Informatie

Hoe de werkelijke flux in het menselijke metabolische model van een cellijn te bepalen?


Het op te lossen probleem is om te bepalen wat de fluxwaarden zijn voor de verschillende reacties in het menselijke metabolische model.

Voor zover ik begrijp, zou een goede manier om dat te doen zijn om genexpressiegegevens te gebruiken om een ​​flux te berekenen, maar ik weet niet zeker of dat een goed idee is of dat het zelfs mogelijk is. Ik ben niet erg zeker van wat het juiste proces is om dit te doen.

Bedankt voor alle hulp of suggesties!


Ik ben geen expert op dit gebied, maar het kwantificeren van genexpressie is geen eenvoudig probleem, hoewel het een mogelijkheid is.

Een oplossing waarvan ik weet dat deze wordt gebruikt, is het gebruik van radioactieve markers. Zie bijvoorbeeld deze recensie en in het bijzonder de sectie "De cel-cel-lactaat-shuttle", die wat inzichten kan geven.

Dit kunnen radioactieve tracers zijn (zoals [14C]lactaat), niet-radioactieve tracers (met [13C] of [2H]), "net exchange metingen" (ik weet niet echt wat dit hier betekent, misschien het soort uitwisselingsberekeningen die ze hier presenteren), en spierbiopten (het is dan mogelijk om de metabolietconcentratie te meten door bijvoorbeeld enzymatische reactie of spectrofotometrie).


Samenvatting: Probeer een van de extensies van FBA die rekening houdt met genregulatie, maar houd rekening met de beperkingen. Zie hieronder voor referenties.

Lang antwoord:

Er zijn twee benaderingen voor het schatten van interne metabole fluxen: de (voornamelijk) experimentele en de (voornamelijk) computationele. Ik zeg in de eerste plaats omdat zelfs voor de experimentele benadering een grote hoeveelheid berekeningen moet worden gedaan, en voor de computationele benadering moeten experimentele studies worden geraadpleegd om realistische modelparameters in te stellen.

Experimentele bepaling van interne metabole fluxen is gecentreerd rond 13C-metabolische fluxanalyse (13C-MFA) uitgevoerd door middel van koolstoflabeling-experimenten, zoals hierboven vermeld. 13C-MFA is gecompliceerd en duur, dus er is een relatief gebrek aan experimentele gegevens, en de meeste experimenten bestrijken slechts een paar fluxen in vergelijking met het aantal mogelijke reacties, meestal enkele duizenden in metabole modellen op genoomschaal. In 13C-MFA schatten de meeste experimenten de fluxen in een veel kleiner model (bijvoorbeeld het centrale koolstofmetabolisme), waarbij andere mogelijke reacties worden vermeden of genegeerd, en de set fluxen die wordt geschat varieert tussen experimenten.

Modellen die worden gebruikt in computationele benaderingen van fluxanalyse zijn doorgaans groter dan de modellen die worden gebruikt in 13C-MFA-experimenten, en daarom is het meestal niet mogelijk om alle fluxen alleen uit experimentele gegevens te bepalen. Daarom wordt voornamelijk een benadering gebruikt die constraint-based modeling (COBRA) wordt genoemd. De basisveronderstelling van de meeste huidige fluxanalysemethoden, zowel experimenteel als computationeel, is dat de metabolietconcentraties zich in een stabiele toestand bevinden. Wiskundig kan dit worden beschreven door de vergelijking

$Soverrightarrow v = 0$

waar $S$ een . is stoichiometrische matrix het relateren van de metabolieten en alle mogelijke reacties (eigenlijk een compacte beschrijving van het metabolische model), en $overrightarrow v$ is de flux vector met alle fluxwaarden. Naast de steady-state-vereiste worden doorgaans beperkingen toegepast op de opname- en uitscheidingssnelheden van verschillende metabolieten, waardoor ze worden beperkt tot biologisch realistische waarden. Ook andere eisen, zoals eisen aan het ATP-onderhoudsverbruik kunnen worden toegepast.

Omdat er typisch veel mogelijke fluxpatronen zijn die aan de bovenstaande beperkingen voldoen, is een principe nodig voor het selecteren van een biologisch realistische oplossing uit de oplossingsruimte van haalbare fluxpatronen. Ervan uitgaande dat cellen hun metabolische patronen op de een of andere manier optimaliseren, is dat anders objectieve functies worden gebruikt die proberen het metabolische gedrag van cellen vast te leggen. Zodra een objectieve functie is gekozen, kan de reeks mogelijke oplossingen worden gezocht voor het fluxpatroon dat de hoogste objectieve waarde geeft als functie van de fluxvector. Aangezien de doelstelling lineair is (eenvoudigweg een gewogen som van fluxen), kan snel een optimale oplossing worden gevonden. Over het algemeen kunnen er veel verschillende optimale oplossingen bestaan ​​voor een bepaalde doelfunctie. De methode om een ​​objectieve functie toe te passen op een beperkt metabool model in stabiele toestand wordt Flux Balance Analysis (FBA) genoemd.

De meest basale en populaire doelstelling is de maximalisatie van de biomassaproductie. Hoewel nuttig voor het bepalen van maximale groeisnelheden, dit doel is waarschijnlijk niet realistisch wanneer het wordt toegepast op menselijke cellen. FBA en verwante methoden zijn over het algemeen zeer geschikt voor het bepalen van prestatielimieten voor afzonderlijke eindpunten zoals groeisnelheid of productie van een enkele metaboliet, maar zijn niet in staat om alle interne metabole fluxen nauwkeurig te bepalen. Belangrijk hierbij is het punt dat er vele optimale oplossingen kunnen bestaan ​​voor een enkele objectieve functie.

Aangezien 13C-MFA en FBA gebaseerd zijn op hetzelfde concept van metabolietbalancering, kunnen ze worden gezien als verschillende uiteinden van hetzelfde spectrum, van puur experimenteel tot puur computationeel, met 13C-MFA-beperkte FBA (waarbij 13C-MFA-resultaten worden gebruikt om de mogelijke fluxen in een model beperken voordat een objectieve functie wordt geoptimaliseerd, of het verschil tussen de experimentele fluxen en de FBA-oplossing, onder voorbehoud van aanvullende beperkingen) in het midden wordt geminimaliseerd.

Voor een inleiding tot Flux Balance Analysis, zie Orth, Thiele & Palsson: "Wat is fluxbalansanalyse?" Natuur Biotechnologie 28 245-48 2010.

