Informatie

Kunnen we spikes maken met een ander enzym dan een SYBR Green Master Mix?


Ik volgde het standaard SYBR Green Protocol voor het doen van een qPCR. Waarvoor ik gebruikte

  • 10 µL van 1X SYBR Green Master Mix
  • Forward Primer en Reverse Primer (elk met een eindconcentratie = 8,5 uM)
  • Sjabloon (onbekende concentratie van een aptamer-selectie)
  • Gemaakt tot 20 uL met water.

De PCR-amplificatie uitgevoerd met behulp van

  1. 95 C Initiële denaturatie
  2. 95, 68, 72 - 35 keer gefietst.

Maar één set monsters uit mijn aptamer-selectie (waarschijnlijk hoog GC-gehalte) werd niet versterkt helemaal niet. Ik heb ook een agarosegel gecontroleerd.

Belangrijke aantekeningen:

  1. Mijn primer conc. is opzettelijk hoog - ik heb altijd versterkt met dergelijke concentraties en het werkt perfect met Vent Polymerase.

  2. Mijn gloeitemperatuur is ook hoog bij 68 C omdat mijn aptamersequenties de neiging hebben GC Rich te zijn.

  3. Met Vent-polymerase is mijn amplificatie erg sterk

Toen ik aantekeningen van leveranciers las, ontdekte ik dat de polymerase in de mastermix een variant van Taq Polymerase [1][3] is (varieert van leverancier tot leverancier) en het is ook bekend dat het GC Rich Sequences [2] slecht versterkt.

  1. https://www.thermofiser.com/order/catalog/product/4309155

  2. https://www.thermofiser.com/order/catalog/product/N8080241

  3. https://www.fishersci.co.uk/shop/products/powerup-sybr-green-master-mix/15366158

Daarom wilde ik een suggestie van iedereen die met aptamers werkt, of als je ervaring hebt met het werken met GC-rijke sequenties, over hoe ik mijn sequenties zou kunnen versterken.

Ik zou het zeer op prijs stellen als ik voor volgende week een antwoord zou kunnen hebben.

Heel erg bedankt voor je hulp!!!


PowerUp SYBR Green Master Mix

Introductie van PowerTrack SYBR Green Master Mix met een tweekleurig kleurvolgsysteem dat helpt om pipetteerfouten te verminderen.

PowerUp SYBR Green Master Mix bevat gepatenteerde Dual-Lock Taq DNA-polymerase-enzym, dat een combinatie van twee hot-start-mechanismen gebruikt om de activiteit ervan te regelen. Zorgen voor strakke controle over Taq activering, helpt deze dubbele hot-startbenadering ongewenste vroege activiteit van het polymerase bij lage temperaturen te voorkomen, wat kan leiden tot niet-specifieke amplificatie. Formulering van de Dual-Lock Taq in een handige 2X pre-mix met een geoptimaliseerd buffersysteem, gepatenteerde additieven en reinigingsmiddelen, verbetert de specificiteit van PowerUp SYBR Green Master Mix verder.

Bij een evaluatie van 24 verschillende primersets met PowerUp SYBR Green Master Mix werd een enkele smeltcurve verkregen in 100% van de reacties zonder de noodzaak van primeroptimalisatie of herontwerp. Daarentegen werd niet-specifieke amplificatie gezien voor sommige van dezelfde doelen in mengsels van verschillende concurrenten, zoals blijkt uit meerdere pieken in de smeltcurve (Figuur 1). Validatie van specificiteit in SYBR-reacties is essentieel voor gegevenskwaliteit en validiteit (Bustin et al 2009). De hoge specificiteit van de PowerUp SYBR Green Master Mix stelt u in staat minder tijd en geld te besteden aan het optimaliseren en opnieuw ontwerpen van primers om hoogwaardige gegevens te verkrijgen.

Reproduceerbaarheid is een andere belangrijke maatstaf voor de gegevenskwaliteit in realtime PCR-reacties, en reproduceerbaarheid neemt vaak af bij een lage sjabloonconcentratie waar de effecten van variabiliteit worden verergerd. Echter, PowerUp SYBR Green Master Mix, met zijn dubbele hot-start Taq DNA-polymerase, vertoont uitstekende reproduceerbaarheid over een breed dynamisch bereik voor een verscheidenheid aan geteste doelen (Figuur 2). Een strakkere reproduceerbaarheid zorgt voor een grotere betekenis bij het analyseren van laag-overvloedige transcripten en kleinere vouwveranderingen.


Productvergelijking

Hogere versterkingsefficiëntie en sterker fluorescentiesignaal

Met behulp van dezelfde cDNA-template en primers om GAPDH te amplificeren, werd Bimake 2x SYBR Green QPCR Master Mix sneller geamplificeerd met een sterker fluorescentiesignaal en een betere amplificatie-efficiëntie dan andere merken.

Nauwkeurige kwantificering en hoge stabiliteit

Met behulp van dezelfde cDNA-template en primers om RPL37 te amplificeren, toont Bimake 2x SYBR Green QPCR Master Mix nauwkeurige kwantificering met hoge stabiliteit.

Hogere specificiteit en gevoeligheid

Het niet versterken van low-copy targets kan te wijten zijn aan een gebrek aan gevoeligheid en/of specificiteit. Bimake 2x SYBR Green QPCR Master Mix maakt gebruik van een nieuw type hot-start enzym dat niet-specifieke amplificatie bij lage temperatuur vermindert, waardoor de amplificatie van low-copy genen wordt verbeterd.


Amerika

De site wordt in het Engels weergegeven.

We gebruiken deze cookies om ervoor te zorgen dat onze site veilig en naar behoren functioneert. Ze zijn noodzakelijk om onze diensten te laten functioneren en kunnen niet worden uitgeschakeld in onze systemen. Ze worden meestal alleen ingesteld naar aanleiding van acties van u die neerkomen op een verzoek om diensten, zoals inloggen, het gebruik van een winkelwagen of het invullen van formulieren. U kunt uw browser zo instellen dat deze cookies blokkeert of u voor deze cookies waarschuwt, maar sommige delen van onze diensten werken niet zonder deze. Net als de andere cookies die we gebruiken, kunnen strikt noodzakelijke cookies first-party cookies of third-party cookies zijn.

