte monsters van 1 ml die gedurende 2 uur in de detector waren geplaatst een macroscopische klont aan de basis van de cuvet, vergezeld van een afname van de optische dichtheid, wat suggereert dat ten minste één klonterende omgevingsfactor (CEF) was geconcentreerd door de ventilator en filter in de detector fungeren als stofvanger. Zo dienden monsters van 1 ml van E. coli ATCC ® 25922™ als biosensoren voor CEF's, en de detector diende als een biosensor-positieve controle.

E. coli-cellen waren ook beweeglijk op platen

Hoekzoekende motiliteit van E. coli ATCC ® 25922™ werd ook waargenomen op MH-agarplaten gewikkeld in Parafilm en gedurende 2 weken bij kamertemperatuur geïncubeerd, zoals blijkt uit de vorming van een

1 cm brede confluente ring rond de gehele rand van de plaat, hoewel confluente gebieden en afzonderlijke kolonies die oorspronkelijk na 1𠄲 dagen verschenen, gescheiden waren van de rand.

Celklontering ging gepaard met kruisbesmetting in VCC-randputten

De UMB VCC-procedure was gevoelig voor kruisbesmetting in de 36 niet-geïnoculeerde randputjes, wat mogelijk aangeeft dat klonteren de deeltjesgrootteverdeling en adhesieve eigenschappen van de cellen beïnvloedt, wat op zijn beurt de aerosolvorming tijdens het pipetteren bevordert (Ericksen, 2014b). Figuur 2 toont cellen die zijn bemonsterd uit een kruisbesmet randputje na opslag bij 4°C. De UCLA VCC-methode, met cellen in 10 µL gepipetteerd onder 90 µL in plaats van een 50 µL suspensie toegevoegd aan 50 µL als druppeltjes van bovenaf, (Welkos et al., 2011) minimaliseert de kans op kruisbesmetting. -besmetting en is een veiligere en effectievere methode voor het overbrengen van bacteriën zoals de gevaarlijke BSL-3-pathogeen Bacillus anthracis.

Figuur 2. Blue Gram-kleuring en drempelwaarden bij een vergroting van 400×.

A: Blauwe ringen geven het polysacharideresidu aan van klompjes cellen die vermoedelijk van de objectglaasjes zijn gewassen tijdens de Gram-kleuringsprocedure. Deze polysachariden waren onzichtbaar bij inspectie na Gram-kleuring en vóór het aanbrengen van lactofenol-katoenblauw. Andere experimenten produceerden kleinere donkerblauwe cirkels in plaats van ringen. B : Drempelresultaten. Een grote meerderheid van zwarte pixels bevindt zich in de polysacharideringen.

De blauwe Gram-kleuring onthult polysachariden die onzichtbaar zijn na alleen Gram-kleuring

De lactofenol katoenblauwe Gramkleuring (BGS) onthulde alomtegenwoordige cirkelvormige of ringvormige structuren die donkerblauw kleurden (Figuur 2A). Alle cellen kleurden lichtblauw omdat alle cellen geglycosyleerd zijn en polysachariden uit de media concentreren als onderdeel van hun metabolisme. Zeldzame gebieden met onduidelijke blauwe kleuring werden ook waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van zetmeel en andere polysachariden die aanwezig zijn in MHB, wat suggereert dat de intensiteit van blauwe kleuring ook zou kunnen ontstaan ​​door zetmeel en andere koolhydraten met de capsulaire polysachariden. MHB bevat 1,5 g/L zetmeel, plus een verscheidenheid aan andere koolhydraten in rundvleesextract. Koolhydraten, die Maillard-reactie (Maillard, 1912) en karamelisatieproducten moeten hebben omvat, hechtten zich aan het glas in de intense hitte van de fixatiestappen en bleven op het glaasje gedurende de Gram-kleuringsprocedure. Deze polysacharideresten waren onzichtbaar toen dezelfde glaasjes werden waargenomen na Gram-kleuring en vóór het aanbrengen van lactofenol-katoenblauw. De intensiteit van donkerblauwe kleuring suggereert overvloedige capsule- en slijmvorming.

Polysacharidekleuring kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door middel van drempelwaarde

Het toepassen van de drempeltechniek met behulp van een drempel van 100 onderscheidde de donkere van de lichte kleuring met weinig zichtbare achtergrondruis (Figuur 2B). Drempelwaarde voor BGS-beelden vastgelegd met een vergroting van 160× en 1600× (Figuur 3 ) is ook mogelijk met de Amscope-microscoop. Pixelvorming kan echter onnauwkeurigheid toevoegen bij 160× en de grote omvang van de klonten zou de variabiliteit van veld tot veld vergroten bij 1600×. TSB- of MHB-culturen van E. coli ATCC ® 43827™ (ML-35) produceerden onder geen enkele omstandigheid macroscopische klonten in verschillende experimenten die in 2013 en 2014 werden uitgevoerd, wat aangeeft dat de waargenomen klontering stamafhankelijk is.

Afbeelding 3. Blauwe Gramkleuring resulteert bij een vergroting van 160×, 400× en 1600×.

A – C : 160×. D – F : 400×. G – I : 1600×. Cellen werden bemonsterd uit de randputjes van een ander virtueel kolonietellingsexperiment dan Figuur 2 .

