Informatie

4.12: Intermediair metabolisme - biologie


De directe energiebron voor de meeste cellen is: glucose. Andere koolhydraten, vetten en eiwitten kunnen in bepaalde cellen of op bepaalde tijden als bron van ATP worden gebruikt. De complexiteit van het mechanisme waarmee cellen glucose gebruiken, doet je misschien vurig hopen dat niet voor elke soort brandstof een soortgelijk geconstrueerd systeem nodig is. En dat is het inderdaad niet.

Een van de grote voordelen van de stapsgewijze oxidatie van glucose tot CO2 en H2O is dat verschillende van de tussenproducten die tijdens het proces worden gevormd, het glucosemetabolisme koppelen aan het metabolisme van andere voedselmoleculen.

Wanneer bijvoorbeeld vetten als brandstof worden gebruikt, wordt het glycerolgedeelte van het molecuul omgezet in PGAL en komt op dat moment in de glycolytische route. Vetzuren worden omgezet in moleculen van acetyl COA en gaan de ademhalingsroute binnen om te worden geoxideerd in de mitochondriën. De aminozuren die vrijkomen bij de hydrolyse van eiwitten kunnen ook als brandstof dienen.

  • Eerst wordt de stikstof verwijderd, een proces dat deaminering wordt genoemd.
  • De resterende fragmenten komen dan op verschillende punten in de luchtwegen terecht.

Bijvoorbeeld,

  • de aminozuren Gly, Ser, Ala en Cys worden omgezet in pyrodruivenzuur en gaan de mitochondriën binnen om te worden ingeademd.
  • acetyl-CoA en verschillende tussenproducten in de citroenzuurcyclus dienen als toegangspunten voor andere aminozuurfragmenten (weergegeven in blauw).

Deze verbindingen maken dus de ademhaling van overtollige vetten en eiwitten in de voeding mogelijk. Er is geen speciaal mechanisme van cellulaire ademhaling nodig voor die dieren die voor hun energievoorziening grotendeels afhankelijk zijn van ingenomen vetten (bijvoorbeeld veel vogels) of eiwitten (bijvoorbeeld carnivoren).

Veel van het eiwit dat we consumeren, wordt uiteindelijk omgezet in glucose (een proces dat gluconeogenese wordt genoemd) om de hersenen en andere weefsels van brandstof te voorzien. Hoewel al onze voedingsmiddelen tot op zekere hoogte onderling converteerbaar zijn, zijn ze dat niet helemaal. Met andere woorden, geen enkel voedsel kan in al onze anabole behoeften voorzien. We kunnen inderdaad veel vetten synthetiseren uit glucose, maar bepaalde onverzadigde vetten kunnen niet worden gesynthetiseerd en moeten rechtstreeks in onze voeding worden opgenomen. Dit zijn linolzuur, linoleenzuur en arachidonzuur. Alle zijn onverzadigd; dat wil zeggen, dubbele bindingen hebben. Hoewel we 11 van de aminozuren uit koolhydraatvoorlopers kunnen synthetiseren, moeten we 9 andere (de "essentiële aminozuren") direct verkrijgen.

Veel van de punten die het koolhydraatmetabolisme verbinden met het katabolisme van vetten en eiwitten, dienen als tweewegkleppen (in de figuur aangegeven met tweekoppige pijlen). Ze bieden niet alleen aanknopingspunten voor het katabolisme (cellulaire ademhaling) van vetzuren, glycerol en aminozuren, maar ook voor hun synthese (anabolisme). Zo kan de katabole afbraak van zetmeel (via acetyl-CoA en PGAL) leiden tot de synthese van vet.

Fructose vormt een speciaal probleem

Fructose wordt geproduceerd door de vertering van de disaccharide sucrose (gewone tafelsuiker) in de monosacchariden glucose en fructose. Zowel glucose als fructose delen dezelfde empirische formule (C6H12O6) en dezelfde calorische inhoud (686 kcal/mol). Maar het lichaam behandelt ze heel anders.

Glucose wordt door alle cellen opgenomen en gemetaboliseerd om ATP te genereren door glycolyse en cellulaire ademhaling, en overtollige glucose wordt bij voorkeur omgezet in glycogeen in plaats van in vetten. Fructose wordt alleen door levercellen opgenomen en overtollige fructose wordt omgezet in vetten (vetzuren en glycerol). In de VS worden de meeste frisdranken en bereide voedingsmiddelen nu gezoet met fructose (60% fructose, 40% glucose) glucosestroop. Overmatige consumptie van deze producten kan heel goed in verband worden gebracht met de toenemende prevalentie in de VS van obesitas en diabetes type 2.


Wordt intermediair metabolisme weer een hot veld van de biologie?

Het 3 december nummer van Wetenschap bevatte een speciale sectie over metabolisme, met als inleiding een inleidend artikel getiteld “Metabolism is Not Boring'8221.

Lang geleden, in de jaren twintig tot en met de jaren vijftig, was intermediair metabolisme een hot veld van de biologie. Dit culmineerde in de toekenning van de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde in 1953 aan Hans Krebs 'voor zijn ontdekking van de citroenzuurcyclus'8221 en Fritz Lipmann voor zijn ontdekking van co-enzym A en het belang ervan voor het intermediaire metabolisme. 8221.

Zoals de meesten van jullie weten, publiceerden Watson en Crick datzelfde jaar, 1953, de structuur van DNA, waarmee ze in 1962 de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde kregen. Dit begon het grote tijdperk van de moleculaire biologie. Als gevolg van het overweldigende succes van de moleculaire biologie is de studie van het intermediaire metabolisme op de achtergrond geraakt. Het beantwoorden van de meeste vragen in toonaangevende biologie vereiste weinig of geen aandacht voor intermediair metabolisme. Zoals besproken in het overzichtsartikel van Steven L. McKnight dat is opgenomen in de speciale sectie, komt metabolisme echter weer op de voorgrond van de medische geneeskunde. Onderzoeksproblemen die zowel moleculaire biologie als metabolisme vereisen, lijken nu interessante en belangrijke uitdagingen.