Voor het uitvoeren van Flux Balance Analyse zijn verschillende softwarepakketten beschikbaar. Een van de meest gebruikte is de COBRA Toolbox voor Matlab. Een versie voor Python genaamd CobraPy is ook in ontwikkeling. Beide zijn beschikbaar op http://opencobra.sourceforge.net/openCOBRA/Welcome.html

Merk op dat de meeste genexpressiegegevens alleen relatieve veranderingen in expressie tussen twee aandoeningen laten zien. De meeste methoden zijn dus gebaseerd op het vergelijken van twee verschillende omstandigheden. Meer recentelijk kan RNA-sequencing (RNAseq) ook worden gebruikt om meer directe metingen van genexpressieniveaus te verkrijgen. Er zijn veel uitbreidingen en variaties op FBA gepubliceerd die rekening houden met genexpressie. Sommige hiervan zijn regelgevende FBA (rFBA, Covert & Palsson: Journal of Biological Chemistry, 2002 277, 28058-28064), Metabolische aanpassing door differentiële expressie (MADE, Jensen & Papin: Bio-informatica. 2011 februari 15;27(4):541-7 ) en iMAT (Schlomi et al: Bio-informatica (2010) 26 (24): 3140-3142.). Voor een recentere methode, gx-FBA (genexpressie-FBA), zie *Navid & Almaas, BMC Systems Biology 2012, 6:150).

Misschien wil je ook dit artikel lezen dat gaat over weefselspecifieke metabole modellen: Computationele reconstructie van weefselspecifieke metabole modellen: toepassing op het menselijke levermetabolisme. Mol Syst Biol. 2010 sep 7;6:401. doi: 10.1038/msb.2010.56.

Het probleem met het gebruik van FBA en gerelateerde methoden om interne fluxen te schatten, is dat validatie van de resultaten moeilijk is vanwege het genoemde gebrek aan experimentele gegevens. In het laatste jaar van mijn master heb ik een projectrapport over dit onderwerp geschreven, met daarin een basisbeschrijving van 13C-MFA. Het kan worden gelezen op http://www.slideshare.net/jarlemag/rapport-31295058


Je kunt genexpressie niet gebruiken om fluxen te schatten. De redenen zijn als volgt. Genexpressie bepaalt mRNA-niveaus die op hun beurt enzymniveaus bepalen. De relatie tussen genexpressie en enzymniveau is echter niet lineair. Uw grootste probleem is echter dat de fluxen systeemafhankelijke eigenschappen zijn en niet afhankelijk zijn van een enkel enzym. Een flux is in principe een functie van alle kinetische eigenschappen van elk enzym in de route. De enige manier om de fluxen te krijgen, is door directe meting of door FBA- of kinetische modellen te gebruiken.


Succinaatdehydrogenaseremmers: in silico fluxanalyse en in vivo metabolomics-onderzoeken tonen geen ernstige metabole gevolgen voor ratten en mensen

metabolische modellering toont robuustheid van het metabolisme van zoogdieren in de richting van SDH-remming.

in vivo plasma metabolomics uitgevoerd met SDHI fungiciden boscalid & fluxapyroxad.

in silico vergelijking toonde geen verschillen voor rat & mens ten opzichte van SDH-remming.

SDHI-blootstelling: geen accumulatie van succinaat/lactaat bij ratten, niet verwacht bij mensen.


Metabole flux afleiden in kankeronderzoek

Cellulair metabolisme is een dynamisch systeem waarin metabolische voedingsstoffen constant worden geconsumeerd en afgebroken om energie te genereren (Fig. 1a). Prolifererende kankercellen activeren verder anabole routes om metabolische voorlopers te produceren voor het synthetiseren van macromoleculen, waaronder DNA, RNA, eiwitten en lipiden [1, 2]. Dit wordt mogelijk gemaakt via een complex metabool netwerk dat bestaat uit duizenden biochemische reacties [3, 4]. De dynamiek van het metabolisme kan worden beschreven in termen van de snelheid van metabole reacties, meestal aangeduid als metabole flux (de snelheid van transformatie van een substraat naar productmetabolieten in eenheden van mol per tijdseenheid per cel). Een belangrijk doel van metabool onderzoek naar kanker is begrijpen hoe de metabole flux door tumoren opnieuw wordt bedraad om energetische en biosynthetische eisen te ondersteunen [5, 6]. Het begrijpen van tumorspecifieke veranderingen in de metabole flux vergemakkelijkt de identificatie van geïnduceerde afhankelijkheid van specifieke enzymen waarvan de farmacologische remming zich selectief richt op kankercellen [7].

Metabole flux beschrijft de dynamiek van het cellulaire metabolisme. een Metabolische voedingsstoffen worden constant geconsumeerd en gemetaboliseerd om energie te genereren en biomassa te synthetiseren om celreplicatie te ondersteunen. B Metabolische fluxen geven een direct beeld van het cellulaire metabolische fenotype dat niet direct duidelijk is door algemeen toegankelijke 'omics'-technologieën

Een belangrijke complicatie bij metabolisch onderzoek naar kanker is dat, in tegenstelling tot de concentratie van mRNA, eiwitten en metabolieten, de metabole flux, die het cellulaire metabolische fenotype weerspiegelt, geen direct meetbare hoeveelheid is (figuur 1b). Het kan echter worden afgeleid door een combinatie van experimentele en computationele technieken.

De meest directe benadering voor het ondervragen van de intracellulaire metabole flux in kankercellen is het traceren van isotopen [8,9,10]. Dit werkt door kankercellen te voeden met isotopisch gelabelde voedingsstoffen en het isotopisch labelingspatroon van metabolieten te meten via massaspectrometrie of nucleaire magnetische resonantie (NMR). We bespreken hier de algemene toepassing van deze benadering in kankercellen die in cultuur worden gekweekt, hoewel het ook wordt gebruikt voor in vivo-onderzoeken [11, 12]. Het isotopische labelpatroon van metabolieten is indicatief voor de relatieve bijdrage van verschillende routes aan hun biosynthese. Terwijl een handmatige inspectie van gemeten metabolietisotoopdistributies de kwalitatieve beoordeling van metabolische activiteiten vergemakkelijkt, maakt computationele interpretatie via 13C-Metabolic Flux Analysis (13C-MFA) verder kwantitatieve inferentie van fluxen mogelijk.

Een andere veelgebruikte benadering voor fluxinferentie is COBRA-gebaseerde reconstructie en analyse (COBRA), die fluxbeoordeling mogelijk maakt via metabole netwerken op genoomschaal. COBRA wordt van oudsher gebruikt om microbieel metabolisme te modelleren voor biotechnologische en biotechnische doeleinden [13,14,15]. Recentere reconstructies van menselijke metabole netwerkmodellen op genoomschaal maakten het mogelijk deze benadering toe te passen voor grootschalige modellering van normale weefsels en verschillende menselijke ziekten, waaronder kanker [3, 16,17,18,19]. COBRA voorspelt fluxen onder metabolische stationaire toestand door rekening te houden met fysisch-chemische overwegingen, met name stoichiometrische massabalans, waarbij de totale productie- en consumptiesnelheden van metabolieten gelijk moeten zijn onder stabiele omstandigheden. Een belangrijk kenmerk van COBRA is het vermogen om flux en metabolische herbedrading te voorspellen door verschillende 'omics'-datasets op te nemen, zoals transcriptomics, proteomics en metabolomics. Dit maakt fluxvoorspelling mogelijk voor grote verzamelingen cellijnen en tumoren via bestaande functionele genomics- en metabolomics-datasets, waaronder TCGA [20], NCI60 [21], CCLE [22,23,24] en Connectivity Map [25].

