Informatie

Wat betekent het: het stabiel geïntegreerde gen dragen


Deze studie lezen http://www.nature.com/cr/journal/v23/n10/full/cr2013122a.html

zij schrijven

Meerdere exogeen en endogene genen kunnen gelijktijdig worden geactiveerd door CRISPR-on

We testten enkele, dubbele en drievoudige activering van een TetO::tdTomato-transgen en de endogene SOX2- en IL1RN-genen (Figuur 3A) in HEK293T-cellen die het stabiel geïntegreerde TetO::tdTomato-transgen dragen

Kun je me alsjeblieft helpen begrijpen: ze hebben het over exogeen gen. Maar zeggen "het stabiel geïntegreerd dragen". Betekent dit dat dit gen (TetO::tdTomato) in het celgenoom zit (geïntegreerd in het genoom)? Zo ja, wat is hier de betekenis van exogeen?

Bedankt!


Volgens Merriam Webster wordt een exogeen gen gedefinieerd als "geïntroduceerd vanuit of geproduceerd buiten het organisme of systeem; specifiek: niet gesynthetiseerd binnen het organisme of systeem - endogeen vergelijken".

Ik geloof dat ze verwijzen naar het tetO::tdTomato-transgen als een exogeen, of niet afkomstig van de onderzochte soort


Kinetiek van HCMV onmiddellijke vroege mRNA-expressie in stabiel getransfecteerde fibroblasten

Sabine P. Snaar, Pauline Verdijk, Hans J. Tanke, Roeland W. Dirks Kinetiek van HCMV onmiddellijke vroege mRNA-expressie in stabiel getransfecteerde fibroblasten. J Cell Science 15 januari 2002 115 (2): 321-328. doi: https://doi.org/10.1242/jcs.115.2.321

Overtuigend bewijs ondersteunt een nauw verband in tijd en ruimte tussen eukaryote pre-mRNA-synthese en -verwerking en nucleocytoplasmatisch transport van rijp mRNA. In deze studie hebben we het kinetische gedrag van deze processen op een kwantitatieve manier geanalyseerd. We gebruikten FISH en confocale scanning lasermicroscopie om transcripten te detecteren die zijn geproduceerd door een induceerbaar humaan cytomegalovirus onmiddellijk vroeg (HCMV-IE) expressiesysteem. Na inductie accumuleerde een grote hoeveelheid pre-mRNA in nucleaire foci op of nabij hun transcriptieplaatsen en, op een later tijdstip, door het hele nucleoplasma. Remming van RNA-polymerase II-activiteit resulteerde in een snelle afname van het aantal transcripten in de nucleaire RNA-foci (halfwaardetijd twee minuten), wat aangeeft dat geaccumuleerde transcripten snel werden gesplitst en vervolgens werden vrijgegeven. De gedispergeerde nucleoplasmatische transcripten verlieten de kern met een halfwaardetijd van -10 minuten. Beide processen waren temperatuurafhankelijk, wat suggereert dat mRNA-export een actief proces is. RNA-polymerase II-activering onthulde dat de productie van rijpe HCMV IE-mRNA's minder dan vijf minuten vereiste. Transcripties straalden vanaf dat moment uit het gen met een gemiddelde snelheid van -0,13 m 2 /sec. Het lijkt er dus op dat deze processen nauw met elkaar verbonden zijn in tijd en ruimte, met de splitsingsreactie als snelheidsbeperkende factor.


Virale DNA-integratie

Veel bacteriële en dierlijke virussen sluimeren in de geïnfecteerde cel en hun DNA kan worden geïntegreerd in het DNA van het chromosoom van de gastheercel. Het geïntegreerde virale DNA repliceert zoals het celgenoom repliceert na celdeling, het geïntegreerde virale DNA wordt gedupliceerd en gewoonlijk gelijkelijk verdeeld over de twee cellen die het resultaat zijn. De bacteriën die de niet-infectieuze voorloperfaag dragen, de profaag genaamd, blijven gezond en blijven groeien totdat ze worden gestimuleerd door een storende factor, zoals ultraviolet licht. Het profaag-DNA wordt vervolgens uit het bacteriële chromosoom gesneden en de faag repliceert, waardoor veel nageslachtfagen worden geproduceerd en de bacteriële gastheercel wordt gelyseerd. Dit proces, oorspronkelijk ontdekt in gematigde bacteriofagen in 1950 door de Franse microbioloog André Lwoff, wordt lysogenie genoemd.

Het klassieke voorbeeld van een gematigde bacteriofaag wordt lambda (λ)-virus genoemd, dat gemakkelijk lysogenie veroorzaakt in bepaalde soorten van de bacterie Escherichia coli. Het DNA van de -bacteriofaag is geïntegreerd in het DNA van de E coli gastheerchromosoom in specifieke regio's die aanhechtingsplaatsen worden genoemd. De geïntegreerde profaag is de overgeërfde, niet-infectieuze vorm van het virus. Het bevat een gen dat de lytische functies van de faag onderdrukt en er zo voor zorgt dat de gastheercel het faag-DNA samen met dat van zichzelf blijft repliceren en dat het niet wordt vernietigd door het virus. Ultraviolet licht of andere factoren die de replicatie van DNA in de gastheercel stimuleren, veroorzaken de vorming van een recA-protease, een enzym dat de λ-faagrepressor afbreekt en λ-faagreplicatie en uiteindelijk vernietiging van de gastheercel induceert.

Excisie van het profaag-DNA uit het chromosomale DNA van de gastheer (als een eerste stap in de synthese van een infectieus, lytisch virus) resulteert soms in de verwijdering van een deel van het DNA van de gastheercel, dat is verpakt in defecte bacteriofagen. verwijderd en aan het andere uiteinde vervangen door een gen van de gastheerbacterie. Zo'n virusdeeltje wordt een transducerende faag genoemd omdat het, wanneer het een bacteriële cel infecteert, het gen gevangen door λ-faag-DNA kan overbrengen naar de volgende bacteriële cel die het infecteert. Transductie door bacteriofagen is een efficiënt middel om de genetische informatie van de ene bacteriële cel naar de andere over te dragen.

