Informatie

Waarom moeten we DNA-sequenties amplificeren?


Ik leer over biotechnologie. Ik heb geen opleiding in biologie of scheikunde en ben gewoon geïnteresseerd in het onderwerp biotechnologie.

Ik vraag me af waarom we meerdere kopieën van een stukje DNA nodig hebben om er iets mee te doen (bijv. PCR)? Waarom is één stukje DNA niet genoeg? Is machines niet precies genoeg om met één stukje van een DNA-sequentie te werken om er iets mee te doen?

Ik kan begrijpen dat een experiment kan mislukken. Maak in dat geval 8-16 kopieën voor zekerheid. Maar waarom een ​​buitengewone (miljarden) aantal exemplaren? Welk praktisch nut heeft het? Welke toepassingen vereisen een buitengewone hoeveelheid DNA om succesvol te zijn? Verhogen de miljarden kopieën alleen maar de snelheid van het experiment door snel een stukje DNA te kunnen "uitvissen"? Ik kan het idee gewoon niet helemaal bevatten.


Dit is een vraag die ik me ook herinner toen ik jonger was op school. Nu als professional is het veel te voor de hand liggend om het zelfs maar uit te leggen. Maar ik denk dat het een belangrijke en veel voorkomende vraag is, die een paar voorbeelden uit de dagelijkse laboratoriumpraktijk rechtvaardigt.

Voorwoord

Je moet begrijpen dat DNA een molecuul is. Het is echt klein. Het is niet triviaal om er precies mee te werken, het te detecteren of twee verschillende stukjes DNA van elkaar te onderscheiden, laat staan ​​ze te rangschikken. Door middel van amplificatie maken we veel DNA aan zodat we voldoende kunnen bereiden om reacties mee te maken.

visualisatie

Meestal maken we DNA zichtbaar door chemische kleurstoffen te gebruiken die licht uitstralen (fluoroforen) of door radioactieve stukjes in te bouwen om het DNA zichtbaar te maken.

Dit is een veelvoorkomend geval in het laboratorium: we moeten genoeg DNA hebben om in volgende reacties te gebruiken. Wanneer we met DNA werken, is het zeer zeldzaam dat we 100% van de tijd precies krijgen wat we willen, oftewel een perfecte opbrengst. We willen bijvoorbeeld een keer een stukje DNA knippen. Maar we hebben een schaar (d.w.z. restrictie-enzymen) die het DNA meerdere keren zal hakken, vooral als we de reactie te lang laten duren. Wat we doen is 100 eenheden DNA nemen, deze onderwerpen aan de reactie en de resultaten bekijken met behulp van bijvoorbeeld elektroforese met een agarosegel. We kunnen dan 40 eenheden ongeknipt DNA zien, 30 eenheden enkelvoudig gesneden DNA en ongeveer 30 eenheden DNA die meerdere keren zijn geknipt (2+ keer, dus het zijn kleine fragmenten). Wij hebben nodig genoeg enkelvoudig gesneden DNA om door te gaan met de volgende reactie, in het volle besef dat er geen verontreinigende stukjes DNA zijn. Meestal zijn er veel reacties achter elkaar die we doen om iets te bereiken in het lab. Klonen, in vitro amplificatie, sequencing, genbewerking, genen voorbereiden voor transgenese, RNAi-probes maken, wat heb je.

Meer is beter

Een ander geval: als je de volgorde van DNA wilt weten, moet je de volgorde ervan bepalen. De volgordebepaling is echter onvolmaakt en er treden fouten op. Om zeker te zijn, her-sequensen we hetzelfde DNA vele malen om een ​​zeker beeld te krijgen van hoe de sequentie eruit ziet, zonder redelijke twijfel. Het tien keer sequencen van DNA is echt betrouwbaarder dan het één keer sequencen. Dit kan zijn vanwege hoe de moleculen zich gedragen in oplossing, of vanwege degradatie, of tientallen andere dingen. Je moet begrijpen dat dit ook niet specifiek is voor sequencing; veel reacties volgen dezelfde logica.

Amplificatie als specificatietool

Door primers in PCR te gebruiken, kunnen we ervoor zorgen dat we krijgen wat we willen. In principe betekent dit dat we een gajillion kopieën kunnen maken van iets waarin we geïnteresseerd zijn (bijvoorbeeld een gen), zelfs van een enkele DNA-streng die dingen kan bevatten waarin we niet geïnteresseerd zijn (bijvoorbeeld de rest van het genoom).

Sommige gedachten

Dit antwoord is zeker niet uitgebreid, maar ik hoop dat het een inleiding is voor u om te begrijpen dat DNA-werk gewoon heel slimme nanotechnologie is, en we zijn nog niet op het niveau van het uitvoeren van nanotechnologie op afzonderlijke moleculen, met volledig vertrouwen, precisie of werkzaamheid. Dagelijks hebben we genoeg nodig om het met onze ogen te kunnen zien, dus versterken en reageren we met intercalerende kleurstoffen om ze met het blote oog zichtbaar te maken!


Een nieuwe benadering voor het versterken van DNA

Tijdens replicatie worden de twee strengen gescheiden. Elke streng van het oorspronkelijke DNA-molecuul dient dan als een sjabloon voor de productie van zijn complementaire tegenhanger. Krediet: Wikimedia Commons

Het analyseren van DNA is nuttig voor een aantal vitale toepassingen. Dit omvat diagnose en monitoring van ziekten, identificatie van criminelen en het bestuderen van de functie van een gericht DNA-segment. Echter, methoden die voor analyses worden gebruikt, vereisen vaak meer DNA dan in een typisch monster beschikbaar is. 'Daarom is versterking nodig, maar niet altijd eenvoudig. De meest gebruikte amplificatie- of fotokopieermethode is de polymerasekettingreactie (PCR). Een nieuwe PCR-methode zou het amplificatieproces kunnen helpen en zo robuuste testen kunnen ontwikkelen die voorheen niet mogelijk waren.

Deoxyribonucleïnezuur (DNA) is een molecuul dat in de celkern wordt aangetroffen en dat de 'instructies' bevat voor de ontwikkeling en het functioneren van levende organismen. Het wordt vaak vergeleken met een set blauwdrukken, omdat het de instructies bevat die nodig zijn om cellen te bouwen. Deze instructies zijn verdeeld in segmenten langs een DNA-streng.

DNA bestaat uit een dubbele helix van twee complementaire strengen gemaakt van nucleotiden, een structuur die vaak wordt vergeleken met een ladder. Wanneer het tijd is om te repliceren, ontspannen de twee DNA-strengen - of 'zijkanten' van de ladder - zich en scheiden. Een enzym genaamd DNA-polymerase leest de individuele strengen en matcht complementaire basen - de 'sporten' van de ladder - met de originele streng. Nieuwe strengen worden geproduceerd aan beide zijden van het oorspronkelijke DNA, waardoor twee identieke dubbele DNA-helices worden gemaakt, bestaande uit een originele en een nieuwe streng. Dit proces vindt plaats in alle levende organismen en vormt de basis voor biologische overerving.

Replicatie kan ook kunstmatig worden verwerkt. De polymerasekettingreactie (PCR), ook wel 'moleculair fotokopiëren' genoemd, is een snelle en relatief goedkope techniek die wordt gebruikt om kleine DNA-segmenten te amplificeren of veel kopieën te maken. Dit is nodig omdat methoden die worden gebruikt voor het analyseren van DNA of het bepalen van de DNA-basenpaarsequentie meer DNA vereisen dan in een typisch monster kan zijn. Daarom is het doel van PCR om een ​​specifiek gebied van een DNA-streng te amplificeren.

