Informatie

De strategie van Sanger DNA-sequencing begrijpen


De Sanger-sequencingmethode creëert grote aantallen sequenties van alle mogelijke lengtes, eindigend met een specifieke nucleotide, door te eindigen met een getagde (fluorescerende) nucleotide aan het einde.

Maar als je al fluorescerende nucleotiden van een specifieke base hebt, waarom doe je er dan niet gewoon een gewone PCR mee, maak dan een enorm aantal kopieën van volledige lengte van de originele sequentie, en bekijk dan eenvoudig de locaties waar de nucleotide fluoresceert om alle locaties van die basis. Waarom hebben we een groot aantal exemplaren nodig die eindigen op elk mogelijk locatie, zoals bij de Sanger-methode?


Als je de volledige lengte van het DNA markeert met de fluorescerende labels, krijg je veel signalen van hetzelfde nucleotide zonder de mogelijkheid om onderscheid te maken waar het eigenlijke nucleotide bevindt zich op de streng.

Sanger-sequencing stopt niet bij de voorbereiding van de getermineerde en gelabelde DNA-strengen, de volgende stap is cruciaal om te kunnen onderscheiden waar de gelabelde base zich daadwerkelijk bevindt. Na labeling wordt het monster door capillaire gelelektroforese met hoge resolutie geleid om ze op grootte te sorteren. Het kleinste fragment komt eerst naar buiten, dan het fragment met één basis meer enzovoort. De detector die vervolgens identificeert welk fragment er doorheen komt, bevindt zich aan het uiteinde van het capillair.

Dit werkt zoals weergegeven in de schematische afbeelding (vanaf hier):

Als je een volledige streng zou markeren, is er geen onderscheid op grootte mogelijk (idealiter zou al het DNA op dezelfde hoogte van een gel lopen) en zouden alle fluorescerende signalen voor alle posities op dezelfde plek komen. Niet erg behulpzaam.


Voorwoord

Ik stelde oorspronkelijk voor om deze vraag te sluiten omdat ik denk dat het methodologische details verwart met strategie. Er is een geaccepteerd antwoord dat dingen verduidelijkt met een duidelijk diagram van de Sanger-methode. In de gegeven omstandigheden besloot ik een ander soort antwoord toe te voegen - een antwoord dat de nadruk legt op de principes die bij de verschillende benaderingen betrokken zijn, in plaats van praktische details die niet nauw verbonden zijn met de logica van de verschillende benaderingen.

Algemene strategie van DNA-sequencing

Ongeacht de methode vereist de bepaling van DNA (of een lineaire) sequentie twee stukken conceptuele informatie:

  1. Kennis van een bepaalde positie in de reeks.
  2. De identiteit van de basis op die positie. Dit wordt geïllustreerd in de grafiek. Daarnaast is er een praktische eis:
  3. Middelen om dit op unieke wijze te detecteren.

Laten we deze vergelijken in drie verschillende sequentiebenaderingen.

A. Chemische fragmentatie (Maxam & Gilbert)

Hier wordt het DNA waarvan de sequentie moet worden bepaald, aan één uiteinde gelabeld, behandeld met verschillende chemicaliën die in afzonderlijke reacties op verschillende basen splitsen.

  1. De positie wordt aangegeven door de lengte van het fragment.
  2. De basis is bekend van de gebruikte chemische stof.
  3. De detectie wordt uitgevoerd door de verschillende fragmenten op lengte te scheiden en hun radioactiviteit te gebruiken om ze zichtbaar te maken (door autoradiografie).

B. Ketenbeëindiging tijdens synthese (Sanger)

Deze methode maakt gebruik van door enzymen gekatalyseerd kopiëren van het DNA waarvan de sequentie moet worden bepaald, met beëindiging van het kopiëren geproduceerd door de vier di-deoxy-analogen van de deoxynucleotide-trifosfaten (dNTP's) in afzonderlijke reacties.

  1. De positie wordt aangegeven door de lengte van het fragment (zoals in A).
  2. De base is bekend van het bepaalde di-deoxy-analogon dat wordt gebruikt om de reactie te beëindigen.
  3. Detectie wordt uitgevoerd door de syntheseproducten op lengte te scheiden en de radioactiviteit of fluorescentie van de bij de synthese gebruikte dNTP's te gebruiken om ze te visualiseren.

(Opmerking bij de affiche: natuurlijk heb je fragmenten van alle verschillende lengtes nodig als je de basis op elke positie in de keten wilt identificeren.)