We gebruiken deze cookies om uw instellingen en voorkeuren te onthouden. We kunnen deze cookies bijvoorbeeld gebruiken om uw taalvoorkeuren te onthouden.
Voorkeurscookies toestaan

We gebruiken deze cookies om informatie te verzamelen over hoe u met onze diensten omgaat en om ons te helpen deze te meten en te verbeteren. We kunnen deze cookies bijvoorbeeld gebruiken om te bepalen of u interactie heeft gehad met een bepaalde pagina.
Prestatie-/statistiekcookies toestaan

Wij en onze advertentiepartners gebruiken deze cookies om advertenties te leveren, ze relevanter en betekenisvoller voor u te maken, en om de efficiëntie van onze advertentiecampagnes bij te houden, zowel op onze diensten als op andere websites en sociale media.
Marketingcookies toestaan


Wat is SYBR Groen?

SYBR Green is een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om nucleïnezuren te kleuren, met name dubbelstrengs DNA in de moleculaire biologie. De SYBR Green-methode wordt gebruikt om PCR-producten te kwantificeren tijdens de realtime PCR. Zodra het zich bindt met DNA, absorbeert het resulterende DNA-kleurstofcomplex blauw licht en straalt het intens groen licht uit. Het gebeurt vanwege de structurele verandering die optreedt in het kleurstofmolecuul bij binding met dubbelstrengs DNA. Wanneer PCR meer en meer DNA creëert, binden meer kleurstofmoleculen zich aan het DNA, waardoor er meer fluorescentie ontstaat. Daarom neemt de fluorescentie toe met de accumulatie van het PCR-product. Daarom kan de hoeveelheid PCR-product kwantitatief worden gemeten door de SYBR Green-fluorescentiedetectie.

SYBR groene kleurstof kan ook worden gebruikt voor DNA-labeling in cytometrie en fluorescentiemicroscopie. Ethidiumbromide is met succes vervangen door SYBR Green aangezien Ethidiumbromide een kankerverwekkende kleurstof is met verwijderingsproblemen tijdens DNA-visualisatie in de gelelektroforese.

Er zijn voor- en nadelen van de groene SYBR-methode. Deze methode is zeer gevoelig, goedkoop en gemakkelijk te gebruiken. Vanwege het vermogen om te binden aan elk dubbelstrengs DNA, kan niet-specifieke binding echter leiden tot overkwantificering van het PCR-product.

Figuur 01: SYBR Groene Techniek


Methoden:

Reagentia en verbruiksartikelen

QIAamp® MinElute virus-spinkit voor DNA-extractie, QIAprep® Spin Miniprep-kit voor plasmide-extractie en QIAquick® PCR-zuiveringskit werden verkregen van Qiagen, Duitsland. TA-kloneringskit dubbele promotor (pCRII) met One Shot TOP10F'-competente cellen en ampicilline werden verkregen van Invitrogen, San Diego, Californië. DNA Taq-polymerase, BamHI en EcoRI restrictie-enzymen werden verkregen van New England BioLabs, VS. SYBR®-Green PCR-mastermix, MicroAmp® snelle optische reactieplaten met 96 putjes (capaciteit van 0,1 ml) en MicroAmp® optische zelfklevende films voor realtime PCR-assay werden verkregen van Applied Biosystems, Fostercity, CA. Alle experimenten werden uitgevoerd op StepOnePlus®-Real Time PCR-systemen door Applied Biosystems, Fostercity, CA. Voor amplificatie van humaan torsie-tenovirus (TTV) werd een reeks primerparen die eerder zijn beschreven, gebruikt (Tabel 3). Primers werden gemaakt volgens de referentiestam van TTV-genoom TA 278 (Gen Bank acc. No. AB008394) en werden gesynthetiseerd door Microsynth (Zwitserland) op een schaal van 0,2 mol. DNA-ladders, MgCl2, dNTP's en buffers werden verkregen van Fermentas Life sciences, Duitsland.

Monsters en DNA-extractie

Bloedmonsters (5 ml) verzameld in EDTA-buisjes van 20 gezonde volwassen vrijwilligers en 30 willekeurig geselecteerde volwassen HSCT-ontvangers werden gedurende 10 minuten bij 900 g gecentrifugeerd om plasma te scheiden dat onmiddellijk werd ingevroren bij -20°C totdat het werd gebruikt voor DNA-extractie. Er werden twee onafhankelijke DNA-extracties uitgevoerd voor elk van de gezonde personen, samen met één onafhankelijke DNA-extractie voor HSCT-ontvangers, elk uit 200 μl plasma met behulp van de QIAamp MinElute Virus Spin-kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant. DNA werd geëlueerd in 30 L Milli-Q-water. Alle geëxtraheerde DNA-monsters werden tot de analyse bij -20°C bewaard. Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de instelling en monsters van gezonde donoren en HSCT-ontvangers werden gebruikt na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming.

Constructie van plasmiden voor de voorbereiding van standaarden

Een gebied van 119 bp PCR-fragment van TTV-genoom werd geamplificeerd met behulp van primers TTVf en TTVr (Tabel 3). Het resulterende amplicon werd gezuiverd met behulp van de QIAquick PCR Purification-kit, gekwantificeerd met een spectrofotometer en vervolgens gekloond in de TA-kloneringsvector. Het resulterende plasmide werd getransformeerd in One Shot TOP10F' competente cellen volgens de instructies van de fabrikant. Twaalf geïsoleerde kolonies van getransformeerde competente cellen uit vast luria-bertani-medium dat ampicilline (100 g / ml) bevat, werden onderworpen aan bevestiging van TTV-insert. Elke individuele kolonie werd afzonderlijk gesuspendeerd in 3 ml vloeibaar luria-bertani-medium dat 100 g/ml ampicilline bevatte voor een nacht in een schudincubator bij 37°C met een snelheid van 225 rpm. Na incubatie gedurende de nacht werd de zuivering van de plasmiden uitgevoerd met behulp van de QIA prep Spin Miniprep-kit volgens de instructies van de fabrikant. Restrictie-enzymvertering met EcoRI voor de gezuiverde plasmiden werd gedaan om de aanwezigheid van gekloneerd TTV-insert (119 bp) op 1,5% agarosegelelektroforese te bevestigen (gegevens niet getoond). Van TTV-insert (119 bp) gekloneerd in TA-vector werd de sequentie bepaald voor alle 12 afzonderlijke klonen met behulp van M-13 voorwaartse en achterwaartse primers en bevestigd door uitlijning met de TTV-sequentie (Gen Bank acc. nr. AB008394). Dit plasmide met TTV-inserts werd gelineariseerd met BamHI enzym en vervolgens gebruikt voor de bereiding van standaarden in seriële 10-voudige verdunningen van 10 x 109 kopieën tot 20 kopieën/μL.

