Informatie

Hoe worden de fysiologische eigenschappen van mitochondriën gemeten?


dit is mijn eerste vraag over BiologySE. Ik ben een student natuurkunde en wiskunde en doe momenteel een project over simulatie van celgroei. Ik doe literatuuronderzoek en ik heb een vraag over experimentele methoden van celbiologie.

Ik begrijp dat de membraanpotentiaal een maat is voor de mitochondriale functionaliteit (hogere potentiaal betekent een efficiëntere elektronentransportketen). Bovendien is het mitochondriale volume ook een indicator van de mitochondriale efficiëntie (hoger volume, groter gebied, meer plaatsen om elektronentransport uit te voeren).

Ik zou graag enkele punten verduidelijkt willen hebben.

Kunnen deze mitochondriale membraanpotentiaal en -volume in het bijzonder ...

  • worden gemeten voor een enkele cel, of alleen in een populatie?

  • niet-destructief worden gemeten, waardoor de cel in leven blijft?

  • gelijktijdig worden gemeten, of maken experimenten die de ene meten noodzakelijkerwijs de andere niet beschikbaar?

Ik denk vooral aan in vitro experimenten natuurlijk.


Een eenvoudige methode zou zijn om een ​​fluorescerend eiwit in de cel tot expressie te brengen dat zich specifiek op mitochondriën lokaliseert. mito-dsRed is een rood fluorescerend eiwit dat die eigenschap heeft; het kan tot expressie worden gebracht vanuit een plasmide.

Met behulp van fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse zou je de geometrische eigenschappen van de mitochondriën kunnen meten. Dit kan ook op eencellig niveau (met confocale microscoop) en niet-destructief. Het volume kan worden gemeten met wat bekend staat als Z-stacking - een geautomatiseerde techniek waarbij de microscoop verschillende 2D-snaps op verschillende vlakken maakt en deze stapelt om een ​​3D-beeld te construeren.

Je kunt dit ook in levende cellen implementeren; deze methode heet live cell imaging.


Metabolisme

Onze redacteuren zullen beoordelen wat je hebt ingediend en bepalen of het artikel moet worden herzien.

metabolisme, de som van de chemische reacties die plaatsvinden in elke cel van een levend organisme en die energie leveren voor vitale processen en voor het synthetiseren van nieuw organisch materiaal.

Levende organismen zijn uniek omdat ze energie uit hun omgeving kunnen halen en deze kunnen gebruiken voor activiteiten zoals beweging, groei en ontwikkeling en voortplanting. Maar hoe halen levende organismen - of hun cellen - energie uit hun omgeving, en hoe gebruiken cellen deze energie om de componenten waaruit de cellen zijn gemaakt te synthetiseren en samen te stellen?

De antwoorden op deze vragen liggen in de enzym-gemedieerde chemische reacties die plaatsvinden in levende materie (metabolisme). Honderden gecoördineerde, meerstapsreacties, gevoed door energie verkregen uit voedingsstoffen en/of zonne-energie, zetten uiteindelijk gemakkelijk beschikbare materialen om in de moleculen die nodig zijn voor groei en onderhoud.

De fysische en chemische eigenschappen van de componenten van levende wezens die in dit artikel worden behandeld, zijn te vinden in de artikelen koolhydraatcelhormoon lipide fotosynthese en eiwit.


Monitoring van dynamische veranderingen in mitochondriale calciumniveaus tijdens apoptose met behulp van een genetisch gecodeerde calciumsensor

Dynamische veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie als reactie op verschillende stimuli reguleren veel cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie en apoptose (1). Tijdens apoptose bevordert calciumaccumulatie in mitochondriën de afgifte van pro-apoptotische factoren uit de mitochondriën in het cytosol (2). Het is daarom van belang om tijdens apoptose direct mitochondriaal calcium in levende cellen in situ te meten. Hoge resolutie fluorescerende beeldvorming van cellen geladen met dual-excitatie ratiometrische en niet-rtiometrische synthetische calciumindicatorkleurstoffen is bewezen een betrouwbaar en veelzijdig hulpmiddel te zijn om verschillende aspecten van intracellulaire calciumsignalering te bestuderen. Het meten van cytosolische calciumfluxen met behulp van deze technieken is relatief eenvoudig. Het meten van intramitochondriale calciumniveaus in intacte cellen met behulp van synthetische calciumindicatoren zoals rhod-2 en rhod-FF is echter een grotere uitdaging. Synthetische indicatoren gericht op mitochondriën hebben de reacties op herhaalde verhogingen van mitochondriaal calcium afgezwakt en verstoren de mitochondriale morfologie (3). Bovendien hebben synthetische indicatoren de neiging om gedurende enkele uren uit de mitochondriën te lekken, waardoor ze ongeschikt zijn voor langdurige experimenten. Aldus hebben genetisch gecodeerde calciumindicatoren op basis van groen fluorescerend eiwit (GFP) (4) of aequorin (5) gericht op mitochondriën de meting van de mitochondriale calciumdynamiek aanzienlijk vergemakkelijkt. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor realtime meting van mitochondriale calciumfluxen als reactie op verschillende stimuli. De methode is gebaseerd op fluorescentiemicroscopie van 'ratiometrische-pericam' die selectief is gericht op mitochondriën. Ratiometrische pericam is een calciumindicator op basis van een fusie van circulair gepermuteerd geel fluorescerend eiwit en calmoduline(4). Binding van calcium aan ratiometrisch pericam veroorzaakt een verschuiving van zijn excitatiepiek van 415 nm naar 494 nm, terwijl het emissiespectrum, dat piekt rond 515 nm, onveranderd blijft. Ratiometrische pericam bindt een enkel calciumion met een dissociatieconstante in vitro van

1,7 M (4). Deze eigenschappen van ratiometrisch pericam maken de kwantificering van snelle en langdurige veranderingen in mitochondriale calciumconcentratie mogelijk. Verder beschrijven we de aanpassing van deze methodologie aan een standaard wide-field calcium imaging Microscoop met algemeen beschikbare filtersets. Met behulp van twee verschillende agonisten, de purinerge agonist ATP en apoptose-inducerende drug staurosporine, laten we zien dat deze methode geschikt is voor het bewaken van veranderingen in de mitochondriale calciumconcentratie met een temporele resolutie van seconden tot uren. Verder tonen we ook aan dat ratiometrisch pericam ook nuttig is voor het meten van mitochondriale splijting/fragmentatie tijdens apoptose. Zo is ratiometrisch pericam bijzonder geschikt voor continue langetermijnmeting van mitochondriale calciumdynamiek tijdens apoptose.


Inhoud

Mitochondriën kunnen een aantal verschillende vormen hebben. [23] Een mitochondrion bevat buiten- en binnenmembranen die zijn samengesteld uit fosfolipide dubbellagen en eiwitten. [17] De twee membranen hebben verschillende eigenschappen. Vanwege deze dubbelmembraanorganisatie zijn er vijf verschillende delen van een mitochondrion:

  1. Het buitenste mitochondriale membraan,
  2. De intermembrane ruimte (de ruimte tussen de buitenste en binnenste membranen),
  3. Het binnenste mitochondriale membraan,
  4. De cristae-ruimte (gevormd door invouwen van het binnenmembraan), en
  5. De matrix (ruimte binnen het binnenmembraan).

Mitochondriën die van hun buitenmembraan zijn ontdaan, worden mitoplasten genoemd.

Buitenmembraan Bewerken

De buitenste mitochondriale membraan, die het gehele organel omsluit, is 60 tot 75 angstrom (Å) dik. Het heeft een eiwit-tot-fosfolipide-verhouding die vergelijkbaar is met die van het celmembraan (ongeveer 1:1 op gewichtsbasis). Het bevat grote aantallen integrale membraaneiwitten die porines worden genoemd. Een belangrijk transporteiwit is het porievormende spanningsafhankelijke anionkanaal (VDAC). De VDAC is de primaire transporteur van nucleotiden, ionen en metabolieten tussen het cytosol en de intermembrane ruimte. [24] [25] Het is gevormd als een bètacilinder die het buitenmembraan omspant, vergelijkbaar met dat in het gramnegatieve bacteriële membraan. [26] Grotere eiwitten kunnen het mitochondrion binnendringen als een signaalsequentie aan hun N-terminus bindt aan een groot multisubeenheid-eiwit genaamd translocase in het buitenmembraan, dat ze vervolgens actief over het membraan beweegt. [27] Mitochondriale pro-eiwitten worden geïmporteerd via gespecialiseerde translocatiecomplexen.

Het buitenmembraan bevat ook enzymen die betrokken zijn bij uiteenlopende activiteiten zoals de verlenging van vetzuren, oxidatie van epinefrine en de afbraak van tryptofaan. Deze enzymen omvatten monoamineoxidase, voor rotenon ongevoelig NADH-cytochroom c-reductase, kynureninehydroxylase en vetzuur Co-A-ligase. Verstoring van het buitenmembraan zorgt ervoor dat eiwitten in de intermembraanruimte in het cytosol kunnen lekken, wat leidt tot celdood. [28] Het mitochondriale buitenmembraan kan associëren met het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan, in een structuur genaamd MAM (mitochondria-associated ER-membraan). Dit is belangrijk bij de ER-mitochondria calciumsignalering en is betrokken bij de overdracht van lipiden tussen het ER en de mitochondriën. [29] Buiten het buitenmembraan bevinden zich kleine (diameter: 60Å) deeltjes die subeenheden van Parson worden genoemd.

Intermembrane ruimte Bewerken

De mitochondriale intermembrane ruimte is de ruimte tussen het buitenste membraan en het binnenste membraan. Het is ook bekend als perimitochondriale ruimte. Omdat het buitenmembraan vrij doorlaatbaar is voor kleine moleculen, zijn de concentraties van kleine moleculen, zoals ionen en suikers, in de intermembraanruimte hetzelfde als in het cytosol. [17] Grote eiwitten moeten echter een specifieke signaalsequentie hebben om over het buitenmembraan te worden getransporteerd, dus de eiwitsamenstelling van deze ruimte is anders dan de eiwitsamenstelling van het cytosol. Een eiwit dat op deze manier in de intermembraanruimte is gelokaliseerd, is cytochroom c. [28]

Binnenmembraan Bewerken

Het binnenste mitochondriale membraan bevat eiwitten met drie soorten functies: [17]

  1. Degenen die de kettingredoxreacties voor elektronentransport uitvoeren, die ATP in de matrix genereren
  2. Specifieke transporteiwitten die de passage van metabolieten in en uit de mitochondriale matrix reguleren

Het bevat meer dan 151 verschillende polypeptiden en heeft een zeer hoge eiwit-tot-fosfolipide-verhouding (meer dan 3:1 in gewicht, wat ongeveer 1 eiwit is voor 15 fosfolipiden). Het binnenmembraan is de thuisbasis van ongeveer 1/5 van het totale eiwit in een mitochondrion. [30] Bovendien is het binnenmembraan rijk aan een ongebruikelijk fosfolipide, cardiolipine. Dit fosfolipide werd oorspronkelijk ontdekt in koeienharten in 1942 en is meestal kenmerkend voor mitochondriale en bacteriële plasmamembranen. [31] Cardiolipine bevat vier vetzuren in plaats van twee, en kan helpen om het binnenmembraan ondoordringbaar te maken. [17] In tegenstelling tot het buitenmembraan bevat het binnenmembraan geen porines en is het zeer ondoordringbaar voor alle moleculen. Bijna alle ionen en moleculen hebben speciale membraantransporters nodig om de matrix in of uit te gaan. Eiwitten worden via het translocase van het binnenmembraan (TIM)-complex of via OXA1L in de matrix getransporteerd. [27] Daarnaast is er een membraanpotentiaal over het binnenmembraan, gevormd door de werking van de enzymen van de elektronentransportketen. Binnenmembraanfusie wordt gemedieerd door het binnenmembraaneiwit OPA1. [32]

Cristae Bewerken

Het binnenste mitochondriale membraan is gecompartimenteerd in talrijke plooien, cristae genaamd, die het oppervlak van het binnenste mitochondriale membraan vergroten, waardoor het vermogen om ATP te produceren wordt vergroot. Voor typische levermitochondriën is het gebied van het binnenmembraan ongeveer vijf keer zo groot als het buitenmembraan. Deze verhouding is variabel en mitochondriën van cellen die een grotere vraag naar ATP hebben, zoals spiercellen, bevatten nog meer cristae. Mitochondriën in dezelfde cel kunnen aanzienlijk verschillende crista-dichtheid hebben, waarbij degenen die nodig zijn om meer energie te produceren een veel groter crista-membraanoppervlak hebben. [33] Deze plooien zijn bezaaid met kleine ronde lichamen die bekend staan ​​als F1 deeltjes of oxysomen. [34]

Matrix bewerken

De matrix is ​​de ruimte omsloten door het binnenmembraan. Het bevat ongeveer 2/3 van de totale eiwitten in een mitochondrion. [17] De matrix is ​​belangrijk bij de aanmaak van ATP met behulp van het ATP-synthase in het binnenmembraan. De matrix bevat een sterk geconcentreerd mengsel van honderden enzymen, speciale mitochondriale ribosomen, tRNA en verschillende kopieën van het mitochondriale DNA-genoom. Van de enzymen omvatten de belangrijkste functies oxidatie van pyruvaat en vetzuren, en de citroenzuurcyclus. [17] De DNA-moleculen worden in nucleoïden verpakt door eiwitten, waaronder TFAM. [35]

De meest prominente rollen van mitochondriën zijn het produceren van de energievaluta van de cel, ATP (d.w.z. fosforylering van ADP), door middel van ademhaling en het reguleren van het cellulaire metabolisme. [18] De centrale reeks reacties die betrokken zijn bij de productie van ATP staan ​​gezamenlijk bekend als de citroenzuurcyclus of de Krebs-cyclus. Het mitochondrion heeft echter naast de productie van ATP nog vele andere functies.

Energieconversie Bewerken

Een dominante rol voor de mitochondriën is de productie van ATP, zoals blijkt uit het grote aantal eiwitten in het binnenmembraan voor deze taak. Dit wordt gedaan door de belangrijkste producten van glucose te oxideren: pyruvaat en NADH, die in het cytosol worden geproduceerd. [18] Dit type cellulaire ademhaling, ook wel aërobe ademhaling genoemd, is afhankelijk van de aanwezigheid van zuurstof, die het grootste deel van de vrijgekomen energie levert. [36] Wanneer zuurstof beperkt is, zullen de glycolytische producten worden gemetaboliseerd door anaërobe fermentatie, een proces dat onafhankelijk is van de mitochondriën. [18] De productie van ATP uit glucose en zuurstof heeft een ongeveer 13 keer hogere opbrengst tijdens aerobe ademhaling in vergelijking met fermentatie. [37] Plantaardige mitochondriën kunnen ook een beperkte hoeveelheid ATP produceren, hetzij door de suiker te breken die tijdens de fotosynthese wordt geproduceerd, hetzij zonder zuurstof door het alternatieve substraat nitriet te gebruiken. [38] ATP gaat door het binnenmembraan met behulp van een specifiek eiwit, en door het buitenmembraan via porines. [39] ADP keert terug via dezelfde route.

Pyruvaat en de citroenzuurcyclus

Pyruvaatmoleculen geproduceerd door glycolyse worden actief getransporteerd over het binnenste mitochondriale membraan en in de matrix waar ze ofwel kunnen worden geoxideerd en gecombineerd met co-enzym A om CO te vormen2, acetyl-CoA en NADH, [18] of ze kunnen worden gecarboxyleerd (door pyruvaatcarboxylase) om oxaalacetaat te vormen. Deze laatste reactie "vult" de hoeveelheid oxaalacetaat in de citroenzuurcyclus op en is daarom een ​​anaplerotische reactie, waardoor het vermogen van de cyclus om acetyl-CoA te metaboliseren toeneemt wanneer de energiebehoefte van het weefsel (bijvoorbeeld in spieren) plotseling wordt verhoogd door activiteit. [40]

In de citroenzuurcyclus worden alle tussenproducten (bijv. citraat, iso-citraat, alfa-ketoglutaraat, succinaat, fumaraat, malaat en oxaalacetaat) geregenereerd tijdens elke omwenteling van de cyclus. Het toevoegen van meer van een van deze tussenproducten aan het mitochondrion betekent daarom dat de extra hoeveelheid binnen de cyclus wordt vastgehouden, waardoor alle andere tussenproducten toenemen als de ene wordt omgezet in de andere. Daarom heeft de toevoeging van een van hen aan de cyclus een anaplerotisch effect, en de verwijdering ervan heeft een cataplerotisch effect. Deze anaplerotische en cataplerotische reacties zullen in de loop van de cyclus de hoeveelheid oxaalacetaat die beschikbaar is om te combineren met acetyl-CoA om citroenzuur te vormen, verhogen of verlagen. Dit verhoogt of verlaagt op zijn beurt de snelheid van ATP-productie door het mitochondrion, en dus de beschikbaarheid van ATP voor de cel. [40]

Acetyl-CoA daarentegen, afgeleid van pyruvaatoxidatie, of van de bèta-oxidatie van vetzuren, is de enige brandstof die in de citroenzuurcyclus terechtkomt. Met elke omwenteling van de cyclus wordt één molecuul acetyl-CoA verbruikt voor elk molecuul oxaalacetaat dat aanwezig is in de mitochondriale matrix, en wordt nooit geregenereerd. Het is de oxidatie van het acetaatgedeelte van acetyl-CoA dat CO . produceert2 en water, waarbij de zo vrijgekomen energie wordt opgevangen in de vorm van ATP. [40]

In de lever is de carboxylering van cytosolisch pyruvaat in intra-mitochondriaal oxaalacetaat een vroege stap in de gluconeogene route, die lactaat en gedeamineerd alanine omzet in glucose, [18] [40] onder invloed van hoge niveaus van glucagon en/ of epinefrine in het bloed. [40] Hier heeft de toevoeging van oxaalacetaat aan het mitochondrion geen netto anaplerotisch effect, aangezien een ander tussenproduct van de citroenzuurcyclus (malaat) onmiddellijk uit het mitochondrion wordt verwijderd om te worden omgezet in cytosolisch oxaalacetaat, dat uiteindelijk wordt omgezet in glucose, in een proces dat bijna het omgekeerde is van glycolyse. [40]

De enzymen van de citroenzuurcyclus bevinden zich in de mitochondriale matrix, met uitzondering van succinaatdehydrogenase, dat als onderdeel van Complex II aan het binnenste mitochondriale membraan is gebonden. [41] De citroenzuurcyclus oxideert het acetyl-CoA tot koolstofdioxide en produceert daarbij verminderde cofactoren (drie moleculen NADH en één molecule FADH2) die een bron van elektronen zijn voor de elektronentransportketen, en een molecuul GTP (dat gemakkelijk wordt omgezet in een ATP). [18]

NADH en FADH2: de elektronentransportketen Bewerken

De elektronen van NADH en FADH2 worden overgebracht naar zuurstof (O2), een energierijk molecuul, [36] en waterstof (protonen) in verschillende stappen via de elektronentransportketen. NADH en FADH2 moleculen worden geproduceerd in de matrix via de citroenzuurcyclus, maar worden ook geproduceerd in het cytoplasma door glycolyse. Reductie-equivalenten uit het cytoplasma kunnen worden geïmporteerd via het malaat-aspartaat-shuttlesysteem van antiporter-eiwitten of worden ingevoerd in de elektronentransportketen met behulp van een glycerolfosfaat-shuttle. [18] Eiwitcomplexen in het binnenmembraan (NADH-dehydrogenase (ubiquinon), cytochroom-c-reductase en cytochroom-c-oxidase) voeren de overdracht uit en de incrementele afgifte van energie wordt gebruikt om protonen (H+) in de intermembraanruimte te pompen. Dit proces is efficiënt, maar een klein percentage elektronen kan voortijdig zuurstof verminderen, waardoor reactieve zuurstofsoorten zoals superoxide worden gevormd. [18] Dit kan oxidatieve stress in de mitochondriën veroorzaken en kan bijdragen aan de achteruitgang van de mitochondriale functie die gepaard gaat met het verouderingsproces. [42]

