Informatie

Zullen dode cellen in kweekmedia enige significante invloed hebben op levende cellen tijdens incubatie?


Ik genereer stabiele cellijnen en heb iets van 25+ kweekflessen om voor te zorgen. In het ideale geval kan ik dode cellen in de media laten zitten met de levende aanhanger zonder me te haasten om constant van media te veranderen - Zal dit de groei van levende cellen beïnvloeden - Ik wil ze niet hinderen omdat ze al in hoge mate zitten [] Hygromycine


Ik weet niet zeker of dit verband houdt met de daadwerkelijke dode cellen, maar ik heb ontdekt dat het niet veranderen van de media op platen tijdens het genereren van lijnen uit primaire culturen tot besmetting kan leiden. Nogmaals, ik heb niet vastgesteld of dit komt omdat er dode cellen beschikbaar zijn voor verontreinigingen om voedingsstoffen uit te halen, of dat het gewoon is omdat het veranderen van media verontreinigingen verwijdert voordat ze te veel kunnen groeien. Maar misschien wilt u dat in gedachten houden. Ik heb geconstateerd dat het veranderen van media om de 3 dagen goed genoeg is.

Het hangt ook af van waar je je lijnen voor wilt gebruiken. Als je celsignalering of polarisatie wilt bestuderen (als of dit immuuncellen zijn), kan dat een probleem zijn, omdat het dode materiaal immuuncellen zal activeren en hun signaalpatronen zal veranderen. Dit heeft minder te maken met uw zorgen over de algehele groei en meer met het ontwikkelen van een goed model voor wat u ook doet.

Om eerlijk te zijn, deze signaalverschuivingen kunnen de proliferatie in cultuur moduleren, maar dat zal echt variëren van celtype tot celtype. Sorry dat ik een beetje vaag ben! Het is alleen dat alle cellen anders zijn. Ik werk toevallig met immuuncellen die nogal kieskeurig zijn. Er zijn echter andere soorten die veel robuuster zijn, zoals fibroblasten, waar je waarschijnlijk op zou kunnen spugen en ze zouden in orde zijn.

Als het veranderen van de media om de 3 dagen echt te omslachtig is, zou je kunnen proberen om kleine subculturen af ​​te splitsen en een mini-experiment te doen om te zien of het veranderen van de media vs. niet de samenvloeiing beïnvloedt na een week of zo? Dat zou je vertellen hoe flexibel je cellen zijn als het gaat om dit.

Bewerken: hier zijn enkele publicaties die de effecten van dode cellen in cultuur en verschillen tussen celtypen bespreken. Ik raad je ook aan om, als je een cellijn gebruikt, informatie op te zoeken via de ATCC-website en hun datasheet te lezen en enkele van de topreferenties die ze plaatsen die waarschijnlijk beschrijven hoe de lijn geïsoleerd was en de beste praktijken voor cultuur.

  1. "Remmende effecten van persistente apoptotische cellen op de productie van monoklonale antilichamen in vitro" - een goed voorbeeld van hoe een gebrek aan verwijdering van dode cellen in vitro kan de celfunctie / het fenotype beïnvloeden en benadrukt de verschillen tussen verschillende celtypen.

  2. "Celdood in zoogdiercelcultuur: moleculaire mechanismen en cellijn-engineeringstrategieën" - een goede recensie die raakt aan de feitelijke moleculaire mechanismen waarop ik zinspeelde. Ik raad in het bijzonder aan om de sectie "Inductie van celdood in celculturen van zoogdieren" te lezen, omdat het een samenvatting geeft van en linkt naar verschillende primaire bronnen die laten zien hoe toename van celdood zaken als productief, groei en celaantal kan beïnvloeden. Het gaat ook goed in op de verschillende soorten celdood, wat belangrijk is om te begrijpen, maar misschien een beetje te ingewikkeld is voor de oorspronkelijke vraag.

  3. "Verbanden tussen metabolisme en apoptose in zoogdiercellen: toepassingen voor anti-apoptose-engineering" - even goed als de vorige bron, maar bekijkt het door een meer metabolische lens, waarvan ik denk dat het nuttig is bij het beschouwen van de realiteit van celcultuur.


