Informatie

Wat zijn 'zuurstabiele' aminozuren?


Ik heb de neiging om termen te zienaminozuur,zuur stabiel aminozuur, envrije aminozurenvaak gebruikt op het gebied van voeding, maar ze worden soms door elkaar gebruikt, wat me in de war brengt.

Ik weet dat:

  • aminozuur is een algemene term om organische verbindingen te beschrijven die zowel essentiële als niet-essentiële aminozuren omvatten.

  • vrije aminozuren is een algemene term voor aminozuren die niet worden afgebroken uit een eiwitbron; in plaats daarvan bestaat het in zijn oorspronkelijke vorm 'vrij'.

  • zuur stabiel aminozuur… geen idee

Klopt dat (correct me if I'm wrong)? Wat is de grotere relatie tussen alle drie de termen? Zou het consumeren van een vrij aminozuur beter zijn dan een van een eiwit, of van een zuur stabiel aminozuur? Waarom zou iemand ervoor kiezen om een ​​bepaalde klasse aminozuren te consumeren boven een andere?


De aminozuren asparagine en glutamine hebben hydrolyseerbare amidegroepen op hun R-groepen, zoals hier getoond:

Let op de meest linkse amidegroep op beide aminozuren. Bij blootstelling aan zuur zouden deze groepen hydrolyseren, waardoor ammoniak vrijkomt.

Dit was interessant toen mensen aminozuursamenstellingen bepaalden door gezuiverde eiwitten met zuur te hydrolyseren (voorbeeldpapier dat dit doet) en ze vervolgens door HPLC of massaspectroscopen te laten lopen. Deze methode maakt echter geen onderscheid tussen asparagine/aspartaat en glutamine/glutamaat vanwege hun zuur-instabiel natuur.

Dus om je vraag te beantwoorden: een zuurstabiel aminozuur is elk aminozuur dat niet afbreekt onder behandeling met zuur.

Aanvullende aminozuren die onder een dergelijke behandeling worden afgebroken, kunnen hier worden gevonden en omvatten serine, threonine, tyrosine, tryptofaan en cysteïne naast de twee bovengenoemde aminozuren. Deze aminozuren worden afgebroken via alternatieve routes die verschillen van die waardoor de bovengenoemde aminozuren worden afgebroken.

Tot slot, ervan uitgaande dat je het hebt over aminozuren in voedingssupplementen, de reden? zuurbestendig aminozuren worden gerapporteerd, is omdat zure hydrolyse meestal de methode is die wordt gebruikt om de eiwitten tot aminozuren te hydrolyseren, en daarom zou de fabrikant met deze methode geen zuuronstabiele aminozuren kunnen produceren, wat leidt tot dat label op uw supplementen.


Proteïnogeen aminozuur

Proteïnogene aminozuren zijn aminozuren die tijdens translatie biosynthetisch in eiwitten worden ingebouwd. Het woord "proteïnogeen" betekent "eiwit creëren". Gedurende het hele bekende leven zijn er 22 genetisch gecodeerde (proteïnogene) aminozuren, 20 in de standaard genetische code en nog eens 2 die kunnen worden opgenomen door speciale vertaalmechanismen. [1]

Daarentegen zijn niet-proteïnogene aminozuren aminozuren die ofwel niet in eiwitten zijn opgenomen (zoals GABA, L-DOPA, of triiodothyronine), verkeerd opgenomen in plaats van een genetisch gecodeerd aminozuur, of niet direct en geïsoleerd geproduceerd door standaard cellulaire machines (zoals hydroxyproline). Dit laatste is vaak het gevolg van post-translationele modificatie van eiwitten. Sommige niet-proteïnogene aminozuren worden ingebouwd in niet-ribosomale peptiden die worden gesynthetiseerd door niet-ribosomale peptidesynthetasen.

Zowel eukaryoten als prokaryoten kunnen selenocysteïne in hun eiwitten opnemen via een nucleotidesequentie die bekend staat als een SECIS-element, dat de cel aanstuurt om een ​​nabijgelegen UGA-codon te vertalen als selenocysteïne (UGA is normaal gesproken een stopcodon). Bij sommige methanogene prokaryoten kan het UAG-codon (normaal gesproken een stopcodon) ook worden vertaald naar pyrrolysine. [2]

In eukaryoten zijn er slechts 21 proteïnogene aminozuren, de 20 van de standaard genetische code, plus selenocysteïne. Mensen kunnen 12 van deze van elkaar of van andere moleculen van intermediair metabolisme synthetiseren. De andere negen moeten worden geconsumeerd (meestal als hun eiwitderivaten), en daarom worden ze essentiële aminozuren genoemd. De essentiële aminozuren zijn histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, fenylalanine, threonine, tryptofaan en valine (d.w.z. H, I, L, K, M, F, T, W, V). [3]

Er is gevonden dat de proteïnogene aminozuren gerelateerd zijn aan de reeks aminozuren die kunnen worden herkend door ribozyme autoaminoacyleringssystemen. [4] Dus, niet-proteïnogene aminozuren zouden zijn uitgesloten door het contingente evolutionaire succes van op nucleotide gebaseerde levensvormen. Er zijn andere redenen aangevoerd om te verklaren waarom bepaalde specifieke niet-proteïnogene aminozuren over het algemeen niet in eiwitten worden ingebouwd, bijvoorbeeld ornithine en homoserine cycliseren tegen de peptideruggengraat en fragmenteren het eiwit met relatief korte halfwaardetijden, terwijl andere toxisch zijn omdat ze kunnen ten onrechte worden opgenomen in eiwitten, zoals het arginine-analogon canavanine.