Om PCR uit te voeren, worden de twee strengen van de dubbele DNA-helix fysiek gescheiden door toepassing van hoge temperatuur (93-98 ° C) in een proces dat DNA-smelten wordt genoemd. In de tweede stap wordt de temperatuur verlaagd en worden de twee DNA-strengen, nu gescheiden, sjablonen voor zogenaamde primers. Primers zijn korte enkelstrengs DNA-moleculen die complementair zijn aan het DNA-gebied waarop amplificatie wordt gericht. Na het verlagen van de temperatuur, vinden de primers die aan het PCR-proces worden toegevoegd, het specifieke doelwit en binden het eraan. Een enzym genaamd DNA-polymerase zal een nieuwe DNA-streng uit de primer verlengen - of bouwen - met behulp van het onderliggende enkelstrengige DNA-molecuul als sjabloon.

COMPAS-PCR met behulp van zeer complementaire primers toegepast op 5S ribosomaal DNA direct repeat genen, zoals getoond in dit voorbeeld. Krediet: Noors Instituut voor Wateronderzoek (NIVA)

Zoals hierboven vermeld, zijn primers korte enkelstrengs DNA-moleculen. Deze zijn meestal ongeveer 20 nucleotiden lang. Deze reeks nucleotiden hecht zich specifiek aan het begin van de sjabloonstreng door basenparing - het vinden van de complementaire basen. DNA-polymerase kan dan het volgende complementaire nucleotide toevoegen. De polymerase gaat door met het toevoegen van meer complementaire nucleotiden aan het matrijs-DNA totdat een nieuwe dubbele DNA-streng is voltooid, of om de metafoor hierboven te gebruiken, een nieuwe ladder wordt gebouwd, met één originele kant en één nieuwe kant.

Dubbele primers maken het mogelijk om het gebied van een DNA-molecuul dat door de PCR moet worden geamplificeerd, nauwkeurig te definiëren. Deze twee flankerende primers geven aan waar de nieuwe keten moet beginnen en eindigen.

Een kleine paradigmaverschuiving

Een centrale regel die sterk verankerd is in de geest van de moleculaire wetenschapper is dat primers alleen complementair moeten zijn aan de doelsequentie, en niet aan elkaar. Dit om te voorkomen dat primers elkaar als sjablonen gebruiken en zo verdere mogelijke betrokkenheid bij traditionele doelamplificatie uit te schakelen.

In een recente studie, gepubliceerd in het wetenschappelijke tijdschrift PLOS One, Senior Research Scientist Marc Anglès d'Auriac van het Noorse Instituut voor Wateronderzoek (NIVA) toont aan dat het mogelijk is om zeer complementaire primers te gebruiken en toch de hierboven genoemde ongelukkige gevolgen te vermijden. De nieuwe methode heeft de naam COMPAS-PCR gekregen, wat staat voor COMplementary Primer Asymmetric PCR.

Kortom, Anglès d'Auriac merkte op dat primers die complementair zijn tussen zichzelf en een doelwit (drievoudige overlay) nog steeds een amplificatieproduct kunnen definiëren als ze deel uitmaken van een herhaald DNA-motief of -structuur. Dit is weergegeven in onderstaande figuur. Verder werd de fysieke belemmering van doelamplificatie als gevolg van primercomplementariteit verlicht door het introduceren van asymmetrische primerconcentraties. Asymmetrisch betekent in dit opzicht oneven aantallen moleculen tussen de twee primers. De ene primer bestaat uit een laag aantal moleculen, de andere uit een hoog aantal.

Hoge resolutie smeltanalyse van twee drie-primer duplex COMPAS-PCR voor de differentiatie van S. salar, S. trutta en hybriden. Krediet: Noors Instituut voor Wateronderzoek (NIVA)

"Als je gelijke concentraties gebruikt, zoals je gewoonlijk doet voor PCR, zullen de primers, die in gelijke hoeveelheden aanwezig zijn, aan elkaar kleven", zegt Anglès d'Auriac.

"Met asymmetrische concentraties heeft de overmaat of hooggeconcentreerde primer een aantal moleculen die niet vastzitten aan de beperkende primer, en is daarom beschikbaar voor doelamplificatie."

"Deze contra-intuïtieve benadering zal de primer met lage concentratie isoleren, maar ook beschermen", zegt Anglès d'Auriac.

Met de beperkende primer die vastzit en dus beschermd is, is het mogelijk dat de primer met hoge concentratie alleen werkt, dat wil zeggen een enkelstrengs kopie van het DNA-doelwit maken. Wanneer voldoende enkelstrengige amplicons worden geproduceerd, kunnen ze dienen als sjabloonmateriaal voor de primer met lage concentratie. De beperkende primer wordt vrijgegeven en de reactie schakelt over naar klassieke exponentiële PCR-amplificatie.

"Dit vergroot de toepassingsmogelijkheden van PCR voor de wetenschapper, legt Anglès d'Auriac uit."

Repetitieve structuren

Polymerasekettingreactie (PCR). Krediet: Wikimedia

In veel organismen is een aanzienlijk deel van het genomische DNA zeer repetitief, waarbij meer dan de helft van de sequentie bestaat uit repetitieve elementen bij mensen.

Het was inderdaad een zich herhalende DNA-structuur die ervoor zorgde dat Anglès d'Auriac buiten de gebaande paden ging denken en het COMPAS-PCR-principe naar voren bracht, een kleine paradigmaverschuiving op het gebied van moleculaire fotokopie.

Bij het uitvoeren van op DNA gebaseerde diagnoses voor zalmachtigen, met name de identificatie van de nauw verwante beekforel (Salmo trutta) en Atlantische zalm (Salmo salar), had Anglès d'Auriac moeite om deze soorten te scheiden, inclusief hybriden tussen hen. Snelle en nauwkeurige identificatie zou de monitoring en studies van rivierecosystemen helpen verbeteren, aangezien de identificatie van hybriden belangrijk is om de ecologische gezondheid van stroomgebieden in te schatten. Na COMPAS-PCR te hebben gebruikt, kon Anglès d'Auriac een PCR-productanalysemethode toepassen, de zogenaamde smeltanalyse met hoge resolutie, voor het identificeren van bruine forel, Atlantische zalm en hun hybriden in één test.

Anglès d'Auriac benadrukt echter dat het COMPAS-PCR-principe niet beperkt is tot de identificatie van vissoorten. Het gebruik van bijna volledig complementaire primers die gericht zijn op dezelfde sequentie kan van toepassing zijn op alle kopieën die naast elkaar liggen, in DNA-motieven die van belang zijn als doelwitsequenties.

"Van DNA-herhalingssequenties wordt gerapporteerd dat ze meer dan 50% van het menselijk genoom uitmaken en zijn aanwezig in veel "huishoudelijke" genfamilies, zoals het 5S-ribosomale gen dat in deze studie wordt gebruikt. Daarom zullen de algemene COMPAS-PCR-principes helpen bij de ontwikkeling van nieuw DNA amplificatiestrategieën die profiteren van deze herhaalde DNA-structuren", besluit Marc Anglès d'Auriac.


Lezing 17: Genomen en DNA-sequencing

Professor Martin vertelt over DNA-sequencing en waarom het nuttig is om de DNA-sequentie te kennen, gevolgd door linkage mapping en vervolgens de verschillende methoden om DNA te sequencen.

Instructeur: Adam Martin

Lezing 1: Welkom Introdu.

College 2: Chemische binding.

College 3: Structuren van Am.

Lezing 4: Enzymen en Meta.

College 5: Koolhydraten an.

Lezing 9: Chromatine Remode.

Lezing 11: Cellen, The Simpl.

College 16: Recombinant DNA.

Lezing 17: Genomen en DNA.

Lezing 18: SNP's en Human .

College 19: Cell Traffickin.

College 20: Celsignalering .

College 21: Celsignalering .