Deze manier van overdracht van genetische informatie, lysogene conversie genaamd, verleent genen met speciale functies aan bacteriële cellen zonder dergelijke functies. Het komt veel voor bij bacteriën en is een belangrijk aspect van de epidemiologie (incidentie, verspreiding en controle) van infectieziekten. Bijvoorbeeld de bacterie Corynebacterium diphtheriae is de veroorzaker van difterie, maar alleen als het de profaag van bacteriofaag β bevat, die codeert voor het toxine dat verantwoordelijk is voor de ziekte.


“Hacken van de software van het leven”: Salesmanship versus cranks

Het is misschien een beetje hard van me om te zeggen dat het verhaal van 'de “mRNA-vaccins zijn gentherapie'-verhaal van antivaxxers een zelf toegebrachte wond is. Het is echter helemaal niet hard om erop te wijzen hoe wetenschappers en leidinggevenden van Moderna die hun technologie verkopen, antivaxxers van taal hebben voorzien die ze gemakkelijk konden gebruiken tegen COVID-19-vaccins. In het bijzonder maakt Mercola veel van deze toespraak uit 2017 van Dr. Tal Zaks, medisch directeur van Moderna, waarin hij mRNA-vaccins vergeleek met 'het hacken van de software van het leven':

Ik kreunde toen ik het transcript las:

“We hebben deze fenomenale digitale wetenschappelijke revolutie meegemaakt, en ik ben hier vandaag om je te vertellen dat we in feite de software van het leven hacken, en dat het de manier verandert waarop we denken over preventie en behandeling van ziekten,& #8221 zei Zaks.

In elke cel zit iets dat boodschapper-RNA of kortweg mRNA wordt genoemd, dat de kritieke informatie van het DNA in onze genen doorgeeft aan het eiwit, wat in feite het spul is waar we allemaal van gemaakt zijn. Dit is de kritische informatie die bepaalt wat de cel daadwerkelijk gaat doen. Dus we beschouwen het als een besturingssysteem

“Dus, als je dat zou kunnen veranderen... als je een regel code zou kunnen invoeren, of een regel code zou kunnen veranderen, blijkt dat dat ingrijpende gevolgen heeft voor alles, van griep tot kanker...

'Stel je voor dat we in plaats van [de patiënt] het eiwit van een virus te geven, ze de instructies zouden geven over hoe het eiwit moet worden gemaakt, hoe het lichaam zijn eigen vaccin kan maken', zei hij.

Omdat we het brede potentieel van mRNA-wetenschap erkennen, wilden we een mRNA-technologieplatform creëren dat heel erg op een besturingssysteem op een computer lijkt. Het is zo ontworpen dat het uitwisselbaar kan worden aangesloten en afgespeeld met verschillende programma's. In ons geval is het '8220programma'8221 of '8220app'8221 ons mRNA-medicijn 'de unieke mRNA-sequentie die codeert voor een eiwit.

Ik heb echt een hekel aan computeranalogieën vanwege de kernconcepten van de moleculaire biologie, ook al begrijp ik waarom ze aantrekkelijk zijn voor tech-ondernemers. Hoe dan ook, kijk hoe snel deze specifieke analogie is bewapend door antivaxxers, wat ertoe heeft geleid dat Leo Hohmann bijvoorbeeld berichten schreef als 'Laat je Big Pharma toe zijn 'computerbesturingssysteem' in je lichaam te installeren?' 8221 Google gewoon “Moderna hacken van de software van het leven” en kijk wat je bedenkt. Je ziet dingen als:

Het wordt echter erger en Mercola profiteert vrolijk van Moderna's losse analogieën:

Zaks maakt verder onderscheid tussen conventionele vaccins en mRNA-vaccins door uit te leggen dat wanneer je een conventioneel vaccin gebruikt, er viraal eiwit buiten de cel rondzweeft, terwijl de mRNA-benadering de cel herprogrammeert om dat virale eiwit in zichzelf te creëren.

“Wat is er alarmerender?', vraagt ​​hij. “Een vreemdeling die door de buurt dwaalt, of iemand die zojuist op je begane grond heeft ingebroken en het alarm heeft geactiveerd? Dat is wat er gebeurt met een mRNA-vaccin. Je hebt de alarmdraad geactiveerd en nu belt de cel 911, belt hij de politie - terwijl hij tegelijkertijd het eiwit maakt en zegt: 'Dat is de slechterik'. hoe een mRNA-vaccin werkt.”

Zaks verwijst ook naar de mRNA-opnames van het bedrijf als 'informatietherapie', wat gewoon een andere manier is om gentherapie te zeggen, omdat mRNA een drager is van genetische code. (Ter verduidelijking, de code in je natuurlijke mRNA komt overeen met je DNA, terwijl vaccin-mRNA geen equivalent heeft in je genoom omdat het van buiten komt. je lichaam ervoor.)

De analogie van Zaks met een sluiper is niet eens logisch, biologisch of als analogie. Hij lijkt het RNA van een vaccin te vergelijken met een 'sluipmoordenaar'8221 vergeleken met de 'sluipmoordenaar' van het virus buiten de cel. Het is geen wonder dat antivaxxers zulke taal zo gemakkelijk tegen COVID-19-vaccins kunnen keren, aangezien Zaks lijkt te suggereren dat het lichaam meer gealarmeerd is door RNA in zijn cellen dan door vreemd eiwit dat in het lichaam circuleert. Wat betreft 'informatietherapie', mijn enige gedachtelezing die dateert uit het begin van de jaren tachtig: gag me met een lepel.