Absolute kwantificering van TTV-DNA

PCR-reactie voor absolute kwantificering van TTV-DNA met SYBR Green in een reactie van 25 L is als volgt: elke reactie bevat 12,5 μL SYBR Green PCR-mastermix, 5 μL template (seriële 10-voudige verdunningen van de gelineariseerde plasmidestandaarden of/ geëxtraheerd DNA van de plasmamonsters van gezonde bloeddonoren), 1,25 L (500 nm) van elke primer (TTVF-1, TTVF-2, TTVR-1, TTVR-2) en 2,5 μL Milli-Q-water. De cyclusomstandigheden omvatten initiële activering van AmpliTaq Gold DNA-polymerase (aanwezig in SYBR Green mastermix) gedurende 10 minuten bij 95°C. De daaropvolgende PCR-omstandigheden bestonden uit 40 denaturatiecycli bij 95°C gedurende 15 seconden en annealing en verlenging bij 60°C gedurende 1 minuut per cyclus. Na real-time data-acquisitie werd de cyclusdrempelwaarde berekend door het punt te bepalen waarop de fluorescentie een willekeurige drempelwaarde overschrijdt. Standaarden met bekende TTV DNA-kopieën werden bereid in twee onafhankelijke seriële verdunningen en werden uitgevoerd in het bereik van 100 kopieën tot 10 x 109 kopieën op vier niet-opeenvolgende dagen om biologische, inter-, intraday-variabiliteit en nauwkeurigheid van de test te evalueren. Bovendien werd een reeks standaarden van één seriële verdunning ook in drievoud op twee verschillende dagen uitgevoerd om de variaties binnen de dag en tussen de dag te evalueren. De variabiliteit van de test werd geëvalueerd door de Ct waarden lopen op dezelfde dag (intra-day) en op verschillende dagen (inter-day) en werd weergegeven als variatiecoëfficiënt (CV). De nauwkeurigheid werd berekend door de verhouding van terugberekende kopieën van de standaardcurve te nemen tot het theoretische aantal kopieën van de reacties. Real-time PCR-assay voor testmonsters (HSCT-ontvangers) en voor biologische replica's van elk gezond individu werden uitgevoerd met de opname van TTV-plasmidestandaarden en negatieve controles in elke run. Daarnaast werd de nauwkeurigheid van de test ook gecontroleerd door bekend TTV-positief DNA uit te voeren (positieve controles met exacte log-kopieën/ml). De virale genomische kopieën per ml plasma werden berekend zoals beschreven door Huang et al. [26] d.w.z. door de kopieën per reactie te vermenigvuldigen met een factor 30 [30 L geëxtraheerd DNA/5 L sjabloon x (1 ml/200 μL plasma)].

Smeltcurve-analyse voor specificiteit

Na amplificatie werd een smeltcurve- of dissociatiecurve-analyse uitgevoerd om de specificiteit van het PCR-product te meten. Het temperatuurprogramma dat werd gebruikt voor de smeltcurveanalyse was 95°C gedurende 15 seconden gevolgd door 60°C gedurende 1 minuut en vervolgens 95°C gedurende 15 seconden met een hellingssnelheid van +0,3°C/seconde.


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


Amerika

De site wordt in het Engels weergegeven.

We gebruiken deze cookies om ervoor te zorgen dat onze site veilig en naar behoren functioneert. Ze zijn noodzakelijk om onze diensten te laten functioneren en kunnen niet worden uitgeschakeld in onze systemen. Ze worden meestal alleen ingesteld naar aanleiding van acties van u die neerkomen op een verzoek om diensten, zoals inloggen, het gebruik van een winkelwagen of het invullen van formulieren. U kunt uw browser zo instellen dat deze cookies blokkeert of u voor deze cookies waarschuwt, maar sommige delen van onze diensten werken niet zonder deze. Net als de andere cookies die we gebruiken, kunnen strikt noodzakelijke cookies first-party cookies of third-party cookies zijn.

We gebruiken deze cookies om uw instellingen en voorkeuren te onthouden. We kunnen deze cookies bijvoorbeeld gebruiken om uw taalvoorkeuren te onthouden.
Voorkeurscookies toestaan

We gebruiken deze cookies om informatie te verzamelen over hoe u met onze diensten omgaat en om ons te helpen deze te meten en te verbeteren. We kunnen deze cookies bijvoorbeeld gebruiken om te bepalen of u interactie heeft gehad met een bepaalde pagina.
Prestatie-/statistiekcookies toestaan

Wij en onze advertentiepartners gebruiken deze cookies om advertenties te leveren, ze relevanter en betekenisvoller voor u te maken, en om de efficiëntie van onze advertentiecampagnes bij te houden, zowel op onze diensten als op andere websites en sociale media.
Marketingcookies toestaan


