Informatie

Hoe helpt GTP bij de stap van codonherkenning?


Het anticodon van een binnenkomend tRNA-basenparen met het complementaire mRNA-codon in de A-plaats. Hydrolyse van GTP verhoogt de efficiëntie en nauwkeurigheid van deze stap. Hoe doet GTP dat?


Op GTP gebaseerde structurele veranderingen (zelfs motorische acties) komen veel voor in biologische systemen. Voor bijv. G-eiwitten, Rab-GTPase (vesiculair transport), Ran-GTPase (nucleaire export/import).

Dus al deze GTP-gebonden eiwitten maken gebruik van een intrinsieke of geassisteerde GTPase-activiteit om GTP om te zetten in GDP. Deze omzetting veroorzaakt verandering in de structuur van het bijbehorende eiwit. Om terug te gaan naar de GTP-gebonden vorm zijn eiwitten nodig die GEF (Guanine nucleotide Exchange Factors) worden genoemd.

Dus in het geval van translatieverlenging, is de verlengingsfactor een GTPase die de bevestiging verandert bij GTP-hydrolyse. Deze bevestigingsverandering verdraait het tRNA zodat het gebonden aminozuur dichter bij het peptidyl-transferasecentrum komt (als de P-site zich aan de linkerkant bevindt, is het aminozuur aan de rechterkant gebondenCCAstaart van tRNA. De draai zorgt ervoor dat het aminozuur naar links beweegt - naar de P-site).

U kunt boeken zoals Genes van Lewin raadplegen voor details.


Essay over mRNA (voor universiteits- en medische studenten) | Biologie

Bent u op zoek naar een essay over 'Translation of mRNA and Its Types'? Vind paragrafen, lange en korte essays over 'Vertaling van mRNA en zijn typen', speciaal geschreven voor universiteits- en medische studenten.

Essay # 1. Inleiding tot de vertaling van mRNA:

Vertaling is een proces waarbij genetische informatie wordt vertaald uit een “nucleïnezuur lan­guage” in een “aminozuurtaal”. Het wordt gekatalyseerd door ribosoom, dat eiwitten en ribosomaal RNA (rRNA) bevat. Translatie is een RNA-gerichte synthese van polypeptiden. Dit proces vereist alle drie de klassen van RNA, mRNA, rRNA en transfer-RNA (t-RNA) die kunnen binden aan drie basenpaarcodons op een boodschapper-RNA (mRNA) en ook het juiste aminozuur dragen dat door het codon wordt gecodeerd. De chemie van de vorming van peptidebindingen is relatief eenvoudig, de processen die leiden tot de vorming van een peptidebinding zijn buitengewoon ingewikkeld.

De tRNA's dragen geactiveerde aminozuren in het ribosoom dat is samengesteld uit rRNA en ribosomale eiwitten. Het ribosoom is geassocieerd met het mRNA, wat zorgt voor correcte toegang van geactiveerde tRNA's en dat de nodige enzymatische activiteiten bevat om de vorming van peptidebindingen te katalyseren. Het ribosoom is inactief wanneer het bestaat uit twee subeenheden (een grote en een kleine) voordat het contact maakt met een mRNA. De kleine eenheid van het ribosoom initieert het translatieproces wanneer het een mRNA in het cytoplasma tegenkomt.

De vertaling verloopt in een geordend proces. Eerst vindt een nauwkeurige en efficiënte initiatie plaats, dan moet de ketenverlenging en tenslotte een nauwkeurige en efficiënte beëindiging plaatsvinden. Al deze drie processen vereisen specifieke eiwitten, waarvan sommige ribosoom-geassocieerd zijn en vele andere gescheiden zijn van het ribosoom, maar er tijdelijk mee geassocieerd kunnen zijn. Het eerste A-U-G-codon op het 5'8242-uiteinde van het mRNA fungeert als een 'start'-signaal voor de translatie en codeert voor de introductie van een methionine-aminozuur. De initiatie is voltooid wanneer het methionine-tRNA een van de twee bindingsplaatsen op het ribosoom inneemt.

De eerste plaats is de plaats waar het groeiende peptide zal verblijven, het staat bekend als de P-plaats en een andere plaats juist in de richting van de P-plaats is bekend als de A-plaats waar het binnenkomende tRNA is bevestigd. Elk eiwit begint met het methionine-aminozuur, niet alle eiwitten zullen uiteindelijk methionine aan één uiteinde hebben. Als de “start” methionine niet nodig is, wordt deze verwijderd voordat het nieuwe eiwit aan het werk gaat

Het ribosoom bindt aan het mRNA bij het startcodon (AUG) dat alleen wordt herkend door het initiator-tRNA. Het ribosoom gaat verder naar de verlengingsfase van eiwitsynthese. Tijdens deze fase binden complexen, bestaande uit een aminozuur gekoppeld aan tRNA, achtereenvolgens aan het juiste codon in mRNA door complementaire basenparen te vormen met het tRNA-anti-shycodon. Het ribosoom beweegt van codon naar codon langs het mRNA. Aminozuren worden één voor één toegevoegd, vertaald in polypeptidische sequenties gedicteerd door DNA en weergegeven door mRNA. Aan het einde bindt een afgiftefactor aan het stopcodon, waardoor de translatie wordt beëindigd en het volledige polypeptide opnieuw uit het ribosoom wordt verwijderd.

Activering van aminozuren:

Het is de stap waarin elk van de deelnemende aminozuren reageert met ATP om het aminozuur AMP-complex en pyrofosfaat te vormen. De reactie wordt gekatalyseerd door een specifiek aminozuur activerend enzym, aminoacyl-tRNA-synthetase genaamd, in aanwezigheid van Mg2+. Er is een afzonderlijk aminoacyl-tRNA-synthetase-enzym voor elk soort aminozuur. Veel van de energie die vrijkomt bij de scheiding van fosfaatgroepen van ATP zit gevangen in het aminozuur AMP-complex. Het complex blijft tijdelijk geassocieerd met het enzym. Het aminozuur AMP-enzymcomplex wordt een geactiveerd aminozuur genoemd.

Het pyrofosfaat wordt gehydrolyseerd tot twee anorganische fosfaten (2pi). Elk tRNA en het aminozuur dat het draagt, wordt herkend door individuele aminoacyl-tRNA-synthetasen. Activering van aminozuren vereist energie in de vorm van ATP. Eerst bindt het enzym het aminozuur aan het a-fosfaat van ATP met de gelijktijdige afgifte van pyrofosfaat. Dit wordt een aminoacyl-adenylaat-tussenproduct genoemd. Vervolgens katalyseert het enzym de overdracht van het aminozuur naar ofwel de 2'8242- of 3'8242-OH van het ribosegedeelte van de 3-terminale adenosinerest van het tRNA, waardoor het geactiveerde aminoacyl-tRNA wordt gegenereerd, dit is de omkeerbare reactie.

Nauwkeurige herkenning van het juiste aminozuur en het juiste tRNA is voor elk aminoacyl-tRNA-synthetase anders. Verschillende aminozuren hebben verschillende R-groepen. Het enzym voor elk aminozuur heeft een andere bindingsholte voor zijn specifieke aminozuur. Het is absoluut noodzakelijk dat het onderscheid tussen het juiste aminozuur en het juiste tRNA wordt gemaakt door een bepaald synthetase voordat het aminoacyl-tRNA uit het enzym wordt vrijgegeven. Nadat het product is vrijgegeven, is er geen manier om te controleren of een bepaald tRNA is gekoppeld aan het overeenkomstige tRNA (Fig. 8.13).

Opladen van tRNA:

Hier verbindt het aminozuur AMP-enzymcomplex zich met de aminozuurbindingsplaats van zijn specifieke tRNA, waar zijn COOH-groep bindt met de OH-groep van het terminale basetriplet CCA. De reactie wordt gekatalyseerd door hetzelfde enzym, aminoacyl-tRNA-synthetase. Het opnieuw ontstane tRNA-aminozuurcomplex wordt een geladen tRNA genoemd. AMP en enzym komen vrij. Het vrijgekomen enzym kan een ander aminozuurmolecuul activeren en aan een ander tRNA-molecuul hechten. De energie die vrijkomt door de verandering van ATP naar AMP wordt vastgehouden in het aminozuur-tRNA-complex. Deze energie wordt later gebruikt om de vorming van peptidebindingen aan te drijven wanneer aminozuren aan elkaar worden gekoppeld en een polypeptide vormen. Het tRNA-aminozuurcomplex verplaatst zich naar de ri­bosomen, de plaats van eiwitsynthese.

