Informatie

Wordt het dehydratatieproces twee keer gebruikt bij de voorbereiding van permanente glaasjes?


Ik krijg les "voorbereiding van permanente dia's" door een van mijn docenten in de cursus Biologische Technieken. Hij gaf me de volgende stappen om een ​​permanente dia te maken: In totaal zijn er zeven stappen, maar de verwarring ligt in het feit dat de stap die betrokken is bij uitdroging twee keer wordt gebruikt. Ik begreep niet dat als de specimens eenmaal zijn uitgedroogd, waarom ze dan opnieuw moeten worden gedehydrateerd? Is het niet zo dat na de dehydratatiestap, het monster opnieuw wordt gehydrateerd in het kleurproces, en dat er dan weer een dehydratatieproces nodig is?


Monsters voorbereiden voor de elektronenmicroscoop

Elektronenmicroscopen zijn zeer krachtige hulpmiddelen voor het visualiseren van biologische monsters. Ze stellen wetenschappers in staat cellen, weefsels en kleine organismen zeer gedetailleerd te bekijken. Deze biologische monsters kunnen echter niet worden bekeken op elektronenmicroscopen terwijl ze leven. In plaats daarvan moeten de monsters complexe voorbereidingsstappen ondergaan om ze te helpen de omgeving in de microscoop te weerstaan. Het voorbereidingsproces doodt het weefsel en kan ook veranderingen in het uiterlijk van het monster veroorzaken.

Voor wetenschappers die biologische monsters willen bekijken, vormt dit een uitdaging: hoe kan het monster worden bewaard zodat het er zoveel mogelijk uitziet als in het levende organisme, terwijl het nog steeds bestand is tegen visualisatie in de elektronenmicroscoop.


U bent waarschijnlijk bekend met hoe een touw ontrafelt wanneer u het doorsnijdt. Hetzelfde gebeurt, op microscopisch niveau, met het kleine stukje weefsel dat de biopsie wordt genoemd. Ketens van eiwitmoleculen beginnen bijna onmiddellijk te degenereren nadat het weefsel is verwijderd. We noemen dit weefsel autolyse. Denk nog eens aan het doorgesneden touw. Een ding dat kan worden gedaan om te voorkomen dat het ontrafelt, is door een brandende lucifer tegen de gerafelde uiteinden te houden, zodat de vezels samensmelten. Om weefselautolyse te stoppen, wordt de biopsie in een weefselprocessor geplaatst die 10% neutraal gebufferde formaline gebruikt om de losse uiteinden van eiwitmolecuulketens te verknopen, waardoor verdere afbraak wordt voorkomen. Dit proces staat bekend als: weefsel fixatie. Nadat de dokter het stuk weefsel heeft verwijderd, is het eerste wat hij doet het in een container met 10% neutraal gebufferde formaline te plaatsen.

Wanneer het chirurgische specimen in het Histopathology Lab aankomt, wordt het naar een bruto station. Hier wordt het grondig geïnspecteerd op ziekte, gemeten en anderszins beschreven. Een spraakopname, bekend als grof dictaat, wordt gemaakt en vervolgens in het permanente rapport van de patiënt getypt. De biopsie wordt vervolgens vastgezet in een plastic weefselcassette die in een bad met formaline wordt geplaatst.


Alcohol gebruiken

Voor de hobbyist die af en toe een glaasje wil maken, is het bewaren van een hele reeks verschillende chemische fixeermiddelen waarschijnlijk een overkill (en ook niet gezond). Ik bewaar een flesje met 96% ontsmettingsalcohol op mijn plank, waarin ik de exemplaren, meestal kleine insecten, laat vallen zodra ze aankomen. In deze oplossing kunnen ze bijna onbeperkt worden bewaard. Wanneer Voor het maken van permanente dia's, breng ik ze rechtstreeks over naar Euparal-montagemedium.

Pure alcohol (ethanol) is ook geschikt voor het fixeren en bewaren van plantenspecimens, zonder celinhoud. De alcohol heeft de neiging het cytoplasma te doen krimpen, maar tast de celwanden niet aan. De alcohol verhardt ook het plantmateriaal, waardoor het makkelijker te snijden is met een microtoom (die vaak toch de celinhoud weghaalt).


Wordt het dehydratatieproces twee keer gebruikt bij de voorbereiding van permanente glaasjes? - Biologie

Montagemedia: een overzicht

Shamala Ravikumar 1 , R Surekha 1 , Rooban Thavarajah 2
1 Afdeling Orale en Maxillofaciale Pathologie, Navodaya Dental College, Raichur, Karnataka, India
2 Afdeling Orale en Maxillofaciale Pathologie, Ragas Dental College and Hospital, Chennai, India

Datum van webpublicatie10-mrt-2014

Correspondentie adres:
Shamala Ravikumar
Afdeling Orale Pathologie, Navodaya Dental College, Raichur, Karnataka
India

Bron van ondersteuning: Geen, Belangenverstrengeling: Geen

DOI: 10.4103/2277-8632.128479

Histologische coupes die voor langere tijd moeten worden onderzocht of bewaard, moeten onder een dekglaasje worden gemonteerd. Er zijn verschillende soorten montagemedia verkrijgbaar, zowel in de handel als ook bereid in het eigen laboratorium voor het monteren van weefselcoupes. Sommige soorten montagemedia harden uit om het dekglaasje stevig op zijn plaats te houden en andere soorten gebruiken verschillende oplosmiddelen zoals water, glycerine en xyleen omdat de vlekken in de monstervoorbereiding gevoelig zijn voor bepaalde oplosmiddelen. Om de immonofluorescerende dia's te voorkomen, bevatten weinig montagemedia antifade-reagentia. Omdat in de literatuur minder nadruk wordt gelegd op montagemedia, wordt een poging gedaan om verschillende soorten montagemedia en hun gebruik bij routinematige histopathologische en immunochemische kleuring te herzien, te wagen en samen te vatten.

trefwoorden: antifade, dekglaasje, montagemedia


Hoe dit artikel te citeren:
Ravikumar S, Surekha R, Thavarajah R. Montagemedia: een overzicht. J NTR Univ Health Sci 20143, Suppl S1:1-8

Hoe deze URL te citeren:
Ravikumar S, Surekha R, Thavarajah R. Montagemedia: een overzicht. J NTR Univ Health Sci [serie online] 2014 [geciteerd 28 juni 2021]3, Suppl S1:1-8. Beschikbaar op: https://www.jdrntruhs.org/text.asp?2014/3/5/1/128479

In histologie of een pathologisch laboratorium is montage de laatste procedure in de reeks die eindigt met een permanent histologisch preparaat op tafel, ruim na de weefselverwerking en kleuring. Namelijk (1) fixeren, (2) inbedden in paraffine, (3) snijden, (4) kleuren, (5) dehydrateren en (6) opruimen. [1]

