Informatie

Hoe wordt elke regio van het DNA slechts één keer gerepliceerd?


In "Molecular Biology of THE CELL" 3e editie, 1994, door Alberts, et al. (Ja ik weet dat er een nieuwere editie is)

de vraag wordt gesteld op pagina 362

Hoe wordt elke regio van het DNA slechts één keer gerepliceerd?

Er worden twee suggesties gedaan:

  1. Model voor toevoeging van remmer
  2. Initiatie-verwijderingsmodel

Aangezien de 3e editie van het boek nu 24 jaar oud is, is het antwoord dan ontdekt en zo ja, wat is het?

Ik ben nu de 3e editie aan het lezen, want dat is wat ik heb en ben van plan de nieuwere 6e editie te kopen als er de komende maanden geen 7e editie uitkomt. Dit is voor zelfstudie, dus ik hoef me niet te haasten of de nieuwste en beste informatie te hebben voor de eerste keer dat ik leer, omdat ik alleen maar aan het lezen ben.


DNA-replicatie zorgt ervoor dat dit slechts één keer gebeurt door het gebruik van licentiefactoren. Deze factoren worden vrijgegeven en binden aan de oorsprong van replicatie tijdens één afzonderlijke fase. Nadat de factoren zijn losgelaten en de eerste fase is beëindigd, begint de daadwerkelijke replicatie.

Informatie over de licentiefactoren:

De licentiefactoren die worden gebruikt om het pre-replicatiecomplex te creëren, zijn het Minichromosome Maintenance (Mcm2-7) eiwit, Cdc6 en Cdt1. De Cdc6 en Cdt1 zijn nodig om de Mcm's op het DNA te laden en worden daarom sterk gecontroleerd tijdens de celcyclus. De Mcm2-7-hexameer is de eigenlijke DNA-helicase die wordt gebruikt tijdens DNA-replicatie.

De manier waarop de herreplicatie van DNA wordt voorkomen, is dat wanneer de DNA-replicatie begint, de Mcm-helicase zich verwijdert van de ORC en het nieuw gerepliceerde DNA, wat betekent dat het dan niet opnieuw kan worden gestart. Samen met de fysieke verplaatsing van de helicase, wordt de activiteit van Cdt1 onderdrukt door het eiwit Geminin, dat de licentie van de helicase verhindert in tijden van niet-replicatie.

Afbeelding uit het artikel over de licentie.

Meer informatie over dit onderwerp: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2688777/#!po=21.8085


3 fasen van DNA-replicatieproces (met diagram)

Lees dit artikel om meer te weten te komen over de drie fasen van het DNA-replicatieproces.

De drie fasen van het replicatieproces zijn: (1) initiatie (2) verlenging en (3) beëindiging.

Replicatie in prokaryoten en eukaryoten vindt plaats door zeer vergelijkbare mechanismen, en dus is de meeste informatie die hier wordt gepresenteerd voor bacteriële replicatie ook van toepassing op eukaryote cellen.

Het bestaat uit drie fasen die hieronder worden opgesomd:

Het gaat om herkenning van de posities op een DNA-molecuul waar de replicatie zal beginnen.

Het omvat de gebeurtenissen die plaatsvinden bij de replicatievork, waar de ouder-polynucleotiden worden gekopieerd.

Het wordt minder begrepen. Het treedt op wanneer het oudermolecuul volledig is gerepliceerd.

(a) Initiatie:

In een cel begint DNA-replicatie op specifieke locaties in het genoom, genaamd '8220origins'8221. In het geval van E. coli is de oorsprong van replicatie een sequentie van ongeveer 245 basenparen (bp), genaamd oriC. Origins bevatten DNA-sequenties die worden herkend door replicatie-initiatoreiwitten (bijv. DnaA in E. coli en het Origin Recognition Complex in gist), deze eiwitten binden om het proces van replicatie te starten. De initiatoreiwitten rekruteren andere eiwitten om de twee strengen te scheiden en replicatievorken te initiëren.

Het afwikkelen van DNA bij de oorsprong en de synthese van nieuwe strengen vormt een replicatievork. De replicatievork is een structuur die ontstaat wanneer DNA wordt gerepliceerd. Het wordt gecreëerd door de werking van helicase, die de waterstofbruggen verbreekt die de twee DNA-strengen bij elkaar houden. De resulterende structuur heeft twee vertakkende '8220prongs'8221, elk bestaande uit een enkele DNA-streng.

Bij bacteriën, die een enkele oorsprong van replicatie hebben op hun circulaire chromosoom, creëert dit proces uiteindelijk een '8220theta-structuur'8221 (lijkend op de Griekse letter theta: 8). Daarentegen hebben eukaryoten langere lineaire chromosomen en initiëren ze replicatie bij meerdere oorsprongen en waarvan de replicatievorken over kortere afstanden vorderen. Gist heeft bijvoorbeeld ongeveer 322 oorsprongen, wat overeenkomt met 1 oorsprong per 36 kb DNA, en mensen hebben ongeveer 20.000 oorsprongen, of 1 oorsprong voor elke 150 kb DNA. Eenmaal geïnitieerd, kunnen twee replicatievorken uit de oorsprong tevoorschijn komen en in tegengestelde richting langs het DNA voortbewegen. Replicatie is daarom bidirectioneel met de meeste genomen (Fig. 3.4).

Initiatie van DNA-replicatie in micro-organismen (E. coli):

We weten aanzienlijk meer over DNA-synthese in prokaryoten dan in eukaryoten. Zoals we hebben besproken, overspant oriC van E.coli 245 bp DNA. Sequentieanalyse van dit segment laat zien dat het twee korte herhalingsmotieven bevat, één van negen nucleotiden en de andere van 13 nucleotiden. De vijf kopieën van een herhalingsmotief van negen nucleotiden worden verspreid door oriC gepresenteerd.

Deze regio's zijn de bindingsplaats voor een eiwit dat DnaA wordt genoemd. Aangezien er vijf kopieën van de bindingssequenties zijn, zou men kunnen denken dat vijf kopieën van DnaA aan de oorsprong hechten, maar in feite werken gebonden DnaA-eiwitten samen met ongebonden moleculen totdat ongeveer 30 kopieën met de oorsprong zijn geassocieerd. Hechting vindt alleen plaats wanneer het DNA negatief super-coiled is, zoals de normale situatie is voor het E. coli-chromosoom.

Het resultaat van DnaA-binding is dat de dubbele helix zich opent (smelt) binnen de tandemreeks van drie AT-rijke herhalingen van 13 nucleotiden die zich aan het ene uiteinde van de oriC-sequentie bevinden. Het exacte mechanisme is onbekend, maar DnaA lijkt niet de enzymatische activiteit te bezitten die nodig is om basenparen te verbreken, en daarom wordt aangenomen dat de helix wordt gesmolten door torsiespanningen die worden geïntroduceerd door aanhechting van de DnaA-eiwitten.

Een aantrekkelijk model stelt zich voor dat de DnaA-eiwitten een tonachtige structuur vormen waaromheen de helix is ​​gewikkeld. Het smelten van de helix wordt bevorderd door HU, de meest voorkomende van de DNA-verpakkingseiwitten van E. coli. Het smelten van de helix initieert een reeks gebeurtenissen die een nieuwe replicatievork vormen aan beide uiteinden van het open gebied. De eerste stap is de bevestiging van een pre-priming complex op elk van deze twee posities.

Elk pre-priming complex bestaat aanvankelijk uit 12 eiwitten, zes kopieën van DnaB en zes kopieën van DnaC, maar DnaC heeft een voorbijgaande rol en wordt vrijgelaten uit het complex kort nadat het is gevormd, waarbij de functie waarschijnlijk eenvoudigweg de aanhechting van DnaB bevordert .

