Informatie

Zitten er knopen in het DNA?


Deze vraag klinkt misschien gek. Hoe komt het dat de DNA-moleculen in de cel niet helemaal verstrengeld zijn met de tijd? Als ik lange snaren in een doos zou doen en ermee zou schudden, zouden er knopen ontstaan ​​en zou ik niet gemakkelijk elk touwtje van elkaar kunnen scheiden.

Maar tijdens mitosen zijn de chromosomen volledig van elkaar geïsoleerd, terwijl anders het DNA vrij in de kern zweeft.


Ik denk dat een sleutelfactor is dat DNA-moleculen geen passieve stukjes touw zijn die vrij kunnen bewegen (wat de oorzaak is van knopen in touwachtige dingen die te lang alleen worden gelaten).

Om te beginnen is het DNA-molecuul een actief onderdeel van het celmetabolisme, omdat het voortdurend wordt getranscribeerd (om RNA en eiwitten te genereren) of gekopieerd of gecorrigeerd enzovoort. En als onderdeel van zijn rol in het metabolisme is het DNA-molecuul nauw verbonden met RNA-moleculen, eiwitten en specifiek eiwitten waar het DNA omheen is gewikkeld, "histonen" genoemd. De Wikipedia-pagina voor "Chromatin" (waarvan chromosomen in feite zijn gemaakt) beschrijft verschillende aspecten van deze organisatie, waaronder:

Dat DNA dat genen codeert die actief worden getranscribeerd ("aangezet"), is losser verpakt en geassocieerd met RNA-polymerasen (aangeduid als euchromatine), terwijl dat DNA dat codeert voor inactieve genen ("uitgeschakeld") meer gecondenseerd is en geassocieerd met structurele eiwitten (heterochromatine).

Dus DNA wordt constant gemanipuleerd door allerlei eiwitten en enzymen die de vorm en positie in de ruimte beïnvloeden; het ligt daar niet alleen. En voor zover het in de knoop zou raken, zou dat waarschijnlijk deel uitmaken van de manipulaties van de enzymen en eiwitten, of zouden ze vrij gemakkelijk kunnen worden aangepakt. Dit betekent echter niet dat DNA geen knopen heeft, in feite lijkt het erop dat het heel goed kan:

DNA EN KNOOPTHEORIE (van The Institute for Environmental Modeling aan de University of Tennessee)

Conclusies: Principes van topologie geven celbiologen een kwantitatieve, krachtige en invariante manier om eigenschappen van DNA te meten. Principes van de knooptheorie hebben geholpen bij het ophelderen van de mechanismen waarmee enzymen DNA uitpakken. Bovendien zijn topologische methoden van invloed geweest bij het bepalen van de linkshandige wikkeling van DNA rond histonen. Het meten van veranderingen in het aantal kruisingen is ook behulpzaam geweest bij het begrijpen van de beëindiging van DNA-replicatie en de rol van enzymen bij recombinatie.

(merk op dat dit artikel kijkt naar DNA in E.coli, dat zijn DNA niet in chromatine organiseert zoals eukaryoten dat doen).

DNA ontwarren (van de Natuur blog CreatureCast, 2013)

Deze link bevat een video over topoisomerases, enzymen die ook in de vorige link worden genoemd en die DNA ontwarren.

Een Monte Carlo-studie van knopen in lange dubbelstrengs DNA-ketens (PLOS Computational Biology, 2016)

Citaat uit de samenvatting:

Hoewel ons grofkorrelige model alleen gebaseerd is op experimentele knoopkansen van korte DNA-strengen, reproduceert het de juiste persistentielengte van DNA. Dit geeft aan dat knopen niet alleen een fijne maatstaf zijn voor structurele eigenschappen, maar ook een veelbelovend hulpmiddel voor het ontwerpen van polymeermodellen.

De actieve site van het SET-domein is gebouwd op een knoop (Natuur Structurele Biologie, 200)
Een knoop of geen knoop? Het record 'rechtstreeks' op eiwitten zetten (Computerbiologie en scheikunde, 2003)

Deze artikelen bespreken potentiële knopen in een histon-eiwit, niet DNA, maar illustreren dat topologie en knopen belangrijk kunnen zijn in macromoleculen:

Een knoop in het SET-domein helpt bij het vormen van de actieve plaats van methyltransferase, waar AdoHcy bindt en methylering van lysine waarschijnlijk optreedt.

Een nieuwe knoop gevonden in het SET-domein wordt onderzocht in het licht van vijf recente kristalstructuren en hun beschrijvingen in de literatuur. Met behulp van het algoritme van Taylor werd vastgesteld dat de ruggengraatketen geen echte knoop vormt.

De ontdekking van een voorspelde DNA-knoop onderbouwt een model voor plaatsspecifieke recombinatie (Wetenschap, 1985)

Deze link is een beetje pijnlijk om te lezen (en uit 1985, dus ik weet niet of hij is vervangen, maar hij heeft meer dan 200 citaten), dus ik laat het bij de titel.

En tot slot dit artikel, dat ik als laatste heb bekeken maar waarschijnlijk eerst had moeten bekijken omdat de eerste zin van de samenvatting letterlijk je vraag beantwoordt:

Directe observatie van DNA-knopen met behulp van een nanoporie in vaste toestand (Natuur Nanotechnologie, 2016)

Lange DNA-moleculen kunnen zichzelf in knopen verstrengelen. Experimentele technieken voor het observeren van dergelijke DNA-knopen (voornamelijk gelelektroforese) zijn beperkt tot bulkmethoden en circulaire moleculen met een lengte van minder dan 10 kilobaseparen. Hier laten we zien dat nanoporiën in vaste toestand kunnen worden gebruikt om individuele knopen in zowel lineaire als circulaire enkelvoudige DNA-moleculen van willekeurige lengte direct te observeren.


Kijken hoe de passage van geknoopt DNA door nanoporiën glipt

Iedereen die op een zeilboot heeft gezeten, weet dat het leggen van een knoop de beste manier is om een ​​touw aan een haak te bevestigen en te voorkomen dat het wegglijdt. Hetzelfde geldt voor naaigaren waar knopen worden aangebracht om te voorkomen dat ze door twee stukken stof glippen. Hoe kunnen dan lange DNA-filamenten, die een ingewikkelde en sterk geknoopte structuur hebben, erin slagen om door de kleine poriën van verschillende biologische systemen te gaan? Dat is de fascinerende vraag van Antonio Suma en Cristian Micheletti, onderzoekers van de International School for Advanced Studies (SISSA) in Triëst, die computersimulaties gebruikten om de mogelijkheden van het genetisch materiaal in dergelijke situaties te onderzoeken. De studie is zojuist gepubliceerd in PNAS.

"Onze computationele studie werpt licht op de nieuwste experimentele doorbraken op het gebied van geknoopte DNA-manipulatie en voegt interessante en onverwachte elementen toe", legt Micheletti uit. "We hebben voor het eerst waargenomen hoe geknoopte DNA-filamenten door minuscule poriën met een diameter van ongeveer 10 nanometer (10 miljardste van een meter) gaan. Het gedrag dat in onze simulaties werd waargenomen, kwam goed overeen met de experimentele metingen die zijn verkregen door een internationaal onderzoeksteam onder leiding van Cees Dekker , die slechts een paar maanden geleden werden gepubliceerd in Nature Biotechnology. Deze geavanceerde en geavanceerde experimenten markeerden een keerpunt voor het begrijpen van DNA-knopen. Huidige experimenten kunnen echter niet "zien" hoe DNA-knopen daadwerkelijk door de nauwe porie gaan." In feite doet het fenomeen zich voor op een kleine ruimtelijke schaal en is het daarom ontoegankelijk voor microscopen. Dit is precies de reden waarom onze groep zijn toevlucht nam tot wat de grote Duitse biofysicus Klaus Schulten 'de computationele microscoop' noemde, dat wil zeggen computersimulaties.