Serieus, ik wou dat Moderna deze specifieke analogie zou verliezen. Het heeft zoveel kwaad gedaan (en doet nog steeds). Ik begrijp waarom het aantrekkelijk is om mRNA te zien als '8220software'8221, maar in werkelijkheid is dat niet zo. Als je echt de analogie wilt nastreven, zou ik zeggen dat DNA de software is, mRNA de compilatie van die software en het eiwit de output, maar zelfs dat is een gespannen analogie. Hoe je ook naar die analogie kijkt, het stelt Mercola in staat om een ​​favoriete oude antivaccin-trope uit te halen, een die nieuw leven werd ingeblazen voor COVID-19-vaccins, namelijk dat vaccins 'transhumanisme'8220 zijn, een bewering van antivaxxers die ik voor het eerst opmerkte in 2012.

Serieus, kijk naar Mercola die hiermee loopt:

Op ware technocratische, transhumanistische manier van de Vierde Industriële Revolutie zien Zaks en andere mRNA-pushers het lichaam als uw hardware, uw genetische code als software en deze mRNA-injecties als software-updates. Zoals opgemerkt door Patrick Wood in een recent artikel in Technocracy News: 15

'Puur en eenvoudig, dit is onverbloemd, rauw transhumanisme... Wetenschappers denken dat ze de genetische code kunnen herschrijven [zijn woorden, niet de mijne, voor iedereen die nog steeds niet gelooft dat deze mRNA-vaccins de genetische code veranderen, alleen maar omdat sommige & #8216fact checker'8217 zegt dat ze dat niet doen], in de overtuiging dat ze iemands door God gegeven genetische samenstelling kunnen verbeteren, betreedt gevaarlijk terrein...

Deze wetenschappers geloven echt dat het menselijk lichaam niets meer is dan een machine die kan worden gehackt en opnieuw kan worden geordend volgens de instructies van een programmeur... Wie zegt dat ze niet één probleem zullen oplossen en iets veel ergers zullen creëren?'8221

En natuurlijk, volgens Mercola, is transhumanisme als gevolg van COVID-19-vaccins een essentieel onderdeel van de “Great Reset”, een complottheorie die beweert dat de pandemie door de wereldwijde elites is ontworpen om een ​​“reset mogelijk te maken. 8221 waarin ze de wereldeconomie overnemen. Ik kan het niet helpen, maar merk op dat “the Great Reset” een ander voorbeeld is van hoe slecht gekozen woorden complottheoretici in feite een geschenk geven. “The Great Reset” is echt een plan dat voor het eerst werd voorgesteld door het World Economic Forum en onderzoekt hoe landen kunnen herstellen van de COVID-19-pandemie. Ik bedoel, serieus? Wie heeft deze term bedacht? Wie bij Moderna dacht dat het een goed idee zou zijn om hun behandelingen te presenteren als 'het hacken van de software van het leven', gezien alle negatieve connotaties van hacken?

Nogmaals, woorden zijn belangrijk. Hoewel ik Moderna niet te hard kan maken omdat het voorzichtig is bij het indienen van de SEC-registratie en het gebruik van taal die de onzekerheden in de regelgeving van die tijd weerspiegelde, kan ik Tal Zaks en de leiding van Moderna de schuld geven van het gebruik van zulke gemakkelijk te bewapenen analogieën, zoals “hacking the software of life' om zijn product aan investeerders te verkopen. Ik kan het World Economic Forum kwalijk nemen voor het bedenken van een term als de '8220Great Reset'8221. Deze woorden zijn belangrijk, en deze woorden zijn een geschenk voor COVID-19-complottheoretici en een last voor degenen die proberen desinformatie tegen te gaan.


Afdeling Biologie

Ankur Dalia.*   Foto door James Brosher, IU Studios

Bacteriën kunnen nieuwe eigenschappen krijgen, zoals antibioticaresistentie, door DNA met elkaar te delen via processen die cumulatief horizontale genoverdracht worden genoemd.

Een belangrijk mechanisme van horizontale genoverdracht wordt natuurlijke transformatie genoemd, een proces waarbij een bacterie vrij DNA uit de omgeving kan opnemen en dat DNA vervolgens in zijn genoom kan integreren. Bacteriën nemen DNA op uit de omgeving met behulp van lange haarachtige aanhangsels aan het oppervlak die pili worden genoemd (zie “DNA-opwindende bacteriën geven nieuw inzicht in hoe superbacteriën resistentie tegen geneesmiddelen verwerven''8221 en “IU-wetenschappers kijken hoe bacteriën 'harpoen'-DNA maken om hun evolutie te versnellen& #8221).

In een nieuwe studie, gepubliceerd in het tijdschrift Cel, richten IU-onderzoekers zich op het karakteriseren van hoe bacteriën dit DNA in hun genoom kunnen integreren nadat ze het uit de omgeving hebben opgenomen. Dit werk werd geleid door Ankur Dalia, een assistent-professor aan de afdeling Biologie van de Indiana University College of Arts and Sciences.

In een poging om DNA-integratie beter te begrijpen, ontwikkelde het Dalia-lab nieuwe methoden om dit proces direct in realtime te observeren in afzonderlijke bacteriële cellen onder de microscoop. Specifiek ontwikkelden ze een aantal fluorescerende "reporters" om precies te vertellen (1) wanneer cellen DNA probeerden te integreren (zie Video'1601), (2) wanneer cellen erin slaagden dit DNA te integreren, en (3) wanneer het nieuwe DNA dat ze integreerden kwam tijdens het proces tot uiting.