De laatste is een helicase, een enzym dat basenparen kan breken. DnaB begint het enkelstrengs gebied binnen de oorsprong te vergroten, waardoor de enzymen die betrokken zijn bij de verlengingsfase van replicatie in E. coli, nu de replicatievorken beginnen weg te gaan van de oorsprong en het kopiëren van DNA begint.

Initiatie van DNA-replicatie in gist:

Herkomsten die in gist worden geïdentificeerd, worden autonoom replicerende sequenties of ARS's genoemd. De oorsprong van atypische gist is korter dan die van E. coli oriC, en is gewoonlijk minder dan 200 bp lang. Daarin worden vier subdomeinen herkend.

Twee van deze subdomeinen A en B1 '8211 vormen de oorsprongherkenningssequentie, een stuk van in totaal zo'n 40 bp dat de bindingsplaats is voor het Origin-herkenningscomplex (ORC), een set van zes eiwitten die hechten aan de oorsprong.

ORC's zijn beschreven als gistversies van de E. coli DnaA-eiwitten, maar deze interpretatie is waarschijnlijk niet strikt correct omdat ORC's tijdens de celcyclus aan gistoorsprong lijken te blijven. Het zijn eerder echte initiator-eiwitten. Het is waarschijnlijker dat ORC's betrokken zijn bij de regulatie van genoomreplicatie, en fungeren als bemiddelaars tussen replicatieoorsprongen en de regulerende signalen die de initiatie van DNA-replicatie coördineren met de celcyclus.

Er zijn vergelijkbare sequenties in gist als die van oriC van E. coli. Dit leidt ons naar de twee andere geconserveerde sequenties in de typische gistoorsprong, subdomeinen B2 en B3. Ons huidige begrip suggereert dat deze twee subdomeinen functioneren op een manier die vergelijkbaar is met de E. coli-oorsprong. Subdomein B2 lijkt overeen te komen met de 13-nucleotide repeat-array van de E. coli-oorsprong, zijnde de positie waarop de twee strengen van de helix voor het eerst worden gescheiden.

Dit smelten wordt veroorzaakt door torsiestress die wordt geïntroduceerd door aanhechting van een DNA-bindend eiwit, ARS-bindingsfactor 1 (ABF1), dat hecht aan subdomein B3. Net als bij E. coli wordt het smelten van de helix in een gistreplicatie-oorsprong gevolgd door hechting van de helicase en andere replicatie-enzymen aan het DNA, waardoor het initiatieproces wordt voltooid en de replicatievorken hun voortgang langs het DNA kunnen beginnen. De oorsprong van replicatie in hogere eukaryoten is niet goed begrepen.

(b) Verlenging:

Als de replicatie eenmaal is gestart, vorderen de replicatievorken langs het DNA en nemen ze deel aan de synthese van een nieuwe streng. Op chemisch niveau lijkt de matrijsafhankelijke synthese van DNA sterk op de matrijsafhankelijke synthese van RNA die optreedt tijdens transcriptie, maar de twee processen zijn behoorlijk verschillend.

1. Discontinue strengsynthese en het priming-probleem Tijdens DNA-replicatie moeten beide strengen van de dubbele helix worden gekopieerd. DNA-polymerase-enzymen kunnen echter alleen DNA synthetiseren in de 5'8242 3'8242-richting. Dit betekent dat één streng van de dubbele ouder-helix, de leidende streng genoemd, op een continue manier kan worden gekopieerd, maar de replicatie van de achterblijvende streng moet op een discontinue manier worden uitgevoerd, wat resulteert in een reeks korte segmenten die moeten aan elkaar worden geligeerd om de intacte dochterstreng te produceren.

Deze korte segmenten van polynucleotiden worden Okazaki-fragmenten genoemd. Deze fragmenten werden voor het eerst geïsoleerd uit E. coli-bacteriën in 1969. Okazaki-fragmenten zijn 1000-2000 nucleotiden lang, maar bij eukaryoten lijken de equivalente fragmenten veel korter, misschien minder dan 200 nucleotiden lang.

2. Een ander kenmerk van DNA-replicatie is dat DNA-polymerase geen DNA-synthese kan initiëren op een molecuul dat volledig enkelstrengs is: er moet een kort enkelstrengs gebied zijn om een ​​3''8242-uiteinde te verschaffen waaraan het enzym nieuwe nucleotiden kan toevoegen. Nucleotiden worden toegevoegd met een snelheid van 50.000 basen per minuut. De keuze van nucleotide wordt bepaald door complementaire aard.

Bij dit tempo is de kans op fouten één op de duizend basenparen gerepliceerd. Het werkelijke percentage is echter vrij laag (één op een miljard). Dit is gelijk aan ongeveer één fout per genoom per duizend bacteriële replicatiecycli. Deze fout wordt verder gecorrigeerd door proeflezen (verwijdering van mismatch-nucleotide door DNA-polymerase III). Dit betekent dat er primers nodig zijn, één voor het initiëren van complementaire strengsynthese op het leidende polynucleotide, en één voor elk segment van discontinu DNA dat wordt gesynthetiseerd op de achterblijvende streng.

Omdat DNA-polymerase niet overweg kan met een volledig enkelstrengs matrijs, hebben RNA-polymerasen in dit opzicht geen problemen, dus de primers voor DNA-replicatie zijn gemaakt van RNA. In bacteriën worden primers gesynthetiseerd door primase, een speciale RNA-polymerase waarbij elke primer 4-15 nucleotiden lang is en waarvan de meeste beginnen met de sequentie 5'8242-AG-3'8242. Zodra de primer is voltooid, wordt de strengsynthese voortgezet door DNA-polymerase III.

Bij eukaryoten is de situatie complexer omdat het primase stevig is gebonden aan DNA-polymerase a en samenwerkt met dit enzym bij de synthese van de eerste paar nucleotiden van een nieuw polynucleotide. Deze primase synthetiseert een RNA-primer van 8-12 nucleotiden en geeft het vervolgens over aan DNA-polymerase a, dat de RNA-primer verlengt door ongeveer 20 nucleotiden DNA toe te voegen. Na voltooiing van de DNA-RNA-primer wordt de DNA-synthese voortgezet door het belangrijkste replicatieve enzym, DNA-polymerase 5.

Priming hoeft slechts één keer op de leidende streng plaats te vinden, binnen de replicatieoorsprong, want eenmaal geprimed, wordt de leidende strengkopie continu gesynthetiseerd totdat de replicatie is voltooid. Op de achterblijvende streng is priming een herhaald proces dat elke keer moet plaatsvinden wanneer een nieuw Okazaki-fragment wordt gestart.

3. Replicatievorkverlenging - Net als bij de bevestiging van DnaB-helicase, gevolgd door verlenging van het gesmolten gebied van de replicatieoorsprong, eindigt de initiatiefase. Nadat de helicase aan de oorsprong is gebonden om een ​​pre-priming-complex te vormen, is de primase erbij betrokken, wat resulteert in het primosoom, dat de replicatie van de leidende streng initieert. Het doet dit door de RNA-primer te synthetiseren die DNA-polymerase III nodig heeft om te beginnen met het kopiëren van de sjabloon. Er is meer dan één helicase bekend en dit enzym is betrokken bij verschillende processen, zoals transcriptie, recombinatie naast replicaties.

4. Complementaire strengen van een DNA hebben de neiging om duplex te worden. Tijdens het replicatieproces wordt voorkomen dat dit kleverige enkelstrengs DNA duplex wordt door speciale eiwitten die enkelstrengs bindende eiwitten (SSB's) worden genoemd. Zodra 1000-2000 nucleotiden in de leidende streng zijn toegevoegd, begon de synthese van de achterblijvende streng of Okazaki-fragmenten. Dit vereist ook een RNA-primer en DNA-polymerase III vergelijkbaar met de leidende streng.