Naarmate de protonconcentratie in de intermembraanruimte toeneemt, ontstaat er een sterke elektrochemische gradiënt over het binnenmembraan. De protonen kunnen via het ATP-synthasecomplex terugkeren naar de matrix en hun potentiële energie wordt gebruikt om ATP te synthetiseren uit ADP en anorganisch fosfaat (Pl). [18] Dit proces wordt chemiosmosis genoemd en werd voor het eerst beschreven door Peter Mitchell, [43] [44] die in 1978 de Nobelprijs voor scheikunde kreeg voor zijn werk. Later werd een deel van de Nobelprijs voor Scheikunde 1997 toegekend aan Paul D. Boyer en John E. Walker voor hun verduidelijking van het werkingsmechanisme van ATP-synthase. [45]

Warmteproductie Bewerken

Onder bepaalde omstandigheden kunnen protonen de mitochondriale matrix opnieuw binnengaan zonder bij te dragen aan de ATP-synthese. Dit proces staat bekend als: proton lek of mitochondriale ontkoppeling en is te wijten aan de gefaciliteerde diffusie van protonen in de matrix. Het proces resulteert in het vrijkomen van de niet-gebruikte potentiële energie van de elektrochemische gradiënt van protonen als warmte. [18] Het proces wordt gemedieerd door een protonkanaal genaamd thermogenine, of UCP1.[46] Thermogenine wordt voornamelijk aangetroffen in bruin vetweefsel, of bruin vet, en is verantwoordelijk voor niet-rillende thermogenese. Bruin vetweefsel wordt aangetroffen bij zoogdieren en bevindt zich op het hoogste niveau in het vroege leven en bij dieren die in winterslaap zijn. Bij de mens is bruin vetweefsel bij de geboorte aanwezig en neemt af met de leeftijd. [46]

Opslag van calciumionen

De concentraties vrij calcium in de cel kunnen een reeks reacties reguleren en zijn belangrijk voor signaaltransductie in de cel. Mitochondriën kunnen tijdelijk calcium opslaan, een proces dat bijdraagt ​​aan de homeostase van calcium in de cel. [47] [48] Hun vermogen om snel calcium op te nemen voor latere afgifte maakt ze tot goede "cytosolische buffers" voor calcium. [49] [50] [51] Het endoplasmatisch reticulum (ER) is de belangrijkste opslagplaats van calcium, [52] en er is een significant samenspel tussen het mitochondrion en ER met betrekking tot calcium. [53] Het calcium wordt opgenomen in de matrix door de mitochondriale calcium uniporter op het binnenste mitochondriale membraan. [54] Het wordt voornamelijk aangedreven door de mitochondriale membraanpotentiaal. [48] ​​Afgifte van dit calcium terug in het inwendige van de cel kan plaatsvinden via een natrium-calcium-uitwisselingseiwit of via "calcium-geïnduceerde-calcium-afgifte"-routes. [54] Dit kan calciumpieken of calciumgolven veroorzaken met grote veranderingen in de membraanpotentiaal. Deze kunnen een reeks eiwitten van het tweede boodschappersysteem activeren die processen kunnen coördineren, zoals de afgifte van neurotransmitters in zenuwcellen en de afgifte van hormonen in endocriene cellen. [55]

De instroom van Ca2+ naar de mitochondriale matrix is ​​recentelijk geïmpliceerd als een mechanisme om de bio-energetica van de luchtwegen te reguleren door de elektrochemische potentiaal over het membraan tijdelijk te laten "pulsen" van ΔΨ-gedomineerd naar pH-gedomineerd, wat een vermindering van oxidatieve stress mogelijk maakt. [56] In neuronen werken gelijktijdige verhogingen van cytosolisch en mitochondriaal calcium om de neuronale activiteit te synchroniseren met het mitochondriale energiemetabolisme. Mitochondriale matrixcalciumniveaus kunnen de tientallen micromolaire niveaus bereiken, wat nodig is voor de activering van isocitraatdehydrogenase, een van de belangrijkste regulerende enzymen van de Krebs-cyclus. [57]

Cellulaire proliferatieregulatie

De relatie tussen cellulaire proliferatie en mitochondriën is onderzocht. Tumorcellen hebben voldoende ATP nodig om bioactieve verbindingen zoals lipiden, eiwitten en nucleotiden te synthetiseren voor snelle proliferatie. [58] Het grootste deel van ATP in tumorcellen wordt gegenereerd via de oxidatieve fosforylatieroute (OxPhos). [59] Interferentie met OxPhos veroorzaakt stopzetting van de celcyclus, wat suggereert dat mitochondriën een rol spelen bij celproliferatie. [59] Mitochondriale ATP-productie is ook van vitaal belang voor celdeling en differentiatie bij infectie [60] naast basisfuncties in de cel, waaronder de regulatie van celvolume, opgeloste stofconcentratie en cellulaire architectuur. [61] [62] [63] ATP-niveaus verschillen in verschillende stadia van de celcyclus, wat suggereert dat er een verband bestaat tussen de overvloed aan ATP en het vermogen van de cel om een ​​nieuwe celcyclus in te gaan. [64] De rol van ATP in de basisfuncties van de cel maakt de celcyclus gevoelig voor veranderingen in de beschikbaarheid van mitochondriaal afgeleid ATP. [64] De variatie in ATP-niveaus in verschillende stadia van de celcyclus ondersteunt de hypothese dat mitochondriën een belangrijke rol spelen bij de regulatie van de celcyclus. [64] Hoewel de specifieke mechanismen tussen mitochondriën en de regulatie van de celcyclus niet goed worden begrepen, hebben onderzoeken aangetoond dat controlepunten van de celcyclus met een lage energie de energiecapaciteit bewaken voordat ze aan een nieuwe ronde van celdeling beginnen. [9]

Extra functies Bewerken

Mitochondriën spelen een centrale rol bij veel andere metabole taken, zoals:

  • Signalering via mitochondriale reactieve zuurstofsoorten [65]
  • Regulering van de membraanpotentiaal[18] -geprogrammeerde celdood [66]
  • Calciumsignalering (inclusief door calcium opgewekte apoptose) [67]
  • Regulering van cellulair metabolisme[9]
  • Bepaalde heemsynthesereacties [68](zie ook: porfyrine) synthese. [49]
  • Hormonale signalering [69] Mitochondriën zijn gevoelig en reageren op hormonen, gedeeltelijk door de werking van mitochondriale oestrogeenreceptoren (mtER's). Deze receptoren zijn gevonden in verschillende weefsels en celtypen, waaronder hersenen [70] en hart [71].
  • Immuunsignalering [72]
  • Neuronale mitochondriën dragen ook bij aan cellulaire kwaliteitscontrole door de neuronale status naar microglia te rapporteren via gespecialiseerde somatische verbindingen. [73]

Sommige mitochondriale functies worden alleen in specifieke soorten cellen uitgevoerd. Mitochondriën in levercellen bevatten bijvoorbeeld enzymen waarmee ze ammoniak kunnen ontgiften, een afvalproduct van het eiwitmetabolisme. Een mutatie in de genen die een van deze functies reguleren, kan leiden tot mitochondriale ziekten.

Mitochondriën (en verwante structuren) komen voor in alle eukaryoten (behalve twee - de Oxymonad Monocercomonoides en Henneguya salminicola). [5] [6] [7] [74] Hoewel ze vaak worden afgebeeld als boonachtige structuren, vormen ze een zeer dynamisch netwerk in de meeste cellen waar ze voortdurend splitsing en fusie ondergaan. De populatie van alle mitochondriën van een bepaalde cel vormt het chondrioom. [75] Mitochondriën variëren in aantal en locatie, afhankelijk van het celtype. Een enkel mitochondrion wordt vaak aangetroffen in eencellige organismen, terwijl menselijke levercellen ongeveer 1000-2000 mitochondriën per cel hebben, die 1/5 van het celvolume uitmaken. [17] De mitochondriale inhoud van anderszins vergelijkbare cellen kan aanzienlijk variëren in grootte en membraanpotentiaal, [76] met verschillen die voortkomen uit bronnen, waaronder ongelijke verdeling bij celdelingen, wat leidt tot extrinsieke verschillen in ATP-niveaus en stroomafwaartse cellulaire processen. [77] De mitochondriën bevinden zich genesteld tussen myofibrillen van spieren of gewikkeld rond het sperma-flagellum. [17] Vaak vormen ze een complex 3D-vertakkingsnetwerk in de cel met het cytoskelet. De associatie met het cytoskelet bepaalt de mitochondriale vorm, die ook de functie kan beïnvloeden: [78] verschillende structuren van het mitochondriale netwerk kunnen de populatie een verscheidenheid aan fysieke, chemische en signaleringsvoor- of nadelen opleveren. [79] Mitochondriën in cellen zijn altijd verdeeld over microtubuli en de verdeling van deze organellen is ook gecorreleerd met het endoplasmatisch reticulum. [80] Recent bewijs suggereert dat vimentine, een van de componenten van het cytoskelet, ook cruciaal is voor de associatie met het cytoskelet. [81]

Mitochondria-geassocieerd ER-membraan (MAM)

Het mitochondria-geassocieerde ER-membraan (MAM) is een ander structureel element dat in toenemende mate wordt erkend vanwege zijn cruciale rol in cellulaire fysiologie en homeostase. Ooit beschouwd als een technisch probleem in celfractioneringstechnieken, zijn de vermeende ER-vesikelverontreinigingen die steevast in de mitochondriale fractie verschenen, opnieuw geïdentificeerd als vliezige structuren afgeleid van de MAM - de interface tussen mitochondriën en de ER. [82] Fysieke koppeling tussen deze twee organellen was eerder waargenomen in elektronenmicrofoto's en is meer recentelijk onderzocht met fluorescentiemicroscopie. [82] Dergelijke studies schatten dat bij de MAM, die tot 20% van het mitochondriale buitenmembraan kan omvatten, het ER en de mitochondriën worden gescheiden door slechts 10-25 nm en bij elkaar worden gehouden door eiwitbindende complexen. [82] [29] [83]

Gezuiverd MAM uit subcellulaire fractionering is verrijkt met enzymen die betrokken zijn bij de uitwisseling van fosfolipiden, naast kanalen die geassocieerd zijn met Ca2+-signalering. [82] [83] Deze hints van een prominente rol voor de MAM in de regulatie van cellulaire lipide-opslag en signaaltransductie zijn bevestigd, met significante implicaties voor mitochondriaal-geassocieerde cellulaire fenomenen, zoals hieronder besproken. De MAM heeft niet alleen inzicht gegeven in de mechanistische basis die ten grondslag ligt aan fysiologische processen als intrinsieke apoptose en de verspreiding van calciumsignalering, maar het bevordert ook een meer verfijnd beeld van de mitochondriën. Hoewel vaak gezien als statische, geïsoleerde 'krachtcentrales' die zijn gekaapt voor cellulair metabolisme door een oude endosymbiotische gebeurtenis, onderstreept de evolutie van de MAM de mate waarin mitochondriën zijn geïntegreerd in de algehele cellulaire fysiologie, met een intieme fysieke en functionele koppeling aan het endomembraansysteem.

Fosfolipide overdracht Bewerken

De MAM is verrijkt met enzymen die betrokken zijn bij de biosynthese van lipiden, zoals fosfatidylserinesynthase op het ER-vlak en fosfatidylserinedecarboxylase op het mitochondriale vlak. [84] [85] Omdat mitochondria dynamische organellen zijn die voortdurend splijtings- en fusiegebeurtenissen ondergaan, hebben ze een constante en goed gereguleerde toevoer van fosfolipiden nodig voor membraanintegriteit. [86] [87] Maar mitochondriën zijn niet alleen een bestemming voor de fosfolipiden waarvan ze de synthese voltooien, maar dit organel speelt ook een rol bij de interorganellenhandel van de tussenproducten en producten van fosfolipide biosyntheseroutes, ceramide- en cholesterolmetabolisme, en glycosfingolipiden anabolisme. [85] [87]

Een dergelijke smokkelcapaciteit is afhankelijk van de MAM, waarvan is aangetoond dat het de overdracht van lipide-tussenproducten tussen organellen vergemakkelijkt. [84] In tegenstelling tot het standaard vesiculaire mechanisme van lipidenoverdracht, wijst het bewijs erop dat de fysieke nabijheid van het ER en de mitochondriale membranen bij de MAM het mogelijk maakt om lipiden tussen tegenover elkaar liggende dubbellagen om te draaien. [87] Ondanks dit ongebruikelijke en schijnbaar energetisch ongunstige mechanisme, heeft dergelijk transport geen ATP nodig. [87] In plaats daarvan is in gist aangetoond dat het afhankelijk is van een multiproteïne-bindende structuur die de ER-mitochondria-ontmoetingsstructuur of ERMES wordt genoemd, hoewel het onduidelijk blijft of deze structuur direct lipideoverdracht bemiddelt of nodig is om de membranen binnen te houden. voldoende dicht bij elkaar om de energiebarrière voor lipid flipping te verlagen. [87] [88]

De MAM kan ook deel uitmaken van de secretoire route, naast zijn rol bij intracellulaire lipidehandel. In het bijzonder lijkt de MAM een tussenbestemming te zijn tussen het ruwe ER en de Golgi in de route die leidt tot assemblage en uitscheiding van lipoproteïne met zeer lage dichtheid, of VLDL. [85] [89] De MAM dient dus als een kritische metabole en handelshub in het lipidenmetabolisme.

Calcium signalering Bewerken

Een cruciale rol voor het ER in calciumsignalering werd erkend voordat een dergelijke rol voor de mitochondriën algemeen werd aanvaard, deels omdat de lage affiniteit van Ca2+-kanalen gelokaliseerd op het buitenste mitochondriale membraan in tegenspraak leek te zijn met de vermeende responsiviteit van dit organel op veranderingen in intracellulaire Ca2+ flux. [82] [52] Maar de aanwezigheid van de MAM lost deze schijnbare tegenstelling op: de nauwe fysieke associatie tussen de twee organellen resulteert in Ca2+-microdomeinen op contactpunten die efficiënte Ca2+-transmissie van het ER naar de mitochondriën vergemakkelijken. [82] Transmissie vindt plaats als reactie op zogenaamde "Ca2+ puffs" die worden gegenereerd door spontane clustering en activering van IP3R, een canoniek ER-membraan Ca2+-kanaal. [82] [29]

Het lot van deze trekjes - in het bijzonder of ze beperkt blijven tot geïsoleerde locaties of geïntegreerd zijn in Ca2+-golven voor voortplanting door de cel - wordt grotendeels bepaald door MAM-dynamiek. Hoewel de heropname van Ca2+ door het ER (gelijktijdig met de afgifte ervan) de intensiteit van de trekjes moduleert, waardoor mitochondriën tot op zekere hoogte worden geïsoleerd van hoge Ca2+-blootstelling, dient de MAM vaak als een firewall die in wezen Ca2+ trekjes buffert. door te fungeren als een gootsteen waarin vrije ionen die in het cytosol vrijkomen, kunnen worden geleid. [82] [90] [91] Deze Ca2+-tunneling vindt plaats via de Ca2+-receptor met lage affiniteit VDAC1, waarvan onlangs is aangetoond dat deze fysiek is vastgemaakt aan de IP3R-clusters op het ER-membraan en verrijkt bij de MAM. [82] [29] [92] Het vermogen van mitochondriën om als Ca2+-put te dienen, is het resultaat van de elektrochemische gradiënt die wordt gegenereerd tijdens oxidatieve fosforylering, waardoor het tunnelen van het kation een exergoon proces is. [92] Normale, milde calciuminstroom van cytosol naar de mitochondriale matrix veroorzaakt tijdelijke depolarisatie die wordt gecorrigeerd door protonen weg te pompen.

Maar transmissie van Ca 2+ is niet eerder eenrichtingsverkeer, het is tweerichtingsverkeer. [52] De eigenschappen van de Ca 2+ pomp SERCA en het kanaal IP3R dat aanwezig is op het ER-membraan vergemakkelijken de feedbackregulatie gecoördineerd door de MAM-functie. In het bijzonder zorgt de klaring van Ca2+ door de MAM voor spatio-temporele patronen van Ca2+-signalering omdat Ca2+ de IP3R-activiteit op een bifasische manier verandert. [82] SERCA wordt eveneens beïnvloed door mitochondriale feedback: opname van Ca2+ door de MAM stimuleert de ATP-productie, waardoor er energie wordt verschaft die SERCA in staat stelt het ER te herladen met Ca2+ voor aanhoudende Ca2+-efflux bij de MAM. [90] [92] De MAM is dus geen passieve buffer voor Ca 2+ trekjes, maar helpt bij het moduleren van verdere Ca 2+-signalering via feedbacklussen die de ER-dynamiek beïnvloeden.