Dood of levend: moleculaire beoordeling van microbiële levensvatbaarheid

Op nucleïnezuur gebaseerde analytische methoden, variërend van soortgerichte PCR's tot metagenomica, hebben ons begrip van microbiologische diversiteit in natuurlijke monsters aanzienlijk uitgebreid. Deze methoden bieden echter slechts beperkte informatie over de activiteiten en fysiologische toestanden van micro-organismen in monsters. Zelfs de meest fundamentele fysiologische toestand, levensvatbaarheid, kan niet cross-sectioneel worden beoordeeld met standaard DNA-gerichte methoden zoals PCR. Er zijn nieuwe op PCR gebaseerde strategieën ontwikkeld, gezamenlijk moleculaire levensvatbaarheidsanalyses genoemd, die nucleïnezuren geassocieerd met levensvatbare cellen onderscheiden van die geassocieerd met geïnactiveerde cellen. Om het nut van deze methoden te maximaliseren en de resultaten correct te interpreteren, is het noodzakelijk om rekening te houden met de fysiologische diversiteit van leven en dood in de microbiële wereld. Dit artikel bespreekt moleculaire levensvatbaarheidsanalyse in die context en bespreekt toekomstige kansen voor deze strategieën in genetische, metagenomische en eencellige microbiologie.


Abstract

Hydrogels vormen een aantrekkelijk materiaalplatform voor de realisatie van driedimensionale (3D) weefsel-engineered constructies, omdat ze afstembare mechanische eigenschappen hebben, compatibel zijn met verschillende soorten cellen en lijken op elementen die worden aangetroffen in natuurlijke extracellulaire matrices. Tot dusver werden talrijke hydrogel-kraakbeen/botweefselengineering (TE)-gerelateerde studies uitgevoerd door gebruik te maken van een enkele celinkapselingsbenadering. Hoewel multicellulaire sferoïde culturen gunstige eigenschappen vertonen voor kraakbeen of bot-TE, is het chondrogene of osteogene differentiatiepotentieel van stamcelmicrosferoïden in hydrogels niet veel onderzocht. Deze studie onderzoekt, voor de eerste keer, hoe stijfheid van op gelatine gebaseerde hydrogels (met een opslagmodulus van 538, 3584 of 7263 Pa) de proliferatie en differentiatie van microsferoïden beïnvloedt die worden gevormd uit telomerase-geïmmortaliseerde menselijke vet-afgeleide stamcellen (hASC/ hTERT). Confocale microscopie geeft aan dat alle geteste hydrogels de levensvatbaarheid van de cellen ondersteunden tijdens hun kweekperiode van 3 tot 5 weken in het controle-, chondrogene of osteogene medium. Hoewel in de zachtere hydrogels cellen van naburige microsferoïden binnen een paar dagen begonnen te ontgroeien en met elkaar te verbinden, was hun uitsteeksel langzamer of beperkt in stijvere hydrogels of die gekweekt in chondrogeen medium, respectievelijk. Hoge expressies van chondrogene markers (SOX9, EEN BLIKJE, COL2A1), gedetecteerd in alle geteste hydrogels, bewees dat de chondrogene differentiatie van hASC/hTERT-microsferoïden zeer succesvol was, vooral in de twee zachtere hydrogels, waar superieure kraakbeenspecifieke eigenschappen werden bevestigd door Alcian-blauwkleuring. Deze chondrogeen geïnduceerde monsters kwamen ook tot expressie COL10A1, een marker van chondrocythypertrofie. Interessant genoeg vertoonde de hydrogel zelf (zonder differentiatiemedium) een lichte chondrogene inductie. Ongeacht de stijfheid van de hydrogel, in de monsters gestimuleerd met osteogeen medium, de expressie van geselecteerde markers RUNX2, BGLAP, ALPL, en COL1A1 was niet sluitend. Desalniettemin bevestigde de von Kossa-kleuring de aanwezigheid van calciumafzettingen in osteogeen gestimuleerde monsters in de twee zachtere hydrogels, wat suggereert dat deze ook osteogenese bevorderen. Deze waarneming werd ook bevestigd door de Alizarine Red-kwantificatietest, waarmee grotere hoeveelheden calcium werden gedetecteerd in de osteogeen geïnduceerde hydrogels dan in hun controles. De gepresenteerde gegevens geven aan dat de inkapseling van van vet afkomstige stamcelmicrosferoïden in op gelatine gebaseerde hydrogels veelbelovend potentieel vertoont voor toekomstige toepassingen in kraakbeen of bot-TE.