3. Resultaten en discussie

Voor zover wij weten, verhoogde het S-eiwit de expressie van Tnf-α, Il-1β, Il-6 en mife RNA's in oudere mannelijke M𠄼SF–Mϕ (Fig.ਁ A𠄼, Suppl.  Fig.ਁ ), terwijl alleen Tnf-α, Il-1β en Il-6 werden tot overexpressie gebracht bij jonge mannelijke Mϕ (Fig.ਁ A𠄼). Daarentegen vertoonde IL34-Mϕ van oude mannelijke muizen een ontstekingsremmend effect, met remming van Tnf-α en Il-6 (Fig.ਁ G, I), terwijl remming van Il-1β en Il-6 werden waargenomen in IL-34-Mϕ van jonge mannelijke muizen (Fig.ਁ H–I). Deze gegevens geven aan dat het S-eiwit de expressie van SASP-cytokinen in M𠄼SF–Mϕ verhoogde, terwijl het verlaagde in IL-34-Mϕ, van mannelijke muizen. Voor jonge en oudere vrouwelijke MCSF-Mϕ die zijn blootgesteld aan het S-eiwit, zijn er geen significante fluctuaties in de expressie van de Tnf-α, Il-1β, Il-6 en mife genen werden waargenomen (Fig.ਂ Suppl.  Fig.ਁ ). Bovendien is alleen een significante toename van de expressie van Il-1β (Fig.ਂ I) werd gedetecteerd bij jonge vrouwelijke IL-34 Mϕ, terwijl er geen veranderingen werden waargenomen in een van de gerapporteerde cytokines bij oudere vrouwelijke IL34-Mϕ. Deze gegevens kwamen overeen met een recent gepubliceerde waarneming die aantoont dat hoge serumspiegels van TNF-α en IL-6 zijn geïdentificeerd bij de COVID-19-patiënten, waarbij IL-6 significant hoger was bij ernstig zieke patiënten [9], maar de geslacht of leeftijdsverdeling van deze gegevens zijn niet gerapporteerd. Bovendien is bij COVID-19-patiënten de M-CSF, maar niet de IL-34-expressie, beoordeeld en bleek deze verhoogd [10]. Hoewel M-CSF en IL-34 zijn geïdentificeerd bij chronische ontstekingen, is hun specifieke bijdrage aan het ontstekingsproces nog niet gedetailleerd [11]. Onze geslachts- en leeftijdsspecifieke observaties bij muis Mϕ correleerden met statistische bevindingen van hoge prevalentie en ernst van COVID-19-symptomen bij oudere mannelijke patiënten [2, 12]. Bovendien toonden onze gegevens duidelijk het verwachte inflammatoire fenotype aan dat geïnduceerd wordt door de SARS-CoV-2 in M-CSF, maar niet in IL-34, gedifferentieerde Mϕ.

De effecten van SARS-CoV-2 Spike Protein op de expressie van senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP) markers in M𠄼SF– en IL-34-geprimede macrofagen (Mϕ) geïsoleerd uit beenmerg van jonge en oude mannelijke C57BL/6-muizengeïsoleerd uit beenmerg van jonge en oude man C57BL. De veranderingen in de mRNA-genenexpressie van pro-inflammatoire cytokines (AC, GI), nucleaire senescentie-regulerende eiwitten (DF, JL) en cathepsine B, L en K (M–R), evenals de intracellulaire cathepsines-activiteit (S ), werden beoordeeld in M𠄼SF– of IL34-geprimede beenmerg afgeleide macrofagen (M𠄼SF–Mϕ, IL-34-Mϕ) na 24 uur blootstelling aan 10 ng/ml SARS-CoV- 2 S-eiwit (n =ਅ monsters/conditie). Macrofagen werden geïsoleerd uit 2 maanden oude en 24 maanden oude mannelijke en vrouwelijke C57BL/6-muizen. Magic Red en Hoechst-kleurstoffen werden gebruikt om respectievelijk cathepsines-activiteit (rood) en kernen (blauw) te labelen. Schaalbalk: 50 μm. Er is gebruik gemaakt van een one-way ANOVA met een post-hoc Tukey's-test voor de vergelijkingen tussen verschillende groepen (n =ਅ monsters/conditie) ∗p <਀.05, ∗∗p' x000a0<਀.01. (Voor interpretatie van de verwijzingen naar kleur in deze figuurlegenda wordt de lezer verwezen naar de webversie van dit artikel.)

De effecten van SARS-CoV-2 Spike Protein op de expressie van senescence-associated secretory fenotype (SASP) markers in M𠄼SF– en IL-34-primed macrofagen (Mϕ) geïsoleerd uit beenmerg van jonge en oudere vrouwen C57BL/6 muizen. De veranderingen in de genexpressie van inflammatoire cytokines (AC, GI), senescentiemarkers (DF, JI) en cathepsines (M–R), evenals de intracellulaire cathepsine-activiteit (S), werden beoordeeld in M𠄼SF– of IL-34-Mϕ na 24 uur blootstelling aan 10 ng/ml SARS-CoV-2 S-proteïne (n =ਅ monsters/conditie). Macrofagen werden geïsoleerd uit beenmerg van 2 maanden oude en 24 maanden oude mannelijke en vrouwelijke C57BL/6-muizen. Magic Red en Hoechst-kleurstoffen werden gebruikt om respectievelijk cathepsines-activiteit (rood) en kernen (blauw) te labelen. Schaalbalk: 50 μm. Er is gebruik gemaakt van een one-way ANOVA met een post-hoc Tukey's-test voor de vergelijkingen tussen verschillende groepen (n =ਅ monsters/conditie) ∗p <਀.05, ∗∗p' x000a0<਀.01. (Voor interpretatie van de verwijzingen naar kleur in deze figuurlegenda wordt de lezer verwezen naar de webversie van dit artikel.)

Omdat het S-eiwit de productie van pro-inflammatoire SASP-cytokinen van Mϕ (Fig.ਁ, Fig. het S-eiwit op de expressie van belangrijke nucleaire senescentie-regulerende eiwitten, waaronder Hmgb1, p53 en p21, in MCSF- en IL34-Mϕ. Blootstelling aan het S-eiwit veroorzaakte de overexpressie van Hmgb1, p53 en p21, door MCSF-Mϕ (Fig.ਁ D𠄿), maar niet in IL34-Mϕ, geïsoleerd uit oude en jonge mannelijke muizen (Fig.ਁ J-L). In tegenstelling tot, Hmgb1 en p21 werden significant tot overexpressie gebracht in jonge vrouwelijke IL34-Mϕ (Fig.ਂ D,F), maar niet in MCSF-Mϕ. Interessant is dat er geen veranderingen werden waargenomen in M𠄼SF– en IL-34-Mϕ van oude vrouwelijke muizen, die mogelijk worden beïnvloed door SARS-CoV-2 via verschillende signaalroutes. HMGB1 is een schade-geassocieerd moleculair patroon (DAMP) alarmine, dat senescentie-geassocieerde ontsteking versterkt [14]. Bovendien is HMGB1 een mediator van de infiltratie van ontstekingscellen in de longen en draagt ​​het bij aan de herprogrammering van Møx003d5 naar een pro-inflammatoir fenotype, dat wordt opgereguleerd in de verouderende longen en nieren [15]. Evenzo worden p53 en zijn stroomafwaartse gen p21 opgereguleerd bij fibrotische longziekte en het is bekend dat ze worden geactiveerd als reactie op DNA-schade [16, 17]. Bovendien grijpt p53 in bij virale activering en is het geïdentificeerd in de bronchiale lavagevloeistof van COVID-19-patiënten [18, 19].