Het montagemedium is de oplossing waarin het monster wordt ingebed, meestal onder een dekglas. Het kan vloeibaar, gom of harsachtig zijn, oplosbaar in water, alcohol of andere oplosmiddelen en van de externe atmosfeer worden afgesloten door niet-oplosbare ringvormige media. [2] Het belangrijkste doel van montagemedia is om het specimen fysiek te beschermen, het montagemedium bindt specimen, dia en dekglaasje samen met een duidelijke duurzame film. Het medium is belangrijk voor de beeldvorming omdat het de weergave van het preparaat beïnvloedt. [3]

Montagemedia moeten idealiter een brekingsindex (RI) hebben die zo dicht mogelijk bij die van het vaste eiwit (weefsel) ligt (ongeveer 1,53). Als licht van het ene medium naar het andere gaat, verandert het van snelheid en buigt het. Een voorbeeld hiervan is de schijnbare buiging van een stok wanneer deze in water wordt geplaatst. Licht reist het snelst in een vacuüm en in alle andere media reist licht langzamer. De RI van een medium is de verhouding van de lichtsnelheid in een vacuüm tot de lichtsnelheid in het medium (het is altijd >1). [4]

Een montagemedium met een RI die dicht bij die van het gefixeerde weefsel ligt, zal het daarom transparant maken, waarbij alleen de gekleurde weefselelementen zichtbaar zijn. Dit is waar de term "opruimen" komt van - xyleen, bijvoorbeeld, heeft een RI die heel dicht bij die van vast weefsel ligt, waardoor een zekere mate van transparantie wordt opgewekt. [4]

Een montagemedium met een RI te ver aan weerszijden van 1,53 zal een slechte helderheid en contrast opleveren. Dit kan praktisch worden aangetoond door een weefselsectie zonder montagemedium te bekijken, aangezien lucht een RI van 1,0 heeft. [4] Er moet een montagemedium worden gekozen dat de specifieke vlekken die worden gebruikt niet vervaagt, bijvoorbeeld basische anilinekleurstoffen moeten worden aangebracht in niet-zuurhoudende montagemiddelen. Preparaten die de Pruisische blauwe reactie laten zien, moeten in niet-reducerende media worden gemonteerd. [5]

  1. RI moet zo dicht mogelijk bij die van glas liggen, d.w.z. 1,5.
  2. Het moet kleurloos en transparant zijn.
  3. Het mag er niet toe leiden dat de vlek zich verspreidt of vervaagt.
  4. Het moet droog zijn tot een non-stick consistentie en relatief snel uitharden.
  5. Het mag niet terugkrimpen van de rand van het dekglas.
  6. Het moet in staat zijn om de weefselspleten volledig te doordringen en te vullen.
  7. Het mag geen nadelig effect hebben op weefselcomponenten.
  8. Het moet bestand zijn tegen besmetting (met name de groei van micro-organismen).
  9. Het moet de sectie beschermen tegen fysieke schade en chemische activiteit (oxidatie en veranderingen in pH).
  10. Het moet volledig mengbaar zijn met dehydrant of klaringsmiddel.
  11. Het moet uitharden zonder te kristalliseren, barsten of krimpen (of het materiaal dat wordt gemonteerd op een andere manier vervormen) en mag niet reageren met, uitlogen of vervaging veroorzaken in vlekken en reactieproducten (inclusief die van histochemische enzymen, hybridisatie en immunohistochemische procedures).
  12. Ten slotte moet het mountant, eenmaal ingesteld, stabiel blijven (in termen van de hierboven genoemde functies). [6],[7]

Harsachtige/niet-waterige/klevende media

Dit zijn natuurlijke of synthetische harsen opgelost in benzeen, tolueen of xyleen en worden gebruikt wanneer een permanente montage vereist is en worden vaak gebruikt in routinematige H- en E-kleuringsprocedures. [6]

Over het algemeen verharden lijmen door verdamping van het oplosmiddel en fixeren daardoor het bijbehorende dekglaasje aan de dia. Tijdens dit proces verandert de RI van het medium, weg van die van het oplosmiddel en in de richting van die van de droge mountant. De exacte RI van het toegepaste medium is daarom niet bekend. Desalniettemin, aangezien de RI van hydrofobe (zelfklevende) mountants meestal die van weefseleiwitten (vast) benadert en ze zorgen voor een stevige hechting van het dekglaasje, zijn deze mountants het type dat het meest wordt gebruikt. [7]

Natuurlijke harsachtige media

  • Canadese balsem (RI = 1,52-1,54)
  • Fenolbalsem (variant van Canadese balsem)
  • Dammarbalsem (RI = 1,52-1,54)
  • Euparal (RI = 1,48). [2]

Canadese balsem is een oleohars die wordt verkregen uit de schors van de spar Abiesbalsamea (van de familie Pinaceae), afkomstig uit Noord-Amerika. De gedroogde hars is vrij oplosbaar in xyleen en andere organische oplosmiddelen. De standaard mountant voor histologie en ook voor taxonomie, of het nu zoölogisch of botanisch is, is Canadese balsem, een nu schaarse en zeer dure natuurlijke hars. [1],[7]

De Canadese balsem werd in de jaren 1830 door Andrew Pritchard voor het eerst beschreven als een geschikt montagemedium. Het is het meest gebruikte fixeermiddel vanwege zijn bewezen archiveringskwaliteit, met een staat van dienst van 150 jaar en kristalliseert niet en neemt geen vocht op. Mount en Pitkin stellen dat Canadese balsem het enige bindmiddel is dat niet verslechtert als het jarenlang in verschillende klimaten wordt bewaard. Noyes vermeldt enkele miljoenen jaren als levensduur van Canadese balsem, en vergelijkt het met natuurlijk gefossiliseerd barnsteen. Walker en Crosby vermelden dat Canadese balsem bijzonder wordt aanbevolen omdat de RI (1,53) heel dicht bij die van glas ligt. [2]

Rawlins degradeert Canada-balsem als ooit op grote schaal gebruikt, omdat het sterk "autofluorescerend" is. De schadelijke oplosmiddelen die een gevaar voor de gezondheid vormen, zoals xyleen, kunnen het gebruik ervan als fixeermiddel beperken en het gebruik van niet-toxische oplosmiddelen in plaats van xyleen zoals histomount kan het veiligheidsprobleem oplossen, maar kunnen andere problemen veroorzaken, zoals langzame verharding en voortijdige verdonkering. Andere auteurs hebben problemen gemeld zoals 'craquelé'. Andere nadelen zijn dat het geel wordt met de leeftijd, dat het erg langzaam uithardt en omdat het in de loop van de tijd steeds zuurder wordt, kationische kleurstoffen slecht bewaard blijven en het Pruisische blauwe product van de Perls-reactie wordt gebleekt. [2],[7]

is een semi-synthetische mountant. Het is samengesteld uit een mengsel van eucalyptol, sandarac (een hars van de boom, Tetraclininarticulata geteeld in Noordwest-Afrika), paraldehyde en camsal (kamfer en fenylsalicylaat). Het wordt beschouwd als een goed blijvend conserveermiddel, bewezen in de loop van de tijd, van constante kwaliteit, veilig, snel en gemakkelijk te gebruiken, optisch goed met een lage RI en snel drogend. Het maakt geen gebruik van het kankerverwekkende oplosmiddel xyleen en is daarom beter dan Canadese balsem en wordt gebruikt als alternatief voor balsem. Er kan enige vervaging optreden in met hematoxyline gekleurde coupes. In deze situatie wordt de groene (of "Vert") koperbevattende vorm van Euparal aanbevolen. [2],[5],[7]

zijn vergelijkbaar met Canadese balsem en worden zelden gebruikt als fixeermiddel vanwege vuil en onzuiverheden die gewoonlijk aanwezig zijn en de moeilijkheid om voorbereide fixatie te filteren. [5]

Synthetische harsachtige media

Er is een groot aantal synthetische harsen verkrijgbaar, hetzij gemaakt in het laboratorium, hetzij commercieel bereid. De meest gebruikte zijn de polyesterenen, zoals Kirkpatrick & Lendrum's mountant en Gurr's distrene weekmaker xyleen (DePex).