Lezing 22: Neuronen, actie.

College 23: Celcyclus en .

Lezing 24: Stamcellen, Apo.

Lezing 27: Visualiseren van Lif.

College 28: Visualiseren van Lif.

Lezing 29: Cell Imaging Te.

Lezing 32: Infectieziekte.

College 33: Bacteriën en An.

College 34: Virussen en mieren.

College 35: Reproductieve Cl.

PROFESSOR: En vandaag ga ik het hebben over DNA-sequencing. En ik wil beginnen met een soort voorbeeld te illustreren van hoe het kennen van de DNA-sequentie nuttig kan zijn. Dus je herinnert je nog dat we in de vorige lezing spraken over hoe je een gen zou kunnen identificeren door middel van functionele complementatie. En dit proces omvatte het maken van een DNA-bibliotheek met verschillende DNA-fragmenten gekloond in verschillende plasmiden en vervolgens het vinden van de naald in de hooiberg waar je het gen vindt dat een defect kan redden in een mutant die je hebt.

Dus als deze lijn die ik hier trek genomisch DNA is, en het zou genomisch DNA kunnen zijn van, laten we zeggen, een prototrofe voor LEU2, het leucine-gen. Dit is dus van een prototroof.

Dan zou je het DNA kunnen knippen met EcoRI. En als er geen restrictieplaats in dit LEU2-gen zit, krijg je een fragment dat het LEU2-gen bevat. En dan zou je dit kunnen klonen in een soort plasmide dat zich repliceert in het organisme waarin je het introduceert en waarin je het verspreidt.

En zo zou je dan kunnen testen of dit stukje DNA dat je hebt een LEU2-auxotroof complimenteert, oké?

Eén ding waar ik op wil wijzen is dat omdat deze EcoR1-sites, deze plakkerige uiteinden, dit EcoR1-uiteinde of dit EcoR1-uiteinde zouden herkennen, je je kunt voorstellen dat dit gen, als het gen zo leest, het op deze manier in het plasmide zou kunnen invoegen. Of het kan in de tegenovergestelde richting worden ingevoegd. Het kan dus omgekeerd zijn. Dit zou dus een soort replicatieoorsprong hebben en een soort selecteerbare marker.

Maar als u dezelfde restrictiesite heeft, kan deze op de ene of de andere manier worden ingevoegd. Dat is slechts één ding dat ik wilde opmerken.

Laten we zeggen dat je, in plaats van leucine, geïnteresseerd bent in cyclisch afhankelijk kinase, en je had een mutant eind-CDK en je had deze sequentie van je gist-CDK-gen. In plaats van door een hele bibliotheek met stukjes DNA te moeten graven voor het CDK-gen, ben je eigenlijk aan het vissen naar die naald in de hooiberg. Als je de sequentie van het menselijk genoom zou kennen, zou je vergelijkbare genen kunnen identificeren door sequentiehomologie.

En je zou dan een meer directe benadering kunnen kiezen, waarbij je... laten we zeggen dat je nu een stuk menselijk DNA hebt, dubbelstrengs DNA, en het heeft het CDK-gen. Je zou menselijk DNA kunnen nemen met dit CDK-gen. En je hebt een unieke sequentie rond het CDK-gen, waardoor je dit DNA kunt denatureren. En als je het DNA denatureert, krijg je twee enkele strengen DNA. En je zou dan primers kunnen ontwerpen die unieke sequenties herkennen die het CDK-gen flankeren.

Dus je zou je kunnen voorstellen dat je hier een primer zou hebben en een primer hier. En dan zou je PCR kunnen gebruiken om specifiek het CDK-gen te amplificeren, het kan het genoom zijn of uit een bibliotheek. En dan krijg je dit fragment hier, inclusief CDK. Dus als je de sequentie van het genoom kent, kun je sneller gaan van misschien een gen waarvan je hebt vastgesteld dat het belangrijk is in een organisme, en het menselijke equivalent vinden dat iets soortgelijks bij mensen doet. Dus deze stap hier is eigenlijk PCR.

En laten we zeggen dat het CDK-gen restrictieplaatsen had. Eens kijken, we zeggen hier restrictieplaats K en A. Als je dan deze restrictieplaatsen in je DNA-fragment hebt, kun je dat stukje DNA verteren of knippen met deze restrictie-endonucleasen. En dan krijg je een fragment van CDK met K en A plakkerige uiteinden. We zullen doen alsof deze beide plakkerige uiteinden hebben.

En nu heb je unieke plakkerige uiteinden tussen K en A. En je hebt misschien een vector die ook deze twee plaatsen heeft. En je zou deze vector kunnen verteren met deze twee enzymen. En dat zou je toelaten om het specifieke gen in dit plasmide in te voegen.

En als je twee unieke sites hebt, omdat K hier alleen K herkent en A alleen A, dan zal het inligeren. Maar je kunt het met een specifieke oriëntatie doen omdat je twee verschillende restrictiesites hebt. Dus ik hoop dat jullie allemaal zien hoe het is met één restrictiesite versus twee.

Okee. Laten we zeggen dat u iets ingewikkelders wilt doen dan dit. Laten we zeggen dat je, in plaats van alleen het gen te identificeren dat betrokken is bij celdeling, een nieuw gen wilt ontwikkelen om te bepalen waar dit specifieke eiwit, CDK, zich in de cel bevindt. Dus we hebben CDK, dat van gist of van mensen kan zijn, het maakt niet uit. En je wilt een nieuw eiwit ontwikkelen dat je kunt zien.

Dus onthoud dat professor Imperiali eerder dit jaar groen fluorescerend eiwit introduceerde. En dit groen fluorescerende eiwit is van een gen van kwallen. Dus nu kunnen we, met behulp van wat ik je heb verteld, een gen reconstrueren of manipuleren met DNA van drie verschillende organismen, om een ​​CDK-variant te maken die we in de cel kunnen zien.

Dus onthoud, een groen fluorescerend eiwit is als een baken, als het aan een eiwit is vastgemaakt. Als je er blauw licht op schijnt, straalt het groen licht uit. En dus kun je een fluorescentiemicroscoop gebruiken om het te zien.

In dit geval, laten we zeggen dat er hier ook een andere restrictieplaats is, R. En laten we zeggen dat je een fragment van GFP hebt dat twee restrictieplaatsen heeft, A en R. Je zou dan dit fragment en dit fragment kunnen knippen met deze restrictie-enzymen A en R En je zou GFP kunnen invoegen aan het C-uiteinde van het CDK-gen. Dus je zou een gen kunnen krijgen met CDK GFP in een bacteriële vector.

Welke van deze knooppunten zou volgens u het meest gevoelig zijn bij het uitvoeren van dit soort experimenten? Er zijn dus drie knooppunten. Er is deze, deze en deze. Waar ga je waarschijnlijk het meest over nadenken als je dit experiment doet?

ADAM MARTIN: De A-site. Miles heeft helemaal gelijk. Deze gaat belangrijk worden. En waarom heb je die site gekozen?

PUBLIEK: Van de drie sites zijn er twee half ingevoegd, half origineel [ONHOORBAAR]. Maar bij A zijn beide zijden inzetstukken. Dus [ONAUDIBLE] voorzichtig.

ADAM MARTIN: En als je een fusie-eiwit probeert te maken, wat zal dan een belangrijke kwaliteit hiervan zijn? Malik, had je een punt?

PUBLIEK: Nou, ze proberen [ONAUDIBLE] we moeten ervoor zorgen dat de [ONAUDIBLE].

ADAM MARTIN: Uitstekend werk. Dus Malik wees net op twee heel belangrijke dingen. Om hier een fusie-eiwit van te maken, heb je twee verschillende open leesramen. Deze twee open leesramen moeten in elkaar passen.