VCC-kruisbesmetting is normaal gesproken een zeldzame gebeurtenis

De geschiedenis van honderden VCC-experimenten aan de UMB tussen 2003 en 2014 (Ericksen et al., 2005 Pazgier et al., 2012 Rajabi et al., 2012 Wei et al., 2009 Wei et al., 2010 Wu et al., 2005 Wu et al., 2007 Xie et al., 2005a Xie et al., 2005b Zhao et al., 2012 Zhao et al., 2013 Zou et al., 2008) laat duidelijk zien dat randputten bijna altijd helder zijn, niet troebel, na de 12 uur durende uitgroeifase van VCC-experimenten. In een periode van 1 maand in augustus en september 2013 werden 13 viervoudige kalibratie-experimenten uitgevoerd met dezelfde pipetteertechniek als de zesvoudige kalibratie-experimenten in de oorspronkelijke VCC-publicatie (Ericksen et al., 2005). In de experimenten van 2013 waren echter vier in plaats van zes kalibratiecurven beperkt tot 32 interne putten (C3-F10). Deze experimenten gebruikten de rijke media MHB, TSB of kleine variaties daarvan. De uitwendige 64 putjes (rijen A, B, G en H en kolommen 1, 2, 11 en 12) bevatten twee ringen met verontreinigingscontroleputjes in plaats van de enkele ring van 36 putjes die oorspronkelijk werd gebruikt. In deze experimenten die net buiten een bioveiligheidskast werden uitgevoerd die werd gebruikt voor VCC-experimenten, werd geen van de 832 controleputjes voor contaminatie troebel na de incubatie van 12 uur. Ervan uitgaande dat klonteren wordt veroorzaakt door een omgevingsfactor, suggereren deze experimenten sterk dat CEF's die aanwezig zijn in de laboratoriumomgeving overweldigend niet-kweekbaar zijn in rijke media zoals MHB of TSB. Een alternatieve verklaring van zeldzame celklontering en zeldzame paradoxale punten is dat bacteriële cellen een mechanisme hebben om zelden en constitutief klontering en biofilmvorming te induceren, zelfs in de afwezigheid van een veroorzaker of contaminant. Als celklontering wordt veroorzaakt door een verontreiniging, zijn er verschillende mogelijke bronnen in de laboratoriumomgeving. Naast levensvatbare besmetting kunnen niet-kweekbare bacteriën invloed uitoefenen op snelgroeiende E. coli-cellen. Verder is het bekend dat nucleïnezuren ervoor zorgen dat cellen samenvloeien tot klonten over een brede grootteverdeling in zowel bacteriële als zoogdiercelkweek. In de lucht zwevende CEF's die kleiner zijn dan een bacteriecel, zouden met weinig of geen weerstand door de HEPA-filters kunnen gaan, wat betekent dat deze moleculen van invloed kunnen zijn geweest op experimenten die zowel binnen als buiten bioveiligheidskasten zijn uitgevoerd. Maatregelen zoals trypsinisatie, behandeling met andere proteasen en behandeling met nucleasen zoals benzonase worden gewoonlijk toegepast om klontering te verminderen of te elimineren (Kruse & Patterson, 1973). Voor hetzelfde doel werd afschuiving toegepast in VCC-kalibratiecurven door pipetpunten in contact te brengen met de dwarsdoorsnedehoek van elk putje wanneer 15 keer op en neer wordt gepipetteerd om te mengen (Ericksen, 2014b), hoewel groeicurven tekenen vertoonden van grote klonten. genoeg om meetbare verschillen in optische dichtheid te produceren die aan exponentiële groei voorafgingen. Klontering had geen effect op de lineariteit van de kalibratiecurve, wat mogelijk aangeeft dat een klein deel van de cellen routinematig groeit als klonten en biofilms in afwezigheid van antimicrobiële middelen.

Discussie Klompvorming kan leiden tot persisters die resistent zijn tegen antimicrobiële peptiden

De aanwezigheid van polysachariden geassocieerd met E. coli ATCC ® 25922™ cohesie suggereert dat in de omstandigheden die bij UMB zijn bestudeerd, deze stam klontering gebruikt, mogelijk als een afweermechanisme. Het vormen van een klonter omringd door polysachariden zou kunnen bijdragen aan resistentie tegen antimicrobiële lectines zoals defensines (Wang et al., 2003) die aan het oppervlak zouden worden gebonden en geremd, waardoor verdere diffusie naar binnen zou worden beperkt en persistente cellen zouden worden beschermd (Ericksen et al., 2005) in het midden van de klomp. Deze overlevenden zouden kunnen bijdragen aan de afwijking van eenvoudige exponentiële doding (Luria & Latarjet, 1947) waargenomen in alle VCC-onderzoeken bij UMB van defensine-activiteit tegen E. coli. Ze zouden ook de aanwezigheid van paradoxale datapunten kunnen verklaren die af en toe worden waargenomen in de geschiedenis van VCC-experimenten bij UMB. Zo veroorzaakte het defensine HNP1 bij de hoogste concentratie van 256 µg/ml een grotere overleving dan 128 µg/ml in de initiële VCC-studie (Ericksen et al., 2005). MHB bevat een aanzienlijke hoeveelheid (1,5 g/L ) van toegevoegd zetmeel. Polysachariden in rijke media zouden kunnen bijdragen aan de volledige remming van antimicrobiële peptiden, wat essentieel is voor VCC-assays om overlevende bacteriën te kunnen inventariseren met behulp van de QGK-gegevensanalysemethode. Kwalitatieve defensine-lectine-activiteit volgt in het algemeen de hiërarchie: geglycosyleerde eiwitten > vertakte polysachariden > lineaire polysachariden > oligosachariden > monosachariden. (Lehrer, R.I., persoonlijke communicatie) Bacterieel slijm en capsules zijn sterk vertakt en bevatten geglycosyleerde eiwitten (Wilkinson, 1958). Als remming hetzelfde kwalitatieve patroon volgt als binding, zouden bacteriële capsulaire polysachariden krachtige defensineremmers zijn. Klomp-, biofilm- en capsulevorming is mogelijk gedeeltelijk geëvolueerd als resistentiemechanismen tegen de oude selectiedruk die door de hele levensboom wordt uitgeoefend door antimicrobiële peptiden in de omgeving.

Klompvorming suggereert dat glycosidase-activiteit essentieel is voor de werkzaamheid tegen persisters

Een mogelijk gevolg van de remming van defensines door polysacchariden zou kunnen zijn dat therapieën met lectine antimicrobiële peptiden als actieve ingrediënten niet effectief zouden zijn tegen klonten of biofilms in afwezigheid van ten minste één ander actief ingrediënt dat de polysaccharidecapsule afbreekt, zoals een glycosidase. Omdat polysacharidestructuren in capsules en slijm sterk variëren, evenals de specificiteiten van glycosidasesubstraten, is het mogelijk dat een bepaald enzym slechts tegen een beperkt aantal bacteriën actief is. In de afwezigheid van in vivo glycosidasen zou activiteit tegen een breed spectrum van pathogene bacteriën daarom een ​​enzymcocktail van glycosidasen vereisen die het lectine antimicrobiële peptide of een glycosidase met ongewoon promiscue substraatspecificiteit vergezellen.


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


13.6F: Antimicrobiële peptiden - Biologie

Neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Huntington [1] zijn belangrijke gevolgen van abnormale apoptose van neuronen. Deze abnormale apoptose is ook verantwoordelijk voor het optreden van een hartinfarct [2] en leverziekten [3]. Recent beschikbare medicamenteuze behandelingen zijn gedeeltelijk effectief, omdat ze alleen de functie verbeteren van de neuronen die nog in leven zijn, maar ze hebben geen invloed op de onderliggende mechanismen die tot hun dood leiden [ 4 ].