De meeste cellen vereisen pH-omstandigheden in het bereik van 7,2-7,4 en nauwkeurige controle van de pH door een buffersysteem is essentieel voor optimale kweekomstandigheden. Er zijn grote variaties op dit optimum, fibroblasten geven de voorkeur aan een hogere pH (7,4-7,7), terwijl continu getransformeerde cellijnen meer zure omstandigheden vereisen.

Regeling van de pH is met name belangrijk onmiddellijk na het zaaien van cellen wanneer een nieuwe cultuur zich aan het vestigen is en wordt gewoonlijk bereikt door een van de twee buffersystemen (i) een "natuurlijk" buffersysteem waarbij gasvormig CO2 balanceert met de CO3/HCO3 inhoud van het kweekmedium en (ii) chemische buffering met behulp van een zwitterion genaamd HEPES.

Culturen met natuurlijk bicarbonaat/CO2 buffersystemen moeten in een atmosfeer van 5-10% CO . worden gehouden2 in lucht meestal geleverd in een CO2 broedmachine. Bicarbonaat/CO2 is goedkoop, niet-toxisch en biedt ook andere chemische voordelen voor de cellen.

HEPES heeft een superieure buffercapaciteit in het pH-bereik van 7,2-7,4, maar is relatief duur en kan bij hogere concentraties (boven

100nM). HEPES-gebufferde culturen vereisen geen gecontroleerde gasvormige atmosfeer.

De meeste commerciële kweekmedia bevatten fenolrood als pH-indicator, zodat de pH-status van het medium constant wordt aangegeven door de kleur. Meestal moet het kweekmedium worden vervangen/aangevuld als de kleur geel (zuur) of paars (basisch) wordt.


Een efficiëntere manier om cellen te isoleren

Wetenschappers die efficiënt werken, bereiken meer in minder tijd en met minder inspanning. We hebben een slimmere manier ontwikkeld om cellen te isoleren die minder tijd en moeite kosten zonder afbreuk te doen aan de betrouwbaarheid, zuiverheid of herstel.

Doorvoer

Doorvoer verwijst naar de snelheid waarmee celisolatie kan worden voltooid in termen van monstervolume, aantal cellen of aantal monsters. Hoeveel cellen kun je isoleren in één celscheidingsexperiment? Hoeveel monsters kunt u tegelijkertijd verwerken? Als u met grote monstervolumes of meerdere monsters tegelijk werkt, moet u overwegen welke celisolatietechnologie uw gewenste doorvoer kan ondersteunen.

Makkelijk te gebruiken

Gebruiksgemak draagt ​​bij aan de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van een celscheidingsmethode, vooral voor nieuwe gebruikers. In één voorbeeld waren vrijwilligers op expeditie naar de Boliviaanse Andes in staat cellen te isoleren om het effect van hoogte op het immuunsysteem te bestuderen, ondanks dat ze geen ervaring hadden met celscheiding en beperkte toegang tot laboratoriumapparatuur. Eenvoudige celisolatieprotocollen waren de sleutel tot het verminderen van gebruikersfouten en variabiliteit.

Monster- en celtypen

Monster- en celtypes kunnen bepalen welke celscheidingstechnologieën voor u beschikbaar zijn. Er is bijvoorbeeld een in de handel verkrijgbare immunomagnetische celisolatiekit voor de isolatie van ILC's uit muizenlongen, maar er is er mogelijk geen die is geoptimaliseerd voor de isolatie van Th2-cellen uit vetweefsel. Bovendien kan het monstervolume waarmee u werkt ook de beschikbare celscheidingstechnologieën voor uw toepassing beperken.

