Informatie

Welk plasmide kan T7-RNA-polymerase tot expressie brengen in zoogdiercellen?


Weet iemand welk plasmide T7-RNA-polymerase tot expressie kan brengen in zoogdiercellen, ik zou het graag willen transfecteren met een ander plasmide dat het gen van belang bevat onder controle van de T7-promoter. Heel erg bedankt!


Een leidersequentie die in staat is om RNA-expressie en eiwitsynthese in zoogdiercellen te verbeteren

Brian P. Wellensiek, Andrew C. Larsen en Julia Flores droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

Centrum voor Evolutionaire Geneeskunde en Informatica, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Centrum voor Evolutionaire Geneeskunde en Informatica, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Afdeling Scheikunde en Biochemie, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Centrum voor Infectieziekten en Vaccinologie, The Biodesign Institute, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5401

School of Life Sciences, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5912

Centrum voor Evolutionaire Geneeskunde en Informatica, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Afdeling Scheikunde en Biochemie, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Correspondentie met: John C. Chaput, 727 E. Tyler, Tempe, AZ 85287-5301. E-mail: [email protected] Zoek naar meer artikelen van deze auteur

Centrum voor Evolutionaire Geneeskunde en Informatica, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Brian P. Wellensiek, Andrew C. Larsen en Julia Flores droegen in gelijke mate bij aan dit werk.

Centrum voor Evolutionaire Geneeskunde en Informatica, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Centrum voor Evolutionaire Geneeskunde en Informatica, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Afdeling Scheikunde en Biochemie, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Centrum voor Infectieziekten en Vaccinologie, The Biodesign Institute, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5401

School of Life Sciences, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5912

Centrum voor Evolutionaire Geneeskunde en Informatica, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Afdeling Scheikunde en Biochemie, Arizona State University, Tempe, Arizona, 85287-5301

Correspondentie met: John C. Chaput, 727 E. Tyler, Tempe, AZ 85287-5301. E-mail: [email protected] Zoek naar meer artikelen van deze auteur


T7 en DH5 alpha - Help me wat dingen op te helderen (Feb/04/2010 )

Hallo!
Ik ben bezig met mijn masterscriptie en ik probeer een aantal dingen op te helderen zodat ik ze volledig begrijp. Nu ben ik het T7-expressiesysteem aan het onderzoeken. Als ik het goed begrijp, wordt het T7-RNA-polymerase meestal ingebouwd in het chromosomale genoom onder controle van een lac-operator die de transcriptie start met de toevoeging van IPTG. Vervolgens vindt het polymerase de T7-promotor op het plasmide en begint het mRNA vanaf deze plaats te transcriberen.

Ik heb echter ergens gelezen dat mijn bacteriestam, DH5-alfa, zijn eigen T7-RNA-polymerase-gen niet draagt, en dat dit op het plasmide aanwezig zou moeten zijn en getransformeerd moet worden. Is dit waar? Ik vermoed van niet, omdat ik niet kan zien dat mijn plasmiden (pTZ19R en pSE420) zoiets bevatten. Kun je me helpen om dingen op te helderen?

Wat je leest klopt. De meeste T7-expressie vindt plaats in bacteriestammen die zijn gelysogeniseerd met de DE3-faag, die het T7-RNA-polymerase onder controle van de lac-promoter draagt. DH5a heeft dit niet. Gewoonlijk worden stammen met deze modificatie in hun naam aangegeven, zoals BL21 (DE3). De reden dat DH5a deze modificatie typisch niet draagt, is dat het slecht is voor eiwitexpressie, omdat het nog steeds het lon-protease bevat, dat de neiging heeft om tot expressie gebrachte eiwitten af ​​te breken. De BL21-stam is uitgeschakeld voor deze en andere proteasen.

Je zou zeker de lac-promoter en het T7-RNA-polymerase-gen op een plasmide (hetzelfde of een co-transformerende) in DH5a kunnen dragen. Weinig mensen doen dit, omdat ze zich zorgen maken over de resulterende eiwitexpressie.

Bedankt voor je antwoord. Ik hoopte dat ik dingen verkeerd had zodat ze logischer zouden zijn. Ik ging terug naar mijn oorspronkelijke bron en ze klonen mijn gen in een pTZ19R-expressievector en transformeren in DH5a voor expressie. Als DH5a een slechte genexpressiestam is, waarom zou iemand dat dan willen doen? En hoe vindt expressie plaats als er geen T7 RNA-polymerase is?

Ik heb geprobeerd het onderwerp nu te onderzoeken, maar het enige dat het doet, is me meer in de war brengen. Ik vond dit in een Invitrogen-informatiedocument:
Belangrijk: DH5'945 E. coli heeft geen IPTG nodig om zelfs expressie van de lac-promoter te induceren
hoewel de stam de Lac-repressor uitdrukt. Het aantal kopieën van de meeste plasmiden overschrijdt
het repressornummer in de cellen. Als u zich zorgen maakt over het verkrijgen van maximale niveaus van
expressie, voeg IPTG toe tot een eindconcentratie van 1 mM.

Mijn oorspronkelijke bron vermeldt IPTG helemaal niet, en ik nam aan dat dit was omdat ze niet alle informatie over de productie van het eiwit wilden geven, maar misschien gebruiken ze het gewoon niet?

Ik heb ook gemerkt dat ik duidelijkere resultaten krijg op mijn SDS-PAGE terwijl ik een methode gebruik waarbij PMSF betrokken is. Mijn supervisors mening is dat het niet nodig is, maar ik denk dat het de lon-protease zou blokkeren en een soort van effect zou hebben? Ik zal daar waarschijnlijk nog wat meer testen over doen, alleen voor persoonlijk vermaak..

Ok, ik ben gewoon aan het brabbelen met mijn vragen, maar de eerste zijn de belangrijkste. Waar is de polymerase?

Het pTZ19R-plasmide heeft ZOWEL een lac-promoter en een T7-promotor stroomopwaarts van zijn meervoudige kloneringsplaats. In een LacI-stam zal dit tot expressie komen vanaf de lac-promotor, wat niets te maken heeft met de T7-promotor. De T7-promoter is er om expressie in een BL21 (DE3)-stam mogelijk te maken. Als ik om het eiwit zou geven, zou ik subkloneren in BL21(DE3) en induceren met IPTG, en dan (zoals u doet) zuiveren in aanwezigheid van PMSF, hoewel dat bij BL21-stammen minder belangrijk is.


RESULTATEN

Niet-cytopathische RNA-vectoren.

Het niet-cytopathische replicon SINrep19 is ontworpen als een dubbele subgenomische RNA-vector, met behulp van de 5'-promotor voor vreemde genexpressie en een 3'-promotor om de expressie van pac (Figuur 1EEN). BHK-cellen werden getransfecteerd met gesynthetiseerde afgetopte replicon-RNA's in vitro, verguld en 12-18 uur toegestaan ​​om te herstellen. We legden vervolgens selectie op voor cellen die productief waren getransfecteerd met de replicons door toevoeging van puromycine aan celkweekmedium. Binnen 24 uur werden controle- of niet-getransfecteerde cellen volledig geëlimineerd (I.F., E.A., T.A. Hoffman, B.M.P., M.S. Lippa, S.S. en C.M.R., niet-gepubliceerde gegevens).