Suma en Micheletti leggen uit: "De simulaties onthulden dat het passeren van de knoop op twee verschillende manieren kan plaatsvinden: één waar de knoop strak zit en de andere waar de knoop meer gedelokaliseerd is. In beide gevallen slaagt de knoop er niet alleen in om door de porie, maar het doet dat in een zeer korte tijd." Bovendien passeert de knoop meestal in de laatste stadia van de translocatie, wanneer het grootste deel van de DNA-streng al is gepasseerd. "Maar er is iets meer dat contra-intuïtief is", stellen de auteurs, "de grootte van de knoop, of deze nu klein of groot is, lijkt niet veel invloed te hebben op de porieobstructietijd. De laatste hangt in plaats daarvan af van de translocatiesnelheid, die, in bocht, hangt af van de beginpositie van de knoop langs de gloeidraad." Deze resultaten, zeggen de onderzoekers, zouden moeten helpen bij het ontwerpen van toekomstige experimenten die de spontane knopen van DNA onderzoeken, een nog grotendeels onontgonnen locatie, vooral met betrekking tot de grootte van DNA-knopen.

Het bevorderen van ons huidige begrip van knopen in biologische moleculen is belangrijk om hun implicaties te verduidelijken in zowel biologische als toepassingen, zoals DNA-sequencing met behulp van nanoporiën. Suma en Micheletti hopen dat de veelbelovende richtingen die door hun onderzoek worden gesuggereerd, kunnen leiden tot een meer gedetailleerde en nauwkeurige profilering van verstrengeling in DNA, RNA en eiwitten.


Zijn er knopen in chromosomen?

Recente ontwikkelingen hebben voor het eerst de bepaling mogelijk gemaakt van driedimensionale structuren van individuele chromosomen en genomen in kernen van enkele haploïde muizenembryostamcellen (ES) op basis van Hi⁻C-chromosoomconformatiecontactgegevens. Hoewel deze eerste structuren een relatief lage resolutie hebben, bieden ze de eerste experimentele gegevens die kunnen worden gebruikt om chromosoom- en intacte genoomvouwing te bestuderen. Hier analyseren we deze structuren verder en leveren we het eerste bewijs dat G1-fasechromosomen geknoopt zijn, consistent met het feit dat grafieken van contactwaarschijnlijkheid versus sequentiescheiding een machtswetafhankelijkheid laten zien die tussen die van een fractale bolletje en een evenwichtsstructuur ligt.

trefwoorden: DNA-chromosoomgebieden chromosomen fractal bolletjes knopen.

Belangenconflict verklaring

Er zijn geen conflicten te melden.

Figuren

Structuur van het intacte genoom...

Structuur van het intacte genoom van model 3 van cel nr. 2. Chromosomen...

Variatie in experimentele contactkans ...

Variatie in experimentele contactwaarschijnlijkheid met sequentiescheiding berekend over alle 8 cellen.…

Schematische tekeningen van de vijf…

Schematische tekeningen van de vijf eenvoudigste knopen ( 0 0 , 3 1…

Structuur van chromosoom 14 van...

Structuur van chromosoom 14 van cel 2 [48]. Paneel ( een ) shows…

De stabiliteit van een knoop tegen willekeurige verplaatsingen van zijn knopen. De kans…


DNA: de knopen uitwerken

DNA heeft, net als andere macromoleculen, de neiging zichzelf te verstrengelen. De factoren die de vorming van knopen en hun rol in biologische processen beheersen, zijn echter slecht begrepen vanwege een gebrek aan geschikte observatietechnieken. Nu kunnen onderzoekers met behulp van een solid-state nanoporiesysteem de aard van deze ongrijpbare kenmerken onderzoeken.

Er zijn eerder verschillende experimentele technieken gebruikt om DNA-knopen te onderzoeken, maar het zijn allemaal bulkmethoden die beperkt zijn tot relatief korte (<10 kilobasenparen) en/of circulair DNA. De nanopore-techniek daarentegen, gerapporteerd door Cees Dekker en collega's in Natuur Nanotechnologie maakt de observatie van individuele knopen in willekeurig lang, dubbelstrengs lineair en circulair DNA mogelijk. "Hoewel dergelijke knopen het meest voorkomen bij lange lengtes, was er vóór onze techniek geen methode om knopen in lange DNA-moleculen waar te nemen", legt Dekker uit.

Solid-state nanoporiën worden gebruikt om de fundamentele eigenschappen van biomoleculen op een enkel molecuulniveau en hun interacties (bijvoorbeeld tussen DNA en eiwitten), evenals DNA-scheiding en sequencing te bestuderen. De techniek houdt in dat een elektrische potentiaal wordt aangelegd over een membraan dat een nanoporie bevat (meestal ongeveer 20 nm breed) met aan weerszijden een met elektrolyt gevuld reservoir. Een geladen biomolecuul (zoals DNA) wordt door een elektroforetische kracht door de nanoporie gedreven, waar het een blokkade in de ionenstroom veroorzaakt die afhangt van het volume polymeer in de porie en, in het geval van DNA, van de specifieke basenparen .

Hoewel DNA-translocatie door nanoporiën de basis is van verschillende toepassingen in commerciële ontwikkeling (bijvoorbeeld in detectie en sequencing) en geschikt is voor grote DNA-moleculen, heeft de techniek niet eerder informatie opgeleverd over de aanwezigheid en aard van knopen. Het team van Dekker bestudeert al meer dan 15 jaar DNA-sensing in nanoporiën. "Sinds ik begon te werken aan DNA-translocatie door nanoporiën, vroeg ik me af waarom DNA zo'n kleine porie op een mooie kop-staart-manier zou doorkruisen zonder enige knopen tegen te komen", zegt Dekker. Nu, gewapend met een veel hogere temporele resolutie in vergelijking met hun vorige nanoporiënsysteem, toonden ze aan dat het niet alleen mogelijk is om knopen te detecteren, maar ook om ongekende, gedetailleerde informatie over hun eigenschappen te verkrijgen.

De onderzoekers onderzochten hoe het optreden van knopen afhangt van de DNA-lengte (tot 166 kilobasenparen), maar ook van de grootte en positie van individuele knopen. Het optreden van knopen nam toe met de lengte, met een constante waarschijnlijkheid per lengte-eenheid, wat consistent is met de resultaten van eerdere theoretische simulaties. Bovendien zagen ze onder hoge spanning dat knopen in lineair DNA naar buiten gleden als het DNA door de nanoporie ging. De meest opmerkelijke bevinding was echter dat de knopen extreem strak waren (<100 nm).

De implicaties van dit werk strekken zich uit tot elke toepassing waarbij lange polymeren betrokken zijn, evenals fundamentele studies van knopen in biologische systemen. “De aanwezigheid van knopen is in veel nanoporiëntoepassingen grotendeels genegeerd, omdat de beperkte resolutie van de metingen ons verhinderde ze waar te nemen”, legt Dekker uit. "Nu we hebben aangetoond dat de knopen er zijn, is het belangrijk om daar rekening mee te houden bij toepassingen, zoals de detectie van DNA-gebonden eiwit, en vooral bij het sonderen van lange DNA-lengtes."

"De aanwezigheid van knopen is in veel nanoporiëntoepassingen grotendeels genegeerd, omdat de beperkte resolutie van de metingen ons verhinderde ze te observeren"

Cristian Micheletti, een theoreticus en expert in polymeerknopen van de International School for Advanced Studies in Triëst, Italië, die niet betrokken was bij de studie, merkt op: "Dit bevestigt levendig de voorspelling dat, voor geëquilibreerde DNA-ketens, de meest waarschijnlijke knooplengte is relatief klein. De passage door de porie kan echter ook hebben bijgedragen aan het strakker worden van de knoop, zoals we hebben waargenomen in translocatiesimulaties van geknoopt, enkelstrengs DNA. Wat betreft een natuurlijke (zij het uitdagende) uitbreiding van dit werk, voegt Micheletti toe: "Ik hoop dat deze doorbraak in de nabije toekomst ook kan helpen bij het opsporen van enkelstrengs DNA-verstrengeling." Dit zou met name relevant zijn voor sequencing, waarvoor enkelstrengs DNA nodig is.