Dus deze kruising hier moet in het frame zijn waar GFP in frame staat met CDK, wat betekent dat je dezelfde triplet-codons voor GFP leest, daar in hetzelfde frame als CDK. U wilt er ook zeker van zijn dat hier geen stopcodon is. Want als je hier een stopcodon had, maak je gewoon een CDK-eiwit. En dan stopt het en dan heb je het niet meer gefuseerd met GFP.

En jullie zullen meer van deze in het huiswerk verwerken. Je krijgt er dus wel een idee van.

Dus nu voor de rest van deze lezing en ook voor de lezing van maandag, wil ik een probleem met je doornemen. Kortom, als je een bepaalde ziekte hebt die erfelijk is, hoe kun je dan van weten dat die ziekte erfelijk is, om erachter te komen welk gen verantwoordelijk is voor die bepaalde ziekte? En dit gaat gepaard met het nadenken over verschillende resolutieniveaus, in termen van kaarten.

Dus de kaart met de hoogste resolutie die je voor een genoom kunt hebben, is de sequentie. Je kunt de volledige nucleotidesequentie van een genoom hebben. En dat is de hoogst mogelijke resolutie omdat je een enkele nucleotide resolutie hebt over wat elk basenpaar is. Maar dat is hetzelfde als je appartementsnummer en je huisnummer kennen en eigenlijk alles weten. Maar om te beginnen, wil je misschien weten op welk continent het is, of in welk land het is.

En dus moet je eerst de mogelijke locaties voor een bepaald ziektegen verfijnen. En dat zal in eerste instantie inhouden dat wordt vastgesteld aan welk chromosoom en aan welk gebied van een chromosoom een ​​bepaald ziekte-allel is gekoppeld. En dat houdt in dat je in wezen een koppelingskaart maakt, waar je vaststelt waar een ziektegen zich bevindt op basis van zijn koppeling aan bekende markers die in het genoom aanwezig zijn.

Dit vereist dat u zich twee weken geleden herinnert, toen we spraken over koppeling en recombinatie. En je zult je herinneren dat we keken naar het verband tussen genen en vliegen en genen en gist. Een verschil tussen dat type koppelingsmapping en het in kaart brengen van menselijke koppelingen is dat we niet echt duidelijke eigenschappen hebben die worden gedefinieerd door afzonderlijke genen. Je kunt niet zomaar haarkleur nemen en het haarkleurgen in kaart brengen om het te koppelen aan een ziektegen. Omdat haarkleur wordt bepaald door vele, vele verschillende genen.

Dus bij fruitvliegen kun je witte ogen nemen en kijken of het verband houdt met gele lichaamskleur, omdat beide worden bepaald door enkele genen. We hebben dus iets anders nodig dan alleen fenotypische eigenschappen hebben die we kunnen volgen. We hebben zogenaamde moleculaire markers nodig om koppelingsmapping uit te voeren.

Dus wat we nodig hebben in deze moleculaire markers... nou, als we er eens over nadenken of we de koppeling tussen de A- en B-genen willen bepalen. En als je deze kruising zou doen, zou je dan in staat zijn om de koppeling te bepalen?

Georgia, je hebt een motie ingediend die correct was. Vertel het me. Waarom schudde je je hoofd nee?

PUBLIEK: Ze zouden allemaal heterozygoot zijn.

ADAM MARTIN: Ja, ze zouden allemaal heterozygoot zijn. Omdat dit individu hetzelfde allel op beide chromosomen heeft, kun je het ene chromosoom niet van het andere onderscheiden. Het punt dat ik wil maken, is dat om verbanden te zien, je variatie nodig hebt.

We hebben dus variatie nodig. En een andere term voor genetische variatie is polymorfisme. We hebben dus polymorfisme, of genetische variatie, nodig tussen deze moleculaire markers.

We hebben ook genetische variatie in de ziekte nodig. Maar dat hebben we. We hebben individuen die door een ziekte zijn getroffen en individuen die niet door een ziekte zijn getroffen. Dus daar hebben we variatie in allelen. Maar om het in kaart te brengen met een moleculaire marker, om koppeling aan een moleculaire marker in kaart te brengen, heb je ook hier variatie nodig. Dus het probleem met deze kruising is dat je heterozygoot moet hebben. Er moet variatie zijn in dit individu, waarbij beide allelen heterozygoot zijn.

Dus nu wil ik het hebben over enkele van deze moleculaire markers die we kunnen gebruiken, en hoe ze variëren tussen individuen en tussen chromosomen. Dit wordt misschien de kaart met de laagste resolutie. Maar ik heb het hier over deze koppelingskaart. En je kunt zien dat er onderaan verschillende soorten polymorfismen zijn die we kunnen gebruiken om een ​​bepaald ziekte-allel te koppelen aan een specifiek chromosoom en een specifieke plaats op het chromosoom.

Dus ik begin met de eerste, wat een eenvoudige herhaling van een reeks is. Het gaat onder vele namen. Maar ik blijf bij wat er op de dia staat.

Dus een eenvoudige reeksherhaling wordt ook wel een microsatelliet genoemd. Dus misschien zie je die term rondzweven, als je hierover leest. En wat een eenvoudige reeksherhaling is, zoals de naam al aangeeft, is een eenvoudige reeks. Het kan een dinucleotide zijn, zoals CA. En het is gewoon een dinucleotide dat steeds weer wordt herhaald.

Dus op een chromosoom heb je misschien een unieke reeks, die ik als een lijn zal tekenen. , En dan zou je een CA-dinucleotide kunnen hebben dat een aantal keren wordt herhaald, N. En dan wordt dat gevolgd door een andere unieke reeks. En dat is wat er in zit.

Dus dat zou een draad zijn. En dan heb je in de tegenovergestelde streng een unieke reeks, het complement van CA, wat GT is, en dan, nogmaals, een unieke reeks. En dus is er variatie in het aantal herhalingen van de CA. En dus is er polymorfisme. We kunnen dit dus gebruiken om een ​​verband vast te stellen tussen deze marker en een fenotype, zoals een ziektefenotype.

Dus hoe zou je het aantal herhalingen kunnen detecteren dat hier aanwezig is? Heeft iemand een idee van een tool die we hebben besproken en die hier kan worden gebruikt? Dus een hint die ik je gaf is dat de volgorde hier uniek is en de volgorde hier uniek. Dus is er een manier waarop we die unieke reeks kunnen gebruiken om te bepalen of er een verschil is in het aantal herhalingen?

Wat is een techniek die we hebben besproken waarbij een onderdeel van de techniek een unieke reeks herkent? Ja, Natalie?

ADAM MARTIN: Nou, CRISPR Cas9 is een mogelijkheid. Jeremy, heb je een idee?

ADAM MARTIN: PCR-- dus het is waar. Je zou het kunnen laten herkennen. Maar dan moet je het op de een of andere manier detecteren. Dus wat vaker wordt gebruikt, is PCR. Dat zijn allebei goede ideeën. Maar met PCR zou je hier een primer kunnen ontwerpen en hier een primer. En je zou deze herhalingsreeks kunnen versterken. En het aantal herhalingen zou de grootte van je PCR-fragment bepalen.

Dus als je PCR zou doen, dan zou je een PCR-fragment krijgen dat de primers aan elk uiteinde heeft, maar dan een bepaalde grootte heeft op basis van het aantal herhalingen. Dus dan hebben we een soort gereedschap nodig waarmee we de grootte van een bepaald DNA-fragment kunnen bepalen. En dus ga ik je zo'n hulpmiddel voorstellen, namelijk gelelektroforese.