5. DNA-polymerase I is betrokken bij het verwijderen van de RNA-primer van Okazaki-fragmenten, met 5'8242 → 3'8242 exo-nuclease-activiteit. Gap gecreëerd door primer wordt opgevuld door nucleotiden toe te voegen aan het 3'8242-uiteinde. De inkeping tussen twee Okazaki-fragmenten wordt afgesloten door DNA-ligase door de vorming van fosfodiesterbindingen (Fig. 3.5).

(c) Beëindiging:

Omdat bacteriën circulaire chromosomen hebben, vindt beëindiging van replicatie plaats wanneer de twee replicatievorken elkaar ontmoeten aan het andere uiteinde van het ouderchromosoom. E coli reguleert dit proces door het gebruik van terminatiesequenties die, wanneer gebonden door het Tus-eiwit, slechts één richting van de replicatievork doorlaten.

Als resultaat zijn de replicatievorken beperkt om elkaar altijd binnen het terminatiegebied van het chromosoom te ontmoeten. Eukaryoten initiëren DNA-replicatie op meerdere punten in het chromosoom, dus replicatievorken ontmoeten en eindigen op veel punten in het chromosoom waarvan niet bekend is dat ze op een bepaalde manier worden gereguleerd.


De eerste fase van interfase heet de G1 fase, of eerste gap, omdat er weinig verandering zichtbaar is. Echter, tijdens de G1 stadium is de cel behoorlijk actief op biochemisch niveau. De cel verzamelt de bouwstenen van chromosomaal DNA en de bijbehorende eiwitten, evenals voldoende energiereserves om de taak van het repliceren van elk chromosoom in de kern te voltooien.

Gedurende de interfase blijft nucleair DNA in een semi-gecondenseerde chromatineconfiguratie. In de S-fase (synthesefase) DNA-replicatie resulteert in de vorming van twee identieke kopieën van elk chromosoom - zusterchromatiden - die stevig zijn bevestigd aan het centromeergebied. In dit stadium is elk chromosoom gemaakt van twee zusterchromatiden en is het een gedupliceerd chromosoom. Het centrosoom wordt gedupliceerd tijdens de S-fase. De twee centrosomen zullen aanleiding geven tot de mitotische spoel, het apparaat dat de beweging van chromosomen tijdens de mitose orkestreert. Het centrosoom bestaat uit een paar staafvormige centriolen die haaks op elkaar staan. Centriolen helpen bij het organiseren van celdeling. Centriolen zijn niet aanwezig in de centrosomen van veel eukaryote soorten, zoals planten en de meeste schimmels.


RESULTATEN

Grondbeginselen van Rerep-Seq

Rerep-Seq maakt gebruik van de semiconservatieve aard van DNA-replicatie om selectief opnieuw gerepliceerd DNA te fragmenteren en te verrijken. Cellen worden gelabeld met de thymidine-analoog BrdU voor één celcyclus om BrdU-opname in het nieuw gerepliceerde DNA mogelijk te maken (Figuur 1A linkerpaneel). Replicatie resulteert in opname van BrdU in een enkele DNA-streng, terwijl replicatie resulteert in opname van BrdU in beide strengen.

Grondbeginselen van Rerep-Seq. (EEN) Schema van selectieve fragmentatie van opnieuw gerepliceerd DNA. Replicerend DNA neemt BrdU op in een nieuw gesynthetiseerde streng, replicerend DNA verwerft BrdU in beide strengen. Rerep-Seq-digest: UVA-blootstelling fotolyseert BrdU om uracil te produceren, gevolgd door nucleotide-excisie door UDG, om een ​​abasische plaats te produceren en het genereren van enkelstrengige breuken door digestie met APE1. Normaal gerepliceerd DNA genereert enkelstrengs breuken en versprongen dubbelstrengs breuken in gerepliceerd DNA. (B enC) Selectieve fragmentatie van gist (B) en menselijk (C) genomisch DNA vereist BrdU-, UVA- en UDG/APE-1-digestie. Genomisch DNA van cellen die waren gelabeld met BrdU voor nul of twee celcycli (−,+ BrdU) om dubbel gelabeld gerepliceerd DNA na te bootsen, werd behandeld met de aangegeven stappen van de Rerep-Seq-digestieprocedure. (NS enE) Optimalisatie van fragmentgrootte voor gist en menselijk DNA. Genomisch DNA blootgesteld aan verschillende doses UVA gevolgd door behandeling met UGD/APE1 en DNA blootgesteld aan UVA gevolgd door variërende UDG- en APE1-digestietijd. (F enG) Selectieve fragmentatie en verrijking van dubbel BrdU-gelabeld gist-DNA. (H enl) Selectieve fragmentatie en verrijking van dubbel BrdU-gelabeld menselijk DNA. Rerep-digest op genomisch DNA behandeld met BrdU gedurende 1, 2 of 3 celcycli. DNA-fragmenten werden met gel geëxtraheerd en gelijke volumes werden geanalyseerd door qPCR met primers in ARS307 (gist) en ACTb-gen (mens). Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drie biologische replicaten (N = 3), foutbalken vertegenwoordigen de SEM.

Grondbeginselen van Rerep-Seq. (EEN) Schema van selectieve fragmentatie van opnieuw gerepliceerd DNA. Replicerend DNA neemt BrdU op in een nieuw gesynthetiseerde streng, replicerend DNA verwerft BrdU in beide strengen. Rerep-Seq-digest: UVA-blootstelling fotolyseert BrdU om uracil te produceren, gevolgd door nucleotide-excisie door UDG, om een ​​abasische plaats te produceren en het genereren van enkelstrengige breuken door digestie met APE1. Normaal gerepliceerd DNA genereert enkelstrengs breuken en versprongen dubbelstrengs breuken in gerepliceerd DNA. (B enC) Selectieve fragmentatie van gist (B) en menselijk (C) genomisch DNA vereist BrdU-, UVA- en UDG/APE-1-digestie. Genomisch DNA van cellen gelabeld met BrdU voor nul of twee celcycli (−,+ BrdU) om dubbel gelabeld gerepliceerd DNA na te bootsen, werd behandeld met de aangegeven stappen van de Rerep-Seq-digestieprocedure. (NS enE) Optimalisatie van fragmentgrootte voor gist en menselijk DNA. Genomisch DNA blootgesteld aan verschillende doses UVA gevolgd door behandeling met UGD/APE1 en DNA blootgesteld aan UVA gevolgd door variërende UDG- en APE1-digestietijd. (F enG) Selectieve fragmentatie en verrijking van dubbel BrdU-gelabeld gist-DNA. (H enl) Selectieve fragmentatie en verrijking van dubbel BrdU-gelabeld menselijk DNA. Rerep-digest op genomisch DNA behandeld met BrdU gedurende 1, 2 of 3 celcycli. DNA-fragmenten werden met gel geëxtraheerd en gelijke volumes werden geanalyseerd met qPCR met primers in ARS307 (gist) en ACTb-gen (mens). Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drie biologische replicaten (N = 3), foutbalken vertegenwoordigen de SEM.