Niet-cytopathische SIN-vectoren. (EEN) SINrep19 RNA, de dubbele subgenomische niet-cytopathische RNA-vector, transcribeert vreemde genen en de pac gen uit negatieve streng-templates met behulp van afzonderlijke subgenomische promoters (promoterposities worden aangegeven door pijlen in zowel DNA- als RNA-constructen). (B) Een bipartiete niet-cytopathische RNA-vector vertrouwt op SINrep18 om de replicatie te ondersteunen van een defect, interfererend SIN-genoom dat een gen van belang bevat. Het 5'-uiteinde van het DI-RNA heeft een tRNA Asp-sequentie (20). (C) SINrep21 is een DNA-vector voor het SINrep19-replicon. Na DNA-transfectie werden replicon-RNA's getranscribeerd via nucleaire enzymen en naar het cytoplasma getransporteerd. Replicaties initiëren autonome replicatie en drukken de . uit pac gen en vreemde genen van belang. Run-off verwijst naar geschikte sites voor run-off transcriptie MCS, sites voor meerdere klonen.

Een vergelijking van de totale β-gal-activiteit geleverd door SINrep19/lacZ met die van andere SIN/lacZ-replicons wordt getoond in Tabel 1. Het persistente replicon produceerde slechts ≈4% van de enzymactiviteit geproduceerd door het cytopathische SINrep3/lacZ-replicon. Dit is in overeenstemming met de verlaagde niveaus van genomische en subgenomische SIN-RNA's die zijn waargenomen in cellen die zijn getransfecteerd met het niet-cytopathische ouderreplicon (I.F., E.A., T.A. Hoffman, B.M.P., M.S. Lippa, S.S. en C.M.R., niet-gepubliceerde gegevens).

Expressie van β-gal door verschillende SIN-replicons

Strategieën met behulp van DI RNA's.

Een bepalend kenmerk van alfavirus-DI-deeltjes zijn verhoogde RNA-replicatieniveaus ten opzichte van wildtype- of helpervirus (19). DI-genomen die worden ondersteund door een niet-cytopathisch SIN-replicon, kunnen ook verhoogde replicatieniveaus vertonen en bijgevolg verhoogde productie van vreemde genen. Voor één SIN DI bleek een belangrijke determinant de vervanging te zijn van een tRNA-achtige structuur voor het authentieke 5'-uiteinde van een defect genoom (20). DI-RNA's die coderen voor heterologe genen werden geconstrueerd op basis van deze structuur en gebruikt in combinatie met een niet-cytopathisch replicon dat een enkele subgenomische promotor bevat om pac genexpressie (SINrep18).

In één strategie werden DI-RNA's getransfecteerd in pur R-cellen die SINrep18 al repliceerden (Fig. 1B). Om DI-getransfecteerde cellen fenotypisch te onderscheiden van niet-getransfecteerde cellen, werd een tweede dominante selecteerbare marker gebruikt. De neo gen, dat resistentie verleent tegen het geneesmiddel G418, werd naast het gen van belang geplaatst en aangestuurd door het interne ribosoomingangsplaatselement van het encefalomyocarditisvirus. de DI/lacZ-neo vector produceerde >20 keer het niveau van β-gal geproduceerd door SINrep19 maar iets minder dan dat van het cytopathische replicon (Tabel 1). Metabolische labeling van actinomycine-d-resistente RNA-soorten in vivo gaf aan dat DI-RNA's tot hogere niveaus repliceerden dan alleen niet-cytopathische replicons en dat DI/lacZ-neo-gemedieerde expressie was stabiel na meerdere passages, zelfs in de afwezigheid van G418-selectie (gegevens niet getoond). Deze gegevens suggereren dat een DI/replicon-vectorsysteem in staat is tot expressie op hoog niveau van vreemde genen, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van verhoogde replicatie van het DI-genoom ten opzichte van die van het replicon.

Om het vermogen van niet-cytopathische replicons om een ​​DI-vector te complementeren verder te karakteriseren, onderzochten we het vermogen van SINrep18 om expressie van luciferase te induceren in cellen die constitutief DI /luc van een nucleaire promotor. Dit transcript dient als een sjabloon voor replicatie en transcriptie bij introductie van een helpervirus of replicon (11). Zoals Tabel 2 laat zien, accumuleerden niet-geïnduceerde cellen een laag constitutief niveau van luciferase-activiteit dat werd versterkt door infectie en evenredig was met de hoeveelheid toegevoegd SIN-virus. Toen deze cellen werden getransfecteerd met SINrep18 gevolgd door puromycineselectie en passage, accumuleerde overvloedige luciferase-activiteit in de eerste 5 dagen en hield deze gedurende ten minste nog eens 4 dagen aan. Dus, hoewel niet-cytopathische replicons minder eiwit per tijdseenheid tot expressie brengen dan hun cytopathische tegenhangers, kan hun vermogen tot langdurige expressie leiden tot accumulatie van zeer hoge eiwitniveaus.

Inductie van luciferase door niet-cytopathische replicons of SIN-virus

Frequentie van tot expressie brengende cellen en stabiliteit van celpopulaties bij passage.

De stabiliteit van een expressievector op lange termijn bepaalt sterk het nut ervan. Omdat RNA-virussen, waaronder SIN, genetisch behoorlijk plastisch zijn, hebben we het patroon van β-gal-expressie via niet-cytopathische replicons, per cel, in de loop van de tijd onderzocht. Zoals Fig. 2 laat zien, repliceert een populatie cellen die SINrep19/lacZ bevatte >10% β-gal-negatieve cellen in de eerste paar passages en bleef expressie-negatieve cellen accumuleren bij verdere passage. Een vergelijkbaar verlies van expressie werd gezien voor SINrep18 + DI/lacZ (Fig. 2) en voor andere markergenen (gegevens niet getoond). Dus, ondanks de voortdurende selectie van puromycine, evenals het feit dat de lacZ en pac genen genetisch gekoppeld waren, ontstonden expressie-negatieve varianten binnen de geselecteerde populaties. We hebben twee belangrijke bronnen voor deze heterogeniteit overwogen: (l) replicons accumuleren waarschijnlijk mutaties of deleties in de lacZ-gen tijdens SIN-replicatie en (ii) replicons worden geïnitieerd als een populatie, wat de heterogeniteit van de in vitro gesynthetiseerde RNA's.

Stabiliteit van β-gal-expressie door niet-cytopathische replicons. Tijdens de celpassage (1:10, ongeveer elke 48 uur) werd een deel van de cellen in afzonderlijke putjes gezaaid en gekleurd met X-gal zoals beschreven in Materialen en methodes. De stabiliteit van p-gal tot expressie brengende gekloonde cellijnen werd bepaald door gebruik te maken van klonen die waren geselecteerd op expressie op hoog niveau. Het percentage β-gal-negatieve cellen werd berekend door microscopisch onderzoek van verschillende willekeurige velden.