  1. DPX (DePeX [Distrene 80: een commercieel polystyreen, een weekmaker, bijv. dibutylftalaat en xyleen]) (RI = 1,52)
  2. Histomount (RI = 1,49-1,50)
  3. Dekkingsbon (RI = I.53)
  4. Gurr's neutrale montagemedium (RI = 1,51)
  5. Histoclad (RI = 1,54)
  6. Hoeveelheid (RI = 1.526)
  7. Pro-texx (RI = 1,495)
  8. Technicon Hars (RI = 1,62)
  9. Uv-inert (RI = 1.517)
  10. XAM (RI = 1,52). [6],[7]

is een kleurloos, neutraal medium waarin de meeste standaardbeitsen goed bewaard blijven. Het wordt bereid door het gewone plastic, polystyreen, op te lossen in een geschikt koolwaterstofoplosmiddel (meestal xyleen). Gurr suggereerde dat het tijdens het drogen een aanzienlijke mate van krimp ondergaat en royaal op het objectglaasje moet worden aangebracht. Ze zetten snel in en trekken zich daarbij vaak terug van de rand van het dekglaasje. Dit kan worden voorkomen door een weekmaker toe te voegen, waarvan wordt aangenomen dat deze het effect weerstaat door een gaas te vormen met de gepolymeriseerde kunststof. Meest gebruikte routine mountant. Het heeft een groter voordeel ten opzichte van balsem dat dia's kunnen worden ontdaan van overtollig vulmiddel door het eenvoudigweg af te strippen na het snijden langs de rand van het dekglaasje. [2],[5],[7]

Gurr's neutrale montagemedium (RI 1.51)

is een mengsel van coumaron en andere harsen als 76% oplossing in cineol. Deze mountant is een nogal stroperige oplossing.

Adam's Histoclad is een 60% oplossing van een kunsthars in tolueen.

's Permount is een 60% oplossing van naftaleenpolymeer in tolueen.

Texx van Lerner Laboratories 171 industry Pittburghs is een montagemedium met een neutrale pH en met een antioxidantadditief om de vlekkwaliteit te behouden. Het is oplosbaar in zowel tolueen als xyleen.

mountant van de Technicon Corporation is een 60% oplossing van coumaron-indeenpolymeer in benzeen en xyleen in gelijke delen. Het heeft de neiging om bellen te vormen bij het uitharden vanwege de hoge vluchtigheid van benzeen.

gepatenteerd montagemedium dat niet fluorescerend is van Gurr. [6]

Secties van weefsel ingebed in plastic verbindingen (zoals epoxyharsen) kunnen met succes worden gemonteerd in vloeibare hars van hetzelfde type. De coupes moeten volledig droog zijn voordat het fixatiemiddel wordt aangebracht, wat het beste kan worden ingesteld onder dezelfde omstandigheden die zijn voorgeschreven voor weefselblokken. [7]

Lichtgevoelige harsen

Lichtpolymeriserende harsen hebben het voordeel van zeer korte uithardingstijden, die in de orde van 10-30 seconden blootstelling aan ultraviolet licht vereisen om volledig uit te harden. Eenmaal uitgehard kan het fixeermiddel echter niet worden opgelost en kan het dekglaasje niet worden verwijderd (zoals nodig kan zijn voor het restaureren). Lichtgevoelige harsen op acrylbasis zijn ook geschikt voor fluorescentiemicroscopie. [7]

Waterige montagemedia

Waterig montagemedium wordt gebruikt voor het monteren van secties uit gedestilleerd water wanneer de vlekken zouden worden ontkleurd of verwijderd door alcohol en xyleen, zoals het geval zou zijn bij de meeste vetvlekken (Soedan-methoden). Deze media zijn van drie soorten: de siropen, gelatinemedia en Arabische gommedia. [5]

Sommige van de metachromatische vlekken hebben de neiging om kort na de montage vanuit de secties in de montagemedia te diffunderen: dit kan worden voorkomen door fructosestroop te gebruiken. Gome-vlekken, bijvoorbeeld methylgeweld, hebben de neiging om na montage in het medium te diffunderen. Dit kan worden voorkomen door het medium van Highman te gebruiken. Waterige montagemedia vereisen de toevoeging van bacteriostatische middelen zoals fenol, kristal van thymol of natriummerthiolaat om de groei van schimmels te voorkomen. [5],[6]

  1. Water (RI = 1.333).
  2. Glycerinegelei (RI = 1,47).
  3. Glycerine-Glycerol (RI = 1,47).
  4. Medium van apathie (RI = 1,52).
  5. Farrant's medium (RI = 1,43).
  6. Highman's medium (RI = 1,52).
  7. Fructosestroop (RI = 1,47).
  8. Polyvinylalcohol.

Ondanks de lage RI (1.333), dient water als een handig tijdelijk fixeermiddel voor sommige hele specimens voor het onderzoeken van bepaalde levende micro-organismen (zoutoplossing) en in het bijzonder bij het controleren van secties tijdens de kleuringsprocedures. [7]

Dit wordt meestal beschouwd als het standaard fixeermiddel voor vetvlekken. Los de gelatine op in het gedestilleerde water in een erlenmeyer in een waterbad en voeg goed glycerine en fenolmengsel toe en bewaar. [5]

Dit veelgebruikte waterige fixeermiddel is een mengsel van glycerol en gelatine en heeft een RI van 1,47. Het moet vrij hard worden, maar voor langdurige bewaring kunnen secties het beste worden geringd en verzegeld. Er zijn verschillende formuleringen in gebruik. [7]

Net als bij andere oplosmiddelen wordt het gebruikt omdat het goedkoop, veilig en snel te gebruiken is met weinig voorbereiding. Het dekglaasje aan met een hydrofobe afdichting zal de levensduur van gemonteerde secties verlengen, hoewel kationische kleurstoffen in de loop van de tijd in het medium zullen diffunderen. Met fosfaat gebufferde glycerol (RI = 1,47) wordt vaak gebruikt om secties voor immunofluorescentie te monteren en glycerol kan aan andere middelen worden toegevoegd om het drogen en barsten te vertragen. [7]

Medium van apathie (RI = 1,52)

Het is een van de meest bruikbare waterige mountants voor fluorescentiemicroscopie, aangezien het vrijwel niet-fluorescerend is.