Genomisch DNA van cellen die zijn gelabeld met BrdU wordt gezuiverd en onderworpen aan biochemische verwerking om ssDNA-breuken te induceren op de plaatsen waar BrdU is opgenomen. DNA wordt onderworpen aan UVA-behandeling in aanwezigheid van Hoechst 33258 om het broom uit BrdU te fotolyseren en deoxyuracil achter te laten (figuur 1A middelste paneel). Deoxyuracil wordt vervolgens verwijderd door behandeling met UDG (uracil-DNA-glycosylase), waarbij een abasische plaats achterblijft. De abasische plaats wordt vervolgens omgezet in een enkelstrengige DNA-breuk door deoxyribose-excisie door APE1 (apurinine/apyrimidinisch endodeoxyribonuclease), wat enkele DNA-inkepingen oplevert in normaal gerepliceerd DNA, maar verspringende inkepingen (dwz dubbelstrengs DNA-breuken) in gerepliceerd DNA (Figuur 1A rechter paneel). Het gefragmenteerde, opnieuw gerepliceerde DNA kan vervolgens worden geïsoleerd door fractionering op grootte en geanalyseerd door kwantitatieve PCR of sequentiebepaling van de volgende generatie.

Parameters die van invloed zijn op Rerep-Seq-afschuiving van DNA

De hoeveelheid gerepliceerde DNA-fragmentatie kan empirisch worden gecontroleerd om overeen te komen met de voorkeuren van de onderzoeker (Figuur 1B-E). Elke stap in de Rerep-Seq-digestprocedure: BrdU-labeling, UVA-behandeling en UDG+APE1-digestie zijn allemaal vereist voor DNA-fragmentatie van zowel gist als menselijk DNA (Figuur 1B en C). Elk van deze stappen kan worden gebruikt om de mate van fragmentatie te beheersen. In het bijzonder is de hoeveelheid UVA-blootstellingstijd een sterke bepalende factor voor DNA-schering (Figuur 1D en E), die kan worden verfijnd door de hoeveelheid tijd van de UDG- en APE1-enzymatische spijsvertering te wijzigen. Empirisch testen van deze omstandigheden resulteerde in het gebruik van 30 M BrdU voor menselijke cellen en 0,1 mM BrdU voor gistcellen met 7,5 min UVA en 2 uur digestie om fragmenten te genereren gecentreerd van 300 tot 600 bp voor optimale bibliotheekconstructie met behulp van de Illumina Nextera DNA Flex-bibliotheekvoorbereidingskit (19). Met behulp van deze voorwaarden hebben we Rerep-Seq-fragmentatie gevalideerd door gist en menselijke cellen te labelen voor maximaal drie celcycli om te bepalen of Rerep-Seq DNA alleen verrijkte in cellen die voor meer dan twee celcycli met BrdU zijn gelabeld, waardoor rereplicatie wordt gesimuleerd (Figuur 1F- L). Gel geëxtraheerd gefragmenteerd DNA werd geanalyseerd met qPCR (Figuur 1G en I). We waren in staat om DNA alleen te fragmenteren en significant te verrijken van cellen die waren gelabeld met BrdU gedurende ten minste twee celcycli.

Validatie van Rerep-Seq door gesimuleerde DNA-replicatie in S. cerevisiae

Het ontbreken van eerdere technologie om gerepliceerd DNA te evalueren, vormde een uniek probleem voor het valideren van Rerep-Seq met behulp van regio's waarvan bekend is dat ze repliceren. Om dit probleem op te lossen, hebben we DNA-replicatie gesimuleerd door cellen dubbel te labelen via een replicatietiming-experiment op een manier die bekende vroege replicerende regio's een tweede keer zouden repliceren (replicatie nabootsen) en fungeren als proxy's voor DNA-replicatie (Figuur 2A en B). Om deze aanpak te valideren, hebben we eerst de cultuur in α-factor gearresteerd om de cellen in G1 te synchroniseren (Figuur 2A en C). Vervolgens hebben we de cellen vrijgegeven in media die BrdU bevatten en na 40 minuten hebben we de α-factor opnieuw toegevoegd om de cellen te synchroniseren via één deling op G1 (Figuur 2C). We lieten de cellen vervolgens een tweede keer vrij in media die BrdU bevatten en verzamelden DNA uit cellen met de aangegeven tijdsintervallen na vrijgave. Met behulp van deze aanpak moet DNA tijdens de tweede celcyclus dubbelstrengs BrdU label vroege replicerende regio's vóór late replicerende regio's (Figuur 2B). In deze tweede release moeten vroege replicerende regio's bij voorkeur eerst worden verrijkt met Rerep-Seq, gevolgd door detectie van latere replicerende regio's op latere tijdstippen (Figuur 2C en D). Ter vergelijking isoleerden we ook gedurende drie celcycli volledig gelabeld DNA in asynchrone kweek. Zoals verwacht, zagen we verhoogde fragmentatie naarmate cellen vorderden door de tweede celcyclus (Figuur 2D).

Simulatie van DNA-replicatie in gistcellen. (EEN) Schema van gesimuleerde DNA-replicatie in gistcellen. Gist gesynchroniseerd met α-Factor en vervolgens vrijgegeven in verse media die 0,1 mM BrdU bevatten, gevolgd door een tweede arrestatie en vrijgave in BrdU met monsters verzameld op de aangegeven tijdstippen. (B) Schematische voorstelling van selectieve fragmentatie en verrijking van vroege replicerende regio's in de tweede celcyclus. Na de eerste celcyclus wordt één DNA-streng gelabeld met BrdU (pre-label). Terwijl de gesynchroniseerde cultuur de tweede S-fase start, nemen vroege replicerende regio's BrdU op in beide DNA-strengen en zijn ze nu vatbaar voor fragmentatie en verrijking. (C) Bevestiging van de voortgang van de celcyclus door flowcytometrie. (NS) Fragmentatie van DNA neemt toe naarmate gist de tweede celcyclus doorloopt. (E) Bevestiging van verrijking van vroege replicerende regio. Gelijke volumes gel geëxtraheerd gefragmenteerd DNA geanalyseerd door qPCR met primers tegen vroege (ARS307) en late (ACT1) replicerende regio's. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde verrijking van gemiddeld drie biologische replicaten (N = 3), foutbalken vertegenwoordigen de SEM.

Simulatie van DNA-replicatie in gistcellen. (EEN) Schema van gesimuleerde DNA-replicatie in gistcellen. Gist gesynchroniseerd met α-Factor en vervolgens vrijgegeven in verse media die 0,1 mM BrdU bevatten, gevolgd door een tweede arrestatie en vrijgave in BrdU met monsters verzameld op de aangegeven tijdstippen. (B) Schematische voorstelling van selectieve fragmentatie en verrijking van vroege replicerende regio's in de tweede celcyclus. Na de eerste celcyclus wordt één DNA-streng gelabeld met BrdU (pre-label). Terwijl de gesynchroniseerde cultuur de tweede S-fase start, nemen vroege replicerende regio's BrdU op in beide DNA-strengen en zijn ze nu vatbaar voor fragmentatie en verrijking. (C) Bevestiging van de voortgang van de celcyclus door flowcytometrie. (NS) Fragmentatie van DNA neemt toe naarmate gist de tweede celcyclus doorloopt. (E) Bevestiging van verrijking van vroege replicerende regio. Gelijke volumes gel geëxtraheerd gefragmenteerd DNA geanalyseerd door qPCR met primers tegen vroege (ARS307) en late (ACT1) replicerende regio's. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde verrijking van gemiddeld drie biologische replicaten (N = 3), foutbalken vertegenwoordigen de SEM.