Activering van ribosoom:

Het is de stap waarin de kleinere en de grotere subeenheden van ribosoom met elkaar worden verbonden. TKis wordt veroorzaakt door de mRNA-keten. Het mRNA verbindt de kleinere ribosomale subeenheid met behulp van het eerste codon door een basenparing met een geschikte sequentie op rRNA. De combinatie van beide wordt initiatiecomplex genoemd. De grotere subeenheid voegt zich later bij de kleine subeenheid en vormt een actief ribosoom. Activering van ribosoom door mRNA vereist een juiste concentratie van Mg++.

Essay # 2. Soorten vertaling van mRNA:

A. Prokaryotische vertaling van mRNA:

Polypeptidevorming in prokaryoten:

Het gaat om drie evenementen:

(c) Beëindiging van de polypeptideketen.

Translatie in prokaryoten omvat de assemblage van de componenten van het translatiesysteem, de twee ribosomale subeenheden (klein en groot), het mRNA dat moet worden vertaald, het eerste (formyl) aminoacyl-tRNA (het tRNA geladen met het eerste aminozuur), GTP (als een energiebron), en drie initiatiefactoren (IF1, IF2 en IF3) die de assemblage van het initiatiecomplex helpen.

Het ribosoom heeft drie locaties: de A-site, de P-site en de E-site. De A-site is het toegangspunt voor het aminoacyl-tRNA (behalve voor het eerste aminoacyl-tRNA, fMet-tRNAF Met , die binnenkomt op de P-site). De P-plaats is waar het peptidyl-tRNA wordt gevormd in het ribosoom, terwijl in de E-plaats de uitgangsplaats is van het nu ongeladen tRNA nadat het zijn aminozuur aan de groeiende peptideketen heeft geleverd.

De mRNA-keten heeft aan zijn 5'8242-uiteinde een '8220initiator'8221- of '8220start'8221-codon (AUG), waarvan de herkenning het begin van de vorming van polypeptiden aangeeft (Fig. 8.14). Dit codon ligt dicht bij de P-plaats van het ribosoom. In de polycistronische prokaryotische RNA's bevindt dit AUG-codon zich naast een Shine-Delgarno-element in het mRNA. Het Shine-Delgarno-element (Fig. 8.15) wordt herkend door complementaire sequenties in het kleine subeenheid-rRNA (165 in E. coli).

Het aminozuur formylmethionine (methionine in eukaryoten) zet het proces op gang. Het wordt gedragen door tRNA met een anticodon UAC dat bindt aan het initiatorcodon AUG van mRNA. Initiatiefactoren (IF1, IF2 en IF3) en GTP bevorderen het initiatieproces. De grote ribosomale subeenheid voegt zich nu bij de kleine subeenheid om het ribosoom te voltooien. In dit stadium wordt GTP gehydrolyseerd tot BBP. Het ribosoom heeft formylmethionine dat tRNA draagt ​​op de P-plaats. Later wordt het formylmethionine veranderd in normaal methionine door het enzym deformylase in prokaryoten. Indien niet vereist, wordt methionine later gescheiden van de polypeptideketen door een proteolytisch enzym aminopeptidase (Fig. 8.16).

In het initiatieproces van de eiwitsynthese binden de eerste Initiatiefactoren IF-1 en IF-3 zich aan de 305 ribosomale subeenheid, en voorkomen dat 30S- en 50S-subeenheden voortijdig combineren. Binding van het mRNA aan de 30S-subeenheid vindt zo plaats dat het initiatiecodon (AUG) aan een precieze locatie op de 30S-subeenheid bindt. Door het voorkomen van herassociatie van subeenheden kan het pre-initiatiecomplex worden gevormd. Binding van IF-1 helpt te verzekeren dat het initiatie-aminoacyl-tRNA, fMet-tRNA fMet alleen in de P-plaats kan binden en ander aminoacyl-tRNA tijdens de initiatie op de A-plaats kan binden. De initiatie van translatie vereist herkenning van een AUG-codon. In de polycistronische prokaryotische RNA's bevindt het AUG-codon zich naast een Shine-Delgarno-element in het mRNA. Het Shine-Delgarno-element wordt herkend door gebruikelijke sequenties in het kleine subeenheid-rRNA (165 in E. coli). IF-2 is een klein GTP-bindend eiwit dat bindt aan het initiator fMet-tRNA en helpt het te koppelen aan de kleine ribosoomsubeenheid.

Verlenging van de polypeptideketen omvat toevoeging van aminozuren aan het carboxyluiteinde van de groeiende keten. Het groeiende eiwit verlaat het ribosoom via de polypeptide-uitgangstun­nel in de grote subeenheid (Fig. 8.17).

Drie verlengingsfactoren (EF Tu, EF Ts en EF G) helpen bij de verlenging van de poly­peptideketen. Verlenging begint wanneer het fmet-tRNA de P-plaats binnengaat, wat een conforma­tional verandering veroorzaakt die de A-plaats opent voor het nieuwe aminoacyl-tRNA om te binden. Deze binding wordt vergemakkelijkt door elongatiefactor-Tu (EF-Tu), een kleine GTPase. Nu bevat de P-plaats het begin van de peptideketen van het te coderen eiwit en de A-plaats heeft het volgende aminozuur dat aan de peptideketen moet worden toegevoegd. Het groeiende polypeptide dat is verbonden met het tRNA op de P-plaats, wordt losgemaakt van het tRNA in de P-plaats en er wordt een peptidebinding gevormd tussen de laatste aminozuren van het polypeptide en het aminozuur dat nog steeds aan het tRNA op de A-plaats is bevestigd.

Dit proces, dat bekend staat als de vorming van peptidebindingen, wordt gekatalyseerd door een ribozym peptidyltransferase, een activiteit die intrinsiek is aan het 23S-ribosomale RNA in de 50S-ribosomale subeenheid. Een geladen tRNA-molecuul komt samen met zijn aminozuur, bijvoorbeeld proline, het ribosoom binnen op de A-plaats. Het anticodon GGA lokaliseert en bindt met het complementaire codon CCU van de mRNA-keten door waterstofbruggen. Het aminozuur methionine wordt overgebracht van zijn tRNA naar het nieuw aangekomen proline-tRNA-complex waar de twee aminozuren samenkomen door een peptidebinding.

Het proces wordt gekatalyseerd door het enzym peptidyltransferase dat zich op het ribosoom bevindt. In dit proces wordt de koppeling tussen het eerste aminozuur en zijn tRNA verbroken en vormt de – COOH-groep nu een peptidebinding met het vrije -NH2 groep van het tweede aminozuur. Het tweede tRNA draagt ​​dus een dipeptide, formylmethionineproline. De energie die nodig is voor de vorming van een peptidebinding komt van de vrije energie die vrijkomt door de scheiding van aminozuur (formylmethionine of methionine) van zijn tRNA.

Het eerste tRNA, nu ongeladen, scheidt zich van de mRNA-keten op de P-plaats van het ribo­soom en keert terug naar de gemengde pool van tRNA's in het cytoplasma. Hier is het nu beschikbaar om een ​​ander molecuul van zijn specifieke aminozuur te transporteren. Nu beweegt het ribosoom één codon langs het mRNA in de richting 3'8242. Hiermee wordt het tRNA-dipeptidecomplex op de A-site naar de P-site getrokken. Dit proces wordt translocatie genoemd. Het vereist GTP en een translocase-eiwit genaamd EF-G-factor. De GTP wordt gehydrolyseerd tot GDP en anorganisch fosfaat om energie vrij te maken voor het proces.

In dit stadium arriveert bijvoorbeeld een derde tRNA-molecuul met zijn eigen specifieke aminozuur, arginine, op de A-plaats van het ribosoom en bindt zich met behulp van anticodon AGA aan het complementaire codon UCU van de mRNA-keten. Het dipeptide formylmethionineproline wordt van het voorgaande tRNA naar het derde tRNA verschoven waar het met behulp van het peptidyltransferase-enzym het aminozuur arginine weer samenvoegt. Het dipeptide wordt dus een tripept, formyl-methionine-proline-arginine. Het tweede tRNA dat nu ongeladen is, verlaat de mRNA-keten en verlaat de P-plaats. Het tRNAtripeptide-complex wordt getransloceerd van de A-plaats naar de P-plaats.

Het hele proces met de aankomst van het tRNA-aminozuurcomplex, de vorming van peptidebindingen en de translocatie wordt herhaald. Terwijl het ribosoom over het mRNA beweegt, komen alle codons van mRNA één voor één aan op de A-plaats en groeit de peptideketen. De aminozuren zijn dus gekoppeld tot een polypeptide in een sequentie die door het DNA wordt gecommuniceerd via het mRNA. Een polypeptideketen die in het proces van synthese is, wordt vaak een ontluikend polypeptide genoemd. Omdat tRNA's aan mRNA zijn gekoppeld door codon-anticodon basenparing, bewegen tRNA's ten opzichte van het ribosoom waarbij het ontluikende polypeptide van de A-plaats naar de P-plaats wordt genomen en het ongeladen tRNA naar de E-uitgangsplaats wordt verplaatst. Dit proces wordt gekatalyseerd door rekfactor G (EF-G). Het ribosoom blijft de resterende codons op het mRNA vertalen naarmate meer aminoacyl-tRNA aan de A-plaats bindt, totdat het ribosoom een ​​stopcodon op mRNA bereikt (UAA, UGA of UAG). De groeiende polypeptideketen blijft altijd gehecht aan zijn oorspronkelijke ribosoom en wordt niet overgedragen van het ene ribosoom naar het andere. Op een bepaald ribosoom kan slechts één polypeptideketen tegelijk worden gesynthetiseerd.