Deze video toont een Vibrio cholerae cel waar twee afgelegen gebieden van het bacteriële DNA-genoom zijn 'beschilderd'8221 zodat we ze onder een microscoop kunnen zien. Het ene gebied is gemarkeerd met een blauw eiwit, terwijl het andere is gemarkeerd met een groen eiwit. Deze cellen brengen ook een rood eiwit tot expressie dat is gefuseerd met ComM, een eiwit dat nodig is voor de integratie van DNA tijdens natuurlijke transformatie. In deze video zijn deze V. cholerae cellen kregen DNA dat zou moeten integreren in de nabijheid van het blauw geverfde gebied in het genoom. Omdat we zien dat het rode ComM-eiwit naar die locatie gaat (en overlapt met de blauwe vlek in de cel), vertelt dit ons dat kijken waar het rode ComM-eiwit naartoe gaat in de cel, ons kan vertellen wanneer deze cellen DNA proberen te integreren in de cel. hun genoom. Hierdoor konden we bepalen hoe goed cellen dit belangrijke proces kunnen uitvoeren, dat van cruciaal belang is voor bacteriën om nieuwe eigenschappen zoals antibioticaresistentie te verwerven.

"Met behulp van deze fluorescerende verslaggevers," zei Dalia, "waren we in staat om ondersteunend bewijs te leveren voor veel van de stappen in het DNA-integratieproces, te bepalen hoe efficiënt het algehele proces van DNA-integratie is, en - belangrijker nog - om een ​​gedetailleerde tijdlijn te genereren voor het hele proces."

De gedetailleerde tijdlijn onthulde dat, na DNA-integratie, het nieuw geïntegreerde DNA zeer snel tot expressie werd gebracht, wat betekent dat er snel nieuwe eiwitten werden gemaakt die door dit DNA werden gecodeerd. Maar toen de bacteriële cel zich splitste, erfde slechts één van de twee dochtercellen het nieuwe DNA. Dus één dochtercel erfde de eiwitten die afkomstig waren van het nieuw geïntegreerde DNA zonder daadwerkelijk het DNA te erven dat voor dat eiwit codeert, met andere woorden, deze cellen hebben het eiwit 'niet-genetisch' geërfd (zie video 1602).

Deze video toont een Vibrio cholerae cel waar twee nabijgelegen gebieden van het bacteriële DNA-genoom zijn 'beschilderd'8221 zodat we ze onder een microscoop kunnen zien. Het ene gebied is gemarkeerd met een blauw eiwit en het andere is gemarkeerd met een rood eiwit. Deze cellen kregen vervolgens DNA dat het rood gemarkeerde gebied van het genoom moet verwijderen en een gen moet introduceren dat kan coderen voor een groen eiwit. In deze video zien we eerst dat de cel DNA integreert in zijn genoom (wat wordt aangegeven door een verlies van de felrode vlek in de cel), en vervolgens zijn genoom repliceert (wat wordt aangegeven door de '8220splitsing' van de blauwe vlek in de cel), en tenslotte zien we dat de cel snel het groene eiwit maakt dat wordt gecodeerd door het nieuw verworven DNA. Interessant is dat we zien dat wanneer de blauwe vlekken '8220split'8221 (ook bekend als het genoom wordt gerepliceerd), dat de plek aan de rechterkant ook een heldere rode vlek heeft. Dit betekent dat het genoom aan de rechterkant NIET het nieuwe DNA heeft gekregen en dat alleen het genoom aan de linkerkant van de cel (ook bekend als de blauwe vlek aan de linkerkant) het nieuw geïntroduceerde DNA heeft. Dit betekent dat als deze cel zich eenmaal deelt, alleen de cel aan de linkerkant daadwerkelijk het DNA heeft om het groene eiwit te maken. Maar aan het einde van de video kunnen we zien dat zowel de cel aan de linkerkant als de cel aan de rechterkant het groene eiwit hebben gekregen. Dit betekent dat ook al heeft de cel aan de rechterkant niet het DNA om het groene eiwit te maken, het wel het groene eiwit kan verwerven. Dit suggereert dat dit bacteriële proces “niet-genetische” overerving kan mediëren, wat voorheen niet werd gewaardeerd.

Het Dalia-lab toonde aan dat deze niet-genetische overerving in bepaalde contexten belangrijke gevolgen kan hebben voor de cel. Toen het nieuw geïntegreerde DNA bijvoorbeeld codeert voor antibioticaresistentie, ontdekten de onderzoekers dat de cel die het antibioticumresistentie-eiwit erft maar niet het antibioticumresistentie-DNA erft, nog steeds resistent is tegen het antibioticum (zie video'1603). Nog verrassender was dat cellen die deze antibioticaresistentie niet-genetisch hadden geërfd, lange tijd resistent bleven tegen het antibioticum.

In deze video richt je je aandacht op de cel die wordt aangegeven door de rode pijl. Cellen in dit experiment kregen DNA waarmee ze twee dingen tot expressie zouden kunnen brengen: een groen eiwit en een eiwit dat resistent is tegen een antibioticum. Deze experimenten waren afbeeldingen in aanwezigheid van het antibioticum, dus als cellen groeien, betekent dit dat ze resistent zijn tegen het medicijn. Zodra de aangegeven cel zich deelt, kun je zien dat de resulterende cel aan de linkerkant heldergroen wordt en blijft groeien en delen. Dit is de cel die het DNA heeft geërfd dat codeert voor het groene eiwit en het antibioticumresistentiegen. Ga terug naar het begin van de video en kijk nu nog eens naar de aangegeven celdeling. Als je naar de cel rechts kijkt, zie je dat deze cel OOK blijft groeien en delen maar niet knalgroen wordt. Deze cel heeft niet het DNA geërfd dat codeert voor het groene eiwit OF het antibioticumresistentie-eiwit, MAAR hij kan nog steeds groeien in de aanwezigheid van het antibioticum. Dit komt omdat het het antibioticumresistentie-eiwit heeft geërfd ZONDER het DNA te erven dat dat eiwit maakt. Vergelijk de groei van deze cel met cellen die geen DNA hebben gekregen, wat rechtsonder in de video te zien is. Deze cellen groeien niet in aanwezigheid van het antibioticum. Dit suggereert dat dit bacteriële proces “niet-genetische” overerving kan mediëren, wat voorheen niet werd gewaardeerd.