De structuur van DNA biedt een mechanisme voor erfelijkheid

Genen dragen biologische informatie die nauwkeurig moet worden gekopieerd voor overdracht aan de volgende generatie telkens wanneer een cel zich deelt om twee dochtercellen te vormen. Uit deze eisen komen twee centrale biologische vragen naar voren: hoe kan de informatie voor het specificeren van een organisme in chemische vorm worden vervoerd en hoe wordt deze nauwkeurig gekopieerd? De ontdekking van de structuur van de dubbele DNA-helix was een mijlpaal in de biologie van de twintigste eeuw omdat het onmiddellijk antwoorden op beide vragen suggereerde, waardoor het probleem van erfelijkheid op moleculair niveau werd opgelost. De antwoorden op deze vragen bespreken we in deze paragraaf kort en in de volgende hoofdstukken gaan we daar dieper op in.

DNA codeert informatie via de volgorde, of sequentie, van de nucleotiden langs elke streng. Elke base'x02014A, C, T of G'x02014 kan worden beschouwd als een letter in een vierletterig alfabet dat biologische boodschappen in de chemische structuur van het DNA beschrijft. Zoals we in hoofdstuk 1 zagen, verschillen organismen van elkaar omdat hun respectieve DNA-moleculen verschillende nucleotidesequenties hebben en bijgevolg verschillende biologische boodschappen uitdragen. Maar hoe wordt het nucleotide-alfabet gebruikt om berichten te maken, en wat beschrijven ze?

Zoals hierboven besproken, was het al lang voordat de structuur van DNA werd bepaald bekend dat genen de instructies bevatten voor het produceren van eiwitten. De DNA-berichten moeten daarom op de een of andere manier coderen voor eiwitten (Figuur 4-6). Deze relatie maakt het probleem meteen begrijpelijker, vanwege het chemische karakter van eiwitten. Zoals besproken in Hoofdstuk 3, worden de eigenschappen van een eiwit, die verantwoordelijk zijn voor zijn biologische functie, bepaald door zijn driedimensionale structuur, en zijn structuur wordt op zijn beurt bepaald door de lineaire volgorde van de aminozuren waaruit het is samengesteld. De lineaire volgorde van nucleotiden in een gen moet daarom op de een of andere manier de lineaire volgorde van aminozuren in een eiwit beschrijven. De exacte overeenkomst tussen het vierletterige nucleotide-alfabet van DNA en het twintigletterige aminozuuralfabet van eiwitten, de genetische code, is niet duidelijk uit de DNA-structuur, en het duurde meer dan tien jaar na de ontdekking van de dubbele helix voordat het werd uitgewerkt. In hoofdstuk 6 beschrijven we deze code in detail tijdens het uitwerken van het proces, bekend als genexpressie, waardoor een cel de nucleotidesequentie van een gen vertaalt in de aminozuursequentie van een eiwit.

Figuur 4-6

De relatie tussen genetische informatie in DNA en eiwitten.

De complete set informatie in het DNA van een organisme wordt het genoom genoemd en het bevat de informatie voor alle eiwitten die het organisme ooit zal synthetiseren. (De term genoom wordt ook gebruikt om het DNA te beschrijven dat deze informatie bevat.) De hoeveelheid informatie in genomen is onthutsend: een typische menselijke cel bevat bijvoorbeeld 2 meter DNA. Uitgeschreven in het vierletterige nucleotide-alfabet, beslaat de nucleotidesequentie van een heel klein menselijk gen een kwart van een pagina tekst (Figuur 4.7), terwijl de volledige reeks nucleotiden in het menselijk genoom meer dan duizend boeken zo groot als deze. Naast andere kritische informatie bevat het de instructies voor ongeveer 30.000 verschillende eiwitten.

Afbeelding 4-7

De nucleotidesequentie van het menselijke β-globine-gen. Dit gen draagt ​​de informatie voor de aminozuursequentie van een van de twee soorten subeenheden van het hemoglobinemolecuul, dat zuurstof in het bloed vervoert. Een ander gen, de α-globine (meer.)

Bij elke celdeling moet de cel zijn genoom kopiëren om het door te geven aan beide dochtercellen. De ontdekking van de structuur van DNA onthulde ook het principe dat dit kopiëren mogelijk maakt: omdat elke DNA-streng een sequentie van nucleotiden bevat die precies complementair is aan de nucleotidesequentie van zijn partnerstreng, kan elke streng fungeren als een sjabloon of schimmel , voor de synthese van een nieuwe complementaire streng. Met andere woorden, als we de twee DNA-strengen aanduiden als S en S′, kan streng S dienen als een sjabloon voor het maken van een nieuwe streng S′, terwijl streng S′ kan dienen als een sjabloon voor het maken van een nieuwe streng S (Figuur 4-8). De genetische informatie in DNA kan dus nauwkeurig worden gekopieerd door het prachtig eenvoudige proces waarbij streng S zich scheidt van streng S′, en elke gescheiden streng dient dan als een sjabloon voor de productie van een nieuwe complementaire partnerstreng die identiek is aan zijn vroegere partner.

Afbeelding 4-8

DNA als sjabloon voor zijn eigen duplicatie. Omdat nucleotide A alleen succesvol paren met T en G met C, kan elke DNA-streng de sequentie van nucleotiden in zijn complementaire streng specificeren. Op deze manier kan dubbel-helix DNA precies worden gekopieerd. (meer. )

Het vermogen van elke streng van een DNA-molecuul om te fungeren als een sjabloon voor het produceren van een complementaire streng stelt een cel in staat om te kopiëren, of repliceren, zijn genen alvorens ze door te geven aan zijn nakomelingen. In het volgende hoofdstuk beschrijven we de elegante machinerie die de cel gebruikt om deze enorme taak uit te voeren.


Levitt, M. J. molec. Biol. 104, 59–107 (1976).

Némethy, G. & Scheraga, H.A. Q. Rev. Biophys. 10, 239–352 (1977).

Skolnick, J. & Kolinski, A. J. molec. Biol. 221, 499–531 (1991).

Chan, HS & Dill, K.A. Natuurkunde vandaag 46, 24–32(1993).

Grosberg, A. & Nechaev, S. Adv. Polym. Wetenschap. 106, 1–29(1993).

Connolly, M.L. Kuntz, ID & Crippen, G.M. Biopolymeren 19, 1167–1182 (1980).

Crowell, Richard, H. & Fox, Ralph, H. Inleiding tot knopentheorie (Ginn, New York, 1963).

Burde, G. & Zieschang, H. knopen (de Gruyter, New York, 1985).

Rolfsen, D. Knopen en schakels (Publish or Perish, Berkeley, 1976).

Wu, F.Y. Rev. Mod. Fys. 64, 1099–1131 (1992).

Koniaris, K. & Muthukumar, M. J. chem. Fys. 95, 2873–2881 (1991).


Persbericht

Het is DNA, maar niet zoals we het kennen.

In een wereldprimeur hebben Australische onderzoekers een nieuwe DNA-structuur geïdentificeerd &ndash genaamd het i-motief &ndash in cellen. Het i-motief is een verwrongen lsquoknot' van DNA en is nog nooit eerder rechtstreeks in levende cellen gezien.

De nieuwe bevindingen, van het Garvan Institute of Medical Research, zijn vandaag gepubliceerd in het toonaangevende tijdschrift Natuur Chemie.

Diep in de cellen van ons lichaam ligt ons DNA. De informatie in de DNA-code &ndash alle 6 miljard A-, C-, G- en T-letters &ndash geeft nauwkeurige instructies over hoe ons lichaam is gebouwd en hoe het werkt.