Het reguleren van de ER-afgifte van Ca2+ bij de MAM is bijzonder kritisch omdat slechts een bepaald venster van Ca2+-opname de mitochondriën, en bijgevolg de cel, in homeostase houdt. Er is voldoende intra-organel Ca2+-signalering vereist om het metabolisme te stimuleren door dehydrogenase-enzymen te activeren die essentieel zijn voor de flux door de citroenzuurcyclus. [93] [94] Echter, zodra Ca2+-signalering in de mitochondriën een bepaalde drempel overschrijdt, stimuleert het de intrinsieke route van apoptose gedeeltelijk door het mitochondriale membraanpotentieel dat nodig is voor metabolisme te laten instorten. [82] Studies die de rol van pro- en anti-apoptotische factoren onderzoeken, ondersteunen dit model. Zo is aangetoond dat de anti-apoptotische factor Bcl-2 interageert met IP3R's om Ca2+-vulling van het ER te verminderen, wat leidt tot verminderde efflux bij de MAM en het voorkomen van ineenstorting van de mitochondriale membraanpotentiaal post-apoptotische stimuli. [82] Gezien de noodzaak van een dergelijke fijne regulatie van Ca2+-signalering, is het misschien niet verrassend dat ontregeld mitochondriaal Ca2+ betrokken is bij verschillende neurodegeneratieve ziekten, terwijl de catalogus van tumoronderdrukkers er een paar bevat die verrijkt zijn bij de MAM. [92]

Moleculaire basis voor tethering Bewerken

Recente vorderingen in de identificatie van de tuiers tussen de mitochondriale en ER-membranen suggereren dat de steigerfunctie van de betrokken moleculaire elementen secundair is aan andere, niet-structurele functies. In gist is ERMES, een multi-eiwitcomplex van interagerende ER- en mitochondriaal-residente membraaneiwitten, vereist voor lipideoverdracht aan de MAM en is een voorbeeld van dit principe. Een van zijn componenten is bijvoorbeeld ook een bestanddeel van het eiwitcomplex dat nodig is voor het inbrengen van transmembraan-bèta-barrel-eiwitten in de lipidedubbellaag. [87] Een homoloog van het ERMES-complex is echter nog niet geïdentificeerd in zoogdiercellen. Andere eiwitten die betrokken zijn bij steigers hebben ook functies die onafhankelijk zijn van structurele tethering aan de MAM, bijvoorbeeld ER-resident en mitochondrial-resident mitofusinen vormen heterocomplexen die het aantal inter-organelcontactplaatsen reguleren, hoewel mitofusinen eerst werden geïdentificeerd vanwege hun rol bij splijting en fusiegebeurtenissen tussen individuele mitochondriën. [82] Glucose-gerelateerd eiwit 75 (grp75) is een ander eiwit met twee functies. Naast de matrixpool van grp75 dient een deel als chaperonne die de mitochondriale en ER Ca2+-kanalen VDAC en IP3R fysiek verbindt voor efficiënte Ca2+-transmissie bij de MAM. [82] [29] Een andere potentiële ketting is Sigma-1R, een niet-opioïde receptor waarvan de stabilisatie van ER-resident IP3R de communicatie bij de MAM kan behouden tijdens de metabole stressrespons. [95] [96]

Perspectief bewerken

De MAM is een cruciale signalerings-, metabolische en mensenhandelhub in de cel die de integratie van ER en mitochondriale fysiologie mogelijk maakt. Koppeling tussen deze organellen is niet alleen structureel, maar ook functioneel en cruciaal voor de algehele cellulaire fysiologie en homeostase. De MAM biedt dus een perspectief op mitochondriën dat afwijkt van het traditionele beeld van dit organel als een statische, geïsoleerde eenheid die door de cel is toegeëigend voor zijn metabolische capaciteit. [97] In plaats daarvan benadrukt deze mitochondriale-ER-interface de integratie van de mitochondriën, het product van een endosymbiotische gebeurtenis, in diverse cellulaire processen. Onlangs is ook aangetoond dat mitochondriën en MAM's in neuronen verankerd zijn aan gespecialiseerde intercellulaire communicatiesites (zogenaamde somatische verbindingen). Microgliale processen bewaken en beschermen neuronale functies op deze plaatsen, en MAM's zouden een belangrijke rol spelen in dit soort cellulaire kwaliteitscontrole. [73]

Er zijn twee hypothesen over de oorsprong van mitochondriën: endosymbiotisch en autogeen. De endosymbiotische hypothese suggereert dat mitochondriën oorspronkelijk prokaryotische cellen waren, in staat om oxidatieve mechanismen te implementeren die niet mogelijk waren voor eukaryote cellen, ze werden endosymbionten die in de eukaryoot leven. [98] In de autogene hypothese werden mitochondriën geboren door een deel van het DNA van de kern van de eukaryote cel af te splitsen op het moment van divergentie met de prokaryoten. Dit DNA-deel zou zijn omsloten door membranen, die niet door eiwitten konden worden gekruist . Omdat mitochondriën veel kenmerken gemeen hebben met bacteriën, wordt de endosymbiotische hypothese breder geaccepteerd. [98] [99]

Een mitochondrion bevat DNA, dat is georganiseerd als verschillende kopieën van een enkel, meestal circulair chromosoom. Dit mitochondriale chromosoom bevat genen voor redox-eiwitten, zoals die van de ademhalingsketen. De CoRR-hypothese stelt voor dat deze co-locatie vereist is voor redox-regulatie. Het mitochondriale genoom codeert voor sommige RNA's van ribosomen en de 22 tRNA's die nodig zijn voor de translatie van mRNA's in eiwitten. De cirkelvormige structuur wordt ook gevonden in prokaryoten. Het proto-mitochondrion was waarschijnlijk nauw verwant aan Rickettsia. [100] [101] De exacte relatie van de voorouder van mitochondriën tot de alfaproteobacteriën en of het mitochondrion tegelijkertijd of na de kern werd gevormd, blijft controversieel. [102] Er is bijvoorbeeld gesuggereerd dat de SAR11-clade van bacteriën een relatief recente gemeenschappelijke voorouder deelt met de mitochondriën, [103] terwijl fylogenomische analyses aangeven dat mitochondriën zijn geëvolueerd uit een proteobacteriën-afstamming die nauw verwant is aan of een lid is van alfaproteobacteriën . [104] [105]

Subgroepen Ib, II, IIIa, IIIb, IV en V

De ribosomen waarvoor het mitochondriaal DNA codeert, zijn qua grootte en structuur vergelijkbaar met die van bacteriën. [107] Ze lijken sterk op het bacteriële 70S-ribosoom en niet op de 80S-cytoplasmatische ribosomen, waarvoor nucleair DNA wordt gecodeerd.

De endosymbiotische relatie van mitochondriën met hun gastheercellen werd gepopulariseerd door Lynn Margulis.[108] De endosymbiotische hypothese suggereert dat mitochondriën afstammen van bacteriën die op de een of andere manier endocytose door een andere cel overleefden en in het cytoplasma werden opgenomen. Het vermogen van deze bacteriën om ademhaling uit te voeren in gastheercellen die afhankelijk waren van glycolyse en fermentatie, zou een aanzienlijk evolutionair voordeel hebben opgeleverd. Deze symbiotische relatie is waarschijnlijk 1,7 tot 2 miljard jaar geleden ontstaan. [109] [110] Een paar groepen eencellige eukaryoten hebben alleen rudimentaire mitochondriën of afgeleide structuren: de microsporidians, metamonads en archamoebae. [111] Deze groepen verschijnen als de meest primitieve eukaryoten op fylogenetische bomen die zijn geconstrueerd met behulp van rRNA-informatie, wat ooit suggereerde dat ze vóór de oorsprong van mitochondriën verschenen. Het is nu echter bekend dat dit een artefact is van aantrekkingskracht op lange vertakkingen - het zijn afgeleide groepen en bevatten genen of organellen die zijn afgeleid van mitochondriën (bijvoorbeeld mitosomen en hydrogenosomen). [4] Hydrogenosomen, mitosomen en verwante organellen zoals gevonden in sommige loricifera (bijv. Spinoloricus) [112] [113] en myxozoa (bijv. Henneguya zschokkei) worden samen geclassificeerd als MRO's, mitochondrion-gerelateerde organellen. [114] [115]

Monocercomonoides lijken hun mitochondriën volledig te hebben verloren en ten minste enkele van de mitochondriale functies lijken nu te worden uitgevoerd door cytoplasmatische eiwitten. [116]

Mitochondriën bevatten hun eigen genoom. De menselijk mitochondriaal genoom is een circulair DNA-molecuul van ongeveer 16 kilobasen. [117] Het codeert voor 37 genen: 13 voor subeenheden van ademhalingscomplexen I, III, IV en V, 22 voor mitochondriaal tRNA (voor de 20 standaard aminozuren, plus een extra gen voor leucine en serine), en 2 voor rRNA. [117] Eén mitochondrion kan twee tot tien kopieën van zijn DNA bevatten. [118]

Net als bij prokaryoten is er een zeer hoog aandeel coderend DNA en zijn er geen herhalingen. Mitochondriale genen worden getranscribeerd als multigene transcripten, die worden gesplitst en gepolyadenyleerd om rijpe mRNA's op te leveren. De meeste eiwitten die nodig zijn voor de mitochondriale functie worden gecodeerd door genen in de celkern en de overeenkomstige eiwitten worden geïmporteerd in het mitochondrion. [119] Het exacte aantal genen dat wordt gecodeerd door de kern en het mitochondriale genoom verschilt tussen soorten. De meeste mitochondriale genomen zijn circulair. [120] Over het algemeen mist mitochondriaal DNA introns, zoals het geval is in het menselijke mitochondriale genoom [119] maar introns zijn waargenomen in sommige eukaryote mitochondriale DNA, [121] zoals dat van gist [122] en protisten, [ 123] inclusief Dictyostelium discoideum. [124] Tussen eiwitcoderende regio's zijn tRNA's aanwezig. Mitochondriale tRNA-genen hebben verschillende sequenties van de nucleaire tRNA's, maar er zijn gelijkenissen van mitochondriale tRNA's gevonden in de nucleaire chromosomen met een hoge sequentieovereenkomst. [125]

Bij dieren is het mitochondriale genoom typisch een enkel cirkelvormig chromosoom dat ongeveer 16 kb lang is en 37 genen heeft. De genen, hoewel sterk geconserveerd, kunnen qua locatie variëren. Vreemd genoeg wordt dit patroon niet gevonden in de luis van het menselijk lichaam (Pediculus humanus). In plaats daarvan is dit mitochondriale genoom gerangschikt in 18 minicirculaire chromosomen, die elk 3-4 kb lang zijn en één tot drie genen bevatten. [126] Dit patroon komt ook voor bij andere zuigende luizen, maar niet bij kauwluizen. Er is aangetoond dat recombinatie optreedt tussen de minichromosomen.

Alternatieve genetische code Bewerken

Uitzonderingen op de standaard genetische code in mitochondriën [17]
Organisme Codon Standaard mitochondriën
Zoogdieren AGA, AGG Arginine stopcodon
ongewervelde dieren AGA, AGG Arginine serine
schimmels CUA Leucine Threonine
Alle bovenstaande AUA isoleucine methionine
UGA stopcodon Tryptofaan

Hoewel eerder kleine variaties op de standaard genetische code waren voorspeld [127] werd er geen ontdekt tot 1979, toen onderzoekers die menselijke mitochondriale genen bestudeerden, vaststelden dat ze een alternatieve code gebruikten. [128] De mitochondriën van veel andere eukaryoten, waaronder de meeste planten, gebruiken echter de standaardcode. [129] Sindsdien zijn er veel kleine varianten ontdekt [130], waaronder verschillende alternatieve mitochondriale codes. [131] Verder zijn de AUA-, AUC- en AUU-codons allemaal toegestane startcodons.

Sommige van deze verschillen moeten worden beschouwd als pseudo-veranderingen in de genetische code vanwege het fenomeen van RNA-editing, dat gebruikelijk is in mitochondriën. In hogere planten werd gedacht dat CGG codeerde voor tryptofaan en niet voor arginine, maar het codon in het bewerkte RNA bleek het UGG-codon te zijn, in overeenstemming met de standaard genetische code voor tryptofaan. [132] Merk op dat de mitochondriale genetische code van de geleedpotige een parallelle evolutie heeft ondergaan binnen een phylum, waarbij sommige organismen AGG op unieke wijze naar lysine vertalen. [133]

Replicatie en overerving Bewerken

Mitochondriën delen door binaire splitsing, vergelijkbaar met bacteriën. [134] De regulatie van deze divisie verschilt tussen eukaryoten. Bij veel eencellige eukaryoten zijn hun groei en deling gekoppeld aan de celcyclus. Een enkel mitochondrion kan bijvoorbeeld synchroon met de kern delen. Dit proces van deling en segregatie moet streng worden gecontroleerd, zodat elke dochtercel ten minste één mitochondrion ontvangt. In andere eukaryoten (bijvoorbeeld bij zoogdieren) kunnen mitochondriën hun DNA repliceren en zich voornamelijk delen als reactie op de energiebehoeften van de cel, in plaats van in fase met de celcyclus. Wanneer de energiebehoefte van een cel hoog is, groeien en delen mitochondriën. Wanneer het energieverbruik laag is, worden mitochondriën vernietigd of worden ze inactief. In dergelijke voorbeelden worden mitochondriën blijkbaar willekeurig verdeeld over de dochtercellen tijdens de deling van het cytoplasma. Mitochondriale dynamiek, het evenwicht tussen mitochondriale fusie en splitsing, is een belangrijke factor in pathologieën die verband houden met verschillende ziektetoestanden. [135]

De hypothese van mitochondriale binaire splitsing is gebaseerd op de visualisatie door fluorescentiemicroscopie en conventionele transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). De resolutie van fluorescentiemicroscopie (

200 nm) is onvoldoende om structurele details te onderscheiden, zoals een dubbel mitochondriaal membraan in mitochondriale deling of zelfs om individuele mitochondriën te onderscheiden wanneer er meerdere dicht bij elkaar liggen. Conventionele TEM heeft ook enkele technische beperkingen [ die? ] bij het verifiëren van mitochondriale deling. Cryo-elektronentomografie werd onlangs gebruikt om mitochondriale deling in bevroren, gehydrateerde intacte cellen te visualiseren. Het onthulde dat mitochondriën delen door te ontluiken. [136]

De mitochondriale genen van een individu worden alleen van de moeder geërfd, met zeldzame uitzonderingen. [137] Bij mensen, wanneer een eicel wordt bevrucht door een sperma, komen de mitochondriën, en dus het mitochondriale DNA, meestal alleen uit het ei. De mitochondriën van het sperma komen het ei binnen, maar dragen geen genetische informatie bij aan het embryo. [138] In plaats daarvan worden de mitochondriën van de vader gemarkeerd met ubiquitine om ze te selecteren voor latere vernietiging in het embryo. [139] De eicel bevat relatief weinig mitochondriën, maar deze mitochondriën delen zich om de cellen van het volwassen organisme te bevolken. Deze modus wordt gezien bij de meeste organismen, inclusief de meeste dieren. Echter, mitochondriën bij sommige soorten kunnen soms vaderlijk worden geërfd. Dit is de norm bij bepaalde naaldplanten, maar niet bij pijnbomen en taxussen. [140] Voor Mytilids vindt vaderlijke overerving alleen plaats binnen mannetjes van de soort. [141] [142] [143] Er is gesuggereerd dat het op een zeer laag niveau bij mensen voorkomt. [144]

Uniparentale overerving leidt tot weinig kans voor genetische recombinatie tussen verschillende lijnen van mitochondriën, hoewel een enkel mitochondrion 2-10 kopieën van zijn DNA kan bevatten. [118] Welke recombinatie plaatsvindt, handhaaft de genetische integriteit in plaats van de diversiteit te handhaven. Er zijn echter studies die bewijs tonen van recombinatie in mitochondriaal DNA. Het is duidelijk dat de enzymen die nodig zijn voor recombinatie aanwezig zijn in zoogdiercellen. [145] Verder zijn er aanwijzingen dat dierlijke mitochondriën recombinatie kunnen ondergaan. [146] De gegevens zijn meer controversieel bij mensen, hoewel er indirect bewijs van recombinatie bestaat. [147] [148]

Entiteiten die uniparentale overerving ondergaan en met weinig tot geen recombinatie zullen naar verwachting onderhevig zijn aan Muller's ratel, de accumulatie van schadelijke mutaties totdat functionaliteit verloren gaat. Dierlijke populaties van mitochondriën vermijden deze opbouw door een ontwikkelingsproces dat bekend staat als de mtDNA-bottleneck. Het knelpunt maakt gebruik van stochastische processen in de cel om de cel-tot-cel variabiliteit in mutante belasting te vergroten naarmate een organisme zich ontwikkelt: een enkele eicel met een bepaald aandeel mutant mtDNA produceert dus een embryo waarin verschillende cellen verschillende mutante belastingen hebben. Selectie op celniveau kan dan werken om die cellen met meer mutant mtDNA te verwijderen, wat leidt tot een stabilisatie of vermindering van de mutantbelasting tussen generaties. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan het knelpunt wordt besproken, [149] [150] [151] met een recente wiskundige en experimentele metastudie die bewijs levert voor een combinatie van willekeurige verdeling van mtDNA's bij celdelingen en willekeurige omzet van mtDNA-moleculen in de cel. [152]

DNA-reparatie Bewerken

Mitochondriën kunnen oxidatieve DNA-schade herstellen door mechanismen die analoog zijn aan die in de celkern. De eiwitten die worden gebruikt bij mtDNA-reparatie worden gecodeerd door nucleaire genen en worden getransloceerd naar de mitochondriën. De DNA-reparatieroutes in mitochondriën van zoogdieren omvatten base-excisiereparatie, dubbelstrengs breukreparatie, directe omkering en mismatch-reparatie. [153] [154] Ook DNA-schade kan worden omzeild, in plaats van gerepareerd, door translesiesynthese.

Van de verschillende DNA-reparatieprocessen in mitochondriën is de herstelroute voor base-excisie het meest uitgebreid bestudeerd. [154] Herstel van base-excisie wordt uitgevoerd door een opeenvolging van enzymatisch gekatalyseerde stappen, waaronder herkenning en excisie van een beschadigde DNA-base, verwijdering van de resulterende abasische plaats, eindverwerking, opvulling van gaten en ligatie. Een veel voorkomende schade in mtDNA die wordt gerepareerd door base-excisieherstel is 8-oxoguanine, geproduceerd door de oxidatie van guanine. [155]

Dubbelstrengs breuken kunnen worden gerepareerd door homologe recombinatie reparatie in zowel zoogdier-mtDNA [156] als planten-mtDNA. [157] Dubbelstrengige breuken in mtDNA kunnen ook worden gerepareerd door microhomologie-gemedieerde eindverbinding. [158] Hoewel er bewijs is voor de reparatieprocessen van directe omkering en mismatch-reparatie in mtDNA, zijn deze processen niet goed gekarakteriseerd. [154]

Gebrek aan mitochondriaal DNA

Sommige organismen hebben het mitochondriaal DNA helemaal verloren. In deze gevallen zijn genen die worden gecodeerd door het mitochondriale DNA verloren gegaan of overgebracht naar de kern. [117] Cryptosporidium, mitochondriën hebben die geen DNA hebben, vermoedelijk omdat al hun genen verloren zijn gegaan of zijn overgedragen. [159] In Cryptosporidium, hebben de mitochondriën een veranderd ATP-generatiesysteem dat de parasiet resistent maakt tegen veel klassieke mitochondriale remmers zoals cyanide, azide en atovaquon. [159] Mitochondriën die geen eigen DNA hebben, zijn gevonden in een zeeparasitair dinoflagellaat van het geslacht Amoebophyra. Dit micro-organisme, A. zeker, heeft functionele mitochondriën die geen genoom hebben. [160] Bij verwante soorten heeft het mitochondriale genoom nog steeds drie genen, maar in A. zeker slechts een enkel mitochondriaal gen - het cytochroom-c-oxidase I-gen (cox1) — wordt gevonden en is naar het genoom van de kern gemigreerd. [161]

De bijna afwezigheid van genetische recombinatie in mitochondriaal DNA maakt het een nuttige bron van informatie voor het bestuderen van populatiegenetica en evolutionaire biologie. [162] Omdat al het mitochondriaal DNA wordt geërfd als een enkele eenheid of haplotype, kunnen de relaties tussen mitochondriaal DNA van verschillende individuen worden weergegeven als een genenboom. Patronen in deze genenbomen kunnen worden gebruikt om de evolutionaire geschiedenis van populaties af te leiden. Het klassieke voorbeeld hiervan is in de menselijke evolutionaire genetica, waar de moleculaire klok kan worden gebruikt om een ​​recente datum voor mitochondriale Eva te geven. [163] [164] Dit wordt vaak geïnterpreteerd als een sterke steun voor een recente moderne menselijke expansie uit Afrika. [165] Een ander menselijk voorbeeld is de sequentiebepaling van mitochondriaal DNA van Neanderthaler botten. De relatief grote evolutionaire afstand tussen de mitochondriale DNA-sequenties van Neanderthalers en levende mensen is geïnterpreteerd als bewijs voor het ontbreken van kruising tussen Neanderthalers en moderne mensen. [166]

Mitochondriaal DNA weerspiegelt echter alleen de geschiedenis van de vrouwtjes in een populatie. Dit kan gedeeltelijk worden ondervangen door het gebruik van vaderlijke genetische sequenties, zoals het niet-recombinerende gebied van het Y-chromosoom. [165]

