Informatie

Is er een protocol voor het invriezen en ontdooien van Bacillus subtilis-cellen?


Er is een boek dat zegt Bacillus-sporen op te slaan in 50% glycerol bij -70 graden Celsius (er wordt niet vermeld of de 50% eindconcentratie is of niet). Maar voor zover ik weet, kunnen de cellen zelf worden opgeslagen in elk % glycerol zolang de uiteindelijke glycerolconcentratie 15% (v/v) is bij -80 graden Celsius.

Is er een verschil tussen het bewaren van sporen en cellen? Omdat het boek zei de cellen te bewaren bij een bepaalde glycerolconcentratie en de sporen bij een andere glycerolconcentratie.

Stel ook dat ik wat B. subtilis uit het cryobuisje schraap voor hergebruik, en ze zijn ingevroren. Moet ik wachten tot de geschraapte cellen zijn ontdooid en dan plaat ik ze, of plaat ze terwijl ze nog bevroren zijn?

En als ik deze cellen wil sporuleren, moet ik deze bevroren cellen dan terugwinnen door ze 's nachts te plateren en te incuberen, of kan ik ze gewoon rechtstreeks in het sporulatiemedium laten vallen? Ik wil de details goed hebben.


Hoewel ik nog nooit bacteriestamculturen van sporen heb gedaan, denk ik niet dat het nodig is, omdat de standaardprocedure voor het maken van bacteriestammen zonder problemen zou moeten werken.

Daarvoor kweek je je bacteriën in vloeibare cultuur tot je de late log-fase bereikt (je hebt dus veel bacteriën in je media), neem 1 ml van de kweek, meng het met 100% glycerol om een ​​uiteindelijke glycerolconcentratie van 50 te bereiken % en vries het dan in bij -80°C. Hierbij kun je het voor lange tijd bewaren (waarschijnlijk niet voor onbepaalde tijd maar jarenlang kan wel).

Als je je culturen weer tot leven wilt brengen, neem je de buis en gebruik je een inentingslus of een pipetpunt om een ​​beetje van de bevroren cultuur te schrapen en op een geschikte agarplaat te plaatsen. Als u wilt opschalen, kiest u een kolonie van de plaat in vloeibare media.

Omdat glycerol lastig te pipetteren is (en ook steriliteitsproblemen kan hebben), ben ik ook overgestapt op DMSO als cryo-beschermend middel voor bacterieculturen. Voeg eenvoudig 15% (eindconcentratie) DMSO toe aan de cryo-flacons (dus 150ul DMSO tot 850 cultuur), meng en bevries de cellen. In mijn ervaring werkt dit net zo goed als glycerol.


Cellen testen op bacteriële en schimmelbesmetting

In gevallen van grove celcultuurverontreiniging kan het blote oog de aanwezigheid van bacteriën en schimmels identificeren. Om infecties op een laag niveau te detecteren, wordt echter de bovenstaande methode aanbevolen.


Resultaten en discussie

EEN B. subtilis pks Fenotype zichtbaar in een interspecies-interactie.

Wanneer gecocultiveerd op agarplaten, B. subtilis en Streptomyces coelicolor ondergaan karakteristieke ontwikkelingsroutes die leiden tot de productie en sporulatie van secundaire metabolieten. Op vroege tijdstippen tijdens de co-incubatie, een kolonie van B. subtilis groeien op een gazon van S. coelicolor produceert een nogal onopvallende gemengde cultuur (Fig. 1 B). Toen we willekeurige transposon-insertiemutanten van B. subtilis onder voorwaarden van co-cultivatie met S. coelicolor, meerdere B. subtilis mutanten vertoonden een opvallend fenotype: ze induceerden de voortijdige synthese in de aangrenzende S. coelicolor van het rode antibioticum undecylprodigiosin [ref. 18 Afb. 1 B en ondersteunende informatie (SI) Afb. 5]. Nucleotidesequentie-analyses onthulden dat elk van de B. subtilis mutanten herbergden een transposon-insertie in een van de pks genen in totaal, hebben we zes onafhankelijke mutanten teruggevonden met transposon-inserties in 5 van de 16 pks genen (SI-tabel 1). Vervolgens hebben we een verwijdering van de volledige pks genencluster, pksΔ (Afb. 1 EEN) en vond dat de volledige deletie een fenotype veroorzaakte dat niet te onderscheiden was van het fenotype dat werd waargenomen bij de individuele transposonmutanten.

Gewapend met de pks deletiestam onderzochten we de effecten ervan op de interacties tussen B. subtilis en andere Streptomyces soort. We vonden dat de pks gencluster is verantwoordelijk voor de productie van een diffundeerbare metaboliet die de groei van Streptomyces avermitilis. De pks fenotypische effect werd aanvankelijk verdoezeld door het feit dat B. subtilis produceert een ander antibioticum dat actief is tegen Streptomyces avermitilis. Met behulp van een tweede scherm identificeerden we de andere activiteit door een mutant in de albA locus, die de productie verstoorde van het lantibiotische subtilosine dat wordt gecodeerd door de sbo-alb genen ( SI-tekst ref. 19). De pks fenotype in interactie met S. avermitilis wordt duidelijk bij het vergelijken van een albAΔ enkele mutant naar a pksik, albAΔ dubbele mutante stam (Fig. 1 B). Deze resultaten gaven een duidelijke indicatie dat de B. subtilis pks genen produceren een actieve bacillaeensynthase (20), wat ons ertoe aanzet vragen te stellen over de organisatie van synthase-enzymen in hun natuurlijke producent.

Subcellulaire lokalisatie van de PKS-eiwitten.

B. subtilis is naar voren gekomen als een uitstekend modelorganisme voor bacteriële cytologie, wat ons een unieke kans gaf om de celbiologie van het enorme NRPS/PKS-biosynthetische systeem te onderzoeken. We begonnen met het construeren van C-terminale fusies van cyaan fluorescerend eiwit (CFP) en geel fluorescerend eiwit (YFP) tot individuele Pks-eiwitten in het synthase (Fig. 1 EEN). Cellen die deze fusie-eiwitten produceren, behielden de remmende activiteit tegen S. avermitilis, wat aangeeft dat de fusie-eiwitten functioneel waren (SI Fig. 5). Cellen die fusies herbergen van YFP met PksR, een grote multimodulaire component van het synthase, en CFP met PksE, een trans-acting AT (7), werden gekweekt tot de laat-exponentiële fase en onderzocht met fluorescentiemicroscopie. Heel verrassend ontdekten we dat PksR-YFP en PksE-CFP elk lokaliseren in een enkele focus binnen de B. subtilis cellen (Fig. 2 EEN). Hetzelfde werd waargenomen voor een PksJ-CFP-fusie (SI Fig. 6). De focus van fluorescentie was niet gefixeerd op dezelfde locatie in elke celmediale en polaire positionering werd waargenomen in verschillende cellen. De meeste cellen hadden een enkele fluorescentiefocus (69%, N = 876, PksR-YFP), hoewel een kleine fractie van de cellen twee foci vertoonde (6%, N = 876, PksR-YFP), en sommige cellen hadden geen detecteerbaar fluorescerend signaal (25%, N = 876, PksR-YFP). In deze cellen is de pks genfusies worden tot expressie gebracht onder hun natieve promotors, en eiwitten van voorspelde grootte voor elke Pks-fusie zijn detecteerbaar door Western blot (Fig. 2 EEN). Er werd geen fluorescentie waargenomen in cellen van kweken in de vroege exponentiële fase, wat suggereert dat NRPS/PKS-synthese of -assemblage onderhevig is aan regulering van de groeifase. We onderzochten het PksR-YFP-eiwit door middel van immunoblot-analyse gedurende een tijdsverloop en ontdekten dat de eiwitabundantie van PksR-YFP toeneemt met de celdichtheid, consistent met de regulering van de groeifase van het bacillaeensynthase (SI Fig. 7).