Overwegingen van het intermediaire metabolisme zijn altijd belangrijk geweest bij de studie van zogenaamde metabole ziekten, met name diabetes type 2 en obesitas en aanverwante aandoeningen zoals dyslipidemie. Zoals echter zowel in het McKnight-artikel als in een artikel van Arnold J. Levine en Anna M. Puzio-Kuter wordt beschreven, is de studie van het intermediaire metabolisme nu ook belangrijk geworden bij kanker, met de ontdekking dat veranderingen in metabole enzymen kunnen leiden tot de productie van "oncometabolieten" die de groei van kankercellen ondersteunen.

In een artikel op deze blog van 31 december 2009 bespraken we onderzoek naar het metabolisme van kanker dat achter het technologieplatform van Agios Pharmaceuticals (Cambridge, MA) zit. In dat artikel benadrukten we de ontdekking dat mutaties in een metabool enzym, cytosolische isocitraatdehydrogenase (IDH1) een oorzakelijke factor zijn in een belangrijke subset van menselijke hersenkankers. De wildtype vorm van IDH1 katalyseert de NADP+-afhankelijke oxidatieve decarboxylering van isocitraat tot α-ketoglutaraat. De mutante vormen van IDH1 katalyseren echter de NADPH-afhankelijke reductie van α-ketoglutaraat tot R(-)-2-hydroxyglutaraat (2HG). 2HG lijkt een oncometaboliet te zijn die betrokken is bij de progressie van laaggradige gliomen naar dodelijke secundaire glioblastomen. Agios-onderzoekers en hun academische medewerkers impliceerden later mutaties in isocitraatdehydrogenase-enzymen en de productie van de oncometaboliet 2HG bij de pathogenese van acute myeloïde leukemie (AML).

Ook besproken in ons artikel was het Warburg-effect, waarbij kankercellen aerobe glycolyse uitvoeren (omzetting van glucose in lactaat, met de productie van 2 moleculen ATP, zelfs in aanwezigheid van zuurstof). Daarentegen metaboliseren de meeste normale zoogdiercellen glucose tot CO2 en water via glycolyse gekoppeld aan de mitochondriale citroenzuurcyclus, waarbij 36 ATP-moleculen worden gegenereerd. Agios wetenschappelijk oprichter en signaaltransductiepionier Lewis Cantley toonde aan dat er een verband is tussen groeifactor-gemedieerde signaaltransductie en aerobe glycolyse in kankercellen. Dr. Cantley en zijn collega's ontdekten in het bijzonder dat pyruvaatkinase M2 (PKM2) een verband is tussen signaaltransductie en aerobe glycolyse. PKM2 bindt aan tyrosine-gefosforyleerde signaaleiwitten, wat resulteert in de omleiding van glycolytische metabolieten van energieproductie via mitochondriale oxidatieve fosforylering naar anabole processen die nodig zijn voor snelle proliferatie van kankercellen.

De artikelen van McKnight en Levine en Puzio-Kuter bespreken ook het Warburg-effect in kankercellen en de rol van mutaties in verschillende metabole enzymen die bijdragen aan kwaadaardige fenotypes. Het McKnight-artikel merkt op dat naast dominante mutaties in isocitraatdehydrogenaten, zeldzame recessieve mutaties in fumaraathydratase en succinaatdehydrogenase ook geassocieerd zijn met kanker. Mutaties in de genen voor deze enzymen, gekoppeld aan verlies van het wildtype allel, resulteren in verhoogde intracellulaire niveaus van respectievelijk fumaraat en succinaat. Deze lijken te werken als oncometabolieten die activatie van de hypoxiereactieroute kunnen induceren, wat de inductie van aerobe glycolyse (het Warburg-effect) en angiogenese veroorzaakt.

Het artikel van Levine en Puzio-Kuter bespreekt ook de rol van oncogenen en tumorsuppressorgenen en hun signaalroutes bij het reguleren van het metabolisme en in het bijzonder bij het induceren van het Warburg-effect. P53-regulatie onderdrukt bijvoorbeeld het Warburg-effect en bevordert het mitochondriale oxidatieve metabolisme. Dus het verlies van p53-functie dat bij de meeste menselijke kankers wordt waargenomen, heeft de neiging om aërobe glycolyse te bevorderen. Andere signaalroutes die betrokken zijn bij met kanker geassocieerde veranderingen in het metabolisme omvatten de Akt- en mTOR-routes, die vaak worden gewijzigd door mutaties in sleutelgenen (bijv. mutaties in PTEN en amplificaties van dergelijke groeifactorreceptoren zoals Her2 en EGFR) bij kanker . Deregulering van deze routes activeert de hypoxie-responsroute, waardoor het Warburg-effect wordt geactiveerd.

Levine en Puzio-Kuter suggereren dat onderzoek gericht op een beter begrip van hoe kanker-geassocieerde signaalroutes biochemische metabole routes reguleren en het Warburg-effect veroorzaken, en de rol van het Warburg-effect in de pathogenese van kanker, kan leiden tot nieuwe strategieën voor het ontdekken van geneesmiddelen. in de oncologie.

De speciale sectie over metabolisme bevat ook een artikel over autofagie, een proces waarbij cellen cellulaire componenten afbreken om beschadigde biomoleculen en organellen te elimineren of om substraten voor metabolisme te verschaffen in geval van verhongering. Hoewel autofagie de gezondheid van cellen bevordert en degeneratieve ziekten kan voorkomen, kan het kankercellen ook in staat stellen te overleven in tumoren die arm zijn aan voedingsstoffen.

Er is ook een recensie van Jay Keasling over metabolic engineering om stoffen te produceren zoals natuurlijke productgeneesmiddelen, chemicaliën en biobrandstoffen. Metabolische engineering is een tak van synthetische biologie die metabole routes ontwikkelt om dergelijke stoffen te produceren, vandaar de opname van deze recensie in de speciale sectie over metabolisme. We hebben verschillende artikelen over synthetische biologie op deze blog, waarvan de meeste gericht zijn op metabolic engineering en de rol ervan bij de productie van geneesmiddelen en de ontdekking van geneesmiddelen.