Om de eerste van deze zorgen weg te nemen. we onderzochten de stabiliteit van expressie in gekloonde populaties van β-gal-positieve cellen. Zoals te zien is in Fig. 2, is een klonaal derivaat van SINrep19/lacZ handhaafde >90% p-gal-expressie door 10 passages werden vergelijkbare resultaten gezien met meerdere celklonen (gegevens niet getoond). De stabiliteit van SINrep18 + DI/lacZ was ook verbeterd na het klonen van een β-gal-positieve cel, hoewel het expressiepercentage bij de 10e passage daalde. Voor gekloonde populaties van zowel SINrep19/lacZ en SINrep18 + DI/lacZ, het weglaten van selectie had geen effect op het percentage P-gal tot expressie brengende cellen over zeven passages (gegevens niet getoond). Deze resultaten suggereren dat het verlies van expressie optreedt als gevolg van SIN-replicatie, maar dit verklaart niet volledig de instabiliteit in niet-gekloneerde populaties. In praktische zin kan deze instabiliteit worden beheerd door het gebruik van cellen met vroege passage en door expressie-positieve cellen direct te klonen.

De hoge mutatiesnelheid van SP6-RNA-polymerase kan bijdragen aan de initiële heterogeniteit binnen een repliconpopulatie. In vivo transcriptie van functionele RNA-replicons met behulp van de nucleaire RNA-polymerase II van de gastheercel zou een alternatief kunnen zijn voor in vitro transcriptie, vergelijkbaar met gepubliceerde strategieën (21, 22). Deze benadering werd voor het eerst getest door p987/SINrep19/lacZ te construeren, die de SINrep19/lacZ-cDNA geflankeerd door de Rous-sarcoomvirus 5'-lange terminale herhalingspromotor en het apenvirus 40-polyadenyleringssignaal. Replicatie van dit replicon werd geïnitieerd door tijdelijke transfectie van plasmide-DNA en puromycineselectie van getransfecteerde populaties. Dergelijke populaties vertoonden langdurige expressie van p-gal in > gt90% van de cellen, hoewel een klein maar detecteerbaar verlies van expressie werd waargenomen (Fig. 2). Er werden geen verschillen in expressieniveau opgemerkt tussen SINrep19- versus p987/SINrep19-tot expressie gebrachte producten. Op basis van dit ontwerp werd een algemene DNA-vector, pSINrep21, geconstrueerd in een middelgrote kopie-vector (Fig. 1C).

Expressie van verschillende heterologe eiwitten.

Enkele representatieve genen die tot expressie worden gebracht met behulp van niet-cytopathische replicons worden getoond in Fig. 3. SINrep19/GFP bevat een synthetische, voor menselijke codons geoptimaliseerde versie van de Aequeorea victoria GFP-gen (12), dat leidde tot heldere fluorescentie van pur R-populaties (Fig. 3 'EEN). Afb. 3B demonstreert het patroon van X-gal-kleuring voor een vijfde passage SINrep19/lacZ tot expressie brengende celpopulatie.

Expressie van modeleiwitten via niet-cytopathische vectoren. Cellen werden geselecteerd na transfectie met SINrep19/GFP (EEN), SINrep19/lacZ (B), SINrep19/CD46 (C en E), of SINrep18 (NS en F). Alle cellen waren representatieve populaties geselecteerd voor pur R zoals beschreven in de tekst. Cellen werden bereid door X-gal-kleuring (B) of immunofluorescentiekleuring voor CD46 (C en NS). (E en F) tonen de toestand van cellen 54 uur na infectie met MV [multipliciteit van infectie (moi) 0,1].

We waren vooral geïnteresseerd in het gebruik van niet-cytopathische replicons om eiwitten aan de secretoire route af te leveren, omdat een gevolg van SIN-infectie de disregulatie van deze cellulaire compartimenten kan zijn (23). We brachten het glycoproteïne CD46 op het menselijke celoppervlak tot expressie, dat betrokken is bij complementregulatie en de receptor is voor het mazelenvirus (MV). CD46 werd tot expressie gebracht op het oppervlak van cellen die SINrep19 / CD46 repliceren (Fig C en NS). Omdat deze receptor vereist is voor MV-binding en binnenkomst, hebben we getest of CD46-expressie MV-permissiviteit aan BHK-cellen zou kunnen verlenen. Zoals te zien in Fig. 3 E en F, toonde een populatie van SINrep19 / CD46-cellen de syncytia-vorming aan die typisch wordt veroorzaakt door MV-infectie, terwijl SINrep18-cellen niet-permissief bleven.

Bovendien werd een niet-membraan verankerde vorm van humane placentaire alkalische fosfatase (SEAP) uitgescheiden in het medium van cellen die SINrep19/SEAP repliceren met een snelheid van 400 ng/106 cellen/24 uur. Evenzo werd een afgeknotte vorm van het E2-glycoproteïne van het hepatitis C-virus (HCV), zonder een transmembraananker, correct geglycosyleerd en gericht op uitscheiding (gegevens niet getoond). De structurele eiwitten van het gele koorts (YF)-virus prM/E zijn ook tot expressie gebracht via SINrep19 en worden correct verwerkt tot prM en E (gegevens niet getoond). Deze gegevens tonen aan dat niet-cytopathische SIN-vectoren biologisch actieve eiwitten aan de secretoire route kunnen leveren.

Expressie van T7 RNA-polymerase.

We onderzochten het vermogen van niet-cytopathische replicons om faag-T7-RNA-polymerase rechtstreeks naar gastheercellen tot expressie te brengen. Dit enzym wordt gewoonlijk aan zoogdiercellen afgegeven door gebruik te maken van een recombinant vacciniavirus, vTF7-3, en het heeft brede bruikbaarheid gevonden bij tijdelijke overexpressie van vreemde genen die stroomafwaarts van de T7-promoter zijn gekloond en geschikte translationele signalen (24). De functie van T7-RNA-polymerase tot expressie gebracht via SINrep19/T7pol werd aangetoond met behulp van verschillende reporters. In één reeks experimenten hebben we deze cellen getransfecteerd met plasmide-DNA dat een functionele Mengo-viruskloon bevat onder transcriptionele controle van de T7-promoter. Zoals te zien is in Fig. 4EEN, was de vorming van Mengo-virusplaques specifiek voor cellen die SINrep19/T7pol herbergen. Deze plaques waren qua grootte en morfologie identiek aan het Mengo-virus geïnitieerd vanaf in vitro transcripties (gegevens niet getoond).

Functionele expressie van T7 RNA-polymerase. (EEN) Mengo-virusplaques na transfectie van controle-BHK-cellen (SINrep18) of T7 tot expressie brengende BHK-cellen (SINrep19/T7pol) met een T7-aangedreven functionele kloon van Mengo-virus. (B) Expressie van het HCV-polyproteïne met (lanen 2 en 3) of zonder (lanen 1 en 4) transfectie van pBRTM/HCV827-3011. Lanen 1 en 2 waren afgeleid van cellen die waren geïnfecteerd met vTF7-3, terwijl lanen 3 en 4 cellen vertegenwoordigen die SINrep19/T7pol bevatten. (C) Expressie van luciferase na transfectie van pEMCLucβgAN in cellen die T7-RNA-polymerase tot expressie brengen via vTF7-3, SINrep19/T7pol, of die T7-RNA-polymerase niet tot expressie brengen (controle). Lysaten werden 6, 24 of 36 uur na transfectie bereid. Dit experiment is representatief voor drie onafhankelijke experimenten.