Los de ingrediënten op met behulp van zachte hitte.

Farrant's medium (RI = 1,43)

Los de Arabische gom op in gedestilleerd water met zachte hitte, voeg glycerine en arseentrioxide toe. Het wordt ook aanbevolen voor vetvlekken. [5]

Highman's medium (RI = 1,52)

Aanbevolen bij de metachromatische kleurstoffen, vooral methylviolet. [6]

Belmedia/afdichtingsmiddelen

Vloeistof-, glycerine- en gom-chloraat moeten om de rand van het dekglaasje worden gewikkeld om het bindmiddel af te dichten en ontsnapping, verlies door verdamping of oxidatie door contact met lucht te voorkomen. Overtollig monutant rond de rand moet vóór het rinkelen met een scalpel worden verwijderd. Als het fixeermiddel vatbaar is voor krimp, kan het rinkelen het binnendringen van lucht niet stoppen, omdat elke spanning die op de ring of het dekglaasje wordt uitgeoefend, kan mislukken. De harsbevestigingen hoeven meestal niet te rinkelen, omdat het oplosmiddel in de hars moet verdampen om uit te harden. Gray suggereert echter dat Canadese balsem wordt geringd om te voorkomen dat het donker wordt door atmosferische oxidatie. Men kan vaste vaseline, paraffinewas of bijenwas, Valap of nagellak gebruiken als ringmiddel of sealant. [1],[3]

Het dekglaasje rinkelen

De term "ringing" is ontstaan ​​omdat aanvankelijk ronde dekglaasjes werden gebruikt en de coating werd aangebracht in de vorm van een cirkel of "ring". Een ringijzer is nodig om het vaste type medium rond het dekglaasje te verspreiden. Er wordt een T-vormig stuk koper gebruikt, dat ongeveer 2,5 cm dik is met de onderkant van het rechtopstaande stuk ingebed in een rubberen stop of houten handvat. Tijdens gebruik wordt het dwarsstuk verwarmd in de vlam van de bunsenbrander, aangeraakt op het oppervlak van het ringmiddel en vervolgens aangebracht op de randen van het dekglaasje. Nagellakvernis kan voorzichtig met een borstel worden aangebracht. Met oefenen kan het bellen eenvoudig, snel en netjes worden afgerond. [1],[5]

  1. Paraffinewas wordt aangebracht met een ringijzer en is bevredigend als tijdelijk ringmiddel.
  2. Du noyer's was-colofonium harsmengsel:

Het wordt bereid door 10 delen paraffinewas in een verdampingsschaal te verhitten en daarin 40 delen colofoniumhars op te lossen. Het is een meer permanente bevestiging.

Nagellak met of zonder kleur kan als beltoon worden gebruikt. Een vloeibaar preparaat dat goed is afgesloten met nagellak kan enkele maanden meegaan.

Asfaltgebaseerd cement kan direct vanuit opvouwbare buizen als ringmedia worden aangebracht, waardoor het een permanente montage is. [1],[2],[5]

Verschillende laboratoria gebruiken synthetische lijmen om coupes en kleine preparaten op de microscoopglaasjes te lijmen. RI en duurzaamheid zijn belangrijk, evenals de pH en chemische bestanddelen van lijm of fixeermiddel, aangezien deze het monster kunnen eroderen of zelfs vernietigen. Hechtmiddelen die momenteel worden gebruikt, zijn araldietepoxyhars, cellofa's, kristalgebonden thermoplastische hars, enz. [2]

Mountants voor immunochemische kleuring (immunofluorescentie en enzymatische labeling)

De keuze van het montagemedium na immunochemische kleuring wordt grotendeels bepaald door het label (en in het geval van enzymatische labels, het chromogeen) dat wordt gebruikt om het antigeen te visualiseren. Waterig montagemedium is over het algemeen geschikt voor alle enzymatische label/chromogeencombinaties en fluorescerende labels. Monsters die in dergelijke media zijn gemonteerd, worden rechtstreeks uit de waterige fase gemonteerd (zonder dehydratatie of klaring). [4]

Fluorescentie-emissie van fluoresceïne-isothiocyanaat uit gelabeld antilichaam in microscopische preparaten kan worden beïnvloed door de kenmerken van het montagemedium, in het bijzonder de pH, de ionsterkte, de viscositeit en de aanwezigheid van blusmiddelen (Cherry, 1970). Fluorescentie-emissie is groter bij alkalische dan bij zure pH (Hiramoto, Bernecky, Jurand en Hamlin, 1964). Een semi-permanent medium dat polyvinylalcohol rang 51-05 Elvanol1 en glycerol bevat, werd beschreven door Rodriguez en Deinhardt in 1960. [9]

Waterige montagemedia voor fycobiliproteïne-fluorescerende labels (fycoerythrin, phycocyanine) mogen geen glycerol bevatten, omdat dit de kleurintensiteit dooft. Evenzo resulteert blootstelling aan excitatielicht van de meeste fluorescerende labels in verminderde kleuring, een proces dat bekend staat als fotobleken. [4]

Fluorescerende montagemedia bevatten gewoonlijk antifade-middelen die het fotobleken van dergelijke labels vertragen, zoals 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octaan (DABCO) en parafenyleendiamine, die werken als opruimers van vrije radicalen. [4]

Harsmedia kunnen alleen worden gebruikt voor enzymatische labels waarbij het precipitaat dat wordt gevormd tussen het enzym en het chromogeen niet oplosbaar is in de alcoholen die worden gebruikt tijdens dehydratatie van het weefsel. [4]

Zowel de kwaliteit als de intensiteit van het fluorescentiesignaal in de meeste immunogelabelde preparaten na waterige montage zoals op polyvinylalcohol gebaseerde oplossingen (bijv. Mowiol) nemen langzaam af met de tijd en ten slotte worden monsters ongeschikt voor onderzoek. Om dit te voorkomen, heeft Espada et al. beschreef een zeer eenvoudige en snelle niet-waterige montageprocedure voor gekweekte cellen en weefselsecties, die het fluorescerende signaal op een uitstekende manier behoudt na immunodetectie. Na fluorescentielabeling worden de preparaten gedehydrateerd in ethanol, geklaard in xyleen en gemonteerd in DePeX. Met behulp van dit niet-waterige montagemedium blijft het fluorescentiesignaal hoog en stabiel, waardoor een geschikte en permanente bewaring van gelabelde en tegengekleurde microscopische preparaten mogelijk is. [10]