Hier geven we een kort overzicht van hoe COBRA en 13C-MFA werken (lezers worden verwezen naar uitgebreide recensies over COBRA [26] en 13C-MFA [27] voor meer technische informatie), recent gebruik van deze benaderingen in kankeronderzoeksstudies, en de beperkingen en open uitdagingen bij elke fluxinferentiebenadering.


Methoden:

Het wiskundige raamwerk dat nodig is om de hoeveelheid geneesmiddel af te stemmen op de collectieve groeirespons van de M. tuberculose bacterie vereist dat we enzymremmingskinetiek, metabole netwerkmodellering en bacteriële populatiegroeimodellen verbinden. Als deze componenten zouden kunnen worden gemodelleerd en geverifieerd door experimentele gegevens, zouden we een computersysteem kunnen creëren om kwantitatief te voorspellen hoe metabole remmers de groei van bacteriën beïnvloeden. Hier presenteren we het raamwerk waarmee we de dosis-responscurves van twee metabole remmers die zijn gegenereerd uit twee onafhankelijke experimentele onderzoeken, konden genereren en reproduceren.

Het wiskundige raamwerk legt het verband tussen a) hoe een bepaalde remmer de flux(en) van een of meer metabolische reacties beïnvloedt [Inhibition Model] (de betrokken reacties worden doelreacties genoemd), b) hoe de verandering in de metabolietstroom of flux van de doelreacties de groeisnelheid van het organisme verlaagt [Metabolic Network], en tot slot, c) hoe de verminderde groeisnelheid resulteert in een effectieve lagere bacteriële celconcentratie [Population Growth Model]. Figuur 1 toont schematisch deze drie componenten en hoe ze met elkaar samenhangen en van elkaar afhankelijk zijn. Met de modellen gespecificeerd en verbonden zoals beschreven in figuur 1, hangt de rekenprocedure alleen af ​​van de remmerconcentratie en de initiële substraat- en celconcentraties in het medium waaronder het organisme werd gekweekt om de daaropvolgende bacteriële celconcentratie te berekenen. De details die de interne werking van elk model specificeren, worden hieronder gegeven.

Een schematische weergave van het raamwerk om het effect van een remmer op bacteriegroei te simuleren. Gezien de remmerconcentratie [l], beschrijft het remmingsmodel hoe de remmer de reactieflux beïnvloedt van de reactie die wordt geremd (d.w.z. de doelreactie). Deze effecten worden gemodelleerd via expliciete beperkingen op de doelreactieflux. Met behulp van deze beperkingen en de beperkingen op de opnamesnelheid van het substraat, hebben we het Metabolic Network geanalyseerd om de groeisnelheid van de biomassa af te leiden μ en substraatopnamesnelheid v C. Met behulp van het populatiegroeimodel hebben we de groeisnelheid van biomassa gerelateerd: μ en substraatopnamesnelheid v Cnaar celconcentratie [x]. We hebben de groeisnelheid van de biomassa en de verminderde substraatconcentratie dynamisch gekoppeld om een ​​tijdsafhankelijk model te ontwikkelen dat de celconcentratie dynamisch afleidt na de introductie van een remmer. Nadat deze modelcomponenten waren gespecificeerd, samen met het initiële substraat [C0] en cel [x0] concentraties in het groeimedium, hadden de berekeningen die in dit kader werden uitgevoerd alleen input nodig in de vorm van een specifieke remmerconcentratie [l] om celgroei te voorspellen.

Remmingsmodel

De remmingsmodel wordt gedefinieerd door de enzymremmingskinetiek die de reactanten en producten van een bepaalde metabolische reactie (d.w.z. de doelreactie) regelt en relateert de manier waarop de remmerconcentratie [l] wijzigt of voegt beperking toe aan de flux van de doelreactie. De wiskundige vorm van het remmingsmodel hangt af van de specifieke enzymkinetiek geassocieerd met de specifieke remmer en de metabolische reactie die door de remmer wordt beïnvloed. Wiskundig relateert het inhibitiemodel een inhibitorconcentratie [l] tot de resulterende metabolietfluxverhouding in aanwezigheid en afwezigheid van de remmer. Remmers die meer dan één reactie beïnvloeden, kunnen ook worden overwogen.

Metabool netwerk

De metabool netwerk wordt gebruikt om zelfconsistent de totale groeisnelheid van biomassa te berekenen μ, substraatopnamesnelheden v C, en de fluxen van alle metabolische reacties. Het is gekoppeld aan de remmingsmodel en de bevolkingsgroeimodel. De remmingsmodel legt beperkingen op de flux van de doelreacties in het metabolische netwerk die de totale groeisnelheid van de biomassa beïnvloeden, en de bevolkingsgroeimodel voegt beperkingen toe aan de substraatopnamesnelheid van het netwerk van het medium. Het effect van enzymdeleties (deletiemutanten) op de groei kan worden opgenomen in het metabole netwerkmodel door verwijdering van de specifieke reacties die worden gekatalyseerd door de gespecificeerde enzymen [22, 54].

Het metabolische netwerk ontwikkeld door Jamshidi en Palsson [42] voor M. tuberculose, iNJ 661, is in staat om waargenomen groeisnelheden onder een aantal verschillende omstandigheden kwantitatief te reproduceren. We gebruikten dit netwerk, met enkele aanpassingen, als basis voor ons werk (zie Aanvullend bestand 1: Sectie S1) en verifieerden dat de aanpassingen geen invloed hadden op de groeisnelheid van M. tuberculose, zoals oorspronkelijk gerapporteerd [42].

De groeisnelheid van de biomassa, de substraatopnamesnelheden en de reactiefluxen werden rechtstreeks verkregen uit het metabole netwerk door de FBA toe te passen [26]. Door een lineaire programmeermethode te gebruiken, kan FBA de groeisnelheid van de biomassa maximaliseren, afhankelijk van de steady-state massabalans van alle intracellulaire metabolieten en de stoichiometrische beperkingen die door de reacties worden gedefinieerd. De maximalisatie van de groeisnelheid van biomassa is gebaseerd op de aanname dat bacteriën hun groei maximaliseren tijdens de exponentiële fase en vroege stationaire fase-omstandigheden. Deze veronderstelling is aangetoond door eerdere studies om experimentcompatibele resultaten te genereren onder dergelijke omstandigheden [25, 30]. Bijkomende beperkingen die in de FBA kunnen worden gemodelleerd, zijn onder meer de specificatie van omkeerbare en onomkeerbare reacties, evenals limieten voor substraatopname en doelreactiesnelheden. Hier werd FBA uitgevoerd met de COBRA Toolbox [55]. We gebruikten ook de COBRA Toolbox om de reactiefluxen te minimaliseren terwijl we de berekende maximale biomassagroeisnelheid behouden. Deze procedure stelde ons in staat om een ​​unieke set minimale fluxen te verkrijgen die overeenkomt met de meest spaarzame stroom van metabolieten door het netwerk [56-58]. Deze fluxen werden vervolgens gebruikt om de beoogde reactiesnelheden te beperken.