Lokalisatie van Pks-eiwitten in B. subtilis 3610. (EEN) Het PksE-GVB (Bovenste) en PksR-YFP-fusies (Lager) lokaliseren op een discrete plek. (Links) Fluorescentie van Pks-eiwitfusie (FP) (Centrum) fluorescentie van membraan gekleurd met de kleurstof TMA-DPH (Molecular Probes, Eugene, OR) (Rechts) overlay van fluorescentiebeelden. (Afbeeldingen zijn hetzelfde in C en NS). Helemaal rechts een immunoblot van PksE-CFP, PksR-YFP en SrfAB-YFP (zie C, hieronder) onderzocht met anti-GFP-antilichaam toont de synthese van de fusie-eiwitten van volledige lengte. (B) Colocalisatie in een stam die tegelijkertijd PksE-CFP en PksR-YFP produceert. (Links) Fluorescentie van fusie-eiwitten zoals hierboven vermeld. PksE-CFP- en PksR-YFP-afbeeldingen worden samengevoegd om colokalisatie op overlappende punten in geel weer te geven (samenvoegen). Membranen zijn gekleurd met TMA-DPH zoals in EEN (Membranen). (C) Het SrfAB-YFP-eiwit is diffuus in het cytoplasma. (NS) PksE-CFP-lokalisatie vindt plaats met een intacte pks genencluster (Bovenste) maar niet met een onderbreking van pksJ (Lager). De productie van PksE-CFP is identiek in beide stammen door immunoblot (uiterst rechts). Gezuiverd CFP (rechterbaan) is opgenomen om aan te tonen dat de PksE-CFP-fusie stabiel is in de pksJ gemuteerde achtergrond. (Schaalbalken, 1 m.)

Vervolgens vergeleken we de lokalisatie van PksE-CFP en PksR-YFP in dezelfde stam. Zoals voorspeld, hebben we een patroon van overlappende lokalisatie waargenomen, consistent met een gecoördineerde werking van de eiwitten als onderdeel van het holo-enzymsynthase. Fluorescentiemicroscopie van een stam die zowel PksR-YFP als PksE-CFP herbergt, laat inderdaad zien dat de eiwitten colocaliseren (Fig. 2 B). Vergelijkbare colokalisatie was ook duidelijk met behulp van de PksJ-CFP met PksR-YFP-fusies (SI Fig. 6). Deze waarnemingen ondersteunen een model waarin de Pks-eiwitten, mogelijk geassembleerd als functionele enzymatische complexen, zijn georganiseerd als een enkel megacomplex per cel.

Om de lokalisatie van de Pks-eiwitten te vergelijken met eiwitten van vergelijkbare grootte, hebben we CFP en YFP gefuseerd met de vier eiwitten van het surfactine NRPS [SrfAA (≈402 kDa), SrfAB (≈401 kDa), SrfAC (≈144 kDa), en SrfAD (≈27 kDa)] (genolist.pasteur.fr/SubtiList). In tegenstelling tot de Pks-eiwitten, lokaliseren de surfactinesynthase-eiwitten niet op een punt, maar zijn ze diffuus door het cytoplasma (Fig. 2 C en SI Fig. 6). Het niveau van fluorescentie-intensiteit varieert tussen cellen in een veld dat SrfA-eiwitfusies tot expressie brengt met CFP en YFP, consistent met een eerder rapport dat heterogeniteit beschreef binnen een populatie van B. subtilis cellen (21). Differentiële patronen van lokalisatie voor Pks-fusie-eiwitten en die van het surfactinesynthetase suggereren dat de lokalisatiepatronen van de NRPS/PKS- en NRPS-eiwitten fysiologisch relevant zijn voor de productie van kleine moleculen.

Met de fluorescerende fusie-eiwitten konden we ook enkele van de vereisten voor de assemblage van het megacomplex testen. We redeneerden dat de PksE trans-AT, een relatief klein eiwit (≈86 kDa), de aanwezigheid van de grote kernsynthase-eiwitten PksJ, L, M, N en R nodig zou kunnen hebben om goed te lokaliseren. We onderzochten daarom de lokalisatie van een fluorescerende PksE-eiwitfusie in een stam die de gigantische subeenheden mist (Fig. 1 EEN). We hebben een B. subtilis stam die de PksE-CFP-fusie draagt ​​en een transposon-insertie in de pksJ gen ( SI-tekst ). Het verstoren van de pksJ gen zorgde ervoor dat PksE-CFP mislokaliseerde en diffuus werd in het cytoplasma (Fig. 2 NS). Er werd echter een normale lokalisatie van PksE-CFP waargenomen in een stam die een transposonverstoring in droeg pksR, het laatste gen in het cluster (SI Fig. 6). De vereiste van de multimodulaire enzymassemblagelijneiwitten voor de lokalisatie van PksE-CFP geeft aan dat de lokalisatie van de grote Pks-eiwitten het patroon voor de lokalisatie van de trans-werkende enzymen bepaalt.

Een PKS Megacomplex zichtbaar door cryo-elektronenmicroscopie.

Aangezien onze gegevens suggereren dat alle Pks-eiwitten zich op één enkele plaats bevinden, redeneerden we dat dit megacomplex groot en duidelijk genoeg zou kunnen zijn om met EM te worden waargenomen. WT-cellen (ongemodificeerde stam NCIB3610) of cellen die PksR-YFP of PksE-CFP bevatten, werden gecryopreserveerd met behulp van hogedrukbevriezing en vriessubstitutiefixatie om nauwkeurige conservering van subcellulaire structuren te bieden, en dunne secties werden onderzocht door EM (22). De WT-, PksR-YFP- en PksE-CFP-monsters vertoonden allemaal een grote elektronendichte massa in het cytoplasma (Fig. 3 en SI Fig. 8). In alle gevallen wordt de massa naast het celmembraan geplaatst en varieert de positie in de cel van de middencel tot de pool. De massa, die van cel tot cel in grootte en vorm verschilt, lijkt geen discrete grens met het cytoplasma te hebben, wat suggereert dat het niet door een membraan is omsloten (zie SI Fig. 8 voor aanvullende afbeeldingen). Deze massa is niet eerder gerapporteerd in EM-analyses van B. subtilis. We veronderstelden dat eerdere EM-analyses met laboratoriumstammen van B. subtilis zou deze structuur niet hebben gedetecteerd vanwege de aanwezigheid van een gemuteerde kopie van de sfp gen (sfp°), dat codeert voor het fosfopantetheinyltransferase dat nodig is voor de enzymfunctie van de lopende band. Er werd echter een grote elektronendichte massa waargenomen door EM in PY79 (sfp°) cellen met behulp van onze cryopreservatietechnieken, wat aangeeft dat een functioneel Sfp-enzym niet vereist is voor de vorming van megacomplexen (SI Fig. 9). Bovendien hebben we opgemerkt dat lokalisatie van Pks-eiwitfusies zichtbaar is door fluorescentie in de PY79-stam. Een alternatieve verklaring voor het gebrek aan detectie door EM eerder is dat onze methode van cryopreservatie de integriteit van deze structuren handhaaft, die vernietigd kunnen worden met behulp van klassieke fixatieprotocollen.