Recente metingen van de moleculaire klok voor mitochondriaal DNA [167] rapporteerden een waarde van 1 mutatie elke 7884 jaar die teruggaat tot de meest recente gemeenschappelijke voorouder van mensen en apen, wat consistent is met schattingen van mutatiesnelheden van autosomaal DNA (10 −8 per basis per generatie). [168]

Mitochondriale ziekten

Schade en daaropvolgende disfunctie in mitochondriën is een belangrijke factor in een reeks menselijke ziekten vanwege hun invloed op het celmetabolisme. Mitochondriale aandoeningen presenteren zich vaak als neurologische aandoeningen, waaronder autisme. [15] Ze kunnen zich ook manifesteren als myopathie, diabetes, multipele endocrinopathie en een verscheidenheid aan andere systemische aandoeningen. [169] Ziekten veroorzaakt door mutatie in het mtDNA omvatten het Kearns-Sayre-syndroom, het MELAS-syndroom en de erfelijke optische neuropathie van Leber. [170] In de overgrote meerderheid van de gevallen worden deze ziekten door een vrouw op haar kinderen overgedragen, aangezien de zygote zijn mitochondriën en dus zijn mtDNA van de eicel ontleent. Aangenomen wordt dat ziekten zoals het Kearns-Sayre-syndroom, het Pearson-syndroom en progressieve externe oftalmoplegie te wijten zijn aan grootschalige mtDNA-herschikkingen, terwijl andere ziekten zoals het MELAS-syndroom, de erfelijke optische neuropathie van Leber, het MERRF-syndroom en andere te wijten zijn aan puntmutaties in mtDNA. [169]

Bij andere ziekten leiden defecten in nucleaire genen tot disfunctie van mitochondriale eiwitten. Dit is het geval bij ataxie van Friedreich, erfelijke spastische paraplegie en de ziekte van Wilson. [171] Deze ziekten worden overgeërfd in een dominantierelatie, zoals geldt voor de meeste andere genetische ziekten. Een verscheidenheid aan aandoeningen kan worden veroorzaakt door nucleaire mutaties van oxidatieve fosforyleringsenzymen, zoals co-enzym Q10-deficiëntie en het syndroom van Barth. [169] Omgevingsinvloeden kunnen een wisselwerking hebben met erfelijke aanleg en mitochondriale ziekte veroorzaken. Er kan bijvoorbeeld een verband zijn tussen blootstelling aan pesticiden en het latere begin van de ziekte van Parkinson. [172] [173] Andere pathologieën met etiologie waarbij mitochondriale disfunctie betrokken is, zijn schizofrenie, bipolaire stoornis, dementie, de ziekte van Alzheimer, [174] [175] de ziekte van Parkinson, epilepsie, beroerte, hart- en vaatziekten, chronisch vermoeidheidssyndroom, retinitis pigmentosa en diabetes mellitus . [176] [177]

Door mitochondriën gemedieerde oxidatieve stress speelt een rol bij cardiomyopathie bij type 2 diabetici. Verhoogde vetzuurafgifte aan het hart verhoogt de vetzuuropname door cardiomyocyten, wat resulteert in een verhoogde vetzuuroxidatie in deze cellen. Dit proces verhoogt de reducerende equivalenten die beschikbaar zijn voor de elektronentransportketen van de mitochondriën, waardoor uiteindelijk de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) toeneemt. ROS verhoogt ontkoppelingseiwitten (UCP's) en versterkt protonlekkage door de adenine nucleotide translocator (ANT), waarvan de combinatie de mitochondriën ontkoppelt. Ontkoppeling verhoogt dan het zuurstofverbruik door de mitochondriën, wat de toename van vetzuuroxidatie verergert. Hierdoor ontstaat een vicieuze cirkel van ontkoppeling, terwijl het zuurstofverbruik toeneemt, maar de ATP-synthese niet proportioneel toeneemt omdat de mitochondriën zijn ontkoppeld. Minder ATP-beschikbaarheid resulteert uiteindelijk in een energietekort dat zich uit in verminderde hartefficiëntie en contractiele disfunctie. Om het probleem te verergeren, beperken de verminderde calciumafgifte van het sarcoplasmatisch reticulum en de verminderde mitochondriale heropname de cytosolische piekniveaus van het belangrijke signaalion tijdens spiercontractie. Verlaagde intra-mitochondriale calciumconcentratie verhoogt dehydrogenase-activering en ATP-synthese. Dus naast een lagere ATP-synthese als gevolg van vetzuuroxidatie, wordt de ATP-synthese ook belemmerd door een slechte calciumsignalering, wat hartproblemen veroorzaakt voor diabetici. [178]

Relaties met ouder worden Bewerken

Er kan enige lekkage zijn van de hoogenergetische elektronen in de ademhalingsketen om reactieve zuurstofsoorten te vormen. Men dacht dat dit zou resulteren in significante oxidatieve stress in de mitochondriën met hoge mutatiesnelheden van mitochondriaal DNA. [179] Veronderstelde verbanden tussen veroudering en oxidatieve stress zijn niet nieuw en werden voorgesteld in 1956, [180] dat later werd verfijnd tot de mitochondriale theorie van veroudering van vrije radicalen. [181] Er werd gedacht dat er een vicieuze cirkel ontstond, aangezien oxidatieve stress leidt tot mitochondriale DNA-mutaties, wat kan leiden tot enzymatische afwijkingen en verdere oxidatieve stress.

Tijdens het verouderingsproces kunnen er een aantal veranderingen optreden in de mitochondriën. [182] Weefsels van oudere mensen vertonen een afname van de enzymatische activiteit van de eiwitten van de ademhalingsketen. [183] ​​Gemuteerd mtDNA kan echter alleen worden gevonden in ongeveer 0,2% van de zeer oude cellen. [184] Grote deleties in het mitochondriale genoom zouden leiden tot hoge niveaus van oxidatieve stress en neuronale dood bij de ziekte van Parkinson. [185] Er is ook aangetoond dat mitochondriale disfunctie voorkomt bij amyotrofische laterale sclerose. [186] [187]

Aangezien mitochondriën een cruciale rol spelen in de functie van de eierstokken, door ATP te leveren die nodig is voor de ontwikkeling van kiemblaasje tot rijpe eicel, kan een verminderde functie van de mitochondriën leiden tot ontsteking, wat resulteert in voortijdig falen van de eierstokken en versnelde veroudering van de eierstokken. De veroorzaakte disfunctie wordt vervolgens weerspiegeld in zowel kwantitatieve (zoals mtDNA-kopieaantal en mtDNA-deleties), kwalitatieve (zoals mutaties en strengbreuken) en oxidatieve schade (zoals disfunctionele mitochondriën als gevolg van ROS), die niet alleen relevant zijn bij veroudering van de eierstokken , maar verstoren de oöcyt-cumulus-overspraak in de eierstok, zijn gekoppeld aan genetische aandoeningen (zoals Fragile X) en kunnen de embryoselectie verstoren. [188]

De eerste waarnemingen van intracellulaire structuren die waarschijnlijk mitochondriën vertegenwoordigden, werden gepubliceerd in de jaren 1840. [189] Richard Altmann, in 1890, vestigde ze als celorganellen en noemde ze "bioblasten". [189] [190] In 1898 bedacht Carl Benda de term "mitochondria" van het Griekse μίτος, mitos, "draad", en χονδρίον , chondrion, "korrel". [191] [189] [192] Leonor Michaelis ontdekte in 1900 dat Janus-groen kan worden gebruikt als supravitale kleuring voor mitochondriën.In 1904 deed Friedrich Meves de eerste geregistreerde waarneming van mitochondriën in planten in cellen van de witte waterlelie, Nymphaea alba [189] [193] en in 1908, samen met Claudius Regaud, suggereerde dat ze eiwitten en lipiden bevatten. Benjamin F. Kingsbury bracht ze in 1912 voor het eerst in verband met celademhaling, maar bijna uitsluitend gebaseerd op morfologische waarnemingen. [189] In 1913 werden deeltjes uit extracten van cavialever gekoppeld aan de ademhaling door Otto Heinrich Warburg, die hij "grana" noemde. Warburg en Heinrich Otto Wieland, die ook een soortgelijk deeltjesmechanisme hadden gepostuleerd, waren het oneens over de chemische aard van de ademhaling. Pas in 1925, toen David Keilin cytochromen ontdekte, werd de ademhalingsketen beschreven. [189]

In 1939 toonden experimenten met gehakte spiercellen aan dat cellulaire ademhaling met behulp van één zuurstofatoom twee adenosinetrifosfaat (ATP) -moleculen kan vormen, en in 1941 werd het concept ontwikkeld dat de fosfaatbindingen van ATP een vorm van energie in het cellulaire metabolisme zijn, ontwikkeld door Fritz. Albert Lipmann. In de daaropvolgende jaren werd het mechanisme achter cellulaire ademhaling verder uitgewerkt, hoewel het verband met de mitochondriën niet bekend was. [189] De introductie van weefselfractionering door Albert Claude maakte het mogelijk mitochondriën te isoleren van andere celfracties en biochemische analyse alleen op hen uit te voeren. In 1946 concludeerde hij dat cytochroomoxidase en andere enzymen die verantwoordelijk zijn voor de ademhalingsketen, geïsoleerd waren in de mitochondriën. Eugene Kennedy en Albert Lehninger ontdekten in 1948 dat mitochondriën de plaats zijn van oxidatieve fosforylering in eukaryoten. In de loop van de tijd werd de fractioneringsmethode verder ontwikkeld, waardoor de kwaliteit van de geïsoleerde mitochondriën werd verbeterd en er werd vastgesteld dat andere elementen van celademhaling in de mitochondriën zouden voorkomen. [189]

De eerste elektronenmicrofoto's met hoge resolutie verschenen in 1952, ter vervanging van de Janus Green-vlekken als de voorkeursmanier om mitochondriën te visualiseren. [189] Dit leidde tot een meer gedetailleerde analyse van de structuur van de mitochondriën, inclusief bevestiging dat ze waren omgeven door een membraan. Het toonde ook een tweede membraan in de mitochondriën dat zich opvouwde in richels die de binnenkamer verdelen en dat de grootte en vorm van de mitochondriën van cel tot cel varieerde.

De populaire term "krachtpatser van de cel" werd in 1957 bedacht door Philip Siekevitz. [3]

In 1967 werd ontdekt dat mitochondriën ribosomen bevatten. [194] In 1968 werden methoden ontwikkeld om de mitochondriale genen in kaart te brengen, met de genetische en fysieke kaart van mitochondriaal DNA van gist voltooid in 1976. [189]


Verschillen in mitochondriale efficiëntie verklaren individuele variatie in groeiprestaties

De fysiologische oorzaken van intraspecifieke verschillen in fitnesscomponenten, zoals groeisnelheid, zijn momenteel een bron van discussie. Er is gesuggereerd dat verschillen in energiemetabolisme variatie in groei kunnen veroorzaken, maar het blijft onduidelijk of covariatie tussen groeisnelheid en energiemetabolisme: (i) het resultaat is van het verwerven en bijgevolg toewijzen van meer middelen aan groei door bepaalde individuen, en/of is (ii) bepaald door variatie in de efficiëntie waarmee die hulpbronnen worden omgezet in groei. Studies van individueel gehuisveste dieren onder gestandaardiseerde voedingscondities kunnen licht werpen op dit debat. Hier kwantificeren we de individuele variatie in metabolische efficiëntie in termen van de hoeveelheid adenosinetrifosfaat (ATP) die wordt gegenereerd per zuurstofmolecuul dat wordt geconsumeerd door lever- en spiermitochondriën en onderzoeken we de effecten ervan, zowel op de snelheid van eiwitsynthese in deze weefsels als op de snelheid van lichaamsgroei van individueel gevoede juveniele forel (Salmo trutta) een hoog of laag voedselrantsoen krijgen. Zoals verwacht, wonnen vissen op het hoge rantsoen gemiddeld meer in lichaamsmassa en eiwitgehalte dan die op het lage rantsoen. Toch varieerde de groeiprestatie meer dan 10 keer tussen individuen op hetzelfde rantsoen, waardoor sommige vissen op lage rantsoenen sneller groeiden dan andere op hoge rantsoenen. Deze variatie in groei voor een bepaald rantsoen was gerelateerd aan individuele verschillen in mitochondriale eigenschappen: een hoge groeiprestatie van het hele lichaam was geassocieerd met een hoge mitochondriale efficiëntie van ATP-productie in de lever. Onze resultaten laten voor het eerst zien, voor zover wij weten, dat individuele variatie in de efficiëntie waarmee substraten worden omgezet in ATP kan helpen bij het verklaren van duidelijke variatie in groeiprestaties, onafhankelijk van voedselinname. Deze studie benadrukt het bestaan ​​van interindividuele verschillen in mitochondriale efficiëntie en het potentiële belang ervan bij het verklaren van intraspecifieke variatie in de prestaties van hele dieren.

1. Inleiding

Individuele dieren kunnen in zeer verschillende snelheden groeien ondanks het feit dat ze onder dezelfde omstandigheden leven - een bevinding die is gedocumenteerd in een breed scala van taxa (besproken in [1,2]). Dit fenomeen wordt vaak geïnterpreteerd in termen van variatie in individuele kwaliteit. Bijvoorbeeld, individuen die sneller groeien, bereiken doorgaans sneller volwassenheid en kunnen een hogere vruchtbaarheid hebben dan langzamer groeiende individuen, wat wijst op directe fitnessgevolgen van de groeisnelheid [3,4]. De fysiologische processen die ten grondslag liggen aan deze individuele variatie in groeisnelheid worden momenteel echter slecht begrepen.

Een snellere groei kan uiteraard worden bereikt door de voedselinname te verhogen. Individuen met een hoge voedselinname groeien sneller in vergelijking met individuen die een lagere inname van hulpbronnen hebben, omdat grote hoeveelheden voedsel kunnen leiden tot een hogere mate van toewijzing van hulpbronnen aan energetisch kostbare processen, zoals de productie van biomassa en op hun beurt , groei. De variatie in groeisnelheid kan echter aanhouden, zelfs wanneer de voedselinname gestandaardiseerd is. Individuele vissen die tot verzadiging werden gevoerd en een vergelijkbare hoeveelheid voedsel consumeerden, vertoonden bijvoorbeeld drievoudige verschillen in groeiprestaties [5]. Evenzo zijn vijfvoudige verschillen in groeisnelheid aangetoond tussen vissen die een identieke hoeveelheid voedsel consumeren [6]. Dit suggereert dat variatie in groei, althans gedeeltelijk, kan worden toegeschreven aan variatie in de efficiëntie van het gebruik van hulpbronnen en de toewijzing ervan aan biomassaproductie. Toch is er verrassend weinig onderzoek gedaan naar de mogelijke mechanismen die ten grondslag kunnen liggen aan deze variatie in metabole efficiëntie en dus groeiprestaties [7].

Variatie in de efficiëntie waarmee voedsel wordt omgezet in energie wordt verondersteld een belangrijke rol te spelen in het verband tussen voedselinname en groei van dieren [7-9]. Energie afgeleid van voedingsstoffen wordt pas bruikbaar voor cellulaire processen na de transformatie in hoogenergetische moleculen van adenosinetrifosfaat (ATP). ATP is de belangrijkste energiebron voor de meeste cellulaire functies, zoals DNA, RNA en eiwitsynthese (en dus biomassaproductie). De belangrijkste plaatsen van energieconversie zijn de mitochondriën, die meer dan 90% van het ATP van een cel leveren [10]. Mitochondriaal ATP wordt geproduceerd via oxidatieve fosforylering, een proces waarbij energiesubstraten worden geoxideerd om een ​​protongradiënt te genereren die de fosforylering van ADP naar ATP aanstuurt. Hoewel ATP-productie afhangt van de snelheid van substraatoxidatie, kan het aantal ATP-moleculen dat wordt geproduceerd voor elk molecuul zuurstof en energiesubstraat (d.w.z. pyruvaat, glutamaat, acetyl-CoA, enz.) dat door de mitochondriën wordt verbruikt, variëren [11]. Een deel van de energie die wordt gegenereerd door substraatoxidatie wordt gedissipeerd door protonlekkage over het binnenste mitochondriale membraan en deze lekkage kan de beschikbare energie om ATP te produceren verminderen [12]. De hoeveelheid energie die wordt gedissipeerd in het mitochondriale protonlek varieert van persoon tot persoon [13,14] en het is bekend dat deze variatie correleert met de prestaties van het dier [15,16]. Dit verhoogt de mogelijkheid dat variatie in groei tussen individuen kan leiden tot verschillen in de efficiëntie waarmee mitochondriën ATP produceren.

Mitochondriale efficiëntie kan worden gekwantificeerd door de ATP/O-verhouding te meten, dat wil zeggen de verhouding in de hoeveelheid ATP die wordt gegenereerd per verbruikte eenheid zuurstof [17]. Dus hoe hoger deze verhouding, hoe efficiënter een dier zijn metabolische substraten omzet in ATP, waarbij het ATP dan beschikbaar is voor energie-eisende cellulaire processen zoals eiwitsynthese en biomassaproductie [18]. Een aantal onderzoeken heeft positieve verbanden gevonden tussen de gemiddelde groeisnelheid en de gemiddelde mitochondriale efficiëntie bij vergelijking tussen behandelingsgroepen, populaties of selectielijnen [9,19-23], maar tot nu toe is er, voor zover wij weten, geen beoordeling geweest of mitochondriale efficiëntie zou variatie in groeisnelheid tussen individuele dieren kunnen verklaren die met dezelfde voedselinname worden gehouden.

In deze studie hebben we, voor zover wij weten, voor het eerst getest of individuele variatie in groeiprestaties - gemeten zowel als de snelheid van de massatoename in het hele lichaam en als de snelheid van eiwitsynthese - gerelateerd was aan individuele variatie in mitochondriale efficiëntie. Om deze hypothese te testen, hebben we de relaties onderzocht tussen ATP/O-verhouding, fractionele snelheid van eiwitsynthese en groeiprestaties (groeisnelheid, groei-efficiëntie en eiwittoename) bij individueel gehuisveste beekforel (Salmo trutta) van dezelfde leeftijd en onderhouden onder gestandaardiseerde omstandigheden. Om hun voedselinname te standaardiseren, werden vissen gevoerd met individuele beperkte rantsoenen om ervoor te zorgen dat verschillen in groeiprestaties konden worden toegeschreven aan mitochondriale efficiëntieverschillen. We kozen juveniele beekforel als ons studieorganisme omdat grotere lichaamsgrootte bij beekforel een belangrijke bepalende factor is voor fitheid, met snelle groei resulterend in verhoogde overleving [24] en grotere lichaamsgrootte wordt gekoppeld aan hogere vruchtbaarheid [25]. We analyseerden mitochondriale eigenschappen en eiwitsynthese in de lever en de witte spier omdat bekend is dat de fysiologische eigenschappen van deze weefsels de groeiprestaties beïnvloeden [16,26]. We voorspelden positieve interindividuele correlaties tussen mitochondriale efficiëntie, eiwitsynthese en groeiprestaties.

2. Materiaal en methoden

(a) Proefdieren

Bruine forel werd in juni 2015 verplaatst van de broederij (Howietoun, VK) naar de Universiteit van Glasgow. De vissen werden vervolgens in een gemeenschappelijke tank gehouden en onder een 12 L: 12 D fotoperiode bij 12°C gehouden en dagelijks in overmaat gevoerd met forelkorrelvoer (EWOS, West Lothian, VK). In september 2016 vis (N = 60) werden overgebracht naar afzonderlijke compartimenten binnen een stroomtanksysteem dat individuele dagelijkse voeding mogelijk maakte terwijl de vissen onder dezelfde waterkwaliteitsomstandigheden werden gehouden. Elk afzonderlijk compartiment bevatte een kleine schuilplaats (een stuk ondoorzichtige plastic buis).