C. Gefaseerde synthese ('Next Generation Sequencing')

Dit type methode maakt ook gebruik van door enzymen gekatalyseerd kopiëren van het te sequencen DNA. Er is echter geen beëindiging van de ketens, zoals in B, maar de cycli van toevoeging worden gevolgd door verschillende technieken.

  1. De positie van een base in een sequentie wordt aangegeven door de cyclus van toevoeging waarbij de insertie van de base wordt gedetecteerd.
  2. De base is bekend van welke van de verschillende dNTP's de verlengingsreactie kan plaatsvinden.
  3. Detectiemethoden variëren, maar omvatten het detecteren van de afgifte van pyrofosfaat door koppeling aan een lichtemitterende reactie (pyrosequencing) en het detecteren van waterstofionen die vrijkomen tijdens de polymerisatie met behulp van een halfgeleiderchip (ionenstroom).

Coda: Principe en praktijk

Bij het benadrukken van de algemene principes van DNA-sequencing is de genoemde methodologie beperkt tot die welke nodig is voor detectie - het was zelfs niet nodig om PCR te noemen. Natuurlijk hebben verschillende methoden voor het voorbereiden van meerdere monsters voor sequencing de snelheid en kosten van DNA-sequencing enorm beïnvloed. De student moet echter de principes begrijpen voordat hij verzandt in de details, die b.v. in dit Wikipedia-artikel over sequencing en op de website van ATDBIO (zij het een niet ongeïnteresseerd bedrijf).


Hoe werkt Sanger-sequencing?

Laten we teruggaan naar de basis en het technologieplatform verkennen dat al jaren als de gouden standaard wordt beschouwd. Je raadt het al - we hebben het over Sanger Sequencing door capillaire elektroforese. Velen zullen zich afvragen: "Waarom wordt het Sanger Sequencing genoemd?" Sanger Sequencing is vernoemd naar de uitvinder van deze baanbrekende technologie, Dr. Frederick Sanger, die deze methode meer dan 40 jaar geleden in het midden van de jaren '70 ontwikkelde. Dus, wat zijn de basisprincipes van Sanger Sequencing?

Het begint allemaal met een korte primerbinding naast het interessegebied. In aanwezigheid van de 4 nucleotiden zal het polymerase de primer verlengen door het complementaire nucleotide van de matrijs-DNA-streng toe te voegen. Om de exacte samenstelling van de DNA-sequentie te vinden, moeten we deze reactie tot een bepaald einde brengen, zodat we de basis van het uiteinde van dit specifieke DNA-fragment kunnen identificeren. Sanger deed dit door een zuurstofatoom uit het ribonucleotide te verwijderen. Zo'n nucleotide wordt een dideoxynucleotide genoemd. Dit is analoog aan het gooien van een moersleutel in een versnelling. Het polymerase-enzym kan geen normale nucleotiden meer aan deze DNA-keten toevoegen. De extensie is gestopt en we moeten nu vaststellen wat het is. We identificeren het ketenbeëindigende nucleotide door een specifieke fluorescerende kleurstof, 4 specifieke kleuren om precies te zijn. Sanger-sequencing resulteert in de vorming van verlengingsproducten van verschillende lengtes die eindigen met dideoxynucleotiden aan het 3'-uiteinde.

De verlengingsproducten worden vervolgens gescheiden door capillaire elektroforese of CE. De moleculen worden door een elektrische stroom geïnjecteerd in een lange glazen capillair gevuld met een gelpolymeer. Tijdens CE wordt een elektrisch veld aangelegd zodat de negatief geladen DNA-fragmenten naar de positieve elektrode bewegen. De snelheid waarmee een DNA-fragment door het medium migreert, is omgekeerd evenredig met zijn molecuulgewicht. Dit proces kan de extensieproducten op grootte scheiden met een resolutie van één base. Een laser prikkelt de met kleurstof gelabelde DNA-fragmenten wanneer ze door een klein venster aan het einde van het capillair gaan. De geëxciteerde kleurstof zendt een licht uit met een karakteristieke golflengte die wordt gedetecteerd door een lichtsensor. Software kan het gedetecteerde signaal vervolgens interpreteren en vertalen naar een basisoproep. Wanneer de sequencing-reactie wordt uitgevoerd in de aanwezigheid van alle vier de nucleotiden die eindigen, krijg je uiteindelijk een pool van DNA-fragmenten die worden gemeten en base voor base worden gescheiden. Wat u uiteindelijk krijgt, is een gegevensbestand dat de volgorde van het DNA in een kleurrijk elektroferogram toont en een tekstbestand dat u kunt gebruiken om de vragen te beantwoorden die u mogelijk stelt.