Franklin en Filion gebruikten een nieuwe techniek om het vervagen van fluorescentie te vertragen. De antioxidant beta-mercapto-ethanol (BME) werd gebruikt in combinatie met de permanent mountant DePeX (DePeX-BME) vertraagde fluorescerende vervaging van mithramycine, acridine-oranje en Hoechst 33258 gekleurde kippenerytrocyten, elk in verschillende mate. De initiële fluorescentie van alle onderzochte kleurstoffen was intenser met DePeX-BME dan met DePeX alleen. Monsters gemonteerd in DePeX-BME vertoonden sterke fluorescentie en uitstekende morfologie. Ze concludeerden ook dat ze, als ze in het donker werden bewaard, voor onbepaalde tijd konden worden bewaard zonder verslechtering. Het vertragen van het vervagen van fluorescentie met DePeX-BME vergemakkelijkte de kwantificering van deoxyribonucleïnezuur door middel van fluorescentiecytofotometrie. [11]

Montagemedia en vervaging

Het vervagen van de afbeeldingen is een van de belangrijkste factoren bij diagnoseproblemen en het langdurig bewaren van objectglaasjes met weinig van de mountants. Verschillende montagemedia hebben de neiging om na verloop van tijd te vervagen. Humphrey en Pittman gebruikten een eenvoudige cytofotometrische techniek om vervaging van vlekken te kwantificeren van basische aniline kleurstof-gekleurde epoxy-ingebedde weefsels gemonteerd in zes verschillende veelgebruikte mountants. Aanzienlijke vervaging werd gedetecteerd bij alle zes de mountants, hoewel de frequenties varieerden. De laagste mate van vervagen werd waargenomen met immersieolie en de hoogste mate van vervagen met Canadese balsem. [12]

Schmolke voerde het onderzoek uit om het meest geschikte medium te vinden voor duurzame montage van in Araldite ingebedde semi-dunne secties van de hersenschors van konijnen, gekleurd met toluidineblauw en pyronine G. Van de vier geteste synthetische montagemedia voorkwam alleen DePeX vervaging van de secties tijdens de eerste maand. De gemiddelde optische dichtheid van secties na 1 jaar was hoger in preparaten die met DePeX waren gemonteerd dan in secties die waren behandeld met de andere montagetechnieken die in het onderzoek werden getest. [13]

Het voorkomen van het vervagen van de fluorescentie-intensiteit veroorzaakt door het excitatielicht is erg belangrijk voor het verkrijgen van stabiele en nauwkeurige beelden. Er zijn verschillende soorten montagemedia beschikbaar (Gill, 1979 Johnson et al. 1981,1982 Giloh en Sedat 1982 Harris 1986 Krenik et al. 1989 Longin et al.1993), zoals: P-fenyleendiamine (Johnson) et al. 1981, 1982 Platt en Michael 1983), N-propylgallaat (Giloh en Sedat 1982) en 1-4 DABCO (Johnson et al. 1982 Langanger et al. 1983). [14]

Kant-en-klare anti-fading kits zijn ook in de handel verkrijgbaar, zoals Slow Fade Light Antifade Kit (Molecular Probes Eugene, OR), Perma-Fluor (Lipshaw/Immunon Pittsburgh, PA), FluoroGuard Antifade Reagent (Bio-Rad Laboratories Hercules , CA) en ProLong Antifade Kit (Molecular Probes). [14]

Ono et al. vergeleek verschillende commerciële en zelfgemaakte antifade media, met behulp van een confocale laser scanning microscoop gekoppeld aan een computer. Ze maten de vervaging van fluorescentie kwantitatief om een ​​vergelijking te formuleren, evalueerden het antifading-vermogen van verschillende antifading-media en herstelden de vervaagde beelden naar het oorspronkelijke niveau volgens deze vergelijking. ProLong vertoonde de hoogste antifading-factor (EEN) waarde. Zijn EEN waarde bleef hoog, zelfs bij sterke excitatie. ProLong heeft echter een lage initiële intensiteit van fluorescentie (EM1) waarde. Aan de andere kant toonde FluoroGuard de op één na hoogste EEN waarde en een relatief hoge EM1 waarde. [14]

Staudt et al. aantonen dat een oplossing van 97% thiodiethanol (TDE) een perfecte match geeft voor de N = 1.515 RI van glas en immersieolie. Vaste biologische specimens kunnen gemakkelijk worden ingebed in 97% TDE-oplossingen, waardoor een uniforme RI van de lens te diep in het specimen wordt verkregen. [15]

Gecombineerd dekglaasje aan en mountant

Verschillende fabrikanten leveren een medium van vernisachtige aard, dat kan worden gebruikt om het oppervlak van de sectie te coaten, door middel van dompelen, gieten of spuiten. Dit type medium maakt het gebruik van dekglaasjes overbodig. Voor microscopie met laag vermogen kan een combinatie van mountant en dekglaasje behoorlijk bevredigend zijn, hoewel er weinig bescherming van de sectie tegen slijtage wordt gegeven. [8]

De secties monteren

Er zijn veel manieren om het dekglaasje op dia's te monteren, maar welke manier dan ook werkt, is prima zolang er geen luchtbellen worden gevormd.

  1. Een geschikte maat dekglaasje voor montage wordt geselecteerd en op het vloeipapier gelegd.
  2. Een of twee druppels fixeermiddel worden op het objectglaasje met sectie geplaatst, bij voorkeur in het midden om insluiting van luchtbellen te voorkomen.
  3. Het objectglaasje wordt snel omgekeerd over het dekglaasje aan, het ene uiteinde wordt op het vloeipapier geplaatst en het andere uiteinde langzaam omlaag totdat het fixeermiddel het dekglaasje aanraakt.
  4. Het bevloeiingsmiddel verspreidt zich onder het dekglaasje en dia's en met het dekglaasje eraan bevestigd, wordt snel omgekeerd en het dekglaasje aan op zijn plaats geleid met een ontleednaald.

U kunt ook het afdekmiddel op de slede toevoegen zoals beschreven,

Plaats het ene uiteinde van het dekglaasje op de dia en met behulp van een ontleden naald langzaam het dekglaasje op zijn plaats.

  1. Voeg de mountant op het dekglaasje in het midden.
  2. Breng de glijbaan naar beneden (omkeren) naar het dekglaasje aan en laat de oppervlaktespanning trek het dekglaasje aan.

Gebruik alleen voldoende mountant om de ruimte op het dekglaasje/dia te vullen en niet teveel en deze beoordeling komt met ervaring.

  • Te weinig montagemedia veroorzaakt luchtbellen aan de randen van het dekglaasje en men zal in de verleiding komen om op het dekglaasje aan te drukken om een ​​goede afdichting te garanderen. Deze druk kan de driedimensionale structuren in het monster verpletteren of vervormen.
  • Te veel montagemedia zal het rommelig maken en de monsters verplaatsen en het kan het monster onmogelijk maken om op <215100 af te beelden vanwege de zeer korte werkafstand van de olie-immersie objectieflens met hoge vergroting.

Luchtbellen: als er één vreemde luchtbel is, kan deze worden verwijderd met zachte druk, maar als er veel zijn, plaats dan het objectglaasje terug in xyleen in plaats van te jagen met een ontleednaald en tijd te verspillen, zodat het dekglaasje wordt gescheiden en monteer de sectie opnieuw zonder luchtbellen. [5]

Welke drager is het beste?