Talrijke studies tonen aan dat cathepsinen de cellulaire veroudering en met veroudering geassocieerde ziekten kunnen vergemakkelijken, waaronder osteoporose en de ziekte van Alzheimer [20]. Verder worden CatB en L geactiveerd door de S-eiwitten van de SARS- en MERS-coronavirussen om membraanfusie en daaropvolgende afgifte van viraal RNA in de gastheercel te bemiddelen [3]. Belangrijk is dat het niet bekend is dat CatK direct geassocieerd is met virale infectie of replicatie, maar het induceert wel de productie van SASP's, waaronder pro-inflammatoire TNF-α, IL-6 en IL-1β cytokines, van Mϕ en Mϕ-achtige osteoclastprecursoren [[21] , [22] , [23] , [24] ]. Zo hebben we uiteindelijk de leeftijds- en geslachtsafhankelijke mRNA-expressie van CatB, L en K beoordeeld, samen met hun intracellulaire activiteit in M𠄼SF– en IL-34-Mϕ blootgesteld aan het S-eiwit met behulp van realtime PCR en confocale microscopie-assays, respectievelijk.

Bij jonge mannen bleek S-eiwit de expressie van CatB- en CatK-genen en intracellulaire activiteiten significant te verhogen in M𠄼SF–Mϕ (Fig.ਁ M, O), terwijl de expressies en activiteiten van CatL en CatK waren verhoogd in IL -34-Mϕ (Fig.ਁQ–R). Omgekeerd werden de expressie en activiteit van CatB geremd, terwijl die voor CatL en CatK verhoogd waren bij oude mannetjes M𠄼SF–Mϕ (Fig.ਁ M–O ). Er werden geen effecten van S-eiwit waargenomen op IL-34-Mϕ geïsoleerd uit oude muizen. Onze gegevens toonden ook aan dat de expressies en activiteiten van CatB en CatK significant verhoogd waren bij jonge vrouwelijke IL-34-Mϕ (Fig 2P,R), maar de expressie en intracellulaire activiteiten van CatB, CatL en CatK in reactie op S- eiwit werden niet beïnvloed bij jonge en oude vrouwelijke M𠄼SF–Mϕ, noch bij oude vrouwelijke IL-34-Mϕ (Fig.ਂ). Hoewel het belang van CatB en CatL in de door SARS-coronavirus geïnduceerde ontsteking is gemeld in eerdere onderzoeken [25], detecteerde deze studie voor het eerst de verhoogde expressie en intracellulaire activiteit van CatK in M𠄼SF–Mϕ en IL-34-Mϕ blootgesteld aan het S-eiwit van SARS-CoV-2. Daarom is verder onderzoek nodig om de rol van CatK in de leeftijd en geslachtsgerelateerde ernst van COVID-19-symptomen op te helderen.


Discussie

Parr-smolt-transformatie in anadrome zalm gaat gepaard met een kenmerkende voorbereidende toename van de NKA-activiteit van de kieuw, die grotendeels wordt voltooid terwijl de zalm zich nog in het FW bevindt, waardoor de smolt snel van FW naar ZW op volledige sterkte kan bewegen met minimale osmotische verstoring (hoar, 1988). Hier leveren we bewijs dat deze hypo-osmoregulerende ontwikkeling, zoals beoordeeld door veranderingen van transcriptionele, translationele en activiteitsniveaus van belangrijke ion-regulerende eiwitten, wordt gedempt tijdens de lente-smoltificatieperiode in niet aan zee grenzende zalm in vergelijking met anadrome Atlantische zalm.