In sommige gevallen wilt u misschien meerdere celtypen isoleren uit een enkel monster. Met sommige celisolatiemethoden en -technologieën kunt u sequentiële celscheiding uitvoeren.

Kosten staan ​​vaak centraal bij het nemen van beslissingen, vooral als uw onderzoeksfinanciering beperkt is. Denk er bij het evalueren van de kosten van een celscheidingsmethode aan alle kosten op te nemen, inclusief reagentia (bijv. antilichamen, magnetische deeltjes en dichtheidsgradiëntmedia), disposables (bijv. buizen, slangen en kolommen) en tijd en service (bijv. flowcytometrie boekingen van kernfaciliteiten). Kostenbesparingen mogen de prestaties niet in gevaar brengen.

Automatisering

Automatisering kan de variabiliteit verminderen, de benodigde hoeveelheid hands-on tijd beperken en u in staat stellen meer te doen met uw tijd in het lab. Geautomatiseerde celscheidingsinstrumenten, zoals RoboSep™, verminderen ook het risico op blootstelling aan gevaarlijke pathogenen bij het werken met potentieel besmettelijke monsters.


3. RESULTATEN

3.1 Grootteontwikkeling van sferoïden

Zoals eerder beschreven (Metzger et al., 2011, 2013 ), is de LOT beide, een krachtige en gemakkelijke techniek om precies één sferoïde per holte te genereren onder sterk gestandaardiseerde omstandigheden. De grootte van de sferoïden kan gemakkelijk worden bepaald door de cellulaire concentraties in de zaaisuspensie aan te passen terwijl het zaaivolume van 100 ul per holte constant wordt gehouden (Figuur 2). De sferoïden vertoonden een regelmatige ronde morfologie, zelfs op dag 1 na generatie en bijna alle gezaaide cellen waren geïntegreerd in de sferoïde. Merk op dat de morfologie van de co-cultuursferoïden iets onregelmatiger was in vergelijking met de monocultuursferoïden. Bovendien waren de co-cultuursferoïden omgeven door meer cellulair afval, wat duidelijk te zien is voor cocultures-sferoïden bestaande uit 50.000 cellen op dag 3 en dag 6.

In overeenstemming met onze eerder gepubliceerde resultaten over de ontwikkeling van de grootte van sferoïden met verschillende cellulaire samenstellingen (Metzger et al., 2011) nam de grootte van alle onderzochte sferoïden in de loop van de tijd voortdurend af (figuren 3a en 4a). De zeer kleine standaarddeviaties gepresenteerd in de figuren 3a en 4a benadrukken de prestaties van de LOT op indrukwekkende wijze.

3.2 Succes van dissociatie in afzonderlijke cellen

Het voorgestelde dissociatieprotocol zorgde voor een succesvolle dissociatie van mono- en cocultuursferoïden onder gestandaardiseerde omstandigheden. Het was niet nodig om deze omstandigheden te variëren in relatie tot de grootte of de leeftijd van de sferoïden. Alle sferoïden konden binnen 10 minuten worden gedissocieerd onder continu schudden bij 37 ° C in AccuMax, ondersteund door een daaropvolgende pipetteerprocedure die schuifkrachten creëert. Het succes van de enzymatische dissociatie werd eerst microscopisch gecontroleerd, waarbij slechts enkele cellulaire aggregaten werden onthuld, die niet konden worden gevonden na het passeren van de celsuspensie door de 70 µm-voorscheidingsfilters. Bovendien konden er uiteindelijk geen cellulaire aggregaten in de filters worden gevonden, wat aangeeft dat alle persistente aggregaten voldoende konden worden losgemaakt. De LUNA FL-celteller maakte de kwantificering van het aantal afzonderlijke cellen mogelijk en onthulde ten minste 95% enkele cellen voor alle sferoïden (figuren 4, 3b, c en 4b, c). Voor NHDF waren enkele verschillen tussen sferoïden van verschillende groottes waarneembaar: De NHDF-sferoïden bestaande uit 50.000 cellen onthulden een iets lager aantal afzonderlijke cellen op dag 1 en dag 3. Er kon bijna geen invloed op het aantal afzonderlijke cellen worden gevonden voor de co-cultuur sferoïden (Figuur 4b, c). De aanvullende presentatie van deze resultaten die een alternatieve vergelijking in figuren 3c en 4c laten zien, richt zich op de invloed van de leeftijd van sferoïden. Van belang was dat een toename van het aantal afzonderlijke cellen kon worden gedetecteerd voor zowel mono- als co-cultuursferoïden, bestaande uit 50.000 cellen. De directe vergelijking van de resultaten verkregen voor mono- en co-cultuursferoïden onthulde een significant verminderd aantal afzonderlijke cellen voor de meeste co-cultuursferoïden (50.000 cellen op dag 3 en dag 6 10.000 cellen op dag 1, dag 3 en dag 6 5000 cellen op dag 3).

