Informatie

D7. Redox-chemie en eiwitvouwing - biologie


Over het algemeen stellen we ons het interieur van een cel voor in een reducerende omgeving. Cellen hebben voldoende concentraties van "b-mercaptoethanol"-achtige moleculen (gebruikt om disulfidebindingen in eiwitten in vitro te verminderen) zoals glutathion (g-Glu-Cys-Gly) en gereduceerd thioredoxine (met een actieve plaats Cys) om disulfidebinding te voorkomen vorming in cytoplasmatische eiwitten. De meeste cytoplasmatische eiwitten bevatten Cys met een zijketen pKa > 8, wat de vorming van disulfidebindingen zou minimaliseren aangezien de Cys overwegend geprotoneerd zijn bij die pH.

Disulfidebindingen in eiwitten worden meestal aangetroffen in extracellulaire eiwitten, waar ze dienen om multisubunit-eiwitten bij elkaar te houden als ze worden verdund in het extracellulaire milieu. Deze eiwitten die bestemd zijn voor uitscheiding worden cotranslationeel ingevoegd in het endoplasmatisch reticulum (zie hieronder) dat een oxiderende omgeving vormt voor het vouweiwit en waar suikers covalent aan het vouweiwit worden gehecht en disulfidebindingen worden gevormd (zie Hoofdstuk 3D: Glycoproteïnen - Biosynthese en functie ). Eiwitenzymen die betrokken zijn bij de vorming van disulfidebindingen bevatten vrije Cys die gemengde disulfiden vormen met hun doelsubstraateiwitten. De enzymen (thiol-disulfide-oxidoreductasen, eiwitdisulfide-isomerases) hebben een Cys-XY-Cys-motief en kunnen de vorming van disulfidebindingen of hun reductie tot vrije sulfhydrylen bevorderen. Ze zijn bijzonder gevoelig voor redox omdat hun Cys-zijketens moeten wisselen tussen en vrije disulfidevormen.

Intracellulaire disulfidebindingen worden gevonden in eiwitten in het periplasma van prokaryoten en in het endoplasmatisch reticulum (ER) en mitochondriale intermembraanruimte (IMS) van eukaryoten. Voor deze eiwitten wordt het beginstadium van eiwitsynthese (in het cytoplasma) tijdelijk en ruimtelijk gescheiden van de plaats van vorming van disulfidebindingen en uiteindelijke vouwing. Disulfidebindingen kunnen in een doeleiwit worden gegenereerd door gelijktijdige reductie van een disulfide in een eiwitkatalysator, waarbij het netto aantal disulfiden constant blijft (tenzij het enzym opnieuw wordt geoxideerd door een onafhankelijk proces). Als alternatief kan een disulfide worden gevormd door overdracht van elektronen naar oxidatiemiddelen zoals dizuurstof.

In het ER wordt de vorming van disulfidebindingen gekatalyseerd door eiwitten in de disulfide-isomerasefamilie (PDI). Om in dit proces als katalysatoren te functioneren, moeten de PDI's zich in een geoxideerde toestand bevinden die in staat is om elektronen van het eiwitdoel te accepteren voor de vorming van disulfidebindingen. Een flavoproteïne, Ero1, recycleert PDI terug naar een geoxideerde toestand, en de gereduceerde Ero1 wordt geregenereerd bij het doorgeven van elektronen aan dizuurstof om waterstofperoxide te vormen. Samenvattend, bij de vorming van disulfiden in het ER, stromen elektronen van het ontluikende eiwit naar PDI's naar het flavine-eiwit Ero1 naar dioxgen (d.w.z. naar steeds betere elektronenacceptoren). De eerste stap is in feite een disulfide-shuffle, die, wanneer gekoppeld aan de volgende stappen, leidt tot de novo vorming van disulfidebindingen.

In de mitochondriën vindt vorming van disulfidebindingen plaats in de intermembraanruimte (IMS) en wordt geleid door het �mitochondria-disulfiderelaissysteem. Dit systeem vereist twee belangrijke eiwitten: Mia40 en Erv1. Mia40 bevat een redox-actieve disulfidebinding cys-pro-cys en oxideert cys-residuen in polypeptideketens. Erv1 kan dan Mia40 opnieuw oxideren, dat op zijn beurt zelf opnieuw kan worden geoxideerd door het heem in cytochroom c. Gereduceerd cytochroom C wordt geoxideerd door cytochroom C-oxidase van elektronentransport door de doorgang van elektronen naar dizuurstof om water te vormen. Het belang van IMS-eiwitoxidatie wordt minder begrepen, maar men gelooft dat de oxidatieve stress veroorzaakt door een disfunctie kan leiden tot neurodegeneratieve ziekten.

Een recent overzicht door Riemer et al. vergelijkt de ER- en mitochondriale processen voor de vorming van disulfidebindingen:

  • Veel meer en diverse eiwitten vormen disulfiden in het ER in vergelijking met het IMS. De meeste in het IMS hebben een lage molecuulmassa en hebben twee disulfidebindingen tussen helix-turn-helix-motieven. Deze eiwitsubstraten omvatten chaperonnes die de lokalisatie van eiwitten in het binnenmembraan vergemakkelijken, en in eiwitten die betrokken zijn bij elektronentransport in het binnenmembraan.

  • Er zijn veel PDI's in het ER, waarschijnlijk als gevolg van de structurele diversiteit van eiwitsubstraten in het ER. Mia40 lijkt echter de enige PDI in het IMS te zijn.

  • "De novo" vorming van disulfidebindingen wordt geïnitieerd door Ero1 in de ER en Erv1 in de IMS. Convergente evolutie leidde tot vergelijkbare structuren voor beide - een 4-helixbundel die FAD bindt met twee proximale Cys.

  • De mitochondria-route leidt tot watervorming bij reductie van dizuurstof, niet waterstofperoxide, waardoor de vorming van reactieve zuurstofsoorten in de mitochondriën wordt geminimaliseerd. Het in het ER gevormde peroxide wordt vermoedelijk omgezet in een inerte vorm.

  • Het IMS staat in nauwer contact met het cytoplasma via buitenmembraaneiwitten, porines genaamd, die enige glutathiontoegang mogelijk zouden maken. Het IMS presenteert een meer oxiderende omgeving dan het cytoplasma (met meer glutathion). Het ER, zonder een porine-analoog, zou meer oxideren.

  • Omkeerbare vorming van disulfiden in het ER reguleert de eiwitactiviteit.