Caspasen, een groep cysteïneproteasen, zijn proteolytisch van aard en de belangrijkste uitvoerders van apoptose [5]. Caspase-3 is van bijzonder belang bij deze caspases omdat het verantwoordelijk is voor de progressie van AD. Caspasen kunnen worden ingedeeld in twee brede categorieën: ten eerste, initiator-caspasen (caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10), en ten tweede effector-caspasen (caspase-3, caspase-6 en caspase-7). ). Initiator-caspasen werken over het algemeen in de vroege stadia van een proteolytische cascade, terwijl effector-caspasen stroomafwaarts werken en betrokken zijn bij de splitsing van specifieke cellulaire eiwitten [ 6 ].

De initiatie van de caspase-cascadereactie kan alleen worden gereguleerd door caspaseremmers. Remmers van caspase-3 werden beschreven als veelbelovende cardioprotectanten [7], neuroprotectanten [8] en hepatoprotectanten [9]. Van veel verbindingen zoals isatines [10], peptidealdehyden [11] en homoftalimiden [12] is gerapporteerd dat ze caspaseremmers zijn vanwege het hebben van elektron-deficiënte carbonylen die een interactie aangaan met de doelwitplaats en remmende reacties vertonen. Er zijn verschillende onderzoeken beschikbaar over farmacofoor- en structuurgebaseerde geneesmiddelenontwerp van peptide- en niet-peptide-caspase-3-remmers, waaronder verschillende caspase-3 PDB-ID's. Bindingsinteracties van deze remmers zijn bijna vergelijkbaar in de bindingsholte van caspase-3. Lakshmi et al. hebben ligand- en structuurgebaseerde virtuele screening uitgevoerd op caspase-3-remmers. Ze gebruikten een andere kern, maar dezelfde activiteitstest. Ze hebben PDB ID 1PAU gebruikt en bijna vergelijkbare interacties gerapporteerd (waterstof-binding interacties tussen de verbinding en Arg 207 en tussen Ser 209 en Trp214) zoals we rapporteren in de huidige studie [13]. Alle bovenstaande onderzoeken zijn beschikbaar over verschillende kernen en verschillende caspase-3 PDB-ID's, maar tot nu toe is er geen studie beschikbaar over pyrrolo[3,4-c]chinoline-1,3-dionen met PDB-ID: 1GFW. Over het algemeen zijn krachtige caspase-3-remmers die tot nu toe zijn gerapporteerd, peptiden van aard [14 – 17]. Dergelijke remmers krijgen echter vaak een slechte celpermeabiliteit en een lage metabole stabiliteit [18]. Dit probleem kan worden overwonnen door de ontwikkeling van niet-peptide kleinmoleculige remmers van caspase-3.

Farmacofoormodellering is de afgelopen jaren een van de belangrijke en succesvolle op liganden gebaseerde benaderingen geweest voor het ontdekken van nieuwe geneesmiddelen [19 – 21]. Het is gedefinieerd als een term die de configuraties van chemische kenmerken weergeeft die gemeenschappelijk zijn voor alle liganden. Een farmacofoorhypothese verzamelt de gemeenschappelijke kenmerken verdeeld in de driedimensionale ruimte die groepen in een molecuul vertegenwoordigen die deelnemen aan belangrijke interacties tussen het medicijn en de actieve plaats [22]. Bij de zoektocht naar een nieuw medicijn dient een farmacofoor vaak als template voor het gewenste ligand [23, 24].

In de huidige studie hebben we een op atomen gebaseerd 3D-farmacofoormodel ontwikkeld met behulp van de PHASE-module, die de belangrijkste structurele kenmerken biedt die nodig zijn voor de biologische activiteit. Verder werden bindingsinteracties van actieve moleculen geanalyseerd in bindingspocket van caspase-3 met behulp van Glide the in SP-modus. Op een atoom gebaseerd 3D-QSAR-model genereert kubussen die de structurele kenmerken benadrukken die nodig zijn voor caspase-3-remming. Dit stukje informatie kan nuttig zijn voor het verder ontwerpen van krachtigere caspase-3-remmers.

Het rekenwerk is uitgevoerd op Red Hat Linux Enterprise 3.0 met Intel Pentium Core 2-Duo-processor, 1'2009GB RAM en 120'2009GB (harde schijf). Alle constructies zijn gebouwd op Maestro 8.5, een module van Schrodinger [25]. Verder werd PHASE 3.0-module [26] gebruikt voor farmacofoormodellering.

Een dataset van 82 verbindingen werd geselecteerd uit twee series caspase-3-remmers met vergelijkbare basiskernen en activiteitstests [27, 28].

De constructies werden gebouwd, gevolgd door schone geometrie en energieminimalisatie met de OPLS'x5f2005 krachtveldmethode. De activiteitsgegevens voor elke verbinding werden genomen als negatieve logaritmen van IC50 waarden (molair). Alle structuren van verbindingen met hun waargenomen en voorspelde activiteitengegevens worden gegeven in Tabellen 1 en 2 .

Caspase-3-remmers (Series I) met de waargenomen en de voorspelde biologische activiteiten.

Verbinding R1 R2 IC50 (M) pIC50 opgemerkt pIC50 voorspelde
6b F H 0.0000628 4.20204 4.31
6c Br H 0.0000371 4.430626 4.76
6d H 2.1 E - 07 6.677781 6.34
6e H CH3 6.36 E - 06 5.196543 4.72
6f* Br CH3 1.58 E - 06 5.801343 5.28
6g* CH3 4.4 E - 08 7.356547 6.91
6u H CH2CO2CH3 4.65 E - 06 5.332547 5.35
6i* F CH2CO2CH3 0.0000025 5.60206 5.45
6j Br CH2CO2CH3 4.6 E - 07 6.337242 5.90
6k CH2CO2CH3 1.6 E - 08 7.79588 7.48
6l H CH2CH2CO2CH3 0.0000233 4.632644 4.63
6m* F CH2CH2CO2CH3 0.0000055 5.259637 5.48
6n Br CH2CH2CO2CH3 1.08 E - 06 5.966576 5.94
6o CH2CH2CO2CH3 3.7 E - 08 7.431798 7.66
6p H 8.11 E - 06 5.090979 5.33
6q* Br 2,54 E - 06 5.595166 5.89
6r 1.5 E - 08 7.823909 7.46
6t Br 3.6 E - 07 6.443697 6.71
6u* DUS3H 9 E - 08 7.045757 7.16
6z 1.6 E - 08 7.79588 8.01
8a* 3.3 E - 08 7.48148 7.12
8b 2 E - 08 7.69897 7.72
8c 2.1 E - 08 7.677781 7.90
8d 2.3 E - 08 7.638272 7.54
8e 5.5 E - 08 7.259637 7.01
8f 4 E - 09 8.39794 8.37

* Verbindingen die betrokken zijn bij de testset.

Caspase-3-remmers (Series II) met de waargenomen en de voorspelde biologische activiteiten.