Gutierrez stelt dat "Geen enkele montagemedia volledig bevredigend is." De meeste werknemers die willen dat hun diamontages permanent zijn, hebben hun eigen montagemiddelen voorbereid en "huisdierennamen" gegeven en nemen niet de moeite om het recept te publiceren.

Veel merken van mountants zijn en zijn gemaakt naar geheime recepten waarvan de namen of recepten zijn veranderd en door anderen zijn gekopieerd. De restaurator kan worden geconfronteerd met het probleem dat hij niet weet waaruit de verslechterende mountant bestaat, zelfs als de naam van de mountant op het objectglaasje staat, omdat dit misschien niet het gepubliceerde recept is. [2]

Tot slot hebben verschillende commerciële fabrikanten verschillende montagemedia en fluorescentievrije montagemedia, zowel in waterige als in harsvorm. RI speelt ook een gelijkwaardige rol bij het kiezen van het goede mountant. Daarom moet men een montagemedium kiezen dat past bij het bekijken en de vereiste secties behouden voor verder onderzoek.


Wordt het dehydratatieproces twee keer gebruikt bij de voorbereiding van permanente glaasjes? - Biologie

U heeft een machinevertaling aangevraagd van geselecteerde inhoud uit onze databases. Deze functionaliteit is uitsluitend bedoeld voor uw gemak en is op geen enkele manier bedoeld om menselijke vertaling te vervangen. Noch BioOne, noch de eigenaren en uitgevers van de inhoud doen, en wijzen uitdrukkelijk af, enige uitdrukkelijke of impliciete verklaringen of garanties van welke aard dan ook, inclusief, maar niet beperkt tot, verklaringen en garanties met betrekking tot de functionaliteit van de vertaalfunctie of de nauwkeurigheid of volledigheid van de vertalingen.

Vertalingen worden niet bewaard in ons systeem. Uw gebruik van deze functie en de vertalingen is onderworpen aan alle gebruiksbeperkingen die zijn opgenomen in de gebruiksvoorwaarden van de BioOne-website.

Méndez-Herrera-techniek: nieuwe zuiveringstechniek voorgesteld voor onvolwassen stadia en interne structuren van volwassen insecten

N. Acevedo-Reyes, 1 D.H. Zetina, 1 E. Blanco-Rodríguez, 1,* J.A. López-Buenfil, 1 R. Martínez-Rosas 1

1 Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF), Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad en Calida


6 stappen van weefselverwerking voor histologie

1. Haal je potlood tevoorschijn

Na fixatie wordt het weefsel overgebracht naar een weefselcassette. Deze zijn er in verschillende maten en houden het weefsel vast en beschermen het tijdens de verwerking.

Zodra de inbeddingsfase is bereikt, wordt het cassettedeksel afgebroken en vormt het hoofdgedeelte van de cassette een basis voor het paraffinewasblok. De cassettes kunnen met de hand worden geëtiketteerd (met een potlood!) of uw histologisch laboratorium kan een cassette-etiketteermachine hebben.

Er zijn drie hoofdstappen bij weefselverwerking, namelijk: 'dehydratie', 'clearing' en 'infiltratie'. Elk van de stappen van de verwerkingsmethode omvat de diffusie van een oplossing in weefsel en dispersie van de vorige oplossing in de reeks.

2. Al het plezier van de carrousel

In de meeste moderne instituten en histologische laboratoria zal de verwerking worden uitgevoerd in speciale weefselverwerkingsmachines. Het oudere ontwerp van de machine is een carrousel, die een kooi bevat waarin de weefselcassettes worden geplaatst. Deze carrousel heeft een aantal glazen bekers die oplosmiddelen en oplossingen bevatten die ervoor zorgen dat het weefsel uitgedroogd is en klaar is voor inbedding in paraffine. The carousel vertically agitates the cage in each solution before moving on to the next solution in the dehydration/clearing method.

The modern processors have a chamber in which the specimens are held and the different solutions are pumped in and out of the chamber. In general, the whole process takes around six hours and is usually set up to run overnight.

3. First, Remove the Water

First, the tissue needs to be dehydrated to remove the water, which is present either free or bound to the tissue. Paraffin wax is hydrophobic, therefore, most of the water in the tissue must be removed before it can be infiltrated with wax. This process is carried out by immersing tissue in a series of ethanol solutions of increasing concentrations until 100%, water-free alcohol is reached. A series of increasing concentrations is used to ensure that the water in the tissue is gradually replaced by the alcohol and to avoid excessive distortion of the tissue.

Various components of the cell are also removed by this process. At the lower end of the ethanol concentrations, water-soluble proteins are removed, whilst towards the 100% ethanol step, certain lipids may be dissolved.

4. Ethanol and Wax Don’t Mix

Although the tissue reaches the final stage of dehydration in 100% ethanol, it’s not possible to proceed straight to wax embedding, as ethanol and wax don’t mix!

This is where ‘clearing’ comes in. The term ‘clearing’ refers to the property of the solvents used – they have a relatively high refractive index and when tissue is immersed in it, it becomes transparent and clear.

5. It’s Becoming Clearer…

The solvent used for this intermediate stage is usually xylene. The ‘clearing agent’ needs to be miscible with both ethanol and paraffin wax. Following dehydration, the tissue is immersed in one to three different xylene immersions. In these stages, the ethanol is gradually replaced with xylene and when the tissue is embedded, the xylene will be replaced by the molten paraffin wax.

Shrinkage of tissue can occur at these final stages as the xylene also removes fat residues left in the samples.

6. At Last – A Block!

The final stages are called ‘infiltration’ and ‘blocking out’. Infiltration is when the final xylene is replaced with molten wax, which infiltrates the tissue. Again, this is typically three different wax immersions to ensure that none of the clearing agent remains in the tissue.

After the final infiltration, the tissue cassettes are transferred to an embedding station. This machine has reservoirs of molten wax, hotplates, and a cold plate for setting the blocks. The infiltrated tissue is removed from the cassette and orientated within a suitably sized metal mold. The mold is filled with molten wax, the main part of the labeled cassette is placed on top and this is also filled with wax. The whole mold is transferred to the cold plate to finally set.

That ends the journey from tissue to wax block, which is, I guess, the start of another journey of sectioning, making slides, and immunohistochemistry!

Finally, below is a table that highlights the typical main stages of tissue processing for histology.

Tafel 1. Main stages of tissue processing for histology.

ProcessOplossingTime
uitdroging70% alcohol60 mins
uitdroging90% alcohol45 mins
uitdrogingAbsolute alcohol45 mins
uitdrogingAbsolute alcohol45 mins
uitdrogingAbsolute alcohol60 mins
ClearingXylene60 mins
ClearingXylene60 mins
ClearingXylene60 mins
InfiltrationParaffin wax30 mins
InfiltrationParaffin wax60 mins
InfiltrationParaffin wax90 mins
Blocking OutParaffin waxn/a

Do you have any questions about tissue processing for histology? Leave a comment below!