Disulfidebindingsregulatie in de periplasmatische ruimte van bacteriën

De redoxgevoeligheid van de Cys-zijketen die wordt aangetroffen in disulfidebindingen is belangrijk bij het reguleren van de eiwitactiviteit. Met name de thiolgroep van het aminozuur Cys, een belangrijk nucleofiel dat vaak in de actieve plaats wordt aangetroffen, kan worden gemodificeerd om de eiwitactiviteit te regelen. De vorming van een disulfidebinding of de oxidatie van vrije thiolen tot sulfeenzuur of verder tot sulfine- of sulfonzuur kan de eiwitactiviteit blokkeren. De E. Coli periplasmatische eiwitten DsbA (disulfidebinding A) zetten aangrenzende vrije thiolen om in disulfide-gekoppelde cystine, waarbij het proces wordt gereduceerd. DsbB reoxideerde DsbA terug naar zijn katalytisch actieve vorm. Hoe zit het met periplasmatisch eiwit zoals YbiS met een actieve plaats Cys? Omdat de omgeving van het periplasma oxideert, moet YbiS-mist worden beschermd tegen oxidatieve omzetting van de vrije Cys in sulfinezuur of sulfonzuur, waardoor het eiwit inactief wordt. Het mechanisme omvat twee periplasmatische eiwitten, bekend als DsbG en DsbC, die vergelijkbaar zijn met thioredoxine. Deze twee eiwitten zijn in staat elektronen af ​​te staan ​​aan het onbeschermde thiol, waardoor het niet oxideert, waardoor YbiS actief kan blijven in het periplasma. Om de activiteit te behouden, worden DsbG en DsbC verminderd door een ander periplasmatisch eiwit, DsbD.


Eiwitvouwing en vorming van disulfidebindingen in de eukaryote cel: vergaderverslag op basis van de presentaties op de European Network Meeting on Protein Folding and Disulfide Bond Formation 2009 (Elsinore, Denemarken)

Het endoplasmatisch reticulum (ER) speelt een cruciale rol als compartiment voor eiwitvouwing in eukaryote cellen. Defecten in eiwitvouwing dragen bij aan een groeiende lijst van ziekten, en vooruitgang in ons begrip van de moleculaire details van eiwitvouwing helpt om efficiëntere manieren te bieden om recombinante eiwitten te produceren voor industrieel en medicinaal gebruik. Bovendien heeft onderzoek van de afgelopen jaren het belang aangetoond van de ER als een signaleringscompartiment dat bijdraagt ​​aan de algehele cellulaire homeostase. Het kasteel van Hamlet vormde een prachtig decor voor de laatste Europese netwerkbijeenkomst om dit onderwerp te bespreken in Elsinore, Denemarken, van 3 tot 5 juni 2009. De bijeenkomst werd georganiseerd door onderzoekers van de afdeling Biologie van de Universiteit van Kopenhagen en omvatte 20 lezingen door namen en jongere wetenschappers, gericht op onderwerpen als oxidatieve eiwitvouwing en rijping (met name in het ER, maar ook in andere compartimenten), cellulaire redoxregulatie, ER-geassocieerde afbraak en de ongevouwen eiwitrespons. Er werden spannende nieuwe ontwikkelingen gepresenteerd en de intieme setting met ongeveer 50 deelnemers bood een uitstekende gelegenheid om actuele belangrijke vragen in het veld te bespreken.


Thiol Redox-overgangen in celsignalering, deel A: chemie en biochemie van laagmoleculair gewicht en eiwitthiolen

Pierluigi Mauri, . Fulvio Ursini, in Methoden in Enzymologie, 2010

2 MS/MS-identificatie van redox-schakelaars in eiwit

In eiwitchemie worden structurele disulfiden geïdentificeerd door peptiden geproduceerd door verschillende endoproteasen onder reducerende en niet-reducerende omstandigheden te vergelijken en opnieuw te rangschikken. Deze benaderingen (besproken in Gorman et al., 2002 ) zijn lang en complex en worden tegenwoordig geleidelijk vervangen door moderne op MS/MS gebaseerde technologie.

Wanneer een eiwit dat een redox-switch bevat in zijn geoxideerde vorm is, produceert proteolyse ofwel een fragment dat het disulfide bevat of dubbele fragmenten die aan elkaar zijn gekoppeld door het disulfide. In beide gevallen is het verschijnen van een nieuw peptide met een massa 2 a.m.u. lager dan de massa van ofwel het gereduceerde peptide of de som van twee peptiden, suggereert een identificatie die zal worden gevalideerd door MS/MS-sequencing.

Het belangrijkste nadeel van de benadering is de noodzaak van een alkalische pH voor de activiteit van trypsine, de meest specifieke en gestandaardiseerde endoprotease die in proteomics wordt gebruikt. In feite, wanneer Cys worden gedissocieerd, vindt een thiol-disulfide-scramblering plaats door een nucleofiele aanval van thiolaat op het disulfide, zoals Sanger al in 1953 aangaf. Deze kunstmatige herschikking verzwakt de geldigheid van de disulfidetoewijzing diep (Gorman et al., 2002 ).

Hoewel deze belangrijke valkuil vaak over het hoofd wordt gezien in meldingen van disulfide-identificatie, waaronder glutathionylering, is het optreden ervan, wanneer trypsine wordt gebruikt en het eiwit vrije cysteïnes bevat, onvermijdelijk. Het gebruik van alkyleringsmiddelen om vrij Cys in onze handen op te vangen was niet bevredigend, aangezien de mogelijkheid dat een thiolaat nog steeds reageert met een disulfide in plaats van met het alkyleringsmiddel, niet volledig kan worden uitgesloten.

Het gebruik van het endoprotease pepsine, dat actief is bij een zure pH, voorkomt het versleutelen van thiol-disulfide, maar deze benadering lijdt onder de lage en onvoorspelbare specificiteit van de proteolyse.

In onze studies werd dit probleem opgelost door heuristisch uit te gaan van een constant proteolytisch patroon in het geoxideerde en gereduceerde eiwit. Kandidaat-dubbele peptiden werden geïdentificeerd volgens het fragmentatiepatroon dat werd waargenomen onder reducerende omstandigheden. MS/MS-analyse van de dubbel-by-reeks bevestigde de juiste identificaties.


Het oxidase DsbA vouwt een eiwit met een niet-opeenvolgende disulfide

Een van de laatste onopgeloste problemen van de moleculaire biologie is hoe de opeenvolgende aminozuurinformatie leidt tot een functioneel eiwit. Een correcte disulfidevorming binnen een eiwit is hierbij essentieel. We presenteren periplasmatisch ribonuclease I (RNase I) van Escherichia coli als een nieuw endogeen substraat voor de studie van oxidatieve eiwitvouwing. Een van de vier disulfiden is tussen niet-opeenvolgende cysteïnes. In het algemeen vereist het vouwen van eiwitten met niet-opeenvolgende disulfiden het eiwitdisulfide-isomerase DsbC. Daarentegen laat onze studie met RNase I zien dat DsbA een voldoende katalysator is voor correcte disulfidevorming in vivo en in vitro. DsbA is dus specifieker dan algemeen wordt aangenomen. Verder laten we zien dat het redoxpotentieel van het periplasma afhangt van de aanwezigheid van glutathion en de Dsb-eiwitten om het op -165 mV te houden. We hebben de invloed van deze redoxpotentiaal op de vouwing van RNase I bepaald. Onder de meer oxiderende omstandigheden van dsb(-)-stammen wordt DsbC noodzakelijk om niet-eigen disulfiden te corrigeren, maar het kan DsbA niet vervangen. Al met al vouwt DsbA een eiwit met een niet-opeenvolgende disulfide zolang er geen onjuiste disulfiden worden gevormd.