Verbinding R IC50 (M) pIC50 opgemerkt pIC50 voorspelde
3 5.4 E - 08 7.268 7.23
4 2.3 E - 08 7.638 7.70
5 4.1 E - 08 7.387 7.48
6 5.5 E - 06 5.26 6.05
7 2 E - 08 7.699 7.89
8 3.2 E - 08 7.495 7.37
9 9.7 E - 08 7.013 6.90
10 5.6 E - 08 7.252 7.01
11 5.8 E - 08 7.237 7.16
12 5.5 E - 08 7.26 7.12
13* 5.3 E - 08 7.276 7.02
14* 2.4 E - 08 7.62 7.27
15 1,52 E - 07 6.818 6.64
16 1.96 E - 07 6.708 6.30
18 3 E - 08 7.523 7.38
19* 2.1 E - 08 7.678 7.67
20 8.5 E - 08 7.071 6.96
21 1.1 E - 08 7.959 8.02
22 1.1 E - 08 7.959 7.53
23 6.61 E - 07 6.18 6.21
24 7.3 E - 08 7.137 7.02
25 3.7 E - 08 7.432 7.59
26 1.9 E - 08 7.721 7.58
28 2.4 E - 08 7.62 7.57
29 2.3 E - 06 5.638 6.54
30 2.4 E - 08 7.62 7.64
31 8 E - 09 8.097 8.11
32 2.2 E - 08 7.658 7.73
33 2 E - 08 7.699 7.91
34 1 E - 08 8 7.92
35* 9 E - 09 8.046 7.41
36 2.2 E - 08 7.658 7.78
37* 4.06 E - 07 6.391 7.26
38 2 E - 08 7.699 7.32
39* 3.5 E - 08 7.456 7.58
40* 1.7 E - 08 7.77 7.45
41* 1.3 E - 08 7.886 7.51
42 1.4 E - 08 7.854 7.94
43 8 E - 09 8.097 8.40
44 9 E - 09 8.046 8.37
45 6 E - 09 8.222 8.36
46 6 E - 09 8.222 8.16
47* 5 E - 09 8.301 8.01
48 5 E - 09 8.301 8.45
49 3 E - 09 8.523 8.42
51* 4 E - 09 8.398 8.47
54 1.2 E - 08 7.921 7.88
55* 1.8 E - 08 7.745 7.91
56 1.4 E - 08 7.854 8.00
57* 1.3 E - 08 7.886 7.98
58 3 E - 09 8.523 8.19
59* 8.2 E - 08 7.086 8.05
60 1.5 E - 08 7.824 7.32
61 4,04 E - 07 6.394 6.21
62 1.8 E - 08 7.745 7.65
63 2.98 E - 06 5.526 6.46

* Verbindingen die betrokken zijn bij de testset.

PHASE, versie 3.0, werd gebruikt voor farmacofooropheldering en QSAR-modelbouw. Het biedt zes ingebouwde soorten farmacofoorkenmerken: waterstofbrugacceptor (A), waterstofbrugdonor (D), hydrofoob (H), negatief ioniseerbaar (N), positief ioniseerbaar (P) en aromatische ring (R) . Liganden werden verwerkt met het LigPrep-programma om protoneringstoestanden toe te wijzen die geschikt zijn voor pH 7,0. Alle moleculen werden als actief beschouwd voor het bouwen van de hypothese. Het genereren van conformeren voor elk ligand werd uitgevoerd met de ConfGen-methode waarbij het maximale aantal conformeren werd ingesteld op 100 per ligand en het totale aantal stappen per roteerbare binding werd ingesteld op 100 (Tabel 3). Voor deze methode werd bemonstering van de conformationele ruimte gedaan in de snelle modus. Het maximale relatieve energieverschil was 10 Kcal/mol. Afstandsafhankelijke diëlektrische reddingsbehandeling werd uitgevoerd. Zowel de pre- als de post-procesminimalisatiestappen werden respectievelijk ingesteld op 100 en 50. De minimalisatie en energieberekening zijn gedaan met behulp van de OPLS'x5f2005 krachtveldmethode. De standaard farmacofoor-functiedefinities werden gebruikt voor het genereren van sites. Na het genereren van de site werd de gemeenschappelijke farmacofoor doorzocht uit een reeks varianten die werd gegenereerd door een systematische variatie van het aantal sites. Variant AAHRR waarvoor alle verbindingen waren gematcht, werd doorzocht om de beste algemene farmacofoorhypothese (AAHRR.6) te genereren op basis van de overlevingsscore per FASE.De minimale afstand tussen twee willekeurige locaties was ingesteld op 2 Å en de maximale boomdiepte was ingesteld op 4 met een uiteindelijke doosgrootte van 1 Å. De overlevingsscore van de hypothese kan worden bepaald met behulp van de volgende formule: overlevingsscore = (Vectorscore) + (Sitescore) + (Volumescore) + (Selectiviteitsscore) + (Aantal actieven die overeenkomen met de hypothese − 1) − (Referentie-ligand relatieve conformationele energie) + (Referentie-ligandactiviteit). Hypothese AAHRR.6 werd geselecteerd als de beste hypothese omdat deze een hogere overlevingsscore (3.785) heeft dan andere (tabel 4). De hoogste overlevingsscore voor de algemene farmacofoorhypothese geeft de beste afstemming van de actieve liganden op deze hypothese. Deze uitlijning geeft de fitness aan alle remmers. De best uitgelijnde ligand geeft de maximale fitheid. De best gescoorde hypothese werd vervolgens gebruikt om een ​​op atomen gebaseerd 3D-QSAR-model te bouwen. Op farmacofoor gebaseerde QSAR's houden geen rekening met ligandkenmerken buiten het farmacofoormodel, zoals mogelijke sterische botsingen met de receptor. Dit vereist overweging van de gehele moleculaire structuur, daarom is een op atomen gebaseerd QSAR-model nuttiger bij het verklaren van de structuur-activiteitsrelatie. In op atomen gebaseerde QSAR wordt een molecuul behandeld als een set overlappende van der Waals-bollen [22].

De ontwikkeling van een farmacofoormodel werd uitgevoerd na het verdelen van de dataset van 82 verbindingen in training (62 verbindingen) en testsets (20 verbindingen) en na toepassing van PLS-factor 4 en rasterafstand 1 Å. De selectie van de trainingsset werd gedaan op basis van de informatie in termen van zowel structurele kenmerken als biologische activiteitsbereiken van moleculen. De trainingsset omvatte de verbindingen die alle activiteiten omvatten (hoog, matig en laag actief) [29]. De trainingsset van 62 verbindingen werd gebruikt voor de ontwikkeling van 3D-QSAR-modellen op basis van atomen. In deze studie werden de meeste actieve verbindingen (verbindingen 49 en 58) gesuperponeerd in bindingsholte met betrekking tot algemene farmacofoorhypothesen om uit te leggen waarom ze vergelijkbaar zijn in activiteit.