De iconische &lsquo-dubbele-helix&rsquo-vorm van DNA heeft tot de publieke verbeelding geleid sinds 1953, toen James Watson en Francis Crick op beroemde wijze de structuur van DNA blootlegden. Het is nu echter bekend dat korte stukken DNA ook in andere vormen kunnen voorkomen, althans in het laboratorium en wetenschappers vermoeden dat deze verschillende vormen een belangrijke rol kunnen spelen in hoe en wanneer de DNA-code wordt "gelezen".

De nieuwe vorm ziet er heel anders uit dan de dubbelstrengs DNA dubbele helix.

"Als de meesten van ons aan DNA denken, denken we aan de dubbele helix", zegt universitair hoofddocent Daniel Christ (Head, Antibody Therapeutics Lab, Garvan), die mede-leider was van het onderzoek. &ldquoDit nieuwe onderzoek herinnert ons eraan dat er totaal verschillende DNA-structuren bestaan ​​&ndash en mogelijk belangrijk zijn voor onze cellen.&rdquo

&ldquoHet i-motief is een vierstrengige &lsquoknot&rsquo van DNA,&rdquo, zegt universitair hoofddocent Marcel Dinger (hoofd, Kinghorn Center for Clinical Genomics, Garvan), die samen met A/Prof Christ het onderzoek leidde.

&ldquoIn de knoopstructuur binden C-letters op dezelfde DNA-streng aan elkaar &ndash dit is dus heel anders dan een dubbele helix, waar &lsquo-letters op tegenovergestelde strengen elkaar herkennen, en waar C's binden aan Gs [guanines].&rdquo

Hoewel onderzoekers het i-motief eerder hebben gezien en in detail hebben bestudeerd, is het alleen getuige geweest in vitro Dat wil zeggen, onder kunstmatige omstandigheden in het laboratorium, en niet in cellen.

In feite hebben wetenschappers in het veld gedebatteerd of i-motief &lsquoknots&rsquo überhaupt zouden bestaan ​​in levende wezens & ndash een vraag die wordt opgelost door de nieuwe bevindingen.

Om de i-motieven in cellen te detecteren, ontwikkelden de onderzoekers een nauwkeurig nieuw hulpmiddel &ndash een fragment van een antilichaammolecuul &ndash dat specifiek i-motieven met een zeer hoge affiniteit kan herkennen en eraan kan hechten. Tot nu toe heeft het ontbreken van een antilichaam dat specifiek is voor i-motieven het begrip van hun rol ernstig belemmerd.

Cruciaal was dat het antilichaamfragment DNA in spiraalvorm niet detecteerde, en evenmin "quadruplexstructuren" (een structureel vergelijkbare vierstrengige DNA-rangschikking).

Met de nieuwe tool ontdekten onderzoekers de locatie van 'motieven' in een reeks menselijke cellijnen. Met behulp van fluorescentietechnieken om te bepalen waar de i-motieven zich bevonden, identificeerden ze talloze groene vlekken in de kern, die de positie van i-motieven aangeven.

&ldquoWat ons het meest opwindde, is dat we de groene vlekken &ndash de i-motieven &ndash in de loop van de tijd konden zien verschijnen en verdwijnen, zodat we weten dat ze zich vormen, oplossen en weer vormen,&rdquo, zegt dr. Mahdi Zeraati, wiens onderzoek de bevindingen van het onderzoek ondersteunt.

De onderzoekers toonden aan dat i-motieven zich meestal vormen op een bepaald punt in de cel&lsquo,levenscyclus&rsquo&ndash, de late G1-fase, wanneer DNA actief wordt&lsquogelezen&rsquo. Ze toonden ook aan dat er i-motieven voorkomen in sommige promotorregio's (gebieden van het DNA die bepalen of genen aan of uit worden gezet) en in telomeren, 'delen' van chromosomen die belangrijk zijn bij het verouderingsproces.

Dr Zeraati zegt: "We denken dat het komen en gaan van de i-motieven een aanwijzing is voor wat ze doen. Het lijkt waarschijnlijk dat ze er zijn om genen aan of uit te zetten en om te beïnvloeden of een gen actief wordt gelezen of niet.&rdquo

"We denken ook dat de voorbijgaande aard van de i-motieven verklaart waarom ze tot nu toe zo moeilijk op te sporen waren in cellen", voegt A/Prof Christ eraan toe.

A/Prof Marcel Dinger zegt: "Het is spannend om een ​​geheel nieuwe vorm van DNA in cellen te ontdekken en deze bevindingen zullen de weg vrijmaken voor een hele nieuwe impuls om te begrijpen waar deze nieuwe DNA-vorm echt voor is en of het gevolgen zal hebben voor de gezondheid." en ziekte.&rdquo

Aanbevolen papier: Mahdi Zeraati, David B. Langley, Peter Schofield, Aaron L. Moye, Romain Rouet, William E. Hughes, Tracey M. Bryan, Marcel E. Dinger en Daniel Christ. In de kernen van menselijke cellen worden I-motief DNA-structuren gevormd. Natuurchemie DOI 2018: 10.1038/s41557-018-0046-3

Steun: Dit werk werd ondersteund door de National Health and Medical Research Council (Australië) en de Australian Research Council.


DNA KNOPEN EN SUPECOILING

Knopen evenwicht

Een belangrijke vraag met betrekking tot het samenspel van DNA-supercoiling en DNA-knotting is hoe het knoopevenwicht wordt beïnvloed door DNA-supercoiling. Laten we, om het concept van knoopevenwicht uit te leggen, eerst een denkbeeldige situatie beschouwen, waar torsie-ontspannen, sterk verdunde circulaire DNA-moleculen van een bepaalde grootte thermische fluctuaties ondergaan, waarbij ideale type II DNA-topoisomerasen intersegmentale passages mogelijk maken wanneer twee DNA-segmenten met elkaar botsen. . Een dergelijke reactie zal een knoopevenwicht bereiken wanneer nieuwe rondes van passages evenveel kans hebben om nieuwe DNA-knopen te vormen als om ze ongedaan te maken, en naarmate de reactie verder vanaf dit punt voortgaat, zal de fractie moleculen die verknoopt zijn redelijk constant blijven. Omdat DNA-DNA-passages gemedieerd door DNA-topoisomerasen in werkelijkheid niet-willekeurig zijn, werd het knoopevenwicht meestal bereikt in experimenten waarbij lineaire DNA-moleculen een langzame cyclisatiereactie ondergingen vanwege het uitgloeien van hun lange samenhangende uiteinden. Bij zo'n annealing raken sommige moleculen verknoopt en wordt aangenomen dat de fractie verknoopte moleculen dezelfde is als die verkregen bij knoopevenwicht als gevolg van vrije doorgangen (35, 36). Verschillende biochemische en numerieke onderzoeken bevestigden het intuïtieve idee dat het aantal knopen bij het knoopevenwicht toeneemt met de ketengrootte van DNA-moleculen en afneemt met toenemende elektrostatische afstoting tussen DNA-segmenten, wat op zijn beurt afhangt van de concentratie van de tegenionen (35-37). Laten we nu eens kijken hoe het knoopevenwicht verandert wanneer het bestudeerde DNA actief in een supercoiled vorm wordt gehouden, zoals het geval is in levende bacteriële cellen. We beschouwen een hypothetische, geïdealiseerde situatie waarin bacterie Topo IV intersegmentale passages uitvoert die kunnen leiden tot knopen of losraken wanneer twee DNA-segmenten met elkaar botsen (in werkelijkheid, zoals hieronder besproken, zijn de passages die door Topo IV worden gemedieerd selectief en afhankelijk van de ruimtelijke rangschikking van de DNA-segmenten). Bovendien zijn we van mening dat DNA-gyrase en Topo I de mogelijke afname of toename van DNA-torsiestress als gevolg van knoopvorming compenseren door het initiële niveau van torsiestress dat typisch is voor natuurlijke DNA-supercoiling te herstellen. Zal het steady-state knoopevenwicht onder dergelijke omstandigheden resulteren in een hogere of lagere fractie van verknoopte DNA-moleculen dan bij het knoopevenwicht met torsierelaxeerde DNA-moleculen?