En dat is in een notendop Sanger Sequencing.

Als je meer wilt weten, download dan ons gratis Sanger Sequencing Handbook.

We maken voortdurend nieuwe Seq It Out-video's, dus als je een idee hebt dat het een geweldig onderwerp zou zijn, stuur ons dan een bericht.


De strategie van Sanger DNA-sequencing begrijpen - Biologie

* Ontdekkingskracht is het vermogen om nieuwe varianten te identificeren.
† Mutatieresolutie is de grootte van de geïdentificeerde mutatie. NGS kan grote chromosomale herschikkingen identificeren tot op enkele nucleotidevarianten.
‡ 10 ng DNA zal produceren

1 kb met Sanger-sequencing of

300 kb met gerichte resequencing (250 bp ampliconlengte × 1536 amplicons met een AmpliSeq for Illumina-workflow)

Opties voor Sanger vs. Next-Generation Sequencing

Sanger-sequencing is een effectieve benadering voor variantscreeningstudies wanneer het totale aantal monsters laag is. Voor variantscreeningstudies waarbij het aantal monsters hoog is, is ampliconsequencing met NGS efficiënter en kosteneffectiever. Voor ontdekkingsgerelateerde toepassingen zal elke NGS-benadering een hogere ontdekkingskracht bieden in vergelijking met Sanger-sequencing. Het ontdekkingsvermogen zal toenemen naarmate de totale grootte van de doelsequentie toeneemt. Gerichte resequencing (amplicon- of verrijkingsmethoden) is de meest kosteneffectieve oplossing bij het sequencen van meer dan 20 doelregio's.


DMCA-klacht

Als u van mening bent dat inhoud die beschikbaar is via de Website (zoals gedefinieerd in onze Servicevoorwaarden) een of meer van uw auteursrechten schendt, dient u ons hiervan op de hoogte te stellen door middel van een schriftelijke kennisgeving (“Inbreukmelding”) met de hieronder beschreven informatie aan de aangewezen onderstaande makelaar. Als Varsity Tutors actie onderneemt als reactie op een Kennisgeving van Inbreuk, zal het te goeder trouw proberen contact op te nemen met de partij die dergelijke inhoud beschikbaar heeft gesteld door middel van het meest recente e-mailadres, indien aanwezig, dat door een dergelijke partij aan Varsity Tutors is verstrekt.

Uw kennisgeving van inbreuk kan worden doorgestuurd naar de partij die de inhoud beschikbaar heeft gesteld of naar derden zoals ChillingEffects.org.

Houd er rekening mee dat u aansprakelijk bent voor schade (inclusief kosten en advocatenhonoraria) als u een materiële verkeerde voorstelling van zaken geeft dat een product of activiteit inbreuk maakt op uw auteursrechten. Als u er dus niet zeker van bent dat inhoud die zich op de Website bevindt of waarnaar wordt gelinkt door uw auteursrecht schendt, moet u overwegen eerst contact op te nemen met een advocaat.

Volg deze stappen om een ​​melding in te dienen:

U moet het volgende opnemen:

Een fysieke of elektronische handtekening van de eigenaar van het auteursrecht of een persoon die gemachtigd is om namens hen op te treden Een identificatie van het auteursrecht waarvan wordt beweerd dat het is geschonden Een beschrijving van de aard en exacte locatie van de inhoud waarvan u beweert dat het inbreuk maakt op uw auteursrecht, in voldoende detail om Varsity Tutors in staat te stellen die inhoud te vinden en positief te identificeren, we hebben bijvoorbeeld een link nodig naar de specifieke vraag (niet alleen de naam van de vraag) die de inhoud bevat en een beschrijving van welk specifiek deel van de vraag - een afbeelding, een link, de tekst, enz. - uw klacht verwijst naar uw naam, adres, telefoonnummer en e-mailadres en een verklaring van u: (a) dat u te goeder trouw gelooft dat het gebruik van de inhoud waarvan u beweert dat deze inbreuk maakt op uw auteursrecht, is niet door de wet is geautoriseerd, of door de eigenaar van het auteursrecht of de vertegenwoordiger van een dergelijke eigenaar (b) dat alle informatie in uw kennisgeving van inbreuk juist is, en (c) op straffe van meineed, dat u ofwel de eigenaar van het auteursrecht of een persoon die gemachtigd is om namens hen op te treden.