Dit wordt gedaan om de interne stabiliteit en het voorspellend vermogen van de QSAR-modellen te testen. Ontwikkelde QSAR-modellen werden gevalideerd door de volgende procedures [30].

Interne validatie werd uitgevoerd met behulp van de leave-one-out (q 2, LOO) methode. Voor het berekenen van q2 werd elk molecuul in de trainingsset één keer geëlimineerd en werd de activiteit van het geëlimineerde molecuul voorspeld door gebruik te maken van het model dat door de resterende moleculen was ontwikkeld. De q 2 werd berekend met behulp van de volgende vergelijking die de interne stabiliteit van een model beschrijft: (1) q 2 = 1 - ∑ i = 1 N ( y pred , i - yi ) 2 ∑ i = 1 N ( yi - ym ) 2 , waarbij yi en y pred , i respectievelijk de feitelijke en de voorspelde activiteiten van het i-de molecuul in de trainingsset zijn, en ym de gemiddelde activiteit is van alle moleculen in de trainingsset.

Voor externe validatie werd de activiteit van elk molecuul in de testset voorspeld met behulp van het door de trainingsset ontwikkelde model. De pred_ r 2 waarde wordt als volgt berekend: (2) pred _ r 2 = 1 - ∑ i = 1 N ( y pred , i - yi ) 2 ∑ i = 1 N ( yi - ym ) 2 , waarbij yi en y pred , i respectievelijk de werkelijke en de voorspelde activiteiten van het i-de molecuul in de testset zijn, en ym de gemiddelde activiteit is van alle moleculen in de trainingsset.

Docking-onderzoek werd uitgevoerd op de Glide 5.0-module van Schrodinger [31]. Röntgenkristalstructuur van caspase-3 (PDB ID: 1GFW met resolutie van 2.80 Å) werd gebruikt voor docking-onderzoek. De selectie van PDB ID werd gedaan op basis van overeenkomsten van gecokristalliseerd ligand [isatinesulfonamide of (s)-1-methyl-5-(2-(fenoxymethyl)pyrrolidin-1-ylsulfonyl)indoline-2,3-dion] met de gerapporteerde caspase-3-remmers. Alvorens met het koppelen te beginnen, werd eiwitbereiding uitgevoerd door verwijdering van gecokristalliseerd ligand en gekoppelde watermoleculen gevolgd door toevoeging van waterstofatomen. Vervolgens werd het eiwit geminimaliseerd met krachtveld OPLS'x5f2005. Deze verfijnde eiwitstructuur werd gebruikt voor het genereren van receptorroosters door gebruik te maken van standaardparameters. De rastergrootte wordt gedefinieerd volgens de grootte van het gecokristalliseerde ligand. Alle aminozuren binnen 10 Å van het gecokristalliseerde ligand werden opgenomen in de generatie van het rasterbestand. Alle geminimaliseerde remmers werden in de receptor gedokt en de beste houding van elke remmer werd waargenomen. Het doel van het koppelen in deze studie is alleen om de interacties van de twee meest actieve verbindingen (verbindingen 49 en 58) met residuen op de actieve plaats die nodig zijn voor biologische respons te tonen.

3. Resultaten en discussie 3.1. Atom-gebaseerde 3D-QSAR-modelontwikkeling

We hebben een op atomen gebaseerd 3D-QSAR-model ontwikkeld met een rasterafstand van 1.0 Å en een maximale PLS-factor van vier. Het model is ontwikkeld met behulp van vijfpunts gemeenschappelijke farmacofoorhypothese AAHRR.6 (Figuur 1), die bestaat uit twee waterstofbrugacceptoren (A), één hydrofobe (H) en twee aromatische ringen (R). Deze hypothese (AAHRR.6) is geselecteerd op basis van de hoogste overlevingsscore en deze punten werden aangeduid als A6A7H8R9R10. Het door de PLS-methodologie ontwikkelde 3D-QSAR-model heeft bewonderenswaardige significante statistieken (R 2 = 0,925, F-waarde = 175,9, SD = 0,298, Q 2 = 0,798, q 2 = 0,53 en pred _ r 2 = 0,80), die worden gegeven in Tabel 5 .

Statistische gegevens van het 3D-QSAR-model voor PLS-factor vier.

Gemeenschappelijke farmacofoorhypothese en afstanden tussen farmacofore locaties. Roze bollen met pijlen tonen waterstofbrugacceptor met eenzame elektronenparen. Groene bol toont hydrofoob en gele ringen tonen ringaromaten.

De plots tussen de geobserveerde en de voorspelde activiteiten werden gemaakt voor zowel de trainings- als de testsets (Figuur 2 en 3 ). De hogere waarden van R 2 en Q 2 in respectievelijk de training en de testset worden duidelijk aangegeven door de punten die extreem dicht bij de best passende lijn liggen. Op basis van de statistische gegevens kan worden aangenomen dat het model statistisch fit is. Een QSAR-model is handig wanneer het een externe dataset kan voorspellen die niet wordt gebruikt bij het bouwen van modellen, dat wil zeggen voor een testset. We hebben een hoge pred_ r 2 waarde (pred_ r 2 = 0.80) verkregen, wat wijst op een significant extern voorspellend vermogen van het QSAR-model.

Plot tussen waargenomen en voorspelde biologische activiteiten van de trainingsset van verbindingen.

Plot tussen waargenomen en voorspelde biologische activiteiten van de testset van verbindingen.

Het ontwikkelde 3D-QSAR-model kan worden gevisualiseerd als een cluster van kubussen, die aanvullende informatie opleverde over de structurele kenmerken die nodig zijn voor activiteit. De blauwe kubussen wijzen op gunstige eigenschappen, en de rode kubussen wijzen op ongunstige eigenschappen voor activiteit. Een vergelijkende studie van deze gunstige en ongunstige kenmerken voor de meest actieve (58) en de minst actieve (6b) verbindingen wordt getoond in Figuur 4 . In de meest actieve verbinding (58) kunnen blauwe kubussen rond verschillende posities van de basiskern als volgt worden verklaard: blauwe kubussen rond positie 8 verklaren waarom omvangrijke groepen met elektronenzuigend vermogen gunstig zijn voor activiteit, rond positie 2, ze verklaren waarom heteroarylsubstitutie is gunstig voor activiteit, en rond de A7-positie verklaren ze dat het elektronegatieve atoom direct aan C is gehecht1 koolstof is het gunstige kenmerk voor activiteit. Minder actieve verbindingen (verbindingen 6b, 6c, 6e en 6i) hebben alleen elektronenzuigende substituenten, maar ze missen een omvangrijke substitutie op positie 8. Deze observatie verklaart dat omvangrijke groepssubstitutie met elektronenzuigend vermogen rond positie 8 cruciaal is voor activiteit . Onze waarnemingen komen overeen met die van de eerdere rapporten [27, 28] die meldden dat de remmende activiteit van caspase-3 extreem afhankelijk is van de aard van de substituenten op posities 2 en 8. We observeerden die elektronenzuigende groep op positie 8 en heteroaryl groep op positie 2 zijn intrinsiek voor activiteit [27, 28].