Al met al is de speciale sectie van 3 december over metabolisme de moeite van het lezen waard voor basisonderzoekers, en voor onderzoekers op het gebied van de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen in biotechnologische en farmaceutische bedrijven. Het kan uw perspectieven verbreden en leiden tot nieuwe ideeën voor O&O of samenwerking, vooral bij het ontdekken van oncologische geneesmiddelen.
___________________________________________________

Als de producenten van deze blog en als adviseurs voor de biotechnologische en farmaceutische industrie, zou Haberman Associates graag van u horen. Als u werkzaam bent in een biotech- of farmaceutisch bedrijf en u wilt een 15-20 minuten durende, vrijblijvende telefonische discussie over kwesties die in deze of andere blogartikelen naar voren worden gebracht, of over andere kwesties die belangrijk zijn voor uw bedrijf, klik dan hier. We verwelkomen ook uw opmerkingen over dit of enig ander artikel op deze blog.


1. Inleiding

Metabolisme omvat de hele reeks chemische reacties die plaatsvinden in een levend organisme waardoor het zich kan reproduceren, ontwikkelen, zijn structuur kan behouden en op de omgeving kan reageren. Deze chemische reacties vormen een ingewikkeld netwerk van paden en cycli waarin de stroom van reactieproducten (metabolieten) wordt bepaald door vele regulerende mechanismen. Traditioneel wordt het metabolisme onderverdeeld in katabolisme, de afbraak van complexe moleculen, en anabolisme, processen die verband houden met de synthese van complexe organische stoffen.

Volgens de hierboven gegeven definitie omvat metabolisme elk cellulair proces, variërend van DNA-replicatie tot transcriptie en translatie tot enzymfunctie, en omvat het ook de chemie van kleine moleculen in de cel. In dit hoofdstuk zullen we ons concentreren op het intermediaire metabolisme, dat alle reacties beschrijft die te maken hebben met de opslag en opwekking van metabolische energie die nodig is voor de biosynthese van verbindingen met een laag molecuulgewicht en energieopslagverbindingen (Mathews en Van Holde, 1996). In de intermediaire metabolismeroute speelt de structuur van elk enzym een ​​cruciale rol bij het bepalen van de specifieke eigenschappen van elke reactie.

Begin jaren zeventig introduceerde Brenner Caenorhabditis elegans als een meercellig genetisch model, vooral omdat dit organisme zeer weinig somatische cellen heeft, wat het voor onderzoekers mogelijk maakte de cellijn te reconstrueren en de bedrading van het zenuwstelsel in kaart te brengen (Brenner, 1974). Sindsdien is het een van de krachtigste instrumenten geworden voor het bestuderen van de genetica van de ontwikkeling van metazoa, neurobiologie, veroudering en vele andere biologische processen. Deze worm is echter minder vatbaar voor klassiek biochemisch onderzoek. Het is soms moeilijk om grote hoeveelheden gesynchroniseerde individuen te verkrijgen, eierschalen en nagelriemen vormen een moeilijke barrière en het is vrijwel onmogelijk om zuiver weefsel in biochemisch relevante hoeveelheden te verzamelen (Mains en McGhee, 1999). Desalniettemin hebben veel metabolische studies van vrijlevende en parasitaire nematoden (Bolla, 1980) ons in staat gesteld om dieper inzicht te krijgen in de complexe biochemische gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan het leven van C. elegans .

Het intermediaire metabolische netwerk is goed geconserveerd bij eukaryoten en de belangrijkste metabole routes die worden gevonden in heterotrofe organismen zijn ook aanwezig in C. elegans (Vastrik et al., 2007). In het eerste deel van dit hoofdstuk gaan we dieper in op de kenmerken van deze algemene paden in onze C. elegans model. We zullen ons vervolgens concentreren op de vitale verbindingen die niet kunnen worden gesynthetiseerd door C. elegans en moeten daarom uit de omgeving worden gehaald. Vitaminen, essentiële aminozuren en andere verwante verbindingen worden besproken in het gedeelte over voedingsbehoeften. Aan het einde van dit hoofdstuk wordt ook een kort overzicht gegeven waarin de verschillende metabolische afvalproducten en de opslag en productie van metabolische energie in C. elegans .

Op veel kruispunten binnen het metabolische netwerk kan de stroom van metabolieten worden omgeleid naar een specifieke richting, afhankelijk van de behoefte van het organisme op dat specifieke moment. Deze metabole verschuivingen kunnen onmiddellijk optreden, b.v. als reactie op veranderende omgevingen, of langzamer in de loop van de C. elegans levenscyclus. In sectie 6 zullen we enkele van de typische metabole veranderingen uitleggen die plaatsvinden vanaf de embryogenese tot het laatste larvale stadium, inclusief het gespecialiseerde dauer-stadium. We zullen ons ook richten op de metabolische veranderingen die gepaard gaan met het verouderingsproces van wormen, en de grote fluctuaties in biotische en abiotische omgevingsfactoren waarmee de bodembewoner te maken kan krijgen. C. elegans . Ten slotte bespreken we de metabole patronen die ontstaan ​​door veranderingen in temperatuur, voedselbeperking, zuurstofgebrek of osmotische stress.


Op expressie gebaseerde netwerkbiologie identificeert verandering in de belangrijkste regulerende routes van diabetes type 2 en de bijbehorende risico's/complicaties

Type 2 diabetes mellitus (T2D) is een multifactoriële en genetisch heterogene ziekte die leidt tot verminderde glucosehomeostase en insulineresistentie. De gevorderde vorm van ziekte veroorzaakt acute cardiovasculaire, renale, neurologische en microvasculaire complicaties. Er is dus een constante behoefte om nieuwe en efficiënte behandelingen tegen de ziekte te ontdekken door verschillende nieuwe alternatieve signaleringsmechanismen te ontdekken die kunnen leiden tot diabetes en de bijbehorende complicaties. De huidige studie maakt detectie van moleculaire doelen mogelijk door hun rol in veranderde biologische routes tijdens diabetes en de bijbehorende risicofactoren en complicaties te ontrafelen. We hebben een geïntegreerd concept van functionele netwerken gebruikt door co-expressienetwerk en interactienetwerk samen te voegen om de transcriptioneel veranderde routes en reguleringen die bij de ziekte betrokken zijn, te detecteren. Onze analyse rapporteert vier nieuwe significante netwerken die kunnen leiden tot de ontwikkeling van diabetes en andere geassocieerde disfuncties. (a) Het eerste netwerk illustreert de opwaartse regulatie van TGFBRII die oxidatieve stress faciliteert en de expressie van vroege transcriptiegenen veroorzaakt via de MAPK-route, wat leidt tot cardiovasculaire en niergerelateerde complicaties. (b) Het tweede netwerk demonstreert nieuwe interacties tussen GAPDH en inflammatoire en proliferatie kandidaat-genen, d.w.z. SUMO4 en EGFR, wat wijst op een nieuw verband tussen obesitas en diabetes. (c) Het derde netwerk toont unieke interacties PTPN1 met EGFR en CAV1 die zouden kunnen leiden tot een verminderde vasculaire functie bij diabetische nefropathie. (d) Ten slotte hebben we uit ons vierde netwerk afgeleid dat de interactie van bèta-catenine met CDH5 en TGFBR1 via Smad-moleculen zou kunnen bijdragen aan endotheeldisfunctie. Een kans op het optreden van niercomplicaties kan worden gesuggereerd in T2D-conditie. Een experimenteel onderzoek naar dit aspect kan verder leiden tot een meer beslissende observatie bij de identificatie van geneesmiddeldoelen en een beter begrip van de pathofysiologie van T2D en de complicaties ervan.