Abstract

Biologische afbreekbaarheid van metaal-aminozuren (AA) complexen is niet gedocumenteerd. Dergelijke kennis is nodig om de rol van AA in metaalmobiliteit en biologische beschikbaarheid in het bodemmilieu te beoordelen. In deze studie werd de biologische afbraak van vrije glycine (Gly), glutamine (Gln), arginine (Arg) en histidine (His) vergeleken met hun Zn-complexen in een natuurlijke zoute bodem voor en na het wassen. De grondmonsters werden verzameld op een diepte van 0 tot 15 cm van een zoute grond voor en 7 dagen na het wassen. Het grondig wassen van de zoute gronden met behulp van irrigatiewater met een laag zoutgehalte (EC < 2 dS m −1) is een gangbare praktijk die door de boeren in de regio wordt toegepast voordat ze worden gezaaid. Mineralisatie van AA, onthuld door CO2 afgifte (35-66% in zoute grond en 20-42% in gewassen grond) na 48 uur incubatie, wat wijst op een snelle afbraak van AA in de bodem. Complexering met Zn verminderde de mineralisatie van AA aanzienlijk. In zoute grond behandeld met AA is de cumulatieve afgifte van CO2 na 48 uur incubatie varieerde van 12,4 tot 47,5 mg C kg -1 , terwijl het 5,8-37,9 mg C kg -1 was in dezelfde grond behandeld met Zn-AA-complexen (ZnAAC). Het effect van complexering met Zn op CO2 release was afhankelijk van het type AA. Lagere C-mineralisatie en dus hogere stabiliteit van ZnAAC vergeleken met vrij AA ondersteunt de conclusie dat complexvorming van metaal de afbreekbaarheid van AA aanzienlijk vermindert. Volgens de resultaten moet meer aandacht worden besteed aan de effectiviteit van complexering met eiwitachtig AA bij de mobilisatie van metalen in de bodem dan eerder is gerapporteerd.


Aminozuur geheugensteuntjes voor de biologie olympiade

Er zijn enkele aminozuren die de eerste letter van de aminozuurnaam niet als afkorting gebruiken. Waaronder:

    • K = lysine
      • Denken ' K lysine'
        • Y = tyrosine.
          • Denk dat 't' Y rosine
            • D = asparaginezuur
              • Denk aan ‘aspar NS ijszuur’
                • Q = glutamine.
                  • Denk ‘ Q -tamine’
                    • R = arginine.
                      • Denk ‘ R -ginine’
                        • E = glutaminezuur.
                          • Denk aan 'glut' E microfoon'8217 zuur'8217
                            • F = fenylalanine
                              • Denk ‘ F enylalanine’
                                • N = asparagine
                                  • Denk ‘ N asparagine’
                                  • W = tryptofaan
                                    • Denk dat 't'Wyptofaan'8217.

                                    Een ander handig geheugensteuntje staat hieronder:

                                    niet-polaire alifatische aminozuren:

                                    • FVIP WGLAM :
                                          • Fenylalanine (F)
                                          • (V)aline
                                            • (I)soleucine
                                              • (P)roline
                                                  • Tryptofaan (W)
                                                  • (G)lycine
                                                    • (L)eucine
                                                      • (A)lanine
                                                      • (M)ethionine

                                                      Polair ongeladen aminozuren:

                                                      • S an T a N ooit Q uits C hrYstma:
                                                              • (S)erine
                                                                • (T)hreonine
                                                                  • Asperges(N)e
                                                                    • glutamine (Q)
                                                                    • (C)ysteïne
                                                                    • T(Y)rosine

                                                                    Aromatisch : W hif Ter info

                                                                    Met -OH groepen :

                                                                      • zuur
                                                                          • DE ath is altijd negatief (-)
                                                                          • Aspartaat (D), glutamaat (E)
                                                                          • Basis :
                                                                            • ZijnL ies Ar e Basis’ of BA HRK (uitgesproken als schors)
                                                                              • (H)istidine, lysine (K), A(R)ginine

                                                                              EEN LETTER AFKORTINGEN VOOR AMINOZUREN

                                                                              Aromatisch aminozuren: WFY (lees als “wifey”). WFY ruikt altijd lekker!


                                                                              ZUURBASISGEDRAG VAN AMINOZUREN

                                                                              In een waterige oplossing bij een bepaalde verbindingsspecifieke pH kan deze structuur veranderen zodat een proton van de COOH, carbonzuurgroep, overgaat naar de NH2, aminogroep, waardoor een ion overblijft met zowel een negatieve lading als een positieve lading, wat resulteert in een netto neutrale lading omdat het aantal geprotoneerde ammoniumgroepen met een positieve lading en gedeprotoneerde carboxylaatgroepen met een negatieve lading gelijk is. Dit ion heet a zwitterion (Duitse betekenis bastaard-ion of hybride ion). De zwitterionvorm van aminozuren is de meest stabiele vorm in het menselijk lichaam.

                                                                              De aminozuurstructuur hangt af van de pH van de oplossing. Als je de pH verlaagt tot een lage pH of een zure toestand, dan neemt het -COO'8211 deel van het zwitterion een waterstofion op, het aminozuur heeft nu een totale lading van +1 en is niet langer een zwitterion.

                                                                              Als je de pH verhoogt naar een hogere pH of basische toestand, wordt het waterstofion verwijderd uit de NH3 + groep van het zwitterion, heeft het aminozuur nu een totale lading van -1 en is het niet langer een zwitterion.

                                                                              De pH verschuiven

                                                                              Als je begint met een aminozuur dat is aangezuurd door toevoeging van geconcentreerd zuur, heb je het lage pH-ion met een netto totale lading van +1. Als u precies de juiste hoeveelheid base, NaOH, toevoegt, heeft uw aminozuur geen netto positieve lading meer. Je bent nu terug bij een zwitterion. De pH waar het zwitterion wordt gevormd staat bekend als het iso-elektrische punt van het aminozuur. Het iso-elektrische punt is het punt waar de netto totale lading nul is. Deze ph varieert van aminozuur tot aminozuur. Als je doorgaat met het toevoegen van een base-oplossing van NaOH aan het aminozuur, kun je overschakelen van het zwitterion naar een ion met een hoge pH met een totale lading van -1. Je kunt dit proces omkeren door zuur aan het ion toe te voegen en van een negatief geladen aminozuur naar een zwitterion of zelfs terug naar een positief geladen aminozuur-ion te gaan.

                                                                              Titratiecurve op basis van pH van een aminozuur

                                                                              Wanneer u de pH uitzet tegen het volume van NaOH, krijgt de curve een beetje de vorm van de letter ' &8220S'8221. Alle titratiecurven hebben deze karakteristieke vorm. De titratiecurve heeft twee relatief vlakke gebieden aan de boven- en onderkant, de benen. De stijging tussen deze vlakke gebieden staat bekend als het buigpunt. In het midden van deze stijging bestaan ​​alleen zwitterions. Met behulp van het middelpunt van de stijging in uw grafiek, kunt u de pH van het iso-elektrische punt van uw aminozuur bepalen.