En gelelektroforese houdt in dat je DNA neemt dat je hebt gegenereerd, door PCR of door DNA te knippen met een restrictie-enzym, en het in een gel te laden die agarose bevat. Misschien is het samengesteld uit agarose. Het zou kunnen zijn samengesteld uit polyacrylamide. En omdat DNA negatief geladen is, de ruggengraat, als je er een stroom doorheen laat lopen, zoals de positieve elektrode aan de onderkant, dan gaat het DNA door deze gel slingeren.

Nu zullen we een snelle demonstratie geven, als jullie twee zouden kunnen komen. Ik heb één vrijwilliger nodig. Ori, zoek 10 van je vrienden en schakel ze uit. Okee. Dat is waarschijnlijk goed. Ja.

Oké, Hannah, waarom gaan jullie niet... jullie moeten verbinding maken, oké? Blijf hier. We beginnen bij dit einde. Dit is de negatieve elektrode hier. De positieve elektrode zal daar beneden zijn. En Jackie wordt onze enige nucleotide. Jullie linken als... ja. Je hoeft niet te doen-si-do, of iets dergelijks.

Okee. Wat ik wil dat jullie doen, is dat jullie door deze kegels slalommen alsof het allemaal agarosegel is. Zodat je naar de andere kant gaat. En ik ga nu de stroom aanzetten. Dus ga. Oké, stop.

Okee. Zie hoe het kortere DNA-fragment gemakkelijker door de kegels kan navigeren en verder kan komen. Het was dus wat gesjoemeld. Weet ik. Maar ik had gewoon een manier nodig om ervoor te zorgen dat je altijd onthoudt dat het kortere nucleotide, of het kortere fragment, sneller gaat migreren.

Jullie kunnen terug naar boven. Hartelijk dank voor uw deelname. Laten we ze een applaus geven.

Okee. Dus wat je net zag, is dat de langere DNA-fragmenten meer worden geremd door door de gel te bewegen. En dus gaan ze langzamer bewegen en dus niet zo ver in de gel. Terwijl de kleine fragmenten veel sneller zullen bewegen omdat ze veel sneller door deze gel kunnen manoeuvreren. Er zal dus een omgekeerde evenredigheid zijn tussen de grootte van de DNA-keten en zijn bewegingssnelheid. Je zult het kortere DNA-fragment altijd sneller zien bewegen.

Dus hoe een van deze gels er in werkelijkheid uitziet, wordt hier getoond. Dit is dus een DNA-gel van agarose. En er is DNA getest in deze verschillende monsters. En wat je ziet is dat deze gel vervolgens wordt gekleurd met een kleurstof, zoals ethidiumbromide, waardoor je de individuele DNA-fragmenten kunt visualiseren. En dus geeft een band op deze gel een hele hoop DNA-fragmenten aan die allemaal ongeveer even lang zijn. Dus in wezen kun je de DNA-lengte meten met behulp van deze techniek.

Wat hier aan het einde van de gel is, dit is waarschijnlijk een soort DNA-ladder, waar je DNA-fragmenten van bekende lengte hebt die je kunt gebruiken om de lengte van deze banden hier te kalibreren. Dus zo meet je de DNA-lengte. En we gaan het keer op keer gebruiken, als we het hebben over DNA en sequentiebepaling.

Laten we nu eens nadenken over hoe dit ons gaat helpen om een ​​verband te leggen tussen een bepaalde marker in het genoom en een genetische ziekte. Dus als we nadenken over deze microsatelliet-herhalingen, zei ik je dat ze polymorf zijn. Ze vertonen veel variatie in grootte. Hier is een voorbeeld van een vrouw die twee microsatellieten van gemiddelde grootte heeft. Als je hiernaar kijkt -- als je PCR hebt gedaan en de grootte hiervan hebt gemeten, krijg je twee verschillende banden omdat er hier twee verschillende allelen van verschillende lengte zijn.

Je kunt dus zien dat deze persoon twee herhalingen van gemiddelde lengte heeft. En deze persoon heeft kinderen gehad met een persoon die een korte en een lange microsatelliet heeft. En dat zie je hier op de gel.

Nu is dit vrouwtje aangetast door een ziekte. En deze twee personen hebben kinderen. En je ziet dat een aantal van die kinderen door de ziekte is getroffen. Dus op welke wijze van overerving ziet dit eruit? Als u de keuze had tussen autosomaal recessief, autosomaal dominant, geslachtsgebonden dominant en geslachtsgebonden recessief, hoe ziet dit er dan uit? Ach, Carmen.

PUBLIEK: Autosomaal recessief.

ADAM MARTIN: Autosomaal recessief? Waarom ga je voor recessief? Ja ga je gang.

PUBLIEK: Omdat er een man is die getroffen is. Maar niet beide ouders zijn getroffen. Het lijkt er dus op dat de vader heterozygoot is en de moeder homozygoot recessief.

ADAM MARTIN: Dat is mogelijk. Dat is precies de logica die ik wil zien. Is er een andere mogelijkheid? Ja, Jeremia.

PUBLIEK: Autosomaal dominant.

ADAM MARTIN: Het kan ook autosomaal dominant zijn. Dus je hebt gelijk. Je hebt gelijk. Als dit geen zeldzame ziekte was, zou die man drager kunnen zijn en het aan de helft van de kinderen kunnen doorgeven. Dus dat is goed. Je hebt in wezen meer informatie nodig om onderscheid te maken tussen autosomaal recessief en autosomaal dominant.

Voor dit doel gaan we voor autosomaal dominant. En wat je ziet, is dat je naar de getroffen individuen wilt kijken en wilt zien of het fenotype van de ziekte is gekoppeld of verbonden met een van deze microsatelliet-allelen. Dus als we kijken naar... we hebben eigenlijk PCR-DNA van al deze individuen. En als je kijkt naar wie er last van heeft, elk van de individuen heeft deze M dubbele prime-band. En geen van de onaangetaste individuen heeft het.

Het is dus duidelijk dat het beter zou zijn om meer stambomen en meer gegevens te hebben om de significantie tussen deze koppeling echt vast te stellen. But this is just a simple example, showing what you could possibly see if you have one of these molecular markers linked to a particular disease allele. So that kind of establishes the principle.

Now let's think about what are some other molecular markers that are possible? So another type of marker, and this is one that's the most common one, if I go here. So here, you see here's is a linkage map, here. And you see most of these bands are green. And the green markers, here, are what are known as Single Nucleotide Polymorphisms, or SNPs.

So single nucleotide polymorphisms-- and this is abbreviated SNP. And what a single nucleotide polymorphism is, is it's a variation of a nucleotide at a single position in the genome. So it's just a one base pair difference at a position. So there's variation of single nucleotide at a given position, at a position in the genome. And because that's a pretty general definition, there are tons of these in the genome.

Now one thing to think about is you could have a mutation in an individual that creates a SNP. So you could have a de novo formation of a SNP. But if you have a SNP and it gets incorporated to the gametes of an individual, then that variant is going to be passed on to the next generation. So this is something that could occur de novo. But it is also heritable. And if it's heritable, then you can follow it and use it to determine if a given variant is linked to a given phenotype, like a disease.

So to identify a single nucleotide polymorphism, it's helpful to be able to sequence the DNA. And I'll talk about how we could do that in just a minute. But before I go on, I just want to point out a subclass of SNPs that can be visualized without sequencing. And these are called restriction fragment length polymorphisms.

So restriction fragment-- so it's going to involve some type of restriction enzyme digest length polymorphism. It's a long word. But it's abbreviated RFLP. And what this is, is it's a variation of a single nucleotide. But this is a subclass of SNP. Because this is when the variation occurs in a restriction site for a restriction enzyme.

So if you remember your good friend EcoR1, EcoR1 recognizes the nucleotide sequence GAATTC. And EcoR1 only cleaves DNA sequence that has GAATTC. So if there was a single nucleotide variation in the sequence, such that it's now GATTTC, or something like that, that destroys the EcoR1 site. And so EcoR1 will no longer be able to recognize this site in the genome and cut it.