Assemblage van een megasynthasecomplex in B. subtilis. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van dunne coupes van gecryopreserveerd B. subtilis cellen onthult een elektronendichte massa nabij het plasmamembraan in WT (ongemodificeerde stam NCIB3610), PksE-CFP en PksR-YFP-cellen. ImmunoEM-lokalisatie van de PksR-YFP- en PksE-CFP-eiwitten naar de massa is zichtbaar als cirkelvormige elektronendichte stippen van 20-nm gouddeeltjes geconjugeerd aan het secundaire antilichaam (pijlpunten). Pijlen geven de NRPS/PKS-megacomplexmassa aan. (Schaalbalk, 0,2 m.) (Rechts onder) Een afbeelding met een hogere vergroting van PksR-YFP gelokaliseerd in het megacomplex wordt weergegeven. De pijl wijst naar de celwand en het plasmamembraan. Pijlpunt wijst naar een gouddeeltje. (Schaalbalk, 0,1 m.)

Om te bepalen of de massa die we zien door EM in een WT B. subtilis cel overeenkomt met de fluorescerende focus van NRPS/PKS waargenomen in onze fluorescentiemicroscopie-analyses, gebruikten we immunoEM-detectie van PksR-YFP en PksE-CFP. Met behulp van een primair anti-GFP-antilichaam en een met goud gemerkt secundair antilichaam, hebben we waargenomen dat PksR-YFP en PksE-CFP zich lokaliseren in de elektronendichte massa in de B. subtilis cytoplasma (Fig. 3 en SI Fig. 8). De aanwezigheid van de grote massa in WT B. subtilis en de lokalisatie van Pks-eiwitten op deze massa suggereert dat we een eiwitachtige subcellulaire structuur hebben geïdentificeerd waarvan de functie, ten minste gedeeltelijk, de biosynthese van uitgescheiden bacillaeen is.

Om te onderzoeken of de assemblage van het megacomplex afhangt van de Pks-eiwitten, vergeleken we WT B. subtilis naar een pksΔ stam door EM. Door onze analyse te beperken tot cellen die longitudinaal in onze EM-dunne secties waren gesneden, vergeleken we 43 cellen van de WT-stam met 43 cellen van de pksstam. In deze analyse hadden 21 van 43 WT dunne secties een zichtbare massa met vergelijkbare kenmerken als massa's die positief waren in onze immunoEM-lokalisatie van PksR-YFP en PksE-CFP (SI Fig. 9). Daarentegen is de pksΔ dunne secties misten deze structuren, met slechts 3 van de 43 pksΔ cellen met een massa die we niet ondubbelzinnig konden uitsluiten. De aanwezigheid van deze massa's in WT maar niet pksΔ-cellen geven aan dat de assemblage van deze structuur de Pks-eiwitten vereist. We veronderstellen dat de massa een organel-achtige verzameling is van voornamelijk NRPS/PKS-synthasen en mogelijk andere eiwitten.

Gezien de enorme omvang van deze macromoleculaire assemblage, hebben we geprobeerd de hoeveelheid NRPS / PKS-eiwit in een enkele cel te schatten met behulp van kwantitatieve Western-blots ( SI-tekst ). We hebben berekend dat een enkele cel gemiddeld 50-150 kopieën van het PksR-eiwit en ≈ 5.000-10.000 kopieën van het PksE-eiwit bevat. Het is waarschijnlijk dat niet alle PksE-eiwitten in het complex aanwezig zijn, omdat we een fluorescerend signaal in het cytoplasma kunnen detecteren. De nauwkeurigheid van de geschatte massa van het megacomplex wordt beperkt door variatie in grootte van de structuur (zoals gezien door fluorescentie-intensiteit en EM) van cel tot cel en door de verschillen in immunoblot-overdracht tussen kleine gezuiverde GFP (27 kDa) en de veel grotere PksR-YFP (312-kDa) en PksE-CFP (104-kDa) eiwitfusies. De verhouding van 10-100 × de hoeveelheid trans-AT, PksE, ten opzichte van het multimodulaire eiwit, PksR, is echter consistent met de voorspelde functie van de eiwitten. Op basis van de relatieve stoichiometrie van kernsynthase-eiwitten ten opzichte van trans-werkende enzymen, kan de massa van een enkel compleet synthase ruim 2,5 megadalton bedragen. Een verzameling van vele synthasen zou variëren van 10 tot 100 megadalton.

Assemblagelijnvereniging van PKS multimodulaire eiwitten PksM, PksN en PksR.

In overeenstemming met de organisatie van de lopende band, veronderstelden we dat individuele B. subtilis NRPS/PKS's bestaan ​​uit een kernsynthase bestaande uit de PksJ-R-eiwitten en meerdere kopieën van trans-werkende enzymen. Om de associatie van individuele synthasecomponenten in de cel te onderzoeken, gebruikten we een anti-GFP-antilichaam geconjugeerd aan Sepharose-parels om PksR-YFP en geassocieerde NRPS/PKS-eiwitten uit cellysaten te immunoprecipiteren. Co-immuno-geprecipiteerde eiwitten werden ofwel met trichloorazijnzuur geprecipiteerd of uit met zilver gekleurde acrylamidegels gesneden en geïdentificeerd door tandem-MS-analyse. Een WT-stam zonder fusie diende als een negatieve controle. Peptidefragmenten van de PksN- en PksM-eiwitten werden geïdentificeerd in de MS-analyses, consistent met deze eiwitten die individuele assemblagelijnen vormen met PksR (SI-tabel 2). Zoals voorspeld door een colineaire volgorde van montage (Fig. 1 EEN), waren peptiden van PksN overvloediger in MS-analyse dan peptiden van PksM. We hebben PksJ en PksL niet geïdentificeerd in de co-immunoprecipitatie-experimenten. De afwezigheid van canonieke linker-domeinen aan de C-uiteinden van PksJ en PksL suggereert dat de gesplitste modules op de PksJ-L- en PksL-M-knooppunten zijn georganiseerd door niet-linker-eiwit-eiwit-interacties (6, 23, 28). De interacties tussen PksJ-PksL- en PksL-PksM-eiwitten vormen dus mogelijk geen complex met voldoende stabiliteit voor immunoprecipitatie. We hebben een biosynthetisch schema voor bacillaeen voorgesteld dat wordt ondersteund door de collineaire assemblage van PksJ-R (28). Op basis van onze kennis van de bacillaeenstructuur zouden de C-terminale KS-domeinen op PksJ en PksL alleen dienen voor de overdracht van een acyl-S-T-tussenproduct, in tegenstelling tot de opname van een extra substraat. Daarentegen zou de interactie tussen PksN en PksR actie vereisen van de PksN C-terminale DH- en KR-modules op een acyl-S-T-tussenproduct gehecht aan het N-terminale PksR-T-domein (Fig. 4). Gezien dit schema speculeren we dat PksN, PksM en PksR een complex vormen dat we kunnen identificeren door middel van immunoprecipitatie, maar PksJ-PksL of PksL-PksM niet. Dus, in de afwezigheid van canonieke C- en N-terminale linkers, kunnen de vereisten voor substraatverwerking en overdracht tussen multimodulaire eiwitten in een synthase belangrijke determinanten zijn van eiwitcomplexvorming en synthase-assemblage.