Bewijs voor redox-detectie door een menselijk hartcalciumkanaal

Ionenkanalen zijn cruciaal voor het leven en reageren snel op stimuli om fysiologische reacties op te roepen. Calciuminstroom in de hartspier vindt plaats via de ionengeleidende α1C-subeenheid (Cav1.2) van het L-type Ca(2+)-kanaal. Glutathionylering van Cav1.2 resulteert in een verhoogde calciuminstroom en is duidelijk in ischemisch menselijk hart. Er bestaat echter controverse over de vraag of directe wijziging van Cav1.2 verantwoordelijk is voor een veranderde functie. We hebben direct de functie van gezuiverd menselijk Cav1.2 in proteoliposomen beoordeeld. Afknotting van het C-uiteinde en mutatie van cysteïnes in het N-terminale gebied en cytoplasmatische lus III-IV-linker veranderden de effecten van thiol-modificerende middelen op open waarschijnlijkheid van het kanaal niet. Mutatie van cysteïnen in cytoplasmatische lus I-II linker veranderde echter de open waarschijnlijkheid en eiwitvouwing, beoordeeld door thermische verschuivingstest. We vinden dat C543 de gevoeligheid van Cav1.2 voor oxidatieve stress verleent en voldoende is om de kanaalfunctie en posttranslationele vouwing te wijzigen. Onze gegevens leveren direct bewijs voor het calciumkanaal als een redoxsensor die snelle fysiologische reacties mogelijk maakt.

Figuren

Figuur 1. Karakterisering van de Ca v…

Figuur 1. Karakterisering van de Ca v 1.2 stroom van de menselijke lange NT isovorm...

Figuur 2. De lange NT isovorm en...

Afbeelding 2. De lange NT-isovorm en korte NT-isovorm reageren op dezelfde manier als DTT en...

Figuur 3. Afkappen van het C-uiteinde van...

Figuur 3. Het afkappen van het C-uiteinde van de lange NT-isovorm verhoogt de P . aanzienlijk O…

Figuur 4. Mutatie van cysteïnes in de…

Figuur 4. Mutatie van cysteïnes in de N-terminus van de lange NT isovorm niet...

Figuur 5. Mutatie van cysteïnes in de…

Figuur 5. Mutatie van cysteïnes in de cytoplasmatische lus III-IV linker van de lange NT...

Figuur 6. Mutatie van cysteïnes in de…

Figuur 6. Mutatie van cysteïnes in het lus I-II linkergebied van de lange NT...

Figuur 7. Mutatie van cysteïne 543 naar...

Figuur 7. Mutatie van cysteïne 543 naar serine verandert de reactie van het kanaal op...


Structuur-functierelaties, fysiologische rollen en evolutie van ER-residente selenoproteïnen van zoogdieren

Selenium is een essentieel sporenelement bij zoogdieren. De belangrijkste biologische vorm van deze micronutriënt is het aminozuur selenocysteïne, dat aanwezig is in de actieve plaatsen van seleno-enzymen. Zeven van de 25 selenoproteïnen van zoogdieren zijn geïdentificeerd als bewoners van het endoplasmatisch reticulum, waaronder het 15-kDa selenoproteïne, type 2 joodthyroninedejodinase en selenoproteïnen K, M, N, S en T. De meeste van deze eiwitten zijn slecht gekarakteriseerd. Recente studies impliceren echter dat sommigen van hen betrokken zijn bij de kwaliteitscontrole van eiwitvouwing in het ER, retrotranslocatie van verkeerd gevouwen eiwitten van het ER naar het cytosol, metabolisme van het schildklierhormoon en regulatie van calciumhomeostase. Bovendien zijn sommige van deze eiwitten betrokken bij de regulering van het glucosemetabolisme en bij ontstekingen. Deze review bespreekt de evolutie en structuur-functierelaties van de ER-residente selenoproteïnen en vat recente bevindingen over deze eiwitten samen, die de opkomende belangrijke rol van selenium en selenoproteïnen in de ER-functie onthullen.


Invoering

Natuurlijke linkers fungeren als spacers tussen de domeinen van multidomein-eiwitten. Er zijn verschillende interdomein-linkers geïdentificeerd aan de grenzen van functioneel verschillende domeinen. 1 Deze linkers hebben een spiraalstructuur en vertonen een voorkeur voor Gln-, Arg-, Glu-, Ser- en Pro-aminozuren. 1 Een geautomatiseerde methode om interdomein-linkers te extraheren uit een dataset van eiwitten met een bekende driedimensionale structuur, onthulde dat de meerderheid van de interdomain-linkersets Pro-, Arg-, Phe-, Thr-, Glu- en Gln-residuen vormen die fungeren als starre spacers. 2 Proline komt veel voor in veel natuurlijk afgeleide interdomein linkers, en structurele studies geven aan dat proline-rijke sequenties relatief rigide verlengde structuren vormen om ongunstige interacties tussen de domeinen te voorkomen. 3 Een onafhankelijke analyse toonde aan dat Thr, Ser, Gly en Ala ook voorkeursresiduen zijn in natuurlijke linkers. 4 Bovendien zijn flexibele Gly-rijke regio's waargenomen als natuurlijke linkers in eiwitten, waardoor lussen worden gegenereerd die domeinen in multidomein-eiwitten verbinden. 5, 6 De vooruitgang in recombinant-DNA-technologie vergemakkelijkte de fusie van eiwitten of domeinen met behulp van deze synthetische aminozuurlinkers. Naast structurele studies van eiwit-eiwitinteracties, hebben een breed scala aan toepassingen op het gebied van biotechnologie deze gefuseerde eiwitten gebruikt om op eiwit gebaseerde biochemie te onderzoeken, zoals het creëren van kunstmatige bifunctionele enzymen, 7 om antilichamen 8 en eiwitten te produceren met gespecialiseerde functies, 9 en als hulpmiddelen voor FRET-analyse. 10

De karakterisering van eiwit-eiwit interacties is vaak nodig om inzicht te krijgen in verschillende biologische processen. Toch wordt de studie van eiwit-eiwit-interacties voor veel complexen belemmerd wanneer een of meer partners van het complex ongevouwen of onstabiel zijn. Traditioneel wordt dit probleem aangepakt door de co-expressie en/of co-zuivering van beide eiwitten. 11 Voor zwak interagerende of onstabiele complexen resulteert de co-expressie en/of co-zuivering echter vaak in een enkel eiwit. 12 Eiwitmanipulatietechnieken waren een andere optie om ongevouwen of onstabiele eiwitten aan te pakken, met behulp van een chimeer met een enkele polypeptideketen om de twee bindingspartners te verbinden via een flexibele aminozuurlinker 13 . Met deze chimere eiwitten was het toen mogelijk om zowel de intramoleculaire als intermoleculaire eiwit-eiwit-interacties te behouden, 14 en chimere eiwitten zijn gebruikt om stabiele, oplosbare binaire complexen te genereren voor structurele studies, evenals functionele dimeren. 15

Het koppelen van bindingspartners met behulp van een kunstmatige linker zal de nabijheid tussen de interactiepartners vergroten en de natuurlijke interactie behouden. In gevallen waar de interactiepartners niet gekoppeld zijn, is het mogelijk dat de bindingspartners dissociëren vanwege hun lage affiniteit en/of vanwege de kristallisatieomstandigheden. De meeste kunstmatige linkers die worden gebruikt om chimere eiwitten voor structurele studies te genereren, zijn rijk aan Gly-residuen (Tabel I). Interessant is dat de natuurlijk voorkomende, flexibele linkers die in veel eiwitten worden gevonden, ook rijk zijn aan Gly-residuen. In de volgende sectie bespreken we enkele van deze natuurlijk voorkomende Gly-rijke linkers.