In overeenstemming met de recente bevindingen bij regenboogforel (Richards et al., 2003), vonden we vier NKA α-isovormen (α1a, α1b, α1c en α3) aanwezig in zalmkieuwen, terwijl α2 niet werd gedetecteerd. De huidige bevindingen van een tijdelijke opregulatie van kieuw-α1b-mRNA-niveaus in anadrome zalm, gelijktijdig met een continue afname van α1a, suggereren dat wederzijdse expressie van deze twee isovormen niet alleen een mechanisme vertegenwoordigt waardoor zalmachtigen kieuw-NKA kunnen moduleren als reactie op veranderd zoutgehalte (Richards et al., 2003 Mackie et al., 2005 Bystriansky et al., 2006), maar vormt ook een belangrijk kenmerk dat ten grondslag ligt aan de voorbereidende toename van NKA-activiteit van de kieuwen die optreedt in anadrome zalm voorafgaand aan SW-invoer. Aangezien gill-1b-mRNA de belangrijkste isovorm is die wordt opgereguleerd in anadrome smolts in de huidige studie, en een relatieve 20-voudig hogere opregulatie laat zien dan α1a van parr naar smolts in mei, is het waarschijnlijk dat de voorbereidende toename van de totale kieuw NKA α-subeenheid mRNA-niveaus die eerder werden gerapporteerd in zalm (D'Cotta et al., 2000 Seidelin et al., 2001) kunnen in feite het resultaat zijn geweest van specifieke 1b-isovorm-upregulatie. In tegenstelling tot anadrome zalm, trad er geen duidelijke smolt-achtige toename van kieuw-1b-spiegels op in niet aan zee grenzende zalm. Aan de andere kant loopt een lichte toename van α1b in juvenielen die in het voorjaar zijn ingesloten, parallel met een lagere temporele toename van de enzymactiviteit van deze vissen in vergelijking met anadrome smolts. Verhoogde NKA-activiteit is echter niet noodzakelijkerwijs afhankelijk van verhoogde α1b-isovorm-mRNA-niveaus. In tegenstelling tot studies over zalmachtigen, waaronder de huidige, werd een voorbijgaande 1a-upregulatie gevonden in killivissen na overdracht van brak water (BW) naar SW (Scott et al., 2004a). α1a werd echter ook opgereguleerd bij overdracht van BW naar FW, en deze toename was groter en langduriger dan van BW naar SW. Scott et al. vonden verder (Scott et al., 2004b) dat de verschillen in mortaliteit die werden waargenomen tussen noordelijke en zuidelijke killivissen bij overdracht van BW naar FW goed correleerden met kieuw-NKA-activiteit en α1a-mRNA-niveaus. Met uitzondering van de voorbijgaande toename in SW, komen beide studies van Scott en collega's overeen met de hypothese dat α1a kinetische eigenschappen heeft die geassocieerd zijn met succesvolle ionregulatie in FW (Richards et al., 2003), maar de wederzijdse verschuiving tussen α1a en α1b isovormen lijkt specifiek te zijn voor zalmachtigen. Hoewel een algehele voorbijgaande opregulatie van kieuw NKA α1b-mRNA, gelijktijdig met een abrupte, aanhoudende afname van α1a-niveaus in zowel anadrome als niet aan zee grenzende zalm na SW-overdracht, consistent is met recente bevindingen bij zalmachtigen (Richards et al., 2003 Mackie et al., 2005 Bystriansky et al., 2006), illustreren de verschillen in omvang waarmee deze twee stammen reageren op blootstelling aan SW een belangrijke eigenschap die verband houdt met de ontwikkeling van hypo-osmoregulerend vermogen bij zalmachtigen. De aanwezigheid en omvang van reacties op veranderingen in het zoutgehalte is afhankelijk van hun euryhaliene capaciteit voorafgaand aan SW-invoer. Ondanks hogere NKA α1b-mRNA-niveaus in anadrome zalm na SW-overdracht, vertonen ingesloten zalmen bijvoorbeeld een hogere inductie van α1b-niveaus, vergeleken met hun overeenkomstige FW-waarden. Het is daarom waarschijnlijk dat niet aan zee grenzende zalm het gebrek aan voorbereidende veranderingen kan compenseren door hogere de novo synthese van α1b na SW-overdracht, zoals verder blijkt uit een hogere relatieve inductie van enzymactiviteit bij deze vissen in SW. Gelijkaardige verschillen werden recentelijk waargenomen tussen regenboogforel, Arctic char Salvelinus alpinus en Atlantische zalm na SW-overdracht (Bystriansky et al., 2006). In het geval van NKA α1c deden zich echter geen duidelijke veranderingen voor in anadrome of niet aan zee grenzende zalm in de huidige studie, wat de suggestie ondersteunt van een `huishoudelijke' functie van α1c in kieuwweefsel van zalmachtigen (Richards et al., 2003).

Gill Na + K + , 2Cl - cotransporter mRNA-niveaus (A) en eiwitovervloed (B in anadrome (gesloten cirkels) en niet aan zee grenzende (open cirkels) Atlantische zalm in FW van 26 februari tot 18 juni. Symbolen voor anadrome (gesloten driehoek) en niet aan zee grenzende zalm (open driehoek) na 96 uur ZW (34% jij) blootstelling, en anadrome (gesloten ruit) en niet aan zee grenzende zalm (open ruit) medio juni na 1 maand in ZW zijn voor de duidelijkheid gecompenseerd. Waarden zijn gemiddelden ± sem (N=8-10). * Significant verschil tussen stammen in FW (P<0.05). Verschillende hoofdletters en kleine letters geven verschillen aan (P<0.05) tussen tijdspunten binnen respectievelijk anadrome en niet aan zee grenzende zalm. † Significante verschillen tussen ZW en ZW in niet aan zee grenzende zalm.

Gill Na + K + , 2Cl - cotransporter mRNA-niveaus (A) en eiwitovervloed (B in anadrome (gesloten cirkels) en niet aan zee grenzende (open cirkels) Atlantische zalm in FW van 26 februari tot 18 juni. Symbolen voor anadrome (gesloten driehoek) en niet aan zee grenzende zalm (open driehoek) na 96 uur ZW (34% jij) blootstelling, en anadrome (gesloten ruit) en niet aan zee grenzende zalm (open ruit) medio juni na 1 maand in ZW zijn voor de duidelijkheid gecompenseerd. Waarden zijn gemiddelden ± sem (N=8-10). * Significant verschil tussen stammen in FW (P<0.05). Verschillende hoofdletters en kleine letters geven verschillen aan (P<0.05) tussen tijdspunten binnen respectievelijk anadrome en niet aan zee grenzende zalm. † Significante verschillen tussen ZW en ZW in niet aan zee grenzende zalm.

Gill cystic fibrosis transmembraan conductance regulator I (CFTR I) mRNA-niveaus in anadrome (gesloten cirkels) en niet aan zee grenzende (open cirkels) Atlantische zalm in FW van 26 februari tot 18 juni. CFTR I werd niet gemeten na SW-overdracht. Waarden zijn gemiddelden ± sem. (N=8-10). * Significant verschil tussen stammen in FW (P<0.05). Verschillende hoofdletters en kleine letters geven verschillen aan (P<0.05) tussen tijdstippen binnen respectievelijk anadrome en niet aan zee grenzende zalm.

Gill cystic fibrosis transmembraan conductance regulator I (CFTR I) mRNA-niveaus in anadrome (gesloten cirkels) en niet aan zee grenzende (open cirkels) Atlantische zalm in FW van 26 februari tot 18 juni. CFTR I werd niet gemeten na SW-overdracht. Waarden zijn gemiddelden ± sem. (N=8-10). * Significant verschil tussen stammen in FW (P<0.05). Verschillende hoofdletters en kleine letters geven verschillen aan (P<0.05) tussen tijdstippen binnen respectievelijk anadrome en niet aan zee grenzende zalm.