De voorspelde functie voor de enzymen en enzymatische modules die worden gecodeerd door het bacillaeengencluster. De eiwitten PksB-I, AcpK en PksS zijn vrijstaande enzymen waarvan wordt aangenomen dat ze in trans functioneren ten opzichte van de multimodulaire eiwitten. PksJ, -L, -M, -N en -R zijn multimodulaire NRPS/PKS (PksJ en -N) of PKS (PksL, -M en -N) eiwitten die de kernassemblagelijnsynthase vormen. De voorspelde functie van elke afzonderlijke module of losstaand enzym wordt vermeld in de legenda. De ongebruikelijke C-terminale KS-modules in PksJ en -L en de N-terminale DH-modules in PksL en -M zullen waarschijnlijk interproteïne-overdracht van ontluikend bacillaeen bemiddelen.

Hoe de verzameling van afzonderlijke NRPS/PKS-assemblagelijnen in een cel zich tot één megacomplex organiseert, moet nog worden bepaald. Een mogelijkheid is dat een specifiek deel van elke assemblagelijn wordt geassocieerd met een membraansubdomein, hetzij direct, hetzij door interactie met een membraaneiwit. Dit soort membraanassociatie is waargenomen in eiwitten van andere lopende band-enzymen (24, 25). Een andere mogelijkheid is dat de afzonderlijke assemblagelijncomplexen met elkaar associëren tot een megacomplex. In dit scenario zou membraanassociatie van het megacomplex kunnen plaatsvinden via een subset van de intacte assemblagelijnen, maar de assemblage van megacomplexen zou worden aangedreven door interacties tussen domeinen binnen individuele synthasen. Intrigerend genoeg zijn er voorspelde coiled-coil-motieven binnen verschillende van de ATd-domeinen in het Pks-synthase (figuur 4). We speculeren dat de coiled-coil-domeinen een rol kunnen spelen bij het bestellen van multimodulaire eiwitten binnen een enkele assemblagelijn of bij het bemiddelen van de mogelijke associatie van twee complete assemblagelijnen.

Kortom, we rapporteren verschillende voorheen niet-gekarakteriseerde kenmerken van de organisatie en capaciteit van: B. subtilis antibiotica te maken. De eiwitten van het bacillaeensynthase zijn opgenomen in een organelachtige cluster naast het membraan. Vorming en lokalisatie van dit megacomplex komen overeen met de assemblage van een biosynthetische fabriek, mogelijk gekoppeld aan speciale secretiemachines om toxische ophoping van bacillaeen in het cytoplasma te voorkomen. Het zal belangrijk zijn om de identiteit van het (de) exporterende eiwit(ten) te bepalen, evenals de biochemische determinanten voor de lokalisatie van de Pks-eiwitten en de assemblage van het megacomplex. Hoewel lantibiotische synthasefabrieken verankerd aan het cytoplasmatische oppervlak van bacteriële membranen zijn gerapporteerd (26, 27), bieden onze bevindingen inzicht in de quaternaire organisatie van biosynthetische fabrieken van natuurlijke producten in antibioticaproducenten. Ten slotte benadrukken we dat de combinatie van de bacillaeenstructuur en de waargenomen synthase-organisatie in het modelorganisme B. subtilis heeft een groot potentieel voor het begrijpen van enzymatische synthese van hybride PK-NRP-metabolieten.


Tips en veelgestelde vragen

De optimale concentratie van langdurige opslag van glycerol is onbekend. De meeste laboratoria slaan bacteriën op in 15-25% glycerol.

U kunt de glycerolvoorraad bereiden op hetzelfde moment dat u uw plasmide-DNA bereidt. Neem 's morgens, wanneer u uw vloeibare bacteriecultuur ophaalt, 500 μL cultuur om uw glycerolvoorraad te maken voordat u begint met uw plasmide-minivoorbereiding.

Probeer uw glycerolvoorraad niet te vaak in te vriezen/ontdooien. Door de glycerolvoorraad op droogijs te plaatsen terwijl u strepen op LB-agar maakt, wordt voorkomen dat deze volledig ontdooit en wordt de houdbaarheid verlengd.

Het is erg belangrijk dat u de glycerol schudt voor het invriezen (5-6 keer). Zorg ervoor dat je één uniforme oplossing ziet, en dat er geen lagen aanwezig zijn.

Zorg ervoor dat u zowel het deksel als het buisje van een glycerolbouillon labelt voordat u het monster bij -80°C plaatst. Bevroren buizen zijn moeilijk om op te schrijven en monsters die gedurende lange tijd bij -80°C worden bewaard, kunnen etiketten kwijtraken die aan de buis vastzitten!


RNAP is ongevoelig voor vertaling

Een belangrijke voorspelling van op hol geslagen transcriptie is dat: B. subtilis RNAP's moeten ongevoelig zijn voor translatie, wat in contrast staat met het wijdverbreide gebruik van translatie-gecontroleerde transcriptieterminatie in E coli. In overeenstemming met deze voorspelling vonden we dat intrinsieke transcriptieterminators in B. subtilis zijn effectief, zelfs wanneer de hele terminator-haarspeld is vertaald. Toen we de translatie forceerden door een sterke intrinsieke terminator stroomafwaarts van een sterk vertaald gen (pupG) door het stopcodon ervan te vervangen (Fig. 2a en Extended Data Fig. 5a), bleef de transcriptie doorlezen ondetecteerbaar (Fig. 2b). Daarentegen is hetzelfde ORF-uitgebreide construct in E coli toont volledig opgeheven terminator-activiteit, wat consistent is met het huidige paradigma dat het nauw aansluitende ribosoom de vorming van terminatorhaarspeldjes blokkeert (Fig. 2c) 12,27,28. Dus, in tegenstelling tot E coli, de baanbrekende ribosomen in B. subtilis moduleren intrinsieke transcriptieterminatiesignalen niet sterk (behalve in sommige gevallen 29-31). Dit fundamentele verschil kan op twee belangrijke manieren bijdragen aan de uiteenlopende regulerende mechanismen die tussen deze soorten worden waargenomen. Ten eerste stelt het intrinsieke terminators in staat om functionele non-stop mRNA's te genereren voor sterk vertaalde genen in bacillen 32 , zoals het mRNA voor een alternatieve ribosoom-reddingsfactor waarvan de analoge in E coli wordt post-transcriptioneel gegenereerd door RNase III-splitsing 33,34. Ten tweede leidt het gebrek aan koppeling waarschijnlijk tot het vermijden van ribosoom-gecontroleerde transcriptionele verzwakkers en geeft het in plaats daarvan de voorkeur aan op riboswitch of eiwit gebaseerde mRNA-leiders die algemeen worden waargenomen in B. subtilis 14,17-19 .

een, Schema's van ORF-extensieconstructie en controles voor: pupG (80e percentiel in translatie-efficiëntie). T1: pupG terminator (99,97% beëindigingsefficiëntie), T2: Frisdrank terminator (99,9% beëindigingsefficiëntie). Sterren geven mutaties aan. De stop-tot-stam afstanden NS voor de natieve en uitgebreide constructies zijn respectievelijk 26 nt en min 14 nt. b-c, Northern blots tegen doorgelezen isovormen (boven) en controle voor pupG uitdrukking (onder) voor constructies aangegeven in een. N.D.: niet gedetecteerd. Zie aanvullende figuur 1 voor gelbrongegevens. Northern-blotting werd tweemaal uitgevoerd voor B. subtilis (biologische replica's) en eenmalig E coli. Resultaten voor beide soorten werden onafhankelijk bevestigd (biologische replicaten) door qRT-PCR (methoden). NS, Voorbeelden van terminator-stamlussen die overlappen met stopcodons (patA d=� niet, ispG d=𢄥 nt). Pieken in Rend-seq-gegevens tonen plaatsen van beëindiging. Terminator-stelen zijn gemarkeerd. Stopcodons zijn aangegeven in rood. Vertaalefficiëntie voor patA en ispG zijn respectievelijk 63e en 90e percentielen in B. subtilis. e, Genoombrede distributie van stop-tot-stamafstanden NS (zie inzet) voor intrinsieke terminators met een hoge betrouwbaarheid in B. subtilis (boven, n=1228) en E coli (onder, n=409). ORF-overlappende terminators (NS𢙀) zijn in donker magenta, en ribosoom-overlappende terminators (NS� nt) zijn in medium en donker magenta, met de respectievelijke fractie terminators aangegeven. Zie ook Uitgebreide gegevens Fig. 5, Aanvullende gegevens 2.