In een andere reeks experimenten werden T7-RNA-polymerase tot expressie brengende cellen getransfecteerd met pBRTM/HCV827-3011, een plasmide dat het niet-structurele gebied van HCV bevat onder controle van de T7-promoter (25). De verwachte producten werden geïmmunoprecipiteerd, wat aangeeft dat het HCV-polyproteïne tot expressie werd gebracht en op de juiste manier werd verwerkt (Fig. 4B, lanen 3 en 4). Ter vergelijking brachten we ook het faagpolymerase tot expressie via vTF7-3, wat dezelfde producten opleverde maar in grotere overvloed (Fig. 4B, lanen 1 en 2).

Om de hoeveelheid T7-tot expressie gebracht product beter te kwantificeren, onderzochten we de expressie van luciferase in de tijd in cellen die waren getransfecteerd met een plasmide dat codeert voor het luc-gen dat wordt aangestuurd door een T7-promoter, pEMCLucβgAN (een geschenk van Jon A. Wolff, Universiteit van Wisconsin). Cellen die T7-RNA-polymerase tot expressie brengen via vTF7-3 of SINrep19/T7pol hadden te allen tijde overvloedige luciferase-activiteit. Met vaccinia geïnfecteerde cellen vertoonden een eerdere piek van activiteit, die na 36 uur afnam, consistent met de vernietiging van geïnfecteerde cellen door vaccinia. Daarentegen bleef SINrep19 / T7pol luciferase accumuleren en overtrof de activiteit in vTF7-3-geïnfecteerde cellen tussen 24 en 36 uur. Deze gegevens laten zien dat SINrep19/T7pol functionele T7-RNA-polymerase tot expressie kan brengen op een niveau dat vergelijkbaar is met dat van vTF7-3, maar met minder cytotoxiciteit.


CONCLUSIES

Onze resultaten laten zien dat een orthogonale set van synthetische transcriptiefactoren (met sterke on-target en lage off-target activiteit) kan worden geconstrueerd in E coli, en dit vertegenwoordigt het eerste programmeerbare activeringssysteem in bacteriën waarvan we ons bewust zijn, waardoor het scala aan beschikbare opties voor transcriptionele activiteit in bacteriën wordt uitgebreid en het vooruitzicht wordt geboden om dezelfde klasse van op rekrutering gebaseerde benaderingen te gebruiken die al beschikbaar zijn in eukaryote organismen.

Bij onze ontwikkeling van het iiT7-systeem hebben we mutatie van de T7 RNA-polymerase en inkorting van de wildtype pt7-promotor gebruikt om de DNA-bindingscapaciteiten van de T7 RNAP te verminderen, waardoor de promotorherkenning en transcriptionele initiatiefuncties van de T7 RNAP worden ontkoppeld en de promotorherkenning mogelijk wordt afhankelijk worden gemaakt van een hulp-DNA-bindend eiwit. Een significante prestatieverbetering werd verkregen door covalente fusie tussen de DNA-bindende domeinen te vervangen door eiwit-eiwit-interacties (via onze leucine-ritsparen), die het DNA-bindingsproces verder ontkoppelden van transcriptionele initiatie, en waarschijnlijk hielp om promoter-ontsnapping en transcriptverlenging te vergemakkelijken .

Na het testen van een reeks varianten en het optimaliseren van de prestaties, bestaat de best functionerende huidige vorm van het iiT7-systeem (zoals weergegeven door de orthogonaliteitsplot in figuur 3E) uit het volgende: één eiwitfusie waarin een DNA-bindend domein is gefuseerd met een leucine zipper (zoals ZFA5-LZ2A) een tweede eiwitfusie waarin een leucine-rits is opgenomen die is geselecteerd om eiwit-eiwit-interacties te vormen met het eerste construct en gefuseerd met een T7-RNAP (zoals LZ2B-T7) en een promotor die zowel de DNA-bindende doelwit van de zinkvingerarray en een afgeknotte T7-promotorsequentie (zoals p1zfa5-d1). Het programmeren van het systeem (het creëren van nieuwe doelen) omvat het verwisselen van de ZFA-domeinen en het invoegen van de overeenkomende DNA-bindingssequenties in de promotor. Het afstemmen van de resulterende activeringsniveaus kan worden bereikt door de keuze van ZFA-domeinen, LZ-domeinen of beide te variëren. Het aantal beschikbare permutaties voor afstemming kan snel uit de hand lopen, dus ons advies aan ontwerpers die het systeem willen gebruiken (vooral als ze werken zonder een screeningpijplijn met hoge doorvoer) zou zijn om een ​​LZ-paar te selecteren en dat vast te laten tijdens het verkennen van de activiteitsniveaus die het gevolg zijn van het variëren van alleen de ZFA-domeinen veranderingen in de LZ-domeinen kunnen indien nodig in een later stadium worden aangebracht om de activiteitsniveaus aan te passen.

Dit op fagen gebaseerde RNAP-systeem met twee componenten in bacteriën begint te lijken op transcriptie in eukaryoten, waar transcriptiefactoren kern-RNAP's rekruteren voor minimale promoters die op zichzelf weinig activiteit of specificiteit hebben. Interessant genoeg, samenvallend met de voorbereiding van dit manuscript, Hillen et al. toonde door middel van kristallografie aan dat het menselijke mitochondriale RNAP (een homoloog van T7 RNAP) een mechanisme gebruikt dat erg lijkt op het mechanisme dat we hier hebben ontwikkeld, waarbij de mitochondriale transcriptiefactor TFAM de ZFA's in ons systeem vervangt (70). TFAM en het mitochondriale RNAP werken samen via alfa-helixdomeinen die opvallend veel lijken op de leucine-ritssluitingen die we voor hetzelfde doel in ons systeem hebben gebruikt (aanvullende figuur S8). Het is geruststellend om onbedoeld te zijn geconvergeerd op hetzelfde type oplossing als miljarden jaren van evolutie. Deze convergentie kan ook worden gebruikt om toekomstige richtingen te informeren door te suggereren dat het smelten van DNA ook verder kan worden losgekoppeld van transcriptie in RNAP, aangezien de tweede mitochondriale transcriptiefactor TFB2M deze rol op zich nam in het mitochondriale RNAP.

Het iiT7-systeem biedt een veelbelovende methode voor het uitbreiden van het aantal synthetische transcriptiefactoren dat beschikbaar is in bacteriële contexten, waarbij het grote aantal bekende ZFA- en LZ-componenten de basis vormt voor de modulaire constructie van door de gebruiker geselecteerde bibliotheken van orthogonale componenten, elk in staat tot hoge transcriptionele activiteit bij rekrutering. Door verder te zoeken in de mutatieruimte van het T7-polymerase, kan het mogelijk zijn om een ​​mutant met transcriptionele activiteit te vinden in de afwezigheid van enig element van de natieve T7-promoter, wat het systeem verder zou vereenvoudigen.