We analyseerden het gefragmenteerde DNA voorafgaand aan de voorbereiding van de bibliotheek door qPCR. We gebruikten primers voor een bekend vroeg replicerend gebied, een sequentie gedefinieerde oorsprong van DNA-replicatie in gist genaamd Autonomous Replicating Sequence 307 (ARS307), en het late replicerende gebied dat het gen ACT1 bevat. We hebben vastgesteld dat Rerep-Seq in staat was om vroege replicerende regio's specifiek te verrijken voorafgaand aan detectie van latere replicerende regio's (Figuur 2E) (18). De geverifieerde monsters werden onderworpen aan bibliotheekvoorbereiding door Illumina's Nextera DNA Flex Library Prep Kit-protocol, hoewel standaard adapterligatie en andere bibliotheekvoorbereidingsprocedures zouden moeten werken op het gefragmenteerde DNA. Belangrijk, inclusief een in vitro DNA-reparatiestap (we gebruikten NEB's FFPE-reparatiekit om inkepingen en oxidatie te repareren) voorafgaand aan het starten van het Nextera DNA Flex Library Prep-protocol verhoogde de bibliotheekopbrengsten aanzienlijk (gegevens niet getoond) en we raden aan deze reparatiestap op te nemen.

Normalisatie van Rerep-Seq-lezingen

In zowel gist- als menselijke cellen repliceren mitochondriën asynchroon (ongeacht de celcyclusstilstand) en veel sneller dan het genomische DNA (20, 21). Dit betekent dat in de praktijk al het mitochondriaal DNA systemisch dubbel gelabeld is met BrdU en dus in elk monster gelijkelijk moet worden verteerd. We hebben ervoor gekozen om het mitochondriaal DNA te gebruiken als interne controle voor normalisatie. Een BrdU-gelabelde spike-in, zoals een gelabeld plasmide, kan desgewenst ook worden gebruikt voor normalisatie, maar de interne controle van gelabeld mitochondriaal DNA heeft onder de meeste omstandigheden de voorkeur. Na normalisatie van het lezen naar RPM, werden individuele monsters geschaald op basis van het aandeel uitlezingen dat was uitgelijnd met de mitochondriën (zie het gedeelte 'Materialen en methoden').

Rerep-Seq verrijkt vroeg replicerend DNA

Er werd verwacht dat het Rerep-Seq-signaal van ons replicatietiming-experiment pieken vertoonde bij vroege afvuren van ARS's op vroege tijdstippen, gevolgd door geleidelijke verbreding van pieken naar late replicerende regio's met uiteindelijke fusie van pieken en afvlakking van het signaal naarmate cellen vorderden door de tweede celcyclus . Zoals verwacht, komen Rerep-Seq-signaalpieken voort uit vroege afvuren van ARS's 15 min na G1-release. Deze pieken namen toe in intensiteit, verbreden en uiteindelijk fuseren met late replicerende regio's naarmate de cel vordert door de S-fase (Figuur 3A). Het patroon is duidelijk zichtbaar uit elk van de drie biologische replica's (aanvullende figuur S1) en wordt gehandhaafd wanneer de replica's samen worden gemiddeld (Figuur 3A). Belangrijk is dat Rerep-Seq, uitgevoerd op cellen die gedurende meer dan drie generaties met BrdU zijn gelabeld, geen verrijking van vroege replicatiedomeinen aantoont (Figuur 3A, cc-monster).

Wereldwijde verrijking van vroege replicerende regio's in gist met behulp van Rerep-Seq. (EEN) Rerep-Seq bij Chr II naarmate cellen door S-fase vorderen. RPM genormaliseerd, mitochondriaal geschaald Rerep-Seq-signaal. Tracks vertegenwoordigen het gemiddelde van drie biologische replica's voor elk tijdstip (twee voor drie celcycluslabels, 3cc). Vroege tijdstippen vertonen verrijking bij vroeg afvuren ARS (ERD's, in blauwe LRD's, in rood onderaan de plot) gevolgd door een verbreding van het signaal naar late replicerende regio's naarmate de cel door de S-fase vordert. ARS's worden aangegeven door grijze maatstreepjes onderaan de plot. (B) Hittekaart van Rerep-Seq rond 410 bevestigde ARS's op 25 minuten na G1-release. Gecentreerd zijn 410 bevestigde ARSs ± 25 kb, gesorteerd op Rerep-Seq-signaalintensiteit. Blauwe vinkjes duiden op vroege vuren van ARS's. (C enNS) Meta-analyse van verrijking bij alle ERD's (C) en alle LRD's (D).

Wereldwijde verrijking van vroege replicerende regio's in gist met behulp van Rerep-Seq. (EEN) Rerep-Seq bij Chr II naarmate cellen door S-fase vorderen. RPM genormaliseerd, mitochondriaal geschaald Rerep-Seq-signaal. Tracks vertegenwoordigen het gemiddelde van drie biologische replica's voor elk tijdstip (twee voor drie celcycluslabels, 3cc). Vroege tijdstippen vertonen verrijking bij vroeg afvuren ARS (ERD's, in blauwe LRD's, in rood onderaan de plot) gevolgd door een verbreding van het signaal naar late replicerende regio's naarmate de cel door de S-fase vordert. ARS's worden aangegeven door grijze maatstreepjes onderaan de plot. (B) Hittekaart van Rerep-Seq rond 410 bevestigde ARS's op 25 minuten na G1-release. Gecentreerd zijn 410 bevestigde ARSs ± 25 kb, gesorteerd op Rerep-Seq-signaalintensiteit. Blauwe vinkjes duiden op vroege vuren van ARS's. (C enNS) Meta-analyse van verrijking bij alle ERD's (C) en alle LRD's (D).

Om de Rerep-Seq-verrijking van vroege replicerende regio's verder te valideren, hebben we 410 bevestigde ARS-elementen geclassificeerd als vroege of late replicerende regio's (17). We definieerden ERD's als regio's in het bovenste kwartiel van het signaal en LRD's het onderste kwartiel van het signaal in eerder gerapporteerde replicatietiminggegevens (17-18, 22-23). Vervolgens hebben we het Rerep-Seq-signaal 25 minuten na de release uitgezet binnen 25 kb van elk ARS. De ARS's werden gesorteerd op volgorde van de Rerep-Seq-signaalintensiteit van hoog naar laag. We hebben een sterke Rerep-Seq-verrijking waargenomen bij vroege replicerende ARS's aangegeven door blauwe maatstreepjes (Figuur 3B). Een metanalyse van zowel vroege ARS als late ARS (Figuur 3C en D) toont aan dat het signaal verrijkt over de vroege replicerende ARS-sequenties op vroege tijdstippen na de release, terwijl latere regio's geen intensiteit kregen totdat de cellen verder waren gevorderd door de celcyclus. Samen tonen deze gegevens aan dat Rerep-Seq dubbel BrdU-gelabeld DNA op een temporele en locus-specifieke manier verrijkt.

Validatie van Rerep-Seq door gesimuleerde DNA-replicatie in menselijke cellen

Om Rerep-Seq in menselijke cellen te valideren, hebben we een vergelijkbaar gesynchroniseerd replicatietiming-experiment uitgevoerd. Hoewel menselijke cellen geen door de sequentie gedefinieerde oorsprong hebben, zoals de gist-ARS's, volgt DNA-replicatie een georkestreerd timingprogramma met gedefinieerde vroege en late replicerende regio's (24). We labelden MDA-MB-231-cellen gedurende 4 uur met BrdU voordat we gedurende 12 uur een G2 / M-arrestatie met nocodazol induceerden. Dit maakte één celcyclus van labeling met BrdU mogelijk (Figuur 4A). We verzamelden G2 / M-arresteerde cellen, wasten ze twee keer en lieten ze los in verse media die BrdU bevatten. Toen cellen de daaropvolgende S-fase binnengingen, zouden vroege replicerende regio's eerst BrdU-labeling van de tweede streng moeten krijgen, waarbij replicatie van deze regio's wordt nagebootst. (Figuur 4A). We verzamelden cellen op 0, 10, 15 en 25 uur na de release en analyseerden hun DNA-gehalte door flowcytometrie om de voortgang van de celcyclus te bevestigen (Figuur 4B). Gezuiverd genomisch DNA uit deze culturen werd onderworpen aan de Rerep-Seq-digestprocedure (Figuur 4C). Fragmented DNA, sizes ranging from 100 to 3000 bp, was separated on an agarose gel, excised, purified, repaired and then analyzed for early and late replicating regions by qPCR.