De grote RNAP-ribosoomafstand in B. subtilis heeft ook een grote invloed op de positie van intrinsieke transcriptieterminators aan het einde van operons. Met behulp van end-enriched RNA-seq (Rend-seq, zie SI-discussie voor een beschrijving) om actieve intrinsieke terminators in kaart te brengen 35 , vonden we dat veel terminator-stam-loops direct overlappen met stopcodons van de laatste genen van operons (107/1228 met ‘stop-tot-stam afstand’ 𢙀 nt, Fig. 2d), een configuratie die antitermination zou veroorzaken in E coli door de baanbrekende ribosomen 12 . Bovendien is de grote meerderheid (72%) van de intrinsieke terminators in B. subtilis zijn gepositioneerd binnen een halve ribosoomvoetafdruk stroomafwaarts van het stopcodon (stop-tot-stamafstand � nt, Fig. 2e, aanvullende gegevens 2). In E coli, bevindt slechts 24% van de intrinsieke terminatorstammen zich binnen 12 nt van het stopcodon, en deze hebben een significant verminderde terminatieactiviteit vergeleken met andere terminators (p㰐 𢄣 , Uitgebreide gegevens Fig. 5b - ​ -e). e). Daarentegen zijn de gen-proximale terminators in B. subtilis vertonen geen significant zwakkere beëindiging (pϠ.3, Extended Data Fig. 5f - ​ -i), i ), wat wijst op een gebrek aan translationele interferentie op de vorming van terminator-haarspeldjes. Deze resultaten tonen verder aan dat de meeste operons in B. subtilis worden getranscribeerd zonder een nauw aansluitend ribosoom.


Conclusie

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een geoptimaliseerde steekproefmethode voor: B. subtilis metaboloom analyses. Voor zover ons bekend is dit de eerste B. subtilis metaboloomanalyseprotocol dat rekening houdt met de EC. Behalve voor werk beschreven door Coulier el al. (2006) [26], de EG voor B. subtilis is niet beschreven in de literatuur [32] of ligt onder het bereik beschreven door Atkinson [24]. De verschillende resultaten die worden gezien met verschillende extractieoplossingen en de variërende resultaten, afhankelijk van het bemonsteringsprotocol, geven aan dat niet alleen de EC wordt beïnvloed door het gekozen metaboloombemonsteringsprotocol, maar ook het hele metabolietprofiel. Dit onderstreept het belang van specifiek ontwikkelde protocollen.

Ten slotte biedt de beschreven aanpak de mogelijkheid om een ​​globaal beeld te krijgen van het intracellulaire metaboloom van B. subtilis. Dit zou bijvoorbeeld het screenen van metabolisch interessante mutanten mogelijk maken of de afhankelijkheid van het intracellulaire metaboloom van groeiomstandigheden of omgevingsstress analyseren.


Transformatie van microbiële complexen in componenten van bodemconstructies van verschillende oorsprong (bodem, turf, zand) tijdens vries-ontdooiprocessen

In een modelexperiment werd de transformatie van microbiële complexen van gecultiveerde saprotrofe bacteriën en gisten tijdens invriezen-ontdooien bestudeerd in verschillende natuurlijke substraten die worden gebruikt om bodemconstructies te maken voor stedelijke landschapsarchitectuur en voor het kweken van kruidachtige planten. Het aantal saprotrofe bacteriën en gisten was zowel afhankelijk van het type substraat als van temperatuurveranderingen tijdens het invriezen-ontdooien. Bij het invriezen van veen en grond (bouwhorizon) tot 0 en –5°C en bij het daaropvolgende ontdooien tot 0°C werd een significante toename van het gistgetal geregistreerd. Het maximale aantal gisten in grond en veen was 5,1 log (KVE/g). In tegenstelling tot het aantal gisten, werd het aantal saprotrofe bacteriën in bodem en veen gekenmerkt door een sterke afname wanneer de substraattemperatuur negatief was en piekte op respectievelijk 19-22 en 10°C. Het maximale aantal bacteriën in grond en veen was respectievelijk 7,5 en 8,0 log (KVE/g). In zand was het aantal saprotrofe bacteriën en gisten niet afhankelijk van de temperatuur en was 5,0 log (CFU/g) voor bacteriën en 3,4 log (CFU/g) voor gisten in alle stadia van de vries-ontdooicycli. In totaal werden 15 saprotrofe bacteriesoorten en 29 gistsoorten geïsoleerd uit verschillende componenten van bodemconstructies. Bij de maximale bevriezingstemperatuur in de cycli (–5°C), drie bacteriesoorten met psychrofiele eigenschappen (Flavobacterium psychrophilum) en het vermogen om endosporen te vormen die resistent zijn tegen verschillende bijwerkingen (Bacillus subtilis, B. megaterium) werden geïsoleerd uit grond en veen. Onder de gisten die bij negatieve temperatuur uit aarde en turf werden geïsoleerd en die ook psychrofiele eigenschappen hadden, waren: Candida-sake, Rhodotorula glutinis, Rh. mucilaginosa, en Solicoccozyma terricola. Bacteriën met psychrofiele eigenschappen, F. psychrophilum en Pseudomonas fluorescens, evenals twee soorten bacillen, Bacillus subtilis en B. megaterium werden onthuld in zand bij negatieve temperaturen. Slechts één gistsoort, Debaryomyces hansenii, in staat om stresscondities te overleven in de vorm van ascosporen, werd geïsoleerd uit zand bij -5°C. Het effect van temperatuurdalingen op korte termijn op de dynamiek van het aantal en de diversiteit van de microbiële gemeenschappen in bodemconstructies in een modelexperiment toonde aan dat gespecialiseerde bodemconstructies in staat waren om kortstondige temperatuurdalingen, typisch voor de lente- en herfstperiode, te "tolereren", waardoor het aantal initiële populaties na stopzetting van de negatieve effecten. Dit duidt ook op ontwikkeling van de bodemconstructies in het proces van functioneren, in plaats van op snelle degradatie.


Resultaten en discussie

EEN B. subtilis pks Fenotype zichtbaar in een interspecies-interactie.