studies van in vivo gevormde knopen in Escherichia coli onthulde dat pBR322-plasmiden gegroeid in E coli stammen met defect DNA-gyrase waren tot 10 keer vaker geknoopt dan plasmiden die in wildtype stammen waren gekweekt (38). Aangezien DNA-gyrase verantwoordelijk is voor het handhaven van het DNA in een supercoiled vorm en niet de ontknopende topoisomerase is per se, zoals Topo IV is ( 39), geeft dit resultaat een sterke aanwijzing dat DNA-supercoiling Topo IV helpt om het DNA in levende bacteriële cellen ongeknoopt te houden. Het effect van supercoiling op ontknoping werd ook onderzocht in vitro door het ontknopen van supercoiled en non-supercoiled DNA-moleculen te vergelijken met Topo IV (39), d.w.z. het enzym waarvan wordt aangenomen dat het verantwoordelijk is voor DNA-ontknoping en decatenatie van DNA in E coli. De auteurs van die studie kwamen tot de conclusie dat DNA-supercoiling de snelheid van ontknoping bij Topo IV niet noemenswaardig verhoogt (39). Een nadere beschouwing van de gepresenteerde gegevens laat echter duidelijk zien dat, hoewel complexe DNA-knopen door Topo IV even snel in eenvoudigere knopen leken te worden omgezet, ongeacht of ze supercoiled waren of niet, het losmaken van minder complexe knopen, zoals klaverknopen, duidelijk was. gestimuleerd door DNA-supercoiling, terwijl klaverknopen zich opstapelden toen Topo IV inwerkte op een mengsel van complexe DNA-knopen die niet supercoiled waren [zie figuur 7 in ref. (39)]. Een waarschijnlijke verklaring voor dit gedrag is dat de aanwezigheid van eenvoudige knopen in niet-supercoiled DNA-moleculen geen voldoende energiegradiënt produceert die tot ontknoping kan leiden, en daarom moet deze gradiënt worden versterkt door DNA-supercoiling. Voor complexe knopen is de energiewinst als gevolg van een strengpassage die leidt tot vereenvoudiging van knopen echter voldoende groot om deze passages te sturen, zelfs in de afwezigheid van DNA-supercoiling.

Energetische componenten van het samenspel tussen DNA-knopen en supercoiling

Zoals hierboven besproken, in vivo en in vitro studies ondersteunen het idee dat DNA-supercoiling DNA-knoping remt. Deze remming is echter mogelijk niet gerelateerd aan een verandering van de vrije-energiegradiënt die is geïntroduceerd door DNA-supercoiling, maar is eerder het resultaat van ATP-consumerende Topo IV-actie die de vrije energiegradiënt van DNA-moleculen niet hoeft te volgen. Om precies te zijn, DNA-supercoiling zou Topo IV kunnen helpen bij het kiezen van de passages die leiden tot ontknoping, zelfs als deze niet de vrije energiegradiënt van het systeem volgden. Daarom vertellen de hierboven besproken onderzoeken ons niet echt of DNA-supercoiling de energiegradiënt verandert op een manier die DNA-knopen ongunstig beïnvloedt. Echter, simulatiestudies, waarbij men de energie en de topologie van de gemodelleerde DNA-moleculen kan beheersen, en waar men ook de voorwaarde kan stellen dat passages plaatsvinden ongeacht een bepaalde ruimtelijke ordening van botsende segmenten, zou ons deze informatie kunnen verschaffen.

Het is intrigerend dat twee verschillende simulatiestudies die het effect van DNA-supercoiling op DNA-knopen onderzochten, tot de tegenovergestelde conclusies kwamen. Terwijl Podtelezhnikov et al. (11) concludeerde dat DNA-supercoiling DNA-knoping stimuleerde, Burnier et al. ( 40) concludeerde het tegendeel. Laten we de redenen van die discrepantie onderzoeken. Beide onderzoeken gebruikten een zeer vergelijkbare Metropolis-Monte Carlo-simulatiemethode die rekening houdt met de elastische eigenschappen van DNA en de effectieve diameter van het DNA (4). Tijdens de Metropolis-Monte Carlo-simulatieprocedure veranderen de gemodelleerde moleculen voortdurend van vorm en verkennen ze de beschikbare configuratieruimte. Dit laatste kan worden gezien als het geheel van alle mogelijke configuraties van de elastische keten onder invloed van thermische agitatie, en uiteraard zullen in dat ensemble energetisch gunstige configuraties vaker voorkomen. Daarom, als het knopen van supercoiled moleculen energetisch gunstig zou zijn, zou men een sterke neiging moeten waarnemen van supercoiled DNA-moleculen om te worden geknoopt. Thermische beweging kan op zichzelf geen twee DNA-segmenten door elkaar laten gaan. Om de werking van DNA-topoisomerasen te verklaren, moet men daarom tijdens de simulatie segmentbewegingen toestaan ​​die leiden tot strengpassages, en dus mogelijk tot knopen of losmaken. Als intersegmentale passages echter zijn toegestaan ​​zonder enige beperking met betrekking tot de topologische toestand van de moleculen, ontspannen de gesimuleerde supercoiled DNA-moleculen snel. Dit maakt de simulaties ongeldig die gericht zijn op het testen van het effect van het handhaven van het DNA in supercoiled vorm op de neiging van DNA-moleculen om geknoopt of ongeknoopt te raken.

Verschillende eerdere simulatiestudies toonden aan dat bij het instellen van een vaste ΔLk (het verschil tussen de werkelijke Lk van de gemodelleerde moleculen en hun Lk0), en bij het toestaan ​​van intersegmentale passages die niet resulteerden in de vorming van knopen, behielden de gesimuleerde supercoiled DNA-moleculen hun oorspronkelijke supercoiling en bemonsterden ze zelfs op een efficiëntere manier de configuratieruimte in vergelijking met simulaties waarin intersegmentale passages niet waren toegestaan ​​(4) . Met deze techniek leken gesimuleerde configuraties van supercoiled DNA-moleculen bijvoorbeeld op die waargenomen door elektronenmicroscopie (41). Podtelezjnikov et al. ( 42), lieten in hun simulaties die de wisselwerking tussen DNA-supercoiling en DNA-knopen onderzochten, ook deze bewegingen toe die resulteerden in passages van niet-geknoopt naar knopen en vice versa, terwijl de ΔLk gefixeerd bleef. Met die instelling raakten de gesimuleerde supercoiled DNA-moleculen steeds meer geknoopt en vormden linkshandige torusknopen met toenemende complexiteit. Op basis hiervan concludeerden de auteurs dat DNA-moleculen die de ΔLk kenmerkend houden voor negatief supercoiled DNA-moleculen de neiging zouden hebben om passages te ondergaan die leiden tot de vorming van linkshandige torusknopen.