Belangenconflict verklaring

Concurrerende belangen: De auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belangen bestaan.

Figuren

Figuur 1. Overzicht geïntegreerd netwerk van…

Figuur 1. Overzicht van geïntegreerd netwerk van gen-gen co-expressie en eiwit-eiwit interactie-informatie van microarray ...

Afbeelding 2. TranscriptionFactors_KidneyComplication-netwerk illustreert de interactie...

Figuur 2. TranscriptionFactors_KidneyComplication-netwerk illustreert de interactie van proto-oncogenen met SMAD-moleculen en nucleaire receptoren...

Figuur 3. GAPDH-EGFR_MicrovascularComplication-netwerk toont EGFR-geïnduceerde ...

Figuur 3. GAPDH-EGFR_MicrovascularComplication-netwerk toont EGFR-geïnduceerde insulineresistentie en verminderde GAPDH-geïnduceerde microvasculaire...

Figuur 4. Akt/Pi3k-pathway_VascularDysfunction-netwerk vertoont opwaartse regulering...

Figuur 4. Akt/Pi3k-pathway_VascularDysfunction-netwerk toont opwaartse regulering van deze route door verhoogde expressie van EGFR...

Figuur 5. Wnt_VascularComplication-netwerk toont de interactie...

Figuur 5. Wnt_VascularComplication-netwerk toont de interactie tussen mitochondriale splitsing, ROS, Wnt-signalering en VE-cadherine ...

Figuur 6. Gemiddelde clusteringcoëfficiënt C(k) van...

Figuur 6. Gemiddelde clusteringcoëfficiënt C(k) van alle genen met k-links volgt de schaal...

Figuur 7. Machtswet knooppunt-graadverdeling voor...

Figuur 7. Machtswet knooppunt-graadverdeling voor de vier handtekeningnetwerken.

Figuur 8. Analyse van topologische coëfficiënten die modulaire…

Figuur 8. Topologische coëfficiëntenanalyse die de modulaire netwerkorganisatie aangeeft.


De onderlinge omzetting van brandstoffen en Waarom we dik worden van het eten van te veel snoep!

De directe energiebron voor de meeste cellen is: glucose.

Hoe energie wordt gewonnen uit glucose wordt beschreven in:
Glycolyse en in
Cellulaire ademhaling.

De complexiteit van het mechanisme waarmee cellen glucose gebruiken, doet je misschien vurig hopen dat niet voor elke soort brandstof een soortgelijk geconstrueerd systeem nodig is. En dat is het inderdaad niet.

Een van de grote voordelen van de stapsgewijze oxidatie van glucose tot CO2 en H2O is dat verschillende van de tussenproducten die tijdens het proces worden gevormd, het glucosemetabolisme koppelen aan het metabolisme van andere voedselmoleculen.

Wanneer bijvoorbeeld vetten als brandstof worden gebruikt, wordt het glycerolgedeelte van het molecuul omgezet in PGAL en komt op dat moment in de glycolytische route. Vetzuren worden omgezet in moleculen van acetyl COA en gaan de ademhalingsroute binnen om te worden geoxideerd in de mitochondriën.

  • Eerst wordt de stikstof verwijderd, een proces dat deaminering wordt genoemd.
  • De resterende fragmenten komen dan op verschillende punten in de luchtwegen terecht.
  • de aminozuren Gly, Ser, Ala en Cys worden omgezet in pyrodruivenzuur en gaan de mitochondriën binnen om te worden ingeademd.
  • acetyl-CoA en verschillende tussenproducten in de citroenzuurcyclus dienen als toegangspunten voor andere aminozuurfragmenten (weergegeven in blauw).

Deze verbindingen maken dus de ademhaling van overtollige vetten en eiwitten in de voeding mogelijk. Er is geen speciaal mechanisme van cellulaire ademhaling nodig voor die dieren die voor hun energievoorziening grotendeels afhankelijk zijn van ingenomen vetten (bijvoorbeeld veel vogels) of eiwitten (bijvoorbeeld carnivoren).

Veel van het eiwit dat we consumeren, wordt uiteindelijk omgezet in glucose (een proces dat gluconeogenese wordt genoemd) om de hersenen en andere weefsels van brandstof te voorzien.

Hoewel al onze voedingsmiddelen tot op zekere hoogte onderling converteerbaar zijn, zijn ze dat niet helemaal. Met andere woorden, geen enkel voedsel kan in al onze anabole behoeften voorzien.

We kunnen inderdaad veel vetten synthetiseren uit glucose, maar bepaalde onverzadigde vetten kunnen niet worden gesynthetiseerd en moeten rechtstreeks in onze voeding worden opgenomen.

Ze zijn allemaal onverzadigd, dat wil zeggen, ze hebben dubbele bindingen.

Hoewel we 11 van de aminozuren uit koolhydraatvoorlopers kunnen synthetiseren, moeten we 9 andere (de "essentiële aminozuren") direct verkrijgen.