                                                                              Aminozuren

                                                                              Figuur 1. Aminozuren hebben een centraal asymmetrisch koolstofatoom waaraan een aminogroep, een carboxylgroep, een waterstofatoom en een zijketen (R-groep) zijn bevestigd.

                                                                              Aminozuren zijn de monomeren waaruit eiwitten zijn opgebouwd. Elk aminozuur heeft dezelfde fundamentele structuur, die bestaat uit een centraal koolstofatoom, ook bekend als de alfa (α) koolstof, gebonden aan een aminogroep (NH2), een carboxylgroep (COOH) en aan een waterstofatoom. Elk aminozuur heeft ook een ander atoom of een groep atomen gebonden aan het centrale atoom dat bekend staat als de R-groep (Figuur 1).

                                                                              De naam '8220aminozuur'8221 is afgeleid van het feit dat ze zowel de aminogroep als de carboxylzuurgroep in hun basisstructuur bevatten. Zoals gezegd zijn er 20 aminozuren aanwezig in eiwitten. Tien hiervan worden bij de mens als essentiële aminozuren beschouwd omdat het menselijk lichaam ze niet kan produceren en ze uit de voeding worden gehaald.

                                                                              Voor elk aminozuur is de R-groep (of zijketen) anders (Figuur 2).

                                                                              Figuur 2

                                                                              Figuur 2. Er zijn 20 veelvoorkomende aminozuren die vaak worden aangetroffen in eiwitten, elk met een andere R-groep (variantgroep) die de chemische aard ervan bepaalt.

                                                                              De chemische aard van de zijketen bepaalt de aard van het aminozuur (dat wil zeggen, of het zuur, basisch, polair of niet-polair is). Het aminozuur glycine heeft bijvoorbeeld een waterstofatoom als de R-groep. Aminozuren zoals valine, methionine en alanine zijn niet-polair of hydrofoob van aard, terwijl aminozuren zoals serine, threonine en cysteïne polair zijn en hydrofiele zijketens hebben. De zijketens van lysine en arginine zijn positief geladen en daarom worden deze aminozuren ook wel basische aminozuren genoemd. Proline heeft een R-groep die is gekoppeld aan de aminogroep en een ringachtige structuur vormt. Proline is een uitzondering op de standaardstructuur van een animozuur omdat de aminogroep niet gescheiden is van de zijketen (Figuur 2).

                                                                              Aminozuren worden weergegeven door een enkele hoofdletter of een afkorting van drie letters. Valine is bijvoorbeeld bekend onder de letter V of het drieletterige symbool val. Net zoals sommige vetzuren essentieel zijn voor een dieet, zijn sommige aminozuren ook noodzakelijk. Ze staan ​​bekend als essentiële aminozuren en bij mensen omvatten ze isoleucine, leucine en cysteïne. Essentiële aminozuren verwijzen naar die welke nodig zijn voor de opbouw van eiwitten in het lichaam, hoewel ze niet door het lichaam worden geproduceerd, welke aminozuren essentieel zijn, verschilt van organisme tot organisme.

                                                                              Figuur 3. De vorming van peptidebindingen is een dehydratatiesynthesereactie. De carboxylgroep van één aminozuur is gekoppeld aan de aminogroep van het binnenkomende aminozuur. Daarbij komt een watermolecuul vrij.

                                                                              De volgorde en het aantal aminozuren bepalen uiteindelijk de vorm, grootte en functie van het eiwit. Elk aminozuur is aan een ander aminozuur gebonden door een covalente binding, bekend als een peptidebinding, die wordt gevormd door een dehydratatiereactie. De carboxylgroep van één aminozuur en de aminogroep van het binnenkomende aminozuur combineren, waardoor een watermolecuul vrijkomt. De resulterende binding is de peptidebinding (Figuur 3).

                                                                              De producten die door dergelijke koppelingen worden gevormd, worden peptiden genoemd. Naarmate meer aminozuren zich bij deze groeiende keten voegen, staat de resulterende keten bekend als een polypeptide. Hoewel de termen polypeptide en eiwit soms door elkaar worden gebruikt, is een polypeptide technisch gezien een polymeer van aminozuren, terwijl de term eiwit wordt gebruikt voor een polypeptide of polypeptiden die zijn gecombineerd, vaak gebonden niet-peptide prosthetische groepen hebben, een verschillende vorm hebben , en hebben een unieke functie. Na eiwitsynthese (vertaling) worden de meeste eiwitten gemodificeerd. Deze staan ​​bekend als post-translationele modificaties. Ze kunnen splitsing, fosforylering ondergaan of de toevoeging van andere chemische groepen vereisen. Pas na deze aanpassingen is het eiwit volledig functioneel.

                                                                              De evolutionaire betekenis van cytochroom c

                                                                              Cytochroom c is een belangrijk onderdeel van de elektronentransportketen, een onderdeel van de cellulaire ademhaling, en wordt normaal gesproken aangetroffen in het cellulaire organel, het mitochondrion. Dit eiwit heeft een heem-prothetische groep en het centrale ion van het heem wordt afwisselend gereduceerd en geoxideerd tijdens elektronenoverdracht. Omdat de rol van dit essentiële eiwit bij het produceren van cellulaire energie cruciaal is, is het in de loop van miljoenen jaren weinig veranderd. Eiwitsequencing heeft aangetoond dat er een aanzienlijke hoeveelheid cytochroom c aminozuursequentiehomologie is tussen verschillende soorten, met andere woorden, evolutionaire verwantschap kan worden beoordeeld door de overeenkomsten of verschillen tussen de DNA- of eiwitsequenties van verschillende soorten te meten.

                                                                              Wetenschappers hebben vastgesteld dat menselijk cytochroom c 104 aminozuren bevat. Voor elk cytochroom c-molecuul van verschillende organismen waarvan tot nu toe de sequentie is bepaald, verschijnen 37 van deze aminozuren op dezelfde positie in alle monsters van cytochroom c. Dit geeft aan dat er mogelijk een gemeenschappelijke voorouder is geweest. Bij het vergelijken van de eiwitsequenties van de mens en de chimpansee werd geen sequentieverschil gevonden. Toen de sequenties van mens en resusaap werden vergeleken, was het enige verschil dat werd gevonden in één aminozuur. In een andere vergelijking laat sequencing van mens tot gist een verschil zien op de 44e positie.