De rol van de NKA α3-subeenheid-isovorm bij acclimatisering van het zoutgehalte lijkt minder belangrijk dan α1-isovormen. Studies in heterologe expressiesystemen hebben zelfs aangetoond dat NKA-isozymen van zoogdieren verschillende affiniteiten voor Na+ en K+ vertonen, waarbij de α3-isovorm hogere Km waarden voor Na+ dan de α1- en α2 NKA-isozymen (Jewell en Lingrel, 1991 Blanco en Mercer, 1998 Crambert et al., 2000). Een lagere Na+-affiniteit van α3-isozymen suggereert dus dat isozymen die deze isovorm omvatten, minder efficiënt kunnen zijn in het transporteren van Na+ wanneer de intracellulaire Na+-concentratie laag is. Hoewel het een kleinere omvang heeft dan α1b, suggereert een duidelijke voorbijgaande toename van gillα3-mRNA-niveaus in anadrome, maar niet aan zee grenzende zalm, een significante rol van deze isovorm tijdens parr-smolt-transformatie. In overeenstemming met de bevindingen bij regenboogforel (Richards et al., 2003), vertoonden noch anadrome noch niet aan zee grenzende zalm een ​​significante toename van -3 niveaus na blootstelling aan SW. In tilapia, Oreochromis mossmabicus, kieuw α3 (tweevoudig) en α1 (vijfvoudig) mRNA-niveaus nemen toe na overdracht van FW naar SW (Feng et al., 2002). Taken together, these results suggest that differential expression of α1 subunit isoforms is more pronounced than for α3 isoforms, probably because the α1 isoforms have kinetic properties more favorable for the differential ion transport processes of chloride cells in FW and SW(Richards et al., 2003 Evans et al., 2005). Nevertheless, further studies are necessary to ascertain the relative importance and specific roles of α1 and α3 in ion regulation.

The NKA β1-subunit is necessary for protein maturation and anchoring of the enzyme in cell membranes. Thus, co-expression of both α andβ subunits are essential for NKA function(Blanco and Mercer, 1998). The transient increase of gill NKA β1 mRNA levels in anadromous salmon in the present study is largely in accordance with previous findings(Seidelin et al., 2001). On the other hand, the lack of a preparatory increase of β1 mRNA levels in landlocked salmon, despite elevated enzyme activity in May and June, and further, decreasing levels of β1 mRNA at peak smoltification in anadromous salmon and in both strains after SW transfer, suggest additional mechanisms by which β subunits may be regulated, possibly through various osmoregulatory and/or hormone response elements(Kolla et al., 1999 Deane and Woo, 2004) or differential expression of multiple β subunit isoforms. For instance, in the European eel Anguilla anguilla, expression of gillβ 233, a duplicate copy of the NKA β1-isoform, has been found to be dependent upon the developmental stages of these fish, as upregulation only occurs in migratory silver eels, and not in adult non-migratory yellow eels following SW transfer(Cutler et al., 2000). Recently, in silico analysis of Expressed Sequence Tags has identified at least four NKA β subunit isoforms in salmonids(Gharbi et al., 2004 Gharbi et al., 2005). Assuming that multiple β subunit isoforms are present in gills, it is possible that differential expression of putative gill β1 isoforms may be similar to isoform switching of gill α1a and α1b during salmon smoltification and salinity acclimation. Alternatively, β-subunit abundance could be regulated at post-transcriptional levels, and thus differ from regulation of α-subunit synthesis.

Changes at the transcriptional level are often assumed to parallel increased protein abundance. As such, one would expect differential regulation of α-subunit isoforms at the transcriptional level to bring about differences in α protein abundance. Overall, a good correspondence between total NKA α-subunit mRNA, protein abundance and enzyme activity in the present study would suggest a coordinated regulation at the transcriptional and translational levels. This was not always the case,however, as both anadromous and landlocked salmon displayed a similar transient increase in gill α protein abundance, despite totalα-subunit mRNA levels in May being 2.5-fold higher in anadromous than landlocked salmon, based on an estimation of all four α-subunit isoforms. Similar differences in overall α-subunit mRNA and protein abundance have been found in anadromous salmonids(D'Cotta et al., 2000 Seidelin et al., 2001 Tipsmark et al., 2002),killifish (Scott et al.,2004b) and tilapia (Lee et al., 1998 Lee et al.,2003). Thus, the transient increase of α-subunit mRNA and protein abundance, with peak levels in May, concurrent with sustained elevated enzyme activity in June, indicate the importance of both transcriptional and post-transcriptional mechanisms in modulating NKA activity. Post-transcriptional mechanisms have been shown to modulate gill NKA activity in brown trout Salmo trutta(Tipsmark and Madsen, 2001),and could explain a sustained enzyme activity in June, despite a decrease in corresponding α-subunit protein and mRNA levels. The temporal switching of gill α1a and α1b mRNA between anadromous and landlocked salmon contrasts the similar transient upregulation of α-subunit protein in these two strains. Assuming that upregulation of α-isoform mRNA levels are, in fact, associated by translational changes in putative NKAα-isoform abundance, it is conceivable that the α5 antibody, which is based on conserved regions of multiple α-subunit isoforms in several vertebrate species (Takeyasu et al.,1990), may recognize all putative α-subunit isoforms, and thus account for some of the discrepancies observed in the present study. Further investigations should verify differential expression of putativeα-isoforms at the translational level in order to ascertain their physiological role in ion regulation.

While gill NKA is an essential participant in both ion secretion and uptake in gills, the basolateral NKCC and apical CFTR anion channel are considered to be primarily involved in ion secretion(Evans et al., 2005). Present findings of a preparatory transient increase of gill NKCC mRNA and protein levels in anadromous salmon are largely in accordance with previous studies in salmon (Pelis et al., 2001 Tipsmark et al., 2002). Interestingly, landlocked salmon appear to have lost the preparatory upregulation of gill NKCC mRNA associated with the parr-smolt transformation. However, like the anadromous salmon, landlocked salmon have the capacity to upregulate this transcript following SW transfer. This suggests that our TaqMan assay most likely is specific for the secretory NKCC isoform. On the other hand, two secretory isoforms, the NKCC1a and NKCC1b, have been identified in European eel, and only gill NKCC1a is upregulated following SW transfer (Cutler and Cramb,2002). Thus, one cannot exclude the possibility of more than one secretory isoform being present in salmon gills, and that these may be differentially regulated. As with NKA, there was no straightforward correspondence between NKCC mRNA and protein levels, in either anadromous or landlocked salmon, as increased NKCC protein abundance was more profound than NKCC mRNA levels, possibly reflecting a lower turnover of this protein in salmon gills. Similar differences have been observed in anadromous salmonids(Tipsmark et al., 2002) and killifish (Scott et al.,2004b). On the other hand, a distinct upregulation of NKCC protein in landlocked salmon between May and June contradicts the apparent lack of a preparatory increase at the transcriptional level in these fish. Some of the discrepancies observed in present and other studies may be ascribed to the use of the T4 antibody, as it most likely recognizes both the secretory and an absorptive isoforms (Lytle et al.,1995).