Bevolkingsgroeimodel

Gezien de groeisnelheid van biomassa μ en de substraatopnamesnelheden v Cgedefinieerd door het metabole netwerk, de bevolkingsgroeimodel biedt een mechanisme voor het berekenen van cel [x] en substraat [C] concentraties in het gespecificeerde medium. Dit model houdt rekening met veranderingen in de substraatconcentraties in de tijd, die kunnen worden gebruikt om te volgen hoe verschillende koolstofbronnen bij voorkeur worden gebruikt in het metabolische proces [30].

Wiskundig verbindt het populatiegroeimodel de biomassagroeisnelheid μ naar de werkelijke celconcentratie [x] van de bacteriën als functie van de tijd t. Dit proces moet rekening houden met de tijdelijke uitputting van het beperkende substraat C in het medium terwijl cellen groeien, wat afhankelijk is van de opnamesnelheid van het substraat v Cdoor de cellen. Omdat hoe meer cellen groeien, hoe meer ze het beperkende substraat verbruiken, hebben we deze koppeling weergegeven via de volgende twee ODE's:

waarbij de haakjes [.] de concentratie van "." aangeven en [C] staat voor de concentratie van het beperkende substraat C in het midden. De factor 24 converteert eenvoudig de tijd t van uren tot dagen, aangezien de eenheden van μ en v Cworden respectievelijk uitgedrukt in h -1 en mmol/(h·gDW), dat wil zeggen mmol per uur per gram droog gewicht van M. tuberculose. Vergelijking 1 omvatte geen cellulair sterftecijfer omdat we bacteriegroei simuleerden tijdens exponentiële fase en vroege stationaire fase-omstandigheden, waar cellulaire groei een meer dominante rol speelt dan cellulaire dood. Eerdere studies onder vergelijkbare groeiomstandigheden, die ook niet expliciet een term voor sterftecijfer bevatten, verkregen simulatieresultaten die consistent waren met experimentele gegevens [25, 30].

De groeisnelheid van de biomassa μ en de opnamesnelheid van het beperkende substraat v Cworden voor een bepaald tijdstip bepaald door een FBA van het metabolische netwerk uit te voeren voor een bepaalde remstofconcentratie [l] en een bovengrensbeperking op de beperkende substraatopnamesnelheid. We hebben formeel een notatie ingevoerd om de groeisnelheid aan te geven μ en de opnamesnelheid v Coutputs van een FBA van een metabool netwerk voor een gegeven set inputvoorwaarden [l] en als:

We gebruikten het Michaelis-Menten kinetische model [25] om de bovengrens van de substraatopnamesnelheid te schatten:

waar V mgeeft de maximale initiële snelheid van substraatopname aan en K mvertegenwoordigt de Michaelis-Menten-snelheidsconstante. Bovendien hebben we de experimentele uitlezing gekoppeld, in dit geval de optische dichtheid (OD) onder licht met een golflengte van 600 nm [46, 53], tot de celconcentratie [x] door:

waarbij K staat voor een evenredigheidsconstante. Andere experimentele uitlezingen kunnen op dezelfde manier worden verklaard.

Gevoeligheidsanalyse van parameterwaarden

De aanwezigheid van een aantal parameters in ons wiskundig raamwerk rechtvaardigde een gevoeligheidsanalyse over hoe de toegewezen parameterwaarden de uiteindelijke berekeningsresultaten beïnvloedden. We gebruikten twee verschillende metrieken om de parametergevoeligheid vast te stellen. In de eerste analyse hebben we de variatie in de resultaten gemeten door elk van de parameterwaarden afzonderlijk in te stellen op redelijke onder- en bovengrenzen [10], in dit geval ± 50% van de gekozen parameterwaarden. In de tweede analyse hebben we de gevoeligheidscoëfficiënt voor elk van de parameters berekend. Deze coëfficiënt geeft een maat voor de afhankelijkheid tussen de berekende resultaten en de bijbehorende parameter. Indien OD vertegenwoordigt de celconcentratie uitgedrukt als optische dichtheid onder 600 nm golflengte licht en P de op gevoeligheid geanalyseerde parameter vertegenwoordigt, wordt de gevoeligheidscoëfficiënt als volgt gedefinieerd [59, 60]:

Andere waarneembare zaken, anders dan OD, kan worden vervangen in Vgl. 6. Om de gevoeligheidscoëfficiënt voor een parameter numeriek te berekenen P, we zijn begonnen vanafP = +0.5P en herhaalde het proces door ∂ . te verminderenP en het berekenen van de gevoeligheidscoëfficiënt tot geconvergeerd, dat wil zeggen tot opeenvolgende waarden van ∂P hetzelfde opgeleverd. Vervolgens herhaalden we het proces vanaf ∂P = -0.5P tot convergentie. In de hier uitgevoerde berekening convergeerden beide processen naar dezelfde numerieke waarde.

Om de verschillende soorten parameters in ons raamwerk aan te pakken, hebben we de gemodelleerde parameters in vier groepen ingedeeld: groep I opgenomen parameters verkregen uit de literatuur, groep II inclusief die bepaald door het matchen van experimentele gegevens, groep III inclusief die waarvan wordt aangenomen dat ze zijn afgeleid van andere parameters, en groep IV inclusief die welke, per definitie, direct werden bepaald nadat de andere parameters waren gedefinieerd. Tijdens de gevoeligheidsanalyse van de parameters in groepen I, II, en III, we berekenden dosis-responscurven terwijl we elke parameter met 50% verhoogden en verlaagden (behalve die waarvan de waarden niet hoger kunnen zijn dan één) en gevoeligheidscoëfficiënten die drie orden van grootte in remmerconcentratie omspannen. Hoewel de parameters in groep III werden verondersteld te zijn afgeleid van de parameters in groepen I en II, tijdens de gevoeligheidsanalyse voor de eerste twee groepen hielden we de parameterwaarden in groep III gemaakt. Ook omdat de parameters in groep IV afhankelijk waren van andere parameters en hun waarden veranderden omdat we een gevoeligheidsanalyse op deze onafhankelijke parameters uitvoerden, hebben we geen analyse voor deze groep uitgevoerd.