De vissen werden eerst twee weken geacclimatiseerd in hun individuele compartimenten, waarbij ze dagelijks tot overmaat werden gevoerd op dezelfde forelpellets. De vissen werden vervolgens 22 uur vastgehouden en kort verdoofd (50 ml -1 benzocaïne in water) voor het meten van de lichaamsmassa (± 0,001 g) om de calorie-inname en daarmee de voedselrantsoenen (als aantal pellets) te kunnen berekenen. Gedurende de volgende 5-10 weken (zie hieronder) werden de vissen eenmaal daags gevoerd met een gemiddeld rantsoen van pellets (vermoedelijk voldoende voor groei maar minder dan een maximale opnamesnelheid) met behulp van een vergelijking van Elliott [27] waarmee de berekening van individueel specifiek rantsoen in calorieën als functie van de lichaamsmassa van de vis (W) in gram en watertemperatuur (t) van 12°C als volgt:

Vissen kregen hun rantsoen in de vroege ochtend, alle vissen consumeerden hun volledige dagelijkse rantsoen binnen 2 uur. De lichaamsmassa werd om de twee weken gemeten en de voedselrantsoenen werden herberekend om te corrigeren voor gewichtstoename. De vissen moesten 22 uur vasten vóór elke meting van het lichaamsgewicht, en bij terugkeer naar hun compartiment werden ze 2 uur later gevoerd dan normaal om tijd te geven om te herstellen van de verdoving en om ervoor te zorgen dat ze het rantsoen aten. Alle vissen consumeerden hun volledige dagelijkse rantsoen en wonnen tijdens deze acclimatisatieperiode aan massa.

(b) Dieetbehandeling en groeimetingen

Na deze periode van acclimatisatie aan een intermediair dieet, werden de vissen gedurende 14 dagen overgeschakeld naar de laatste dieetbehandeling. Deze duur werd gekozen omdat het de mate van mitochondriale omzetting beperkte die zou optreden tijdens de groeiperiode, maar voldoende was om verschillen in de groeisnelheid tussen individuen te detecteren [28]. Omdat aan het einde van het experiment slechts twee individuen per dag konden worden geanalyseerd op hun mitochondriale functie, werd de start van de dieetbehandeling gespreid over een periode van vijf weken (zodat de voorafgaande acclimatisatieperiode varieerde tussen 5 en 10 weken). Twee vissen per dag (die 14 dagen later samen zouden worden verwerkt) werden dus willekeurig toegewezen aan de behandelingen: van één vis werd het rantsoen verhoogd tot 150% van het tussenrantsoen (hoog rantsoen, N = 30) en de ander had zijn rantsoen verlaagd tot 50% van het tussenrantsoen (laag rantsoen, N = 30). Het lage rantsoen leverde naar schatting voldoende energie om te voorzien in onderhoudsbehoeften en relatief langzame groei [27], terwijl het hoge rantsoen de maximale voedselopname van jonge beekforel benaderde [27]. De lichaamsmassa varieerde van 3,61 tot 15,48 g over individuen aan het begin van het experiment, maar verschilde niet tussen vissen die vervolgens werden toegewezen aan de twee voedselbehandelingen (hoog rantsoen: 8,15 ± 0,49 g, laag rantsoen: 8,18 ± 0,48 g, t-toets: t58 = −0.041, P = 0,967). De lichaamsmassa werd opnieuw gemeten (zoals hierboven) op dag 7 van de dieetbehandeling en de rantsoenen werden opnieuw berekend om te corrigeren voor groei. Alle vissen, op één na, consumeerden hun volledige dagelijkse rantsoen binnen 2 uur tijdens de experimentele periode. Deze vis werd uit alle analyses verwijderd, zodat een uiteindelijke steekproefomvang van 59 vissen werd verkregen (hoog voedsel: N = 29 laag voedsel: N = 30).

Groeisnelheid en groei-efficiëntie werden gelijktijdig geschat over een periode van 7 dagen, beginnend op dag 7 van de experimentele behandeling (in de volgende vergelijking de initiële vislichaamsmassa (BM) genoemd) en eindigend op dag 14 (uiteindelijke vis-BM). Specifieke groeisnelheid (% dag −1) werd gedefinieerd als:

De dagelijkse voedselopname werd berekend uit het dagelijkse voedselrantsoen en werd uitgedrukt in korrelmassa. De groei-efficiëntie (mg toename in lichaamsgewicht mg −1 gegeten voedsel) werd voor elke vis gemeten als:

Aan het einde van de voedselbehandelingsperiode werden fractionele snelheden van eiwitsynthese en mitochondriale eigenschappen gemeten in de vissen volgens de hieronder beschreven protocollen.

(c) Schatting van de winst in eiwit voor het hele lichaam

De relatie tussen het eiwitgehalte van het hele lichaam en de lichaamsmassa van vissen die met middelmatige, lage en hoge rantsoenen zijn gekweekt, werd gebruikt om het eiwitgehalte van elke vis aan het begin en aan het einde van de dieetbehandeling te schatten en daardoor de winst in eiwitgehalte te schatten gedurende de behandelperiode. Concreet bepaalden we eerst de relatie tussen de lichaamsmassa van een vis en zijn eiwitgehalte in het hele lichaam (elektronisch aanvullend materiaal, figuur S1), met behulp van een aparte groep beekforellen van dezelfde leeftijd en grootte (zie het elektronische aanvullende materiaal voor volledige details in de rubriek 'Proteïnegehalte in het hele lichaam').

Het aanvankelijke eiwitgehalte in het hele lichaam (initiële BP) van elke experimentele vis werd daarom geschat op basis van zijn lichaamsmassa aan het begin van de voedselbehandeling, met behulp van de kalibratieregressie voor vissen op het tussenrantsoen. Het uiteindelijke eiwitgehalte in het hele lichaam (uiteindelijke BP) van elke experimentele vis werd eveneens geschat op basis van zijn lichaamsmassa aan het einde van de voedselbehandeling, met behulp van de juiste vergelijking voor zijn dieetbehandeling. Specifieke eiwittoename (% dag −1) werd vervolgens gedefinieerd als:

(d) Meting van de fractionele snelheid van eiwitsynthese

Het percentage van de eiwitmassa dat per dag wordt gesynthetiseerd - de fractionele snelheid van eiwitsynthese - werd gemeten met behulp van de flooding-dosistest [29], aangepast voor het gebruik van stabiele isotooptracer, de ring-D5-fenylalanine (D5-Phe) [30]. Kortom, de verhoudingen van de hoeveelheid D5-Phe ten opzichte van de hoeveelheid totaal fenylalanine (totaal Phe gelijk aan D5-Phe plus zijn natuurlijke versie) in zowel de eiwitpool als de vrije pool van aminozuren maken het mogelijk om de fractionele snelheid van eiwitsynthese te berekenen. De test werd eerst gevalideerd voor bruine forel van deze leeftijd en grootte door een voorlopig tijdsverloopexperiment uit te voeren (elektronisch aanvullend materiaal). Uit dit validatie-experiment hebben we vastgesteld dat een D5-Phe-incubatietijd van ongeveer 60 minuten was een geschikte opnameduur.

Voor het hoofdexperiment werden de vissen 21 uur gevast voordat ze in het buikvlies werden geïnjecteerd met de D5-Phe oplossing. Elke vis werd vervolgens onmiddellijk in een afzonderlijke tank met 2 l belucht water geplaatst voor een periode van ongeveer 1 uur (gemiddelde ± s.e.: 1 uur05 min ± 0u00 min) zonder voedsel en in het donker. De vissen werden vervolgens geruimd en hun levers werden onmiddellijk ontleed, gewogen en gespoeld met gedestilleerd water. Een deel van de lever werd gewogen en bewaard in ijskoude respirometriebuffer (0,1 mM EGTA, 15 µM EDTA, 1 mM MgCl2, 20 mM Taurine, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM d-sucrose, 60 mM lactobionzuur, 1 g l −1 runderserumalbumine in wezen vetzuurvrij, pH 7,2 met KOH) voor daaropvolgende meting van mitochondriale eigenschappen (zie hieronder). Een tweede portie van de lever voor het meten van de eiwitsynthese werd gewogen en onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -70°C tot verdere analyse. Evenzo werden twee monsters van wit spierweefsel genomen dorsaal naar de zijlijn (om contaminatie met rode vezels te voorkomen) en net achter de rugvin. Eén aliquot werd van de ene kant van de vis verzameld en in respirometriebuffer bewaard, terwijl de andere aliquot van de andere kant werd verzameld en onmiddellijk werd ingevroren. Na extractie en kwantificering van de fenylalanine-isotopen in zowel de vrije aminozuurpool als in de eiwitpool (details in het elektronische aanvullende materiaal), werd de fractionele snelheid van eiwitsynthese (Ks in % dag −1) berekend als:

(e) Meting van mitochondriale eigenschappen

Omdat slechts twee monsters tegelijkertijd konden worden uitgevoerd om mitochondriale eigenschappen te meten, werden levermonsters van de twee individuen in een verwerkingsbatch eerst gehomogeniseerd zoals in [15,16] en beoordeeld op mitochondriale functie, terwijl het submonster van witte spier werd bewaard in respirometriebuffer op ijs voor de volgende run.

Zuurstof- en magnesiumgroene fluorescentiesignalen werden gelijktijdig gedetecteerd met behulp van twee respirometriekamers uitgerust met fluorescerende sensoren en opgenomen met behulp van D at L ab-software (Oroboros Instruments, Innsbruck, Oostenrijk). Weefselhomogenaat van elke vis werd onmiddellijk na bereiding toegevoegd aan een van de twee meetkamers. Mitochondriale efficiëntie werd gemeten zoals in Salin et al. [31]. In het kort hebben we een protocol gebruikt voor het schatten van de ATP/O-verhouding die tegelijkertijd zowel het zuurstofverbruik als de ATP-productie op hetzelfde monster meet. Cytochroom C oxidase (COX) ademhaling werd vervolgens gemeten om standaardisatie van de mitochondriale dichtheid van de weefsels mogelijk te maken [32]. De snelheid van zuurstofverbruik gelijktijdig met ATP-productie werd beoordeeld door verzadigend ADP toe te voegen aan de kamer die complexe I- en II-substraten bevat. COX-activiteit werd gemeten na toevoeging van ascorbaat en N,N,N′,N′-tetramethyl-P-fenyleendiamine-dihydrochloride. De spierproef was identiek aan de leverproef, maar adenylaatkinaseremmer werd aan de meetkamer toegevoegd met het deelmonster van de spier die op ijs werd gehouden (zie het elektronische aanvullende materiaal voor volledige details van het protocol).

De snelheden van massaspecifiek zuurstofverbruik en ATP-productie bij elke stap van het protocol werden gemiddeld over 30-60 s stabilisatie. Fluxen van O2 en ATP werden uitgedrukt in pmol s -1 mg -1 nat gewicht weefsel. De ATP/O-ratio werd berekend als de verhouding van gecorrigeerde ATP-productie tot verdubbeling van de O .-snelheid2 verbruik op het moment dat de ATP werd geproduceerd.

(f) Statistische analyse

We gebruikten eerst correlatieanalyse om te testen of fysiologische parameters (mitochondriale efficiëntie (ATP / O-verhouding), mitochondriale dichtheid (COX-activiteit) en fractionele snelheid van eiwitsynthese (Ks)) gecorreleerd waren tussen de lever en de witte spier in dezelfde vis. Vervolgens hebben we lineaire gemengde modellen (LMM's) gebruikt om de verbanden te bepalen tussen mitochondriale efficiëntie van de lever en/of spieren en de fractionele snelheid van eiwitsynthese voor verschillende snelheden van voedselinname. De modellen omvatten Ks van lever of spier als de afhankelijke variabele, ATP/O-ratio van lever en spier als continue voorspellers, en de voedselinname (hoog of laag) als een vaste factor, en tweerichtingsinteracties tussen voedselinname en covariaten. Om te controleren op effecten van mitochondriale dichtheid op de fractionele snelheid van eiwitsynthese, omvatten de modellen COX-activiteit van de lever en spieren als een covariabele en in tweerichtingsinteracties met voedselinname, met Ks als de afhankelijke variabele. Verwerkingsbatch werd opgenomen als een willekeurig effect om te controleren voor de volgorde waarin vissen werden verwerkt. Voorlopige analyses toonden aan dat de fractionele snelheid van eiwitsynthese niet werd beïnvloed door de duur van D5- Phe-blootstelling of de massa van het monster dat is gebruikt voor de extractie van de fenylalanine-isotopen, dus de blootstellingsduur en de massa van het monster werden niet als covariabelen opgenomen in de uiteindelijke modellen. We hebben uiteindelijk getest of de mate van mitochondriale efficiëntie en de fractionele snelheid van eiwitsynthese van de lever en/of de spier individuele variatie in groeiprestaties verklaarden met behulp van een lineaire gemengde modelbenadering. De modellen omvatten de groeiprestaties (specifieke groeisnelheid, groei-efficiëntie en specifieke eiwittoename) als afhankelijke variabelen, en ATP/O-ratio en Ks van lever en spier als continue voorspellers, de voedselinname als een vaste factor, met verwerkingsbatch als een willekeurige factor. Om te controleren op effecten van mitochondriale dichtheid op groeiprestaties, werd COX-activiteit van de lever of spier opgenomen als een covariabele in de modellen met specifieke groeisnelheid, groei-efficiëntie en specifieke eiwitaanwinst als de afhankelijke variabele. Deze modellen omvatten ook tweerichtingsinteracties tussen covariaten en voedselregime. Om te controleren voor effecten van de initiële lichaamsgrootte op de groeiprestaties, werd de initiële lichaamsmassa opgenomen als een covariabele in de modellen met specifieke groeisnelheid of groei-efficiëntie als de afhankelijke variabele, terwijl de initiële schatting voor het eiwitgehalte van het hele lichaam werd opgenomen als een covariabele in het model voor specifieke eiwitaanwinst. Alle modellen werden vereenvoudigd door niet-significante termen te verwijderen in een achterwaartse verwijderingsprocedure, te beginnen met tweerichtingsinteracties. De significantie werd getest toen termen uit het model werden verwijderd. Alle statistische analyses werden uitgevoerd in IBM SPSS Statistics 21 (Chicago, IL). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± s.e., en het significantieniveau was ingesteld op P < 0,05.

3. Resultaten

De mitochondriale efficiëntie (ATP / O-verhouding) vertoonde significante inter-individuele variatie, die voor elk weefsel ten minste tweevoudig varieerde tussen individuen met dezelfde voedselinname (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S1). De fractionele snelheid van eiwitsynthese Ks verschilde tot twee- of vijfvoudig in respectievelijk lever en spieren bij personen met dezelfde voedselinname (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S1). Er was geen correlatie tussen de fysiologische kenmerken (ATP/O-ratio en Ks) van lever en spier van dezelfde vis (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S2).

De fractionele snelheid van spiereiwitsynthese Ks in een vis was afhankelijk van de ATP/O-verhouding van zijn levermitochondriën, hoewel dit effect afhing van de voedselinname (lever-ATP/O door interactie met voedselopname, tabel 1). Terwijl spier Ks positief gerelateerd was aan de ATP/O-verhouding in de levermitochondriën van vissen met het hoge voedselrantsoen (t36 = 2.80, P = 0,008), was er geen dergelijke relatie bij vissen die een laag voedselrantsoen kregen (t36 = −0.92, P = 0,362 figuur 1). Tussen-individuele variatie in de fractionele snelheid van eiwitsynthese Ks in de lever werd niet verklaard door de mitochondriale efficiëntie in lever of spier (LMM, P > 0,05).

Figuur 1. Verband tussen de fractionele snelheid van eiwitsynthese (Ks) in de spieren en mitochondriale efficiëntie (ATP/O-verhouding) in de lever van juveniele forel bij lage versus hoge voedselinname. Doorlopende lijnen laten een significant effect zien. N = 28–30 vissen per voerniveau. Zie tabel 1 voor statistische analyses.

Tabel 1. Resultaten van lineaire gemengde modelanalyse van de fractionele snelheid van eiwitsynthese (Ks) in de spier van een beekforel als functie van de voedselinname en de eigenschappen (ATP/O-verhouding en cytochroom C oxidase, COX-activiteit) van mitochondriën in zijn spieren en lever. (Verwerkingsbatch werd opgenomen als een willekeurig effect om te controleren voor de volgorde waarin vissen werden verwerkt. Niet-significante termen werden uitgesloten van de uiteindelijke analyse. Vet geeft significante resultaten aan.)

a Voedselinname: vaste factor op twee niveaus (lage en hoge voedselinname).

b Volledig model: spier Ks = voedselinname + lever-COX-activiteit + spier-COX-activiteit + lever-ATP/O-ratio + spier-ATP/O-ratio + voedselinname × lever-ATP/O-ratio + voedselinname × lever-COX-activiteit + voedselinname × spier COX-activiteit + voedselinname × spier-ATP/O-verhouding.

Het is niet verrassend dat de voedselinname een positief effect had op de specifieke groeisnelheid, waarbij vissen gemiddeld een driemaal hogere specifieke groeisnelheid hebben op het hoge dan op het lage rantsoen (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S1). Individuen van dezelfde voedselbehandeling varieerden echter aanzienlijk in hun specifieke groeisnelheid, waarbij de snelstgroeiende vissen in het lage rantsoen de groei van sommige vissen op het hoge rantsoen overtreffen (figuur 2een lage voedselinname: −6,00 tot 110,57 mg dag −1 hoge voedselinname: 68,86-394,43 mg dag −1). Deze individuele variatie in groeisnelheid werd gedeeltelijk verklaard door verschillen in mitochondriale efficiëntie van de lever, hoewel het effect afhing van de voedselinname (lever-ATP/O volgens interactietabel voor voedselbehandeling 2). De specifieke groeisnelheid van vissen die hoge rantsoenen kregen, was sterk en positief gekoppeld aan de ATP/O-verhouding in hun levermitochondriën (t41 = 4.46, P < 0,001 figuur 2een), terwijl de trend niet significant was wanneer de voedselinname laag was (t41 = 0.33, P = 0,745). Ongeacht de voedselinname was de specifieke groeisnelheid van een vis sterk maar negatief gekoppeld aan de Ks in zijn spier na controle op lever-ATP/O (tabel 2). Specifieke groeisnelheden onder beide rantsoenen waren niet gerelateerd aan de ATP/O-verhouding in spiermitochondriën of aan de Ks in de lever (tabel 2).

Figuur 2. Relaties tussen indices van groeiprestaties en mitochondriale efficiëntie (ATP/O-ratio) bij jonge beekforel bij lage versus hoge voedselniveaus. (een) Specifieke groeisnelheid in relatie tot lever ATP/O ratio, en (B) groei-efficiëntie in relatie tot de ATP/O-verhouding van de lever. Doorlopende lijnen laten significante effecten zien. N = 29–30 vissen per voerniveau. Zie tabel 2 voor statistische analyses. (een) Uitgezet zijn gedeeltelijke residuen van de specifieke groeisnelheid voor vissen bij een hoog voedselrantsoen, geëvalueerd bij gemiddelde initiële lichaamsmassa = 9,59 g. (B) Uitgezet zijn gedeeltelijke residuen van groei-efficiëntie geëvalueerd bij gemiddelde initiële lichaamsmassa = 9,02 mg.