So you could imagine that if you had one individual in the genome having three EcoR1 sites, if you digest this region, you'd get two fragments. But if you destroyed the one in the middle, then if you digested this piece of DNA, then you'd only get one fragment. And that's something. Because it results in different sizes of fragments, that's something you can see just by doing DNA electrophoresis. And maybe you would use some method to detect this specific region, so that you're not looking at all the DNA in the genome, but you're establishing linkage to this specific area.

You could use PCR. You can have PCR primers here and here. And you could then cut with EcoR1. In one case, you'd get two fragments. In this case, you'd get two fragments. In this case, if you amplified this region of the genome and cut with EcoR1, you'd only get one fragment. So you'd be able to differentiate between those possibilities.

AUDIENCE: When you use PCR, are there [INAUDIBLE]?

AUDIENCE: Are there [INAUDIBLE]?

ADAM MARTIN: Oh. You're saying what causes it to stop? That's a great question, Malik. Ja.

So initially, it's not going to stop. That's absolutely right. But because every step, each time you replicate, it's then primed with another primer. So you'd replicate something like this that's too long. But then the reverse primer would replicate like this. And it would stop.

So if you go back to my slide from last lecture, look through that and see if it makes sense how it's ending. Because if you do this 30 times, you really will enrich for a fragment that stops and ends at the two primers, or begins and ends at the two primers, I should say. Goede vraag. Bedankt.

Okee. Now, let's talk about DNA sequencing. Because as I showed you, obviously, these SNPs, because there are so many of them, are probably the most useful of these markers to narrow in on where your disease gene is. And to detect a SNP, we need to be able to sequence DNA.

So I'm going to start with an older method for DNA sequencing, which conceptually, is very similar to how we do DNA sequencing today. And so it will illustrate my point. And then at the end, I'll talk about more modern techniques to sequencing.

So the technique I'm going to introduce to you is called Sanger sequencing. And that's because it was identified by an individual named Fred Sanger. And I'm going to just take a very simple DNA sequence, in order to illustrate how Sanger sequencing works.

So let's take a sequence that's really simple. This is very, very simple, and then more sequence here. So let's say we want to determine the nucleotide that's at every position of this DNA fragment. So one way we could maybe conceptually think about doing this, is to try to let DNA polymerase tell us where given nucleotides are. And if we're going to use DNA polymerase, what are we going to need, in order to facilitate this process? Yes, Rachel.

ADAM MARTIN: You're going to need nucleotides, definitely. So we're going to need nucleotides. Wat nog meer? To start, what are you going to need? Miles?

ADAM MARTIN: You're going to need a primer, exactly. Goed gedaan. So you need a primer. So here's a primer.

And now, we're going to try to get DNA polymerase to tell us whenever there is a given nucleotide in this DNA sequence. And so think with me. Let's say we were able to get DNA polymerase to stop whenever there was a certain nucleotide.

So if we go through just a couple nucleotides, let's say, at first, we want DNA polymerase to stop whenever there's an A. So let's say there was a possibility it would stop at this A. If it's stopped at this A, you'd generate a fragment of this length. But if it read on through that A, there's another possibility that it would stop at this A.

So we're kind of looking at when these are stopping. And the final possibility is it goes on and stops at this A. So if this DNA polymerase stopped only at As, you'd get fragments that are these three discrete lengths.

Now let's consider another possibility. So pink here is stop at A. And in blue, I'm going to draw what would happen if it stopped at T. So they all start from the same place. If it stopped at T, it would just stop one nucleotide beyond this A in this simple sequence. So in blue here, this is stop at T.

But if it's just a possibility, it stops. And some of the polymerases could go beyond this T and go to the next T and stop here. And again, this would be one nucleotide length longer than this pink one, here. And the final one would-- I'll just draw it down here-- would get out to this last T, here.

So what you see is if we could get DNA polymerase to stop at these discrete positions, we'd get a different sized fragments, whether it was stopping at one nucleotide versus the other nucleotide. You all see how this is resulting in different fragment lengths. Yes, Andrew.

AUDIENCE: How would you create a pattern [INAUDIBLE]?

ADAM MARTIN: There are companies now. You can basically take nucleotides and synthesize these primers chemically, not using DNA polymerase.

AUDIENCE: I'm saying how would you know what primer to use, if you don't know the sequence?

ADAM MARTIN: Oh, in this case, you'd have to start with some sequence that you know. So in most sequencing technologies, you kind of make a DNA library, where you know the sequence of the vector. And then you'd use the vector sequence as a primer to sequence into the unknown sequence. Grote vraag. Goed gedaan.

Okee. So what we need now then is some sort of tool or ability to stop DNA polymerase when there's a certain nucleotide base. And to do that, we can use this type of molecule, here, which is known as a dideoxynucleotide. Remember, for DNA polymerase to elongate a chain, it requires that the last base have a three prime hydroxyl.

And so what this dideoxynucleoside triphosphate is, is it's a nucleoside triphosphate that lacks a three prime hydroxyl. Here, I'll highlight that.

So you see this guy? You see it bolt the highlight H? There's a hydrogen there on the three prime carbon, rather than the normal hydroxyl group. So if this base gets incorporated into a elongating chain, DNA polymerase is not going to be able to move on.

So this method where you can add a certain dideoxynucleoside triphosphate to stop chain elongation is known as a chain termination method. So you're getting chain termination. And you're getting this chain termination with a specific dideoxynucleoside triphosphate. So these dideoxynucleotide triphosphates, if they get incorporated into the DNA, are going to halt the synthesis of that DNA strand.

So if we take our example, here, this might be a reaction that has dideoxythymidine triphosphate. So if we had dideoxythymidine triphosphate in this sample and it's elongating, then when the polymerase reaches this point, there's a possibility that it will incorporate the dideoxynucleoside triphosphate. And if this is a dideoxynucleoside triphosphate, then there won't be a three prime hydroxyl.

And DNA polymerase will just be like, oh, I can't go on! Because it's not going to have a three prime hydroxyl. So it's not going to be able to continue with the next nucleotide. So this is known as chain termination.

So let me take you through an example, here. Okee. So here's an example that you have a slide of. And again, there's a template strand, which is the top strand. And this method requires that you have a primer. And what's often done is you label the primer.

So the first step is you have to denature your DNA. So you have to go from double stranded DNA to a single stranded DNA. And then you mix the double stranded DNA with first, this labeled primer, such that the primer can then yield to the single stranded DNA. You need DNA polymerase, as I've mentioned. And as, I believe, Rachel mentioned before, you need the building blocks of DNA. So you need the four dideoxynucleoside triphosphates.

So you always have the four dideoxynucleotide triphosphates. But what's special here is you're going to spike several reactions with one of the dideoxynucleoside triphosphates. So you spike the reaction with a tiny amount of one of your dideoxynucleoside triphosphates.

So let's say you have a reaction, here. And this this one here has dideoxyadenosine triphosphate. Then polymerase will along get this strand until there's a thymidine on the template. And then there's a possibility that it will incorporate this dideoxy NTP. And if it does, then you get chain termination. And you get a fragment of this length.

But the other possibility, because there is still the deoxy form of the NTP present, it's possible that it incorporates a deoxyadenosine triphosphate there. And keeps going, and then incorporates a dideoxy ATP later on, where you have another T. And so the polymerase will essentially randomly stop at these different thymidine residues, depending on whether or not a dideoxynucleoside triphosphate is incorporated. And that means for a given reaction, one in which you have dideoxy ATP, you get a certain pattern of bands that represent the length of fragments, where you have, in this case, a thymidine base.