Wanneer gecocultiveerd op agarplaten, B. subtilis en Streptomyces coelicolor ondergaan karakteristieke ontwikkelingsroutes die leiden tot de productie en sporulatie van secundaire metabolieten. Op vroege tijdstippen tijdens de co-incubatie, een kolonie van B. subtilis groeien op een gazon van S. coelicolor produceert een nogal onopvallende gemengde cultuur (Fig. 1 B). Toen we willekeurige transposon-insertiemutanten van B. subtilis onder voorwaarden van co-cultivatie met S. coelicolor, meerdere B. subtilis mutanten vertoonden een opvallend fenotype: ze induceerden de voortijdige synthese in de aangrenzende S. coelicolor van het rode antibioticum undecylprodigiosin [ref. 18 Afb. 1 B en ondersteunende informatie (SI) Afb. 5]. Nucleotidesequentie-analyses onthulden dat elk van de B. subtilis mutanten herbergden een transposon-insertie in een van de pks genen in totaal, hebben we zes onafhankelijke mutanten teruggevonden met transposon-inserties in 5 van de 16 pks genen (SI-tabel 1). Vervolgens hebben we een verwijdering van de volledige pks genencluster, pksΔ (Afb. 1 EEN) en ontdekte dat de volledige deletie een fenotype veroorzaakte dat niet te onderscheiden was van het fenotype dat werd waargenomen bij de individuele transposonmutanten.

Gewapend met de pks deletiestam onderzochten we de effecten ervan op de interacties tussen B. subtilis en andere Streptomyces soort. We vonden dat de pks gencluster is verantwoordelijk voor de productie van een diffundeerbare metaboliet die de groei van Streptomyces avermitilis. De pks fenotypisch effect werd aanvankelijk verdoezeld door het feit dat B. subtilis produceert een ander antibioticum dat actief is tegen Streptomyces avermitilis. Met behulp van een tweede scherm identificeerden we de andere activiteit door een mutant in de albA locus, which disrupted the production of the lantibiotic subtilosin encoded by the sbo-alb genen ( SI Text ref. 19). De pks phenotype in interaction with S. avermitilis is made clear when comparing an albAΔ single mutant to a pksik, albAΔ double mutant strain (Fig. 1 B). These results provided a clear indication that the B. subtilis pks genes produce an active bacillaene synthase (20), prompting us to pursue questions regarding the organization of synthase enzymes in their natural producer.

Subcellular Localization of the PKS Proteins.

B. subtilis has emerged as an excellent model organism for bacterial cytology, which gave us a unique opportunity to investigate the cell biology of the enormous NRPS/PKS biosynthetic system. We began by constructing C-terminal fusions of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) to individual Pks proteins in the synthase (Fig. 1 EEN). Cells producing these fusion proteins retained inhibitory activity against S. avermitilis, indicating that the fusion proteins were functional (SI Fig. 5). Cells harboring fusions of YFP with PksR, a large multimodular component of the synthase, and CFP with PksE, a trans-acting AT (7), were grown to late-exponential phase and examined by fluorescence microscopy. Quite surprisingly, we found that PksR-YFP and PksE-CFP each localize to a single focus within the B. subtilis cells (Fig. 2 EEN). The same was observed for a PksJ-CFP fusion (SI Fig. 6). The focus of fluorescence was not fixed at the same location in each cell medial as well as polar positioning was observed in different cells. The majority of cells had a single focus of fluorescence (69%, N = 876, PksR-YFP), although a minor fraction of cells showed two foci (6%, N = 876, PksR-YFP), and some cells had no detectable fluorescent signal (25%, N = 876, PksR-YFP). In these cells, the pks gene fusions are expressed under their native promoters, and proteins of predicted size for each Pks fusion are detectable by Western blot (Fig. 2 EEN). No fluorescence was observed in cells from cultures in early exponential phase, suggesting that NRPS/PKS synthesis or assembly is subject to growth-phase regulation. We examined the PksR-YFP protein by immunoblot analysis during a time course and found that protein abundance of PksR-YFP increases with cell density, consistent with growth-phase regulation of the bacillaene synthase (SI Fig. 7).

Localization of Pks proteins in B. subtilis 3610. (EEN) The PksE-CFP (Bovenste) and PksR-YFP fusions (Lower) localize to a discrete spot. (Links) Fluorescence of Pks protein fusion (FP) (Center) fluorescence from membrane stained with the dye TMA-DPH (Molecular Probes, Eugene, OR) (Rechts) overlay of fluorescence images. (Images are the same in C en NS). On the far right, an immunoblot of PksE-CFP, PksR-YFP and SrfAB-YFP (see C, below) probed with anti-GFP antibody shows synthesis of the full-length fusion proteins. (B) Colocalization in a strain simultaneously producing PksE-CFP and PksR-YFP. (Links) Fluorescence from fusion proteins as noted above. PksE-CFP and PksR-YFP images are merged to show colocalization at points of overlap in yellow (Merge). Membranes are stained with TMA-DPH as in EEN (Membranes). (C) The SrfAB-YFP protein is diffuse in the cytoplasm. (NS) PksE-CFP localization occurs with an intact pks gene cluster (Bovenste) but not with a disruption of pksJ (Lower). Production of PksE-CFP is identical in both strains by immunoblot (far right). Purified CFP (right lane) is included to demonstrate that the PksE-CFP fusion is stable in the pksJ mutant background. (Scale bars, 1 μm.)

We next compared the localization of PksE-CFP and PksR-YFP in the same strain. As predicted, we observed a pattern of overlapping localization, consistent with concerted action of the proteins as part of the holoenzyme synthase. Indeed, fluorescence microscopy of a strain harboring both PksR-YFP and PksE-CFP shows that the proteins colocalize (Fig. 2 B). Similar colocalization was also apparent using the PksJ-CFP with PksR-YFP fusions (SI Fig. 6). These observations support a model in which the Pks proteins, possibly assembled as functional enzymatic complexes, are organized as a single megacomplex per cell.

To compare localization of the Pks proteins with proteins of a similar size, we fused CFP and YFP to the four proteins of the surfactin NRPS [SrfAA (≈402 kDa), SrfAB (≈401 kDa), SrfAC (≈144 kDa), and SrfAD (≈27 kDa)] (genolist.pasteur.fr/SubtiList). In contrast to the Pks proteins, the surfactin synthase proteins do not localize to a point but are diffuse throughout the cytoplasm (Fig. 2 C and SI Fig. 6). The level of fluorescence intensity varies between cells in a field expressing SrfA protein fusions to CFP and YFP, consistent with a previous report that described heterogeneity within a population of B. subtilis cells (21). Differential patterns of localization for Pks fusion proteins and those of the surfactin synthetase suggest that the localization patterns of the NRPS/PKS and NRPS proteins are physiologically relevant for production of small molecules.

The fluorescent fusion proteins also allowed us to test some of the requirements for the assembly of the megacomplex. We reasoned that the PksE trans-AT, a relatively small protein (≈86 kDa), might require the presence of the large core synthase proteins PksJ, L, M, N, and R to localize properly. We therefore investigated the localization of a fluorescent PksE protein fusion in a strain lacking the giant subunits (Fig. 1 EEN). We engineered a B. subtilis strain carrying the PksE-CFP fusion and a transposon insertion in the pksJ gene ( SI Text ). Disrupting the pksJ gene caused PksE-CFP to mislocalize and become diffuse in the cytoplasm (Fig. 2 NS). However, normal localization of PksE-CFP was observed in a strain carrying a transposon disruption in pksR, the last gene in the cluster (SI Fig. 6). The requirement of the multimodular enzyme assembly line proteins for localization of PksE-CFP indicates that localization of the large Pks proteins determines the pattern for localization of the trans-acting enzymes.