Beëindiging vindt plaats wanneer een van de drie terminatiecodons naar de A-plaats beweegt. Deze codons worden door geen enkele tRNA herkend. Het wordt niet vergezeld door het anticodon van een tRNA-aminozuurcomplex. Er kunnen dus geen aminozuren meer aan de polypep­tide-keten worden toegevoegd. In plaats daarvan worden ze herkend door eiwitten die afgiftefactoren worden genoemd, namelijk RF1 (herkenning van de UAA- en UAG-stopcodons) of RF2 (herkenning van de UAA- en UGA-stopcodons). Deze factoren veroorzaken de hydrolyse van de esterbinding in peptidyl-tRNA en de re­lease van het nieuw gesynthetiseerde eiwit uit het ribosoom.

Een derde afgiftefactor RF-3 katalyseert de afgifte van RF-1 en RF-2 aan het einde van het beëindigingsproces. De afgifte wordt gekatalyseerd door het peptidyltransferase-enzym, hetzelfde enzym dat de peptidebindingen vormt. Het ribosoom springt van de mRNA-keten bij het stopcodon en dissocieert in zijn twee subeenheden. Het voltooide polypeptide (aminozuurketen) komt vrij in het cytoplasma. De ribosomen en de tRNA's kunnen bij afgifte uit het mRNA weer op dezelfde manier functioneren en resulteren in de vorming van een ander polypeptide van hetzelfde eiwit.

B. Eukaryote vertaling van mRNA:

Initiatie van translatie in zowel prokaryoten als eukaryoten vereist een specifiek initiator-tRNA, tRNA met , dat wordt gebruikt om het initiële methionineresidu in alle eiwitten op te nemen, maar tRNA met is specifiek voor initiatie in eukaryoten.

Eukaryotische initiatiefactoren en hun functies:

De specifieke niet-ribosomaal geassocieerde eiwitten die nodig zijn voor nauwkeurige translationele initiatie worden initiatiefactoren genoemd. In E. coli worden ze Ifs genoemd, terwijl ze in eukaryoten worden ontdaan van elFs.

Er zijn talloze elF's geïdentificeerd, zoals weergegeven in tabel 8.4:

Het initiëren van translatie vereist vier specifieke basisstappen: het ribosoom moet dissociëren in zijn ’ 405 en 605 subeenheden. Een ternair complex, d.w.z. het pre-initiatiecomplex, wordt gevormd waarbij de initiator, GTP, eIF-2 en de 405-subeenheid betrokken zijn. Het mRNA is gebonden aan het pre-initiatiecomplex. De 605-subeenheid associeert met het pre-initiatiecomplex om het 80S-initiatiecomplex te vormen. De initiatiefactoren eIF-1 en eIF-3 binden aan de 405 ribosomale subeenheid en geven de voorkeur aan anti-associatie met de 605 subeenheid. Het voorkomen van herassociatie van subeenheden maakt het dus mogelijk dat het pre-initiatiecomplex wordt gevormd (Fig. 8.18).

De eerste stap bij de vorming van het pre-initiatiecomplex is de binding van GTP aan elF-2 om een ​​binair complex te vormen. eIF-2 bestaat uit drie subeenheden, α, β en γ. Het binaire com­plex bindt vervolgens aan het geactiveerde initiator-tRNA, d.w.z. met-tRNA met vormt een ternair complex dat vervolgens bindt aan de 40S-subeenheid die het 43S-pre-initiatiecomplex vormt. Het pre-initiatiecomplex wordt gestabiliseerd door een eerdere associatie van eIF-3 en eIF-1 aan de 40S-subeenheid. De cap-structuur van eukaryote mRNA's wordt voorafgaand aan associatie met het pre-initiatiecomplex door specifieke elF's gebonden. Cap-binding wordt bereikt door de initiatiefactor eIF-4F. Deze factor is eigenlijk een complex van 3 eiwitten eIF-4E, A en G. Het eiwit eIF-4E is een 24 kDa eiwit dat fysiek de cap-structuur herkent en eraan bindt. eIF-4A is een eiwit van 46 kDa dat ATP bindt en hydrolyseert en RNA-helicase-activiteit vertoont. Het afwikkelen van de secundaire structuur van mRNA is nodig om toegang tot de ribosomale subeenheden mogelijk te maken. eIF-4G helpt bij de binding van het mRNA aan het 43S-pre-initiatiecomplex.

Zodra het mRNA correct is uitgelijnd op het pre-initiatiecomplex en het initiator-met-tRNA-met is gebonden aan het initiator-AUG-codon (een proces dat wordt gefaciliteerd door eIF-1) associeert de 60S-subeenheid zich met het complex. De associatie van de 60S-subeenheid vereist de activiteit van eIF-5 die al aan het pre-initiatiecomplex is gebonden. De energie die nodig is om de vorming van het 80S-initiatiecomplex te bewerkstelligen uit de hydrolyse van het GTP gebonden aan eIF-2.

De GDP-gebonden vorm van eIF-2 bindt dan aan eIF-2B, wat de uitwisseling van GTP voor GDP op eIF-2 stimuleert. Wanneer GTP wordt uitgewisseld, dissocieert eIF-2B van eIF-2. Dit wordt de elF-2-cyclus genoemd. Deze cyclus is absoluut vereist om eukaryote translationele initiatie te laten plaatsvinden. De GTP-uitwisselingsreactie kan worden beïnvloed door fosforylering van de a-subeenheid van eIF-2.

In dit stadium is het initiator-met-tRNA gebonden aan het mRNA binnen een plaats van de ribosoom P-plaats. De andere plaats in het ribosoom waaraan binnenkomende geladen tRNA's binden, is de A-plaats voor de aminozuurplaats. De eIF-2-cyclus omvat de regeneratie van GTP-gebonden eIF-2 na de hydrolyse van GTP tijdens translationele initiatie. Wanneer het 405-pre-initiatiecomplex wordt gekoppeld aan het 60S-ribosoom om het 80S-initiatiecomplex te vormen, wordt het GTP gebonden aan eIF-2 gehydrolyseerd en levert het energie voor het associatieproces. Om extra translatie-initiatierondes te voorkomen, moet het aan eIF-2 gebonden BBP worden ingewisseld voor GTP. Dit is de functie van eIF-2B, ook wel guanine-nucleotide-uitwisselingsfactor (GEF) genoemd.

Ook het proces van verlenging vereist specifieke niet-ribosomale eiwitten. In E. coli zijn dit EF's en in eukaryoten eEF's. Verlenging van polypeptiden vindt plaats op een cyclische manier zodat aan het einde van één volledige ronde van aminozuurtoevoeging de A-plaats leeg beschikbaar is en klaar om het binnenkomende aminoacyl-tRNA te accepteren zoals voorgeschreven door het volgende codon van het mRNA. Dit betekent dat niet alleen het binnenkomende aminozuur aan de peptideketen moet worden gehecht, maar dat het ribosoom ook door het mRNA naar het volgende codon moet gaan.

Elk binnenkomend aminoacyl-tRNA wordt naar het ribosoom gebracht door een eEF-la-GTP-complex. Wanneer het juiste tRNA is geregistreerd op de A-site, wordt de GTP gehydrolyseerd en dissociateert het eEF-la-GDP-complex. Voor extra translocatiegebeurtenissen moet het BBP worden uitgewisseld met GTP. Dit wordt uitgevoerd door eEF-lpy op dezelfde manier als de GTP-uitwisseling die plaatsvindt met eIF-2 gekatalyseerd door eIF-2B.

Het peptide gehecht aan het tRNA op de P-plaats wordt overgebracht naar de aminogroep op het aminoacyl-tRNA in de A-plaats. Deze reactie wordt gekatalyseerd door peptidyltransferase. Dit proces wordt transpeptidatie genoemd. Het langwerpige peptide bevindt zich nu op een tRNA in de A-plaats.