Stuur uw klacht naar onze aangewezen agent op:

Charles Cohn Varsity Tutors LLC
101 S. Hanley Rd, Suite 300
St. Louis, MO 63105


1. U kunt elk van de volgende programma's gebruiken om uw .ab1-chromatogrambestand te bekijken:

2. Je zou individuele, scherpe en gelijkmatig verdeelde pieken moeten zien

3. Verwacht 500-700 basen aan schone, betrouwbare DNA-sequentie te krijgen

Alles minder en u zou contaminatie in uw monster kunnen vermoeden of u kunt overwegen uw sequencing-faciliteit te vragen een speciaal protocol toe te passen voor een moeilijk sjabloon. Iets meer en je waagt je in het onzekere terrein.

4. Vertrouw nooit de eerste 20-30 basen van een DNA-sequencing-uitlezing

De pieken hier zijn meestal onopgelost en klein, dus ik stel voor om uw primer ten minste 50 bp stroomopwaarts van de sequentie van belang te ontwerpen.

5. Gebruik een silica-spinkolom voor het zuiveren van de monsters die u verzendt voor DNA-sequencing

Als uw sequencing-faciliteit vereist dat u uw eigen Big Dye PCR-amplificatiereactie uitvoert (in tegenstelling tot het gebruik van de all-inclusive service die sommige bedrijven bieden), kunt u het product zuiveren via de natriumacetaat/isopropanol-precipitatiemethode of met behulp van een beschikbare silica-spinkolom van meerdere leveranciers. De precipitatiemethode heeft een ongelukkig neveneffect van het verknoeien van de reactie rond base 70-75 van de aflezing (zie onderstaande afbeelding), dus ik zou het gebruik van een silica-spinkolom ten zeerste aanbevelen. Ze kunnen prijzig zijn, maar het is het zeker waard.

6. Bewerk uw DNA-sequentie

Tot slot, als je een verkeerd genoemde piek ziet, wees dan niet verlegen. Voel je vrij om het te bewerken. Met de meeste chromatogram-weergaveprogramma's (zelfs de gratis) kunt u de reeks bewerken.

Ik hoop dat deze tips u zullen helpen het meeste uit uw DNA-sequencingresultaten te halen en eventuele problemen op te lossen. Veel succes met het analyseren van je sequenties!

Meer bronnen voor DNA-sequencing:

    Bedankt BitesizeBio dat je dit oorspronkelijk hebt gepubliceerd en ons hebt toegestaan ​​het met onze lezers te delen!


DNA sequentie

David P. Clark, Nanette J. Pazdernik, in Molecular Biology (tweede editie), 2013

4 cyclusvolgorde

De meeste sequentiereacties die worden gebruikt voor geautomatiseerde sequentiebepaling zijn een combinatie van PCR en reguliere sequentiebepaling. Net als bij geautomatiseerde sequencing wordt een mengsel van dubbelstrengs DNA-matrijs, primer en deoxynucleotiden (dNTP's) toegevoegd. Bovendien worden fluorescent gelabelde ddNTP's gemengd in een reactiebuis. In plaats van Sequenase of Klenow-polymerase te gebruiken, kan een hittebestendig DNA-polymerase, zoals een gemodificeerde Taq polymerase, wordt gebruikt. De reacties worden door drie verschillende temperaturen doorlopen om de gelabelde fragmenten te genereren. Net als bij PCR is de eerste stap het denatureren van het template-DNA bij een hoge temperatuur (90°C). De volgende stap is om de primer uit te gloeien bij een lagere temperatuur (50-60°C) en vervolgens de temperatuur te verhogen tot het optimum voor Taq polymerase (70°C). Deze drie stappen worden keer op keer herhaald om een ​​groot aantal gelabelde fragmenten te genereren voor geautomatiseerde sequencing. Zoals eerder varieert elk van deze fragmenten in grootte in stappen van een enkele base als gevolg van de willekeurige opname van de dideoxynucleotiden. De uiteindelijke sequencing-producten worden op grootte gescheiden en geregistreerd voor de fluorescerende kleurstof zoals beschreven in geautomatiseerde sequencing (hierboven).


De Sanger Sequencing Methode

De Sanger-sequencingmethode is gebaseerd op dideoxynucleotiden (ddNTP's), een type deoxynucleosidetrifosfaten (dNTP's), die geen 3'8242 hydroxylgroep hebben en in plaats daarvan een waterstofatoom hebben. Wanneer deze basen binden aan de groeiende DNA-sequentie, beëindigen ze de replicatie omdat ze geen andere basen kunnen binden. Om Sanger Sequencing uit te voeren, voegt u uw primers toe aan een oplossing die de genetische informatie bevat waarvan de sequentie moet worden bepaald, en verdeelt u de oplossing vervolgens in vier PCR-reacties. Elke reactie bevat een met dNTP-mix met een van de vier nucleotiden gesubstitueerd met een ddNTP (A, T, G en C ddNTP-groepen). Aan het einde van de PCR zal elk van uw vier reacties PCR-producten van verschillende lengtes opleveren omdat de replicatie willekeurig wordt beëindigd. Door de monsters op een gel met 4 banen te laten lopen, kunt u de reeks samenstellen, aangezien elke reeks is gerepliceerd uit hetzelfde originele materiaal. Hier is een voorbeeld waarbij de ddNTP's vetgedrukt zijn en de dNTP's niet:

Uw reeks is ATGCTCAG.