Veel van de punten die het koolhydraatmetabolisme verbinden met het katabolisme van vetten en eiwitten, dienen als tweewegkleppen (in de figuur aangegeven met tweekoppige pijlen). Ze bieden niet alleen aanknopingspunten voor het katabolisme (cellulaire ademhaling) van vetzuren, glycerol en aminozuren, maar ook voor hun synthese (anabolisme). Zo kan de katabole afbraak van zetmeel (via acetyl-CoA en PGAL) leiden tot de synthese van vet (zoals velen van ons weten!).

Fructose vormt een speciaal probleem

Fructose wordt geproduceerd door de vertering van de disaccharide sucrose (gewone tafelsuiker) in de monosacchariden glucose en fructose [View]. Zowel glucose als fructose delen dezelfde empirische formule (C6H12O6) en dezelfde calorische inhoud (686 kcal/mol). Maar het lichaam behandelt ze heel anders.


Invoering

Initiële evolutionaire studies van de biochemische functie, die aanleiding gaven tot vergelijkende biochemie, waren voornamelijk gericht op soortspecifieke kenmerken of interspecifieke verschillen in biochemische eigenschappen, met name aspecten van de enzymfunctie en het metabolisme (Somero, 1969 Baldwin, 1970 Hochachka, 1973 Hochachka en Somero, 2002). Deze onderzoeken werden voornamelijk uitgevoerd door biochemici of fysiologen, waren zwaar op biochemie maar licht op evolutie, en werden voornamelijk gepubliceerd in fysiologische of biochemische tijdschriften. Vanaf het einde van de jaren zestig tot de jaren zeventig begonnen evolutionaire biologen genetisch variabele enzymen (allozymen, enzympolymorfisme) te gebruiken als handige experimentele modellen om algemene evolutionair-genetische kwesties te onderzoeken, zoals het relatieve belang van natuurlijke selectie. versus willekeurige genetische drift in micro-evolutie (populatiegenetica van de kortetermijnevolutie). De eerste studies waren zwaar op evolutie maar licht op biochemie, en werden voornamelijk gepubliceerd in evolutionaire of genetische tijdschriften (Lewontin, 1974 Selander, 1976) (beoordeeld door Mitton, 1997). Gedetailleerde kennis van de enzymfunctie werd echter steeds meer gezien als essentieel om een ​​adequaat onderscheid te maken tussen concurrerende evolutionaire hypothesen (bijv. neutralistisch-selectionistisch debat), en diepgaande functionele karakteriseringen van enzymen werden geleidelijk een belangrijk onderzoeksfocus (Koehn et al., 1983 Eanes , 1999 Watt en Dean, 2000). Deze ontwikkeling leidde tot een diepere, meer evenwichtige synthese tussen functionele biochemie en micro-evolutie (populatiegenetica), waarbij zowel geavanceerde biochemische benaderingen [bijv. kinetische analyses van katalytische efficiëntie (Hall en Koehn, 1983)] en krachtige populatie-genetische analyses van enzymevolutie (Eanes, 1999 Storz en Wheat, 2010).

In het afgelopen decennium zijn micro-evolutionaire studies van de biochemische functie uitgebreid om zich steeds meer te richten op adaptieve veranderingen in routes van intermediair metabolisme in tegenstelling tot functionele aspecten van een individueel enzym. Zoals hieronder in meer detail wordt besproken, hebben micro-evolutionaire studies van intermediair metabolisme bijvoorbeeld vanuit een nieuw perspectief lang bestaande problemen in de evolutie onderzocht die niet eerder vanuit een biochemisch oogpunt zijn bestudeerd [hybride afbraak en soortvorming, parallelle evolutie (Burton, 2006 Rausher, 2008 Streisfeld en Rausher, 2009)]. Bovendien heeft metabolische informatie ons begrip van traditionele onderwerpen van biochemische evolutie zoals biochemische aanpassing aan temperatuur uitgebreid (Eanes, 1999), en heeft het ook aanzienlijk bijgedragen aan basisonderzoek naar de genetica van adaptieve evolutie (Rausher, 2008), en de evolutie van complexe eigenschappen, zoals levensgeschiedenis (Zera en Harshman, 2009 Zera en Harshman, 2011). Ten slotte dragen micro-evolutionaire studies van intermediair metabolisme aanzienlijk bij tot de ontwikkeling van evolutionaire systeembiologie, die zich richt op de evolutie van hele netwerken (bijv. glycolyse) (Eanes, 1999 Eanes, 2011), en het effect van netwerkattributen op de evolutie van individuele eiwitten (bijv. 'pathway position' en snelheid van eiwitevolutie) (Eanes, 1999 Dykhuizen en Dean, 2009 Rausher et al., 1999 Rausher et al., 2008 Wright en Rausher, 2010).

Waarom de toegenomen aandacht voor de evolutie van metabolismeroutes?

Een aantal factoren hebben geleid tot een toegenomen interesse in de evolutie van intermediair metabolisme, met name: (1) toenemende waardering voor het belang van integratieve, multi-level onderzoeken (2) een toenemende verschuiving naar 'netwerk'- of 'systeem'-denken en (3) recente technologische ontwikkelingen (omics) die het mogelijk maken om meerdere componenten van paden tegelijk te karakteriseren. Sinds de jaren tachtig is er in de evolutionaire biologie steeds meer aandacht voor integratieve studies die onderzoeken over meerdere niveaus van de biologische hiërarchie koppelen, vaak van het gen tot het hele organisme (Koehn et al., 1983 Feder en Watt, 1992 Eanes, 1999 Rausher, 2008 Zera en Harshman, 2009) (Fig. 1). In deze studies neemt het intermediaire metabolisme vaak een centrale 'gateway'-positie in, die de link legt tussen moleculaire variatie en variatie in de prestaties van het hele organisme.