Simulation of DNA Rereplication in human cells. (EEN) Schematic of simulated DNA rereplication in human cells. MDA-MB-231 cells were treated with BrdU for 4 h followed by a 12-h treatment with nocodazole (with BrdU) to generate a synchronized culture arrested at G2/M with single strand BrdU incorporation. G2/M arrested cells were released into fresh media with BrdU. Samples were collected at 0, 10, 15 and 25 h for analysis by flow cytometry and Rerep-Seq. (B) Confirmation of cell-cycle progression by flow cytometry. (C) Fragmentation of DNA increases as cells progress through the second cell cycle. (NS) Enrichment of early replicating human regions. Mean fold enrichment of qPCR signal over T0, using primers against the early replicating region on Chr16-telomere and the late replicating region containing the HCN1 gene. Data represent the average of three biological replicates (N = 3), error bars represent the SEM.

Simulation of DNA Rereplication in human cells. (EEN) Schematic of simulated DNA rereplication in human cells. MDA-MB-231 cells were treated with BrdU for 4 h followed by a 12-h treatment with nocodazole (with BrdU) to generate a synchronized culture arrested at G2/M with single strand BrdU incorporation. G2/M arrested cells were released into fresh media with BrdU. Samples were collected at 0, 10, 15 and 25 h for analysis by flow cytometry and Rerep-Seq. (B) Confirmation of cell-cycle progression by flow cytometry. (C) Fragmentation of DNA increases as cells progress through the second cell cycle. (NS) Enrichment of early replicating human regions. Mean fold enrichment of qPCR signal over T0, using primers against the early replicating region on Chr16-telomere and the late replicating region containing the HCN1 gene. Data represent the average of three biological replicates (N = 3), error bars represent the SEM.

As expected, we observed an increase in DNA fragmentation as cells progressed through S-phase (Figure 4C). This correlated with Rerep-Seq signal enrichment of the early replicating sub-telomeric region of chromosome 16 at 10 and 15 h post-release, while the late replicating region at the HCN1 gene was not enriched until 25 h post-release (Figure 4D) ( 25). We then processed these validated samples for sequencing using Illumina Nextera DNA Flex Library Prep Kit.

For comparison to our Rerep-Seq data, we used publicly available replication timing data from the related MCF-7 breast cancer cell line ( 16, 26). This replication timing data segmented the genome into ERDs, LRDs and TZs ( 16). Rerep-Seq signal from cells 10 to 15 h post-nocodazole release (correlating with early S phase Figure 4B) strongly correlated with the predefined ERDs from MCF-7 cells (Figure 5A and Supplementary Figure S2 ). Twenty-five hours after release from nocodazole, late regions accumulated signal connecting the intervening ERDs.

Global enrichment of early replicating regions in human cells using Rerep-Seq. (EEN) Rerep-Seq at Chr 16 as cells progress through S-Phase. RPM normalized and mitochondrial DNA scaled Rerep-Seq signal exhibits enrichment at ERDs (blue), followed by a broadening of signal into LRDs (red) as cell progress through S-phase. (B) Heat Map of Rerep-Seq Surrounding ERDs and LRDs 15 h post-nocodazole release. Heatmap is centered on either the ERD or LRD of interest and extends to the midpoint of the adjacent TZ. Each region was scaled from 0 to 100% to size normalize the ERDs and LRDs. The heatmap is sorted from highest to lowest based on signal intensity. Blue ticks indicate the ERDs. (C en NS) Meta analysis of enrichment at all ERDs (C) and all LRDs (NS).

Global enrichment of early replicating regions in human cells using Rerep-Seq. (EEN) Rerep-Seq at Chr 16 as cells progress through S-Phase. RPM normalized and mitochondrial DNA scaled Rerep-Seq signal exhibits enrichment at ERDs (blue), followed by a broadening of signal into LRDs (red) as cell progress through S-phase. (B) Heat Map of Rerep-Seq Surrounding ERDs and LRDs 15 h post-nocodazole release. Heatmap is centered on either the ERD or LRD of interest and extends to the midpoint of the adjacent TZ. Each region was scaled from 0 to 100% to size normalize the ERDs and LRDs. The heatmap is sorted from highest to lowest based on signal intensity. Blue ticks indicate the ERDs. (C en NS) Meta analysis of enrichment at all ERDs (C) and all LRDs (NS).

To confirm ERD enrichment genome wide, we analyzed Rerep-Seq signal 15 h after release across 462 ERDs and 470 LRDs. To define each region, we included half the TZ on either side of the ERD or LRD. Since these domains ranged in size from 1000 to 20 272 173 bps, we scaled across each domain and plotted the data from 0% (middle of preceding TZ) to 100% (middle of following TZ). Each region was then sorted by signal intensity, which resulted in a clear enrichment of ERDs (blue ticks) with higher signal intensity than LRDs (Figure 5B). As with yeast, a meta-analysis of both ERDs and LRDs (Figure 5C and D) demonstrates that signal enriches over ERDs 10 and 15 h post-release, while LRDs gain intensity 25 h post-release. Importantly, MDA-MB-231 cells labeled for two complete cell cycles (2cc, Figure 5A, bottom track) did not exhibit enrichment of Rerep-Seq signal over ERDs or LRDs (Figure 5C and D).

Analysis of rereplication following licensing deregulation in budding yeast

Disruption of replication licensing has been shown to induce DNA rereplication (by flow cytometry) in yeast, drosophila and human cells ( 27–30). However, we know little about which sequences are rereplicated or if the whole genome is rereplicated evenly. To address this question, we took advantage of a CDK-bypass strain, courtesy of Dr Hiroyuki Araki, which harbors a mutant Cdc45 H22Y (JET1), that binds unphosphorylated Sld3, along with galactose inducible DBF4 and a phosphomimetic mutant of Sld2, sld2-11D. Together these mutants facilitate the interaction between Cdc45, Sld2, Sld3 and Dpb11, without phosphorylation, activating DNA replication origins independently of S-phase CDK activity (Figure 6A) ( 31). When grown in galactose, this strain exhibits greater than 2N DNA content even when arrested with α-factor, demonstrating bypass of normal licensing requirements ( 31). We transformed this strain to facilitate BrdU uptake with the BrdU-Inc cassette ( 15) to allow application of Rerep-Seq (Strain YJB18).

Deregulation of replication licensing induces non-random DNA rereplication in Yeast. (EEN) Schematic of genetic CDK bypass inducing DNA rereplication. Mutant Cdc45 H22Y (JET1) in combination with galactose inducible DBF4 and a galactose inducible phospho-mimetic Sld2-11D mutant, binds Sld3 and then facilitates the interaction between Sld3 and Dpb11 without phosphorylation. This results in activating DNA replication origins independently of S-phase CDK activity. (B) Schematic of CDK bypass experiment. YJB18 (JET1 GALp-sld2-11D, GALp-DBF4) cells grown in raffinose are then treated with α-factor to arrest culture in G1. Culture was then split into two: one grown in galactose the other in raffinose. BrdU was added to both. Cells were collected at 5 h post-galactose addition for DNA extraction and PI flow cytometry. (C) Cell-cycle analysis of YJB18 confirms increased DNA content indicative of DNA rereplication. (NS) Fragmentation of rereplicated DNA by Rerep-Seq. (E) RPM normalized and mitochondrial DNA scaled reads were plotted. Data represent the average of three biological replicates. Gray ticks indicate ARS, ERDs are indicated in blue, LRDs in red. Green lines indicate position of Topologically Associating Domains (TADs).