Picturale weergave van kubussen voor de meest actieve (verbinding 58) en de minst actieve (verbinding 6b) verbindingen waarbij blauwe en rode kubussen gunstige en ongunstige regio's voor activiteit vertonen.

In onze vorige studie [32] over caspase-3-remmers rapporteerden we een 2D-QSAR-model. Het eerder ontwikkelde model suggereerde dat het opnemen van de functionele groepen die minder LUMO-energieën hebben, dat wil zeggen meer elektronenaffiniteiten, gunstig is voor biologische activiteit. In onze huidige studie kunnen we ook soortgelijke patronen uitwerken, zoals weergegeven in figuur 4 . Ons momenteel ontwikkelde 3D-QSAR-model komt overeen met ons eerder ontwikkelde 2D-QSAR-model. Bovendien hebben we door de ontwikkelde 3D-QSAR inzichten gekregen die meer mechanistisch zijn.

We hebben met succes een QSAR-model ontwikkeld dat statistisch robuust is en consistent is met eerdere waarnemingen. Het leverde ook belangrijke SAR-informatie op die kan worden gebruikt bij het toekomstige ontwerp van geneesmiddelen voor dit doelwit. Het ontwikkelde QSAR-model kan ook dienen als querymodel voor virtuele screening van grote bibliotheken.

3.2. Bindende interacties van eiwitresiduen met caspase-3-remmers

We onderzochten de bindingsinteracties van de twee meest actieve verbindingen (49 en 58) met de receptor. Ons doel was om de bindingsmodus van deze klasse van moleculen te begrijpen en om te controleren of het ontwikkelde farmacofoormodel goed past bij de actieve plaats. Om dit te bereiken, hebben we flexibele docking uitgevoerd met behulp van de Glide SP-modus. Informatie verkregen uit bindingsinteracties zal verder helpen bij het toekomstige ontwerp van caspase-3-remmers. Naast het analyseren van de bindingsinteracties, werd ook superpositie van de meeste actieve verbindingen met betrekking tot de algemene farmacofoorhypothese gedaan. Het duidde op een uitstekende superpositie van de twee meest actieve verbindingen. Bindingsinteracties van verbinding 49 op de actieve plaats zijn weergegeven in figuur 5 en als volgt uitgelegd: zuurstofatoom van SO2 groep maakt waterstofbinding interactie met NH van Ser 209. NH van aromatische substituent op positie 2 maakt waterstofbinding interactie met zuurstofatoom van Ser 205 en π - π stapelen tussen aromatische substituent op positie 2 en aromatische ring van Tyr 204. Bindingsinteracties van verbinding 58 op de actieve plaats worden als volgt verklaard (Figuur 6 ): zuurstofatoom van SO2 groep maakt waterstofbinding interactie met NH van Ser 209. Stikstofatoom van chinoline maakt waterstofbinding interactie met OH van Ser 251 en π - π stapelen tussen aromatische substituent op positie 2 en aromatische ring van Tyr 204.

Bindingsinteracties van verbinding 49 op de actieve plaats waar het gedokte ligand groen van kleur is. Waterstofbindingen worden uitgedrukt als stippellijnen in paarse kleur en residuen op de actieve plaats worden weergegeven in oranje kleur.

Bindingsinteracties van verbinding 58 op de actieve plaats waar het gedokte ligand groen van kleur is. Waterstofbindingen worden uitgedrukt als stippellijnen in paarse kleur en residuen op de actieve plaats worden weergegeven in oranje kleur.

De interacties van beide verbindingen (49 en 58) met omringende aminozuren werden ook geanalyseerd door MOE moleculaire modelleringssoftware om een ​​duidelijk beeld te krijgen van de stapeling van π - π tussen aromatische substituent op positie 2 en aromatische ring van Tyr 204. Deze weergave duidelijk is vanaf de groene lijn zoals weergegeven in figuur S1 en figuur S2 van de ondersteunende informatie. Zie aanvullende figuren S1 en S2 in aanvullend materiaal dat online beschikbaar is op http://dx.doi.org/10.1155/2013/306081.

Uit deze interacties van de meest krachtige verbindingen met de residuen van de actieve plaats van caspase-3, concludeerden de auteurs dat Ser 209, Ser 251 en Tyr 204 cruciale residuen zijn voor activiteit. Naast deze belangrijke residuen heeft Ser 205 ook een waardevolle bijdrage aan de activiteit. Aangezien verbindingen 49 en 58 vergelijkbare activiteiten hebben, zouden ze bijna dezelfde geschiktheid moeten hebben op gewone farmacofoor, wat duidelijk is uit figuur 7 . Superpositie van de farmacofoorhypothese op gekoppelde ligand (verbinding 58) op de bindingsplaats is weergegeven in Figuur 8 .

Superpositie van verbindingen 49 en 58 op de gemeenschappelijke farmacofoorhypothese.

Superpositie van farmacofoorhypothese op gedokt ligand [verbinding 58 (X1)] op de bindingsplaats waar het gedokte ligand in rode kleur is. Waterstofbindingen worden uitgedrukt in gele kleur en aminozuren worden uitgedrukt in hun standaardvorm (H = histidine, C = cysteïne, S = serine, R = arginine, W = tryptofaan, Y = tyrosine, D = asparaginezuur, F = fenylalanine en E = glutaminezuur).