Dat zou inderdaad het geval zijn geweest als door Topo II gemedieerde passages het aantal DNA-moleculen bij elke intramoleculaire passage niet zouden veranderen. We weten echter dat door topo II gemedieerde passage van niet-geknoopte DNA-moleculen naar linkshandige klaverbladknopen de verlaging van het koppelingsgetal met 2 noodzakelijk maakt. Dus als men bijvoorbeeld begint met een supercoiled molecuul met ΔLk = −5 en een noodzakelijke passage zou uitvoeren leidend tot de vorming van een linkshandige klaverknoop, zou de ΔLk van dat molecuul veranderen in −7 (Figuur 3A). Bijgevolg zou een echte passage energetisch niet gunstig zijn in tegenstelling tot een denkbeeldige topo II-gemedieerde passage met onrealistische eigenschap om de ΔLk constant te houden (Figuur 3A). Bovendien, zelfs als de realistische passage heeft plaatsgevonden, zou DNA-gyrase daarna optreden om het vorige niveau van torsiespanning te herstellen, wat het molecuul in de staat zou duwen met de ΔLk die ∼−8.41 oscilleert. (Figuur 3A) Dit is het gevolg van de formule: Lk = Tw + Wr en het feit dat de Wr van een torsiestijf ontspannen linkshandige klaverknoop -3,41 ( 43) is. Daarom is de Lk0 in torsie-ontspannen linkshandige klaverknopen is kleiner dan in torsie-ontspannen niet-genoteerde DNA-moleculen. Om rekening te houden met de verandering van Lk0 wegens knopen, Burnier et al. ( 40) introduceerde het concept van de effectieve ΔLk (ΔLke), wat het verschil in koppelgetal is tussen de Lk0 van een torsiestijf ontspannen knoop van een bepaald type met inbegrip van de niet-geknoopte knoop en de werkelijke Lk van het gemodelleerde DNA dat hetzelfde knooptype vormt. Wanneer gemodelleerde moleculen het knooptype mogen veranderen maar dezelfde ΔLke behouden, blijft hun torsiespanning ongeveer behouden. Simulaties uitgevoerd onder dergelijke omstandigheden onthulden dat supercoiling intersegmentale passages naar ontknoping leidt, aangezien de laagste energietoestand van DNA-moleculen met een gegeven ΔLke wordt bereikt voor niet-geknoopte DNA-moleculen, en dit is onafhankelijk van het feit of de gevormde knopen links- of rechtshandig zijn ( 40). Hier moet echter worden vermeld dat simulaties die zijn uitgevoerd onder omstandigheden die dezelfde ΔLke behouden voor en na passages die leiden tot knoopvorming, gebaseerd zijn op de onrealistische veronderstelling dat de torsiespanning onmiddellijk na de passage wordt hersteld, terwijl het in werkelijkheid zal duren enige tijd totdat de homeostatische mechanismen die het niveau van torsiespanning regelen, het oorspronkelijke niveau van torsiespanning zullen herstellen (27). De tweede veronderstelling is dat door topoisomerase gemedieerde passages worden aangedreven door de vrije energiegradiënt, terwijl in werkelijkheid type II DNA-topoisomerasen de energie van ATP-hydrolyse koppelen aan de uitgevoerde passage en kunnen werken tegen de vrije energiegradiënt (26). Deze aannames zijn echter nodig om het belang te evalueren van energetische overwegingen bij de studie van het evenwicht in de evenwichtstoestand in de aanwezigheid van homeostatische mechanismen die een quasi constant niveau van DNA-torsiespanning in supercoiled DNA handhaven.

DNA-knopen, supercoiling en de geometrische chiraliteit. (EEN) Vergelijking van de elastische energieën van gesimuleerde negatief supercoiled DNA-moleculen met 3000 bp die ofwel ongeknoopt waren of linkshandige klaverbladknopen vormden [de energiegrafiek is gereproduceerd uit ref. ( 40)]. ΔLk verwijst naar het verschil tussen het werkelijke aantal geknoopte of niet-geknoopte DNA-moleculen en dat van torsiestijf ontspannen, niet-geknoopte DNA-moleculen. De lichtblauwe pijl geeft het energieverschil aan tussen ongeknoopte en geknoopte DNA-moleculen met dezelfde ΔLke. The dark blue arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules resulting from one round of a Topo II-like action. The black arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules under the unrealistic assumption that topoisomerase II could mediate an intramolecular passage reaction without changing the linking number. Note that left-handed trefoil knots reach their minimal energy state for ΔLk ≈3.5 and that this closely corresponds to the average writhe of torsionally relaxed left-handed trefoil knots ( 43) (shown in the inset). For the convenience of the presentation the figure shows three different energetic consequences of formation of left-handed trefoil knot starting from unknotted DNA molecules that were kept at their supercoiling equilibrium at ΔLk ≈ −5. However, natural supercoiling of 3000 bp-long DNA would rather keep the unknotted molecules at ΔLk ≈−15. Therefore, at physiological level of negative supercoiling the passages leading to knot formation will be much stronger opposed by the free energy gradient than for the case analysed here. (B) The concept of geometrical chirality. To determine the geometrical chirality of a crossing one looks what is the smallest rotation of the overlying segment that brings it parallel with the underlying one. If that rotation is clockwise the crossing is left-handed and it is right-handed otherwise. (C) Knot 52L with indicated geometrical chirality of their crossings. An intersegmental passage at any of left-handed crossing will unknot the knot, while a passage at any of right-handed crossings will convert the 52L knot into 31L knot.

DNA knots, supercoiling and the geometric chirality. (EEN) Comparison of the elastic energies of simulated negatively supercoiled DNA molecules with 3000 bp that were either unknotted or formed left-handed trefoil knots [the energy graph is reproduced from ref. ( 40)]. ΔLk refers to the difference between the actual linking number of knotted or unknotted DNA molecules and that of torsionally relaxed unknotted DNA molecules. The light blue arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules with the same ΔLke. The dark blue arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules resulting from one round of a Topo II-like action. The black arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules under the unrealistic assumption that topoisomerase II could mediate an intramolecular passage reaction without changing the linking number. Note that left-handed trefoil knots reach their minimal energy state for ΔLk ≈3.5 and that this closely corresponds to the average writhe of torsionally relaxed left-handed trefoil knots ( 43) (shown in the inset). For the convenience of the presentation the figure shows three different energetic consequences of formation of left-handed trefoil knot starting from unknotted DNA molecules that were kept at their supercoiling equilibrium at ΔLk ≈ −5. However, natural supercoiling of 3000 bp-long DNA would rather keep the unknotted molecules at ΔLk ≈−15. Therefore, at physiological level of negative supercoiling the passages leading to knot formation will be much stronger opposed by the free energy gradient than for the case analysed here. (B) The concept of geometrical chirality. To determine the geometrical chirality of a crossing one looks what is the smallest rotation of the overlying segment that brings it parallel with the underlying one. If that rotation is clockwise the crossing is left-handed and it is right-handed otherwise. (C) Knot 52L with indicated geometrical chirality of their crossings. An intersegmental passage at any of left-handed crossing will unknot the knot, while a passage at any of right-handed crossings will convert the 52L knot into 31L knot.

Geometric components of the interplay between DNA supercoiling and DNA knotting

The free energy gradient provided by DNA supercoiling helps to guide DNA topoisomerases towards efficient unknotting, but this is not sufficient to explain the complexity of the interplay between DNA supercoiling, knotting and catenation. If DNA topoisomerases were simply catalysing reactions along the free energy gradient, then supercoiled DNA molecules in living bacterial cells would be subject to topoisomerase-mediated reactions leading to their rapid torsional relaxation. So for example, bacterial type I DNA topoisomerases, which perform passages of one strand through the other, would relax the torsional stress in supercoiled DNA. However, as the negative torsional stress is required for normal functioning of bacterial DNA, a metabolic short circuit would appear in this case, with type I topoisomerases constantly relaxing negatively supercoiled DNA molecules and with many molecules of DNA gyrase using ATP to re-establish the original level of negative supercoiling. Such a metabolic short-circuit would exhaust the cellular pool of ATP, and is in reality avoided trough molecular mechanisms that evolved to ensure that bacterial type I topoisomerases are only activated by an excessive torsional stress of the DNA or by the appearance of atypical DNA structures ( 27). The excessive torsional stress can be directly sensed at the local DNA level by the facility of strand separation, for example, and this provides the molecular basis of the mechanism protecting normally supercoiled DNA from the action of type I topoisomerases ( 27).