De A-site moet vrij zijn om het volgende aminoacyl-tRNA te accepteren (Fig. 8.19). Het proces van het verplaatsen van het peptidyl-tRNA van de A-plaats naar de P-plaats wordt translocatie genoemd. Translocatie wordt gekatalyseerd door eEF-2 gekoppeld aan GTP-hydrolyse. Tijdens het transloca­tion wordt het ribosoom langs het mRNA verplaatst, zodat het volgende codon van het mRNA zich onder de A-plaats bevindt. Na de translocatie komt eEF-2 vrij uit het ribosoom. De cyclus kan nu opnieuw beginnen. Het vermogen van eEF-2 om translocatie uit te voeren wordt gereguleerd door de staat van fosforylering van het enzym, wanneer gefosforyleerd wordt het enzym geremd. Fosfor & shylering van eEF-2 wordt gekatalyseerd door het enzym eEF2-kinase (eEF2K).

Net als bij initiatie en elongatie, vereist transiationai-terminatie specifieke eiwitfactoren die worden geïdentificeerd als afgevende factoren, RF's in E. coli en eRF's in eukaryoten. Er is één eRF's in eukaryoten. De signalen voor beëindiging zijn hetzelfde in zowel prokaryoten als eukaryoten. Deze signalen zijn terminatiecodons die aanwezig zijn in het mRNA. Er zijn 3 terminatiecodons, UAG, UAA en UGA.

In E. coli worden de terminatiecodons UAA en UAG herkend door RF-1, terwijl RF-2 de terminatiecodons UAA en UGA herkent. De eRF bindt samen met GTP aan de A-plaats van het ribo­soom. De binding van eRF aan het ribosoom stimuleert de peptidy-transferase-activiteit om de peptidylgroep over te dragen aan water in plaats van een aminoacyl-tRNA. Het resulterende ongeladen tRNA dat in de P-plaats achterblijft, wordt verdreven met gelijktijdige hydrolyse van GTP. Het inactieve ribosoom geeft dan zijn mRNA af en het 80S-complex dissocieert in de 40S- en 60S-subeenheden, klaar voor een nieuwe translatieronde.


Samenvatting

Afgiftefactoren RF1 en RF2 herkennen stopcodons die aanwezig zijn op de A-plaats van het ribosoom en activeren hydrolyse van peptidyl-tRNA om de peptideketen vrij te maken. Interacties met RF3, een ribosoom-afhankelijke GTPase, initiëren vervolgens een reeks reacties die de dissociatie van RF1 of RF2 en hun recycling tussen ribosomen versnellen. Twee regio's van Escherichia coli RF1 en RF2 werden eerder geïdentificeerd als betrokken bij stopcodonherkenning en peptidyl-tRNA-hydrolyse. We laten hier zien dat het verwijderen van het N-terminale domein van RF1 of RF2 of het uitwisselen van dit domein tussen de twee factoren geen invloed heeft op de RF-specificiteit, maar verschillende effecten heeft op de activiteit van RF1 en RF2: afgeknot RF1 blijft zeer actief en kan snelle cellen ondersteunen. groei, terwijl cellen met afgeknot RF2 slechts slecht groeien. Transplantatie van een lus van 13 aminozuurresiduen van RF2 naar RF1 schakelt de stopcodonspecificiteit om. De interactie van de afgeknotte factoren met RF3 op het ribosoom is defect: ze stimuleren de uitwisseling van guanine-nucleotiden op RF3 niet, recycling wordt niet gestimuleerd door RF3 en nucleotide-vrij RF3 stabiliseert de binding van RF1 of RF2 aan het ribosoom niet. Het N-terminale domein lijkt echter niet vereist te zijn voor de uitdrijving van RF1 of RF2 door RF3:GTP.


Beëindiging van de vertaling

Beëindiging van translatie vindt plaats wanneer een stopcodon of nonsenscodon (UAA, UAG of UGA) wordt aangetroffen. Bij uitlijning met de A-plaats worden deze stopcodons herkend door afgiftefactoren in prokaryoten en eukaryoten die peptidyltransferase instrueren om een ​​watermolecuul toe te voegen aan het carboxyluiteinde van het aminozuur van de P-plaats. Deze reactie dwingt het aminozuur op de P-plaats om los te komen van zijn tRNA, en het nieuw gemaakte eiwit komt vrij. De kleine en grote ribosomale subeenheden dissociëren van het mRNA en van elkaar worden ze bijna onmiddellijk gerekruteerd in een ander translatie-initiatiecomplex. Nadat veel ribosomen de translatie hebben voltooid, wordt het mRNA afgebroken, zodat de nucleotiden opnieuw kunnen worden gebruikt in een andere transcriptiereactie.


Wat zijn de zes stappen van vertalen in eukaryoten?

Vertaling wordt uitgevoerd in zes stappen: (i) binding van mRNA aan ribosoom, (ii) aminoacylatie, (iii) initiatie, (iv) verlenging, (v) terminatie en (vi) post-translationele modificatie, (i) Binding van mRNA naar ribosoom

L. binding van mRNA aan ribosoom

Ribosomen komen voor in het cytoplasma in gedissocieerde toestand, dat wil zeggen, hun kleinere en grotere subeenheden zijn gescheiden. In prokaryoot helpt de transcriptiefactor IF3 bij de dissociatie van de twee subeenheden van ribosoom en bindt zich vervolgens aan de 30S-subeenheid om vroegtijdige associatie van de twee subeenheden te voorkomen. Ten eerste bindt het mRNA aan de kleinere subeenheid. De kleinere subeenheid heeft twee bindingsplaatsen: een plaats of aminoacylplaats en een P-plaats of peptidylplaats.

Het binnenkomende tRNA met zijn specifieke aminozuur bindt aan de A-plaats en het peptidyl-tRNA dat het langwerpige polypeptide draagt, bindt aan de P-plaats. Het bacteriële ribosoom bevat een andere plaats, de E-plaats of Exit-plaats waaraan het afgevoerde tRNA of tRNA waarvan het peptidyl al is overgebracht, bindt voordat het uit het ribosoom wordt vrijgegeven.

Het prokaryotische mRNA heeft een leidersequentie aan het begin net voor het initiatiecodon AUG. Deze sequentie staat bekend als Shine-Delgarno-sequentie (SD-gebied), die homologie heeft met het 3'8242-uiteinde van het 16S-rRNA (ASD-gebied) dat wordt gevonden in de 30S-subeenheid.

Deze complementariteit zorgt ervoor dat de 30S-subeenheid bindt op de juiste positie van mRNA en het translatieproces begint vanaf het begin van mRNA. In eukaryoot komt de 40S-subeenheid binnen aan het afgetopte s'8217-uiteinde van het mRNA en gaat vervolgens door naar het startcodon door lineair scannen.

(ii) Aminoacylering

Aminoacylering of activering van aminozuur is de stap waarin alle twintig aminozuren worden gekoppeld aan hun specifieke tRNA in het cytoplasma. Deze reactie wordt gekatalyseerd door het enzym aminoacyl-tRNA sythctasc.

Er zijn 20 verschillende soorten synthetasen voor 20 verschillende aminozuren. De aminozuren die door twee of meer tRNA-moleculen worden herkend, zijn verbonden door hetzelfde enzym. In de eerste stap van aminoacylering wordt aminoacyladenylaat-enzymcomplex of aminoacyl-AMP-enzym gevormd met de afgifte van pyrofosfaat.

Amino aminoacyl aminoacyl-adenylaat

Zuursynthetase & #8211 enzymcomplex

In de tweede stap wordt dit complex geassocieerd met het 3′-OII-uiteinde (met ongepaarde CCA-sequentie) van een specifiek tRNA-molecuul. Het AMP wordt nu gehydrolyseerd om een ​​esterbinding te vormen tussen het aminozuur en zijn specifieke tRNA, en het enzym komt ook vrij.

(iii) Initiatie

De eiwitsynthese begint vanaf het aminoterminale uiteinde van het polypeptide, gaat verder door de toevoeging van aminozuren door vorming van peptidebindingen en eindigt bij het carboxylterminale uiteinde. In prokaryoot is het initiatie-aminozuur formylatcd mctheoninc, terwijl het in cukaryotc mcthconinc is. Dus in de prokaryoot zijn er twee soorten tRNA voor mctheoninc. De ene is tRNAP'8221 ct voor initiatie die formylmetheonine draagt ​​en de andere is tRNA dat wordt gehaald voor het transporteren van normaal mctheoninc naar groeiend polypcptide.

De initiatie van polypeptidesynthese in prokaryoot vereist het volgende: l.raRNA, 2. 30S-subeenheid van ribosoom, 3. formylmetheonyl-tRNA (fmet-tRNAf'8221iet), 4. Initiatiefactoren IF-i, IF-2 en IF-3 , 5. GTP, 6. 50S ribosomale subeenheid en 7. Mg+2 de volgorde van gebeurtenissen die optreedt tijdens de initiatie zijn:

1. De kleinere 30S-subeenheid van ribosoom bindt aan de transcriptiefactor IF-3 die voortijdige associatie van de twee ribosomale subeenheden voorkomt.