A PKS Megacomplex Visible by Cryoelectron Microscopy.

Given that our data suggest that all of the Pks proteins reside at a single site, we reasoned that this megacomplex might be large and distinct enough to be observed using EM. WT (unmodified strain NCIB3610) cells or cells containing either PksR-YFP or PksE-CFP were cryopreserved using high-pressure freezing and freeze-substitution fixation to provide accurate preservation of subcellular structures, and thin sections were examined by EM (22). The WT, PksR-YFP, and PksE-CFP samples all showed a large electron-dense mass in the cytoplasm (Fig. 3 and SI Fig. 8). In all cases, the mass is juxtaposed to the cell membrane, and the position within the cell varies from the midcell to the pole. The mass, which differs in size and shape from cell to cell, does not appear to have a discrete border with the cytoplasm, suggesting that it is not membrane enclosed (see SI Fig. 8 for additional images). This mass has not been reported previously in EM analyses of B. subtilis. We hypothesized that previous EM analyses using laboratory strains of B. subtilis would not have detected this structure due to the presence of a mutated copy of the sfp gene (sfp°), which encodes the phosphopantetheinyl transferase required for assembly line enzyme function. However, a large electron-dense mass was observed by EM in PY79 (sfp°) cells using our cryopreservation techniques, indicating that a functional Sfp enzyme is not required for megacomplex formation (SI Fig. 9). In addition, we have noted that localization of Pks protein fusions is visible by fluorescence in the PY79 strain. An alternative explanation for lack of detection by EM previously is that our method of cryopreservation maintains the integrity of these structures, which might be destroyed using classical fixation protocols.

Assembly of a megasynthase complex in B. subtilis. Transmission electron microscopy (TEM) of thin sections from cryopreserved B. subtilis cells reveals an electron-dense mass near the plasma membrane in WT (unmodified strain NCIB3610), PksE-CFP, and PksR-YFP cells. ImmunoEM localization of the PksR-YFP and PksE-CFP proteins to the mass is visible as circular electron-dense dots of 20-nm gold particles conjugated to the secondary antibody (arrowheads). Arrows indicate the NRPS/PKS megacomplex mass. (Scale bar, 0.2 μm.) (Bottom Right) A higher-magnification image of PksR-YFP localized to the megacomplex is displayed. The arrow points to the cell wall and plasma membrane. Arrowhead points to a gold particle. (Scale bar, 0.1 μm.)

To determine whether the mass we see by EM in a WT B. subtilis cell corresponds to the fluorescent focus of NRPS/PKS observed in our fluorescence microscopy analyses, we used immunoEM detection of PksR-YFP and PksE-CFP. Using an anti-GFP primary antibody and a gold-labeled secondary antibody, we observed that PksR-YFP and PksE-CFP localize to the electron-dense mass in the B. subtilis cytoplasm (Fig. 3 and SI Fig. 8). The presence of the large mass in WT B. subtilis and the localization of Pks proteins to this mass suggest that we have identified a proteinaceous subcellular structure whose function, at least in part, is the biosynthesis of secreted bacillaene.

To investigate whether assembly of the megacomplex depends upon the Pks proteins, we compared WT B. subtilis to a pksΔ strain by EM. Limiting our analysis to cells sectioned longitudinally in our EM thin sections, we compared 43 cells of the WT strain to 43 cells of the pksΔ strain. In this analysis, 21 of 43 WT thin sections had a visible mass with similar characteristics to masses that were positive in our immunoEM localization of PksR-YFP and PksE-CFP (SI Fig. 9). By contrast, the pksΔ thin sections lacked these structures, having only 3 of the 43 pksΔ cells with a mass that we could not unambiguously rule out. The presence of these masses in WT but not pksΔ cells indicates that assembly of this structure requires the Pks proteins. We hypothesize that the mass is an organelle-like assemblage of primarily NRPS/PKS synthases and possibly other proteins.

Given the massive size of this macromolecular assemblage, we sought to estimate the amount of NRPS/PKS protein in a single cell using quantitative Western blots ( SI Text ). We calculated that, on average, a single cell contains 50–150 copies of the PksR protein and ≈5,000–10,000 copies of the PksE protein. It is likely that not all of the PksE proteins are present in the complex, because we can detect some fluorescent signal in the cytoplasm. The accuracy of the estimated mass of the megacomplex is limited by variation in size of the structure (as seen by fluorescence intensity and EM) from cell to cell and by the differences in immunoblot transfer between small purified GFP (27-kDa) and the much larger PksR-YFP (312-kDa) and PksE-CFP (104-kDa) protein fusions. However, the ratio of 10–100 × the amount of the trans-AT, PksE, over the multimodular protein, PksR, is consistent with the predicted function of the proteins. Based on the relative stoichiometry of core synthase proteins to trans-acting enzymes, the mass of a single complete synthase may be well over 2.5 megadaltons. An assemblage of many synthases would range from 10 to 100 megadaltons.

Assembly Line Association of PKS Multimodular Proteins PksM, PksN, and PksR.

In accord with the assembly line organization, we hypothesized that individual B. subtilis NRPS/PKSs consist of a core synthase composed of the PksJ-R proteins and multiple copies of trans-acting enzymes. To probe the association of individual synthase components in the cell, we used an anti-GFP antibody conjugated to Sepharose beads to immunoprecipitate PksR-YFP and associated NRPS/PKS proteins from cell lysates. Coimmunoprecipitated proteins were either trichloroacetic acid-precipitated or excised from silver-stained acrylamide gels and identified by tandem MS analysis. A WT strain without a fusion served as a negative control. Peptide fragments of the PksN and PksM proteins were identified in the MS analyses, consistent with these proteins forming individual assembly lines with PksR (SI Table 2). As predicted by a colinear order of assembly (Fig. 1 EEN), peptides of PksN were more abundant in MS analysis than peptides of PksM. We did not identify PksJ and PksL in the coimmunoprecipitation experiments. The absence of canonical linker domains at the C termini of PksJ and PksL suggests that the split modules at the PksJ-L and PksL-M junctions are organized by nonlinker protein–protein interactions (6, 23, 28). Thus, the interactions between PksJ-PksL and PksL-PksM proteins may not form a complex of sufficient stability for immunoprecipitation. We have proposed a biosynthetic scheme for bacillaene that is supported by the collinear assembly of PksJ-R (28). Based on our knowledge of the bacillaene structure, the C-terminal KS domains on PksJ and PksL would serve only for transfer of an acyl-S-T intermediate, as opposed to incorporation of an additional substrate. In contrast, the interaction between PksN and PksR would require action of the PksN C-terminal DH and KR modules on an acyl-S-T intermediate attached to the N-terminal PksR-T domain (Fig. 4). Given this scheme, we speculate that PksN, PksM, and PksR form a complex that we can identify by immunoprecipitation, but PksJ-PksL or PksL-PksM do not. Thus, in the absence of canonical C- and N- terminal linkers, the requirements for substrate processing and transfer between multimodular proteins in a synthase may be important determinants of protein complex formation and synthase assembly.

The predicted function for the enzymes and enzymatic modules encoded by the bacillaene gene cluster. The proteins PksB-I, AcpK, and PksS are free-standing enzymes thought to function in trans to the multimodular proteins. PksJ, -L, -M, -N, and -R are multimodular NRPS/PKS (PksJ and -N) or PKS (PksL, -M, and -N) proteins forming the core assembly line synthase. The predicted function of each individual module or freestanding enzyme is listed in the legend. The unusual C-terminal KS modules in PksJ and -L and the N-terminal DH modules in PksL and -M are likely to mediate interprotein transfer of nascent bacillaene.