Deregulation of replication licensing induces non-random DNA rereplication in Yeast. (EEN) Schematic of genetic CDK bypass inducing DNA rereplication. Mutant Cdc45 H22Y (JET1) in combination with galactose inducible DBF4 and a galactose inducible phospho-mimetic Sld2-11D mutant, binds Sld3 and then facilitates the interaction between Sld3 and Dpb11 without phosphorylation. This results in activating DNA replication origins independently of S-phase CDK activity. (B) Schematic of CDK bypass experiment. YJB18 (JET1 GALp-sld2-11D, GALp-DBF4) cells grown in raffinose are then treated with α-factor to arrest culture in G1. Culture was then split into two: one grown in galactose the other in raffinose. BrdU was added to both. Cells were collected at 5 h post-galactose addition for DNA extraction and PI flow cytometry. (C) Cell-cycle analysis of YJB18 confirms increased DNA content indicative of DNA rereplication. (NS) Fragmentation of rereplicated DNA by Rerep-Seq. (E) RPM normalized and mitochondrial DNA scaled reads were plotted. Data represent the average of three biological replicates. Gray ticks indicate ARS, ERDs are indicated in blue, LRDs in red. Green lines indicate position of Topologically Associating Domains (TADs).

To determine which regions are rereplicated upon deregulation of licensing, we arrested cells in α-factor, shifted cells to galactose or raffinose and added BrdU for 5 h (Figure 6B). When YJB18 was grown in galactose, we observed the expected increase in cellular DNA content by flow cytometry (Figure 6C). YJB18 grown in raffinose was arrested in G1 using α-factor, then split into two cultures: one grown in raffinose with BrdU (no rereplication induction) and one grown in galactose with BrdU (induced rereplication). Five hours of galactose induction was sufficient for G1 arrested cells to attain greater than 2N DNA content and exhibit substantial DNA fragmentation using the Rerep-Seq digest protocol (Figure 6C and D). Fragmented DNA was gel purified, repaired then prepared for sequencing with Illumina Nextera DNA Flex Library Prep Kits.

Analysis of Rerep-Seq data demonstrated that not all chromosomes were rereplicated evenly (Figure 6E and Supplementary Figure S3 ). Generally, we observed large broad domains on multiple chromosomes. Some domains were centered on the chromosomes (chromosomes 12,16), some had two large domains (chromosomes 4,13), while other domains were enriched toward either end of the chromosome (chromosomes 2,3,5,7,10,11,14,15). Some chromosomes either did not rereplicate or were completely rereplicated that we could not distinguish using Rerep-Seq (chromosome 1,6,8,9). These broad domains spanned across multiple ARSs (Figure 6E and Supplementary Figure S3 ) making it difficult to determine the ARS of origin, if any. The broad domains spanned both early and late replication domains and contained both early and late firing ARS sequences. Consistent with crossing multiple replication timing domains, the rereplicated regions also crossed multiple topological boundaries defined previously in α-factor arrested cells ( 32). These data demonstrate that DNA rereplication following licensing disruption in yeast is non-random and does not result in uniform whole genome duplication.


Chromosome Dimer Resolution by Site-Specific Recombination

Invoering

Chromosome replication is a key function of living cells, and any factor that impedes progression of replication forks can result in mutagenesis and genome instability. Several pathways have evolved to rescue replication forks stalled by DNA damage, some of them involving homologous recombination between sister chromosomes. These exchanges pose a unique threat to the integrity of circular genomes because they generate chromosome dimers, which must be converted back to monomers for a correct segregation to daughter cells ( Figuur 1 ). To overcome the problem of chromosome dimerization, bacteria with circular chromosome(s) have evolved a site-specific recombination mechanism, the Xer system, to resolve dimers prior to cell division. The activity of this system is tightly controlled and integrated into the cell cycle via the activity of a DNA translocase associated with the cell division apparatus, the FtsK protein.

Figure 1 . Formation of chromosome dimers. The top panel represents a replicating chromosome undergoing a recombinational repair event after breakage of the lagging-strand template ahead of a replication fork. The action of recombination enzymes leads to the formation of an HJ and a substrate for replication fork restart. Old DNA strands are in blue and newly synthesized strands are in red. The arrowheads show 3′ DNA ends. Resolution of the HJ can occur by cutting either pair of strands: A-cuts or B-cuts indicated by the open and black triangles, respectively. As shown in the bottom panels, A-cuts lead to chromosome dimerization. Notably, the enzyme resolving HJs, the RuvABC complex, prefers A-cut and thus tends to produce dimers from the recombination intermediate drawn here.

Because chromosome dimers do not form in every cell, the Xer system is not essential for growth. In Escherichia coli, it is estimated that about 15% of the cells in a standard laboratory culture require Xer activity to produce viable progeny. In cells carrying unresolved dimers (i.e., mutated for Xer), division proceeds and traps DNA, bisecting the dimeric chromosome. This induces chromosome breakage by an unknown mechanism, which provokes extensive DNA degradation and induction of the SOS response, thereby preventing further cell division. Cells thus form long aseptate filaments containing aberrant DNA masses and finally die. Although few data are available, it is largely anticipated that both the rate of chromosome dimerization and the fate of unresolved dimers vary in different bacteria.


Lysogenic Cycle

The lysogenic cycle is a method by which a virus can replicate its DNA using a host cell. Typically, viruses can undergo two types of DNA replication: the lysogenic cycle or the lytic cycle. In the lysogenic cycle, the DNA is only replicated, not translated into proteins. In the lytic cycle, the DNA is multiplied many times and proteins are formed using processes stolen from the bacteria. While the lysogenic cycle can sometimes happen in eukaryotes, prokaryotes or bacteria are much better understood examples.

A bacteriophage, or bacteria virus, injects its DNA into the bacteria. The DNA is then replicated when the bacteria undergo cell division. Because all DNA is made of the same base molecules, and viral DNA is no exception, the same chemical reaction that replicates bacterial DNA can replicate viral DNA. Since these processes are already happening in the bacteria, the lysogenic cycle can be thought of as the virus hitching a ride on the efforts already being spent by the bacteria. Typically, the bacteria is unharmed by this process because the amount of viral DNA produced is small, and the bacterial machinery has not been hijacked by the virus, like in the lytic cycle.

In this way, through no effort of its own, the virus can replicate its DNA through the lysogenic cycle, or the continued replication of viral DNA through bacterial division. When the conditions are right, the viral DNA will undergo induction and the DNA will switch to the lytic cycle, in which the DNA is actively transcribed and translated into protein shells which can harbor viral DNA outside of the cell. At a certain point, the infected bacteria will be full of viruses, each encapsulated in a viral capsid protein. The cell will lyse, or burst, and the viruses will be released into the environment, able to infect other bacteria.

Once a new capsid, containing viral DNA, finds its way to a bacteria, the process starts over. If the conditions are no longer right for the lytic cycle, the lysogenic cycle resumes. No capsids are produced, but the DNA is replicated when the bacteria undergo replication. To an observer, the virus would appear to be dormant, or the bacteria would look uninfected. Simply replicating the DNA in the lysogenic cycle is not enough to kill or damage the bacteria. In this way, it looks healthy. Once conditions become favorable for the virus to leave the bacteria, it will exit the lysogenic cycle and enter the lytic cycle.

Lysogenic Cycle Steps

Stap 1: A bacteriophage virus infects a bacteria by injecting its DNA into the bacterial cytoplasm, or liquid space inside of the cell wall.

Stap 2: The viral DNA is read and replicated by the same bacterial proteins that replicate bacterial DNA.