1FTK, 1FTL, 1FTO, 1FW0, 1FTJ, 1FTM

Gly-rijke linkers in de natuur

Natuurlijk voorkomende Gly-rijke linkers komen in veel eiwitten voor en het is bekend dat ze, afgezien van het koppelen van domeinen, een functionele rol spelen in het eiwit.De transcriptiefactor PAX6 bestaat uit twee DNA-bindende domeinen, een gepaard domein (PD) en een homeodomein (HD), verbonden door een Gly-rijke linker. 16 Kristalstructuuranalyse van het menselijke PAX6 PD-DNA-complex onthulde dat de verlengde linker kleine groefcontacten maakt met het DNA. 17 In transmembraanglycoproteïnen (TM's) van retrovirussen worden ook belangrijke functionele rollen uitgevoerd door de linkers, die membraanfusie bemiddelen via een N-terminaal fusiepeptide. Het fusiepeptide is via Gly-rijke linkers aan de centrale coiled-coil-kern gekoppeld. De lengte en aminozuursamenstelling van linkers zijn geconserveerd in veel retrovirussen en in HA2 van influenzavirussen. 18 Alanine en proline scanning mutagenese-experimenten toonden aan dat de Gly-rijke linker van humaan T-cel leukemievirus Type 1 (HTLV-1) TM, gp21, betrokken is bij de membraanfusiefunctie. 18 Het N-uiteinde van het SR-eiwit (sequentiespecifieke RNA-bindende factoren), SRSF1, bevat twee RNA-herkenningsmotieven (RRM) die zijn verbonden via een Gly-rijke linker, wat essentieel is voor de binding van exonische splitsingsversterkers (ESE) . 19 In andere gevallen is de rol van de Gly-rijke linker nog onbekend. In filamenteuze Ff-bacteriofagen (M13, fd en f1) bestaat het kleine vachtgen 3-eiwit (g3p) uit drie domeinen (N1, N2 en CT) verbonden door een flexibele Gly-rijke linker 6, een langer Gly-rijk gebied bestaat in de g3p van de IKe filamenteuze faag, maar dit lijkt geen selectief voordeel op te leveren. 20 Gly-rijke linkers zijn ook betrokken bij ziektetoestanden. TDP-43 (TAR DNA-bindend eiwit) bestaat uit twee RNA-bindende domeinen (RBD) en een Gly-rijke C-terminus. Mutaties in het Gly-rijke domein van TDP-43 zijn in verband gebracht met amyotrofische laterale sclerose. 21 Gly-rijke linkers worden ook gebruikt voor bio-imaging-onderzoeken. Nieuwe fluorogeen activerende eiwitten (FAP's) bestaan ​​uit variabele fragmenten met een enkele keten (scFv's), die zijn gemaakt van humaan immunoglobuline variabel zwaar (VH) en variabel licht (VL) domeinen die covalent zijn bevestigd via een Gly- en Ser-rijke linker. 22 Deze FAP's produceren fluorescentie na binding aan een specifieke kleurstof of fluorogeen en worden gebruikt in bio-imaging-onderzoeken om de eiwitdynamiek te volgen.

De rollen van linkers

Poly-Gly en Gly-rijke linkers kunnen worden beschouwd als onafhankelijke eenheden en hebben geen invloed op de functie van de individuele eiwitten waaraan ze hechten. De gefuseerde eiwitten gedragen zich onafhankelijk, zodat de enkelketenige eiwitten de gecombineerde functie van gefuseerde partners kunnen vervullen. 23, 24 De natieve Type I' beta-turn-lus in staphylococcus-nuclease werd bijvoorbeeld vervangen door een vijf-residu-turn-sequentie van concanavaline A, zonder de activiteit van het nuclease te veranderen. De kristalstructuur onthulde dat het hybride eiwit goed gevouwen was en dat de geïntroduceerde turn-sequentie de conformatie van de ouderlijke concanavaline A-structuur behield. 25 In andere systemen kunnen linkerregio's echter de stabiliteit, oplosbaarheid, oligomere toestand en proteolytische resistentie van de gefuseerde eiwitten beïnvloeden. 24 Het repressoreiwit, Arc, is een dimeer met identieke subeenheden. Een gefuseerd eiwit - Arc-linker-Arc - werd getest op zijn stabiliteit, eiwitvouwkinetiek en biologische activiteit door de lengte en samenstelling van de linker te variëren. Hoewel de poly-Gly-linkers maximale conformationele vrijheid boden, slaagden ze er niet in om optimale stabiliteit te garanderen. Daarentegen werd maximale stabiliteit verkregen met een linker die respectievelijk 11 Ala- en 5 Gly-residuen of 7 Ser- en 9 Gly-residuen bevat in het gerandomiseerde gebied van de linker. 26 Flexibele Gly-linkers zijn gebruikt om de vouwing en functie van epitoop-gelabelde eiwitten te verbeteren. Flexibele polypeptide-linkers van 5, 8 of 10 Gly-residuen zijn tussen een epitoop en een gelabeld eiwit geplaatst om de epitoopgevoeligheid en toegankelijkheid te verhogen zonder de eiwitvouwing en -functie te verstoren. 27, 28 Het is dus belangrijk dat de lengte en aminozuursamenstelling van een potentiële linker wordt geoptimaliseerd om de biologische activiteit van de individuele eiwitten in het fused-complex te behouden.