Een interessant verschil in bruikbaarheid werd ontdekt met de T7 RNAP HEP-mutant. Hoewel deze mutant in het algemeen de expressie op het doelwit van promotors verbetert op basis van de d1-afknotting van de pt7-promotersequentie (met uitzondering van de ZFA1-T7(HEP)-fusie), resulteerde dit in feite in een licht verminderde algehele orthogonaliteit als gevolg van een uniforme toename van -doelactiviteit (aanvullende figuur S9). Interessant is dat dezelfde gegevens aantonen dat de slechte activiteit op het doel van de directe ZFA1-T7(HEP)-fusie werd hersteld in de LZ-gebrugde versie van het systeem: ZFA1-LZ2A + LZ2B-T7(HEP) had een sterke activiteit, op een niveau dat bijna identiek is aan dat van zijn broer of zus ZFA2-LZ2A + LZ2B-T7(HEP). Het begrijpen van de relatie tussen ZFA-domeinen en hun interactie met gefuseerde en anderszins gebonden RNAP's vereist nader onderzoek.

Zowel de DNA-bindende als de eiwit-eiwit-interactiedomeinen die hier worden gebruikt, kunnen worden vervangen door nieuwe varianten: we hebben een op ZFA gebaseerde versie van het systeem gedemonstreerd, maar in principe kan elk DNA-bindend domein worden gebruikt, inclusief transcriptionele-activator- zoals (TAL) effectoren en dCas9. Het scheiden van de DNA-bindingsgebeurtenis van de rekrutering door eiwit-eiwit-interacties opent de mogelijkheid om de activiteit van de synthetische transcriptiefactoren af ​​te stemmen of om te schakelen door het groeiende aantal bekende methoden van externe eiwit-eiwit-interactiemodulatie, inclusief chemische en lichte inductie ( 71, 72). Het gesplitste iiT7-complex zou kunnen worden gebouwd rond polynucleotide- en peptide-scaffolds met behulp van modaliteitspecifieke bindingsdomeinen, die als een sensor werken (73, 74) en afstembaarheid mogelijk maken voor ultragevoelige reacties (75). Van het T7-RNAP-polymerase is bekend dat het in eukaryoten werkt (34), wat de toekomstige mogelijkheid opent om synthetische transcriptiefactoren te creëren die in staat zijn om in prokaryoten of eukaryoten te werken. Hoewel er nog werk aan de winkel is om het iiT7-ontwerp volledig te ontwikkelen, is dit een kans om niet alleen de universaliteit van transcriptieontwerpprincipes te testen, maar ook om de natuurlijke evolutie van RNAP's na te bootsen van de eenvoudige faag T7 met één domein tot de modulaire en programmeerbare polymerasen van complexe cellen.


Leerboek Canon: genen tot expressie brengen in bacteriën - (Aug/09/2012 )

Een vluchtig onderzoek van plasmidekaarten laat antibioticaresistentiegenen zien, maar hebben deze genen promotors als (1) "ja" is?

Het onderwerp over genexpressiecontrole gebruikt operon als voorbeeld. Worden deze antibioticagenen door iets of onder enige controle geïnduceerd?

In de leerboeken is de stroom altijd om het gen van interesse te verkrijgen, het te klonen en te selecteren op het plasmide dat bacteriën bevat met behulp van de antibioticummarkers of de expressie van het gen. Maar is het zo eenvoudig of worden de details niet genoemd?

Ik denk dat er hier ook een recente post over promotorloos gen stond. En nog een over twee promotors. Beide brengen me verder in verwarring.

Bedankt aan iedereen die me hier geduldig doorheen wil leiden.

Genen moeten worden getranscribeerd naar RNA en vervolgens worden vertaald naar eiwit om tot expressie te worden gebracht. Transcriptie wordt gecontroleerd door promotors, 5' van het coderende gebied van het eiwit. Er zijn promotors 5' van de antibioticaresistentiegenen in plasmiden. Meestal zijn dit zogenaamde constitutieve promotors, wat betekent dat ze altijd op sommige antibioticaresistentiegenen zitten die enigszins toxisch zijn voor cellen, en de promotors hiervoor kunnen soms selectief worden aangezet in aanwezigheid van het antibioticum, maar dit is enigszins zeldzaam.
Gemeenschappelijke plasmiden die voor klonen worden gebruikt, hebben vaak een promotor 5' van de kloneringsplaats, zodat wanneer gencoderende regio's in de kloneringsplaats worden ingevoegd, het gen tot expressie wordt gebracht. Sommige van deze promotors zijn induceerbaar, dat wil zeggen dat ze kunnen worden in- en uitgeschakeld afhankelijk van de aanwezigheid van specifieke chemicaliën, zoals IPTG of arabinose. Ik hoop dat dit helpt.

1) Om een ​​gen te transcriberen heb je een promotor nodig voor het RNA-polymerase om te binden en mRNA te produceren (afhankelijk van de promotor heb je misschien ook een terminator nodig) op het mRNA dat je stroomopwaarts nodig hebt, het startcodon, een rbs (ribosoombindingsplaats ) zodat het ribosoom kan binden en de translatie kan uitvoeren die resulteert in uw eiwit. Je moet ervoor zorgen dat de oorsprong of replicatie (om het plasmide in de bacteriën te vermenigvuldigen), promotor en rbs specifiek zijn voor bacteriën als bacteri wordt gebruikt voor expressie, of gist als je gist gebruikt enz. Het is mogelijk dat een plasmide een oorsprong van replicatie voor bacteriën zodat u het in bacteriën kunt klonen, en een andere oorsprong van replicatie voor gist, zodat u het plasmide kunt gebruiken voor gistexpressie.
2) Zie het antwoord hierboven met de toevoeging dat als je een antibioticumresistentie hebt, je moet controleren voor welk organisme de promotor specifiek is, dwz ik heb een plasmide dat ampiciline-resistentie geeft in bacteriën, en gentamicine-resistentie bij gebruik voor virale infectie in insectencellen . Aan de andere kant, hoewel de gentamicineresistentie aanwezig is op het plasmide, geeft dit bij bacteriën geen gentamicineresistentie omdat de promotor specifiek is voor de expressie van insectencellen.
3) Zie het antwoord eerder.
4) Met fenotype verwijst u naar eiwitexpressie? Gewoonlijk geeft expressie van vreemde genen geen ander fenotype dan eiwitexpressie en langzamere groei. Soms heb ik een fenotype wanneer ik eiwitten tot expressie breng die DNA/RNA binden, omdat het elk vrij DNA en RNA bindt en giftig wordt voor de cel. Als je eiwitexpressie fenotype noemt, is het niet zo eenvoudig als het op papier lijkt. Maar om uw vraag te beantwoorden, u hoeft geen promotor toe te voegen, de vectoren worden geleverd met een promotor vóór de meervoudige kloneringssite waarin u uw gen van interesse moet invoegen. Er zijn enkele details die mensen missen en dan komen ze in de problemen. Om u bijvoorbeeld alleen de basis te geven:
a) Er zijn klonerende bacteriestammen zoals DH5alpha of XL1Blue die specifieke endonucleasen/recombinasen missen waardoor ze geschikt zijn om DNA in grotere hoeveelheden op te halen. U gebruikt deze stammen om uw ligatiereactie te transformeren om uw uiteindelijke plasmide te krijgen. Langzaam groeien.
Er zijn expressiestammen zoals BL21 die specifieke proteasen missen om je tot expressie gebrachte eiwit intact te houden. Transformeer eerder verkregen plasmide in deze stammen en gebruik dit voor expressie.
c) Er is een variant van BL21, Gold genaamd, die zowel het voordeel heeft dat het de endonucleasen/recombinasen mist en dat het geschikt is voor expressie, wat leidt tot de mogelijkheid om de ligatiereactie direct in deze stam te transformeren en de DH5alpha/Xl1Blue-stap over te slaan
d) Als u werkt met pET-vectoren (met een T7-promoter), moet u werken met expressiestammen die (DE3) in de naam hebben (wat betekent dat ze T7-RNA-polymerase tot expressie kunnen brengen dat deze promotor herkent)
e) Er zijn gevallen waarin, hoewel je alles goed hebt gekloond, je eiwit niet tot expressie wordt gebracht of resulteert in inclusielichamen of dat het verkeerd is gevouwen en gefragmenteerd in de bacteriën. In deze gevallen moet je verschillende expressiestammen testen, verschillende vectoren met promotor van verschillende sterktes, verschillende expressietemperaturen, verschillende media, verschillende N-terminale tags die vouwing bevorderen, verschillende eiwitfragmenten omdat eiwitten in bacteriën die groter zijn dan 50 kDa moeilijk tot expressie kunnen worden gebracht (sommige mensen zeggen groter dan 27 kDa)