2. Het mRNA bindt aan de 30S-subeenheid door de interactie van het SD-gebied van het mRNA en het ASD-gebied van het ribosoom, zodat het startcodon AUG correct wordt gepositioneerd op de P-plaats van het ribosoom.

3. Het fMet-tRNAf*𔄣 (het specifieke tRNA dat wordt geaminoacyleerd tot formylmethionine) bindt aan het AUG-codon op de P-plaats. Het tRNAP'8221* is het enige tRNA dat bindt aan zijn codon aanwezig op de P-plaats alle ander tRNA bindt samen met hun respectievelijke aminozuren aan hun codon dat aanwezig is op de A-plaats.

Daarom coderen AUG-codons als startcodon voor formylmethionine en wanneer ze op andere posities aanwezig zijn, coderen ze voor normaal methionine. Men herinnert zich dat er twee soorten tRNA-moleculen zijn die hetzelfde AUG-codon herkennen maar twee verschillende vormen van methionine dragen.

4. De initiatiefactor IF-i bindt aan de A-plaats en voorkomt binding van enig ander aminoacyl-tRNA aan het codon op de A-plaats tijdens de initiatie.

5. Xow de GTP gebonden IF-2 (GTP-IF-2) en de initiërende fMet-tRNAP 1 '8221 voegen zich bij het complex van 3oSsubunit-IF3-IFi-mRNA.

6. Vervolgens voegt de 50S-subeenheid zich bij het complex dat in de vorige stap is gevormd. De aan IF-2 gebonden GTP wordt gehydrolyseerd tot GDP en Pi. Alle drie de initiatiefactoren laten 1 ribosoom achter. Dit complex van 70S-ribosoom, mRNA en fMct-tRNAf Me: gebonden aan het initiatiecodon op de P-plaats staat bekend als het initiatiecomplex.

(iv) Verlenging

Verlengingsstap omvat de toevoeging van verdere aminozuren zodat de polypeptideketen zou groeien. Deze stap vereist het volgende: 1. het initiatiecomplex, 2. verschillende aminoacyl-tRNA's, 3 twee verlengingsfactoren (EF-Tu en EF-Ts) en 4.GTP. Het rekproces verloopt in drie stappen:

Stap I- Binding van binnenkomende aminoacyl

Het binnenkomende aminoacyl-tRNA bindt aan een complex van EF-Tu-GTP om te resulteren in een aminoacyl-tRNA-Tu-GTP-complex. Dit complex bindt aan de A-plaats van het 70S-initiatiecomplex. Vervolgens wordt GTP gehydrolyseerd tot GDP en wordt het Pi en EF-Tu-GDP-complex vrijgemaakt uit het ribosoom. Het EF-Tu-GTP-complex wordt als volgt geregenereerd en gerecycled door EF-T's en GTP:

EF-Tu-GDP + EF-Ts =EF-Tu -Ts +GDP EF-Tu-Ts + GTP = EF-Tu-GTP + EF-Ts Stap II- Peptidebindingsvorming Dit is een katalytisch proces waarbij een peptidebinding wordt gevormd tussen twee aminozuren gebonden door hun t-RNA-moleculen aan de A-site en de P-site. Deze peptidebinding wordt gevormd tussen het vrije carbonzuur. Groep van de X-formylmethioninegroep bevestigd door zijn tRNA aan de P-plaats en het tweede aminozuur gebonden door zijn tRNA aan A-plaats. De X-formylgroep wordt overgebracht naar de aminogroep van het tweede aminozuur gebonden aan zijn tRNA op de A-plaats. Hierdoor wordt het tRNA

At the A site contains a dipeptide and that at the P site becomes empty. The enzyme responsible for the peptide bond formation is peptidyl transferase. In bacteria the 23S rRNA a component of the 50S ribosomal subunit is thought to carry out peptidyl transferase function.

In this step the peptidyl tRNA bound to the A site comes to the P site of ribosome, the empty tRNA at P site comes to the E site and the A site is occupied by a new codon for the next incoming aminoacyl tRNA. This is accomplished by the movement of ribosome by one codon more in 5′ to 3′ direction of mRNA.

The translocation of ribosome requires EF-G (translocase) and GTP. The deacylated tRNA interacts with the E site mainly located on 50S subunit through its CCA sequence at the 3′-end. The two step transfer of tRNA molecules from A site to P site and from P site to E site could result from the reciprocating motions of the two subunits of ribosome.

This means that 50S and 30S subunits move alternately not simultaneously. Finally the deacylated (empty) tRNA is released to cytosol from the E site.

(v) Termination

Termination of the synthesis of polypeptide is brought about by the presence of any one of the three termination codons on the mRNA. These termination codons are recognized by any one of the three release factors/ termination factors, RFi, RF2 and RF3. RFi and RF2 resemble the structure of tRNA and compete with it for binding to any one of the termination codon at the A site of ribosome.

This phenomenon is known as molecular mimicry.RFi recognises UAG and RF2, UGA. Both recognize UAA. When the A site of the ribosome encounters a termination codon occupied by a release factor instead of an aminoacyl tRNA, elongation of polypeptide stops. At the P site one tRNA with the polypeptide chain is bound to another codon.

The release factor RF3 coupled with GTP splits the peptidyl-tRNA bond. The polypeptide is thus released and the discharged or empty last tRNA is also released from the P site. The ribosome dissociates into 50S and 30S subunits. In eukaryote only one release factor cRFI is known.

The.fundamental mechanism of elongation and termination in eukaryotc resemble with that of prokaryotc.

(vi) Post-translational modifications

The released polypeptide is modified in various ways. The enzyme dcformylasc removes the formyl group from the first amino acid methionine. Then, due to action of exo-amino-peptidase enzyme certain amino acids may be removed from the X- terminal end or C-terminal end or both.

The polypeptide chains singly or in association with other polypeptides fold properly to take a tertiary structure to become functional proteins. Inhibition of transcription and translation

Transcription is selectively inhibited by several antibiotics and drugs. Actinomycin D inhibits the elongation process by intercalating between successive G-C base pairs. Translation is also selectively inhibited by several drugs and antibiotics in prokaryotes. However, these inhibitors are relatively harmless in eukaryotes. Puromycin C is one such important inhibitor which structurally resembles 3′ end of aminoacyl tRNA So this can participate in peptide bond formation producing peptidyl-puromycin. It dissociates from the ribosome and thus terminates translation.


B. Translation - First Steps

1. Making Aminoacyl-tRNAs

Translation is perhaps the most energy-intensive job a cell must do, beginning with the attachment of amino acids to their tRNAs. The basic amino-acylation reaction is the same for all amino acids. A specific aminoacyl-tRNA synthase attaches each tRNA to (charges) an appropriate amino acid. Charging tRNAs requires ATP and proceeds in three steps (shown below).

In the first step, ATP and an appropriate amino acid bind to the aminoacyl-tRNA synthase. ATP is hydrolyzed releasing a pyrophosphate (PPi) and leaving an enzyme-AMP-amino acid complex. Next, the amino acid is transferred to the enzyme, releasing the AMP. Finally, the tRNA binds to the enzyme, the amino acid is transferred to the tRNA and the intact enzyme is regenerated and released. The charged tRNA is ready to use in translation.

Several studies had already established that polypeptides are synthesized from their amino (N-) terminal end to their carboxyl (C-) terminal end. When it became possible to determine the amino acid sequences of polypeptides, it turned out that around 40% of E coli proteins had an N-terminal methionine, suggesting that alle proteins began with a methionine. It also turned out that, even though there is only one codon for methionine, two different tRNAs for methionine could be isolated. One of the tRNAs was bound to a methionine modified by formylation, genaamd formylmethionine-tRNAfmet(of fmet-tRNAf for short). The other was methionine-tRNAleerde kennen (met-tRNAleerde kennen for short), charged with an unmodified methionine.

Methionine and formylated methionine are shown below.

tRNAleerde kennen en tRNAf each have an anticodon to AUG, the only codon for methionine, but have different base sequences encoded by different tRNA genes. tRNAleerde kennen is used to insert methionine in the middle of a polypeptide. tRNAf is the initiator tRNA, and is only used to start new polypeptides with formylmethionine. In prokaryotes, methionine on met-tRNAf is formylated at its amino group to make the fmet-tRNAf. The formylating enzyme that does this does not recognize methionine on met-tRNAleerde kennen.

In E coli, a formylase enzyme removes the formyl group from all N-terminal formyl methionines at some point after translation has begun. As we noted, the methionine itself (and sometimes more N-terminal amino acids) are also removed from about 60% of E. coli polypeptides. Eukaryotes have inherited both the initiator tRNAf and the tRNAmet, using only met-tRNAf during initiation. However, methionine on the eukaryotic initiator met-tRNAf is never formylated in the first place. What&rsquos more, methionine is absent from virtually all mature eukaryotic polypeptides.