De luslengte die door de linker wordt gecreëerd, kan een diepgaand effect hebben op de werking van de linker in het fused-complex. Een systematische studie om de rol van luslengte bij eiwitvouwing en stabiliteit te onderzoeken, werd uitgevoerd met behulp van het Rop-eiwit als modelsysteem. 24 Rop is een homodimeer van helix-loop-helixmonomeren en voor dit experiment werd de lus-linker met twee residuen tussen helix 1 en helix 2 vervangen door een reeks niet-natuurlijke (Gly)1–10 linkers, met 1 tot 10 Gly-residuen. Net als bij het wildtype Rop-eiwit behielden alle 10 de mutanten een sterk helixvormige dimeerstructuur en behielden ze hetzelfde niveau van wildtype RNA-bindende activiteit. Interessant is echter dat de stabiliteit van het Rop-eiwit ten aanzien van thermische en chemische denaturatie omgekeerd gecorreleerd was met de luslengte, dat wil zeggen dat een langere luslengte resulteerde in een progressief verminderde stabiliteit. 24 In gevallen waar eiwitoplosbaarheid en/of -stabiliteit de belangrijkste problemen zijn voor eiwit-eiwitinteractieonderzoeken, kan het aan elkaar binden van de eiwitten de oplosbaarheid en stabiliteit van het complex verbeteren. 30, 31 In sommige gevallen kan de stabiliteit worden verbeterd door de linkerlengte en aminozuursamenstelling te veranderen. 26 Gly-rijke linkers worden dus gebruikt tussen twee interagerende eiwitten om de stabiliteit van een van de bindingspartners te verbeteren of, waar de interactie van voorbijgaande aard is, om een ​​stabiel eiwit-eiwitcomplex te genereren. Hier presenteren we onze analyse van verschillende gevallen waarin kunstmatige Gly-rijke linkers zijn gebruikt om twee eiwitten te fuseren voor structurele studies. Tabel I geeft details over de eiwitten die werden gefuseerd en ook over de lengte en samenstelling van de linker die voor fusie werd gebruikt.

Linkers voor onstabiele eiwitten en hun bindende partners

Sommige eiwitten bestaan ​​in complex met hun bindingspartner(s) om stabiel te blijven in cellen. 23 Ze kunnen niet bestaan ​​als een enkel eiwit en vereisen co-expressie met hun bindingspartner wanneer ze tot expressie worden gebracht in een heteroloog systeem. Overexpressie van afzonderlijke eiwitten zou resulteren in onstabiele eiwitmoleculen of aggregaten met een hoger molecuulgewicht, wat de kristallisatie belemmert. In verschillende gevallen wordt dit aangepakt door het gebruik van flexibele Gly-rijke linkers. In de volgende paragrafen bespreken we kort het gebruik van deze strategie om stabiele major histocompatibility complex (MHC) Klasse II-moleculen, LIM (Lin-11/Islet-1/Mec-3) domeinen en Pregnane X-receptormoleculen voor structurele studies te genereren.

MHC klasse II-peptidecomplexen

De linkers die in MHC-moleculen worden gebruikt, zijn voordelig voor twee verschillende scenario's: om eiwitten te stabiliseren en om tijdelijke eiwit-eiwit-interacties op te vangen. Aanvankelijk werd aangetoond dat de covalente binding van een peptide aan een MHC Klasse II-molecuul het MHC-molecuul zou kunnen stabiliseren. 13 Later werd deze strategie toegepast om het MHC/peptide/TCR (T-celreceptor) ternaire complex te verkrijgen, 75 waarvan werd onthuld dat het een snel dissociërend complex was (zie de sectie Linkers om tijdelijke eiwit-eiwitinteracties op te vangen).

MHC Klasse II-moleculen zijn heterodimere eiwitten die niet-covalent interagerende - en -ketens omvatten. Het extracellulaire deel bestaat uit twee regio's: een peptidebindingsplaats, bestaande uit een 1- of 1-domein, en een Ig-achtig domein, bestaande uit een α2- of β2-domein. Wanneer uitgedrukt als twee verschillende ketens (α en β) en samen gemengd om een ​​αβ-heterodimeer te vormen, resulteerden MHC Klasse II-moleculen in aggregaten met een hoog molecuulgewicht, wat de mogelijke heterogeniteit van αβ-heterodimeren in aanwezigheid van vrije α- en β-ketens suggereert. Er werden echter stabiele αβ-heterodimeren geproduceerd wanneer een antigeen peptide, herkend door een bepaald MHC Klasse II-molecuul, covalent werd gekoppeld aan het N-uiteinde van de MHC Klasse II-1-keten door een 16-aminozuur Gly-rijke linker (GGGGSLVPRGSGGGGS). De aanwezigheid van een linker had geen effect op de herkenning van het peptide-MHC Klasse II-complex door de specifieke T-celhybridoma's. 13 Deze specifieke linker heeft een trombine-splitsingsplaats die wordt geflankeerd door Gly-rijke residuen, zodat de linker tussen de gefuseerde eiwitten kan worden gesplitst. De kristalstructuur van het humane klasse II MHC-eiwit, HLA-DR1, gecomplexeerd met een niet-gekoppeld influenzaviruspeptide (PDB: 1DLH), onthulde echter dat een linker van zes aminozuren voldoende is om het C-uiteinde van het peptide te verbinden met de N-terminus van het MHC klasse II-molecuul 76. Verder was het binden van een ovalbumine (OVA) peptide aan het N-uiteinde van de β1-keten van het IAd MHC Klasse II-molecuul met behulp van een zes-aminozuurlinker (Tabel I), voldoende om de stabiliteit van αβ-heterodimeren te verbeteren (Fig. 1). 78 Verdere kristallisatieproeven toonden aan dat veel omstandigheden kristallen van diffractiekwaliteit konden produceren. Deze experimentele benadering leidde tot de succesvolle kristallisatie van andere MHC Klasse II-peptidecomplexen met behulp van een polypeptidelinker. 31-44

Kristalstructuur van MHC Klasse II-peptidecomplex. Lintweergave van MHC Klasse II IA d (groen) en ovalbuminepeptide (magenta) complex (PDB-code: 2IAD), waarbij de C-terminus van ovalbuminepeptide is gekoppeld aan de N-terminus van de β-keten van MHC Klasse II IA d molecuul met behulp van een GSGSGS (6aa) linker. De elektronendichtheid voor de linker werd niet waargenomen en de mogelijke positie werd aangegeven als blauwe stippellijnen. Alle structuurgerelateerde figuren van deze review zijn opgesteld met het programma PyMol. 77

LIM-domein en verwante eiwitten

LIM (Lin-11/Islet-1/Mec-3) domeinen zijn een klasse van zinkbindende domeinen die eiwit-eiwit interacties bemiddelen om het lot van de cel te reguleren. 23 LIM-domeinbevattende eiwitten zijn onderverdeeld in drie groepen: LIM-only (LMO), LIM homeodomein (LIM-HD) eiwitten en LIM-kinasefamilies. Over het algemeen zijn LMO-eiwitten gelokaliseerd in de kern, maar missen ze een nucleaire lokalisatiesequentie. Om deze eiwitten in de kern te houden, moeten ze dus worden gebonden aan LIM-domeinbindend eiwit-1 (ldb1). LMO1, 2 en 4 spelen een belangrijke rol bij de ontwikkeling van normale en leukemische T-cellen, en de LMO-ldb1-complexen kunnen de genexpressie moduleren. 79 LMO-eiwitten zijn onoplosbaar en onstabiel wanneer ze door bacteriën tot expressie worden gebracht, maar dit kan worden verholpen wanneer ze worden gefuseerd met ldb1 met behulp van een GGSGGHMGSGG- of een GGSGGSGGSGG-linker aan het C-uiteinde. 80 Het LIM-interactiedomein (LID) van ldb1 (300-340) is ongestructureerd in oplossing. 29 Na binding aan de N-terminale LIM-domeinen van LMO2 en LMO4, neemt de LID van ldb1 een verlengde conformatie aan, uitgerekt langs het oppervlak van het LIM-domein [Fig. 2(A)] om het binden te vergemakkelijken.