Tabel 2. Resultaten van lineaire gemengde modelanalyses van indices van groeiprestaties bij individuele beekforellen als functie van hun initiële massa, hun lever- en spiermitochondriale dichtheid (COX-activiteit), voedselinname, lever- en spiermitochondriale efficiëntie (ATP/O-verhouding ) en fractionele snelheden van eiwitsynthese (Ks). (Verwerkingsbatch werd opgenomen als een willekeurig effect om te controleren voor de volgorde waarin vissen werden verwerkt. Niet-significante termen werden uitgesloten van de uiteindelijke analyse. Vet geeft significante resultaten aan.)

a Voedselinname: vaste factor op twee niveaus (lage en hoge voedselinname).

b Volledig model: specifieke groeisnelheid = lever-COX-activiteit + spier-COX-activiteit + initiële lichaamsmassa + voedselinname + lever ATP/O-ratio + spier-ATP/O-ratio + lever Ks + spier Ks + voedselinname × lever-COX-activiteit + voedselinname × spier-COX-activiteit + voedselinname × initiële lichaamsmassa + voedselinname × lever ATP/O-ratio + voedselinname × spier-ATP/O-ratio + voedselinname × lever Ks + voedselinname × spier Ks.

c Volledig model: groei-efficiëntie = lever-COX-activiteit + spier-COX-activiteit + initiële lichaamsmassa + voedselinname + lever ATP/O-ratio + spier-ATP/O-ratio + lever Ks + spier Ks + voedselinname × lever-COX-activiteit + voedselinname × spier-COX-activiteit + voedselinname × initiële lichaamsmassa + voedselinname × lever ATP/O-ratio + voedselinname × spier-ATP/O-ratio + voedselinname × lever Ks + voedselinname × spier Ks.

d Volledig model: specifieke eiwittoename = lever-COX-activiteit + spier-COX-activiteit + initiële eiwitmassa + voedselinname + lever ATP/O-ratio + spier-ATP/O-ratio + lever Ks + spier Ks + voedselinname × lever-COX-activiteit + voedselinname × spier-COX-activiteit + voedselinname × initiële eiwitmassa + voedselinname × lever ATP/O-ratio + voedselinname × spier-ATP/O-ratio + voedselinname × lever Ks + voedselinname × spier Ks.

De groei-efficiëntie varieerde tussen individuen van -0,13 tot 2,23 toename in lichaamsgewicht per massa gegeten voedsel, maar verschilde niet tussen vis met weinig en veel voedsel (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S1). Ongeacht hun voedselinname hadden individuen met de hogere ATP/O-ratio in de lever de hoogste groei-efficiëntie (tabel 2, figuur 2B).

De snelheid van eiwittoename van de forel verschilde ook aanzienlijk tussen individuen, variërend van -1,98 tot 17,74 mg dag -1 voor vissen die het lage rantsoen eten en van -0,21 tot 60,79 mg dag -1 voor vissen op het hoge rantsoen. Personen met een hogere ATP/O-ratio in hun levermitochondriën en een lagere Ks in hun spier hadden een snellere specifieke toename in eiwitmassa (tabel 2). De specifieke snelheid van eiwittoename was niet gerelateerd aan de ATP/O-verhouding in de spiermitochondriën, noch aan Ks in de lever (tabel 2).

4. Discussie

Hoewel de algemene trend was dat de groeiprestaties toenamen wanneer de voedselinname hoger was, vertoonden individuen duidelijk verschillende groeiprestaties, zelfs bij een identieke voedselinname. Deze variatie in groei was gerelateerd aan de mitochondriale functie: individuen die efficiënter waren in het produceren van ATP in hun lever-mitochondriën groeiden sneller, efficiënter en accumuleerden meer eiwitten dan die individuen met minder efficiënte mitochondriën. Personen die een hogere mitochondriale efficiëntie van de lever hadden bij hoge voedselniveaus, hadden een snellere eiwitsynthese in hun spieren. Deze verschillen in eiwitsynthese hadden echter een effect op de groeiprestaties in de tegenovergestelde richting van onze aanvankelijke voorspelling dat 'eiwitsynthese de groei bevordert'. Samenvattend laat ons onderzoek voor het eerst zien, voor zover wij weten, dat onder omstandigheden van vaste voedselinname, de mitochondriale efficiëntie van een individueel dier kan bepalen of het snel of langzaam groeit.

Individuele variatie in groeiprestaties is waarschijnlijk een complex, integrerend kenmerk dat wordt beïnvloed door verschillende fysiologische en gedragskenmerken. Omdat individuele verschillen in groeisnelheid samenhangen met gedrag dat de voedingssnelheid verhoogt [33], kunnen alleen studies van dieren met gecontroleerde voedselinname licht werpen op de fysiologische oorzaken van groeiverschillen. De voedselinname in ons experiment was gestandaardiseerd, waaruit bleek dat de groei van vissen onder hetzelfde rantsoen meer dan driemaal tussen individuen kon variëren. Als gevolg hiervan groeiden sommige vissen op de behandeling met een laag rantsoen eigenlijk sneller dan anderen op de behandeling met een hoog rantsoen, die drie keer zoveel voedsel consumeerden. Hoewel eerder is aangetoond dat verhoogde mitochondriale efficiëntie fitnessgerelateerde eigenschappen bevordert (fysieke prestaties [34], groeiprestaties [9,21-23,35], reproductieve output [36] en veroudering [9,14,36,37] ), laten we hier zien dat deze relatie zelfs kan optreden wanneer dieren vergelijkbare snelheden van voedselinname ervaren. De mitochondriale efficiëntie varieert niet alleen tussen individuen, maar is ook een flexibele eigenschap die kan veranderen als reactie op omgevingsomstandigheden [38,39] en levensfase [34,40]. Een hogere mitochondriale efficiëntie kan ook kosten met zich meebrengen, omdat mitochondriën een belangrijke producent zijn van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en mitochondriale efficiëntie positief gerelateerd kan zijn aan ROS-productie [17,37]. Wanneer de vorming van ROS in een organisme het vermogen van zijn antioxidantverdedigings- en reparatiemechanismen om de effecten ervan te bestrijden overschrijdt, kan er een accumulatie van oxidatieve schade zijn [41]. ROS zijn voorgesteld als een belangrijke factor die ten grondslag ligt aan de veroudering van cellen en het hele organisme [41] en daarom een ​​potentiële kostenpost die verband houdt met snelle groei [42,43]. Ondanks deze kosten kan natuurlijke selectie in sommige contexten de voorkeur geven aan fenotypes met een relatief hoge mitochondriale efficiëntie (omdat dit kan leiden tot snellere groei, grotere lichaamsgrootte op volwassen leeftijd, minimaal sterfterisico en hoger aantal eieren), terwijl in andere contexten een lagere mitochondriale efficiëntie en verminderde ROS-productie kunnen gunstig zijn (bijvoorbeeld onder omstandigheden van ad libitum voedselbeschikbaarheid) [7,17,37,44]. Deze hypothese is in overeenstemming met verschillende recente onderzoeken die suggereren dat variatie in mitochondriale functie een belangrijk doelwit is van natuurlijke selectie [45,46].

Onze bevindingen dat vissen met een hoge lever-mitochondriale efficiëntie een hoge eiwitsynthese in hun spieren en snellere groei hadden, komen overeen met onze voorspellingen dat een hogere efficiëntie bij het omzetten van voedsel in ATP kan leiden tot een verhoogde toewijzing aan energetisch kostbare processen zoals eiwitsynthese en groei . In tegenstelling tot de verwachtingen, was de snelheid van eiwitsynthese in witte spieren negatief gecorreleerd met groeiprestaties van individuen die het best vertoonden lagere spiereiwitsynthese voor een gegeven lever mitochondriale efficiëntie. Een verklaring voor deze discrepantie zou kunnen liggen in het feit dat de snelheid van eiwitsynthese weefselspecifiek is [47] en dat de correlatie van de eiwitsynthesesnelheden over verschillende weefsels in hetzelfde individu slecht kan zijn (zoals aangetoond door deze studie), en dus de reeks weefsels die in onze studie zijn gemeten, is mogelijk niet representatief voor de algehele snelheid van eiwitsynthese in het hele dier, omdat dit zou worden gedefinieerd als de som van de individuele weefselspecifieke eiwitsynthesesnelheden [48]. Er zijn echter positieve relaties tussen eiwitsynthese in de groei van witte spieren en lichaamsgroei gemeld bij andere soorten [26,47]. Een alternatieve verklaring is gebaseerd op het feit dat lichaamseiwitten voortdurend worden afgebroken en gesynthetiseerd, en dat eiwitsynthese dus alleen tot groei zal leiden als de synthesesnelheid groter is dan de afbraaksnelheid. individuele vissen worden meer verklaard door variatie in snelheden van eiwitafbraak dan snelheden van eiwitsynthese [26]. Hoewel metingen van eiwitafbraaksnelheden buiten het bestek van deze studie vielen, is het misschien alleen mogelijk om waargenomen patronen van eiwitgroei te verklaren als alle aspecten van eiwitmetabolisme (synthese en afbraak) in overweging worden genomen [49].

Concluderend heeft onze studie een duidelijk positief verband aangetoond tussen de efficiëntie waarmee levermitochondriën energiesubstraten omzetten in ATP en de groeiprestaties van hele dieren. Toekomstig onderzoek moet zich richten op het kwantificeren van de veronderstelde kosten van zeer efficiënte mitochondriën. Informatie over de oorzaken en gevolgen van variatie in mitochondriale efficiëntie zou de voorspelling mogelijk maken van de gevolgen voor de prestaties van hele dieren van variatie in mitochondriale functie, zodat cellulaire processen worden gekoppeld aan de fitheid van het organisme.

Ethiek

Alle procedures werden uitgevoerd onder de jurisdictie van een UK Home Office-projectlicentie (PPL 60/4292).


RESULTATEN EN DISCUSSIE

Shh-pathway-activiteit verhoogt de mitochondriale massa

We vonden eerder dat blootstelling aan een bioactieve vorm van Shh (ShhN Chen et al., 2002a) of de Shh-agonist SAG (Chen et al., 2002b) gedurende 24-48 uur activeert de Shh-signaleringsroute in gekweekte hippocampale neuronen (Yao et al., 2015). Een van de beoordelingen voor cellulaire Shh-activiteit is het expressieniveau van Gli1-eiwit gemeten door immunoblot (Ingham en McMahon, 2001 Varjosalo en Taipale, 2008 Yao et al., 2015). Om te bepalen hoe snel neuronen zouden reageren op ShhN, hebben we neuronen geïncubeerd met ShhN gedurende verschillende perioden van 1 tot 24 uur, de neuronen geoogst en het Gli1-eiwitexpressieniveau geanalyseerd. We ontdekten dat het Gli1-eiwitniveau in de hippocampale neuronen toenam na slechts 1 uur blootstelling aan ShhN, en de toename ging door met de tijd op een lineaire manier (Figuur 1A). Omdat 24 uur ShhN-incubatie de route sterk activeerde, hebben we dit protocol gebruikt voor de meeste experimenten die in deze studie zijn beschreven, tenzij anders vermeld.

FIGUUR 1: Shh verhoogt de mitochondriale massa in hippocampale neuronen. (A) Gekweekte hippocampale neuronen werden geïncubeerd met ShhN (10%) gedurende verschillende duur van 1 tot 24 uur. De overvloed van het Shh-transcriptiedoel, Gli1, werd gemeten in de neuronale lysaten door immunoblot met behulp van een Gli1-specifiek antilichaam. Dezelfde Gli1-blot (film) werd gedurende 5 of 60 seconden belicht zoals aangegeven. (B) Representatieve immunoblot die COXIV-eiwitniveaus toont in onbehandelde controle- of ShhN- of SAG-behandelde neuronen. SAG werd gebruikt bij 400 nM. (C) Kwantificering van B. Band-intensiteit voor COXIV en β-actine werd gemeten met ImageJ. β-Actine-niveaus werden gebruikt als een normalisatiecontrole. Waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM vier experimenten *P < 0,05. (D) Controle of ShhN-behandelde neuronen werden gefixeerd, gepermeabiliseerd en co-immunolabeled met een antilichaam tegen het mitochondriale enzym ATP-synthase (groen) en een antilichaam tegen een neuronale marker, klasse III β-tubuline (Tuj rood). Neuronen werden gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie.Representatieve ATP-synthasebeelden tonen langwerpige mitochondriën in met ShhN behandelde neuronen. Schaalbalken, 25 m (boven), 10 m (onder). (E) Overvloed en morfologie van mitochondriën werden gevisualiseerd in controle- of ShhN-behandelde neuronen, gecoincubeerd met een mitochondriale kleurstof, MitoTracker Green, en een membraanmarkerkleurstof, BODIPY (rood). Representatieve live-celbeelden tonen langere mitochondriën in met ShhN behandelde neuronen. Schaalbalken, 100 m (boven), 10 m (onder). (F) Kwantificering van mitochondriale morfologie en overvloed (beschreven in Materialen en methodes). Meer dan 80.000 MitoTracker Green-gelabelde mitochondriën uit vier experimenten werden gemeten. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. ***P < 0,001.

In een eerste overzicht van met ShhN behandelde neuronen, merkten we verhoogde niveaus van mRNA's op voor veel mitochondria-gerelateerde moleculen (aanvullende tabel S1), waaronder cytochroom C-oxidasecomplex IV (COXIV), een binnenste mitochondriaal membraaneiwit (Vogel et al., 2006 ongeveer tweevoudige toename van drie biologische replica's door microarray). Daarom hebben we het COXIV-eiwitniveau in ShhN-gestimuleerde neuronen gemeten door immunoblot, met behulp van β-actine-niveaus als normalisatiecontrole. In met ShhN behandelde neuronen was het COXIV-eiwitniveau merkbaar hoger dan controle-neuronen (Figuur 1, B en C). Evenzo verhoogde de Shh-agonist SAG ook het COXIV-niveau aanzienlijk (Figuur 1, B en C).

Vervolgens onderzochten we het mitochondriale enzym ATP-synthase door de neuronen co-immunolabeling te geven met een antilichaam tegen ATP-synthase en een antilichaam tegen een neuronale marker, klasse III -tubuline (Tuj1). Hoewel ATP-synthase-gelabelde mitochondriën werden waargenomen in zowel controle- als ShhN-behandelde neuronen, waren de mitochondriën merkbaar langer in ShhN-behandelde neuronen (Figuur 1D). Door mitochondriën te monitoren met MitoTracker Green, die mitochondriale binnenmembranen labelt (Mitra en Lippincott-Schwartz, 2010), zagen we opnieuw een toename van de populatie van lange buisvormige mitochondriën in de met ShhN behandelde neuronen (Figuur 1E). We gebruikten een aangepaste analysestrategie om de waargenomen veranderingen in mitochondriale morfologie en abundantie te kwantificeren (beschreven in Materialen en methodes). Metingen van >80.000 MitoTracker Green-gelabelde mitochondriën onthulden dat mitochondriën in met ShhN behandelde neuronen ∼2,5 keer langer waren dan mitochondriën in de onbehandelde controle-neuronen (Figuur 1F). Bovendien hebben we een grotere dichtheid van mitochondriën waargenomen in de met ShhN behandelde neuronen (Figuur 1F). Gezamenlijk suggereren deze bevindingen dat Shh-pathway-activering in hippocampale neuronen de algehele mitochondriale massa verhoogt door mitochondriale verlenging te bevorderen en het mitochondriale aantal te verhogen.

Shh-pathway-activiteit vermindert mitochondriale splijting

We zien dat Shh-behandeling resulteert in zowel een toename van de lengte van de individuele mitochondriën als meer totale mitochondriën. Hoewel deze twee effecten samen zouden kunnen bijdragen aan een verhoogde functie van de mitochondriën (later onderzocht), kan het mechanisme voor het genereren van deze effecten afzonderlijk worden beschouwd. De lengte van de mitochondriën wordt gereguleerd door de balans tussen splijting en fusie van mitochondriën. De waargenomen toename van de lengte van de mitochondriën kan worden veroorzaakt door verhoogde niveaus van de fusiebevorderende eiwitten mitofusin1 (Mfn1), mitofusin2 (Mfn2) en optische atrofie 1 (Opa1 Scott en Youle, 2010 Westermann, 2010). Om te onderzoeken of Shh-signalering de niveaus van de fusiebevorderende eiwitten verandert, hebben we Western-blot-analyse van neuronale lysaten uitgevoerd. We hebben geen veranderingen waargenomen in de niveaus van Mfn1 of Mfn2 in ShhN- of SAG-behandelde culturen (Figuur 2, A en B). We hebben ook geen significante toename van Opa1-niveaus waargenomen in met ShhN of SAG behandelde culturen (Figuur 2, C, boven en D, links).

FIGUUR 2: Shh vermindert het mitochondriale splijtingseiwit Drp1. (A) Gekweekte neuronen werden 24 uur geïncubeerd met ShhN (10%) of SAG (400 nM) en neuronale lysaten werden verzameld. Elk monster werd verdeeld in drie gelijke sets (∼20 μg per set) en geanalyseerd in drie immunoblots met behulp van een antilichaam tegen mitofusin1 (Mfn1) of mitofusin2 (Mfn2) of β-actine. (B) Kwantificering van A. Band-intensiteit werd gemeten met ImageJ. Voor elk monster werd de intensiteit van de Mfn-band genormaliseerd naar β-actine. De gepresenteerde gegevens zijn genormaliseerd naar de controlemonsters. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM drie experimenten. (C) Zoals in A werden cellysaten van controle- of ShhN- of SAG-behandelde neuronen geanalyseerd door immunoblots. Parallel lopende monsters werden onderzocht op Opa1, Drp1, Drp1 serine 616-gefosforyleerde vorm (p616Drp1) of β-actine. (D) Kwantificering van C. De verhouding van elke band ten opzichte van β-actine werd genormaliseerd ten opzichte van de waarde van de controlemonsters. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM ***P < 0,001, zes experimenten. De verhoogde niveaus van Opa1 zijn niet statistisch significant (0,99 ± 0,02 in controle versus 1,11 ± 0,07 in met ShhN behandelde neuronen, P = 0,16 of vs. 1,12 ± 0,02 in met SAG behandelde neuronen, P = 0,06). (E) Om de overvloed aan eiwitten geassocieerd met mitochondriën te beoordelen, werden mitochondriën geïsoleerd (beschreven in .). Materialen en methodes). Immunoblot van gezuiverde mitochondriën toont verminderde niveaus van Drp1 en p616Drp1 geassocieerd met mitochondriën in met ShhN behandelde neuronen. PonS, Ponceau S-gekleurde vlek die overeenkomt met het Drp1-gebied. (F) Kwantificering van E. De intensiteit van de banden in de ShhN-monsters wordt weergegeven als een percentage van de intensiteit van de banden in controlecellen. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM. **P < 0,01, *P < 0,05 vier experimenten voor Drp1 en vijf voor p616Drp1. (G) Kwantificering van de snelheid van mitochondriale splijtingsgebeurtenissen in ShhN versus controlecellen (gemiddelde ± SEM). Mitochondriën in controle of met ShhN behandelde neuronen werden gelabeld met MitoTracker Green en afgebeeld met intervallen van 10 s gedurende 10 minuten met behulp van een confocale microscoop met draaiende schijf. Splijtingsgebeurtenissen werden visueel geïdentificeerd tijdens de beoordeling van de datasets na de acquisitie. De grafiek geeft het gemiddelde aantal mitochondriale splijtingsgebeurtenissen elke 10 min per cel weer. **P < 0,01.