Eén type integratieve studie kan worden geclassificeerd als 'bottom-up', waarbij het doel is om te begrijpen in hoeverre moleculaire of biochemische variatie de fitness verandert en dus kan worden beïnvloed door natuurlijke selectie. Een klassiek voorbeeld van zo'n 'verticaal, bottom-up' type onderzoek is het onderzoek naar enzympolymorfisme (Koehn et al., 1983 Watt, 1991 Eanes, 1999 Watt en Dean, 2000 Storz en Wheat, 2010). Het is al lang bekend dat biochemische verschillen tussen allozymen (genetische varianten van een bepaald enzym) noodzakelijk maar niet voldoende zijn om de fitheid van het organisme te beïnvloeden. Om fitheid te beïnvloeden, moeten allozymen de flux differentieel beïnvloeden via het pad waarin ze functioneren. Gezien de vaak niet-lineaire, hyperbolische relatie tussen enzymactiviteit en routeflux (Kacser en Burns, 1979, Kacser en Burns, 1981, Dykuizen en Dean, 1990), waarbij een grote verandering in enzymactiviteit vaak slechts een kleine verandering in flux, is een dergelijke allozym-afhankelijke modulatie van flux geenszins zeker. Dit besef bracht onderzoek naar allozymen en padflux naar de voorgrond in evolutionaire studies van allozymfunctie, en deze heroriëntatie op routes van metabolisme is tot op de dag van vandaag voortgezet (Koehn et al., 1983 Eanes, 1999 Eanes, 2011 Dykhuizen en Dean, 2009).

In andere gevallen was de motivatie voor een integratief onderzoek om de evolutie van een fenotype van het hele organisme te begrijpen, door te begrijpen hoe de onderliggende componenten van de eigenschap evolueren. Dit type onderzoek kan worden geclassificeerd als 'top-down' (Zera en Harshman, 2009 Zera en Harshman, 2011 Dykhuizen en Dean, 2009). Om bijvoorbeeld de evolutie van bloemkleur of een levensgeschiedeniskenmerk zoals verspreiding te begrijpen, hebben werknemers, zoals hieronder in meer detail besproken, veranderingen onderzocht in (i) de routes van intermediair metabolisme die bloempigmenten / lipide vluchtbrandstof produceren, (ii) de enzymen die de routes omvatten, en (iii) de genen die coderen voor de enzymen (Rausher, 2008 Zera en Harshman, 2009). Bovendien, omdat deze routes uit veel interagerende componenten (bijv. Enzymen) bestaan, omvatten deze onderzoeken vaak zowel 'horizontaal' als 'verticaal' onderzoek (Fig. 1). Wat de motivatie ook is, onderzoek naar de oorzaken en gevolgen van wijzigingen van het intermediaire metabolisme speelt een belangrijke rol in deze integratieve studies van adaptatie.

Naast het toenemende belang van integratieve studies, is er een toenemend besef van het belang van netwerk- of systeemdenken in evolutionaire analyse (Eanes, 1999 Dykhuizen en Dean, 1990 Dykhuizen en Dean, 2009 Rausher et al., 2008). Veel aanpassingen bestaan ​​uit een netwerk van op elkaar inwerkende componenten, en om te begrijpen hoe een dergelijke aanpassing evolueert, is het noodzakelijk om te begrijpen hoe de eigenschappen van de componenten evolueren door hun invloed op een bepaalde systemische eigenschap. Omgekeerd kan de functionele positie van een component in het netwerk de evolutionaire dynamiek van die component sterk beïnvloeden. Paden van intermediair metabolisme zijn uitstekende voorbeelden van netwerken en er is toenemende belangstelling voor de evolutie van systemische eigenschappen van metabole routes [bijv. de evolutionaire veranderingen in glycolytische flux (Eanes et al., 2006 Eanes, 2011)], evenals de invloed van route-eigenschappen op de evolutie van routecomponenten [bijv. evolutiesnelheid van een enzym kan afhankelijk zijn van zijn routepositie, b.v. vertakkingspunt versus stroomafwaarts (Eanes, 1999 Rausher et al., 1999 Rausher et al., 2008 Wright en Rausher, 2010)]. Deze toenemende focus op systemische eigenschappen brengt ook routes van intermediair metabolisme naar de voorgrond van studies van evolutionaire biochemie.

Diagram dat verticale en horizontale integratieve studies illustreert van de functionele oorzaken van aanpassing zoals toegepast op componenten van levensgeschiedenisvariatie in Gryllus. Verticale studies (binnen de stippellijnen) richten zich op de causaliteitsketen van een enkele factor door verschillende niveaus van de biologische hiërarchie. In dit geval resulteert variatie in de sequentie en/of expressie van een bepaald gen in geassocieerde variatie in enzymactiviteit, flux door de route waarin het enzym functioneert, en, ten slotte, variatie in een eigenschap van het hele organisme. Horizontale studies (binnen de ononderbroken lijnen) richten zich op meerdere variatiecomponenten op een bepaald niveau van de biologische hiërarchie. In dit geval geeft variatie in meerdere enzymen aanleiding tot variatie in flux door de route waarin de enzymen functioneren. Subscripts verwijzen naar verschillende genen, producten van de genen, enz. In dit voorbeeld zijn de centrale aspecten van de systemische (hele-organisme) fysiologie fluxen door de routes van vetzuurbiosynthese (FA-flux) en vetzuuroxidatie (FA ox flux), die bijdragen aan de triglyceridenconcentratie van het hele organisme.

Diagram dat verticale en horizontale integratieve studies illustreert van de functionele oorzaken van aanpassing zoals toegepast op componenten van levensgeschiedenisvariatie in Gryllus. Verticale studies (binnen de stippellijnen) richten zich op de causaliteitsketen van een enkele factor door verschillende niveaus van de biologische hiërarchie. In this case, variation in the sequence and/or expression of a particular gene results in associated variation in enzyme activity, flux through the pathway in which the enzyme functions, and, finally, variation in a whole-organism trait. Horizontal studies (within the solid lines) focus on multiple components of variation at a particular level of the biological hierarchy. In this case, variation in multiple enzymes gives rise to variation in flux through the pathway in which the enzymes function. Subscripts refer to different genes, products of the genes, etc. In this example, the focal aspects of systemic (whole-organism) physiology are fluxes through the pathways of fatty-acid biosynthesis (FA flux) and fatty-acid oxidation (FA ox flux), which contribute to whole-organism triglyceride concentration.

Finally, the development of various omics approaches (genomics, transcriptomics, proteomics) has produced an unprecedented wealth of information on variation in components of intermediary metabolism. This information, in turn, has provided the opportunity to investigate evolutionary changes in whole pathways, which has made an important contribution to the increased interest in adaptive changes in pathways of metabolism (Frera et al., 1999 Gracey and Cossins, 2003 van Strallen and Roelofs, 2006 Larracuente et al., 2007 Greenburg et al., 2008 Matzkin and Markow, 2009 St-Cyr et al., 2008 Eanes, 2011). In the following section, I focus on five prominent areas of recent research on the microevolution of intermediary metabolism.