3.3 Flowcytometrische live-dood-assay en kwantificering van afval

Voor elke stroomafwaartse toepassing van de cellen is de levensvatbaarheid van de cellen na dissociatie van de sferoïden uiterst belangrijk. Aan de ene kant is de incubatietijd in AccuMax vrij kort (10 min), aan de andere kant kunnen herhaalde centrifugatie en de invloed van de uitgeoefende afschuifkrachten door stringent pipetteren leiden tot verminderde levensvatbaarheid van de cellen. Zoals weergegeven in de figuren 3d,e en 4d,e, lag de levensvatbaarheid van de cellen na dissociatie, bepaald met de live-dead-assay in combinatie met flowcytometrische kwantificering, in de meeste gevallen tussen 85% en 95%. De laagste levensvatbaarheid werd gedetecteerd voor de co-cultuursferoïden (10.000 cellen) op dag 1 met 80,1%. Er waren slechts kleine verschillen te zien voor de vergelijking van de verschillende sferoïde-afmetingen die in de figuren 3d en 4d worden getoond. Verder is er slechts een geringe invloed van de leeftijd van de sferoïden op de levensvatbaarheid (figuren 3e en 4e). In sommige gevallen is een tendens van het hoogste aantal levensvatbare cellen op dag 3 te zien, maar de verschillen zijn slechts gedeeltelijk significant. De directe vergelijking tussen mono- en co-cultuursferoïden onthulde echter een sterke invloed van het gekozen celtype op hun levensvatbaarheid na dissociatie: voor bijna alle groepen waren NHDF-HDMEC-cocultuursferoïden significant minder levensvatbaar dan monocultuursferoïden. Alleen op dag 6 was er geen verschil te zien voor sferoïden bestaande uit 5000 cellen en 50.000 cellen.

In overeenstemming met deze bevindingen nam de hoeveelheid cellulair afval gekwantificeerd door flowcytometrie duidelijk toe voor gedissocieerde cocultuursferoïden op dag 3 en dag 6, terwijl er geen toename van afval kon worden waargenomen voor NHDF-monocultuursferoïden (Figuur 5). Een directe vergelijking van de hoeveelheid afval tussen mono- en co-culturen bracht significant meer afval aan het licht voor de co-culturen op dag 3 en dag 6.

3.4 Flowcytometrische kwantificering van apoptotische cellen

Figuren 3f,g en 4f,g illustreren de resultaten van de kwantificering van Caspase-3-positieve cellen door middel van flowcytometrie. Op het eerste gezicht is het lage aantal apoptotische NHDF voor de gedissocieerde monocultuursferoïden duidelijk. Zelfs op dag 6 vertoonden de grootste sferoïden minder dan 2% apoptotische cellen. Merk op dat slechts een kleine toename van apoptotische cellen in de loop van de tijd kon worden gedetecteerd (Figuur 3f, g). Daarentegen vonden we een vrij hoog aantal apoptotische cellen voor de co-cultuursferoïden, tot bijna 18% (Figuur 4f, g). Voor zowel gedissocieerde mono- als co-cultuursferoïden wordt het aantal apoptotische cellen niet beïnvloed door de grootte van de sferoïden (figuren 3f en 4f), maar door de leeftijd van de sferoïden, wat indrukwekkend te zien is voor de co-cultuursferoïden. In alle gevallen was het aantal apoptotische cellen hoger in gedissocieerde co-cultuur-sferoïden in vergelijking met de overeenkomstige mono-cultuursferoïden