Early in evolution, the need for an initiator tRNA must have ensured a correct starting point for translation on an mRNA and therefore growth of a polypeptide from one end to the other, that is, from its N- to its C-terminus. At one time, formylation of the N-terminal methionine may have served to block accidental addition of amino acids or other modifications at the N-terminus of a polypeptide. Today, formylation seems to be a kind of molecular appendix in bacteria. Since then, evolution (in eukaryotes at least) has selected other features to replace actual formylation as the protector of the N-terminus of polypeptides.

2. Initiation

Now that we have charged the tRNAs, we can look more closely at the three steps of translation. Understanding translation initiation began with a molecular dissection of the components of E. coli cells required for cell-free (in vitro) protein synthesis, including cell fractionation, protein purification and reconstitution experiments. Initiation starts with when the Shine-Delgarno sequence forms Hbonds with a complementary sequence in the 16S rRNA bound to 30S ribosomal subunit. The Shine-Delgarno sequence is a short nucleotide sequence in the 5&rsquo untranslated region (5&rsquo-UTR) of the messenger RNA, just upstream of the initiator AUG codon. This requires the participation of initiation factors IF1 en IF3. In this event, IF1 and IF3 as well as the mRNA are bound to the 30S ribosomal subunit (below).

Demonstration of the binding of an mRNA to a ribosomal subunit required isolation and separation of the 30S ribosomal subunit, an RNA fraction of the cell, and the purification of initiation factor proteins from the bacterial cells. This was followed by reconstitution (adding the separated fractions back together) in the correct order show that mRNA would only bind to the 30S subunit in the presence of the two specific initiation factor proteins.

Next, with the help of GTP and another initiation factor (IF2), the initiator fmettRNAf recognizes and binds to the AUG start codon found in all mRNAs. Some call the resulting structure (shown below) the Initiation Complex, which includes the 30S ribosomal subunit, Ifs 1, 2 and 3, and the fmet-tRNAf.

In the last step of initiation, the large ribosomal subunit binds to this complex. IFs 1, 2 and 3 disassociate from the ribosome and the initiator fmet-tRNA fmet ends up in the P site of the ribosome.

Some prefer to call the structure formed at this point the initiation complex (below).

Initiation can happen multiple times on a single mRNA, forming the polyribosome, or polysome described in Chapter 1. Each of the complexes formed above will engage in the elongation of a polypeptide described next.

3. Elongation

Elongation is a sequence of protein factor-mediated condensation reactions and ribosome movements along an mRNA. As you will see, polypeptide elongation requires a considerable input of free energy.

A) Elongation 1

The first step in elongation is the entry of the next aminoacyl-tRNA (aa2- tRNAaa2), which requires the free energy of GTP hydrolysis. The energy is supplied by the hydrolysis of GTP bound elongation factor 2 (EF2-GTP). The aa2-tRNAaa2 enters the ribosome based on codon-anticodon interaction at the EEN site as shown below.

The GDP dissociates from EF2 as aa2-tRNAaa2 binds the anticodon in the A site. To keep elongation moving along, elongation factor (EF3) rephosphorylates the GDP to GTP, which can re-associate with free EF2.

B) Elongation 2

Peptidyl transferase, a ribozyme component of the ribosome itself, links the incoming amino acid to a growing chain in a condensation reaction.

In this reaction, the fmet is transferred from the initiator tRNAf in the P site to aa2-tRNAaa2 in the A site, forming a peptide linkage with aa2.

C) Elongation 3

Translocase catalyzes GTP hydrolysis as the ribosome moves (translocates) along the mRNA. After translocation, the next mRNA codon shows up in the A site of the ribosome and the first tRNA (in this example, tRNAf) ends up on the E site of the ribosome.

The movement of the ribosome along the mRNA is illustrated below.

The tRNAf, no longer attached to an amino acid, will exit the E site as the next (3rd) aa-tRNA enters the empty A site, based on a specific codon-anticodon interaction (assisted by elongation factors and powered by GTP hydrolysis) to begin another cycle of elongation. Note that in each cycle of elongation, an ATP is consumed to attach each amino acid to its tRNA, and two GTPs are hydrolyzed in the cycle itself. In other words, at the cost of three NTPs, protein synthesis is the most expensive polymer synthesis reaction in cells!

As polypeptides elongate, they eventually emerge from a groove in the large ribosomal subunit. As noted, a formylase enzyme in E coli cytoplasm removes the formyl group from the exposed initiation fmet from all growing polypeptides. While about 40% of E coli polypeptides still begin with methionine, specific proteases catalyze the hydrolytic removal of the amino-terminal methionine (and sometimes even more amino acids) from the other 60% of polypeptides. The removal of the formyl group and one or more N-terminal amino acids from new polypeptides are examples of post-translational processing.

4. Termination

Translation of an mRNA by a ribosome ends when translocation exposes one of the three stop codons in the A site of the ribosome. Stop codons are not situated some distance from the 3&rsquo end of an mRNA. The region between a stop codon to the end of the mRNA is called the 3&rsquo untranslated region of the messenger RNA (3&rsquoUTR).

Since there is no aminoacyl-tRNA with an anticodon to the stop codons (UAA, UAG or UGA), the ribosome actually stalls and the translation slow-down is just long enough for a protein termination factor to enter the A site. This interaction causes release of the new polypeptide and the disassembly of the ribosomal subunits from the mRNA. The process requires energy from yet another GTP hydrolysis. After dissociation, ribosomal subunits can be reassembled with an mRNA for another round of protein synthesis. Translation termination is illustrated below.

We have seen some examples of post-translational processing (removal of formyl groups in E coli, removal of the N-terminal methionine from most polypeptides, etc.) Most proteins, especially in eukaryotes, undergo one or more additional steps of posttranslational processing before becoming biologically active. We will see examples in upcoming chapters.

Let&rsquos conclude this chapter with a &ldquowe thought we knew everything&rdquo moment! A recent study reports that ribosomes can sometimes re-initiate translation in the 3&rsquo UTR of an mRNA using AUG codons upstream of the normal start codon of the mRNA. There is evidence that the resulting short polypeptides may be functional! Click here to read more: here.


How does GTP help in the step of codon recognition? - Biologie

A subscription to J o VE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds .

The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.

If that doesn't help, please let us know.

On the mRNA, the start site for translation is crucial. If translation were to begin one nucleotide before or after the start codon, every codon that follows in the mRNA will be misread, synthesizing a non-functional sequence of amino acids.

Translation begins with the codon AUG, and an initiator tRNA that carries the amino acid Methionine or, the chemically modified formylmethionine in bacteria. 

The initiator tRNA also contains conserved nucleotides that are recognized by proteins called eukaryotic initiation factors, or eIFs. 

Together with eIF2 and GTP, the initiator tRNA binds the P site of the small ribosomal subunit forming the eukaryotic pre-initiation complex.

This complex recognizes the mRNA by interacting with initiation factors eIF4E bound to the 5’ cap, and eIF4G bound to the poly(A) tail-binding proteins.

Powered by ATP hydrolysis, the complex then moves from 5ʹ to 3ʹ direction, with the tRNA anticodon searching for the first AUG sequence on the mRNA.

Upon codon-anticodon recognition, GTP is hydrolyzed and the initiation factors dissociate, allowing the large ribosomal subunit to join the complex and form an intact ribosome.

Now, a new tRNA, carrying the second amino acid, can bind to the A-site on the ribosome and protein synthesis can begin.

In bacteria, mRNAs do not have 5’ caps to initiate translation. 

Instead, each bacterial mRNA contains a leader sequence upstream of the first AUG codon, called the Shine-Dalgarno sequence.

This consensus AGGAGGU sequence serves as the ribosomal binding site by base pairing with a complementary sequence on the 16S rRNA of the small ribosomal subunit. 

Now, the 50S ribosomal subunit can bind to the initiation complex, with the complete ribosome ready to begin translation.

9.5: Initiation of Translation

Initiating translation is complex because it involves multiple molecules. Initiator tRNA, ribosomal subunits, and eukaryotic initiation factors (eIFs) are all required to assemble on the initiation codon of mRNA. This process consists of several steps that are mediated by different eIFs.

First, the initiator tRNA must be selected from the pool of elongator tRNAs by eukaryotic initiation factor 2 (eIF2). The initiator tRNA (Met-tRNAi) has conserved sequence elements including modified bases at specific positions. This makes Met-tRNAi different from other

tRNAs carrying Methionine.

Next, the eIF2/GTP/Met-tRNAi ternary complex and other eIFs bind to the small ribosomal subunit to form a 43S preinitiation complex. Before the preinitiation complex binds the mRNA, to make sure that a correctly processed mRNA is translated, the cell uses initial recognition of the 5’ cap of the mRNA by the eIF4E subunit of eIF4F.