Je vier reacties geven je:
Reactie met ddATP: EEN, ATGCTCEEN, ATGCTCAG
Reactie met ddGTP: ATG, ATGCTCAG
Reactie met ddCTP: ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
Reactie met ddTTP: At, ATGCT, ATGCTCAG

Alle reacties die eenmaal op een gel zijn uitgevoerd, zouden er ongeveer zo uitzien (Afbeelding door Olwen Reina):

Elke band geeft de verschillende lengtecodes aan. De band staat bijvoorbeeld rechts onder de "A" symboliseert de reeks: "ATGCTCEEN

Laten we ons een gezelschapsspel voorstellen. Het spel is een raadspel. Hier is hoe het wordt gespeeld:

Je bedenkt een getal en de groep moet het raden. Het lastige is dat het nummer 200 cijfers lang is. Je leest de cijfers van het nummer in je hoofd zonder een geluid te maken. Om de zoveel tijd onderbreekt iemand je, en je vertelt ze het enkele cijfer dat je net dacht en waar het is in de reeks van 200. Elke keer dat je wordt onderbroken, moet je opnieuw beginnen. Je vertrekt na een paar uur en de groep moet het 200-cijferige nummer achterhalen. Ze moeten de informatie die je hen hebt gegeven bij elkaar zoeken, bijvoorbeeld het 25e getal was 5, het 40e getal was 0, enzovoort. Met behulp van de informatie van hun onderbrekingen kunnen ze het nummer herhalen dat ze je hebben gegeven.

Hoewel dit klinkt als de slechtste game ter wereld, werkt het heel goed voor sequencing!

Helaas is het traag, duur en (voorheen) afhankelijk van radioactieve materialen. Dit zette wetenschappers ertoe aan om nieuwe en betere vormen van genoomsequencing te ontwikkelen.


2. Groottescheiding door gelelektroforese

In de tweede stap worden de oligonucleotiden met eindstandige keten via gelelektroforese op grootte gescheiden. Bij gelelektroforese worden DNA-monsters in één uiteinde van een gelmatrix geladen en wordt een elektrische stroom aangelegd. DNA wordt negatief geladen, zodat de oligonucleotiden naar de positieve elektrode aan de andere kant van de gel worden getrokken. Omdat alle DNA-fragmenten dezelfde lading per massa-eenheid hebben, wordt de snelheid waarmee de oligonucleotiden bewegen alleen bepaald door de grootte. Hoe kleiner een fragment is, hoe minder wrijving het zal ervaren als het door de gel beweegt, en hoe sneller het zal bewegen. Als resultaat zullen de oligonucleotiden van klein naar groot worden gerangschikt, waarbij de gel van onder naar boven wordt afgelezen.

In handmatig Sanger-sequencing, de oligonucleotiden van elk van de vier PCR-reacties worden in vier afzonderlijke lanen van een gel uitgevoerd. Hierdoor kan de gebruiker weten welke oligonucleotiden overeenkomen met elke ddNTP.

In geautomatiseerd Sanger-sequencing, alle oligonucleotiden worden uitgevoerd in een enkele capillaire gelelektroforese in de sequencing-machine.


Technieken voor DNA-sequencing

DNA-sequencingtechnieken worden gebruikt om de volgorde van nucleotiden (A,T,C,G) in een DNA-molecuul te bepalen.