Glyceraldehyde

Toxicokinetics

As glyceraldehyde is a normal metabolic intermediate in humans, it cannot be readily categorized as a ‘toxic’ chemical. Given a large enough exposure or dose, any chemical can result in toxic injury. As with any aldehyde/alcohol, very high air concentrations or accidental ingestion of large amounts would be expected to overwhelm the body's natural defenses and produce an adverse effect (e.g., eye, nose, and lung irritation from airborne dust).

Glyceraldehyde is a chemical that occurs naturally in living organisms, including humans. It is an intermediate in the metabolism of fructose. In the liver, fructose is converted to fructose-1-phosphate by the enzyme fructokinase. Fructose-1-phosphate is then converted to two three-carbon molecules, glyceraldehyde and dihydroxyacetone phosphate, by the enzyme fructose-1-phosphate aldolase. Glyceraldehyde is then converted into glyceraldehyde-3-phosphate by the enzyme glyceraldehyde kinase. Glyceraldehyde-3-phosphate is a high-energy intermediate that provides the body with a way of extracting energy to make ATP, which can then be used to power other metabolic functions, such as muscle contraction. Following exposure and absorption of small to moderate doses, glyceraldehyde would be easily assimilated via this normal carbohydrate metabolic capacity.


We have developed highly efficient mass-spectrometry based technology for system-wide identification and quantification of PTM sites and established the bioinformatics platform for understanding the functional relevance of the PTMs in protein structure and cellular physiology.


BCMB 301: INTERMEDIARY METABOLISM

Carbohydrates: Digestion of carbohydrates, glycolysis and fate of pyruvate in different organisms tricarboxylic acid (TCA) cycle pentose phosphate pathway and fate of reduced coenzymes catabolism of monosaccharides other than glucose gluconeogenesis, Calvin Benson cycle, Cori cycle, glyoxylate cycle glycogenesis and glycogenolysis regulation of carbohydrate metabolism Diseases of carbohydrate metabolism.

Lipids: Digestion of triacylglycerols the different lipases (lipoprotein lipase, hormone-sensitive lipase) fate of glycerol beta-oxidation of fatty acids fate of products (acetyl and propionyl CoA, ketone bodies, reduced coenzymes) synthesis of fatty acids triacylglycerol, cholesterol regulation of metabolism.

Amino acids: Digestion of proteins, transamination, deamination and decarboxylation of amino acids and the fate of ammonia (urea cycle) and carbon skeleton metabolism of specific amino acids (aromatic and sulphur-containing amino acids) synthesis of amino acids in-born errors of amino acid metabolism regulation of metabolism.

Energetics: Free energy and biochemical reactions (spontaneity, anabolic and catabolic reactions) metabolic reactions and ATP energy of hydrolysis of ATP, ADP and phosphorylation products ATP production (substrate level and oxidative phosphorylation, photophosphorylation, C3, C4) coupling reactions uncoupling agents.


Methoden:

Strains, medium and cultivation conditions

The strains used in this study are listed in Table 4. All liquid cultivations were carried out using minimal medium as described in Blank and Sauer (2004) [21]. The pre-cultures were always cultured in glucose minimal medium. Other carbon sources or labeled substrates were only added to the experiment culture at 10 g/l each.

For flux analysis experiments, FY4 was freshly plated from a glycerol stock on a YPD (1% yeast extract, 2% peptone and 2% glucose) plate. The liquid pre-culture was inoculated from the YPD plates. For the experiment cultures, minimal medium containing 10 g/l of either glucose, mannose, galactose or pyruvate as sole carbon source was used. FY4 was cultured in 96-deep-well plates (Kuehner AG, Birsfeld, Switzerland) [35] as batch cultures at 30°C and 300 rpm in a shaker with 50 mm shaking amplitude. The culture volume was 1.2 ml. To improve mixing, a single 4 mm diameter glass bead (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) was added per deep-well. The minimal medium for experiment cultures contained a mixture of 20% [U- 13 C] labeled glucose ( 13 C enrichment ≥ 99%, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA) and 80% naturally labeled glucose. The same experiment was performed separately for mannose ( 13 C enrichment ≥ 99%, Omicron Biochemicals, South Bend, USA), galactose ( 13 C enrichment ≥ 98%, Omicron Biochemicals, South Bend, USA) and pyruvate ( 13 C enrichment ≥ 99%, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA). For glucose and galactose, additional flux experiments were performed with 100% [C1- 13 C] labeled glucose ( 13 C enrichment ≥ 99%, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, USA) or galactose ( 13 C enrichment ≥ 99%, Omicron Biochemicals, South Bend, USA) to better resolve the pentose phosphate pathway.

For the protein expression experiments, GFP-tagged strains and the TAP-tagged reference strain were plated from glycerol stocks on minimal medium plates supplemented with leucine (0.24 g/l), methionine (0.115 g/l) and uracil (0.05 g/l). Liquid pre-cultures of minimal medium containing leucine (0.24 g/l), methionine (0.115 g/l) and uracil (0.05 g/l) were inoculated from the minimal medium plates with 10 g/l glucose. The pre-cultures were cultivated in 96-deep-well plates with the same conditions as explained above. For the experimental culture, additionally histidine (0.025 g/l) was added to the minimal media already containing leucine, methionine and uracil, the carbon source was either 10 g/l glucose, mannose, galactose or pyruvate. The experiment cultures were cultivated in 96-microtiterplates in an incubator with online monitoring of biomass and fluorescence signals (mp2-labs, Aachen, Germany) at 30°C and 800 rpm and a shaking diameter of 3 mm.

For the transcriptional regulation experiment, the transcription factor deletion strains were freshly plated from glycerol stocks on YPD plates containing 300 μg/ml geneticin (G418) (Gibco, Paisley, UK). The liquid pre-cultures were inoculated from the YPD plates. For the liquid cultures yeast minimal medium was used. The pre-cultures were cultivated in 96-deep-well plates with 10 g/l glucose as described above. Medium and cultivation conditions were identical to the flux experiment described above. Only [U- 13 C] experiments were performed.