Most eukaryotic mRNAs are monocistronic, that is, they encode only a single protein. Once the preinitiation complex is bound to the mRNA, the complex moves forward to search for the first AUG triplet, which is usually 50� nucleotides downstream of the 5′-terminal cap.

During this scan, the nucleotides adjacent to the start codon affect the efficiency of codon recognition. If the recognition site is substantially different from the consensus recognition sequence (5ʹ-ACCAUGG-3ʹ), the preinitiation complex may skip over the first AUG triplet in the mRNA and continue scanning to the next AUG. This phenomenon is known as “leaky scanning.” Several viruses, such as the human papillomavirus, use leaky scanning as the predominant mechanism during translation. Other cells also frequently use this to produce multiple proteins from the same mRNA molecule.

Bacterial ribosomes can assemble directly on a start codon that lies several nucleotides downstream of the Shine-Dalgarno sequence. So, a single molecule of bacterial mRNA can code for several different proteins, which makes bacterial mRNAs polycistronic.


Abstract

GTP hydrolysis by elongation factor Tu (EF-Tu) on the ribosome is induced by codon recognition. The mechanism by which a signal is transmitted from the site of codon−anticodon interaction in the decoding center of the 30S ribosomal subunit to the site of EF-Tu binding on the 50S subunit is not known. Here we examine the role of the tRNA in this process. We have used two RNA fragments, one which contains the anticodon and D hairpin domains (ACD oligomer) derived from tRNA Phe and the second which comprises the acceptor stem and T hairpin domains derived from tRNA Ala (AST oligomer) that aminoacylates with alanine and forms a ternary complex with EF-Tu·GTP. While the ACD oligomer and the ternary complex containing the Ala-AST oligomer interact with the 30S and 50S A site, respectively, no rapid GTP hydrolysis was observed when both were bound simultaneously. The presence of paromomycin, an aminoglycoside antibiotic that binds to the decoding site and stabilizes codon−anticodon interaction in unfavorable coding situations, did not increase the rate of GTP hydrolysis. These results suggest that codon recognition as such is not sufficient for GTPase activation and that an intact tRNA molecule is required for transmitting the signal created by codon recognition to EF-Tu.

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Wi 626/11-2), the Alfried Krupp von Bohlen und Halbach-Stiftung, and the Fonds der Chemischen Industrie. T.P. acknowledges a fellowship of the Werner Richard-Dr. Carl Dörken-Stiftung.

Present address: Abteilung Molekulare Entwicklungsbiologie, Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, 37077 Göttingen, Germany.

Present address: Department of Biochemistry, Imperial College of Science, Technology and Medicine, London SW7 2AY, U.K.

Correspondence should be addressed to this author at the Institute of Molecular Biology, University of Witten/Herdecke, 58448 Witten, Germany. Phone: +49 2302 669 119 Fax: +49 2302 669 117 E-mail: [email protected]


Stalling of the ribosome by SecM

Similar to TnaC described above, the peptide SecM exists solely to stall the ribosome synthesizing it. But unlike TnaC, which also requires the presence of high levels of trytophan, SecM has an intrinsic stalling capability. Stalling of the ribosome synthesizing SecM provides time for a downstream RNA helix on the same mRNA strand to unwind. Unwinding of this helix then allows for a new ribosome to bind and synthesize a new protein, SecA, a bacterial ATP-driven translocase that aids the passage of nascent proteins across membranes in conjunction with SecY (see also Dynamics of Protein Translocation). When sufficient levels of SecA have been reached, SecA interacts with the SecM-stalled ribosome to pull on SecM, freeing it and allowing translation to resume (illustrated schematically in Fig. 13). SecM, which serves no other purpose than to stall the ribosome, is released into the cell and degraded.

Much of what is known about SecM stalling comes from biochemical experiments, in which every amino acid in SecM's sequence has been mutated and the resulting effects measured. These experiments revealed few residues as critical, although one stands out in every species as invariable: arginine 163 (R163, see Fig. 13 below). However, until recently, little was known about the precise mechanisms at work. A cryo-EM map of a SecM-stalled ribosome revealed a shifted linkage in the PTC between the P-site tRNA and the SecM peptide. Although the shift was only 0.2 nm, it was hypothesized to be sufficient to inhibit peptide-bond formation, preventing synthesis of the remainder of SecM.

In order to elucidate precisely how SecM stalls the ribosome, we first applied MDFF to the cryo-EM map of the SecM-stalled ribosome to develop an atomic model of the complex. Next, we carried out extensive simulations of this wild-type model along with mutants of both the ribosome and SecM known to disrupt stalling. We discovered a putative communication pathway between the critical R163 and the PTC that causes the observed shifted linkage the pathway is shown schematically in Fig. 13. Finally, through steered MD simulations in which we pulled on the N-terminal end of SecM outside the ribosome, we determined that the pulling action of SecA can break the crucial interactions identified in our previous simulations and, thus, alleviate stalling.

Fig. 13. (left) Structure of the SecM-stalled ribosome determined with MDFF. SecA is shown for visualization purposes only. (middle) Atomic-scale view of SecM in the ribosome's exit tunnel, near the PTC at the top. Residues involved in ribosome-SecM interactions are labeled. (right) Schematic of the communication pathway connecting SecM to the ribosome's PTC.


15.4 RNA Processing in Eukaryotes

In deze sectie onderzoek je de volgende vragen:

  • What are the steps in eukaryotic transcription?
  • What are the structural and functional similarities and differences among the three RNA polymerases?

Aansluiting voor AP ® Cursussen

Scientists discovered a strand of mRNA translated into a sequence of amino acids (polypeptide) shorter than the mRNA molecule transcribed from DNA. Before the information in eukaryotic mRNA is translated into protein, it is modified or edited in several ways. A 5′ methylguanosine (or GTP) cap and a 3′ poly-A tail are added to protect mature mRNA from degradation and allow its export from the nucleus. Pre-mRNAs also undergo splicing, in which introns are removed and exons are reconnected. Exons can be reconnected in different sequences, a phenomenon referred to as alternative gene splicing, which allows a single eukaryotic gene to code for different proteins. (We will explore the significance of alternative gene splicing in more detail in other chapters.)

Information presented and the examples highlighted in the section support concepts outlined in Big Idea 3 of the AP ® Biology Curriculum Framework. The Learning Objectives listed in the Curriculum Framework provide a transparent foundation for the AP ® Biology course, an inquiry-based laboratory experience, instructional activities, and AP ® Exam questions. A Learning Objective merges required content with one or more of the seven Science Practices.

Groot idee 3 Levende systemen slaan informatie op, halen deze op, verzenden en reageren op informatie die essentieel is voor levensprocessen.
Blijvend begrip 3.A Erfelijke informatie zorgt voor continuïteit van het leven.
Essentiële kennis 3.A.1 DNA, en in sommige gevallen RNA, is de primaire bron van erfelijke informatie.
Wetenschapspraktijk 6.5 The student can evaluate alternative scientific explanations.
Leerdoel 3.1 The student is able to construct scientific explanations that use the structures and mechanisms of DNA and RNA to support the claim that DNA and, in some cases, that RNA are the primary sources of heritable information.

Teacher Support

Have students work in groups of 4–5 and ask them to prepare models of RNA molecules undergoing processing. Supply scissors, glue, large sheets of white paper, and colored construction paper to differentiate the components of RNA molecules, exons and introns, and the other molecules such as transcription factors and enzymes associated with the process. Emphasize the importance of the order of the steps. Ask students to specify whether these steps happen in the nucleus or in the cytoplasm.

Ask students which mRNAs would they expect to be stable and which mRNAs should have short half-lives. Proteins that control growth and cell cycles are associated with short-lived RNAs. The globin mRNAs which encode the protein parts of hemoglobin are unusually stable. Synthesis of globin continues in red blood cells without the nucleus being present.

Explain that introns and exons vary in number and length. Mention that not all exons will be included in the final polypeptide and that there is alternative splicing which allows cells to produce different proteins using the same gene.

After transcription, eukaryotic pre-mRNAs must undergo several processing steps before they can be translated. Eukaryotic (and prokaryotic) tRNAs and rRNAs also undergo processing before they can function as components in the protein synthesis machinery.

MRNA Processing

The eukaryotic pre-mRNA undergoes extensive processing before it is ready to be translated. The additional steps involved in eukaryotic mRNA maturation create a molecule with a much longer half-life than a prokaryotic mRNA. Eukaryotic mRNAs last for several hours, whereas the typical E coli mRNA lasts no more than five seconds.

Pre-mRNAs are first coated in RNA-stabilizing proteins these protect the pre-mRNA from degradation while it is processed and exported out of the nucleus. The three most important steps of pre-mRNA processing are the addition of stabilizing and signaling factors at the 5' and 3' ends of the molecule, and the removal of intervening sequences that do not specify the appropriate amino acids. In rare cases, the mRNA transcript can be “edited” after it is transcribed.