In the case of CFTR anion channel isoforms CFTR I and CFTR II, our present findings suggest that these two isoforms are differentially regulated during salmon smoltification. The continuous increase of gill CFTR I mRNA levels in anadromous salmon, and to a lesser extent in landlocked salmon, suggests a preparatory increase of this isoform during acquisition of salinity tolerance. Given that CFTR is primarily involved with ion secretion(Evans et al., 2005), it was somewhat surprising that CFTR II mRNA levels remained stable in FW among both anadromous and landlocked salmon. Assuming that both CFTR isoforms are actually inserted into the apical membrane as functional Cl - channels, it is possible that high CFTR II levels may be important for a rapid activation of CFTR when exposed to higher salinity. In fact, Singer et al.(Singer et al., 2002) found a sustained increase of gill CFTR I mRNA levels in Atlantic salmon smolts following SW, while CFTR II mRNA levels increased transiently, peaking after 24 h in SW. Further studies are clearly required to ascertain the physiological role of CFTR I and II in salmon smoltification and SW adaptation.

Salmonids display a remarkable plasticity when it comes to adjusting ion homeostasis in response to changes in environmental salinity. This plasticity may arise as part of a developmental event, or in response to salinity exposure (McCormick, 2001 Evans et al., 2005 Hiroi and McCormick, 2007). Although the landlocked salmon appears to have lost some of the developmental increase in ion transport proteins associated with preparation for SW migration, these fish seem to have retained the plasticity to respond when challenged with SW, as judged by their ability to upregulate key ion transporters and maintain low plasma Cl - levels similar to the anadromous strain. In contrast to our previous study(Nilsen et al., 2003) where this landlocked strain showed 40% mortality after 16 days in SW, no mortality occurred in the present study. One contributing factor to these contrasting observations may be the larger size of the juvenile Bleke in the present study(mean mass 39.1 g) compared with that of our previous study (mean mass 24.8 g)(Nilsen et al., 2003) when transferred to SW in May. This suggestion is in line with the general view that larger body size corresponds with greater hypo-osmoregulatory capacity in juvenile FW salmonids [see Hoar (Hoar,1988) and references therein]. However, this gradual,size-dependent increase in salinity tolerance in parr and non-anadromous species is different from the rapid and dramatic increase in salinity tolerance that develops during parr-smolt transformation [characterised by concurrent change in ontogeny, increased developmental rate and increased differentiation (McCormick and Saunders,1987)]. A threshold size for smolting in the range 9.5 cm (1+smolts) and 12 cm (2+ smolts) was described in offspring of wild broodstock(Thorpe et al., 1980),supporting our conclusions that fish from both strains were above the critical size threshold for Atlantic salmon smolt development in May (>15 cm, 39-44 g). There is further support for our view that differences between the two strains were not caused by differences in fish size: Bjerknes et al. concluded that fish size did not influence plasma osmolality or muscle water content following SW acclimation of Atlantic salmon >9.5 cm, whereas parr <9.5 cm suffered high mortalities and severe osmotic disturbance(Bjerknes et al., 1992), and Handeland and Stefansson reported higher NKA activity in small than large smolts (approx. 40 g vs 55 g), supporting smolt development being less dependent on fish size even within a wider size range than in the present experiment (Handeland and Stefannson,2001). Finally, with the exception of an increase in NKCC protein abundance, no major changes in ion regulatory parameters were observed in the juvenile Bleke between May and June, despite an increase in fish size to 54.7(±2.9) and 54.9 (±3.6) g of the Bleke and Vosso, respectively. These observations further support our view that the differences observed in May between Vosso smolts and juvenile Bleke reflect differences between strains, and are not caused by the slight (non-significant) difference in fish size in May.

The apparent loss of the preparatory osmoregulatory changes in the landlocked salmon is likely the result of natural selection, as these changes are no long necessary. Similar mechanisms have been suggested for other traits such as the loss of muscle fibers(Johnston et al., 2005), as energy may be wasted in processes that reduce their overall fitness(McDowall, 1988). In contrast,the ability to respond to SW as a protective mechanism has been retained, due to its importance in exploiting other habitats. This plasticity most likely is under less selection pressure, as the trait is only energy demanding upon SW stimulation. Even though our findings suggest the landlocked salmon do not need a preparatory increase in hypo-osmoregulatory capacity to attain ion homeostasis in SW, it must be kept in mind that these results were obtained in a protective environment with no external stressors that would otherwise be present in the wild. As stated above, the capacity to acclimate to seawater may depend on fish size, as larger fish may be able to withstand a hypersaline environment sufficiently long, allowing time for the SW-stimulated plasticity to occur, whereas the smaller fish may suffer severe salinity stress, leaving them unable to accommodate a plastic change. Support for this view was observed in a sub-experiment when fish from the present study experienced additional stress just prior to SW exposure in May. The majority of the landlocked fish died within days of SW exposure, whereas the anadromous salmon all survived (L.E., unpublished observation). Taken together, these observations indicate that stressed fish with an inadequate preparatory development of ion transporters are unable to exploit their inherent plasticity upon SW exposure.

In summary, the present study demonstrates that differential expression of gill NKA α1a, α1b and α3 isoform transcripts may, in part,be an important molecular mechanism underlying potential functional differences in NKA, both during preparatory development and during salinity adjustments in salmon. Furthermore, despite having lost some of the unique preparatory upregulation of key ion-secretory proteins associated with parr-smolt transformation, landlocked salmon have retained some hypo-osmoregulatory capacity when exposed to SW during spring.


Bekijk de video: How to Optimize qPCR using SYBR Green Assays - Ask TaqMan #38 (December 2021).