Omgevingsspecificatie:

Om een ​​GEM te gebruiken voor de voorspelling van verwachte fenotypes, of voor de simulatie van dynamische processen, moet men de chemische samenstelling van de omgeving definiëren (Tabel 2). Het opstellen van de lijst van in het milieu beschikbare moleculen is eenvoudig in eenvoudige laboratoriumexperimenten, waarbij gedefinieerde media met bekende chemische samenstelling worden gebruikt. In deze context hebben databases zoals Media DB [62] of KOMODO [63] een groot aantal gedefinieerde media gecatalogiseerd, wat de metabole modellering enorm vergemakkelijkt. Veel laboratoriumexperimenten worden echter uitgevoerd in ongedefinieerde media die ingrediënten bevatten zoals "gistextract" die niet gemakkelijk kunnen worden vermeld en gekwantificeerd. In de natuur komen microben vaak voor in zeer complexe omgevingen waar de chemische inputs voor het systeem ongedefinieerd zijn, met de tijd variëren en worden veranderd door andere microben in de omgeving. Verder is het niet voldoende om de lijst van verbindingen die in het kweekmedium aanwezig zijn te kennen, maar men moet ook weten met welke snelheden de verbindingen door het organisme kunnen worden geconsumeerd om de grenzen van de opnamereacties van het metabolische model goed te bepalen. In principe kan de samenstelling van de omgeving worden bepaald door middel van experimentele technieken zoals exo-metabolomics, waarbij metingen van metabolieten in de extracellulaire omgeving worden gebruikt om cellulaire opname- en secretiesnelheden af ​​te leiden [64,65,66,67,68]. Deze benadering kan waardevolle informatie opleveren voor het verminderen van de onzekerheid in de omgevingsspecificatie. Deze gegevens hebben echter hun eigen onzekerheid die zorgvuldig moet worden aangepakt [69]. Al deze factoren leiden tot een breed scala aan onzekerheid die ontstaat in de omgevingsspecificatie voor metabole netwerkanalyse [70].

GEM's bieden een mogelijkheid om de onzekerheid die gepaard gaat met complexe omgevingen aan te pakken. GEM-analysealgoritmen, zoals FBA, zijn rekenkundig efficiënt en kunnen dus in een groot aantal omgevingen worden gebruikt om de gevoeligheid van gesimuleerde fluxen voor de samenstelling van voedingsstoffen te kwantificeren. Verschillende studies hebben deze gevoeligheid gekwantificeerd door aspecten van GEM-voorspellingen te identificeren die ofwel sterk worden beïnvloed door of bestand zijn tegen variatie in de samenstelling van het milieu [71,72,73,74,75,76,77]. Het beschrijven van deze gevoeligheid, of robuustheid, geeft een duidelijker beeld van hoe onzekerheid in de omgevingsspecificatie zich wel of niet kan voortplanten naar specifieke GEM-voorspellingen. Al vroeg werd fenotype-fasevlakanalyse ontwikkeld om de impact op de optimale groeisnelheid te laten zien van het variëren van de fluxen van twee beperkende bronnen [71, 72]. Verder gaan dan paren van hulpbronnen, kunnen grote ensembles van voedingsstoffen willekeurig worden bemonsterd om de variabiliteit van alle intracellulaire fluxen te beoordelen. Bijvoorbeeld Almaas et al. toonde, met behulp van een goed samengestelde Escherichia coli GEM, dat de algehele verdeling van metabole fluxen robuust is voor de samenstelling van de omgeving, maar specifieke fluxen variëren, waarbij de meeste discrete variaties optreden in een verbonden "high-flux backbone" van reacties [73]. Daaropvolgend werk benadrukte het evolutionaire belang van een actieve kern van reacties die flux in alle omgevingen dragen [74]. Reed en Palsson toonden verder aan dat reacties met gecorreleerde fluxen in omgevingen indicatief zijn voor de transcriptionele regulerende structuur [75]. Deze studies wijzen op de niet-triviale aard van de gevoeligheid van GEM-voorspellingen voor omgevingsspecificaties. Naast de context van individuele organismen, is GEM-analyse gebruikt om aan te tonen dat het variëren van de omgeving de aard van metabole interacties tussen microbiële organismen [78] kan veranderen en dat bepaalde omgevingsvariabelen, zoals de aanwezigheid van zuurstof, een significante impact kunnen hebben op de interactietypes die ontstaan ​​[79]. Variabele omgevingen kunnen het cellulaire metabolisme beïnvloeden, van individuele reactiefluxen tot het niveau van microbiële interacties. Dus in toepassingen waar de omgeving onzeker is, zijn ensemble- of probabilistische benaderingen nodig om potentiële fenotypen volledig vast te leggen.

Een meer recente benadering, geïnspireerd door het statistische fysica-concept van netwerkpercolatie, maakt gebruik van willekeurige bemonstering van nutriëntensamenstellingen om te kwantificeren welke metabolieten consistent kunnen worden geproduceerd door een bepaald metabool netwerk in vele omgevingen [80]. Deze benadering introduceerde een probabilistisch raamwerk voor het weergeven van de inputmetabolieten van een metabool netwerk, wat in toekomstige methoden de willekeurige bemonstering van omgevingsensembles verder zou kunnen vergemakkelijken. Terwijl de huidige implementatie van dit raamwerk alle milieumetabolieten met gelijke waarschijnlijkheid bemonstert, zou men zich toekomstige benaderingen kunnen voorstellen die milieuonzekerheden nauwkeuriger weergeven door gebruik te maken van vooringenomen distributies die alle beschikbare kennis bevatten. Deze benadering zou de bestaande kloof opvullen tussen het aannemen van een enkele bekende omgeving en het uniform willekeurig bemonsteren van omgevingen. Bovendien zou milieubemonstering kunnen worden gebruikt om de flux (in FBA) of concentraties (in dynamische FBA) van verschillende omgevingscomponenten te variëren, naast hun aanwezigheid en afwezigheid, om de impact van deze hoeveelheden op de eigenschappen van het metabole netwerk te beoordelen.

De specificatie van de omgeving voor GEM-analyse kan verder worden verbeterd met behulp van "omgekeerde ecologie" -methoden die tot doel hebben de natuurlijke omgeving af te leiden uit de metabole netwerkstructuur, hetzij door op beperkingen gebaseerde optimalisatie [81,82,83] of door "zaad"-metabolieten te definiëren die nodig zijn als input voor een metabool netwerk en daarom eerder in de natuurlijke omgeving van dat organisme worden aangetroffen [84, 85]. Aangezien deze methoden de metabolische netwerkstructuur gebruiken om de omgevingsspecificatie te informeren, moeten ze zorgvuldig worden toegepast, aangezien onzekerheid in het netwerk zich kan voortplanten in de omgevingsspecificatie.