                                                                              RESULTATEN

                                                                              Verbeterde doorlezing van natuurlijke codons bij afwezigheid van afgiftefactor 1

                                                                              We veronderstelden dat deletie van afgiftefactor 1 (RF1) een verhoogde UAG-codon-readthrough en verhoogde NSAA-opname zou bevorderen, terwijl concurrentie door verkeerde opname van natuurlijke AA's ook zou kunnen toenemen. Inderdaad, wij en anderen hebben natuurlijke AA-opname waargenomen bij UAG en we waren gemotiveerd om dit dieper te onderzoeken (6, 9, 10, 20). E coli bevat 321 natuurlijke amber stopcodons (6, 9, 11) en dus kunnen RF1-deficiënte stammen de natuurlijke eiwitsynthese mogelijk uitbreiden tot voorbij de UAG- en naar het volgende in-frame stopcodon (Figuur 1A). Op massaspectrometrie gebaseerde proteomics is een ideaal hulpmiddel om deze nieuwe eiwitvormen te karakteriseren. Standaard proteomische workflows kunnen uitgebreide eiwitten niet gemakkelijk identificeren omdat uitgebreide eiwitsequenties niet aanwezig zijn in sequentiedatabases die voor proteomics worden gebruikt. Bovendien waren er eerder geen tools die peptiden identificeren die UAG-readthrough rapporteren van de duizenden geïdentificeerde peptiden die zijn waargenomen in een proteomisch experiment.

                                                                              Een proteomics-workflow om natuurlijke AA's en Sep te identificeren bij native UAG-codons in Escherichia coli. (EEN) Incorporatie van Sep (P) aan het stopcodon (UAG) concurreert met RF1. Sep-opname verlengt de eiwitsynthese tot het volgende in-frame stopcodon (UAA of UGA), waardoor de natuurlijke ORF wordt verlengd. (B) Proteomics-workflow voor de detectie en kwantificering van het doorlezen van UAG-stopcodons. Aangepaste open leesframe (ORF) databases worden gegenereerd op basis van de E coli genoom. ORF's zijn uitgebreid in silico voorbij het natuurlijke UAG-stopcodon en deze uitgebreide ORF's worden aan de standaard toegevoegd E coli proteoom. Deze databases werken samen met proteomics-databasezoeksoftware om uitgebreide eiwit-ORF's uit shotgun-proteomics-datasets te identificeren. TAG-sites in de uitgebreide ORF's worden vertaald als X, of de 20 natuurlijke AA's, om de databases te vullen en peptide-ontdekking en identificatie met aangepaste filters mogelijk te maken. Informatie op eiwit- of peptideniveau kan worden verzameld uit de uitgebreide proteoomgegevens en worden overgebracht naar Skyline om MRM-methoden voor kwantitatieve proteomics te ontwikkelen.

                                                                              Een proteomics-workflow om natuurlijke AA's en Sep te identificeren bij native UAG-codons in Escherichia coli. (EEN) Incorporatie van Sep (P) aan het stopcodon (UAG) concurreert met RF1. Sep-opname verlengt de eiwitsynthese tot het volgende in-frame stopcodon (UAA of UGA), waardoor de natuurlijke ORF wordt verlengd. (B) Proteomics-workflow voor de detectie en kwantificering van het doorlezen van UAG-stopcodons. Aangepaste open leesframe (ORF) databases worden gegenereerd op basis van de E coli genoom. ORF's zijn uitgebreid in silico voorbij het natuurlijke UAG-stopcodon en deze verlengde ORF's worden aan de standaard toegevoegd E coli proteoom. Deze databases werken samen met proteomics-databasezoeksoftware om uitgebreide eiwit-ORF's uit shotgun-proteomics-datasets te identificeren. TAG-sites in de uitgebreide ORF's worden vertaald als X, of de 20 natuurlijke AA's, om de databases te vullen en peptide-ontdekking en identificatie met aangepaste filters mogelijk te maken. Informatie op eiwit- of peptideniveau kan worden verzameld uit de uitgebreide proteoomgegevens en worden overgebracht naar Skyline om MRM-methoden voor kwantitatieve proteomics te ontwikkelen.

                                                                              We hebben eerst op maat gemaakt E coli databases die bevatten in silico voorspelde E coli eiwitsequenties waarin alle ambercodons opnieuw werden toegewezen aan elk van de 20 natuurlijke AA's (Figuur 1B). De 321 geannoteerde UAG-bevattende ORF's in de E coli genoomsequentie (6, 11) werden vervolgens verlengd tot het volgende in-frame niet-TAG-stopcodon. Deze databases werden vervolgens gecombineerd tot een enkele database en gebruikt in combinatie met een conventionele E coli eiwitdatabase voor het ontginnen van de shotgun-proteomische gegevens. Vervolgens hebben we een geautomatiseerd script geïmplementeerd om een ​​lijst met tryptische peptiden te genereren die coderen voor alle mogelijke AA's op TAG-loci.

                                                                              We hebben onze methode eerst getest door de wereldwijde UAG-codon-readthrough in drie te analyseren E coli stammen met aangetoond nut bij het sturen van Sep-opname op UAG-codons (13, 21). Genetisch coderend voor Sep gebruikt een Sep-OTS, dat een fosfoseryl-tRNA-synthetase, een ambercodon dat tRNA Sep decodeert en een variant van elongatiefactor Tu (EF-Sep)(21) bevat. Bij proteomische analyse van deze stammen werden meer dan 1000 eiwitten geïdentificeerd, waaronder 83 TAG-bevattende ORF's (zie aanvullende tabel S2). We onderzochten een wildtype BL21-stam (BL21.WT.SEP.OTS2.1) en detecteerden geen significante vertaling van UAG-codons met één uitzondering (zie figuur 2A en aanvullende tabellen S4 en S5). Vervolgens vergeleken we dezelfde BL21-stam die codeert voor een gevestigde Sep-OTS (21) (BL21.L11C.SEP.OTS2.1 zie aanvullende tabel S1). In deze stam identificeerden we twee inheemse ORF's (ilvA en luxS) waarin een terminaal ambercodon de Sep-insertie en verlenging van het natieve eiwit naar het volgende niet-amberkleurige stopcodon leidde (Figuur 2A). Ten slotte onderzochten we de RF1-deletiestam EcAR7 (EcAR7.SEP.OTS2.1) ( 13), opnieuw met Sep-OTS2.1 en identificeerden we zeven fosfopeptiden (zie aanvullende tabel S3) allemaal met Sep-opname op natieve UAG-codons (Figuur 2A en B). Het verhoogde aantal fosfopeptiden dat is geïdentificeerd in de RF1-deficiënte EcAR7-stam geeft aan dat onze methode gemakkelijk verbeterde doorlezing van native UAG's detecteert als gevolg van RF1-deletie.