It remains to be determined how the collection of individual NRPS/PKS assembly lines in a cell organizes into a single megacomplex. One possibility is that a specific portion of every assembly line is associated with a membrane subdomain, either directly or by interaction with a membrane protein. This kind of membrane association has been observed in proteins from other assembly line enzymes (24, 25). Another possibility is that the individual assembly line complexes associate with each other to form a megacomplex. In this scenario, membrane association of the megacomplex could occur through a subset of the intact assembly lines, but megacomplex assembly would be driven by interactions between domains within individual synthases. Intriguingly, there are predicted coiled-coil motifs within several of the ATd domains in the Pks synthase (Fig. 4). We speculate that the coiled-coil domains may play a role in ordering multimodular proteins within a single assembly line or in mediating the potential association of two complete assembly lines.

In sum, we are reporting several previously uncharacterized features of the organization and capacity of B. subtilis to make antibiotics. The proteins of the bacillaene synthase are incorporated into an organelle-like cluster juxtaposed to the membrane. Formation and localization of this megacomplex are consistent with assembly of a biosynthetic factory, potentially coupled to dedicated secretion machinery to avoid toxic buildup of bacillaene in the cytoplasm. It will be important to determine the identity of the exporter protein(s) as well as the biochemical determinants for localization of the Pks proteins and assembly of the megacomplex. Although lantibiotic synthase factories anchored at the cytoplasmic face of bacterial membranes have been reported (26, 27), our findings provide insights into quaternary organization of natural product biosynthetic factories in antibiotic producers. Finally, we highlight that the combination of the bacillaene structure and the observed synthase organization in the model organism B. subtilis holds great potential for understanding enzymatic synthesis of hybrid PK-NRP metabolites.


Biological Safety Procedures

Biological safety fulfills three purposes: to avoid contamination of your biological sample with other species to avoid exposure of the researcher to the sample and to avoid release of living material into the environment. Biological safety begins with the receipt of the living sample continues with its storage, handling, and propagation and ends only with the proper disposal of all contaminated materials. A catalog of operations known as “sterile handling” is usually employed in manipulating living matter. However, the actual manner of treatment largely depends on the actual sample, which can be quite diverse: Escherichia coli and other bacterial strains, yeasts, tissues of animal or plant origin, cultures of mammalian cells, or even derivatives from human blood are routinely handled in a biological laboratory. Two of these, bacteria and human blood products, are discussed in more detail below.

The Department of Health, Education, and Welfare (HEW) has classified various bacteria into different categories with regard to shipping requirements (see Sanderson and Zeigler, Methods Enzymol204: 248–264 [1991]). Nonpathogenic strains of E coli (such as K12) and Bacillus subtilis are in Class 1 and are considered to present no or minimal hazard under normal shipping conditions. Echter, Salmonella, Haemophilus, and certain strains of Streptomyces en Pseudomonas are in Class 2. Class 2 bacteria are “Agents of ordinary potential hazard: agents which produce disease of varying degrees of severity. but which are contained by ordinary laboratory techniques.” Contact your institution’s safety office concerning shipping biological material.

Human blood, blood products, and tissues may contain occult infectious materials such as hepatitis B virus and human immunodeficiency virus (HIV) that may result in laboratory-acquired infections. Investigators working with lymphoblast cell lines transformed by Epstein–Barr virus (EBV) are also at risk of EBV infection. Any human blood, blood products, or tissues should be considered a biohazard and should be handled accordingly until proved otherwise. Wear appropriate disposable gloves, use mechanical pipetting devices, work in a biological safety cabinet, protect against the possibility of aerosol generation, and disinfect all waste materials before disposal. Autoclave contaminated plasticware before disposal autoclave contaminated liquids or treat with bleach (10% [v/v] final concentration) for at least 30 minutes before disposal (this is valid also for used bacterial media).

Always consult your local institutional safety officer for specific handling and disposal procedures of your samples. Further information can be found in the Frequently Asked Questions of the ATCC homepage and is also available from the National Institute of Environmental Health and Human Services, Biological Safety.


Aardema BW, Lorenz MG, Krumbein WE (1983) Protection of sediment-adsorbed transforming DNA against enzymatic inactivation. Appl Environ Microbiol 46:417–420

Borenstein S, Ephrati-Elizur E (1969) Spontaneous release of DNA in sequential genetic order by Bacillus subtilis. J Mol Biol 45:137–152

Carlson CA, Pierson LS, Rosen JJ, Ingraham JL (1983) Pseudomonas stutzeri and related species undergo natural transformation. J Bacteriol 153:93–99

Catlin BW (1956) Extracellular deoxyribonucleic acid of bacteria and a deoxyribonuclease inhibitor. Science 124:441–442

Crabb DW, Streips UN, Doyle RJ (1977) Selective enrichment for genetic markers in DNA released by competent cultures of Bacillus subtilis. Mol Gen Genet 155: 179–183

Ephrati E (1968) Spontaneous transformation in Bacillus subtilis. Genet Res 11:83–96

Greaves MP, Wilson MJ (1970) The degradation of nucleic acids and montmorillonite-nucleic-acid complexes by soil microorganisms. Soil Biol Biochem 2:257–268

Hara T, Ueda S (1981) A study on the mechanism of DNA excretion from P. aeruginosa KYU-1—effect of mitomycin C on extracellular DNA production. Agric Biol Chem 45:2457–2461

Herdman M, Carr NG (1971) Recombination in Anacystis nidulans mediated by an extracellular DNA/RNA complex. J Gen Microbiol 68:XIV

Labarca CA, Paigen K (1980) A simple, rapid and sensitive DNA assay procedure. Anal Biochem 102:344–352

Lorenz MG, Wackernagel W (1987) Adsorption of DNA to sand and variable degradation rates of adsorbed DNA. Appl Environ Microbiol 53:2948–2952

Lorenz MG, Wackernagel W (1988) Impact of mineral surfaces on gene transfer by transformation in natural bacterial environments. In: Klingmüller W (ed) Risk assessment for deliberate releases. Springer, Berlin Heidelberg New York, p 110–119

Lorenz MG, Aardema BW, Krumbein WE (1981) Interaction of marine sediment with DNA and DNA avalability to nucleases. Mar Biol 64:225–230

Lorenz MG, Aardema BW, Wackernagel W (1988) Highly efficient genetic transformation of Bacillus subtilis attached to sand grains. J Gen Microbiol 134:107–112

Marmur J (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J Mol Biol 3:208–218

Ogram A, Sayler GS, Barkay T (1987) The extraction and purification of microbial DNA from sediments. J Microbiol Methods 7:57–66

Ogram A, Sayler GS, Gustin D, Lewis RJ (1988) DNA adsorption to soils and sediments. Environ Sci Technol 22:982–984

Sinha RP, Iyer UN (1971) Competence for genetic transformation and the release of DNA from Bacillus subtilis. Biochim Biophys Acta 232:61–71

Stewart GJ, Carlson CA (1986) The biology of natural transformation. Annu Rev Microbiol 40:211–235

Takahashi I (1962) Genetic transformation of Bacillus subtilis by extracellular DNA. Biochem Biophys Res Commun 6:467–470


Bekijk de video: BACILLUS SUBTILIS (December 2021).