Discussie

Metabolisme in AGE1.HN

Metabolisme en metabole verschuivingen van de nieuwe menselijke cellijn AGE1.HN werden in deze studie kwantitatief geanalyseerd met behulp van tijdsopgeloste metabole fluxanalyse en stationaire metabole fluxanalyse in verschillende fasen tijdens batchkweek. Onze resultaten geven aan dat de opname van pyruvaat tijdens fase 1 in combinatie met hoge niveaus van andere substraten resulteerde in een inefficiënt metabool fenotype dat wordt gekenmerkt door overloopmetabolisme dat leidt tot de vorming van afvalproducten. In fase 2 schakelde het metabolisme over naar een meest efficiënte toestand die wordt gekenmerkt door lage substraatopnamesnelheden en geen lactaatvorming. De gegevens geven aan dat een verlaging van het substraatgehalte tijdens de teelt resulteerde in een vertraging van de glycolyse tijdens fase 1. Aanvullende experimenten met verschillende pyruvaatconcentraties in het medium ondersteunen de conclusie dat er een sterk verband bestaat tussen pyruvaat in het medium en lactaatproductie in AGE1.HN (gegevens worden elders gepresenteerd). Een andere mogelijkheid zou zijn dat de cellen lactaat alleen zouden kunnen afscheiden totdat een bepaalde concentratie is bereikt en dan de productie zouden stoppen. In andere experimenten die werden uitgevoerd met hoge lactaatstartconcentraties (ongeveer 8 mM) werd echter waargenomen dat de cellen bijna dezelfde hoeveelheid lactaat produceerden als in experimenten waarbij de lactaatstartconcentratie 0 was. Dit geeft aan dat pyruvaatdepletie lijkt een belangrijke factor zijn voor het stoppen van de lactaatproductie. Dit specifieke fenotype werd tot nu toe niet waargenomen in andere zoogdiercellen [22, 23, 26, 41].

Tijdens exponentiële groei van zoogdiercellen onder niet-beperkende substraatniveaus werd inefficiënt substraatgebruik gerapporteerd voor verschillende andere zoogdiercellijnen [22, 23, 28, 42]. Gewoonlijk komt onder deze omstandigheden slechts een kleine hoeveelheid intracellulair pyruvaat in de TCA-cyclus, wat als zeer ongunstig wordt beschouwd. Increasing flux through pyruvate dehydrogenase represents an optimization target for the cultivation of many mammalian cells, but the mechanisms and molecular reasons are still poorly understood [43, 44]. In a recent study on HEK-293, cells pyruvate dehydrogenase activity was reported to be around 22% of glycolytic activity [42]. Very low or even no activity of the pyruvate dehydrogenase complex was reported in other studies on different mammalian cells [23, 45]. In AGE1.HN cells, this was observed only during the first phase. During phases 2 and 3, pyruvate dehydrogenase activity was high. In MDCK cells it was found that an addition of pyruvate in a glutamine depleted medium resulted even in an increase in the flux from pyruvate into the TCA cycle [23]. In AGE1.HN, it seems that available pyruvate has an opposite effect triggering the conversion of pyruvate to lactate. High uptake rates of glucose and pyruvate as observed in phase 1 might lead to an increase of the intracellular pyruvate pool triggering overflow metabolism into lactate/alanine eventually resulting in an increased secretion of these waste metabolites. This might be changed by increasing reactions connecting TCA cycle and glycolysis, e.g., by stimulating pyruvate dehydrogenase and pyruvate carboxylase fluxes [46, 47]. However, the success of this strategy can not be predicted a priori. Increase of fluxes into the TCA cycle must be accompanied by an increase in oxidative phosphorylation activity which might not always be possible. Another strategy that is working in the opposite direction would be decreasing the substrate uptake rates, e.g., by knock down of transporters [48] or decreasing the lactate production, e.g., by knock down of lactate dehydrogenase [40].

Comparison of selected metabolic fluxes in AGE1.HN with those in other cells

Selected metabolic fluxes in AGE1.HN that were calculated by the stationary method for different phases are compared to fluxes published for other mammalian cells (Table 2). Glucose uptake and lactate production rates were generally lower in AGE1.HN than in other cells. Pyruvate represents an extracellular metabolite that was often neglected in other studies [26, 28]. However, as shown in this study and in MDCK cells [23, 49] or CHO cells [50], it is a very interesting metabolite that can induce huge changes in the metabolism. In AGE1.HN cells pyruvate uptake rate was by far lower than in MDCK cells that were grown in high pyruvate medium (Table 2, M2). However, the ratio of pyruvate uptake per glucose uptake was similar. The second phase in AGE1.HN showed a very efficient metabolism concerning substrate usage as already discussed before. The cells were proliferating without lactate production. Pyruvate dehydrogenase (PDH) activity was high. In all other cell lines, high lactate production was observed during the phases that were analyzed by MFA except for CHO cells in presence of galactose after glucose depletion. In order to reach higher cell densities in cultivations of AGE.HN, the second phase could be prolonged by feeding of glutamine. PDH activity in AGE1.HN was low in phase 1 and high in phases 2 and 3. A similar situation was observed in CHO cells [26] which exhibited low PDH activity and overflow metabolism during growth on glucose. After glucose depletion, these cells were consuming lactate in the presence of galactose having high PDH activity. No PDH activity was reported for MDCK cells in glutamine containing medium. In medium without glutamine and high pyruvate concentration low PDH activity was found in these cells. The absolute flux through PDH was highest in continuously cultured hybridoma cells [28], but the metabolism was by far not as efficient as in phase 2 of AGE1.HN since there was high glucose consumption and waste product formation. Absolute glutamate dehydrogenase (GDH) activity of AGE1.HN during phases 1 and 2 was lower than in other cell lines, but the relative activity compared to the glucose uptake rate was quite similar in MDCK and CHO cultures. Upper and lower TCA cycle activity in phases 2 and 3 was similar to the activity in CHO cells with glucose medium (S1 in Table 2) and in MDCK cells (M2 in Table 2) cultured without glutamine. For hybridoma cells, higher TCA cycle activity was reported.

The main differences between the metabolic phases of AGE1.HN are summarized in Fig. 7. The results indicate further targets for improving the metabolic phenotype of these cells to reach higher cell densities as well as to obtain a more efficient utilization of the nutrients. The high overflow metabolism in the beginning of the cultivation with channeling of pyruvate to lactate could be decreased. This could be accomplished by genetic engineering, e.g., deletion of lactate dehydrogenase [51] or introduction of pyruvate carboxylase [46], further medium optimization, e.g., reduced concentrations of pyruvate, or application of new feeding strategies [50]. The observed metabolism in phase 2 indicates the potential of this cell line to grow very efficiently having minimum formation of waste products and minimum energy spilling [52]. Therefore, it seems promising to change environmental conditions, i.e., media, substrate feeding as well as enzyme expression such as to approach the efficient metabolic state of phase 2 during a process. Studies on enzyme expression and detailed labelling experiments in combination with 13 C metabolic flux analysis would provide additional hints for the best way to further improve the cell line.