3.5 Flowcytometrische kwantificering van prolifererende cellen

Op dag 1 na generatie kon een verrassend hoog aantal Ki67-positieve cellen worden gevonden in zowel mono- als co-cultuursferoïden (figuren 3h en 4h). Van belang was dat meer cellen proliferatief waren in beide groepen sferoïden bestaande uit 50.000 cellen in vergelijking met de kleinere sferoïden. Maar al op dag 3 na generatie nam het hoge aantal Ki67-positieve cellen dramatisch af en op dag 6 kon bijna geen proliferatie meer worden gedetecteerd (figuren 3i en 4i). In de meeste gevallen was het aantal Ki67-positieve cellen significant hoger in monocultuursferoïden in vergelijking met cocultuursferoïden.


Stap 4: Optimaliseren

Minimaliseer de achtergrond en behoud de fotostabiliteit van fluorescentiesignalen.

Signaal-tot-achtergrondverhouding kan worden geoptimaliseerd door reagentia te gebruiken die extracellulaire fluorescentie verminderen en de fotostabiliteit van de fluorofoor verhogen. Het is belangrijk om afbeeldingen te maken in media die speciaal zijn ontworpen om de celgezondheid te behouden en tegelijkertijd achtergrondfluorescentie te verminderen of te elimineren in experimenten met live-celbeeldvorming (zie tafel 1). De toevoeging van een achtergrondonderdrukker die compatibel is met levende cellen kan ook helpen de extracellulaire achtergrondfluorescentie te verminderen en de noodzaak van een wasstap te elimineren. Antifade-montagemedia voor levende cellen kunnen op monsters worden toegepast om fotobleken van fluoroforen te verminderen, waardoor signaalverlies bij meerdere of lange blootstellingen wordt voorkomen.

Tabel 1. Vergelijking van beeldmedia.

Hoogtepunten van het product

    wordt gebruikt bij het waarnemen van een hoog achtergrondsignaal of zwakke fluorescentie in de blauwe, groene of rode kanalen. wordt gebruikt om de fotostabiliteit van de fluorofoor te vergroten. is ideaal voor het wassen van cellen en beeldvorming op korte termijn waar langdurige incubatie niet vereist is. is een optisch heldere oplossing die wordt gebruikt voor beeldvorming, het laden van kleurstoffen en wasstappen. Het helpt de cellen tot 4 uur gezond te houden.

Levende HeLa-cellen gelabeld met Tubulin Tracker Green-kleurstof en Tubulin Tracker Deep Red-kleurstof. Beide labels vertonen een hoge off-cell achtergrond wanneer de sonde in de kleuroplossing wordt gelaten (links). Toevoeging van BackDrop Background Suppressor vermindert de extracellulaire achtergrond aanzienlijk terwijl de intracellulaire labeling onaangetast blijft (rechts), waardoor een no-wash-protocol mogelijk wordt voor contrastrijke beeldvorming van tubuline in levende cellen.

De algehele signaalbescherming die wordt geboden door ProLong Live-reagensvergeleken met onbehandelde monsters wordt berekend op basis van het scannummer waarbij behandelde en onbehandelde monsters de EC50-waarde bereiken. De toevoeging van ProLong Live-reagens maakte 100% meer opnames mogelijk met Invitrogen CellLight Mitochondria-RFP-reagens.

Na 120 opnamen met een standaard time-lapse-beeldvormingsprotocol, met ProLong Live-reagens behandelde monsters zijn >20% helderder dan onbehandelde cellen, waardoor meer tijd nodig is voor het verzamelen van gegevens.