Dalia voegde toe dat "ondanks deze overtuigende resultaten, het onbekend is of niet-genetische overerving tijdens natuurlijke transformatie gewoon een onbelangrijk bijproduct is van hoe DNA tijdens het proces in cellen integreert, of dat niet-genetische overerving een belangrijke rol speelt bij het vormen van bacteriële gemeenschappen in de natuur." 8221 Deze nieuwe studie legt echter de basis voor het verder testen van deze vraag.

De andere auteur van het onderzoek was IU-onderzoeker Triana Dalia, een onderzoeksmedewerker in het Dalia-lab.


Partnerschap richt zich op gene-editing therapieën voor familiale ALS

Capsida is gespecialiseerd in het ontwerpen van op virussen gebaseerde middelen voor het leveren van therapieën aan specifieke cellen, terwijl de expertise van CRISPR ligt in de technologie voor het bewerken van genen, met name het CRISPR-systeem voor het bewerken van genen.

"Door Capsida's volledig geïntegreerde gentherapieplatform voor weefseltargeting samen te brengen met de toonaangevende genbewerkingscapaciteiten van CRISPR Therapeutics, kunnen we eersteklas gentherapieën ontwikkelen voor patiënten met ernstige neurologische aandoeningen en het bereik van Capsida's brede mogelijkheden vergroten, ” zei Robert Cuddihy, MD, CEO van Capsida in een persbericht.

CRISPR, een afkorting voor 'geclusterde, regelmatig gespreide korte palindroomherhalingen', is afkomstig van een afweermechanisme dat bacteriën en sommige andere eencellige organismen gebruiken om virale infecties te bestrijden.

In zijn natuurlijke omgeving wordt CRISPR gebruikt om de DNA-sequenties te veranderen die een virus gebruikt om een ​​infectie uit te voeren. Wetenschappers hebben onlangs ontdekt hoe ze CRISPR kunnen hergebruiken in een veel breder en beter afstembaar hulpmiddel, waardoor ze specifieke stukken DNA kunnen toevoegen, verwijderen of anderszins veranderen, zoals mutaties die betrokken zijn bij specifieke ziekten.

De CRISPR-machinerie kan aan cellen worden afgeleverd via een soort onschadelijk virus dat een adeno-geassocieerd virus (AAV) wordt genoemd. Capsida's eigen AAV-engineeringplatform is ontworpen om virussen te genereren die zijn geoptimaliseerd voor specifieke weefseltypes. Het beperken van het vermogen van het virus om andere cellen binnen te dringen, zal naar verwachting de veiligheid en effectiviteit van de therapie verbeteren.

Volgens de overeenkomst zal Capsida onderzoek en ontwikkeling leiden naar familiale ALS-therapieën. CRISPR zal zich richten op de ataxie van Friedreich. Capsida ontwerpt de AAV's die in elk programma worden gebruikt.

Elk bedrijf heeft de mogelijkheid om het programma dat het andere bedrijf leidt samen te ontwikkelen en te commercialiseren. Als een van de medewerkers deze optie zou nastreven, zou elk van hen delen in alle kosten voor onderzoek, ontwikkeling en commercialisering, evenals in de winst.

Capsida, dat verantwoordelijk is voor de procesontwikkeling en productie van beide programma's, heeft ook de mogelijkheid om alle uit deze samenwerking voortvloeiende producten op de markt te brengen.

"We zijn verheugd om deze samenwerking met Capsida aan te gaan", zegt Samarth Kulkarni, PhD, CEO van CRISPR Therapeutics. “De combinatie van het AAV-engineeringplatform van Capsida en het genbewerkingsplatform van CRISPR Therapeutics heeft het potentieel om transformatieve gen-bewerkte therapieën mogelijk te maken voor patiënten met neurologische aandoeningen.'8221


Genetische markers

EEN genotype geeft de genetische toestand van het DNA in een organisme aan. Het is een theoretische constructie die een genetische situatie beschrijft die de waargenomen eigenschappen (fenotype, zie hieronder) van een stam verklaart. E coli genotypen vermelden alleen genen die defect zijn (1). Als een gen niet wordt genoemd, is het niet bekend dat het gemuteerd is *&dagger . Profagen en plasmiden die aanwezig waren in de oorspronkelijke K-12-stam (F, l, e14, rac) worden normaal gesproken alleen vermeld als ze afwezig waren. We hebben l echter niet vermeld, behalve wanneer het aanwezig is, en we hebben F en zijn varianten in alle gevallen vermeld. Haakjes of haakjes omringen een profaag of plasmide indien vermeld. Genen krijgen drieletterige, kleine letters, cursieve namen (bijv. dam) die bedoeld zijn als geheugensteuntjes die de functie van het gen suggereren (hier NSNA eendenine methylase). Als dezelfde functie door meerdere genen wordt beïnvloed, worden de verschillende genen onderscheiden met cursieve hoofdletters (bijv. recA, recB, recC, recD allemaal van invloed reccombinatie). De juiste notatie laat superscript + of - weg in een genotype, maar deze worden soms redundant gebruikt voor de duidelijkheid, zoals bij F'lac - proA + B + . Deletiemutaties worden genoteerd als &Delta, gevolgd door de namen van verwijderde genen tussen haakjes, [bijv. &Delta(lac-pro)]. Alle genen tussen de genoemde genen worden ook verwijderd. Specifieke mutaties krijgen allelnummers die meestal cursief Arabische cijfers zijn (bijv hsdR17) en kan worden gekarakteriseerd als ben= amber (UAG) mutatie of ts=inactief bij hoge temperatuur, indien van toepassing. Enkele veel voorkomende allelen [bijv. &Delta(lac-pro)X111] de regels overtreden. Als de genotypen van twee stammen een gen met hetzelfde allelnummer vermelden, zouden ze precies dezelfde mutatie moeten dragen.