And then you do this for all four bases, where you have four reactions, each with a different base that's dideoxy. So when you're adding these, you're going to do four reactions, one with dideoxy ATP spiked in, one with dideoxy TTP, one with dideoxy CTP, and the last with dideoxy GTP. And because these nucleotides are present in different positions along the sequence, you're going to get distinct banding pattern for each of these reactions. But using that banding pattern, you can then read off the sequence of DNA that's present on the template strand.

So this is how sequencing was done for many, many years. These days, it's been made cheaper and faster. And now what's often used is next generation sequencing. And one the pain in the ass about sequencing before is you'd use a lot of radioactivity. Your primer would be radioactive, so that you could detect these bands. Right now, everything's done using fluorescence, which makes it much nicer, I think.

And so in next generation sequencing, your template DNA is attached to a solid substrate, such that it's immobilized on some type of substrate. And then you add each of the four nucleoside triphosphates. In this case, they're labeled with a dye, such that each one is a different color. But the dye also functions to prevent elongation, such that, again, it's this chain termination. When you incorporate one of these, the polymerase just can't run along the DNA. It incorporates one and then stops.

So if you get your first nucleotide incorporated, it will incorporate one of these four. And it will be fluorescent at a certain wavelength, which you can see using a device or microscope. And then what you then do is chemically modify this base, such that you remove the dye and allow it to extend one more base pair. And so you go one nucleotide at a time. And you read out the pattern of fluorescence that appears. And that gives you the sequence of DNA on this molecule that's stuck to your substrate.

And you can do this in parallel. You can have tons, many different strands of DNA. And you can be reading out the sequence of each one of these strands in parallel.

Super goed. Any questions about DNA sequencing? OKE. Very good. I will see you on Monday. Have a great weekend.


PCR (polymerase chain reaction)

Let's say you have a biological sample with trace amounts of DNA in it. You want to work with the DNA, perhaps characterize it by sequencing, but there isn't much to work with. This is where PCR comes in. PCR is the amplification of a small amount of DNA into a larger amount. It is quick, easy, and automated. Larger amounts of DNA mean more accurate and reliable results for your later techniques.

PCR can be used to create a DNA "fingerprint," which is unique to each individual. These DNA fingerprints can be useful in real-world applications relating to paternity/maternity, kinship, and forensic testing.

The technique was developed by Nobel laureate biochemist Kary Mullis in 1984 and is based on the discovery of the biological activity at high temperatures of DNA polymerases found in thermophiles (bacteria that live in hot springs).

Most DNA polymerases (enzymes that make new DNA) work only at low temperatures. But at low temperatures DNA is tightly coiled, so the polymerases don't stand much of a chance of getting at most parts of the molecules.

But these thermophile DNA polymerases work at 100C, a temperature at which DNA is denatured (in linear form). This thermophilic DNA polymerase is called Taq polymerase, named after thermus aquaticus, the bacteria it is derived from.

Taq polymerase, however, has no proofreading ability. Other thermally stable polymerases, such as Vent and Pfu, have been discovered to both work for PCR and to proofread.

You'll need four things to perform PCR on a sample:

1. The target sample. This is the biological sample you want to amplify DNA from.

2. A primer. Short strands of DNA that adhere to the target segment. They identify the portion of DNA to be multiplied and provide a starting place for replication.

3. Taq polymerase. This is the enzyme that is in charge of replicating DNA. This is the polymerase part of the name polymerase chain reaction.

4. Nucleotides. You'll need to add nucleotides (dNTPs) so the DNA polymerase has building blocks to work with.

There are three major steps to PCR and they are repeated over and over again, usually 25 to 75 times. This is where the automation is most appreciated.

1. Your target sample is heated. This denatures the DNA, unwinding it and breaking the bonds that hold together the two strands of the DNA molecule, leaving you with single stranded DNA (ssDNA).

2. Temperature is reduced and the primer is added. The primer molecules now have the opportunity to bind (anneal) to the pieces of ssDNA. This labels the portions of DNA to be amplified and provides a starting place for replication.

3. New pieces of ssDNA are made. Taq polymerase catalyzes the generation of new pieces of ssDNA that are complimentary to the portions marked by the primers. The job of Taq polymerase is to move along the strand of DNA and use it as a template for assembling a new strand that is complimentary to the template. This is the chain reaction in the name polymerase chain reaction.

PCR is so efficient because it multiplies the DNA exponentially for each of the 25 to 75 cycles. A cycle takes only a minute or so and each new segment of DNA that is made can serve as a template for new ones.

Perhaps the most important thing to remember is to be very aware of contamination. If, for example, you unknowingly slough off a piece of skin into your sample, then jouw DNA may be amplified in the PCR reaction. Here are some other factors to optimize your results with PCR:

1. Annealing temperature. Starts at the low end of what you think will work, then move up as necessary. If the temperature is too low, the primers will make more mistakes and you'll get too many bands when you run your sample on a gel. If the temperature is too high you will get no results and your gel will be blank. You want to be about 3C to 5C below the melting temperature (Tm). A rough formula for determining Tm is Tm=4(G + C) + 2(A + T).

2. Magnesium concentration. You want your Mg2+ concentration to be about 1.5mM to 3mM. If you go too high, the polymerase will make more mistakes.

3. Think carefully about primer design. Both primers should have approximately the same Tm so they both anneal at the same temperature. Two out of three bases on the 3' end should be G or C to get good hybridization (G and C have three H-bonds so you get better polymerization). Lastly, avoid primer dimers, which occur when the primers have ends that will anneal to each other. This will produce NO product.

4. More is not necessarily better. More polymerase produces more nonspecific product, so don't just carelessly dump in a bunch of polymerase. Additionally, PCR reactions don't work if there is too much DNA.

Taq polymerase does not work on RNA samples, so PCR cannot be used to directly amplify RNA molecules. The incorporation of the enzyme reverse transcriptase (RT), however, can be combined with traditional PCR to allow for the amplification of RNA molecules. After you add your RNA sample to the PCR machine, add a DNA primer as usual and allow it to anneal to your target molecule. Then add RT along with dNTPs, which will elongate the DNA primer and make a cDNA copy of the RNA molecules and run the PRC reaction as usual. The product of RT-PCR is a double stranded DNA molecule analogous to the target segment of the RNA molecule.


Why do we use PCR?

Hi all, i am a new student in biology currently in highschool. I am just wondering, what would occur if gel electrophoresis is ran with the culture mix without using PCR, will we still observe DNA bands or not? My current understanding is that pcr is utilized to find a specific sequence in the DNA and amplify it in order to view it on the gel electrophoresis. If PCR is not used, will we see bands or will there not be enough DNA material to observe bands, or if bands ARE observed in absence of PCR, will there be many bands in different positions pertaining to DNA within the cell? Met dank!

PCR is a tool to amplify pieces of DNA or RNA. There might be many reasons you want to do a PCR. Een paar voorbeelden:

You want to amplify a gene so that you can clone it into a plasmid vector.

You want to measure how much of one gene is expressed versus another in a cell.

You want to check the sequence of a region of unknown DNA.

A gel is merely a tool that is used to check the quality and size of the DNA you obtain. The goal is always to amplify a sequence of nucleotides enough to be able to use it for some downstream molecular biology techniques such as cloning or to answer a biological question about the region you are amplifying. Sometimes answering the biological question might require you to run a gel but we don't think of the gel as the goal but rather a tool if that makes sense.

Thanks for your comment. Is it possible to run a dna extract from one cell on agarose without using pcr? Will we observe bands or is there insufficient amount for observations?