Summary of metabolic shifts during batch cultivation of AGE1.HN

Time resolved versus stationary flux analysis

The applied dynamic method is well suited to analyze and monitor metabolic shifts during the cultivation. Cell growth, cell size, extracellular as well as intracellular fluxes of mammalian cells in a cell culture process are highly dynamic which is caused by environmental changes. Therefore, the presented method that is considering the dynamics of all included metabolites and biomass is best suited to understand and finally model the process. Stationary metabolic flux analysis that was applied extensively in the past [23, 53] is only suited to describe the mean metabolism during a certain phase which is a significant disadvantage since changes during the phase considered are neglected [54]. However, if the pseudo steady state assumption during a phase is justified, it can give a useful overview of its average metabolism [55]. The information obtained by flux balance analysis can be validated [56] or further enriched by specific labelling information [57] to resolve reversible, cyclic or parallel fluxes as for example pentose phosphate pathway split [58, 59].


Ondersteunende informatie

S1 Afb

A) The electron micrographs of SARS-CoV-2 (Credit: NIAID-RML) B) Number of spike proteins calculated from intensity measurements of the micrograph along the circumference of the virus.

S2 Afb

The processed final model is used for differential flux analysis.

S3 Afb

The uptake rates were varied and a point optimization program was used to calculate the specific growth rate. The fitness change is reported as the ratio of specific growth rate under perturbation to the specific growth rate under normal uptake rate. All the uptake rates were negative.

S4 Afb

The coefficients of biomass precursors were varied by 널% taken one at a time and the specific growth rate was calculated by FBA.

S1 Dataset

The sheets in the dataset comprises of stepwise calculation of SARS-CoV-2 amino acid composition, nucleotide composition, carbohydrate and lipid composition. The last sheet comprises of the final viral biomass equation.

S2 Dataset

The description of each dataset within S2 Dataset are given in the first sheet.

S1 Text


1. INLEIDING

From its inception, classical biology has relied on reductionist principles. However, the actual nature of the cell, in which all components interact, demanded switching the previous paradigm to a holistic molecular approach, extending the scope of the analysis. These are the foundations that motivated the development of systems biology in the second half of the twentieth century. In particular, systems biology aims at studying the biological processes in terms of the cellular components and their interactions from a holistic molecular perspective ( Kitano, 2002 ).

Some of these components interact in the cellular metabolism, which comprises those biochemical reactions consuming and producing the smallest compounds of the cell, typically named metabolites. These reactions are close to be in thermodynamic equilibrium, requiring the presence of catalytic agents so as to achieve the appropriate rate of activity to sustain life. In most metabolic reactions, a set of proteins named enzymes act as catalysts. The conversion rate of the metabolic reactions is termed metabolic fluxes.

Metabolic reactions are organized into distinct functional modules, forming the so-called metabolic pathways. Some of these pathways have been experimentally reported and manually included in different databases ( Kanehisa et al. , 2012 Keseler et al. , 2011 ), as well as in biochemistry books ( Nelson and Cox, 2000 ), e.g. glycolysis, TCA cycle. However, metabolic pathways are not independent entities for example, the same enzyme or metabolite may appear in different pathways. For this reason, a most general analysis of metabolism requires the simultaneous consideration of different metabolic pathways. In the most extreme scenario, when all the known metabolic pathways are considered, the resulting set of enzymes and metabolites is referred to as genome-scale metabolic networks (GSMNs). The outbreak of different high-throughput experimental techniques has allowed us to increase the accuracy and size of GSMNs, in terms of metabolites, reactions and gene regulation. Currently, GSMNs for several organisms are publicly available through different online repositories ( Schellenberger et al. , 2010 ).

The inherent complexity of GSMNs does not make it possible to perform a manual analysis per se. Different computational strategies have been developed ( Planes and Beasley, 2008 ). Among them, a number of theoretical frameworks have been proposed to extend the concept of metabolic pathways from a network-oriented perspective ( de Figueiredo et al. , 2009 Pey et al. , 2011 , 2013 ). One of the most important pathway concepts is that of Elementary Flux Mode (EFM) ( Schuster et al. , 2000 ). EFMs are a minimum set of enzymes necessary to accomplish mass-balance and thermodynamic (irreversibility) conditions ( Schuster et al. , 2000 ). Although the mass-balance and thermodynamic constraints are directly imposed by means of two linear constraints, the condition that guarantees that only a minimum number of reactions is active, referred to as the non-decomposability condition (NDC), is more difficult and demands further mathematical considerations.

Efficient algebraic frameworks can be found in the literature for calculating the whole set of EFMs of a given metabolic network. These methods are based on an iterative process that has to be completed so as to guarantee that the obtained solutions are EFMs. However, the number of EFMs increases exponentially with the number of reactions constituting the network ( Acuña et al. , 2010 ). Consequently, applying these methodologies to GSMNs goes beyond their scope. Because it is not possible to calculate all the EFMs in GSMNs, different mathematical frameworks were later developed to provide a particular subset of them ( de Figueiredo et al. , 2009 Machado et al. , 2012 Rezola et al. , 2013 ), most of them based on Mixed Integer Linear Programming (MILP).

These optimization methods typically enumerate EFMs in an increasing number of reactions and have been proved effective for a number of applications ( Rezola et al. , 2013 , 2014 ). However, they allow us to add only one biological constraint in the search procedure, e.g. computing the 100 shortest EFMs producing L-lysine, as stated by de Figueiredo et al. (2009) . This limitation is due to NDC. In other words, currently in the literature, there is no general methodology for taking into account more than one biological constraint in the EFM computation without violating NDC.

In this work, we present a novel approach based on MILP that is able to calculate a subset of EFMs fulfilling additional constraints. The framework is illustrated with a toy example and validated with two networks ( Rezola et al. , 2011 Schuster et al. , 2000 ), where all EFMs can be obtained. Subsequently, the scalability of our approach is confirmed by calculating a subset of EFMs in the genome-scale metabolic network of Saccharomyces cerevisiae ( Heavner et al. , 2012 ). Here, we investigated EFMs simultaneously consuming glucose and producing ethanol, guaranteeing that a minimum yield is achieved. We also validated the performance of this new approach when more than two constraints are imposed, particularly by calculating 100 EFMs activating a random set of five reactions.


The study of metabolic pathways

There are two main reasons for studying a metabolic pathway: (1) to describe, in quantitative terms, the chemical changes catalyzed by the component enzymes of the route and (2) to describe the various intracellular controls that govern the rate at which the pathway functions.