Structurele details van LIM-domeinen en hun bindende partnercomplexen. (A) Lintweergave van de kristalstructuur van LMO4 (groen)-ldb1 (magenta) complex (PDB-code: 1RUT), waarbij de C-terminus van LMO4 is gekoppeld aan de N-terminus van Ldb1 met behulp van een GGSGGSGGSGG (11aa) linker . De blauwe stippellijn geeft de mogelijke positie van de ontbrekende aminozuren van de linker weer. (B) NMR-structuur van Lhx3 (groen)-ldb1 (magenta) complex (PDB-code: 2JTN), waarbij de C-terminus van ldb1 is gekoppeld aan N-terminus van Lhx3 met behulp van een GGSGGHMGSGG (11aa) linker (donkerblauw). Zn2+-ionen worden weergegeven als oranje bollen.

Evenzo hebben LIM-HD-eiwitten de neiging onoplosbaar en onstabiel te zijn. Er zijn 12 zoogdier LIM homeodomein eiwitten bestaande uit zes paren paralogen, die vaak overlappende expressiepatronen en functies hebben. Twee van dergelijke paraloge paren zijn LIM homeobox-eiwit 3 en 4 (Lhx3 en Lhx4) en Islet-1 en -2 (Isl1 en Isl2). Wanneer ze tot expressie worden gebracht in bacteriën, hebben de LIM-domeinen van Lhx3 en Lhx4 de neiging te aggregeren en zijn ze grotendeels onoplosbaar. Het koppelen van een interactiepartner, zoals Isl1 of ldb1, aan de LIM-domeinen kan deze aggregatie voorkomen en de productie van oplosbare gebonden complexen 81 mogelijk maken [Fig. 2(B)]. Sindsdien zijn verschillende LIM-domeinstructuren (tabel I) opgelost door dezelfde techniek te gebruiken. 23 , 29 , 30 , 45-50 Figuur 2(A,B) toont de interactie tussen lbd1 en de verschillende LIM-domeinen. Deze structuren werden opgelost met behulp van röntgen- en NMR-technieken. De toewijzing van de ruggengraat door NMR-experimenten voor de Gly-rijke linker onthulde dat de linker bestaat als een willekeurige spoel. 47

PXR-LBD en SRC-1-complex

Pregnane X-receptor (PXR) is een xenobiotische receptor en een ligand-induceerbare transcriptiefactor die betrokken is bij het reguleren van geneesmiddelmetaboliserende enzymen en transporters. PXR bevat twee domeinen: een sterk geconserveerd DNA-bindend domein (DBD) aan het N-uiteinde en een meer divergerend ligand-bindend domein (LBD) aan het C-uiteinde. De LBD van PXR is betrokken bij ligandherkenning en interageert ook met co-activatoreiwitten. PXR is een onstabiel eiwit en bestaat als een complex met zijn co-repressor. Ligandbinding verdringt de co-repressor door een co-activator, de steroid receptor activator 1 (SRC-1). Het bestuderen van de interactie tussen de PXR-LBD en SRC-1 is belangrijk om het mechanisme van ligand-gemedieerde transcriptionele effecten te begrijpen. Een dubbel expressiesysteem werd aanvankelijk gebruikt om deze binding te karakteriseren, maar resulteerde in de productie van onstabiele eiwitten en een stoichiometrie van SRC-1 tot PXR van minder dan 1:1. Watkins et al. gezuiverde PXR met behulp van het SRC-1-domein en combineerde deze PXR vervolgens met een SRC-1-interagerend peptide om een ​​complex te vormen en de kristalstructuur te bepalen (PDB: 1NRL). 82 Ze ontdekten dat het C-uiteinde van PXR dichtbij het N-uiteinde van SRC-1 ligt, op een afstand van 18 Å, waarvoor ten minste vijf aminozuren nodig zijn om deze eiwitten te koppelen. Het SRC-1-peptide werd dus gefuseerd aan het C-uiteinde van de PXR-LBD met behulp van linkers van verschillende lengte, zoals S GGG SSHS, S GGSGG SSHS en S GGSGGSGG SSHS (onderstreepte sequenties zijn de toegevoegde linker, de flankerende gebieden zijn van de interagerende eiwitten), waarbij de meeste kristallen zijn verkregen met de 10-aminozuur Gly-rijke linker 51 (Fig. 3).

Kristalstructuur van het ligand bindende domein van Pregnane X receptor (PXR-LBD) en steroid receptor activator 1 (SRC-1). Lintweergave van PXR-LBD (groen)-SRC-1-interagerend peptide (magenta) complex, waarbij het C-uiteinde van PXR-LBD is gekoppeld met behulp van een GGSGG (5aa)-linker aan het N-uiteinde van het SRC-1-interagerende peptide (VOB-code: 3CTB). De blauwe stippellijn toont de mogelijke posities van de ontbrekende aminozuren van de linker.

Linkers om voorbijgaande eiwit-eiwit interacties op te vangen

Verschillende belangrijke biologische gebeurtenissen worden bepaald door eiwit-eiwit-interacties, waarvan de meeste van voorbijgaande aard en zwak zijn. Het vangen van een zwakke of tijdelijke interactie voor structurele studies is altijd een uitdaging, en flexibele Gly-rijke linkers zijn dus nuttig gebleken in deze gevallen, bijvoorbeeld het vangen van snelle dissociërende reacties, zoals de MHC-molecuulgebonden peptideherkenning door TCR, de interactie tussen een fosfoproteïne en een nucleocapside-eiwit van het paramyxovirus, evenals het vangen van bindingsinteracties met lage affiniteit, zoals in het geval van g3p-TolA en Histon H3-Asf1 (Anti-silencing-functie 1). Verder, in het geval van calmoduline (CaM) en het calmoduline bindende domein (CBD) van calcineurine, is deze strategie gebruikt om een ​​ongestructureerd eiwit te vangen dat secundaire structuur krijgt bij binding met zijn partner. Dit brede gebruik van linkers wordt in de volgende paragrafen kort besproken.