However, it seems more difficult to imagine molecular mechanisms that make naturally supercoiled DNA very good substrate for Topo IV-mediated passages leading to decatenation and unknotting but not to relaxation of negative supercoils ( 39). Since DNA topoisomerases are relatively small compared to overall dimensions of plasmid or chromosomal DNA, they can only distinguish between some local features that are characteristic for unperturbed negatively supercoiled DNA and these that appear in DNA molecules that are knotted and catenated. If there are such structural differences, then type II DNA topoisomerases could have acquired during the evolution the capacity to act preferentially on the DNA–DNA juxtapositions arising due to knotting or catenation, but not on those arising due to negative supercoiling.

Single molecule studies investigating the action of bacterial topoisomerase IV on braided DNA molecules revealed that it acts preferentially on left-handed braids having a local segment juxtaposition geometry similar to that of positively supercoiled DNA, while it leaves right-handed braids, comparable to negative supercoils, practically untouched (see Figure 3 for the explanation of the geometrical chirality of DNA–DNA juxtapositions) ( 44– 46). These observations made a perfect sense as they explained why DNA molecules that are negatively supercoiled are practically immune to Topo IV relaxation, while positive supercoiling that arises during DNA replication can be efficiently relaxed by Topo IV, permitting further progression of the replication forks ( 47). Comparing DNA–DNA juxtapositions in positively- and negatively-supercoiled DNA, one notices that both types have a hooked character ( 48) but can be distinguished by the opposite geometric chirality of winding of juxtaposing segments ( 45, 46).

It is important to mention here the difference between topological and geometric chirality. To determine the topological chirality one needs to operate with the concept of oriented curves and be aware in which direction the imaginary orientation vectors are pointing when two segments of DNA contact each other. Clearly, enzymes cannot recognize imaginary vectors. However, enzymes can recognize geometrical chirality of crossings if their DNA binding sites are arranged in such a way that, when the first DNA molecule is bound, the second can be bound on top of it but only at a certain relative inclination angle with respect to the already bound DNA segment. Depending on that angle, the enzyme may preferentially interact with DNA segments that wind around each other in left- or right-handed way ( 49, 50). In negatively supercoiled DNA the topological sign of perceived intramolecular crossings is negative, however, the opposing DNA segments of negatively supercoiled DNA molecules wind around each other in a right-handed way. The left-handed direction of winding is then characteristic for the juxtapositions in positively supercoiled DNA molecules ( Figure 4) and those are preferentially recognized by Topo IV.

Topological transitions during replication of circular DNA. (EEN) Supercoiled DNA that just started its process of DNA replication. The molecule is still negatively supercoiled and shows right-handed interwinding. The negative supercoiling helps to initiate the process of DNA replication ( 7). (B) Partially replicated DNA molecule with positive torsional stress causing formation of left-handed interwinding in the unreplicated portion and of right-handed interwinding of precatenanes in the replicated portion. The left-handed interwinding can be easily relaxed by DNA gyrase or by topoisomerase IV. Right-handed interwinding is a poor substrate for the relaxation reaction by Topo IV. (C) Standard representation of freshly replicated molecules forming multiply interlinked DNA catenanes. All crossings in this representation have right-handed chirality but this representation is not the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. (NS) Schematic presentation of the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. Minimization of the elastic energy of multiply interlinked catenanes leads to the formation of a left-handed folding of the entire catenanes ( 21, 78). This folding leads to the apparition of left-handed DNA–DNA juxtapositions that are very good substrates for Topo IV-mediated passages that lead to decrease of DNA catenation. (E) Catenanes with decreasing number of interlinks. Individual rings get supercoiled by DNA gyrase, and left-handed crossings may form in the region deformed by the extrusion of supercoils. (F) Singly interlinked catenanes have a complete freedom to form left-handed juxtapositions. Supercoiling provides the necessary ‘pressure’ leading to unlinking. The representations of DNA molecules at different steps of DNA replication are not shown at the same scale but their size was chosen in order to make important points clear. However, all the drawings correspond to sequential stages of DNA replication of a molecule with 800 bp.

Topological transitions during replication of circular DNA. (EEN) Supercoiled DNA that just started its process of DNA replication. The molecule is still negatively supercoiled and shows right-handed interwinding. The negative supercoiling helps to initiate the process of DNA replication ( 7). (B) Partially replicated DNA molecule with positive torsional stress causing formation of left-handed interwinding in the unreplicated portion and of right-handed interwinding of precatenanes in the replicated portion. The left-handed interwinding can be easily relaxed by DNA gyrase or by topoisomerase IV. Right-handed interwinding is a poor substrate for the relaxation reaction by Topo IV. (C) Standard representation of freshly replicated molecules forming multiply interlinked DNA catenanes. All crossings in this representation have right-handed chirality but this representation is not the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. (NS) Schematic presentation of the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. Minimization of the elastic energy of multiply interlinked catenanes leads to the formation of a left-handed folding of the entire catenanes ( 21, 78). This folding leads to the apparition of left-handed DNA–DNA juxtapositions that are very good substrates for Topo IV-mediated passages that lead to decrease of DNA catenation. (E) Catenanes with decreasing number of interlinks. Individual rings get supercoiled by DNA gyrase, and left-handed crossings may form in the region deformed by the extrusion of supercoils. (F) Singly interlinked catenanes have a complete freedom to form left-handed juxtapositions. Supercoiling provides the necessary ‘pressure’ leading to unlinking. The representations of DNA molecules at different steps of DNA replication are not shown at the same scale but their size was chosen in order to make important points clear. However, all the drawings correspond to sequential stages of DNA replication of a molecule with 800 bp.

The geometry of positively supercoiled DNA favours not only left-handed crossings of the formed DNA–DNA juxtapositions but also hooking of contacting DNA segments. Interestingly, the preferential action of type II DNA topoisomerases on hooked juxtapositions was also proposed as the mechanism that explained the seminal experiment by Rybenkov et al. ( 30, 51). This experiment demonstrated that type II DNA topoisomerases acting in vivo on torsionally relaxed DNA keep the level of DNA knotting and catenation much below the topological equilibrium that would have arisen if the passages were simply driven by the free energy gradient ( 30). Type II DNA topoisomerases couple their DNA–DNA passage reaction to ATP hydrolysis and therefore there is no violation of thermodynamic principles connected to the fact that action of type II DNA topoisomerases on a statistical set of plasmid DNA molecules can push this set out of its lowest free-energy state. However, it was very intriguing how DNA topoisomerases, that can only sense local information, may get hints whether performing a DNA–DNA passage in a given place will rather unknot the DNA than lead to DNA knotting.

Several complex mechanisms were proposed over the years to explain how DNA topoisomerases could get these hints: the active sliding model ( 30), the kinetic proofreading ( 52) or the three-site interaction ( 53). While some of these models were incompatible with the known properties of type II topoisomerases (active sliding model), the other models seemed to be unnecessarily complex (kinetic proofreading, three site interaction). In 2002 Vologodskii et al. ( 51) proposed a model according to which type II DNA topoisomerases were actively bending the DNA in the so called G region (G stands for the gate as that DNA region will be later cut and will serve as a gate for the passage of transferred segment known as T segment). According to that model, the DNA topoisomerase was placing itself in the bend in such a way that the T segment could only be transferred if it approached the G region from the inside of the bend. As a consequence, the topoisomerase was providing directionality for the passage of the T segment from the inside to the outside of the strongly bent DNA loop with the G site in its centre. Simulations performed to test this model revealed that this relatively simple mechanism permits a 10-fold reduction of the knotting level below the topological equilibrium ( 51). However, biochemical experiments using Topo IV from E coli showed ∼50-fold reduction of the knotting level below the topological equilibrium and therefore the mechanism proposed by Vologodskii et al. was not sufficient to explain the observed effect.