Om te controleren of het ontwikkelde farmacofoormodel consistent is met de residuen van de actieve plaats van caspase-3, hebben we de overlay-onderzoeken uitgevoerd. In deze studie hebben we de ontwikkelde farmacofoor uitgelijnd op de gedokte poses van de meest krachtige verbinding (58) en vervolgens handmatig gecontroleerd of de voorspelde farmacofore kenmerken consistent waren met de actieve plaats van het eiwit of niet. Het farmacofoormodel voorspelde de kenmerken van de aromatische ring (R) als een belangrijke determinant in biologische activiteit. De docking- en overlay-onderzoeken onthulden een aantal gunstige aromatisch-aromatische en aromatisch-alifatische interacties, zoals weergegeven in figuur S3 verstrekt in de ondersteunende informatie [ 33 ]. De aanwezigheid van residuen zoals TRP206, PHE250 en PHE252 en zijketens van andere alifatische aminozuren rond het aromatische kenmerk in de actieve plaats is consistent.

een ander aromatisch ringkenmerk van de 2e positie van de pyrrolo[3,4-c]chinoline-1,3-dionen.

hydrofobe substituent op sulfonylgroep op de 8e positie van pyrrolo[3,4-c]chinoline-1,3-dionen,

De identificatie van intrinsieke farmacofore kenmerken hangt sterk af van de structurele diversiteit en samenstelling van de trainingsset-verbindingen. Het is duidelijk dat een paar waarschijnlijke farmacofore kenmerken ontbreken tijdens een op liganden gebaseerde modelbouwoefening. Waar mogelijk moet een ontwikkeld farmacofoormodel worden gecontroleerd op consistentie door te koppelen in de actieve plaats van het eiwit. Het missen van deze functies ondermijnt het ontwikkelde farmacofoormodel op geen enkele manier. In plaats daarvan biedt het een eenvoudigere en snellere manier om de grotere gegevensset te screenen. Daarom kunnen we voor toekomstige virtuele screening van caspase-3 een strategie aannemen om de dataset te screenen met de ontwikkelde farmacofoor en vervolgens de top HIT's te analyseren door docking of andere op structuur gebaseerde studies.

We waren succesvol in het ontwikkelen van een op atomen gebaseerd 3D-QSAR-model met een hoog voorspellend vermogen. De ontwikkelde hypothese bestond uit vijf kenmerken met twee waterstofbrugacceptoren (A), één hydrofobe (H) en twee aromatische ringen (R). Uit het op ligand gebaseerde onderzoek kunnen we concluderen dat verschillende elektronenzuigende substituenten en met omvangrijkheid op positie 8 die heteroarylsubstituent op positie 2 gunstig zouden zijn voor het ontwerpen van de nieuwe steigers van caspase-3-remmers. Naast deze suggesties is het ook noodzakelijk dat een carbonylgroep elektronendeficiënt is. Deze resultaten zijn ook consistent met die van onze eerdere studies. Er wordt verder geconcludeerd dat het ontwikkelde 3D-QSAR-model ook kan dienen als een querymodel voor virtuele screening uit een database om nieuwe potentiële caspase-3-remmers te vinden. Het doel van de huidige studie is dus om een ​​computationele benadering te gebruiken voor een snelle, kosteneffectieve evaluatie van caspase-3-remmers. Deze bevindingen kunnen richting geven om een ​​reeks krachtige caspase-3-remmers te vinden die moeten worden gesynthetiseerd en experimenteel onderzocht op hun biologische activiteit.


1. Containers

    • Positief geladen Dendrimeren veroorzaken membraandefecten waardoor cellulaire eiwitten lekken en waar deeltjes doorheen kunnen.
      • "Liposomen zijn microscopische en submicroscopische blaasjes met afmetingen variërend van 10 nm tot 20 m. Ze bestaan ​​meestal uit fosfolipiden, hoewel andere amfifielen zoals niet-ionische oppervlakteactieve stoffen ook kunnen worden gebruikt voor hun constructie. Wanneer fosfolipiden worden gehydrateerd, vormen ze spontaan sferische lipidedubbellagen die het waterige medium en de opgeloste stof omsluiten. Liposomen bieden verschillende voordelen ten opzichte van andere toedieningssystemen, waaronder biocompatibiliteit, controle van biologische eigenschappen via modificatie van fysieke eigenschappen (bijv. lipidesamenstelling, vesikelgrootte, vloeibaarheid van lipidemembraan enz.) en verschillende modi voor geneesmiddelafgifte aan cellen (bijv. absorptie, fuse, endocytose, fagocytose). Liposomen kunnen worden geclassificeerd volgens het aantal lipidedubbellagen als unilamellaire blaasjes (ULV's) en multilamellaire blaasjes (MLV's). Gefunctionaliseerde liposomen kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van peptiden en oligosachariden om zowel de targeting als de levensduur van de circulatie te bereiken. Peptiden kunnen worden gebruikt om liposomen naar de gewenste receptoren te leiden, terwijl bekend is dat poly(ethyleenoxide) (PEO)-geënte fosfolipiden de overleving van liposomen in de bloedsomloop dramatisch verhogen. Een aan het oppervlak gemodificeerd liposomaal medicijnafgiftevehikel kan worden ontwikkeld voor selectieve targeting door een argentine-glycine-asparaginezuur (RGD) -peptide aan het liposoom te koppelen via een PEO-spacer." 49
        • Celpenetrerende peptiden zijn korte peptiden die de cellulaire opname van moleculaire lading van kleine moleculen tot nanodeeltjes en grote DNA-fragmenten vergemakkelijken.
        • “Verschillende in vitro- en in vivo-onderzoeken hebben het potentieel van celpenetrerende peptiden (CPP's), waaronder TAT-peptide (TATp) en oligoarginines, voor de intracellulaire levering van verschillende ladingen bewezen. TATp-gemedieerde cytoplasmatische opname van polymeren (Nori et al. 2003 Hyndman et al. 2004), bacteriofagen (Paschke et al. 2005), plasmide-DNA (Torchilin et al. 2001, 2003 Kleemann et al: 2005), magnetische nanodeeltjes (Dodd et al. 2001 Zhao et al. 2002 Nitin et al. 2004), liposomen (Cryan et al. 2006 Sawant et al. 2006 Gupta et al. 2007) en micellen (Sawant et al. 2006 Sethuraman et al. 2007, 2008 ) gerapporteerd. Succesvolle intracellulaire afgifte vereist direct contact tussen de aan het oppervlak bevestigde CPP's op de farmaceutische nanodrager en het celoppervlak” (Torchilin et al. 2001 Levchenko et al. 2003
          • Receptor-gemedieerde endocytose is een proces waarbij cellen moleculen internaliseren door het naar binnen ontluiken van plasmamembraanblaasjes die eiwitten bevatten met receptorplaatsen die specifiek binden aan de moleculen die worden geïnternaliseerd. (Natuurrecensies Moleculaire celbiologie 6, 112-126 (februari 2005)|doi:10.1038/nrm1571)

          Farmacofoormodellering en dockingstudies op sommige niet-peptide-gebaseerde caspase-3-remmers