T-celreceptor, peptide en MHC klasse II-complexen

T-celreceptoren (TCR) worden gevonden op het oppervlak van T-lymfocyten en herkennen antigenen die zijn gebonden aan MHC-moleculen (major histocompatibility complex). Wanneer de TCR zich bezighoudt met een antigeen en MHC, wordt deze geactiveerd om de immuunrespons te versterken. Het bestuderen van deze interacties is in het verleden echter moeilijk gebleken vanwege een zeer lage affiniteit tussen de TCR en het peptide/MHC-molecuul. Kinetische studies wezen ook op een langzame associatie en snelle dissociatie, waardoor het moeilijk was om deze tijdelijke interactie voor verdere studies te vangen. 75 , 83 Om het TCR/peptide/MHC-complex te stabiliseren voor kristallisatie, werd het antigeen-peptide daarom covalent gekoppeld met behulp van een Gly-rijke linker aan de N-terminus van de -keten van het MHC-molecuul (zie ook de sectie MHC klasse II-peptidecomplexen). ) deze linker hielp om de vorming van een stabiel TCR-antigeen peptide-MHC-molecuul ternair complex te mediëren. 52-54 Een andere manier om dit complex te stabiliseren werd aangetoond met behulp van een polypeptide van acht aminozuren (GGSGGGGG) om het antigeenpeptide en de N-terminus van de variabele β-keten van TCR te koppelen. 55-58 De algehele structuur van de TCR-peptide-MHC- en de MHC-peptide-TCR-moleculen vertoonde geen verschillen in de bindingsgebieden van MHC- en TCR-moleculen met behulp van beide methoden [Fig. 4(A,B)] dus kon de structuur worden opgelost als een ternair complex. Tabel I schetst de verschillende ternaire TCR-peptide-MHC-complexen die met deze methoden zijn opgelost.

Kristalstructuren van verschillende MHC-molecuul-peptide-T-celreceptor (TCR) -complexen. (A) Lintweergave van TCR D10 (groen)-kippenei CA-peptide (geel)-MHC Klasse II IA k (magenta) complex (PDB-code: 1D9K), waarbij het C-uiteinde van het CA-peptide is gekoppeld aan de N -terminus van de a-keten van de MHC klasse II IA k met behulp van een GGGGSLVPRGSGGGGS (16aa) linker. Een interactieve weergave is beschikbaar in de elektronische versie van het artikel. (B) Lintweergave van TCR HA 1.7 (groen)-Hemagglutinine (HA)-peptide (geel)-MHC-molecuul HLA-DR1 (magenta) complex (PDB-code: 1FYT), waar het C-uiteinde van het HA-peptide is gekoppeld aan de N-terminus van de variabele β-keten van de TCR HA 1.7 met behulp van een GGSGGGGG (8aa) linker. De blauwe stippellijn toont de mogelijke posities van de ontbrekende aminozuren van de linker. Een interactieve weergave is beschikbaar in de elektronische versie van het artikel. PRO2206 Afbeelding 4a PRO2206 Afbeelding 4b

Fosfoproteïne-nucleocapside-eiwitcomplex

Binnen het virion van de paramyxovirusfamilie van virussen verpakt het nucleocapside-eiwit (N) het genomische RNA in een spiraalvormig eiwit-RNA-complex dat bekend staat als een nucleocapside. Het wordt gebruikt als een sjabloon voor de transcriptie van mRNA's door een viraal RNA-polymerase, dat uit twee componenten bestaat: het grote eiwit en het fosfoproteïne (P). Terwijl het grote eiwit betrokken is bij de katalytische activiteiten van het polymerase, is het fosfoproteïne betrokken bij het binden van het polymerase aan het nucleocapside via het C-terminale gebied (459-507). De bindingsplaats voor het fosfoproteïne is toegewezen aan de C-terminus (486-505) van het nucleocapside-eiwit. 84 Kinetische studies toonden aan dat dit een snel associërende reactie is, met een zwakke bindingsaffiniteit. Om dit complex te stabiliseren, werd daarom het C-uiteinde van proteïne P gekoppeld met behulp van een Gly- en Ser-rijke linker (GSGSGSGS) aan het N-uiteinde van proteïne N, en het gekoppelde complex werd gekristalliseerd. Deze structuur vertoonde een antiparallelle pakking van de helix van het N-eiwit [Fig. 5(A)]. De hoek tussen de N-eiwithelix en de uiteindelijke helix van het P-eiwit suggereert echter dat het een intermoleculaire interactie tussen P- en N-eiwitten zou kunnen zijn in plaats van intramoleculaire interactie. 14

Structurele details van voorbijgaande eiwit-eiwit-interacties met behulp van Gly-rijke linkers. (A) Lintweergave van de kristalstructuur van fosfoproteïne (P457–507) van paramyxviraal polymerase (groen)-nucleocapside-eiwit (N486–505) (magenta), waarbij het C-uiteinde van P457–507 is gekoppeld met behulp van een GSGSGSGS (8aa) linker aan de N-terminus van het nucleocapside-eiwit (N486–505) (VOB-code: 1T6O).Het interagerende peptide (magenta) was van het aangrenzende symmetriegerelateerde molecuul (cyaan). (B) Lintweergave van het N1-domein van g3p (magenta) -D3-domein van TolA (groen) complex, waarbij de C-terminus van g3p is gekoppeld met behulp van een GGGSEGGGSEGGGSEGGG (18aa) linker naar de N-terminus van TolA (PDB-code : 1TOL). (C) Lintweergave van anti-silencing-functie 1 (Asf1 groen) – α3-helix van Histone H3 (magenta) complex (PDB-code: 2IDC). De linker-aminozuren (AAGAATAA (8aa)) waren niet aanwezig in de pdb behalve de eerste twee Ala-residuen. De voorspelde linkerpositie wordt weergegeven als een blauwe stippellijn in alle panelen.

Ribosomen-SRP-FtsY-complex

Escherichia coli signaalherkenningsdeeltje (SRP) bestaat uit een eiwit (Ffh) en 4.5S RNA. Ffh en FtsY (receptor van SRP) bestaan ​​uit een NG-domein, een GTPase G-domein en een N-domein. Een associatie tussen SRP en FtsY via het NG-domein is vereist voor de levering van ribosoom-ontluikende ketencomplexen aan het membraan, en een wederzijdse GTPase-activering coördineert de overdracht van de signaalsequentie naar de translocon. 59 Associaties van SRP en FtsY omvatten een reeks GTP-onafhankelijke en -afhankelijke stappen en vormen een relatief onstabiel complex dat wordt gevisualiseerd door cryo-EM. De interactie tussen Ffh en FtsY wordt echter gestabiliseerd door fusie van het C-uiteinde van FtsY aan het N-uiteinde van Ffh via een 31-residu Gly- en Ser-rijke linker, wat een enkelketenig construct (scSRP) oplevert. 59 Het scSRP met enkele keten gedraagt ​​zich vergelijkbaar met een niet-gekoppelde SRP en FtsY en bindt efficiënt ribosomen, zonder de GTPase-activiteit te veranderen. De cryo-EM-structuur van scSRP gebonden aan het ribosoom werd aldus beschreven. 59