                                                                              Identificatie van natuurlijke AA's en Sep opgenomen in natieve UAG-codons in Escherichia coli. (EEN) Samenvatting van peptiden die UAG-plaatsen van RF1 + BL21-stammen (BL21.WT.SEP.OTS2.1 (groen) en BL21.L11C.SEP.OTS2.1 (violet)) en de RF1-deficiënte stam EcAR7.SEP.OTS2 omspannen. 1 (bruin) ontdekt met de proteomics-workflow. Peptiden met [email protected] (rood), [email protected] (wit of rood onderstreept *twee Q in sucB) en [email protected] (zwart, cursief) worden vermeld. (B) Geannoteerd tandem MS-spectrum van een fosfopeptide dat de opname van Sep op het natieve UAG-codon in speG laat zien.

                                                                              Identificatie van natuurlijke AA's en Sep opgenomen in natieve UAG-codons in Escherichia coli. (EEN) Samenvatting van peptiden die UAG-plaatsen van RF1 + BL21-stammen (BL21.WT.SEP.OTS2.1 (groen) en BL21.L11C.SEP.OTS2.1 (violet)) en de RF1-deficiënte stam EcAR7.SEP.OTS2 omspannen. 1 (bruin) ontdekt met de proteomics-workflow. Peptiden met [email protected] (rood), [email protected] (wit of rood onderstreept *twee Q in sucB) en [email protected] (zwart, cursief) worden vermeld. (B) Geannoteerd tandem MS-spectrum van een fosfopeptide dat de opname van Sep op het natieve UAG-codon in speG laat zien.

                                                                              Een van de doelen van genetische code-expansie is om eiwitten te produceren met een uitgebreid AA-repertoire met behoud van dezelfde betrouwbaarheid als natuurlijke eiwitsynthese. Naast on-target Sep-opname, identificeerde onze methode off-target opname van glutamine bij inheemse UAG-codons (Figuur 2A). Deze waarnemingen kwamen vaker voor bij de RF1-deficiënte stam, wat suggereert dat verkeerde opname van AA's op UAG-locaties in deze stam zou kunnen worden versterkt.

                                                                              Optimalisatie van Sep-OTS-systemen en kwantificering van NSAA-opname

                                                                              We hebben onze workflow toegepast om de betrouwbaarheid te kwantificeren van verschillende Sep-OTS-systemen die zijn ontworpen voor verbeterde prestaties bij RF1-deficiënte stammen. Een gevestigde GFP-reporter (13) werd gebruikt om gelijktijdig de opname van on-target Sep en off-target AA-opname te kwantificeren (Figuur 3A). We brachten dit eiwit tot expressie in EcAR7, met en zonder de Sep-OTS en voerden een standaard shotgun-proteomische analyse uit van de gezuiverde eiwitten. Vervolgens analyseerden we de shotgun-gegevens met onze bioinformatica-pijplijn zoals hierboven beschreven. In het kort, LC-MS/MS-gegevens werden met MASCOT doorzocht tegen een E coli database en een aangepaste database voor GFP die alle 20 canonieke AA's op het UAG-codon in overweging nam (zie figuur 3A en aanvullende tabel S6). Gemodificeerde of niet-standaard AA's kunnen worden gespecificeerd via aangepaste aanpassingen in de databasezoekmachine. We merken op dat de sequenties van de peptiden die onderdrukking van UAG rapporteren uniek zijn in de peptide-zoekresultaten en dat reporterpeptiden die UAG readthrough rapporteren, kunnen worden geïdentificeerd in Microsoft Excel met een eenvoudig tekstfilter dat de gedeeltelijke reporterpeptidesequentie bevat. Naast Sep identificeerde onze methode een onverwacht groot aantal AA's opgenomen in het UAG-codon. We identificeerden GFP-peptiden met off-target inserties van Q, Y, W, K, G, E, S en T (zie aanvullende tabel S6). We redeneerden dat het aantal geïdentificeerde off-target AA's toenam vanwege het feit dat we ons op een enkel eiwit richtten dat de gevoeligheid en het dynamische bereik verhoogt in vergelijking met onze hele proteome-shotgun-experimenten (Figuur 2A). Off-target opname van Q, Y en W is eerder gerapporteerd (9) en is het resultaat van bijna verwante herkenning van ambercodons door de respectieve natieve aminoacyl-tRNA's (zie aanvullende figuur S2). Onze methode identificeerde op unieke wijze de bijna verwante opname van E en K naast de verkeerde opname van G, S en T. Lysine-insertie bij UAG werd geverifieerd in onze proteomics-gegevens met een onbevooroordeelde database en trypsine-splitsingsregels waar lysine-opname bij UAG nieuwe tryptische splitsing zou produceren plaatsen.

                                                                              Labelvrije MRM-kwantificering van AA-opname bij UAG-codons. (EEN) Het N-uiteinde van de GFP-reporter met het E17-codon vervangen door een TAG. Trypsine snijdt de reporter op K- of R-residuen en genereert peptiden die de opname van niet-standaard of natuurlijke AA's (rood) rapporteren. (B) Er wordt voorspeld dat het vergroten van de sterkte van een OTS voor NSAA-opname de bijna verwante onderdrukking zal overtreffen. (C) MRM-sporen geëxtraheerd uit experimenten met de GFP-reporter en een GAA-codon (E) of met TAG en twee verschillende Sep-OTS's. OTS2.1 was ons oorspronkelijke systeem met twee plasmiden dat één tRNA Sep bevat (21). We hebben de twee plasmiden (OTS2.1) samengevoegd om een ​​enkel plasmide te verkrijgen dat respectievelijk 1 (OTS1.1) en 5 (OTS1.5) tRNA Sep bevat, terwijl het kopienummer voor EF-Sep en de SepRS-constante achterblijven. MRM's voor Sep, E, Y en K worden getoond. (NS) Kwantificering van Sep en bijna-verwante AA-insertie over een reeks Sep-OTS's die verhoogde Sep-opname laten zien met verhoogde sterkte van de Sep-OTS en verminderde verkeerde opname van Y, K en Q.