De fenotype van een stam is een waarneembaar gedrag, b.v. Lac- faalt om te groeien op lactose als enige koolstofbron. Fenotypen hebben een hoofdletter en zijn in het Romeinse type, en de letters worden altijd gevolgd door superscript + of - (of soms r, resistente of s, gevoelig). Hoewel fenotypes strikt genomen niet in een genotype thuishoren, worden ze soms opgenomen na de genotype-aanduiding wanneer het eerste niet duidelijk is uit het laatste [bijv. rpsL104 (Str )-gennaam van Ribosomaal Peiwit, small-subeenheid, S12, geeft resistentie tegen streptomycine].

Enkele veelvoorkomende interessante genen worden hieronder beschreven. Een catalogus van genetisch gedefinieerde genen is te vinden in referentie 2 en op de zeer nuttige internetsite die wordt onderhouden door de E coli Genetic Stock Center (CGSC) aan de Yale University. Aanvullende informatie van CGSC kan worden verkregen bij curator Mary Berlyn via e-mail [email protected]

De aanduiding R(. ) betekent herschikking naar analogie met IN(. ) voor INversie (4). Dus "R(xxx::Tn10--TetS)" betekent de vroegere aanwezigheid van een Tn10-insertie. Voor inserties van wildtype Tn10 werd de herschikking vermoedelijk Tn10 bevorderd, aangezien 99% van de TetS-derivaten van Tn10-bevattende stammen transposon-gepromote herrangschikkingen (5, 6, 7) hebben verkregen die één of beide IS10-elementen sparen.

* Meest E coli laboratoriumstammen zijn gedurende veertig jaar onderzoek zwaar gemutageniseerd en verschillende lijnen kunnen verschillende, tot nu toe onontdekte, mutaties bevatten die al dan niet van invloed zijn op uw situatie. Om deze reden is het soms handig om meer dan één regel, of achtergrondstam, in uw experimenten te proberen.

&dolk E coli B en zijn derivaten zijn natuurlijk Lon- en Dcm-. We hebben dit tussen haakjes vermeld, ook al is het de wildtype-status voor deze soorten.

Referenties

  1. Demerec et al. (1966) Genetica 54, 61-76. PMID: 5961488
  2. Berlyn, MKB (1996) in F.C. Niedhardt et al. (red.), Escherichia coli en Salmonella: cellulaire en moleculaire biologie, (2e ed.), Vol. 2, (pp. 1715-1902). ASM-pers. PMID: 9729611
  3. Raleigh, EA et al. (1991) J. Bacteriol. 173, 2707-2709. PMID: 2013582
  4. Hill, C.W. en B.W. Harnish. (1981) Inversies tussen ribosomale RNA-genen van Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 78:7069-72. PMID: 6273909
  5. Kleckner, N., K. Reichardt en D. Botstein. (1979) Inversies en deleties van het Salmonella-chromosoom gegenereerd door het transloceerbare tetracyclineresistentie-element Tn10. J. Mol. Biol.127:89-115. PMID: 370414
  6. Raleigh, E.A. en N. Kleckner. (1984) Meerdere IS10 herschikkingen in Escherichia coli. J. Mol. Biol.173:437-61. PMID: 6323719
  7. Simons, R.W., F. Houman en N. Kleckner. (1987) Verbeterde enkelvoudige en meervoudige op lac gebaseerde kloneringsvectoren voor eiwit- en operonfusies. Gen. 53:85-96 PMID: 3596251

Lactosepermease-activiteit afgeschaft.

NS (lac) = verwijdering er zijn vier veelvoorkomende verwijderingen met betrekking tot: lac:

NS (lacZ)M15 drukt een fragment uit dat de aanvult lac alfa-fragment gecodeerd door vele vectoren. Deze vectoren geven alleen een blauwe kleur op X-Gal als de gastheer D M15 draagt.

D U169, D X111 en D X74 verwijderen allemaal de volledige lac operon van het chromosoom, naast variërende hoeveelheden flankerend DNA. D X111 verwijdert proAB ook, zodat de cel proline nodig heeft voor groei op minimaal medium, tenzij het ook F' draagtlac proA + B + .


Vector overwegingen

voorbijgaande transfecties zijn efficiënter met zeer supercoiled DNA vergeleken met lineair DNA, vermoedelijk omdat circulair DNA niet kwetsbaar is voor exonucleasen, terwijl lineaire DNA-fragmenten snel door deze enzymen worden afgebroken (McLenachan et al., 2007 von Groll et al., 2006). Bovendien toont atomic force microscopie-analyse zeer verschillende complexatiepatronen tussen kationische lipide-reagentia en circulaire en lineaire DNA-topologieën: terwijl compacte sferische of cilindrische condensaten worden waargenomen met circulair DNA, vertonen lineaire plasmiden uitgebreide parelkettingachtige structuren. Hoewel de kationische lipide-gemedieerde transfectie van de compactere circulaire plasmiden waarschijnlijk door endocytose gaat, kan de toegangsroute van uitgebreide gelineariseerde DNA-structuren heel anders en minder efficiënt zijn (von Groll et al., 2006).

Stabiele transfecties zijn efficiënter bij gebruik lineair DNA vanwege de optimale integratie in het gastheergenoom. Lineair DNA met vrije uiteinden is meer recombinogeen en het is waarschijnlijker dat het in het gastheerchromosoom wordt geïntegreerd om stabiele transformanten op te leveren, hoewel het minder efficiënt door de cel wordt opgenomen.