  • bacteriofaag – A virus that infects bacteria, also known simply as phages.
  • Lytic Cycle – One of two methods of viral reproduction, in which DNA is replicated and capsid cases are made to carry it.
  • Induction – The process by which viral DNA is switched from the lysogenic cycle to the lytic cycle.
  • Viral Capsid Protein – A protein, translated by bacterial mechanisms from viral DNA, meant to encapsulate viral DNA and protect it from the environment while providing a delivery mechanism into the next host.

1. A eukaryotic virus, such as one that can infect humans, typically proliferates by using the cellular machinery of the host it infects to produce more virus DNA, each contained in a capsid. Rarely does the virus only replicate its DNA and not produce a capsid. Which viral reproduction cycle do eukaryotic viruses most display?
A. Lysogenic Cycle
B. Bacteriophagic Cycle
C. Lytic Cycle

2. The virus that causes Dengue Fever, a tropical disease found in areas with high mosquitos, is transferred from human to human via mosquito. In the human cells, the virus multiplies, encapsulates in capsids, and bursts from cells into the bloodstream. The mosquito then picks these capsids up, where they infect some of the mosquito’s cells. The Dengue virus, after multiplying, encapsulating, and making its way to the salivary gland of the mosquito, is then deposited in the next human to be bitten by that mosquito. Which is true?
A. The Dengue virus goes through both the lysogenic and lytic cycles.
B. The Dengue virus goes through the lytic cycle.
C. The Dengue virus goes through the lysogenic cycle.

3. What is the main difference between the lysogenic cycle and the lytic cycle?
A. The fact that DNA is replicated.
B. The amount of DNA replicated and the production of capsid protein covers.
C. The use of the host’s machinery to complete the process.


The Replicon Model of Replication Initiation

The initial replication fork requires the separation of the two strands of the DNA duplex to provide a template for the synthesis of both the RNA primer and new DNA. Specific genomic DNA sequence direct the initiation of DNA Replication. The specific sites at which DNA unwinding and initiation of replication occur are called Origin of Replication.

The Replicon Model of Replication Initiation:

In 963 Frabcois Jacob, Sydney Brenner and Jacques Cuzin proposed a model to explain the events controlling the initiation of replication in bacteria. It proposed two components that control the initiation of replication :

  • Replicator: Replicator is defined as the entire set of cis-acting DNA sequences that is sufficient to direct the initiation of Replication.
  • Initiator: Initiator is the protein which specifically recognizes a DNA elements in the replicator and activates the initiation of replication. The initiator protein is the only sequence specific DNA-binding protein involved in the initiation of replication.

The model proposed that all the DNA replicated from a particular origin as a replicon. In prokaryotes since there is only one origin of replication at the single chromosome, the entire chromosome is a single replicon. In contrast the presence of multiple origins of replication divides each eukaryotic chromosomes into multiple replicons.

Replicator:

The origin of replication is the site on DNA where the DNA is unwound and DNA synthesis initiates. Although the origin of replication is always part of the replicator, sometimes the origin of replication is only a fraction of the replicator.

DNA Sequences of Replicator Share two common features:

  • First, they include a binding site for the initiator protein.
  • They include a stretch of AT-rich DNA that unwinds readily but not spontaneously. Unwinding of DNA at replicators is controlled by the replication Initiation Proteins.

The single replicator required for E-Coli chromosomal replication is called oriC. There are two repeated motif that are critical for oriC function. The 9-mer motif is the binding site for the E-Coli initiator, DnaA, and is repeated four times at oriC. The 1 3-mer motif, repeated 3 times, is the initial site of ssDNA formation during initiation.

Initiator:

Initiator proteins typically perform 3 different functions:

  1. Binding to the replicator – Bind a specific sequence DNA sequence within the replicator.
  2. Unwind DNA – once bound to the DNA, they frequently distort or unwind a region of DNA adjacent to the site of binding.
  3. Recruiting other replication proteins – Initiator proteins interact with additional factors required for replication initiation, thus recruiting them to the replicator.

In Prokaryotes, for example, the E-coli initiator, DnaA binds the repeated 9-mer elements in oriC and is regulated by ATP. When bound to ATP, DnaA also interacts with DNA in the region of the repeated 1 3-mer repeats of oriC. These additional interactions result in the separation of the DNA strands over more than 20bp within the 1 3-mer repeat region. this unwound DNA provides an ssDNA template for additional replication proteins such ad DNA helicase to begin the RNA and DNA synthesis steps of replication.

In Eukaryotes, the initiator is known as the origin recognition complex (ORC). It is a complex formed of 6 proteins. Like DnaA in E-Coli, ORC binds and hydrolyze ATP. ATP is required for sequence-specific DNA binding at the origin. Unlike DNA binding ORC at the replicator does not separate the DNA strands. ORC is , however, required to recruit all the remaining replication proteins to the replicator before it unwinds. Unwinding the strands requires the origin to get activated. Origin activation occurs only when the cell enters S phase of cell cycle.

Unlike prokaryotic initiator, ORC of eukaryotes have two functions:

once the initiator binds to the replicator, the remaining steps in the initiation of replication is largely driven by the protein-protein interactions and protein-DNA interactions that are sequence independent. The end result is the assembly of two replication fork.


Two proteins slow down the train of DNA replication in Drosophila

Quantitative droplet-digital PCR (ddPCR) copy number assay for multiple underreplicated regions. Each bar is the average enrichment relative to a fully replicated control region for three biological replicates. Credit: Jared Nordman

Two major factors matter when it comes to cells copying DNA: getting everything accurate in the sequence and how much of it is replicated. Mistakes can result in mutations, which can lead to diseases such as cancer.

Jared Nordman, assistant professor of biological sciences at Vanderbilt, said scientists already understood the amount of DNA replicated had to do with where the duplication process started and ended – akin to a train carrying passengers from point A to point B. The train's starting point and destination are important, but so is its speed. When it comes to DNA replication, that area hasn't been explored as broadly.

"We knew that the Suppressor of Underreplication (SUUR) protein was involved in slowing down the replication machinery, but we didn't know how it worked," Nordman said. "In fruit flies, which have all the machinery necessary to copy DNA virtually identically to humans, the SUUR protein physically interacts with the Rif1 protein, bringing it to the train. Once there, Rif1 has the capacity to inhibit or slow down replication."

Rif1 controls how much DNA gets copied in human cells too, but nobody knows how it does this job. While humans don't have SUUR, they likely use another adaptive protein to help Rif1 slow down the replication machinery. This work was the foundation for a new National Science Foundation grant to interrogate how the Rif1 protein controls DNA replication, Nordman said.

His team's latest findings on the subject are outlined in a paper titled "Rif1 inhibits replication fork progression and controls DNA copy number in Drosophila," published Oct. 2 in the journal eLife.


Initiation

  • Helicase &ndash The point at which the replication begins is known as the Origin of Replication. Helicase brings about the procedure of strand separation, which leads to the formation of the replication fork. It breaks the hydrogen bond between the base pairs to separate the strand. It uses energy obtained from ATP Hydrolysis to perform the function.
  • SSB Protein &ndash Next step is for the Single-Stranded DNA Binding Protein to bind to the single-stranded DNA. Its job is to stop the strands from binding again.
  • DNA Primase &ndash Once the strands are separated and ready, replication can be initiated. For this, a primer is required to bind at the Origin. Primers are short sequences of RNA, around 10 nucleotides in length. Primase synthesizes the primers.

Origin of Replication in Viruses

Viruses often have a single Replicative origin.

A variety of proteins have been described as being involved in viral replication. For instance, Polyomaviruses utilize host cell DNA polymerases, which attach to a viral origin of replication if the T antigen is present.