                                                                              Labelvrije MRM-kwantificering van AA-opname bij UAG-codons. (EEN) Het N-uiteinde van de GFP-reporter met het E17-codon vervangen door een TAG. Trypsine snijdt de reporter op K- of R-residuen en genereert peptiden die de opname van niet-standaard of natuurlijke AA's (rood) rapporteren. (B) Er wordt voorspeld dat het vergroten van de sterkte van een OTS voor NSAA-opname de bijna verwante onderdrukking zal overtreffen. (C) MRM-sporen geëxtraheerd uit experimenten met de GFP-reporter en een GAA-codon (E) of met TAG en twee verschillende Sep-OTS's. OTS2.1 was ons oorspronkelijke systeem met twee plasmiden dat één tRNA Sep bevat (21). We hebben de twee plasmiden (OTS2.1) samengevoegd om een ​​enkel plasmide te verkrijgen dat respectievelijk 1 (OTS1.1) en 5 (OTS1.5) tRNA Sep bevat, terwijl het kopienummer voor EF-Sep en de SepRS-constante achterblijven. MRM's voor Sep, E, Y en K worden getoond. (NS) Kwantificering van Sep en bijna verwante AA-insertie over een reeks Sep-OTS's die verhoogde Sep-opname laten zien met verhoogde sterkte van de Sep-OTS en verminderde verkeerde opname van Y, K en Q.

                                                                              We speculeerden dat het doorlezen van UAG door bijna verwante aminoacyl-tRNA's de meest voorkomende off-target-gebeurtenissen zouden zijn. Daarom hebben we de impact van RF1-deletie op UAG-translatie-getrouwheid kwantitatief beoordeeld en is de efficiëntie van Sep-insertie gekwantificeerd. Onze methoden omvatten een route om kwantitatieve MRM-assays te bouwen op basis van shotgun-ontdekkingsgegevens via Skyline (19) (Figuur 1B). Dit maakt een methode mogelijk om gelijktijdig zowel Sep- als natuurlijke AA-insertie op het UAG-codon te kwantificeren. Om dit te testen, hebben we een reeks Sep-OTS's gebruikt met toenemende kopie-aantallen van tRNA Sep om beter te kunnen concurreren met bijna verwante readthrough. We gebruikten onze gevestigde GFP-reporter (13) en nieuwe MRM-assay (zie aanvullende tabellen S7 en S8) om labelvrije kwantificering van Sep en natuurlijke AA-opname uit te voeren op een enkel UAG-codon. Belangrijk is dat deze experimenten werden uitgevoerd in de RF1-deficiënte EcAR7-stam (13). We gebruikten twee referentiepeptiden die zich stroomafwaarts van de TAG-locus bevinden om onze monsters voor totale GFP te normaliseren (zie aanvullende figuur S3). Dit maakte een directe vergelijking mogelijk van relatieve abundanties voor elk reporterpeptide over experimenten heen. De hoge reproduceerbaarheid van deze MRM-assay wordt aangetoond door de lage standaarddeviatie voor de detectie van een spike-in stabiele isotoop-gelabelde versies van een van de referentiepeptiden (zie aanvullende figuur S3). We kiezen ervoor om geen vergelijking uit te voeren van absolute intensiteiten tussen peptiden die de invoeging van verschillende AA's rapporteren, omdat bekend is dat de peptidelengte, AA-samenstelling en lading de ionisatie-eigenschappen veranderen. Deze methodologie zou gemakkelijk kunnen worden uitgebreid voor absolute kwantificering van de reporterpeptiden als stabiele isotoop-gelabelde peptiden (bijv. AQUA-peptiden (22)) werden opgenomen voor elke analyt in de test.

                                                                              We hebben eerst de opname van AA in onze GFP-reporter gekwantificeerd met een native glutamaat (E) codon GAA op positie 17 (Figuur 3C en D). Zoals verwacht werd bij dit natieve sense-codon alleen op-target E-opname gedetecteerd. Vervolgens hebben we tegelijkertijd de opname van Sep, Q, E, Y en K in een GFP-construct gekwantificeerd met TAG op positie 17, mede tot expressie gebracht met Sep-OTS's van verschillende sterktes (Figuur 3D). Introductie van de Sep-OTS toonde robuuste en overvloedige on-target Sep-opname op UAG-sites. Een opvallende diversiteit aan amberkleurige codon-readthroughs werd gemakkelijk gekwantificeerd. Onze test heeft direct de aminoacyl-tRNA-competitie gemeten die plaatsvond op het ribosoom. We hebben waargenomen dat Q-, Y- en K-nabij-verwante readthrough afneemt met toenemende sterkte van de Sep-OTS die wordt aangestuurd door het aantal kopieën van het verwante tRNA Sep te verhogen. Deze resultaten demonstreren niet alleen het nut van kwantitatieve beoordeling van Sep-OTS-efficiëntie en zuiverheid van het fosfoproteïneproduct, ze wijzen ook op verdere verbeteringen in E coli stammen, zoals een volledig opnieuw gecodeerde cel (6), die de fitheid van de gastheerstam en de prestaties van de Sep-OTS zou kunnen verbeteren.


                                                                              Wat zijn onnatuurlijke aminozuren?

                                                                              In een notendop, onnatuurlijke aminozuren zijn niet-proteïnogene aminozuren, wat betekent dat ze niet behoren tot de 20 aminozuren die zijn gehecht aan tRNA's in levende cellen die worden gebruikt om eiwitten te polymeriseren.

                                                                              Sommige onnatuurlijke aminozuren komen van nature voor, maar de meeste zijn chemisch gesynthetiseerd.

                                                                              Citrulline is een goed voorbeeld van een geproduceerd niet-proteïnogeen aminozuur in vivo door de oxidatie van arginine, en p-benzoyl-fenylalanine is een voorbeeld van een die helemaal niet in de natuur voorkomt.