Ondanks vergelijkbare opname-efficiënties bij kationische lipide-gemedieerde transfectie, wordt nucleaire afgifte van grote plasmiden gecompromitteerd in vergelijking met kleine plasmidemoleculen. Dit effect wordt waargenomen met equivalente massa- of molaire concentraties van constructen van verschillende grootte, wat suggereert dat nucleaire afgifte van plasmiden kan worden beperkt door de snelheid van intracellulaire transit en dat kleine plasmiden afbraak ontwijken door snelle transit door het cytoplasma, in plaats van door de verzadiging van cellulaire afweer (Lukacs, et al., 2000 McLenachan et al., 2007).


Discussie

We hebben aangetoond dat de ISR de weefselmorfogenese moduleert door de regulatie van dpp-geïnduceerde MAD-fosforylering. In vleugelweefsel wordt dit mechanisme voornamelijk aangedreven door het eIF2α-kinase dGCN2. Deze repressieve effecten worden direct bereikt door de vermindering van translatie die gepaard gaat met fosforylering van eIF2α, en indirect door de inductie van de transcriptiefactor crc (dATF4) en zijn doelen, waaronder d4E-BP (Fig. 4i). Omdat de ISR behouden is tussen metazoën, kunnen onze bevindingen een grotere betekenis hebben in de ontwikkelingsbiologie.

Ontwikkelingssignalen orkestreren weefselpatronen door vooraf bepaalde programma's te volgen. Omgevingsfactoren hebben ook een invloed op de ontwikkeling, en dus is overspraak tussen stresssignalering en ontwikkelingspaden noodzakelijk. Het is bekend dat overexpressie van niet-fosforyleerbare mutanten van eIF2α de ontwikkeling van vergrote volwassen vrouwelijke vliegen versnelt, terwijl expressie van een fosfomimetische eIF2α de ontwikkeling van larven vertraagt ​​[31]. We hebben eerder gemeld dat uitputting van de eIF2α-fosfatase dPPP1R15 een ontwikkelingsvertraging veroorzaakt die vergelijkbaar is met die van fosfomimetische eIF2α [14]. We hebben nu aangetoond dat expressie van dPPP1R15 alleen nodig is voor larvale ontwikkeling in specifieke larvale weefsels, inclusief de imaginaire schijven, en een antagonistische relatie deelt met dGCN2.

In vitro studies indicate that inhibition of protein synthesis mediates some of the inhibitory effects of dGCN2 on BMP signalling, reflecting the short half-lives of components of the BMP signalling cascade. Vein formation in the fly wing is governed by BMP signalling. Dpp (the Drosophila BMP2/4 homologue) binds to the type I receptors, Tkv or Sax, and type II receptor Punt to phosphorylate and activate the transcription factor MAD [32]. Crossvein morphogenesis requires secretion of dpp from nearby longitudinal veins and its chaperoning by the molecules tsg, cv and sog, which are subsequently degraded by Tlr to release dpp at sites defined by high levels of cv-2 [21, 33]. The formation of the dpp gradient also requires the expression of extracellular glypicans, such as dally, and their post-translational modification by enzymes including sulfateless [34, 35]. Changes in the expression levels of at least some of these components may contribute to impaired BMP signalling during activation of the ISR. dally RNAi had a more dramatic effect on wing development when expressed with ppp1r15 RNAi, compared with ppp1r15 RNAi in flies with one hypomorphic allele of dpp d5 . This might relate to differences in the degree to which dally en dpp were depleted, but it might also reflect the dual role of dally in both stabilising and dispersing dpp in the extracellular space and as a co-receptor involved directly in dpp signalling [36]. Examination of wing imaginal discs has not yet revealed dramatic effects of the ISR on signalling via the wnt or hedgehog pathways (not shown), but further studies are necessary before the regulation of developmental signalling by the ISR can be said to show specificity towards the BMP pathway.

crc, the Drosophila homologue of ATF4, also inhibits MAD phosphorylation. The large number of genes sensitive to crc suggests that its effect on BMP signalling may be multifaceted. Our data reveal, however, that part of this effect is mediated by the induction of d4E-BP. Of note, ATF4 binding sites have recently been identified within the d4E-BP gene [37]. By binding to eIF4E, 4E-BP prevents assembly of eIF4F and so selectively inhibits cap-dependent translation [38]. Interestingly, expression of a hyperactive mutant of d4E-BP in the wing has been shown to result in selective loss of the ACV, although the mechanism was unknown [39]. How elevated d4E-BP levels inhibit phosphorylation of MAD in the absence of detectable effects on global translation rates is unclear. It is plausible that the extent of translational attenuation may vary among cap-dependent mRNAs, and, in such a model, as levels of available eIF4E decline, some mRNAs might compete more efficiently than others for a limited supply of the eIF4F. Such sensitivity could explain some of the effects we have described, although the mRNAs responsible for altered MAD phosphorylation have yet to be fully identified. Nevertheless, there are numerous instances in which d4E-BP selectively regulates mRNA translation. For example, insulin signalling inhibits neurotransmitter release via d4E-BP-mediated repression of complexin mRNA translation [40], while dietary restriction enhances the expression of mitochondrial respiratory components by inducing d4E-BP [41]. Indeed, there is emerging evidence in Drosophila that ISR-induced d4E-BP plays a role in biasing translation during infection [42], development and aging [37].

Mice generated to be insensitive to the ISR kinases owing to mutation of the target serine 51 of eIF2α revealed a role for the ISR in mammalian development [7]. Homozygous pups were growth retarded and died from hypoglycemia due to impaired gluconeogenesis, while heterozygous animals developed diabetes if fed high-fat chow owing to impaired pancreatic ß-cell survival.