Leerdoelen

Maak onderscheid tussen de technieken die worden gebruikt om DNA te sequencen

Belangrijkste leerpunten

Belangrijkste punten

  • Genoomsequencing zal ons begrip van genetische biologie aanzienlijk vergroten en heeft een enorm potentieel voor medische diagnose en behandeling.
  • DNA-sequencing-technologieën hebben ten minste drie '8220generaties'8221 doorlopen: Sanger-sequencing en Gilbert-sequencing waren van de eerste generatie, pyrosequencing was van de tweede generatie en Illumina-sequencing is van de volgende generatie.
  • Sanger-sequencing is gebaseerd op het gebruik van ketenterminators, ddNTP's, die worden toegevoegd aan groeiende DNA-strengen en de synthese op verschillende punten beëindigen.
  • Illumina-sequencing omvat het gelijktijdig uitvoeren van tot 500.000.000 verschillende sequencing-reacties op een enkel klein glaasje. Het maakt gebruik van een gemodificeerde replicatiereactie en maakt gebruik van fluorescent gelabelde nucleotiden.
  • Shotgun-sequencing is een techniek voor het bepalen van de volgorde van hele chromosomen en hele genomen op basis van het produceren van willekeurige fragmenten van DNA die vervolgens worden geassembleerd door computers die fragmenten ordenen door overlappende uiteinden te vinden.

Sleutelbegrippen

  • DNA sequentie: een techniek die in de moleculaire biologie wordt gebruikt en die de volgorde van nucleotiden (A, C, G en T) in een bepaald DNA-gebied bepaalt
  • dideoxynucleotide: elk nucleotide gevormd uit een deoxynucleotide door verlies van een tweede hydroxylgroep van de deoxyribosegroep
  • in vitro: elk biochemisch proces dat buiten zijn natuurlijke biologische omgeving wordt uitgevoerd, zoals in een reageerbuis, petrischaal, enz. (van het Latijn voor '8220in glas'8221)

Technieken voor DNA-sequencing

Hoewel technieken om eiwitten te sequensen al sinds de jaren vijftig bestaan, werden technieken om DNA te sequensen pas in het midden van de jaren zeventig ontwikkeld, toen twee verschillende methoden voor het bepalen van de sequentie bijna gelijktijdig werden ontwikkeld, een door de groep van Walter Gilbert 8217 aan de Harvard University, de andere door Frederick Sanger's8217s-groep aan de universiteit van Cambridge. Tot de jaren negentig was de sequentiebepaling van DNA echter een relatief duur en langdurig proces. Het gebruik van radioactief gelabelde nucleotiden verergerde het probleem ook vanwege veiligheidsproblemen. Met de momenteel beschikbare technologie en geautomatiseerde machines is het proces goedkoper, veiliger en binnen enkele uren voltooid. De Sanger-sequencingmethode werd gebruikt voor het sequencing-project van het menselijk genoom, dat in 2003 de sequentiëringsfase beëindigde, maar vandaag zijn zowel de methode als de Gilbert-methode grotendeels vervangen door betere methoden.

Sanger-methode:: In de dideoxyketenterminatiemethode van Frederick Sanger worden fluorescerend gelabelde dideoxynucleotiden gebruikt om DNA-fragmenten te genereren die eindigen op elk nucleotide langs de templatestreng. Het DNA wordt gescheiden door capillaire elektroforese op basis van grootte. Uit de volgorde van gevormde fragmenten kan de DNA-sequentie worden afgelezen. De kleinste fragmenten werden het eerst beëindigd en ze komen het eerst uit de kolom, dus de volgorde waarin verschillende fluorescerende tags de kolom verlaten, is ook de volgorde van de streng. De uitlezing van de DNA-sequentie wordt weergegeven op een elektroferogram dat wordt gegenereerd door een laserscanner.

Sanger-sequencing

De Sanger-methode is ook bekend als de dideoxy-ketenbeëindigingsmethode. Deze sequencingmethode is gebaseerd op het gebruik van ketenterminators, de dideoxynucleotiden (ddNTP's). De dideoxynucleotiden, of ddNTPS's, verschillen van deoxynucleotiden door het ontbreken van een vrije 3'8242 OH-groep op de vijf-koolstofsuiker. Als een ddNTP wordt toegevoegd aan een groeiende DNA-streng, wordt de keten niet verder verlengd omdat de vrije 3'8242 OH-groep die nodig is om nog een nucleotide toe te voegen, niet beschikbaar is. Door een vooraf bepaalde verhouding van deoxyribonucleotiden tot dideoxynucleotiden te gebruiken, is het mogelijk om DNA-fragmenten van verschillende groottes te genereren bij het repliceren van DNA in vitro.