                                                                              Sommige onnatuurlijke aminozuren zijn afgeleid van de 20 natuurlijk voorkomende variëteiten, maar veranderd met behulp van chemische modificaties. We hebben de verschillende soorten onnatuurlijke aminozuren samengevat in Tabel 1.

                                                                              Tafel 1: Verschillende soorten onnatuurlijke aminozuren

                                                                              Type UAA-wijzigingWijziging
                                                                              Niet-proteïnogeen (bijv. citrulline)Geen natuurlijk codon bestaat meestal gemaakt in vivo door de post-translationele modificatie van een natuurlijk aminozuur
                                                                              Beta-aminozurenToevoeging van een tweede koolstofatoom tussen de aminogroep en carboxygroepen
                                                                              Homo-aminozurenToevoeging van een methyleengroep tussen de alfa-koolstof en de zijgroep
                                                                              Beta-homo-aminozurenToevoeging van een tweede koolstof tussen de amino- en carboxygroepen en de toevoeging van een methyleengroep tussen de alfa-koolstof en de zijgroep
                                                                              Gemodificeerde zijgroep (bijv. p-benzoyl-fenylalanine)Wijziging van een natuurlijk voorkomende zijgroep om extra functionaliteit te verlenen
                                                                              N-methylaminozurenDe aanhechting van een methylgroep aan de stikstof in de aminogroep
                                                                              Alfa-methylaminozurenEen methylgroep vervangt de waterstof op de alfa-koolstof
                                                                              D-aminozurenChiraliteit aan de alfa-koolstof bevindt zich in de D-configuratie in plaats van de L-configuratie die wordt aangetroffen in natuurlijk voorkomende aminozuren


                                                                              Wat zijn de voordelen en risico's van het nemen van aminozuursupplementen?

                                                                              Aminozuren worden soms de bouwstenen van het leven of de bouwstenen van eiwitten genoemd. Het zijn organische verbindingen die het menselijk lichaam gebruikt om eiwitten te vormen. Alle aminozuren bevatten zuurstof, koolstof, waterstof en stikstof.

                                                                              Er zijn drie verschillende soorten aminozuren, en dat zijn:

                                                                              Niet-essentiële en voorwaardelijke aminozuren worden door het lichaam gemaakt, ongeacht de voedingsinname, terwijl essentiële aminozuren afkomstig zijn van het voedsel dat we eten. Een eiwitrijk dieet wordt beschouwd als een belangrijk onderdeel van het lichaam dat voldoende essentiële aminozuren binnenkrijgt.

                                                                              Als mensen het over aminozuursupplementen hebben, hebben ze het over het algemeen over supplementen die een of meer van de negen essentiële aminozuren bevatten die het lichaam niet zelf aanmaakt. Waaronder:

                                                                              • Lysine
                                                                              • Leucine
                                                                              • histidine
                                                                              • isoleucine
                                                                              • Methionine
                                                                              • fenylalanine
                                                                              • Threonine
                                                                              • Valine

                                                                              Arginine is required for children but is typically not included in amino acid supplements.

                                                                              Branch chain amino acids are a group of essential amino acids commonly found in over-the-counter supplements. Branch chain refers to three essential amino acids: leucine, isoleucine, and valine.

                                                                              Essential amino acids are typically received through proper diet and nutrition. Sometimes amino acid supplementation is recommended.

                                                                              A diet that contains sufficient protein from meat, fish, dairy products, and eggs is typically all that is needed. Additional amino acids may be recommended when receiving treatment for diseases such as cancer or while under excessive stress.

                                                                              Amino acids are useful because they:

                                                                              • Help with the digestion of food
                                                                              • Assist in repairing body tissue and the growth process
                                                                              • Are used by the body as an energy source

                                                                              Benefits of amino acid supplements

                                                                              Like any medication or supplement, there are risks and benefits. Speak with your healthcare provider to see if supplementation with an essential amino acid blend would improve your overall health.

                                                                              Muscle function

                                                                              Proper amino acid levels are important for muscle development and strength. They help control the balance between the atrophy and growth of human muscle.

                                                                              Supplementing your diet with essential amino acids may increase the supply of nitrogen to your body. It can also help maintain the amount of amino acids stored in your skeletal muscles.

                                                                              Sports performance

                                                                              Amino acids are frequently marketed to athletes along with a high protein diet. Your muscle growth may be increased if you consume essential amino acids shortly before or after exercise.

                                                                              Amino acids may also aid in the exercise recovery period. It is unclear, however, if there is a significant difference between supplementing with amino acids and simply eating a high protein diet.

                                                                              Blood glucose levels

                                                                              Amino acids have been shown to be beneficial to blood sugar levels. Some people with type 2 diabetes who take amino acids are able to lower their blood sugar without impacting their insulin levels. It is unclear what the long-term effects of amino acid supplements on blood sugar may be.

                                                                              Skin conditions

                                                                              Young women who take amino acid supplements may improve their overall skin condition and its moisture level. They can also improve their muscle mass.

                                                                              VRAAG

                                                                              Conclusie

                                                                              Amino acid supplementation may benefit you if your body is lacking in one or more of the essential amino acids. A healthcare provider or nutritionist can help analyze your diet to determine if you should consider taking amino acid supplements.

                                                                              Three of the most commonly mentioned risks of long-term amino acid supplementation are nausea, headache, and pain.

                                                                              Amino acid supplements can impact your blood sugar levels. This means that you should avoid them before and after surgery.

                                                                              Many experts advise against taking supplements that contain a single amino acid. Amino acids with the worst side effects if you take too much include methionine, cysteine, and histidine.

                                                                              Amino acid supplements may interact with other medications that you are taking, including diabetes and thyroid medication. Always check with your doctor before supplementing with amino acids.


                                                                              Referenties

                                                                              Anfinsen CB, Redfield RR, Choate WI, Page J, Carroll WR: Studies on the gross structure, cross-linkages, and terminal sequences in ribonuclease. J Biol Chem. 1954, 207: 201-210.

                                                                              Crooks GE, Brenner SE: Protein secondary structure: entropy, correlations and prediction. Bio-informatica. 2004, 20: 1603-1611. 10.1093/bioinformatics/bth132.

                                                                              Klepeis JL, Floudas CA: ASTRO-FOLD: A combinatorial and global optimization framework for ab initio prediction of three-dimensional structures of proteins from the amino acid sequence. Biophys J. 2003, 85: 2119-2146.