Studies with whole organisms or organs can provide information that one substance is converted to another and that this process is localized in a certain tissue for example, experiments can show that urea, the chief nitrogen-containing end product of protein metabolism in mammals, is formed exclusively in the liver. They cannot reveal, however, the details of the enzymatic steps involved. Clues to the identity of the products involved, and to the possible chemical changes effected by component enzymes, can be provided in any of four ways involving studies with either whole organisms or tissues.

First, under stress or the imbalances associated with diseases, certain metabolites may accumulate to a greater extent than normal. Thus, during the stress of intense exercise, lactic acid appears in the blood, while glycogen, the form in which carbohydrate is stored in muscle, disappears. Such observations do not, however, prove that lactic acid is a normal intermediate of glycogen catabolism rather, they show only that compounds capable of yielding lactic acid are likely to be normal intermediates. Indeed, in the example, lactic acid is formed in response to abnormal circumstances and is not directly formed in the pathways of carbohydrate catabolism.

Second, the administration of metabolic poisons may lead to the accumulation of specific metabolites. If fluoroacetic acid or fluorocitric acid is ingested by animals, for example, citric acid accumulates in the liver. This correctly suggests that fluorocitric acid administered as such, or formed from fluoroacetic acid via the tricarboxylic acid (TCA) cycle, inhibits an enzyme of citrate oxidation.

Third, the fate of any nutrient—indeed, often the fate of a particular chemical group or atom in a nutrient—can be followed with relative ease by administering the nutrient labeled with an isotope. Isotopes are forms of an element that are chemically indistinguishable from each other but differ in physical properties.

The use of a nonradioactive isotope of nitrogen in the 1930s first revealed the dynamic state of body constituents. It had previously been believed that the proteins of tissues are stable once formed, disappearing only with the death of the cell. By feeding amino acids labeled with isotopic nitrogen to rats, it was discovered that the isotope was incorporated into many of the amino acids found in proteins of the liver and the gut, even though the total protein content of these tissues did not change. This suggested that the proteins of these tissues exist in a dynamic steady state, in which relatively high rates of synthesis are counterbalanced by equal rates of degradation. Thus, although the average liver cell has a life-span of several months, half of its proteins are synthesized and degraded every five to six days. On the other hand, the proteins of the muscle or the brain, tissues that (unlike the gut or liver) need not adjust to changes in the chemical composition of their milieu, do not turn over as rapidly. The high rates of turnover observed in liver and gut tissues indicate that the coarse controls, exerted through the onset and cessation of synthesis of pacemaker enzymes, do occur in animal cells.

Finally, genetically altered organisms ( mutants) fail to synthesize certain enzymes in an active form. Such defects, if not lethal, result in the accumulation and excretion of the substrate of the defective enzyme in normal organisms, the substrate would not accumulate, because it would be acted upon by the enzyme. The significance of this observation was first realized in the early 20th century when the phrase “inborn errors of metabolism” was used to describe hereditary conditions in which a variety of amino acids and other metabolites are excreted in the urine. In microorganisms, in which it is relatively easy to cause genetic mutations and to select specific mutants, this technique has been very useful. In addition to their utility in the unraveling of metabolic pathways, the use of mutants in the early 1940s led to the postulation of the one gene-one enzyme hypothesis by the Nobel Prize winners George W. Beadle and Edward L. Tatum their discoveries opened the field of biochemical genetics and first revealed the nature of the fine controls of metabolism.

Because detailed information about the mechanisms of component enzymatic steps in any metabolic pathway cannot be obtained from studies with whole organisms or tissues, various techniques have been developed for studying these processes—e.g., sliced tissues, and homogenates and cell-free extracts, which are produced by physical disruption of the cells and the removal of cell walls and other debris. The sliced-tissue technique was successfully used by the Nobel Prize winner Sir Hans Krebs in his pioneer studies in the early 1930s on the mechanism of urea formation in the liver. Measurements were made of the stimulating effects of small quantities of amino acids on both the rate of oxygen uptake and the amount of oxygen taken up the amino acids were added to liver slices bathed in a nutrient medium. Such measurements revealed the cyclic nature of the process specific amino acids acted as catalysts, stimulating respiration to an extent greater than expected from the quantities added. This was because the added material had been re-formed in the course of the cycle (zie onder Disposal of nitrogen).

Homogenates of tissue are useful in studying metabolic processes because permeability barriers that may prevent ready access of external materials to cell components are destroyed. The tissue is usually minced, blended, or otherwise disrupted in a medium that is suitably buffered to maintain the normal acid–base balance of the tissue, and contains the ions required for many life processes, chiefly sodium, potassium, and magnesium. The tissue is either used directly—as was done by Krebs in elucidating, in 1937, the TCA cycle from studies of the respiration of minced pigeon breast muscle—or fractionated (i.e., broken down) further. If the latter procedure is followed, homogenization is often carried out in a medium containing a high concentration of the sugar sucrose, which provides a milieu favourable for maintaining the integrity of cellular components. The components are recovered by careful spinning in a centrifuge, at a series of increasing speeds. It is thus possible to obtain fractions containing predominantly one type of organelle: nuclei (and some unbroken cells) mitochondria, lysosomes, and microbodies microsomes (i.e., ribosomes and endoplasmic reticulum fragments) and—after prolonged centrifugation at forces in excess of 100,000 times gravity—a clear liquid that represents the soluble fraction of the cytoplasm. The fractions thus obtained can be further purified and tested for their capacity to carry out a given metabolic step or steps. This procedure was used to show that isolated mitochondria catalyze the oxidation reactions of the TCA cycle and that these organelles also contain the enzymes of fatty acid oxidation. Similarly, isolated ribosomes are used to study the pathway and mechanism of protein synthesis.

The final step in elucidating a reaction in a metabolic pathway includes isolation of the enzyme involved. The rate of the reaction and the factors that control the activity of the enzyme are then measured.

It should be emphasized that biochemists realize that studies on isolated and highly purified systems, such as those briefly described above, can do no more than approximate biological reality. The identification of the fine and coarse controls of a metabolic pathway, and (when appropriate) other influences on that pathway, must ultimately involve the study of the pathway in the whole cell or organism. Although some techniques have proved adequate for relating findings in the test tube to the situation in living organisms, study of the more complex metabolic processes, such as those involved in differentiation and development, may require the elaboration of new experimental approaches.


Auteurs informatie

Voorkeuren

Bio-X Institutes, Key laboratory for the Genetics of Developmental and Neuropsychiatric Disorders (Ministry of Education), Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200030, People’s Republic of China

Fangzhou Shen, Hang Zhang & Zhuo Wang

Key Laboratory of Synthetic Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 200032, People’s Republic of China

School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, People’s Republic of China

Luoxi Shi, Hang Zhang, Yangmin Chen & Zhuo Wang

Division of Biostatistics, School of Public Health, University of Minnesota, Minneapolis, 55455, USA

The Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100093, People’s Republic of China