The thing with two/multiple promoters is that there are vectors that are made in such a way that you can use them for expression in different organisms i.e. E coli and insect cells without needing to reclone the gene by having two promoters one after the other such that when in bacteria the RNA polymerase recognizes the bacterial promoter, when in insect cells, the insect cells RNA polymerase recognizes the insect cell promoter. i.e. pTriEX from Novagen,

What you have asked is an entire field of expertise. If this would be easy to explain in 1-2 pages, I wouldn't be needed in my job:) I could suggest some material for reading such as Unit 5.24 from Current Protocol in Protein Science: Strategies to Optimize Protein Expression in E. coli by DM Francis and R. Page. If you cannot access it from your lab, drop me a message with your email address and I will send it to you.

Thank you very much phage434 and ascacioc. I was reading about molecular biology to prepare ahead of my final year. I understand that I am still a long way out and I appreciate your taking the time to explain. Could not really sleep with so many question marks floating about but I am happy to put some of these away.

Just to note here: when I mentioned "phenotype", I was thinking along the line of a new "characteristics" conferred by the new gene. Maybe that was inaccurate and I got mixed up with Drosophila genetics The PET system is fascinating (first impression) but I am not looking to make so many proteins. Just mutant bacterial clones.

Going forward I am sure I will have more questions and I will try to find out the answers by myself first.

To just make a quick note on the phenotype thing: If you are refering to a particular characteristic confered by the gene: if you have a type of cell (bacteria, yeast, mamalian cell line) that is a mutant of a gene (deletion mutant), you can make a rescue experiment using a plasmid containing the gene you deleted from the chromosome. This means that the protein will be expressed from the plasmid and will make the cell healthy (behaving like wild type) again. Plasmids are not only for expression of proteins for purification towards biochemical analysis.

Yes, T7 promoters come from the T7 bacteriophage. Studier, who according to me is the father of cloning, has characterized the bacteriphage many years ago and came up with the idea of pET system. He did also other wonderful things in cloning and protein expression like the autoinduction media. If you have time, you could look up what other contributions he did to the field of cloning.

Indeed, there are many bacterial hosts. What I find important to know is to know what a K strain (cloning strain) and a B strain (expression strain) are. Also, if you start using them, you could start learning the genotyping codes. A strain comes with a certain genotype i.e. mutations and insertions of genes, which make it different to other strains. Basically, at this level you need to read only 1-2 lines of genotype code and be able to tell what is the use of this strain. But this is expert level. A good webpage for this is: http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes But again, this is knowledge you have in your mind when you do only this for many years. Nobody will expect you to know these things (most of the PhD students around me are happy without even knowing that this wiki exists)

Your questions:
1) Good question. Nooit over nagedacht. When I have seen it this morning, I was like: why would you do this? But just for theoretical purposes (even though, I am not 100% sure about what I am saying next): I think that the gene will be transcribed from both promoters i.e. once by RNA polymerase binding to one promoter and another time by binding to the other promoter. On the other hand, it will be crowded in this area and this might lead to slowing down or to shorter mRNA fragments because I imagine that if the first RNA polymerase binds on the upstream promoter and there is also another RNA polymerase downstream, the the first one stumbles accross the second one and cannot continue would wait a while until it cannot move anymore and then detach. Anyhow, we do not do that
2) http://www.amazon.com/Molecular-Cloning-Laboratory-Manual-Edition/dp/0879695773/ref=pd_sim_sbs_b_1 This the the bible of molecular cloning. However, nobody buys this for their own (check the price). Each good lab has a copy. I learn usually from internet, like wikis. The companies that sell the strains/vectors have also good material e.g Novagen. Also, there is a good journal, low impact factor, but specific for this fiels: Journal of Protein Expression & Purification. I check it regularly for new things in the field (generally there are tricks you can learn from how people dealt with their specific protein). Also there is a series of protocols: Current Protocols in Protein Science, or Current Protocols in Molecular Biology. They are written book style but they are mainly online. Actually, this is a field that, in my opinion is based on knowledge, not experience. There is a certain practical experience one needs, but if one lacks the basic knowledge of what is what, he can do the same mistake over and over again.

Yes, been going from one page to another in openwetware.org. Some things make sense and others are totally foreign. Same goes for the genotype notation am looking at Biobricks at the moment and already scratching my head.

Thank you so much for the explanations, Andreea. Dat waardeer ik.

A note on the two promoters situation (I asked a friend yesterday over lunch about this intersting question of yours and she had some additions):
-in the consideration that you are using a vector with its own promoter to clone a gene with natural promoter, and the gene is from the same organism as the vector is i.e. both promoters are recognized by the RNA polymerase that is present in the host, you get a mixture of mRNAs that have the following structure . vector promoter - vector rbs - original promoter - original rbs - AUGgene. and . original promoter - original rbs - AUGgene. (rbs = ribosome binding site).
-the rbs is not a precise sequence, it is 6 consequent nucleotides enriched in As and Gs. Moreover, it is 6-8 bases upstream of the AUG
-in the second construct everything is fine
-in the longer construct (which is most probably the abundant one since expression vector promoters are the strongest found in nature to make your host express mostly your protein) you have a different story: there is a long strand of nucleotides from the 5' end up to the original rbs (the right one for the right AUG) that might be, coincidently, detected as a rbs (the odds are that there are a lot of 6 consecutive A/Gs) and then the ribosome will look for a AUG donwstream the fake rbs and start translation. Again the odds are that there are other AUGs out of frame in this long extra strand of nucleotides. This might lead to the wrong protein being translated.

This is why we do not do this:) We don't like to gamble. If we want the original promoter (which sometimes is the case), we clone the gene with the promoter in such a way to get rid of the original promoter in the vector. If we do not insist on the natural promoter (which anyhow is a weak one, most of them are), we clone only the gene.

A little bit hijacking this topic, but if I understand it correctly there are 2 vectors: expression vectors and cloning vectors (or strains).

The cloning vectors are vectors that provide the possibility to clone (duplicate the plasmid?) the genes you want (stable transfer of the plasmid during cell division?). I assume these are high copy vectors and vectors that maintain the plasmid very stable in high copy numbers?
While expression vectors are vectors that provide everything for a stable expression, translation?