                                                                              Zuker M: Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleïnezuren Res. 2003, 31: 3406-3415. 10.1093/nar/gkg595.http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi

                                                                              Berg J, Tymoczko J, Stryer L: The molecular design of life. Biochemie. Edited by: Stryer L. 2002, New York: W.H. Freeman, 10: 5

                                                                              Geserick C, Meyer HA, Haendler B: The role of DNA response elements as allosteric modulators of steroid receptor function. Mol Cell Endocrinol. 2005, (2 May, Epub ahead of print),

                                                                              Brandon N, Jovanovic J, Moss S: Multiple roles of protein kinases in the modulation of gamma-aminobutyric acid(A) receptor function and cell surface expression. Pharmacol Ther. 2002, 94: 113-122. 10.1016/S0163-7258(02)00175-4. (beoordeling)

                                                                              Kumarevel TS, Gromiha MM, Selvaraj S, Gayatri K, Kumar PK: Influence of medium- and long-range interactions in different folding types of globular proteins. Biophys Chem. 2002, 99: 189-198. 10.1016/S0301-4622(02)00183-7.

                                                                              Gromiha MM, Selvaraj S: Comparison between long-range interactions and contact order in determining the folding rate of two-state proteins: application of long-range order to folding rate prediction. J Mol Biol. 2001, 310: 27-32. 10.1006/jmbi.2001.4775.

                                                                              Biro JC, Benyo B, Sansom C, Szlavecz A, Fordos G, Micsik T, Benyo Z: A common periodic table of codons and amino acids. Biochem Biophys Res Commun. 2003, 306: 408-415. 10.1016/S0006-291X(03)00974-4.

                                                                              Woese CR: The Genetic Code: The Molecular Basis for Gene Expression. 1967, Harper & Row, New York, 156-160.

                                                                              Biro JC, Biro JMK: Frequent occurrence of recognition site-like sequences in the restriction endonucleases. BMC Bioinformatica. 2004, 5: 30-10.1186/1471-2105-5-30.

                                                                              Eisenberg D, Weiss RM, Terwilliger TC, Wilcox W: Hydrophobic moments in protein structure. Faraday Symp Chem Soc. 1982, 17: 109-120. 10.1039/fs9821700109.

                                                                              Biro JC, Fördös G: SeqX: a tool to detect, analyze and visualize residue co-locations in protein and nucleic acid structures. BMC Bioinformatica. 2005, 6: 170-10.1186/1471-2105-6-170.http://www.janbiro.com/download

                                                                              Berman HM, Westbrook J, Feng Z, Gilliland G, Bhat TN, Weissig H, Shindyalov IN, Bourne PE: The protein data bank. Nucleïnezuren Res. 2000, 28: 235-242. 10.1093/nar/28.1.235.http://www.pdb.org/

                                                                              Miyazawa S, Jernigan L: Estimation of Effective Interresidue Contact Energied from Protein Chrystal Structures. Macromolecules. 1985, 18: 534-553. 10.1021/ma00145a039.

                                                                              Miyazawa S, Jernigan RL: Residue-residue potentials with a favorable contact pair term and an unfavorable high packing density term, for simulation and threading. J Mol Biol. 1996, 256: 623-44. 10.1006/jmbi.1996.0114.

                                                                              Junier T, Pagni M: Dotlet: diagonal plots in a web browser. Bio-informatica. 2000, 16: 178-179. 10.1093/bioinformatics/16.2.178.http://www.isrec.isb-sib.ch/java/dotlet/Dotlet.html

                                                                              Cootes AP, Curmi PM, Torda AE: Automated protein design and sequence optimisation: scoring functions and the search problem. Curr Protein Pept Sci. 2000, 3: 255-271. 10.2174/1389203003381351. (beoordeling)

                                                                              Li XQ, Luo LF, Liu CQ: The relation between translation speed and protein secondary structure. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 2003, 35: 193-196. (in Chinese)

                                                                              Neher E: How frequent are correlated changes in families of protein sequences. Proc Natl Acad Sci USA. 1994, 91: 98-102.

                                                                              Levinthal C: How to fold graciously. Mossbauer Spectroscopy in Biological Systems. Edited by: Debrunner P, Tsibris JCM, Munck E. 1969, Proceedings of a Meeting held at Allerton House, Monticello, IL, University of Illinois Press, Urbana, IL, 22-24.

                                                                              Isogai Y, Ota M, Ishii A, Ishida M, Nishikawa K: Identification of amino acids involved in protein structural uniqueness: implication for de novo protein design. Protein Eng. 2002, 15: 555-560. 10.1093/protein/15.7.555.

                                                                              Brunak S, Engelbrecht J: Protein structure and the sequential structure of mRNA: alpha-helix and beta-sheet signals at the nucleotide level. Eiwitten. 1996, 25: 237-252. 10.1002/(SICI)1097-0134(199606)25:2<237::AID-PROT9>3.3.CO2-Y.

                                                                              Gu W, Zhou T, Ma J, Sun X, Lu Z: Folding type specific secondary structure propensities of synonymous codons. IEEE Trans Nanobioscience. 2003, 2: 150-157. 10.1109/TNB.2003.817024.

                                                                              Gupta SK, Majumdar S, Bhattacharya TK, Ghosh TC: Studies on the relationships between the synonymous codon usage and protein secondary structural units. Biochem Biophys Res Commun. 2000, 269: 692-696. 10.1006/bbrc.2000.2351.

                                                                              Gokhale KC, Newnam GP, Sherman MY, YO Chernoff YO: Modulation of prion-dependent polyglutamine aggregation and toxicity by chaperone proteins in the yeast model. J Biol Chem. 2005, (14 Apr, Epub ahead of print),

                                                                              Fan H, Mark AE: Mimicking the action of folding chaperones in molecular dynamics simulations: application to the refinement of homology-based protein structures. Protein Sci. 2004, 13: 992-999. 10.1110/ps.03449904.

                                                                              Walter S, Buchner J: Molecular chaperones-cellular machines for protein folding. Angew Chem Int Ed Engl. 2002, 41: 1098-1113. 10.1002/1521-3773(20020402)41:7<1098::AID-ANIE1098>3.0.CO2-9.