  • Als er geen verdere kweek is gepland, kan een achtergrondonderdrukker worden gebruikt om het signaal te optimaliseren door de waas te verminderen en het contrast te verhogen.
  • Het is aangetoond dat het gebruik van een antifade-reagens de fotostabiliteit van de fluorofoor verhoogt en het effect van fototoxiciteit in verschillende soorten monsters vermindert.

Methoden:

Antilichamen en reagentia

De op suiker gebaseerde celtransportoplossing (SBTS) is een niet-toxisch gepatenteerd mengsel van koolhydraten met een hoog en een laag molecuulgewicht (HemSol™). CellSieve™ CTC-microfiltratiesysteem van Creatv Microtech (Rockville, MD) dat gebruik maakt van een lagedrukvacuümsysteem dat CTC's isoleert op basis van grootte-uitsluiting, > 7 micron, zoals eerder beschreven [42-44]. Op de CTC's gebruikte vlekken waren CellTrackerTM Blue CMAC-kleuring van levende cellen (Thermo-Fisher). FITC-gelabelde Pan-cytokeratine-kloon C11 (Sigma), die humane cytokeratines 4, 5, 6, 8, 10, 13 en 18 herkent. Phycoerythrin (PE)-gelabeld anti-humaan epitheelceladhesiemolecuul (EpCAM), kloon 1B7 (eBioscience) . Alexa Fluor® 594 gelabeld anti-humaan CD45, kloon 2D1 (Novus) en DRAQ5™ fluorescerende DNA-probe (Thermo-Fisher). Blootstellingstijden (en ex/em-golflengten van de Leica-microscoopfilters) waren respectievelijk: Blauw CMAC: 35 msec, (350 nm/460 nm) FITC-CK, 500 msec (470 nm/525 nm) PE-EpCAM, 500 msec (546 nm/585 nm) Alexa Fluor594 500 msec (594 nm/645 nm) . DRAQ5 600 msec (640 nm/690 nm). Monsters werden geanalyseerd met behulp van een Leica fluorescentiemicroscoop en afgebeeld met een Leica-camera en Leica Microsystems-beeldvormingssoftware.

Cellijnen, primaire cellen en bloedmonsters

Eierstokcellen van de Chinese hamster (CHO), menselijke embryonale niercellen (HEK 293), menselijke endotheelcellen van de navelstrengader (HUVEC) en menselijke epitheliale colorectale adenocarcinoomcellen (CACO-2) menselijke epitheelcellen van borstkanker (MCF-7), naast primaire menselijke cellen werden gekocht bij ATCC. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) werden geïsoleerd uit volbloedmonsters die waren verkregen van gezonde vrijwilligers met behulp van Ficoll-scheiding (GE Healthcare) zoals beschreven door de fabrikant. Bloedmonsters van gezonde vrijwilligers werden verkregen met ondertekende geïnformeerde toestemming en IRB-goedkeuring door Western IRB. Bloedmonsters van patiënten werden verzameld met ondertekende geïnformeerde toestemming en een IRB met Inova Fairfax Hospital.

Incubatie van cellen en cellijnen met HemSol™ transportoplossing

HemSol™-conserveringsexperimenten met primaire humane hepatocyten, B-cellen, niercellen, mesenchymale stamcellen en niet-kleincellig (NSC) longcarcinoom werden uitgevoerd in samenwerking met AscentGene Inc. (Gaithersburg, MD). Voorafgaand aan de behandeling met HemSol™ werden ongeveer 105 –107 cellen in hun respectievelijke groeimedia bewaard. Levende cellen werden geteld door uitsluiting met trypaanblauw. Cellen werden vervolgens gemengd met geconcentreerd HemSolTM (2-6X) voor een eindconcentratie van 1X HemSolTM. De cellen werden vervolgens gedurende de aangegeven tijd bij omgevingstemperatuur in de oplossing bewaard, waarna de HemSol™ werd weggewassen met behulp van de respectieve celmedia en levende cellen werden bepaald met trypanblauw-uitsluiting en vermeld in Tabel 1.