Originally published December 10, 2013. Reviewed and updated on November 10, 2020.


Webinar transcript

Immunocytochemistry or ICC is a technique that uses antibodies to visualize the localization of particular proteins within single cells. This video outlines slide preparation from suspension cells followed by fixation, permeabilization, blocking and antibody incubation. Assemble the cytospin equipment before removing the cells from the incubator.

The cytospin deposits thin layer preparations of suspension cells onto slides. Lay the cells and set it running. The cell density, loading volume and spin speed should be optimized for each cell type. For example, larger cells require a slower speed. Unload the slides carefully and place them in a slide tray to dry . before transferring them onto a slide rack.

Ideally, the cell should be fixed immediately. Therefore, place the rack of slides into a pot of fixative and incubate for 5-10 minutes. Next, wash the slides by transferring them sequentially into two pots of Phosphate Buffered Saline, PBS.

Once fixed they can be stored for a short period of time in the fridge but keep them moist. The type of fixative used, and the fixation time will require optimization. The most commonly used fixatives are paraformaldehyde and methanol. However, it is advisable to check the date sheets of the primary antibodies you intend to use for guidance.

Remove the slides from the rack and tap off excess PBS. Draw a hydrophobic barrier around the cells using a PAP pen. This will keep reagents pooled in a small droplet over the cells. It is important to ensure the cells do not dry out during this process. Carefully prepare the permeabilization buffer onto the cells and incubate for five minutes.

The permeabilization step allows antibodies to access intracellular epitopes and will need optimizing depending on the cell type, antigen and intended antibody.

There are a number of different permeabilization agents that can be used. For example, Triton X-100 and for very gentle permeabilization, Tween-20. You do not need to permeabilize if the cells were previously fixed in methanol.

Once the cells are permeabilized, tap excess buffer off the slides and wash in Phosphate Buffered Saline plus Tween-20, PBST, on a shaker for five minutes. Repeat with fresh PBST for a total of three wash steps. Once the washes are complete leave the slides in your wash buffer to avoid them drying out.

While your slides are washing, dampen some paper towel and use it to line a slide tray. This will help to keep your slides moist during the next step. Remove excess buffer from your slides and re-draw your PAP pen circles as they may have partially washed off.

To prevent non-specific antibody binding, the cells need to be blocked. In this case, the cells are blocked in 10% serum and one percent Bovine Serum Albumin, BSA, for one hour at room temperature. The type of blocking buffer and incubation time should be optimized for your experiment.

Note if the cells have been fixed in paraformaldehyde it is common practice to wash with glycine before blocking to quench any remaining fixative. Ideally the species of serum in the blocking buffer should match the species the secondary antibody was raised in to avoid any cross-reactivity.

Whilst the cells are in blocking buffer, prepare the primary antibodies. After blocking, the cells need to be washed three times for five minutes in PBST as before. Remove any excess wash buffer and re-draw the PAP pen circles as they may have partially washed off.

Place your slides in the line slide tray and add your primary antibody solution. Do this one slide at a time to avoid drying. Place a lid on your tray and carefully transfer it to a fridge to incubate overnight.

Wash the slides three times for five minutes in PBST to remove any unbound primary antibody. If the primary antibodies weren't directly conjugated, incubate the cells for one hour at room temperature with secondary antibodies. Nuclear stains such as Hoechst can be included at this point too. Then wash the slides three times again in PBST.

Tap excess buffer off your first slide and place on a slide tray. It is best to deal with one slide at a time to avoid drying. Add a droplet of compatible mounting medium onto the cells ensuring no air bubbles are created.

Using a pair of forceps lower the cover slip down onto the mounting medium allowing the liquid to spread out gradually. Avoid putting any pressure on your slides as this may damage your cells. The slides are now ready for imaging using a confocal microscope or can be stored in the fridge for a short period of time.


Cell Staining Protocol for Microscopy

Microscopy refers to the practice that involves the use of a microscope for the purposes of observing small scale structures that cannot be viewed using the naked eye and often cell staining is necessary as s tructures are difficult to discern due to insufficient contrast.

Cell staining is a technique used for the main purpose of increasing contrast through changing the color of some of the parts of the structure being observed thus allowing for a clearer view. There are a variety of stains that can be used in microscopy.

First of all, staining can be in-vivo or in-vitro. The difference between these is that whereas In-vivo staining refers to the staining of a biological matter while it is still alive, i n-vitro staining refers to a staining technique where the biological matter is non-living.

The following are common stains explaining techniques, preparations and procedures for each:

Haematoxylin and Eosin Staining

These are two stains used in the examination of thin slices of biological tissue. Contrast is created by the stains where Haematoxylin turns the nuclei blue while eosin turns the cytoplasm as well as other parts pink or red.

1- Measure 10 grams of haematoxylin crystals 500 ml of water (70- 80 degrees centigrade) and mix to dilute completely

2- In a separate flask, measure 20 grams of alum and mix with 500 ml of hot tap water (70- 80 degrees)

3- Mix the two mixtures together (1 and 2)

Whereas alum is the mordant, thymol prevents fungal growth.

5- The mixture is then kept in a translucent flask away from direct sunlight for one week. This is covered with a paper towel that allows for air circulation (early maturation). The solution is then put in to a dark flask and topped tightly after one week, and stored in a dark place for 3 weeks. (Late maturation)

1- Measure 10 grams of eosin crystals and add to mix in 1000ml of hot tap water (70- 80 degrees). This should be mixed to dilute and stored in a dark flask. This can be used directly.

1- A rehydrated section is stained in a solution of haematoxylin for 20 to 40 minutes

2- The section is then washed in tap water for about 3 minutes until it turns blue,

3- The section is the differentiated in 70percent ethanol that contains 1 percent of HCL for about 5 seconds to remove excess dye and allow the nuclear to emerge,

This is then washed in tap water,

5- Stain with eosin for 10 minutes,

6- Then wash for about 1 to 5 minutes in tap water,

7- Dehydration, clear and mount on a rack

Haematoxylin-Eosin Stain Kaposi's Sarcoma lesion - Cambridge University Press http://www.cambridge.org

Papanicolaou Staining

This is also referred to as pap-staining or pap smear. It is used for the purposes of examining cell samples that have been obtained from body fluids.

The technique involves the combination of chemicals that include:

O Light green SF yellowish,

ACCUMATE differentiating solution is made ready for use. A substitute of Scott's Tap water is prepared through mixing a part of Scott's Tap water substitute concentrate with 9 parts of deionized water. This is then followed by filtering papanicolaou staining system reagents before use.