Een Sanger-sequencingreactie is slechts een gemodificeerde in vitro DNA-replicatiereactie. Als zodanig zijn de volgende componenten nodig: template-DNA (dit zal het DNA zijn waarvan de sequentie zal worden bepaald), DNA-polymerase om de replicatiereacties te katalyseren, een primer die baseparen voorafgaand aan het deel van het DNA dat u wilt sequencen, dNTP's en ddNTP's. De ddNTP's onderscheiden een Sanger-sequencingreactie van alleen een replicatiereactie. Meestal zal DNA-polymerase in een Sanger-sequencingreactie een geschikt dNTP toevoegen aan de groeiende streng die het in vitro synthetiseert. Maar op willekeurige locaties zal het in plaats daarvan een ddNTP toevoegen. Als dat het geval is, wordt die streng beëindigd op de zojuist toegevoegde ddNTP. Als er voldoende template-DNA's in het reactiemengsel zijn opgenomen, zal in elk ervan de ddNTP op een andere willekeurige locatie worden ingevoegd, en zal er ten minste één DNA eindigen op elk verschillend nucleotide langs de lengte ervan, zolang de in vitro-reactie kan duren. plaats (ongeveer 900 nucleotiden onder optimale omstandigheden.)

De ddNTP's die de strengen beëindigen, hebben fluorescerende labels die er covalent aan zijn bevestigd. Elk van de vier ddNTP's heeft een ander label, dus elke verschillende ddNTP zal een andere kleur fluoresceren.

Nadat de reactie voorbij is, wordt de reactie onderworpen aan capillaire elektroforese. Alle nieuw gesynthetiseerde fragmenten, elk eindigend op een ander nucleotide en dus elk een andere lengte, worden gescheiden op grootte. Terwijl elk fragment van verschillende grootte de capillaire kolom verlaat, prikkelt een laser de fluorescerende tag op zijn terminale nucleotide. Aan de kleur van de resulterende fluorescentie kan een computer bijhouden welk nucleotide aanwezig was als het beëindigende nucleotide. De computer houdt ook de volgorde bij waarin de beëindigende nucleotiden verschenen, wat de volgorde is van het DNA dat in de oorspronkelijke reactie werd gebruikt.

Sequencing van de tweede en volgende generatie

De methoden van Sanger en Gilbert om DNA te sequensen worden vaak 'sequencing van de eerste generatie' genoemd omdat ze als eerste werden ontwikkeld. Aan het eind van de jaren negentig begonnen nieuwe methoden te worden ontwikkeld, sequencingmethoden van de tweede generatie genaamd, die sneller en goedkoper waren. De meest populaire, meest gebruikte sequencingmethode van de tweede generatie was Pyrosequencing.

Tegenwoordig zijn er een aantal nieuwere sequencing-methoden beschikbaar en andere worden momenteel ontwikkeld. Dit worden vaak next-generation sequencing-methoden genoemd. De meest gebruikte sequencingmethode op dit moment is er een die Illumina-sequencing wordt genoemd (naar de naam van het bedrijf dat de techniek op de markt heeft gebracht), maar er zijn tal van concurrerende methoden in de ontwikkelingspijplijn die Illumina-sequencing kunnen vervangen.

Bij Illumina-sequencing worden tot 500.000.000 afzonderlijke sequencing-reacties tegelijkertijd uitgevoerd op een enkel objectglaasje (de grootte van een microscoopglaasje) dat in een enkele machine wordt geplaatst. Elke reactie wordt afzonderlijk geanalyseerd en de sequenties die zijn gegenereerd uit alle 500 miljoen DNA's worden opgeslagen in een aangesloten computer. Elke sequencingreactie is een gemodificeerde replicatiereactie waarbij nucleotiden met een fluorescente tag betrokken zijn, maar er zijn geen dideoxynucleotiden die de keten beëindigen nodig.

Toen het menselijk genoom voor het eerst werd gesequenced met behulp van Sanger-sequencing, duurde het enkele jaren, honderden laboratoria die samenwerkten en een kostprijs van ongeveer $ 100 miljoen om het bijna voltooid te krijgen. Met sequencing van de volgende generatie kan een genoom van vergelijkbare grootte in een paar dagen worden gesequenced, met behulp van een enkele machine, tegen een kostprijs van minder dan $ 10.000. Veel onderzoekers hebben zich ten doel gesteld de sequentiemethoden nog verder te verbeteren totdat een enkel menselijk genoom kan worden gesequenced voor minder dan $ 1000.

Shotgun-volgorde

De Sanger-sequentie kan slechts enkele honderden nucleotiden van de sequentie per reactie produceren. De meeste sequentietechnieken van de volgende generatie genereren nog kleinere sequentieblokken. Genomen zijn opgebouwd uit chromosomen die tientallen tot honderden miljoenen basenparen lang zijn. Ze kunnen alleen in kleine fragmenten worden gesequenced en de kleine fragmenten moeten in de juiste volgorde worden geplaatst om de ononderbroken genoomsequentie te genereren. De meeste projecten voor genomische sequencing maken tegenwoordig gebruik van een benadering die whole genome shotgun sequencing wordt genoemd.