Determination of growth rate, uptake and secretion rates

Growth rates were determined in eight independent experiments on the naturally labeled carbon sources. To determine the growth rate, the optical density at a wavelength of 600 nm was measured in a spectra-photometer (Molecular Devices, Sunnyvale, USA) for 8 to 12 times over the whole growth curve of FY4. Specific growth rates were determined by linear regression of the logarithmic OD600 values over time from at least 6 data points at maximum rate.

The supernatant samples from mid-exponential growing cells were analyzed with an HPX-87H Aminex, ion-exclusion column (Biorad, Munchen, Germany) as described previously [36, 37] on an HPLC HP1100 system (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). The column temperature was 60°C and as eluant 5 mM H2DUS4 was used with a flow rate of 0.6 ml/min. Pyruvate, succinate and acetate were determined at a wavelength of 210 nm with the UV detector. Glucose, mannose, galactose, glycerol and ethanol were measured with a refractive index detector. The uptake and secretion rates were determined from two points (beginning of exponential growth and mid exponential growth), in eight replicates. The substrate or by-product concentrations during exponential growth were plotted against the corresponding cell dry weights. The cell dry weights were calculated from the OD600 values multiplied with a conversion factor that was previously determined. A linear fit was applied to calculate the slope. The inverse of this slope is the biomass yield in g/mmol. The non inversed slope was further multiplied with the growth rate to get uptake and secretion rates.

Flux analysis

The labeled cultures were inoculated with an OD600 of 0.015 or less. 1 ml of culture was harvested during mid-exponential growth (OD600 0.5 - 1.2). The cells were washed three times with ddH2O and stored at -20°C for GC-MS analysis. The supernatant was stored for determining uptake and secretion rates of glucose, mannose, galactose, pyruvate, ethanol, acetate, glycerol and succinate at -20°C. The experiment was repeated at least two times.

Samples for GC-MS analysis were prepared as described previously [20]. The frozen cell pellet was hydrolyzed with 6 mol/l HCl for 12 h at 105°C. The samples were dried at 95°C under a constant air stream. They were derivatized using 20 μl of the solvent DMF (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) and 20 μl of the derivatization agent N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyl-trifluoroacetamide with 1% tert-butyldimethylchlorosilane (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) for 1 h at 85°C. The mass isotopomer distributions of the protein-bound amino acids were measured with a 6890N GC system (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) combined with a 5973 Inert XL MS system (Agilent Technologies, Santa Clara, USA).

Flux ratios were determined from the mass isotopomer distribution of the protein-bound amino acids with the software FiatFlux [38] using the analytical equations developed by Blank and Sauer (2004) [21]. For the determination of the TCA cycle flux ratio, equation 3 of Blank and Sauer (2004) was applied [21]. For growth on pyruvate, only the split between anaplerosis and the TCA cycle could be resolved. The mass isotopomer distribution was corrected for the amount of unlabeled biomass and naturally occurring stables isotopes [20]. For the calculation of net fluxes, all flux ratios were taken from the [U- 13 C] experiment except for the carbon sources glucose and galactose where the ratio for the split between glycolysis and the pentose phosphate pathway was obtained from a [C1- 13 C] experiment. The gluconeogenic ratio varied dependent on the tuning of the MS instrument therefore a flux ratio range was used for the later calculation.

Net fluxes [39, 23] were calculated with the software Fiat Flux. The stoichiometric equation system was solved with constraints of ratios, uptake, secretion and biomass formation rates. For growth on pyruvate, only the flux through the TCA cycle was calculated from the split ratio between anaplerosis and the respiratory TCA cycle. The anaplerotic fraction of the flux into the TCA cycle equals the flux from 2-oxoglutarate to the biomass. Since Mae1p is not expressed during growth on pyruvate (enzyme abundance measurement) we can calculate the actual flux through the TCA cycle from the flux through the anaplerotic reaction and the flux ratio. For all further calculations we assume a standard deviation of 20% for the respiratory flux through the TCA cycle on pyruvate. In the same way then described for pyruvate, the respiration is quantified in the transcription factor deletion strains.

Protein abundance measurement

The enzyme expression level was calculated from the slope between the biomass signal (light scattering) [40] (excitation at 620 nm) and the GFP signal (excitation at 486 nm, emission at 510 nm) gained from the protein GFP-fusion strains [18] (Table 4). HO-TAP::HIS3 was used as reference to correct for auto fluorescence. Thus, the slope between the GFP and the biomass signal, calculated for the reference was subtracted from the slope calculated for the GFP-fusion strains. The slope, corrected for the autofluorescence, quantifies the enzyme abundances. Significant changes are assigned for p-values of 0.12 or lower which ensures that the error ranges between enzyme expression during growth on glucose compared to each other carbon source do not overlap and thus truly differential expressed enzymes are further investigated.

Prediction of involved transcription factors

Transcription factors are more often associated with a subset of differentially expressed proteins than expected by chance were determined by a statistical analysis adopted from Boyle et al. [28] as outlined in Kümmel et al. [29]: The likelihood is calculated with the hypergeometric distribution that a transcription factor is associated with the differential expressed enzymes between two conditions compared to all enzymes (Figure 4).

F : probability value of a transcription factors

k l: number of interactions between a transcription factor and the differential expressed enzymes

m : total number of interactions between a transcription factor and all investigated enzymes

N : number of differential expressed enzymes

N : total number of enzymes

The such calculated significants value F gives the probability that the transcription factor has at least the observed number of interactions with the subset of differential expressed enzymes by chance. When the probability value F is low we conclude that the considered transcription factor is likely to be involved in the regulation of the observed differential expressed enzymes. The transcription factor interactions were from the yeastract database (literature curated once) [27]. The differential expressed enzymes were in this study determined with GFP-fusion strains [18], whereas only p-values of 0.12 or lower were assigned as differentially expressed, which ensures that the error ranges between enzyme expression during growth on glucose compared to each other carbon source do not overlap and thus truly differential expressed enzymes are further investigated. We assigned transcription factors being most likely to regulate the up-regulated enzymes based on the F value (Figure 5). Thus we used, as compromise between the two data sets, the transcription factors with the lowest five F values for the further analysis. The program code is written in MatLab.


Bekijk de video: WoT Мини Новости - Прем 9 за Марафон Скоро и Техника 11 Уровня (December 2021).