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a family of diseases that predominantly affects young adults and carries a high mortality. Although most cases are idiopathic, in 70% of familial cases and 20% of sporadic cases heterozygous germline mutations are identified in the type II BMP receptor (BMPR2) [43,44,45]. The penetrance of the BMPR2 mutation is highly variable, suggesting that additional modifying factors must exist. Recently, two rare subtypes of PAH, pulmonary veno-occlusive disease (PVOD) and capillary haemangiomatosis, were shown to be caused by mutations of EIF2AK4, which encodes the kinase GCN2 [46, 47]. interessant, BMPR2 mutations have also been associated with PVOD, suggesting that similar mechanisms may underlie typical PAH and PVOD [48, 49]. It is tempting to speculate that the mechanism linking GCN2 and BMP signalling that we have described here might have relevance to PAH. Why loss of GCN2-mediated inhibition of BMP signalling should cause a disorder more commonly associated with insufficient SMAD phosphorylation is intriguing. However, mammalian BMP signalling is more complex than that of insects, and it is known that loss of signalling via one BMP type II receptor in pulmonary artery smooth muscle cells can lead to excessive signalling through other type II receptors [50]. Further studies will be necessary to determine if the ISR regulates BMP signalling within the mammalian pulmonary vasculature.


CRISPR Use Creates Malaria-Resistant Mosquitoes

Malaria continues to be a scourge on the human population, leading to hundreds of thousands of deaths each year. While the complex life cycle of the parasite that causes malaria can aid its persistence and genetic diversity, it also allows for potentially multiple therapeutic target areas. Many researchers focus their attention on the parasite's foray into malaria’s transmission vector—the mosquito. In doing so, investigators from the Malaria Research Institute at Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health have just released new data show that the deletion of a single gene from mosquitoes can make them highly resistant to the malaria parasite and thus much less likely to transmit the parasite to humans.

Findings from the new study were published recently in PLOS Pathogens, in an article entitled “CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout of Anopheles gambiae FREP1 Suppresses Malaria Parasite Infection.” The research team used the CRISPR/Cas9 system, which permits precise DNA editing, to delete a gene called FREP1 from the genome of Anopheles gambiae mosquitoes, the chief transmitters of the most pathogenic strain of malaria (Plasmodium falciparum) to humans. Within the modified mosquitoes, malaria parasites were much less likely to survive and multiply.

“Our study shows that we can use this new CRISPR/Cas9 gene-editing technology to render mosquitoes malaria-resistant by removing a so-called host factor gene,” explained senior study investigator George Dimopoulos, Ph.D., professor in the Bloomberg School's department of molecular microbiology and immunology. “This gives us a good technological platform for developing advanced malaria-control strategies, based on genetically modified mosquitoes unable to transmit the disease, and for studying the biology of malaria parasites in their mosquito hosts.”

This study is the first to show that deleting a gene from mosquitoes can make them resistant to malaria parasites. It also underscores the potential of this strategy to modify wild mosquito populations and thereby reduce malaria transmission to humans. The CRISPR/Cas9 system is a set of DNA-editing molecules implicated in bacterial defense mechanism against viruses. In recent years, biologists have adapted it as a precise tool for genetic engineering—in scientific experiments and in prospective genetic-modification strategies against diseases such as malaria.

Though a malaria vaccine is currently available, its protection is only partial and temporary, and like many antimalarial medicines, the vaccine has a limited supply. Researchers are turning to potentially cost-effective strategies that target malaria-carrying mosquitoes to prevent the spread of malaria in the first place.

In the current study, the Hopkins researchers modified A. gambiae mosquitoes by deleting the gene FREP1, which encodes an immune protein, fibrinogen-related protein 1. For reasons that aren't fully clear, the protein helps malaria parasites survive within the mosquito gut and progress to the developmental stages needed for their transmission to people. FREP1 is thus considered a malarial “host factor.”

Amazingly, the elimination of this host factor via the deletion of the FREP1 gene had other effects besides reducing the number of mosquitoes infected with malaria. Na de FREP1 deletion, most of the modified mosquitoes had no evidence in their salivary glands of the sporozoite-stage parasites that enter the human bloodstream through a mosquito bite.

“The resistance to malaria parasites that is achieved by deleting FREP1 is remarkably potent,” Dr. Dimopoulos noted. “If you could successfully replace ordinary, wild-type mosquitoes with these modified mosquitoes, it's likely that there would be a significant impact on malaria transmission.

Replacing ordinary mosquitoes in the wild with genetically modified mosquitoes hasn't yet been attempted on a very large scale, though scientists have been working on gene drive techniques that cause DNA modifications to spread quickly into a wild population via ordinary breeding. Gene drives use CRISPR/Cas9's DNA-editing ability to essentially hack the conception process, pushing a gene modification into all or nearly all the offspring of a modified animal.

In 2016, for example, researchers reported that they had created a CRISPR/Cas9 gene drive that forces a fertility-reducing gene modification into female A. gambiae mosquitoes—which could quickly reduce local Anopheles populations if unleashed in the wild.

In principle, the deletion or inactivation of FREP1 also could be incorporated in a gene drive system. Because it doesn't aim at reducing mosquitoes' health or ability to reproduce—reducing “fitness” in the Darwinian sense—a FREP1 inactivation would create less of an opportunity for mosquito mutations that resist its effects.

Interestingly, the investigators found that deleting FREP1 entirely from Anopheles did, however, come with some fitness costs to the modified mosquitoes. Compared to their wild-type cousins, the FREP1-less mosquitoes developed into adults more slowly, were less likely to take blood meals when given the opportunity, and laid fewer and less viable eggs.

“We're now making mosquitoes in which FREP1 will be inactivated only in the adult gut,” Dr. Dimopoulos remarked. “We predict that when we do that, the mosquito won't suffer the same fitness costs.”

The researchers are continuing to use the CRISPR/Cas9 DNA-editing platform to study the effects of deleting other potential malaria host-factor genes and to learn more about the roles of these host factors in mosquitoes.

“We're focused not just on developing a malaria control strategy, but also learning more about the biology of malaria-carrying mosquitoes,” Dr. Dimopoulos concluded.


Bekijk de video: Wat is een chromosoom? (Januari- 2022).