1- Fix the slides in acetic fixative for 15 minutes,

2- Absolute alcohol for two minutes,

3- 70 percent of alcohol for 2 minutes,

4- in 50 percent for 2 minutes

5- Tap water for 2 minutes,

6- deep in haematoxylin for 4 minutes,

7- Briefly rinse in tap water,

8- Differentiate in acid alcohol for about 5 seconds,

10- Dehydrate using absolute alcohol two times,

11- Stain in orange G for ten seconds,

12- Rinse in absolute alcohol two times

13- Stain in E.A 50 for two minutes,

14- Stain in absolute alcohol two time,

15- Clear in xylene three times,

16- Mount the slide on xylene three times,

een) Presence of a psammoma body in absence of atypical cells in cervicovaginal smear (Papanicolaou stain, 200×) B) Serous ovarian cystoadenofibroma with parietal psammoma bodies (Hematoxylin and Eosin, 100×).

Pusiol et al. CytoJournal 2008 5:7

Acid and Basic Fuchsin Bekladden

Acid fuchsin is a magenta red acid dye that is largely used for plasma staining whereas basic fuchsin is a magenta basic dye largely used to stain the nucleus.

The technique is also referred to as acid fast staining. The acid fast bacteria have a waxy substance ( mycolic acid) on their cell wall that makes them impermeable to staining procedures.

The term acid fast is used since they resist decolourization with acid alcohol. Carbol fuchsin , the primary stain contains phenol, which helps solubilize the cell wall whereas heat is used to increase the penetration of the stain.

On using alcohol to decolorize, cells will be decolorized except for acid fast ones. Methylene blue is used as the counterstain to any cell that was decolorized. At the end of the procedure, acid fast cells remain red/pink while non-acid fast cells retain a blue color.

Preparation of carbol fuchsin by mixing two solutions:

Solution 1- 0.2 grams of basic fuchsin and 10 ml of 95 percent ethanol,

Solution 2- 5 grams phenol and 90 ml of distilled water,

1- Swab pulp larvae together so as to allow the pulp to spread over the slide and allow to dry

2- Heat fix by flaming over a burner several times,

3- Flood using 0.2 percent of carbol fuchsin for about 30 seconds,

4- Wash off the stain and then air dry/gently blot dry before examination

A photomicrograph of Mycobacterium smegmatis (pink) and Micrococcus luteus (blue) 1000x magnification. Mycobacterium smegmatis is acid-fast, retaining the carbol fuchsin dye, thus appearing pink. Micrococcus luteus is not acid-fast, loses the carbol fuchsin during decolorization, and is counter-stained with methylene blue.

Image from: http://inst.bact.wisc.edu

Wright's Stain

This is a Romanowsky type of metachromatic stain that is prepared by mixing specially treated methylene blue dye with eosin.

The acidic portion of the stain unites with the basic components of the cells such as hemoglobin, and thus they are referred to as eosinophilic and are stained pink or red.

The acidic components of the cell, such as the nucleic acids on the other hand take the basic dye and stain blue or purple.

PH has to be controlled using a buffer of 6.4 to 6.7 to avoid poor staining.

O M easure 1.0 grams of wright's stain powder and 400 ml of methanol (methyl alcohol),

O A dd a few glass beads to assist in dissolving and add the ethanol to the stain,

O M ix well at intervals until the powder has completely dissolved (do this by warming in 37 C water bath to aid in the dissolving),

O L abel the bottles and mark it as flammable and toxic,

O T ightly atop and store at room temperature in the dark

1- Prepare a fill of the sample and allow drying on a slide,

2- Prepare three containers, and fill one with one step Wright’s Stain and the other two with distilled water,

3- Keep the stain tightly covered when not in use to avoid evaporation (always replace the stain once it becomes insufficient)

4- Always replace distilled water once iridescent scum start forming on the surface, or when it starts turning blue,

5- Dip the slide in the stain for 15 to 20 seconds,

6- Dip the slide in distilled water in the second container for 15- 45 seconds,

7- Dip the slide in container 3 for 25 seconds using quick dips,

8- Wipe the back of the slide,

9- Dry the slide on a vertical position, on the absorbent surface and avoid blotting the smear,

10- Apply oil to examine microscopically,

These steps should be repeated two times for marrow smears.

1- Prepare the sample and allow to air dry,

2- Place the slide on a rack,

3- Apply the one step wright's stain using dropper bottles,

4- Wait for about 15-30 seconds and add similar volumes of distilled water,

5- Pour stain and water mixture off the slide,

6- Dip the slide in distilled water for about 25 seconds using quick dips,

7- Wipe the back side of the slide,

8- Dry the slide in a vertical position on the absorbent side and avoid blotting the smear,

These steps should be repeated twice for bone marrow samples.

Image from: http://www.vetmed.vt.edu

Gram Staining

This is one of the most common staining techniques.

It is largely used to differentiate bacteria species as either gram positive or gram negative. This is achieved through the chemical properties of bacterial cell walls, where different colors are displayed after staining.

This technique is based on the fact that the gram positive cell wall has a strong attraction for crystal violet following the addition of iodine as compared to the cell wall of gram negative.

Iodine is the mordant, and forms a complex with crystal violet, which is easily washed off from the gram negative cell wall using ethyl alcohol.

Cell staining in Microscopy is useful and necessary to highlight those structual elements of your sample/specimen to be properly observed. There are others that MicroscopeMaster may cover in the future so bookmark this page and revisit to see further staining information.

Learn more about Cell Culture, Cell Division, Cell Differentiation as well as Tissue Culture Types and Techniques. And take a look at the reasons to consider purchasing a Microscope Staining Kit.

Mallory F.B. A.M, M.D. S.D. Pathological Technique. Philadelphia & London. W.B. Sunders Company. Copyright, 1938, by W.B. Sunders Company. Reprinted June, 1942 and September, 1944. Pgs. 70 and 9

Johnson PL, Klein MN: Application of Papanicolaou stain to paraffin sections. Stain Technol 31:223, 1956

Delisle, G., and L. Tomalty. 2002. Mycobacterium tuberculosis. MicrobeLibrary, American Society for Microbiology, Washington, DC.

MicroscopeMaster.com is a participant in the Amazon Services LLC Associates Program, an affiliate advertising program designed to provide a means to earn fees by linking to Amazon.com and affiliated sites.

The material on this page is not medical advice and is not to be used for diagnosis or treatment. Although care has been taken when preparing this page, its accuracy cannot be guaranteed. Scientific understanding changes over time.

** Be sure to take the utmost precaution and care when performing a microscope experiment. MicroscopeMaster is not liable for your results or any personal issues resulting from performing the experiment. The MicroscopeMaster website is for educational purposes only.


CONCLUSIES

The isolation of RNA from FFPE tissue is feasible. Unfortunately, current practices in the biomedical community vary and lack the standardization required for sensitive molecular interrogation. Fundamentally, tissue must be handled in a standardized fashion, similar to how blood and other body fluids are used in routine clinical assays. Analysis of tissue has been called cellular chemistry, and a specimen must meet a specification for the analysis to be consistent and reliable. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue is not currently handled in a fashion consistent with the protocols for analytes used in molecular analysis. Educating the community, including pathologists, clinicians and researchers, is essential for bringing RNA-based assays into the clinical setting (Table 1). Cooperation is needed to advance the design of protocols to maximize both research and patient benefit.


Bekijk de video: Glaasjes Versieren #2 (November 2021).