          Neurodegeneratieve aandoeningen zijn belangrijke gevolgen van overmatige apoptose veroorzaakt door een proteolytisch enzym dat bekend staat als caspase-3. Daarom is caspase-3-remming een gevalideerde therapeutische benadering geworden voor neurodegeneratieve aandoeningen. We hebben farmacofoormodellering uitgevoerd op enkele synthetische derivaten van caspase-3-remmers (pyrrolo[3,4-c]chinoline-1,3-dionen) met behulp van PHASE 3.0. Dit resulteerde in de algemene farmacofoorhypothese AAHRR.6 die verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de biologische activiteit: twee aromatische ringen (R) voornamelijk in de chinolinekern, één hydrofobe (H) groep (CH3), en twee acceptor (A) groepen (–C=O). Na het identificeren van een geldige hypothese, hebben we ook een op atomen gebaseerd 3D-QSAR-model ontwikkeld dat het PLS-algoritme toepast. Het ontwikkelde model was statistisch robuust (

          ). Daarnaast hebben we moleculaire docking-onderzoeken uitgevoerd, onze resultaten cross-gevalideerd en een dieper inzicht verkregen in het moleculaire herkenningsproces.Ons ontwikkelde model kan dienen als een zoekhulpmiddel voor toekomstige virtuele screening en het ontwerpen van geneesmiddelen voor dit specifieke doelwit.

          1. Inleiding

          Neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Huntington [1] zijn belangrijke gevolgen van abnormale apoptose van neuronen. Deze abnormale apoptose is ook verantwoordelijk voor het optreden van een hartinfarct [2] en leverziekten [3]. Recent beschikbare medicamenteuze behandelingen zijn gedeeltelijk effectief, omdat ze alleen de functie verbeteren van de neuronen die nog in leven zijn, maar ze hebben geen invloed op de onderliggende mechanismen die tot hun dood leiden [4].

          Caspasen, een groep cysteïneproteasen, zijn proteolytisch van aard en de belangrijkste uitvoerders van apoptose [5]. Caspase-3 is van bijzonder belang bij deze caspases omdat het verantwoordelijk is voor de progressie van AD. Caspasen kunnen worden ingedeeld in twee brede categorieën: ten eerste, initiator-caspasen (caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10), en ten tweede effector-caspasen (caspase-3, caspase-6 en caspase-7). ). Initiator-caspasen werken over het algemeen in de vroege stadia van een proteolytische cascade, terwijl effector-caspasen stroomafwaarts werken en betrokken zijn bij de splitsing van specifieke cellulaire eiwitten [6].

          De initiatie van de caspase-cascadereactie kan alleen worden gereguleerd door caspaseremmers. Remmers van caspase-3 werden beschreven als veelbelovende cardioprotectanten [7], neuroprotectanten [8] en hepatoprotectanten [9]. Van veel verbindingen zoals isatines [10], peptidealdehyden [11] en homoftalimiden [12] is gemeld dat ze caspaseremmers zijn vanwege het feit dat ze elektronendeficiënte carbonylen hebben die een interactie aangaan met de doelwitplaats en remmende reacties vertonen. Er zijn verschillende onderzoeken beschikbaar over farmacofoor- en structuurgebaseerde geneesmiddelenontwerp van peptide- en niet-peptide-caspase-3-remmers, waaronder verschillende caspase-3 PDB-ID's. Bindingsinteracties van deze remmers zijn bijna vergelijkbaar in de bindingsholte van caspase-3. Lakshmi et al. hebben ligand- en structuurgebaseerde virtuele screening uitgevoerd op caspase-3-remmers. Ze gebruikten een andere kern, maar dezelfde activiteitstest. Ze hebben PDB ID 1PAU gebruikt en bijna vergelijkbare interacties gerapporteerd (waterstof-binding interacties tussen de verbinding en Arg 207 en tussen Ser 209 en Trp214) zoals we rapporteren in de huidige studie [13]. Alle bovenstaande onderzoeken zijn beschikbaar over verschillende kernen en verschillende caspase-3 PDB-ID's, maar tot nu toe is er geen studie beschikbaar over pyrrolo[3,4-c]chinoline-1,3-dionen met PDB-ID: 1GFW. Over het algemeen zijn krachtige caspase-3-remmers die tot nu toe zijn gerapporteerd, peptiden van aard [14-17]. Dergelijke remmers krijgen echter vaak een slechte celpermeabiliteit en een lage metabole stabiliteit [18]. Dit probleem kan worden overwonnen door de ontwikkeling van niet-peptide kleinmoleculige remmers van caspase-3.

          Farmacofoormodellering is de afgelopen jaren een van de belangrijke en succesvolle op liganden gebaseerde benaderingen geweest voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen [19-21]. Het is gedefinieerd als een term die de configuraties van chemische kenmerken weergeeft die gemeenschappelijk zijn voor alle liganden. Een farmacofoorhypothese verzamelt de gemeenschappelijke kenmerken verdeeld in de driedimensionale ruimte die groepen in een molecuul vertegenwoordigen die deelnemen aan belangrijke interacties tussen het medicijn en de actieve plaats [22]. Bij de zoektocht naar een nieuw medicijn dient een farmacofoor vaak als template voor het gewenste ligand [23, 24].

          In de huidige studie hebben we een op atomen gebaseerd 3D-farmacofoormodel ontwikkeld met behulp van de PHASE-module, die de belangrijkste structurele kenmerken biedt die nodig zijn voor de biologische activiteit. Verder werden bindingsinteracties van actieve moleculen geanalyseerd in bindingspocket van caspase-3 met behulp van Glide the in SP-modus. Op een atoom gebaseerd 3D-QSAR-model genereert kubussen die de structurele kenmerken benadrukken die nodig zijn voor caspase-3-remming. Dit stukje informatie kan nuttig zijn voor het verder ontwerpen van krachtigere caspase-3-remmers.

          2. Materiaal en methoden

          Het rekenwerk werd uitgevoerd op Red Hat Linux Enterprise 3.0 met Intel Pentium Core 2-Duo-processor, 1 GB RAM en 120 GB (harde schijf). Alle constructies zijn gebouwd op Maestro 8.5, een module van Schrodinger [25]. Verder werd de PHASE 3.0-module [26] gebruikt voor farmacofoormodellering.

          Een dataset van 82 verbindingen werd geselecteerd uit twee series caspase-3-remmers met vergelijkbare basiskernen en activiteitstests [27, 28].

          De constructies werden gebouwd gevolgd door schone geometrie en energieminimalisatie met de OPLS_2005 krachtveldmethode. De activiteitsgegevens voor elke verbinding werden genomen als negatieve logaritmen van IC50 waarden (molair). Alle structuren van verbindingen met hun waargenomen en voorspelde activiteitengegevens worden gegeven in tabellen 1 en 2.