Analyse van MCF-7-cellen verrijkt met normaal volbloed met HemSol™-transportoplossing

Menselijke borstkankercellijn (MCF-7) werd gelabeld met CellTracker™ Green (Invitrogen) volgens de protocollen van de fabrikant en de cellen werden vervolgens gewassen om de resterende vrije kleurstof te verwijderen. CellTracker™ Green is een intracellulaire kleuring die alleen levende cellen labelt en wordt vastgehouden door celnageslacht, waardoor tracking over meerdere generaties mogelijk is. Ongeveer 10.000 van de gemerkte MCF-7-cellen werden toegevoegd aan 8 ml normaal volbloed. 4 ml van dat bloedmonster werd vervolgens gemengd met HemSolTM en 4 ml werd 4 dagen bij kamertemperatuur zonder HemSolTM geïncubeerd. Na de incubatie werd het bloed gefiltreerd en de filters in weefselkweek gedaan met DMEM, 10% serum bij 37 °C, 5% CO2 en afgebeeld na 3 dagen in cultuur. Een tweede set gelabelde MCF-7-cellen werd gedurende 7 dagen bij kamertemperatuur in volbloed gehouden, gevolgd door filtratie met behulp van het CellSieve ™ CTC-microfiltratiesysteem van Creatv Microtech, zoals eerder beschreven [42-44] en afgebeeld.

Analyse van bloedmonsters van kankerpatiënten die zijn geïncubeerd met HemSol™-transportoplossing

Om de bewaring van levende CTC's in HemSol™ te bepalen, werden dubbele volbloedmonsters (7,5 ml) van 1 borstkankerpatiënt, 1 alvleesklierkankerpatiënt en 1 longkankerpatiënt verzameld in EDTA-vacutainers en de inhoud van één buisje werd onmiddellijk overgebracht naar een 15 conische buis van ml met 6X geconcentreerd HemSol™, dat werd verdund tot 1X HemSol™ met het bloed en gemengd voor volledige verspreiding. Het duplicaat bloedmonster werd overgebracht naar een conische buis die PBS bevatte in hetzelfde volume als het geconcentreerde HemSolTM, en op dezelfde manier gemengd. De bloedmonsters werden 6 dagen bij kamertemperatuur bewaard zonder roeren en vervolgens gefractioneerd door de monsters 1:1 te mengen met PBS en de monsters op Ficoll te leggen. De monsters werden gecentrifugeerd bij 400 x g gedurende 30 minuten bij 18 ° C in centrifugebuizen van 50 ml volgens de instructies van de fabrikant. HemSol™ interfereerde niet met de dichtheidsscheiding van rode bloedcellen van de PBMC buffy coat-laag. De verzamelde buffy coat-laag werd gepelleteerd door centrifugatie en geresuspendeerd in 1 ml PBS met CellTrackerTM Blue CMAC Dye cell live stain (Invitrogen) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur volgens de instructies van de fabrikant. Na incubatie werd ongebonden kleurstof verwijderd door centrifugatie en hersuspenderen van de celpellet in 2 ml PBS gevolgd door opnieuw centrifugeren. De resulterende celpellet werd vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS met 1% paraformaldehyde (PFA), 5 mM EDTA en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na fixatie werden de cellen gefilterd met behulp van CellSieve™ microfiltratiesysteem (Creatv Microtech) [42–45] ingesteld op een stroomsnelheid van 5 ml/min. De gevangen cellen werden vervolgens gepermeabiliseerd met PBS dat 0,4% Triton X-100 in PBS bevatte, tweemaal gewassen met 4 ml PBS en gekleurd zoals eerder beschreven [42-45].


Dankbetuigingen

We danken Jie Gao voor gedeeltelijke confocale gegevensverzamelingen, Guanlong Guo voor het bieden van hulp bij elektrofysiologische opnames en nuttige discussies van andere Xiaoyu Xu-laboratoriumleden. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81473549), het Chongqing Postgraduate Research Innovation Project (CYS18098) en de Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2020D037). De financiers hadden geen rol bij het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.


Bekijk de video: Examen biologie: bacteriën en virussen (December 2021).