Evolutie verbinding

RNA Editing in Trypanosomes

The trypanosomes are a group of protozoa that include the pathogen Trypanosoma brucei, which causes sleeping sickness in humans (Figure 15.13). Trypanosomes, and virtually all other eukaryotes, have organelles called mitochondria that supply the cell with chemical energy. Mitochondria are organelles that express their own DNA and are believed to be the remnants of a symbiotic relationship between a eukaryote and an engulfed prokaryote. The mitochondrial DNA of trypanosomes exhibit an interesting exception to The Central Dogma: their pre-mRNAs do not have the correct information to specify a functional protein. Usually, this is because the mRNA is missing several U nucleotides. The cell performs an additional RNA processing step called RNA editing to remedy this.

Other genes in the mitochondrial genome encode 40- to 80-nucleotide guide RNAs. One or more of these molecules interacts by complementary base pairing with some of the nucleotides in the pre-mRNA transcript. However, the guide RNA has more A nucleotides than the pre-mRNA has U nucleotides to bind with. In these regions, the guide RNA loops out. The 3' ends of guide RNAs have a long poly-U tail, and these U bases are inserted in regions of the pre-mRNA transcript at which the guide RNAs are looped. This process is entirely mediated by RNA molecules. That is, guide RNAs—rather than proteins—serve as the catalysts in RNA editing.

RNA editing is not just a phenomenon of trypanosomes. In the mitochondria of some plants, almost all pre-mRNAs are edited. RNA editing has also been identified in mammals such as rats, rabbits, and even humans. What could be the evolutionary reason for this additional step in pre-mRNA processing? One possibility is that the mitochondria, being remnants of ancient prokaryotes, have an equally ancient RNA-based method for regulating gene expression. In support of this hypothesis, edits made to pre-mRNAs differ depending on cellular conditions. Although speculative, the process of RNA editing may be a holdover from a primordial time when RNA molecules, instead of proteins, were responsible for catalyzing reactions.

  1. mRNA editing changes the coding sequence of the mRNA, but mRNA processing does not.
  2. mRNA editing splices out noncoding RNA, but mRNA processing does not.
  3. mRNA editing adds a cap of 5’-methylguanosine to the mRNA, but mRNA processing does not.
  4. mRNA editing adds a 3’ poly-A tail, but mRNA processing does not.

5' Capping

While the pre-mRNA is still being synthesized, a 7-methylguanosine cap is added to the 5' end of the growing transcript by a phosphate linkage. This moiety (functional group) protects the nascent mRNA from degradation. In addition, factors involved in protein synthesis recognize the cap to help initiate translation by ribosomes.

3' Poly-A Tail

Once elongation is complete, the pre-mRNA is cleaved by an endonuclease between an AAUAAA consensus sequence and a GU-rich sequence, leaving the AAUAAA sequence on the pre-mRNA. An enzyme called poly-A polymerase then adds a string of approximately 200 A residues, called the poly-A tail . This modification further protects the pre-mRNA from degradation and signals the export of the cellular factors that the transcript needs to the cytoplasm.

Pre-mRNA Splicing

Eukaryotic genes are composed of exons , which correspond to protein-coding sequences (ex-on signifies that they are expressed), and intervening sequences called introns (int-ron denotes their intervening role), which may be involved in gene regulation but are removed from the pre-mRNA during processing. Intron sequences in mRNA do not encode functional proteins.

The discovery of introns came as a surprise to researchers in the 1970s who expected that pre-mRNAs would specify protein sequences without further processing, as they had observed in prokaryotes. The genes of higher eukaryotes very often contain one or more introns. These regions may correspond to regulatory sequences however, the biological significance of having many introns or having very long introns in a gene is unclear. It is possible that introns slow down gene expression because it takes longer to transcribe pre-mRNAs with lots of introns. Alternatively, introns may be nonfunctional sequence remnants left over from the fusion of ancient genes throughout evolution. This is supported by the fact that separate exons often encode separate protein subunits or domains. For the most part, the sequences of introns can be mutated without ultimately affecting the protein product.

All of a pre-mRNA’s introns must be completely and precisely removed before protein synthesis. If the process errs by even a single nucleotide, the reading frame of the rejoined exons would shift, and the resulting protein would be dysfunctional. The process of removing introns and reconnecting exons is called splicing (Figure 15.14). Introns are removed and degraded while the pre-mRNA is still in the nucleus. Splicing occurs by a sequence-specific mechanism that ensures introns will be removed and exons rejoined with the accuracy and precision of a single nucleotide. The splicing of pre-mRNAs is conducted by complexes of proteins and RNA molecules called spliceosomes.

Visuele verbinding

  1. Mutations in the spliceosome recognition sequence at each end of an intron, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may occur. Mutations may also add new spliceosome recognition sites.
  2. Mutations in the spliceosome recognition sequence at each end of an exon, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may occur. Mutations may also add new spliceosome recognition sites.
  3. Mutations in the spliceosome recognition sequence at each end of an intron, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may occur. Mutations may also delete existing spliceosome recognition sites.
  4. Mutations at the each end of intron and exon, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may occur. Mutations may also add new spliceosome recognition sites and delete existing sites.

Note that more than 70 individual introns can be present, and each has to undergo the process of splicing—in addition to 5' capping and the addition of a poly-A tail—just to generate a single, translatable mRNA molecule.

Link naar leren

See how introns are removed during RNA splicing at this website.

  1. Helper proteins attach themselves to the ends of introns so that they can be spliced out during RNA splicing and coded areas are spliced together to form mRNA which then codes for the final protein.
  2. Helper proteins attach themselves to the ends of exons so that they can be spliced out during RNA splicing and coded areas are spliced together to form mRNA which encodes the final protein.
  3. Helper proteins attach themselves to mRNA in order to remove the non-coded areas and thus form the pre-mRNA which codes for the final protein.
  4. Helper proteins help the pre-mRNA to recruit various other components which splice out the non-coded regions and form mRNA which codes for the final protein.

Processing of tRNAs and rRNAs

The tRNAs and rRNAs are structural molecules that have roles in protein synthesis however, these RNAs are not themselves translated. Pre-rRNAs are transcribed, processed, and assembled into ribosomes in the nucleolus. Pre-tRNAs are transcribed and processed in the nucleus and then released into the cytoplasm where they are linked to free amino acids for protein synthesis.

Most of the tRNAs and rRNAs in eukaryotes and prokaryotes are first transcribed as a long precursor molecule that spans multiple rRNAs or tRNAs. Enzymes then cleave the precursors into subunits corresponding to each structural RNA. Some of the bases of pre-rRNAs are methylated that is, a –CH3 moiety (methyl functional group) is added for stability. Pre-tRNA molecules also undergo methylation. As with pre-mRNAs, subunit excision occurs in eukaryotic pre-RNAs destined to become tRNAs or rRNAs.

Mature rRNAs make up approximately 50 percent of each ribosome. Some of a ribosome’s RNA molecules are purely structural, whereas others have catalytic or binding activities. Mature tRNAs take on a three-dimensional structure through intramolecular hydrogen bonding to position the amino acid binding site at one end and the anticodon at the other end (Figure 15.15). The anticodon is a three-nucleotide sequence in a tRNA that interacts with an mRNA codon through complementary base pairing.

Als Amazon Associate verdienen we aan in aanmerking komende aankopen.

Wilt u dit boek citeren, delen of wijzigen? Dit boek is Creative Commons Attribution License 4.0 en je moet OpenStax toeschrijven.

    Als u dit boek geheel of gedeeltelijk in gedrukte vorm opnieuw distribueert, moet u op elke fysieke pagina de volgende bronvermelding opnemen:

  • Gebruik de onderstaande informatie om een ​​citaat te genereren. We raden aan om een ​​citatietool zoals deze te gebruiken.
    • Authors: Julianne Zedalis, John Eggebrecht
    • Uitgever/website: OpenStax
    • Book title: Biology for AP® Courses
    • Publication date: Mar 8, 2018
    • Locatie: Houston, Texas
    • Book URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/1-introduction
    • Section URL: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/15-4-rna-processing-in-eukaryotes

    © Jan 12, 2021 OpenStax. Tekstboekinhoud geproduceerd door OpenStax is gelicentieerd onder een Creative Commons Attribution License 4.0-licentie. De OpenStax-naam, het OpenStax-logo, de OpenStax-boekomslagen, de OpenStax CNX-naam en het OpenStax CNX-logo zijn niet onderworpen aan de Creative Commons-licentie en mogen niet worden gereproduceerd zonder de voorafgaande en uitdrukkelijke schriftelijke toestemming van Rice University.


    Bekijk de video: How to Transcribe DNA to RNA (December 2021).