But what are the molecular differences between those? I noticed you mentioned the the lack of proteases in expression strains and the lack of endonucleases/recombinases in cloning vectors, but are there other specific differences?
(eg: high copy in cloning vs low copy in expression? Or a very strong promoter in the exrepssion vectors?).

There are 2 strains you use for the same vector: cloning strain (K strain e.g. DH5alpha, XL1Blue) is the one with mutant dnases and recombinases and expression strain (B strain e.g BL21, Rosseta etc) is the one with mutant proteases.
In the K strain your ligated plasmid would be nicely transformed since there are minimum dnases and recombinases to affect it. These strains grow slow but have great transformation efficiency. They are also very easy to make competent using the Hanahan method which was actually developed for K strains. These strains are used mainly for plasmid production for mini/midi preping.
In the B strain, your protein will be nicely expressed and protected from the proteases, so it can accumulate up to the harvest time. Minimum preoteases to chop your protein up. Grow faster but have terrible transformation efficiency.
The story behind the original B-strains and K-strains is long. Initially, they were doing this old fashion UV-mutation/selection for the nice bacterial strains that people wanted to have. So they obtained strains to suit them but with lots of mutations. Hence, there are quite a few differences on the genome level between the strains. For more details, I recommend:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19765592 (as I said, Studier writes all the nice articles )
The normal workflow from gene to protein in bacteria: PCR your insert with overhangs for the restriction enzymes you want to use restrict digest the vector and the insert with these enzymes ligate vector and insert transform in K strain and plate check the ontained colonies for the right insert by colony PCR miniprep a few of them and send for sequencing once sequence confirmed, transform the plasmid in B-strain and do the expression of your protein in the B-strain.

Now, this is the classical way (details omitted for simplicity do not take it as a protocol there are some steps in between that are essential such as PCR clean up. ). If you for example want to transform an epPCR library or any kind of library of variants and select based on expression of your protein, then you cannot wait to obtain the plasmid from K strain, you have to go directly to the B-strain. So, in this case, due to the fact that nowadays we have a bit of more knowledge of how to manipulate bacteria, beyond UV, people have modified the classical BL21(DE3) to get BL21-Gold(DE3) (and similar strains) which has the advantage that it is also a mutant of endonucleas A (as K strains are, but this one is done nicely with modern molecular biology methods not UV ) Now, you will be tempted to say, hack, why should I use the long way and not transform the ligation directly to BL21(DE3)-Gold? Well, you could do that, but I personally do not like strains with too many mutations (endonuclease A is needed in the bacteria) because they are not too healthy and stressed bacteria do not produce tons of protein. But this is just me.

Another question that might arise would be: why do you go through K-strain until the expression strain:
1- easy to transform ligation reaction into if you use BL21(DE3) for transforming you might end up with no clones, but you might also be lucky. The question is: do you want to play the lotery in the lab?
2 - easy to mini/midiprep your plasmid to have enough for sequencing or other things for which you need ug amounts. Again, nobody says you cannot miniprep from BL21, but you need to be good at. I minipreped successfully from B strains, but I am a mixture of luck and good hands:) I have seen people not being able to miniprep from B-strains. So again: how lucky do you feel to do that? You might end up repeating the entire cloning procedure because you were too lazy to go through the K-strain. (we have a saying in my language: the lazy one, runs more I thought appropriate to insert some wisdom from the elders here )

This was the story about the strains = living organisms that multiplicate on their own. Not to be confused with plasmids: round pieces of DNA that is not able to multiply on its own. For simplicity, I will refer from now own only to bacterial plasmids, even though the parts are common for many other plasmids.
In a plasmid you generally have:
-origin of replication - needed by the bacteria to recognize the plasmid for replication these origins are that thing that give the copy number you can have high copy number plasmids (100 copies per cell) or low copy number plasmids (1-10) this is regulated by the origin of replication. In general, for expressing proteins, you want a low copy number plasmid. But for cloning in bacteria a plasmid to be used for mammalian cell culture imaging or for yeast protein expression, basically to be used in another organism, then you use a high copy number plasmid.
-antibiotic resistance - with its own constitutive promoter and terminator produces protein to clear the antibiotic makes the bacterium survive in the certain antibiotic used for selection
-promoter - used for transcription of mRNA from your insert
-terminator -stops mRNA transcription
-rbs - ribosome binding site - ribosome recognition site for translation to happen
-MCS - multiple cloning site with various restriction sites for you to put your insert into
These are the minimum components you have on an expression vector in bacteria. On top, you have some other regulatory components. But this is advanced molecular biology I will let you discover on your own

Hi carlmartin and Andreea,

Am I correct in saying that since we don't want to "gamble" with the outcome , it also follows that when one wishes to express a protein, it is crucial that the 'thing' downstream of the promoter be an ORF? Or else, we'll have a situation similar to the two-promoter scenario in our hands.

lyok on Sat Aug 11 09:22:22 2012 said:

I could be wrong but I understand both klonen en expression vectors as genetic elements independent of their copy number. While the term expression vector seems to bring to mind a vector used for the overproduction of proteins for purification, a cloning vector can be an 'expression' vector by virtue of it having a promoter (err. right?).

In a rescue / complementation experiment, I believe that plasmids such as the pUC or pGEM with their respective promoters and being in the right environment would be expressed and restore the host.

As for stability and maintenance, it does appear to me in the beginning that high copy number is more superior to low copy one but after some digging found that the latter can be stably maintained too.

ascacioc on Sat Aug 11 10:32:24 2012 said:

I guess certain things are just like that . Brings to mind a discussion I had a while back with someone here regarding copy number and the resulting mRNA and protein but that's for another topic.


Ondersteunende informatie

Figuur S1.

Expression of eYFP-NLS decreases as the space between the promoters increases. Western blot probed with anti-GFP. The levels of eYFP-NLS expression were normalised against the BiP loading control. Two independent clones of each plasmid were examined and the percentage of cells fluorescent after induction is shown.

Figuur S2.

Flow cytometry analysis of Lister 427 pSPR2.1 p3227 and Lister 427 p3383. Two independent clones of each cell line were analysed with the typical result presented here. Red line untransformed Lister 427 pSPR2.1, black line uninduced, green line 18 hours tet induction.

Tabel S1.

Table describing inducible tagging plasmids produced.

Tabel S2.

Table describing plasmids used in this study. pLEW100 is described in Wirtz et al. [2]. p2948 and pDEX377 are described in Kelly et al. [8].

Tabel S3.

DNA sequences of all the plasmids used in this study.