We onderzochten vervolgens het mitochondriale splijtingseiwit dynamin-achtige GTPase Drp1. Fosforylering van Drp op serine 616 verhoogt de splijtingsactiviteit van het eiwit (Taguchi et al., 2007 Chang en Blackstone, 2010). Verminderde Drp1-activiteit zou kunnen bijdragen aan de waargenomen toename in mitochondriale lengte, dus hebben we de niveaus van totaal Drp1 en zijn serine 616-gefosforyleerde vorm (phos616 Drp1 of p616Drp1) gekwantificeerd. Hoewel we geen consistente verandering in totale Drp1 zagen (Figuur 2, C en D, midden), was het niveau van phos616Drp1 significant verlaagd in ShhN- of SAG-behandelde neuronen (Figuur 2, C en D, rechts). Omdat Drp1 wordt gerekruteerd naar splijtingsplaatsen op het mitochondriale oppervlak (Scott en Youle, Westermann, 2010), hebben we mitochondriën gezuiverd van de met ShhN behandelde neuronen en de onbehandelde controleneuronen en hebben we Drp1 onderzocht die is geassocieerd met mitochondriën. Immunoblot-analyse onthulde een significante vermindering van mitochondria-geassocieerde Drp1 en phos616 Drp1 in de met ShhN behandelde neuronen (Figuur 2, E en F). Deze resultaten suggereerden dat Shh-signalering de mitochondriale lengte verandert door splijtingsgebeurtenissen te verminderen door verminderde Drp1-activiteit.

We hebben deze hypothese getest met behulp van live confocale fluorescentiebeeldvorming van mitochondriën in controle versus ShhN-behandelde neuronen en waargenomen dat ShhN-behandeling een significante vermindering van het aantal mitochondriale splijtingsgebeurtenissen in ShhN-neuronen veroorzaakte (0,33 splijtingsgebeurtenis elke 10 min per cel, N = 10 cellen) vergeleken met de controle (0,86 splijtingsgebeurtenis elke 10 min per cel, N = 10 cellen P < 0,005 Afbeelding 2G). Al met al ondersteunen onze resultaten de hypothese dat Shh mitochondriale verlenging in hippocampale neuronen induceert, gedeeltelijk door phos616 Drp1-niveaus en -activiteit te verminderen, waardoor de algehele snelheid van mitochondriale splijting wordt verlaagd.

Naast langere mitochondriën, zorgt Shh-stimulatie ervoor dat meer dan twee keer zoveel mitochondriën zich ophopen in neuronen. Alleen al zou men verwachten dat de waargenomen afname in splijtingsgebeurtenissen een afname van de mitochondriënpopulatie zou veroorzaken. Het is echter bekend dat verlenging van mitochondriën de afbraak van mitochondriën door mitofagie vermindert (Rambold et al., 2011). Hoewel Shh sommige vormen van autofagie stimuleert in hippocampale neuronen (Petralia et al., 2013), beschermt de toegenomen lengte van de mitochondriën als gevolg van verminderde splijting na Shh-behandeling mitochondriën waarschijnlijk tegen afbraak (Gomes et al., 2011).

Opkomend bewijs suggereert een functioneel verband tussen Drp1, actinefilamentdynamiek en actineregulerende eiwitten (Korobova et al., 2013, 2014 Hatch et al., 2014 Ji et al., 2015 Landhuis et al., 2015), waaronder cofilin (Li et al., 2014 Prudent en McBride, 2016). Neerwaartse regulatie van cofiline beïnvloedt Drp1-gemedieerde mitochondriale splijting, wat leidt tot de verlenging van mitochondriën (Li et al., 2014). Omdat Shh-pathway-activiteit in de hippocampale neuronen cofiline effectief neerwaarts reguleert (Yao et al., 2015), is het aannemelijk dat de activiteit van de Shh-signaleringsroute de mitochondriën zou kunnen beïnvloeden door zowel Drp1 als cofiline te reguleren.

Shh-pathway-activiteit verandert het mitochondriale ultrastructurele uiterlijk

We onderzochten vervolgens de ultrastructuur van Shh-gestimuleerde mitochondriën met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Gezien grote experimentele variabelen en onvoldoende resolutie van interne structuren in mitochondriën van deze gekweekte neuronen, hebben we ons gericht op het vergelijken van het mitochondriale algehele uiterlijk in de met ShhN behandelde neuronen met de onbehandelde controle-neuronen. Het merkbare verschil tussen de twee groepen was de over het algemeen donkerdere mitochondriën in de met ShhN behandelde neuronen (Figuur 3, A en B en aanvullende figuren S1 en S2). Om objectieve vergelijkingen te maken, hebben we de intensiteit van mitochondriën gekwantificeerd ten opzichte van de intensiteit van het cytoplasma van hetzelfde neuron. Metingen van 984 mitochondriën bevestigden dat de gemiddelde intensiteit van mitochondriën in met ShhN behandelde neuronen significant hoger was dan die van mitochondriën in onbehandelde controle-neuronen (verhouding van mitochondriale intensiteit tot cytoplasmatische intensiteit voor 2-d ShhN-behandeling: ShhN 32,0 ± 0,85 vs. controle 23,8 ± 1,14, P < 0,001 N ≥ 519 mitochondriën, kweken van drie ratten 3-d ShhN-behandeling: ShhN 39,6 ± 1,34 vs. controle 26,6 ± 0,91, P < 0,001 N ≥ 465 mitochondriënculturen van drie ratten Figuur 3C).

FIGUUR 3: Shh verandert de mitochondriale ultrastructuur. (A, B) Hippocampale neuronen werden gedurende 2 of 3 d met ShhN behandeld en verwerkt voor elektronenmicroscopie. Representatieve elektronenmicrofoto's (vijf voorbeelden voor elke groep) tonen het bereik van mitochondriale structuren en dichtheid in controle en ShhN-behandelde neuronen. Veel merkbaar donkerdere mitochondriën worden gezien in de met ShhN behandelde neuronen. De meeste microfoto's tonen synaptische gebieden waar axonen met presynaptische uiteinden (pre) en dendrieten gemakkelijk kunnen worden onderscheiden. Schaalbalk, 500 nm (linksonder en bovenste drie), 1 m (anders). (C) Mitochondriale intensiteit werd gemeten met ImageJ. In elke elektronenmicrofoto werd een willekeurig gebied over het cytoplasma (mitochondria-vrij) geselecteerd en de intensiteit (gemiddelde grijswaarde) werd gemeten. Hetzelfde geselecteerde gebied werd vervolgens over een mitochondrion verplaatst en de intensiteit werd gemeten. Voor elke microfoto werden drie willekeurig geselecteerde mitochondriën gemeten en de verhouding van elke mitochondriale intensiteit tot de cytoplasmatische intensiteit werd berekend (gemiddelde ± SEM ***P < 0,001, ≥519 mitochondriën voor 2-d behandeling en ≥ 465 voor 3-d behandeling). (D) Mitochondriën werden gezuiverd uit controle- en ShhN-behandelde neuronen en de opgeloste eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE. Immunoblot-analyse laat zien dat het binnenmembraaneiwit COXIV toeneemt na behandeling met ShhN, maar het niveau van het buitenmembraaneiwit VDAC is relatief onveranderd. (E) Kwantificering van D. De intensiteiten van de banden werden gekwantificeerd met behulp van ImageJ. De intensiteit van de banden in de ShhN-monsters wordt genormaliseerd naar de waarde in de controlemonsters. *P < 0,05, vier experimenten.

Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt in het begrijpen van de morfologie en structuur van mitochondriën. De biologische relevantie van mitochondriale elektronendichtheid gezien onder elektronenmicroscopie wordt echter niet begrepen. In een vroege elektronenmicroscopische studie van rattenlevercellen werden mitochondriën lichter of minder elektronendicht na uithongering en vervolgens opnieuw voeden (Rouiller en Bernhard, 1956). In een meer recente studie van embryonale fibroblasten van muizen waren de mitochondriën donkerder na uithongering onder sommige experimentele omstandigheden (Gomes et al., 2011). Deze waarnemingen impliceren, althans in niet-neuronale cellen, een correlatie tussen mitochondriale elektronendichtheid en hun activiteit. In het geval van neuronale cellen lijken de verschillen in mitochondriale elektronendichtheid slechts incidenteel te worden waargenomen. In een elektronenmicroscopische karakterisering van gekweekte hippocampale neuronen - het neuronale type dat in dit werk wordt bestudeerd, leken mitochondriën donkerder in axonen dan in dendrieten (Bartlett en Banker, 1984), hoewel het verschil niet expliciet werd onderzocht. Een soortgelijk verschil werd ook gezien in de gehoorzenuwen, waarvoor presynaptische mitochondriën merkbaar donkerder leken (Redd et al., 2000).

Men zou kunnen speculeren dat donkere mitochondriën wijzen op grotere hoeveelheden mitochondriale eiwitten, met name die op de binnenmembranen van mitochondriën (Gomes et al., 2011). Omdat het COXIV-eiwit zich in de mitochondriale binnenmembranen (Vogel et al., 2006) en het niveau ervan is aanzienlijk verhoogd in de totale cellysaten van met ShhN behandelde neuronen (Figuur 1, B en C), vergeleken we het COXIV-eiwitniveau in mitochondriën die zijn gezuiverd van met ShhN behandelde neuronen met die van controleneuronen. Immunoblot-analyse onthulde dat mitochondriale COXIV ongeveer viermaal hoger was in met ShhN behandelde dan in controle-neuronen (4,27 ± 0,98 in met ShhN behandelde vs. 0,99 ± 0,03 in controle, P = 0.045, N = 4 Figuur 3, D en E).

Shh-pathway-activiteit verhoogt de mitochondriale oxidatieve fosforyleringsactiviteit

Vervolgens onderzochten we de mitochondriale functie met behulp van twee benaderingen. Eerst hebben we de neuronen gecocubeerd met twee kleurstoffen: CMXRos, een rode fluorescerende kleurstof die zich ophoopt in mitochondriale membranen op basis van hun membraanpotentiaal, en MitoTracker Green, dat mitochondriën labelt ongeacht hun membraanpotentieel (Mitra en Lippincott-Schwartz, 2010). We gebruikten de verhouding van CMXRos tot MitoTracker Green om het mitochondriale membraanpotentieel te meten in de met ShhN behandelde en de onbehandelde controle-neuronen. We ontdekten dat met ShhN behandelde neuronen aanzienlijk hogere (∼10-voudig hogere) CMXRos:MitoTracker Green-verhoudingen hebben dan controle-neuronen (P < 0,001 Afbeelding 4, A en B). Ten tweede hebben we het cellulaire zuurstofverbruik (OCR) gemeten met behulp van het Seahorse-systeem (Ferrick et al., 2008) en vergeleken mitochondriale ademhaling en ATP-gekoppelde ademhaling tussen ShhN-behandelde en controle-neuronen. De met ShhN behandelde neuronen hebben significant hogere basale en maximale respiratoire activiteiten (Figuur 4, C en D), evenals verhoogde niveaus van ATP-gekoppelde ademhaling (Figuur 4E). Deze bevindingen suggereren dat Shh-signaleringsactiviteit hippocampale neuronen verschuift van een lagere energieproducerende, anaërobe metabole toestand die voornamelijk afhankelijk is van glycolyse naar een hogere energieproducerende, aërobe toestand die ook oxidatieve fosforylering gebruikt voor ATP-productie (Wu et al., 2007).

FIGUUR 4: Shh verhoogt de mitochondriale oxidatieve fosforyleringsactiviteit. (A) Controle of ShhN-behandelde neuronen werden gecoincubeerd met CMXRos en MitoTracker Green. Representatieve afbeeldingen tonen een warmtekaart van de verhouding van CMXRos tot MitoTracker Green in live, controle en ShhN-behandelde neuronen. Onder, vergrotingen van de bovenaan aangegeven gebieden. Schaalbalken, 100 m (boven), 20 m (onder). (B) Kwantificering van de verhouding van CMXRos tot MitoTracker Green in controle vs. ShhN-behandelde neuronen (zes experimenten, met ∼10 cellen in elk experiment gemiddelde ± SEM **P < 0,01). (C) OCR van controle- en ShhN-behandelde neuronen (beschreven in Materialen en methodes). (D) Gemiddelde waarden van basale en maximale ademhalingscapaciteit in controle- en ShhN-behandelde neuronen. (E) Hogere ATP-gekoppelde ademhaling in met ShhN behandelde neuronen. Voor C–E, zes experimenten. Gemiddelde ± SEM. **P < 0,01, *P < 0,05.

Shh-pathway-activiteit beschermt neuronen tegen stress

Ten slotte onderzochten we het functionele gevolg van de waargenomen Shh-versterkte mitochondriale activiteit in de hippocampale neuronen door het effect van verschillende toxines te onderzoeken. De neuronen werden eerst 24 uur behandeld met de Shh-agonist SAG en vervolgens nog eens 24 uur blootgesteld aan een neurotoxische stressor. De levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten met behulp van een colorimetrische bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen. De neuronen werden gedurende 24 uur blootgesteld aan de neurotoxinen in plaats van een kortere periode om chronische neurologische stress of ziekte na te bootsen in plaats van een acute belediging.

De gebruikte neurotoxische middelen waren amyloïde β-peptide (Aβ-aminozuren 1-42), waterstofperoxide, glutamaat en rotenon. Aβ werd gebruikt om de omstandigheden na te bootsen die neuronen ervaren als Aβ aggregeert en zich ophoopt in de hersenen bij de ziekte van Alzheimer. Aggregeren van Aβ genereert reactieve zuurstofsoorten die membraanlipideperoxidatie, verminderde calciumbehandeling en mitochondriale disfunctie in neuronen veroorzaken (Mattson et al., 1992 Keller et al., 1997 Mark et al., 1997 Prasansuklab en Tencomnao, 2013). Waterstofperoxidebehandeling werd gebruikt om cellulaire oxidatieve stress na te bootsen, terwijl glutamaat excitotoxiciteit induceert en rotenon de mitochondriale functie vermindert door complex I van de mitochondriale elektronentransportketen te remmen. We ontdekten dat in de neuronen zonder SAG-behandeling elk toxine de neuronale levensvatbaarheid aanzienlijk in gevaar bracht: 39,3% reductie met 7,5 M Aβ, 30,0% reductie met 15 µM waterstofperoxide, 29% reductie met 50 µM glutamaatbehandeling en 19,8% reductie met 75 nM rotenon (Figuur 5, A en B). Voorblootstelling aan en gelijktijdige behandeling met SAG verminderde significant de aangetaste levensvatbaarheid van de cellen veroorzaakt door alle geteste toxines: 23,2, 17,4, 14 en 12,9% voor neuronen die werden behandeld met respectievelijk Aβ, waterstofperoxide, glutamaat en rotenon (Figuur 5, A en B) . Deze resultaten geven aan dat Shh-signalering neuronen, althans tot op zekere hoogte, kan beschermen tegen dood veroorzaakt door oxidatieve, excitotoxische en metabole stress.

AFBEELDING 5: Shh beschermt neuronen tegen neurotoxinen. Hippocampale neuronen werden behandeld met SAG (200 nM) op kweekdag 6 (A Aβ en H2O2 experimenten) of 7 (B-glutamaat- en rotenon-experimenten) gedurende 24 uur, gevolgd door co-incubatie met het aangegeven neurotoxine gedurende nog eens 24 uur. De levensvatbaarheid van de cellen werd vervolgens beoordeeld met behulp van een colorimetrische test (beschreven in Materialen en methodes). Gegevens zijn uitgezet als percentage levensvatbaarheid vergeleken met de onbehandelde controlecellen. Alle toxines verminderden de levensvatbaarheid van de neuronen. Behandeling met SAG verbeterde de levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk verminderd door elk toxine (**P < 0,01, *P < 0,05 ten minste drie experimenten).

In deze studie leveren we bewijs dat Shh, bekend als een ontwikkelingsmorfogeen, de mitochondriale overvloed, morfologie, functie en stressresistentie in hippocampale neuronen kan beïnvloeden. Een eerder rapport van gekweekte cerebrale corticale neuronen leverde bewijs dat Shh neuronen kan beschermen tegen metabole stress veroorzaakt door de succinaatdehydrogenaseremmer 3-nitropropionzuur (Wu et al., 2009). Het onderliggende mechanisme is echter niet onderzocht. We ontdekten dat Shh-signalering de grootte en het aantal mitochondriën verhoogt en de mitochondriale ademhaling en ATP-productie in hippocampale neuronen verbetert. Vanwege hun voortdurende elektrische activiteit (actiepotentialen) en prikkelende synaptische transmissie (gemedieerd door glutamaat), hebben neuronen een zeer hoge ATP-behoefte. Dienovereenkomstig maken verlagingen van ATP-niveaus neuronen kwetsbaar voor excitotoxiciteit, een type neuronale dood waarvan bekend is dat het optreedt bij ischemische beroerte en dat waarschijnlijk ook voorkomt bij de ziekte van Alzheimer, Parkinson en Huntington (Mattson, 2003). We ontdekten dat Shh hippocampale neuronen beschermde tegen glutamaat-geïnduceerde excitotoxiciteit en tegen dood veroorzaakt door het mitochondriale toxine rotenon en Aβ, waarvan is aangetoond dat beide de kwetsbaarheid van neuronen voor excitotoxiciteit vergroten (Mattson et al., 1992 Kanki et al., 2004). Onze bevindingen suggereren dat Shh, door de mitochondriale massa en functie te vergroten, neuronen kan beschermen tegen pathologische stressoren die neuronale disfunctie en degeneratie veroorzaken of bevorderen.

Shh-versterkte mitochondriale functie speelt mogelijk ook een rol in andere cellulaire processen in neuronen. We hebben bijvoorbeeld eerder ontdekt dat Shh-pathway-activiteit selectief de axonuitgroei van hippocampale neuronen stimuleert (Yao et al., 2015), hoewel we niet hebben vastgesteld of mitochondriën erbij betrokken waren. Andere studies toonden echter het belang van mitochondriën bij axonale groei aan (Mattson en Partin, 1999 Vaarmann et al., 2016). Daarom is het redelijk om te overwegen dat opregulatie van de mitochondriale functie door de Shh-signaleringsroute belangrijk is voor Shh-gestimuleerde axonuitgroei in hippocampale neuronen (Yao et al., 2015) en andere soorten neuronen (Charron et al., 2003 Parra en Zou, 2010 Wilson en Stoeckli, 2013).

Wat is het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de door Shh geïnduceerde mitochondriale opregulatie? AMP-geactiveerde proteïnekinase (AMPK) speelt een rol bij mitochondriale biogenese (Hardie, 2011). Hoewel onlangs werd gemeld dat activering van AMPK de activiteit van de Shh-signaalroute in tumorcellen onderdrukt (Li et al., 2015), is het onbekend of het tegenovergestelde geldt, dat wil zeggen of Shh-signalering AMPK beïnvloedt. Onze voorlopige waarnemingen geven aan dat het effect van Shh op AMPK, althans in de hippocampale neuronen, niet bestaat of verwaarloosbaar klein is (niet-gepubliceerde gegevens).