It is perfectly possible to run DNA from cells directly on a gel, but you would have to use lots of cells (to get enough DNA to see) and what you expect to see would be totally different. You would also have to use a slightly different electrophoresis setup. PCR specifically generates more of the short DNA sequence between the primers, generating a DNA fragment of a few hundred or thousand base pairs. DNA in cells (if they are mammalian) will be long linear chromosomes millions of base pairs long, or (if they are bacterial) circular chromosomes hundreds of thousands of base pairs long. To separate them on a gel you need to use a technique called pulsed field gel electrophoresis, and also need to be careful purifying the DNA not to shear the enormous DNA molecules.

I'm sorry but most of this is very wrong. You absolutely do extract DNA from samples (cells, tissue etc) and run it on a gel. That is the first check for visualising qualitatively how much DNA you have and the quality of it. Generally one high band means you have a lot of very good DNA (high band = high molecular weight DNA = not degraded into small pieces). When DNA is degraded you will see smearing on a gel (corresponding to lots of different sized fragments of DNA).

PCR has many applications. It is used to amplify (make many copies) of a particular region of DNA. Usually you would do it to look at one particular gene. You run the PCR product on the gel to visualise that amplification has worked. You will not see the DNA that you amplified the PCR product from on the gel because you do not use much in the PCR reaction, and the PCR product is amplified to a concentration much higher than the template DNA.


Ingredients in a PCR mixture – What every component does

In general, a PCR tube will contain the following items:

Water: oplosmiddel
dNTPs (or deoxynucleotide triphosphates): Single bases A, T, C, and G which are used by the polymerase while replicating the DNA. As the polymerase adds base pairs onto the new DNA strand, one base pair is used at a time.
MgCl2: An essential cofactor for the polymerase enzyme
Primers: Short segments of single-stranded DNA used to frame the DNA region that needs to be amplified. They are complementary to the template DNA strand only at defined locations around the target sequence.
Target DNA: The DNA “template” that you want to make copies of. This can be a full DNA chain or a part of a longer chain.
Taq Polymerase: An enzyme from Thermis aquaticus that uses dNTPs and replicates DNA starting from the 3′ end of a template strand towards the 5′ end. Taq is used in PCR specifically because it is resistant to the high temperatures used for separating DNA strands during Step 3a above .


Serology: Overview

Other Body Fluids

DNA profiling has been performed successfully on a wide range of body fluids and tissues for which there are no common tests. Examples include skin (including dandruff), perspiration, nasal mucus, pus, breast milk, and ear wax. For the most part, the biological origin in these cases is inferred from the appearance of the material or its location on the item tested, for example, perspiration from hat bands, nasal mucus on tissues, and so on. There is little call for specific tests to determine the cellular identity of these materials each, however, has a characteristic biochemistry that could be exploited to develop an identification test should it be necessitated.


Sequencing Strategies Developed in the Human Genome Project

The public sector of the human genome project was a consortium of laboratories around the world located largely in the USA, England, France, and Japan. Using the physical-genetic map, the various labs were each assigned a specific set of overlapping BAC clones to sequence in a methodical clone-by-clone highly ordered strategy. Multiple locations on chromosomes were being sequenced at the same time, each initiated by a single BAC called a seed clone. Despite this technology, there are still regions of the human genome which remain unsequenced due to their highly repetitive and variable nature. These regions are so large that they cannot be bridged by a BAC clone.

Each BAC clone selected for genome sequencing became the chief substrate for DNA sequencing. This was accomplished by the physical shearing of the 100 to 300 kb BAC clone, followed by end-repair of the fragments, and cloning into a small-insert plasmid sequencing vector. The BAC sub-clones are then production sequenced en masse until about an 8- to 10-fold redundant coverage of the original BAC clone has been achieved. Following assembly of the production sequence reads, in most cases there remain gaps in the sequence that need to be closed in a process called “finishing” or “gap closure.” Gap closure often requires the use of a variety of techniques and chemistries and typically costs as much or more than the original production sequencing operation. In cases where a gap could not be closed with actual DNA sequence, it was often bridged with paired reads from both sides of the gap with a large DNA clone of known size.

This whole process of methodical genome sequencing is quite involved, time consuming, and expensive. As a result, government DNA sequencing funding strategies were changed after the human genome and several model genomes were completed.


What kind of feedback have you gotten from the users of your product?

We have received very positive feedback from users of our sample products. Many of the companies and research institutions who we met at partnering conferences showed interest in testing our technology, which is very encouraging to us as a start-up company.

Some potential customers seek to use our technology on a large-scale basis in terms of the quantity of amplified DNA, but our current scale is not yet large enough to meet their requests. We have a plan to scale up both our reagent manufacturing capabilities and the amplified DNA quantities.


Why do cloning before sequencing - (May/08/2006 )

i am new in this field and never done microbiology. and now i am searching protocol for sequencing microorganism. but i wonder why it need to CLONE the PCR product before sequencing but not do sequencing immediately after PCR just like doing that in human sample?

in my lab it was mainly a cost issue, with sequencing costing more money than simply cloning and selecting recombinant, which you only sequence when you are sure you have the clone.

also sequencing after you have the clone means you know what sequence is in you plasmid and what is going to be expressed and that no errors have occured or sequence lost during possible restriction digestion (multiple RE sites)

i am new in this field and never done microbiology. and now i am searching protocol for sequencing microorganism. but i wonder why it need to CLONE the PCR product before sequencing but not do sequencing immediately after PCR just like doing that in human sample?

Well, I don't think it has got to do with the kind of tissue sample.
I was told that the sequencing quality is better when you use plasmids as matrices for the sequencing instead of raw pcr-products. Maybe the DNA-polymerase isn't so easy to fall off from a plasmid?!?

I think the long and short of it is that if you sequence from a PCR product, you will lose the first

50-75 bp. I am can't remember why, but I think it has to do with primer artifacts and unincorporated dye terminators shielding small products. If you sequence from a vector, your primer binding site is located outside the PCR product, so you should get the entire PCR product sequence. Also, vector primers are tried and true. Sometimes, primers you use to amplify PCR products make lousy sequencing primers.

does it means that it is not necessary to do cloning before sequencing? as the problem of missing first 50-70bp can be solved by doing both the forward and reverse primer for sequencing .

our lab usually done human DNA and we do sequencing directly after PCR (of course after purification step) . but we haven't done microorganisms. has anyone ever do sequencing directly after PCR in microorganism??

I've been doing Genome Walking with parasite DNA and sequencing the PCR products straight forward (after purifying the band grom gel). It works jus fine provided that you have a amount enough of the product you want to sequence. I have only cloned when the fragment I want to sequence is not easily seen in the gel.

I have no problem sequencing PCR products.

In fact, a case can be made that sequencing PCR products directly is beter than sequencing a cloned PCR product, because when you clone a fragment out of the population of PCR products, you may have selected one with an basepair incorporation error, and thus when you sequence this plasmid, you will get back the error (all the plasmid clones will have the error).

But, when you sequence a population of PCR products directly, the product that has an incorrect base in any given position is likely vastly outnumbered by products that have that particular base correct -- thus the sequence called from this population will be correct.

Working on HIV, we do sequence directly from PCR product which works very fine most of the time, we use forward and reverse primers so we get all we need.

But: when we get unclear signal on the electropherogram, due to insertions/deletions (frequently occuring in HIV genome at certain positions) we need to clone and sequence enough clones to account for what we saw on the original electropherogram.

Problem with cloning is: if you have a certain mutation that you would miss with population sequencing (as we call it for direct sequencing of PCR product), it's hard to tell if this mutation is a PCR artefact (no polymerase is error-free!) or indeed a mutation in the original template. And another question raised with cloning is just how much clones would you have to sequence?

so: depending on your needs: do PCR sequencing of cloning.

I seem to recall reading somewhere that three clones (plucked from three seperate PCR reactions) whose sequence all agree was considered required.


Bekijk de video: Los genes, la evolución y nosotros: Alberto Kornblihtt at TEDxBuenosAires (Januari- 2022).