Hele genoom-shotgun-sequencing omvat het isoleren van vele kopieën van het chromosomale DNA van belang. De chromosomen zijn allemaal gefragmenteerd in groottes die klein genoeg zijn om op willekeurige locaties te worden gesequenced (een paar honderd basenparen). Als gevolg hiervan is elke kopie van hetzelfde chromosoom op verschillende locaties gefragmenteerd en zullen de fragmenten van hetzelfde deel van het chromosoom elkaar overlappen. Elk fragment wordt gesequenced en geavanceerde computeralgoritmen vergelijken alle verschillende fragmenten om te ontdekken welke overlapt met welke. Door de overlappende gebieden op een rij te zetten, een proces dat tiling wordt genoemd, kan de computer de grootst mogelijke continue reeksen vinden die uit de fragmenten kunnen worden gegenereerd. Uiteindelijk wordt de sequentie van volledige chromosomen samengesteld.

Gehele genoom shotgun-sequencing.: Bij shotgun-sequencing worden meerdere kopieën van hetzelfde chromosoom geïsoleerd en vervolgens op willekeurige locaties gefragmenteerd. De verschillende kopieën van het chromosoom genereren uiteindelijk fragmenten van verschillende lengte. Wanneer de volledige verzameling fragmenten is gesequenced, zal het vergelijken van de sequenties van alle fragmenten onthullen welke fragmenten uiteinden hebben die overlappen met andere fragmenten. De volledige sequentie van het ene uiteinde van het oorspronkelijke DNA naar het andere kan worden samengesteld door de sequentie van het eerste overlappende fragment tot het laatste te volgen.

Genoomsequencing zal ons begrip van genetische biologie aanzienlijk vergroten. Het heeft een enorm potentieel voor medische diagnose en behandeling.


Moleculair klonen en recombinant-DNA-technologie

DNA sequentie

DNA-sequencing wordt gebruikt om de exacte volgorde van nucleotiden (A, G, C, T) in een DNA-streng te bepalen. De Sanger dideoxy ketenbeëindigingsmethode kan de sequentie van nucleotiden met hoge betrouwbaarheid bepalen voor een stuk van ongeveer 200-500 basenparen in elk gezuiverd DNA-monster. Gebaseerd op in vitro DNA-synthese, de Sanger-methode synthetiseert korte stukjes DNA in aanwezigheid van nucleotidebasen waaraan andere basen niet kunnen worden toegevoegd: ketenbeëindigende dideoxyribonuceosidetrifosfaten. Deze ketenbeëindigende nucleotiden worden gelabeld en gemengd met reguliere nucleotidebasen, zodat DNA-fragmenten met veel verschillende lengtes zullen worden gecreëerd, elk willekeurig gestopt door de toevoeging van een ketenbeëindigend nucleotide. De vier ketenbeëindigende nucleotiden zijn elk gelabeld met een verschillend gekleurde fluorescerende kleurstof. Duizenden fragmenten van verschillende lengtes worden op een gel gelopen en een geautomatiseerde fluorescentiedetector kan de gel snel scannen om de identiteit van het laatste, eindigende nucleotide te lezen (Figuur 10.6). Moderne laboratoria voor moleculaire biologie hebben de neiging om zelf geen sequentiereacties uit te voeren, omdat het doorgaans sneller en goedkoper is om DNA-monsters naar een speciale faciliteit te sturen voor sequentiebepaling.

Figuur 10.6 . DNA sequentie.

Elk ketenbeëindigend nucleotide is gelabeld met een andere fluorescerende kleurstof en veel fragmenten van DNA worden gesynthetiseerd. Wanneer alle gesynthetiseerde DNA-fragmenten worden gescheiden met behulp van gelelektroforese, worden ze gescheiden op grootte en kan een detector automatisch detecteren welk label zich op elke positie bevindt door de intensiteit van elk fluorescerend signaal te meten.

De Sanger-methode is de gouden standaard voor DNA-sequencing en wordt nog steeds vaak gebruikt voor de dagelijkse verificatie van moleculair-biologische experimenten. DNA-sequencingmethoden zijn het afgelopen decennium echter snel geëvolueerd in wat wordt aangeduid als: volgende generatie sequencing (NGS) technieken die het sequencen van grote stukken DNA goedkoper en sneller maken. NGS-technieken hebben grootschalige sequencing van volledige genomen mogelijk gemaakt en hebben de snelle ontwikkeling van het gebied van genomica mogelijk gemaakt.


Bekijk de video: Sanger sequencing (November 2021).