Ten slotte is het van belang op te merken dat is voorgesteld dat Shh-signalering een tegengesteld effect heeft op mitochondriën in cerebellaire granule-neuronvoorlopers (CGNP's Malhotra et al., 2016). Een onderscheid tussen CGNP's en hippocampale neuronen is dat de eerste zich vermenigvuldigen, maar de laatste gedifferentieerd en postmitotisch zijn. Of de verschillen in reactie op Shh-signalering voortkomen uit intrinsieke verschillen in celtypen, ontwikkelingsstadia of bijbehorende neurale circuits, zijn belangrijke vragen. De discrepantie tussen onze bevindingen en die van Malhotra et al. (2016) kunnen ook het gevolg zijn van verschillen in experimentele omstandigheden en ontwerp. Ze gebruikten bijvoorbeeld recombinant Shh, waarvan de bioactiviteit verwaarloosbaar leek in vergelijking met die van ShhN (supplementaire figuur S3).


Moleculaire machines

Hoe zit het met turbulente beweging in de buurt van eiwitten? Ademhalingseiwitten zijn buitengewone moleculaire machines op nanoschaal die hun conformatietoestand honderden keren per seconde kunnen veranderen. Het ATP-synthase roteert tot 400 keer per seconde [12].

Er is een interessante trend in membraan-integrale respiratoire eiwitten in metazoën waarbij veel van de hydrofobe aminozuren bij dieren met een lage stofwisseling, zoals nematoden, worden vervangen door serine- en threonineresiduen bij actievere dieren, met name vogels en zoogdieren [13]. Serine- en threonineresiduen kunnen uitgebreide netwerken van zwakke waterstofbruggen vormen tussen transmembraanhelices, wat snelle wisselingen tussen de conformationele toestanden die betrokken zijn bij protonpompen zou kunnen vergemakkelijken [14]. Ze kunnen ook helpen bij het stabiliseren van de assemblage van supercomplexen [14], waarvan Chrétien en collega's aantonen dat ze robuuster zijn bij hogere temperaturen dan individuele ademhalingscomplexen [1].


Mitochondriale structuur

Elk celorganel is uniek ontworpen om zijn functies te ondersteunen, zoals te zien is in de structuur en functies van de mitochondriën. Een mitochondrion bestaat uit twee membranen: een buitenmembraan en een binnenmembraan, beide opgebouwd uit eiwitten en andere complexe verbindingen. Omdat beide membranen verschillende eigenschappen hebben, bestaat een enkel mitochondrion uit de intermembraanruimte, de crista-ruimte en de matrix, afgezien van de twee membranen. Elk deel van het organel speelt een belangrijke rol, en de structuur van elk mitochondrion speelt een belangrijke rol bij de uitvoering hiervan.

Het buitenmembraan is de behuizing voor verschillende componenten van mitochondriën en is doorlaatbaar voor ATP, ADP of andere moleculen. Het binnenmembraan bestaat uit moleculen van het elektronentransportsysteem naast transporteiwitten en verschillende complexen. Het is minder doorlaatbaar dan het buitenmembraan. De matrix is ​​cytoplasmatisch en bestaat naast verschillende gassen en enzymen uit de DNA-moleculen. Ribosomen zijn verantwoordelijk voor het synthetiseren van eiwitten en bevinden zich samen met andere complexen in de matrix. De cristae zijn de introversies die verantwoordelijk zijn voor de toename van het oppervlak van het binnenmembraan.


Invoering

Soorten en populaties binnen soorten vertonen aanzienlijke variatie in kenmerken van de levensgeschiedenis, zoals vruchtbaarheid, succes bij het uitkomen, ontwikkelingssnelheid, groeisnelheid en grootte op volwassen leeftijd (Roff 1992). Variatie in deze eigenschappen komt echter niet in alle mogelijke combinaties in de natuur voor (Stearns 1976, 1992). In plaats daarvan is voorgesteld om langs een langzaam tot snel continuüm te gebeuren, met soorten of populaties met een lage reproductiesnelheid, langzame ontwikkeling en lange levensduur aan het ene uiteinde van het continuüm, en die met snellere reproductiesnelheden en ontwikkeling, maar korter levensduur aan de andere kant (Ricklefs en Wikelski 2002). Als zodanig heeft de levenstempo-hypothese zijn basis in het klassieke concept van "r" en "K" selectie (MacArthur en Wilson 1967 Pianka 1970). Het begrip levenstempo is uitgebreid met een verscheidenheid aan fysiologische en gedragskenmerken (Reale et al. 2010), wat wijst op het bestaan ​​van een complex syndroom dat meerdere kenmerken op verschillende niveaus van biologische organisatie koppelt aan variatie in levensgeschiedenisstrategieën. Deze waargenomen verschillen in het schijnbare levenstempo en de bijbehorende fysiologische en gedragskenmerken (Reale et al. 2010) vertegenwoordigen verschillende allocatiekeuzes tussen investeringen in reproductie, groei en overleving (Stearns 1976, 1992) als gevolg van afwegingen als gevolg van de toewijzing van beperkte middelen over verschillende functies (Stearns 1992, Zera en Harshman 2001). Het begrip levenstempo heeft geleid tot substantiële onderzoeksinspanningen en is het onderwerp geweest van meerdere recente syntheses (zie bijv. Dammhahn et al. 2018), maar de geldigheid en onderliggende mechanistische basis ervan zijn nog steeds onderwerp van hevig debat (Royauté et al. 2018 ). Het doel van deze review is om dit concept te onderzoeken in de context van thermische fysiologie, en specifiek om de mogelijke rol van variatie in mitochondriale functie te onderzoeken als een mechanisme dat ten grondslag ligt aan variatie in het levenstempo als een aanpassing aan de omgevingstemperatuur.

Aangenomen wordt dat variatie in stofwisselingssnelheid een belangrijke rol speelt als oorzaak of gevolg van variatie in het levenstempo ( Ricklefs en Wikelski 2002 Wiersma et al. 2007 Williams et al. 2010 Glazier 2015), als individuen aan het snelle einde van het levenstempo-spectrum heeft doorgaans een hogere ruststofwisseling, zelfs nadat rekening is gehouden met verschillen in lichaamsgrootte (Ricklefs en Wikelski 2002). Inderdaad, in een elegante studie met Trinidadiaanse guppy's, Auer et al. (2018) toonden aan dat het standaardmetabolisme een sterke positieve correlatie had met een reeks eigenschappen die verband houden met het levenstempo (zoals mannelijke leeftijd en massa op volwassen leeftijd, vrouwelijke leeftijd en massa bij de eerste bevalling, interval tussen de nesten en reproductieve toewijzing ) in natuurlijke populaties blootgesteld aan verschillende predatiedruk, en dat evolutionaire verandering in het levenstempo na experimentele transplantatie naar locaties met verschillende predatiedruk gepaard ging met veranderingen in de stofwisseling. Deze studies tonen het potentieel aan voor een nauw verband tussen variatie in stofwisseling en het levenstempo, en ze benadrukken het evolutionaire belang van deze associaties. De onderliggende fysiologische en biochemische mechanismen die variatie in de stofwisseling veroorzaken, en dus mogelijk in het levenstempo, zijn echter niet volledig bekend en kunnen processen omvatten die op vele niveaus van biologische organisatie werken (Versteegh et al. 2012 Konarzewski en Książek 2013 Wone et al. 2013 Pettersen et al. 2018).

Een cellulair proces dat een sleutelrol zou kunnen spelen bij het beïnvloeden van het levenstempo is mitochondriale oxidatieve fosforylering (Fig. 1). Mitochondriën zijn de belangrijkste bron van ATP-generatie in dierlijke cellen en zijn dus nauw betrokken bij het metabolisme van voedingsstoffen en energie. Aërobe ATP-productie in het mitochondrion vindt plaats via oxidatieve fosforylering, die wordt bereikt door de eiwitten van het mitochondriale elektronentransportsysteem (ETS) en het ATP-synthase (complex V), een reeks membraanoverspannende of membraan-geassocieerde eiwitten die zich op het binnenste mitochondriale membraan. De eiwitten van het ETS accepteren elektronen van NADH en FADH2 bij respectievelijk complexen I en II van het ETS. Deze elektronen worden vervolgens door het ETS getransporteerd en dit elektronentransportproces resulteert in de translocatie van protonen (H + ) door complexen I, III en IV van de mitochondriale matrix naar de intermembraanruimte. De resulterende protongradiënt wordt gebruikt door het ATP-synthase om ATP te produceren. Merk op dat dit proces niet perfect efficiënt is, aangezien protonen zich ook door het binnenste mitochondriale membraan kunnen verplaatsen via een verscheidenheid aan routes zoals de ontkoppelende eiwitten en de adenine nucleotide translocase, of zelfs door het membraan zelf (Jastroch et al. 2007), waarbij ze de het ATP-synthase, wat resulteert in de dissipatie van de protongradiënt zonder de synthese van ATP.

0V3wNBBQgku5f1Eb8wYc8G4dG4WG9E7SktGcYMBbkQOA7V6mBPvPcaVvVBoGIGLCzWIgrwzxcQnrOxgIO15Q0qRYr4V0DbLpng" />

Mitochondriaal elektronentransport en ATP-synthese. Het elektronentransportsysteem (ETS) bestaat uit een reeks membraan-geassocieerde eiwitcomplexen (Complexen I-IV) ingebed in het binnenste mitochondriale membraan dat de mitochondriale matrix en intermembraanruimte (IMS) scheidt. Elektronendragers brengen elektronen voornamelijk over naar complex I en II, die ze vervolgens doorgeven aan co-enzym Q, een in vet oplosbaar molecuul dat aanwezig is in de lipidefase van het membraan. Co-enzym Q geeft de elektronen vervolgens door aan Complex III, en ze worden uiteindelijk overgebracht naar zuurstof door de werking van Complex IV (cytochroom C oxidase). De overdracht van elektronen door het ETS wordt geassocieerd met de translocatie van protonen (H + ) naar het IMS. Het resulterende proton (ΔP) en elektrische (Ψm) gradiënt wordt gebruikt door Complex V (ATP-synthase) om ATP te synthetiseren. Protonen kunnen ook door het membraan gaan via een verscheidenheid aan lekroutes zoals ontkoppelingseiwitten (UCP) en de adenine-nucleotide-translocator (ANT) die niet resulteren in ATP-synthese.

0V3wNBBQgku5f1Eb8wYc8G4dG4WG9E7SktGcYMBbkQOA7V6mBPvPcaVvVBoGIGLCzWIgrwzxcQnrOxgIO15Q0qRYr4V0DbLpng" />

Mitochondriaal elektronentransport en ATP-synthese. Het elektronentransportsysteem (ETS) bestaat uit een reeks membraan-geassocieerde eiwitcomplexen (Complexen I-IV) ingebed in het binnenste mitochondriale membraan dat de mitochondriale matrix en intermembraanruimte (IMS) scheidt. Elektronendragers brengen elektronen voornamelijk over naar complex I en II, die ze vervolgens doorgeven aan co-enzym Q, een in vet oplosbaar molecuul dat aanwezig is in de lipidefase van het membraan. Co-enzym Q geeft de elektronen vervolgens door aan Complex III, en ze worden uiteindelijk overgebracht naar zuurstof door de werking van Complex IV (cytochroom C oxidase). De overdracht van elektronen door het ETS wordt geassocieerd met de translocatie van protonen (H + ) naar het IMS. Het resulterende proton (ΔP) en elektrische (Ψm) gradiënt wordt gebruikt door Complex V (ATP-synthase) om ATP te synthetiseren. Protonen kunnen ook door het membraan gaan via een verscheidenheid aan lekroutes zoals ontkoppelingseiwitten (UCP) en de adenine-nucleotide-translocator (ANT) die niet resulteren in ATP-synthese.

Zuurstof is de laatste elektronenacceptor langs de ETS en is dus van cruciaal belang voor het blijvend functioneren van de ETS en oxidatieve fosforylering. Onder bepaalde omstandigheden (Murphy 2009) kan zuurstof echter ook interageren met elektronendragers in verschillende stappen langs het ETS, waardoor superoxide wordt gevormd, een soort reactieve zuurstofspecies (ROS). ROS-productie door mitochondriën kan leiden tot oxidatieve schade aan mitochondriale membranen, eiwitten en DNA. Schade is niet beperkt tot het mitochondrion, aangezien deze ROS ook in de cel kunnen worden afgegeven en wijdverbreide schade kunnen veroorzaken, waarvan wordt gedacht dat het een belangrijke determinant is van cellulaire veroudering en dus van levensduur (Selman et al. 2012). De ROS-productie is echter niet de enige bepalende factor voor de mate van oxidatieve schade. Cellen hebben meerdere efficiënte mechanismen om de ROS-productie te bufferen via een verscheidenheid aan niet-enzymatische en enzymatische antioxidanten (Birben et al. 2012). De mate van oxidatieve stress die een organisme ervaart, en dus het potentieel voor oxidatieve schade, zal het evenwicht weerspiegelen tussen de productie van ROS en de omvang van de antioxidantmechanismen. Het is dus waarschijnlijk dat deze balans tussen ROS-productie en antioxidantafweer een belangrijk onderdeel is van de afwegingen waarvan wordt gedacht dat ze ten grondslag liggen aan variatie in het levenstempo (Monaghan et al. 2009). Het feit dat het mitochondrion een sleutelrol speelt, zowel in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de aerobe stofwisseling als in de ROS-productie, suggereert dat dit organel een cruciale schakel kan zijn van de evolutie van de levensgeschiedenis die een rol zou kunnen spelen bij het vaststellen van de afwegingen die ten grondslag liggen aan het tempo levenshypothese (Speakman et al. 2015 Janssens en Stoks 2018).


Dynamiek

Formeel omvat de term 'mitochondriale dynamiek' alle verschillende manieren waarop de geometrische kenmerken van mitochondriale netwerken in de loop van de tijd veranderen. Meer in het algemeen verwijst 'mitochondriale dynamiek' naar de splijtings- en fusiedynamiek die het mitochondriale netwerk voortdurend hermodelleert. Fission snijdt een tubulus in tweeën, terwijl fusie twee tubuli aan elkaar kan koppelen om een ​​langere tubulus of een vertakking te vormen. De balans tussen splitsing en fusie is belangrijk voor het vormgeven van mitochondriale netwerken. Meer splitsing dan fusie leidt tot overgefragmenteerde netwerken, terwijl meer fusie dan splitsing leidt tot oververbonden netwerken in vergelijking met normale, wild-type netwerken (originele artikelen besproken in [24]) (Figuur 2a). Als de fusie voldoende wordt verhoogd ten opzichte van splitsing, hebben alle gescheiden mitochondriale regio's het potentieel om onderling te worden verbonden tot een enkel mitochondriaal netwerk. De canonieke 'individuele' mitochondriën of kleine mitochondriale subnetwerken ontstaan ​​als gevolg van splijtingsgebeurtenissen. Dit zijn echter in feite geen afzonderlijke individuen, maar tijdelijk gescheiden subregio's van het hele mitochondriale netwerk dat zich op een bepaald moment in een of andere staat van splitsing en fusie bevindt. Fotoconversiestudies van matrixgerichte reportereiwitten in gist hebben aangetoond dat het hele mitochondriale netwerk volledig met elkaar verbonden is, en dus de matrixinhoud van het hele netwerk gemengd, binnen 5 seconden na het starten van de fotoconversie in de helft van de cellen, terwijl in de andere helft, 30 binnen die tijd is tot 95% van het netwerk met elkaar verbonden. Na 10 minuten is het hele netwerk van alle cellen met elkaar verbonden en is alle matrixinhoud gemengd [2]. Aangezien de gemiddelde snelheid van splijting en fusie in gistcellen ongeveer één per minuut per cel is [25], suggereert dit dat in de meeste cellen het grootste deel van het netwerk al met elkaar verbonden is en in de rest van de cellen wordt dit zo door verschillende fusiegebeurtenissen. In zoogdiercellen zijn de snelheden van splijting en fusie langzamer [26] en zijn mitochondriale netwerken ook veel groter. Een verminderde snelheid van dynamiek en een grotere omvang samen zouden moeten leiden tot een langer tijdsbestek waarover mitochondriale netwerken met elkaar zijn verbonden, in overeenstemming met experimentele waarnemingen [27, 28]. Verder, omdat fusie een mitochondriaal membraanpotentiaal vereist [29, 30], kunnen subregio's van het netwerk die het vermogen hebben verloren om goed te functioneren en dit membraanpotentiaal te genereren voor onbepaalde tijd gescheiden blijven, en er wordt aangenomen dat ze het doelwit zijn van mitofagie [28] .

De moleculaire machines die verantwoordelijk zijn voor het uitoefenen van de splijtings- en fusiedynamiek zijn uitgebreid bestudeerd. Splijting vindt plaats via het Dnm1p-eiwit, dat een DRP (dynamine-gerelateerd eiwit) GTPase is dat zich kan assembleren tot een spiraalstructuur en kan samentrekken bij activering door accessoire-eiwitten Mdv1p en Fis1p [31, 32]. Intrigerend genoeg is de ER geassocieerd met plaatsen met lichte mitochondriale tubulusvernauwingen die toekomstige splijtingsplaatsen worden. Deze vernauwingen kunnen Dnm1p-binding en efficiëntere splijtingsgebeurtenissen mogelijk maken [33]. Onlangs is activering van actine-polymerisatie-activiteit via forminen ook betrokken bij deze ER-geassocieerde plaatsen van mitochondriale splijting, wat suggereert dat een mogelijk mechanisme voor de ER-geassocieerde mitochondriale vernauwing kan zijn door regulering van cytoskeletdynamica [34]. Fusie omvat twee andere DRP's, Fzo1p en Mgm1p, voor respectievelijk buitenmembraan- en binnenmembraanfusie, waarbij de twee processen worden gecoördineerd door Ugo1p [35]. Het fusieproces vereist GTP-binding en hydrolyse, evenals een membraanpotentiaal [29, 30].

Naast het reguleren van de topologie van het mitochondriale netwerk, kunnen splijting en fusiedynamiek bijdragen aan de homeostatische gezondheid van het mitochondriale netwerk. Onlangs is een 'mitochondriaal kwaliteitscontrolemechanisme' voorgesteld op basis van zowel experimentele als computationele resultaten [36]. Zoals geïllustreerd in figuur 3, maken fusiegebeurtenissen het mogelijk om oxidatief beschadigde mitochondriale inhoud te mengen die wordt gegenereerd als een bijproduct van de ademhaling. Zo kan een beschadigd mitochondriaal fragment worden hersteld wanneer het opnieuw met het netwerk versmelt. Fusie zelf is afhankelijk van mitochondriale membraanpotentiaal. Daarom, hoe meer schade een netwerkfragment is, hoe kleiner de kans dat het opnieuw zal fuseren. In plaats daarvan, als het geïsoleerd blijft, wordt het gericht op omzet door mitofagie.Fissie, aan de andere kant, is het mechanisme dat de continue creatie van kleine mitochondriale fragmenten mogelijk maakt, die ofwel kunnen samensmelten met het netwerk of kunnen worden gescheiden als ze overmatig beschadigd zijn geraakt. Dit model vormt een belangrijk raamwerk voor het ontcijferen van de causaliteit tussen mitochondriale structuur en functie.

Diagram van het 'mitochondriale kwaliteitscontrolemechanisme' toont drie opeenvolgende tijdstippen van splijting en fusie. Pijlen in Tijd 1 vertegenwoordigen twee splijtingsgebeurtenissen. Arrow in Time 3 vertegenwoordigt de re-fusie van het roze fragment tot het netwerk en de dissipatie van de schade. Het rode fragment heeft te veel schade opgebouwd en kan niet opnieuw samensmelten met het netwerk. Het zal gericht zijn op mitofagie. Kleurenbalk vertegenwoordigt de hoeveelheid mitochondriale schade.