Associated Data

Designing and building multigene constructs is commonplace in synthetic biology. Yet functional successes at first attempts are rare because the genetic parts are not fully modular. In order to improve the modularity of transcription, we previously showed that transcription termination in vitro by bacteriophage T7 RNA polymerase could be made more efficient by substituting the standard, single, TΦ large (class I) terminator with adjacent copies of the Vesicular Stomatitis Virus (VSV) small (class II) terminator. However, in vitro termination at the downstream VSV terminator was less efficient than at the upstream VSV terminator, and multigene overexpression in vivo was complicated by unexpectedly inefficient VSV termination within E coli cellen. Here, we address hypotheses raised in that study by showing that VSV or preproparathyroid hormone (PTH) small terminators spaced further apart can work independently (i.e. more efficiently) in vitro, and that VSV and PTH terminations are severely inhibited in vivo. Surprisingly, the difference between class II terminator function in vivo versus in vitro is not due to differences in plasmid supercoiling, as supercoiling had a minimal effect on termination in vitro. We therefore turned to TΦ terminators for 𠇋ioBrick” synthesis of a pentameric gene construct suitable for overexpression in vivo. This indeed enabled coordinated overexpression and copurification of five His-tagged proteins using the first construct attempted, indicating that this strategy is more modular than other strategies. An application of this multigene overexpression and protein copurification method is demonstrated by supplying five of the six E coli translation factors required for reconstitution of translation from a single cell line via copurification, greatly simplifying the reconstitution.


Competent Cell Selection Guide

There are many properties to consider when choosing a strain for your experiments. Requirements such as plasmid preparation, blue/white screening, cytoplasmic disulfide bond formation, and fast colony growth necessitate specific strain choices. The following selection chart highlights the characteristics and formats of NEB&rsquos strains to help select the optimal strain for a particular experiment. The free online tool, NEBcloner can also be used to help select competent cells. For more information, please visit Cloning Competent Cell Strains or E.coli Expression Strains.

CAUTION: Chemically Competent E. coli contain DMSO, a hazardous material. Review the MSDS before handling.

Cloning Strain Properties

  • Dam/Dcm methyltransferase free plasmid growth
  • Fastest growth &ndash colonies visible after 6.5 hours
  • Plasmid preparation after 4 hours
  • Versatile cloning strain
  • DH5&alpha&trade derivative
  • Toxic gene cloning
  • F´ strain with extremely high transformation efficiency
  • Large plasmid and BAC cloning
  • DH10B&trade derivative
  • Cloning unstable inserts
  • Isolating and propagating retroviral/lentiviral clones
  • Ideal for subcloning efficiency transformations, such as plasmi transformation or routine subcloning

Protein Expression Strain Properties

  • Versatile non-T7 expression strain
  • Protease deficient
  • Routine T7 expression
  • Tunable T7 expression for difficult targets
  • Improved purity of target proteins isolated by IMAC
  • Routine non-T7 expression
  • Most popular T7 expression strain
  • Protease deficient
  • T7 expression
  • Protease deficient
  • Better reduction of basal expression
  • T7 expression
  • Protease deficient
  • Highest level of expression control
  • T7 expression/K12 strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • Protease deficient/B strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • T7 expression
  • Protease deficient/B strain
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • T7 expression
  • Protease deficient/B strain
  • Tightly controlled expression of toxic proteins
  • Enhanced capacity to correctly fold proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm
  • Control of IPTG induced expression from Plac, Ptac, Ptrc and T5lac
  • Protease deficient

(1) Rhamnose solution is provided instead of SOC control plasmid is included.
(2) Important for high-quality plasmid preparation.
(3) Lacks Lon and OmpT protease activity.
(4) Constitutively expresses a chromosomal copy of the disulfide bond isomerase DsbC.
(5) nit = nitrofurantoin, tet = tetracycline, cam = chloramphenicol, str = streptomycin, spec = spectinomycin
(6 )Resistance to low levels of streptomycin may be observed.
(7) Legend 50 = 50 µl tubes 200 = 200 µl tubes 96 = 96 well plate 384 = 384 well plate strips = 96 tube strips (50 µl/tube) 400 = 400 µl tubes
(8) 1-5 x 10 8 for R-format.
(9) 1-3 x 10 8 for P-format.


Characterization

Overzicht

1) Expression of different proteins: monitoring growth

2) Expression of proteins with our backbone before and after optimization

3) SDS-PAGEs for the expression assay over the time of Full Construct (BBa_K3037003)

4) Image analysis of the expression in the SDS-PAGEs with ImageJ

Experiments in Detail

1) Expression of different proteins: monitoring growth

To evaluate the impact on the metabolic burden of over-expressing proteins, we tested different constructs cloned into our backbone. For this we used: HRP (BBa_K3037007) and our full construct (BBa_K3037003). After cloning, the constructs were expressed in E. coli pRARE T7 and we monitored growth over time (Figure 2). Induction of the system was performed after 165 min with 1 mM IPTG. Overall, the results prove that when expressed, none of our proteins inhibit growth.

2) Expression of proteins with our backbone before and after optimization

To use this backbone as convenient expression vector in iGEM, we had to include the Prefix and Suffix of the BioBrick Assembly. Subsequentially, we compared the expression of the original vector we recieved, pOCC97, to our optimized version for iGEM, BBa_K3730000.

We found that the original plasmid (= non-optimized) had a XbaI site, which we used to insert our BioBrick BBa_K3037003. This ilegal restriction site was later removed with an overhang PCR. The original XbaI restriction site was positioned downstream of the T7 polymerase promoter and upstream the RBS sequence of the plasmid. This way only BioBricks that already has a RBS fused to them could be expressed. Since we were using the RFC25 standard of Freiburg for our fusion proteins, the inserted protein contained already its own RBS in the Prefix.

However, we experienced on our own how difficult it is to add such a small sequence, as an RBS, to our other constructs. Therefore we redesigned the plasmid to be ready for expression in a single digestion+ligation reaction. We removed the XbaI restriction site and included a Prefix and Suffix of the RFC 10 standard after the RBS of the plasmid (=optimized).

We used the BioBrick assembly method to insert our BioBrick BBa_K3037003, which also has its own RBS due to the RFC25 standard.

In Figure 3, we show the expression of the protein BBa_K3037003 using both plasmids optimized (left) and non-optimized (right) and also different IPTG concentrations for induction and temperature.


The comparison of the growth curves shows that, the new plasmid adapted to the RFC 10 standard did not affect the growth, as it shows similar behavior compared to the original one (Figure 4).

3) SDS-PAGEs of the expression assays of the full construct (BBa_K3037003)

Down below follow several SDS-PAGEs of loaded crude cell extract (all normalized to an OD of 0.5) harvested at different time points pre- and post-induction. Used IPTG concentrations are indicated. Arrows indicate predicted size of the protein of interest.

Comparison of the expression of MBP-HRP (BBa_K3037008) and Full Construct (BBa_3037003)

Expression of full construct in pOCC97 not optimized at 18ºC

Expression of Full Construct in pOCC97 at 37ºC

Expression of Full Construct in pOCC97 optimized

4) Image analysis of the expression in the SDS-PAGEs with ImageJ

The previously shown SDS-pages were then further analysed by using the software ImageJ to correct for loading differences and be able to draw conclusions about the best conditions to express the Full Construct in pOCC97.


Temperature and IPTG induction dependence of the optimized pOCC97

Temperature and IPTG induction dependence of the not optimized pOCC97

Comparison between optimized and not optimized pOCC97


Based on this analysis, it can be concluded that optimal conditions for the expression of our fusion protein, BBa_3037003, is an overnight expression at 18ºC and inducing with 0.5 mM IPTG. We are proud to say that our optimized pOCC97 shows an increased expression and robustness under various conditions tested.


Bekijk de video: Transcription and mRNA processing. Biomolecules. MCAT. Khan Academy (November 2021).