In 2004, a theoretical paper by Buck and Zechiedrich proposed that type II topoisomerases can keep a very low steady-state level of DNA knotting and of DNA catenation by preferentially acting on inter-hooked juxtapositions and performing passages there ( 48, 54). The idea behind that model was that, in freely fluctuating, torsionally relaxed DNA, the interhooked juxtapositions form preferentially in the region where DNA is knotted or catenated ( 48, 54). For entropic reasons the knotted domains in freely fluctuating knotted polymers tend to be rather tight ( 55, 56) and this favours that hooked juxtapositions form there. Indeed, simulation studies using polygons confined to a cubic lattice confirmed that preferential action on hooked juxtapositions can decrease the level of knotting by ∼50 times as compared to random passages ( 57). Also, simulations performed using polygonal chains off-lattice revealed that selection of interhooked juxtapositions can result in a reduction of the knotting level as strong as that observed experimentally ( 58).

The hooked juxtapositions proposed by Buck and Zechiedrich ( 48) and tested in simulations by Liu et al. ( 57, 59) were not assumed to wind in a right- or left-handed way but were modelled as achiral, interhooked juxtapositions where the planes of hooking were perpendicular to each other. Such achiral hooked juxtapositions were sufficient to explain the experiment by Rybenkov et al. ( 30) where the tested DNA was not supercoiled. However, even for unsupercoiled DNA there were other experiments requiring a chirality criteria to explain the observed results. Mann et al. ( 60) reported that human topoisomerase IIα has the very interesting ability to unknot left-handed five crossing twist knots (with the topological notation 52L) in just one passage. These results were puzzling since, even if DNA topoisomerases could specifically recognize hooked juxtapositions resulting from tight knotting of 52 knot, there are possibilities of forming five such juxtapositions and only passages occurring at two of them could lead to a direct conversion of the 52 knot into an unknot ( 61). The question arose then what structural difference could exist between DNA–DNA juxtapositions at these two different types of crossings in freely fluctuating DNA forming 52L knots?

Burnier et al. ( 58) used numerical simulations to test whether, by recognizing and performing passages within inter-hooked juxtapositions in which opposing segments wind around each other in a left-handed way ( Figure 3), the topoisomerases could unknot 52L knots by performing just one passage. The simulations showed that this criteria was indeed very efficient in favouring unknotting of the 52L knot by a single topo II-mediated passage ( 58). In addition, the preferential action on inter-hooked juxtapositions with left-handed character explains also the mechanism by which human topoisomerase IIα relaxes positively supercoiled DNA molecules at least 10 times faster than negatively supercoiled ones ( 62).

Additional support for the hooking model was provided recently by crystallographic analysis of Topo IV DNA complexes ( 63). In these complexes, the DNA to which the topoisomerase is bound (G segment) is strongly bent in the direction consistent with the models proposing that Topo IV induces DNA bends ( 51, 64) or that it preferably binds hooked juxtapositions ( 48, 54). The observation mentioned earlier that plasmids isolated from bacterial strains with defective gyrase are frequently knotted ( 38) is consistent with the interpretation that DNA supercoiling may help Topo IV to distinguish better DNA juxtapositions that are due to knotting from other DNA juxtapositions.

As mentioned earlier, bacterial topoisomerases evolved in such a way that negatively supercoiled DNA molecules are protected against their relaxing activity. In the case of Topo IV, this protection is ensured by the chirality sensing mechanism explained above ( 44– 46): right-handed juxtaposition present in negatively supercoiled DNA are practically immune to its action, whereas left-handed juxtapositions that are predominant in positively supercoiled DNA are very efficiently recognized by Topo IV and are substrate of processive passage reactions ( 44– 46, 65). Presumably, when knots are present in negatively supercoiled DNA molecules they promote formation of DNA–DNA juxtapositions with geometries that are somewhat different than the typical geometry of DNA–DNA juxtapositions in negatively supercoiled DNA. This is certainly the case of DNA molecules forming left-handed trefoil knots whose crossings have a natural tendency to form left-handed dsDNA–dsDNA juxtapositions. However, also DNA molecules forming right-handed trefoil knots, despite their preference to form right-handed dsDNA–dsDNA crossings, may in fact promote formation of juxtapositions that are more hooked or have somewhat different inclination angle than these normally present in negatively supercoiled DNA. In such a case also these knots may be efficiently unknotted by Topo IV action while regular DNA–DNA juxtapositions due to negative supercoiling would not serve as substrates of Topo IV.


Computer model unravels knotty problems in DNA

If you've ever tried to untangle a pair of earbuds, you'll understand how loops and cords can get twisted up. DNA can get tangled in the same way, and in some cases, has to be cut and reconnected to resolve the knots. Now a team of mathematicians, biologists and computer scientists has unraveled how E coli bacteria can unlink tangled DNA by a local reconnection process. The math behind the research, recently published in Scientific Reports, could have implications far beyond biology.

E. coli bacteria can cause intestinal disease, but they are also laboratory workhorses. E coli's genome is a single circle of double-stranded DNA. Before an E coli cell divides, that circle is copied. Opening up the double helix to copy it throws twisting strains elsewhere down the molecule -- just as uncoiling a cord in one place will make it over-coil somewhere else. The process results in two twisted loops of DNA that pass through each other like a "magic rings" trick.

To separate the rings, E coli uses an enzyme called topoisomerase IV, which precisely cuts a DNA segment, allows the loops to pass through the break and then reseals the break. Because topoisomerase IV is so important to bacteria, it's a tempting target for antibiotics such as ciprofloxacin. But when topoisomerase IV is absent, another enzyme complex can step in to carry out this unlinking, although less efficiently. This complex introduces two breaks and unlinks by reconnecting the four loose ends.

"There are other ways to unlink the rings, but how do they do it?" said Mariel Vazquez, professor of mathematics and of microbiology and molecular genetics at the University of California, Davis.

One pathway, Vazquez said, is that the reconnection enzymes remove one link at a time until they get to zero. That solution was favored by the biologists.

But mathematicians look at the problem slightly differently. They understand the DNA as a flexible curve in three-dimensional space. Certain points on the curve can be broken and reconnected. To a mathematician, there are many potential routes for reconnection processes to work -- including some where the number of links actually goes up before going back down.

"These are all the same to a mathematician, but not to a biologist," Vazquez said. To determine the most likely route and resolve the problem, they turned to computational modeling.

Vazquez and colleagues developed computer software with DNA represented as flexible chains to model the possible locations where reconnection enzymes could cut and reconnect the chains. Overall, they modeled millions of configurations representing 881 different topologies, or mathematical shapes, and identified hundreds of minimal pathways to get two DNA circles linked in up to nine places down to two separate circles.

The computer model confirmed the biologists' hunch: Undoing one link at a time is the preferred route to separate the circles of DNA.

The results could have implications far beyond DNA biology, Vazquez said. There are other examples in nature of objects that collide, break and reconnect -- like the dynamics of linked fluid vortices, or the patterns formed by smoke rings, for example. When solar flares are ejected from the sun, powerful magnetic field lines cross and reconnect.

"The math is not DNA specific, and the computation can be adapted," Vazquez said.


Abstract

Various site-specific recombination enzymes produce different types of knots or catenanes while acting on circular DNA in vitro en in vivo. By analysing the types of knots or links produced, it is possible to reconstruct the order of events during the reaction and to deduce the molecular “architecture” of the complexes that different enzymes form with DNA. Until recently it was necessary to use laborious electron microscopy methods to identify the types of knots or catenanes that migrate in different bands on the agarose gels used to analyse the products of the reaction. We reported recently that electrophoretic migration of different knots and catenanes formed on the same size DNA molecules is simply related to the average crossing number of the ideal representations of the corresponding knots and catenanes. Here we explain this relation by demonstrating that the expected sedimentation coefficient of randomly fluctuating knotted or catenated DNA molecules in solution shows approximately linear correlation with the average crossing number of ideal configurations of the corresponding knots or catenanes.


Bekijk de video: TPS Penalaran Umum: Simpulan dari Pernyataan - Bahas Soal - Persiapan UTBK Quipper Video (Januari- 2022).