G3p-TolA-complex

Ff-fagen worden gebruikt als selectiehulpmiddel door eiwitten en peptiden op het faagoppervlak weer te geven door genetische fusie met minder belangrijke mantelgen 3-eiwitten (g3p). g3p bestaat uit drie domeinen (N1, N2 en CT) die met elkaar zijn verbonden door natuurlijke, flexibele Gly-rijke linkers. faag infectie van E coli cel vordert door de interactie tussen het N2-domein en de punt van een F-pilus, waarbij de pilus wordt teruggetrokken door een onbekend mechanisme. 85 Op dit moment interageert het N1-domein met het C-terminale (D3) domein van het integrale membraaneiwit TolA, een interactie die niet duidelijk wordt begrepen, en leidt tot het binnendringen van het faaggenoom in het bacteriële cytoplasma. Om het mechanisme van gastheercelinfectie door fagen verder te begrijpen, was de interactie tussen het N1-domein van g3p en het D3-domein van TolA vereist. 6 De affiniteit tussen deze twee domeinen is echter zwak. 86 Vandaar dat een Gly-rijke linker ((G3ZO)3G3) werd gegenereerd om de C-terminus van het N1-domein van g3p en de N-terminus van het D3-domein van TolA te fuseren. Een lange flexibele linker was van nature aanwezig tussen de N1- en N2-domeinen van g3p, en daarom legde het gebruik van een lange linker tussen het N1-domein van g3p en het D3-domein van TolA geen beperkingen op [Fig. 5(B)].

Histon H3-Asf1 complex

De structuur en organisatie van chromatine is belangrijk tijdens de verschillende stadia van de celcyclus. De eerste stappen van chromatine-organisatie omvatten de afzetting van een (H3/H4)2 heterotetrameer op het DNA. Asf1 (anti-silencing-functie 1) is een van de verschillende histon-chaperonnes die bij deze afzetting betrokken zijn. NMR- en tweehybride-experimenten hebben aangetoond dat het C-uiteinde van de α3-helix van gisthiston H3 een interactie aangaat met Asf1, 87, 88, maar deze interactie is zwak. 87 Om een ​​stabiel complex te verkrijgen, werd daarom de α3-helix van Histon H3 gekoppeld met behulp van een alaninerijke linker (AAGAATAA) aan Asf1 60 [Fig. 5(C)]. Voor zover ons bekend is dit het enige geval waarbij een alaninerijke linker werd gebruikt.

CaM-calcineurine CBD-complex

Een vergelijkbare benadering werd gevolgd om de complexe structuur van calmoduline (CaM) en het calmoduline-bindende domein (CBD) van calcineurine te bestuderen. Calcineurine is een CaM-afhankelijk serine/threonine-eiwitfosfatase dat betrokken is bij verschillende signaalroutes. 89 De CBD van calcineurine is grotendeels ongeordend in afwezigheid van CaM en krijgt een secundaire structuur na interactie met CaM. 90 Om de co-kristallisatie van het CaM-CBD-peptidecomplex te vergemakkelijken, werd het C-uiteinde van CaM gekoppeld aan het N-uiteinde van het CBD-peptide met behulp van een Gly-linker van vijf aminozuren (GGGGG). 61 Later bepaalde dezelfde groep de kristalstructuur van CaM-CBD-peptide door co-kristallisatie in afwezigheid van een linker (PDB: 2R28) en ontdekte dat de structuren van CaM-CBD-peptide met en zonder de linker hetzelfde waren (Fig. 6) dit resultaat bewees dat de aanwezigheid van de flexibele Gly-rijke linker de interacties tussen CaM en CBD-peptide niet remde. 91

Structurele overeenkomsten tussen gekoppelde en niet-gekoppelde complexen van calmoduline en het calcineurine-calmoduline-bindende domein (CBD). (A) Lintweergave van Calmodulin (groen) -CBD van Calcineurin (magenta) complex, waarbij de C-terminal van Calmodulin is gekoppeld met behulp van een GGGGG (5aa) linker aan de N-terminus van de Calcineurin CBD (PDB-code: 2F2P) . De voorspelde linkerpositie wordt weergegeven als een blauwe stippellijn. (B) Lintweergave van Calmodulin (groen) -CBD van Calcineurin (cyaan) complex, gegenereerd door co-kristallisatie (VOB-code: 2R28). Beide structuren bleken vergelijkbaar te zijn. Ca2+-ionen worden weergegeven als oranje bollen.

Linkers om dimerisatie te behouden

Functionele dimeren worden gegenereerd door twee monomeren te fuseren via een Gly-rijke linker, en ze zijn vaak betrokken bij verschillende enzymatische activiteiten. De HIV-1-protease (HIV-PR) en andere retrovirale proteasen zijn dimere moleculen die uit twee identieke subeenheden bestaan. Kristalstructuren van HIV-PR hebben aangetoond dat het dimeerinterface van het protease de amino- en carboxyl-terminale strengen van elke monomere subeenheid bevat. 92 Dit gebonden dimeer biedt een middel om het effect van veranderingen in een van de twee subeenheden op de activiteit van HIV-PR te bepalen. Zo werd een covalent gebonden dimeer van HIV-PR geconstrueerd met een 5-aminozuur (GGSSG) linker die de C-terminus van één monomeer verbond met de N-terminus van de andere. Dit covalent gebonden dimeer vertoonde enzymatische eigenschappen die zeer vergelijkbaar waren met die van het natuurlijke dimeer en bleek stabieler te zijn dan het natuurlijke HIV-PR-dimeer bij pH 7,0, waar het natuurlijke dimeer dissocieert. Figuur 7(A) toont een voorbeeld van covalent gekoppelde HIV-1 PR-dimeer. Latere structuren met behulp van verschillende mutanten van het HIV-PR-gebonden dimeer en de structuren van HIV-PR-gebonden dimeer in aanwezigheid van substraatpeptiden werden bepaald zoals weergegeven in Tabel I. 62-70

Kristalstructuur van covalent gebonden dimeren. (A) Lintweergave van covalent gekoppelde HIV-1-protease (PR)-dimeer (PDB-code: 1HPX), waarbij de C-terminus van een monomeer (magenta) is gekoppeld aan de N-terminus van een andere (groen) met behulp van een GGSSG ( 5aa) linker (weergegeven als een blauwe stippellijn) in aanwezigheid van de proteaseremmerverbinding, KNI-272 (weergegeven als lichtblauwe staafjes). (B) Lintweergave van covalent gebonden transthyretinedimeer (PDB-code: 1QWH), waarbij de C-terminus van een monomeer (magenta) is gekoppeld aan de N-terminus van een andere (groen) met behulp van een GSGGGTGGGSG (11aa) linker. De ontbrekende aminozuren van de linker worden weergegeven als een blauwe stippellijn.

Evenzo is bekend dat transthyretine (TTR), een drager van het schildklierhormoon, thyroxine en het holo-retinol-bindende eiwit, een tetrameer vormt, met twee subeenheden die elk uit een dimeer bestaan. TTR-amyloïdeziekten worden veroorzaakt door verkeerd vouwen, aggregatie en afzetting van wildtype TTR in hartweefsel en andere destabiliserende mutaties die TTR-afzetting vatbaar maken in een verscheidenheid aan weefsels. De snelheidsbeperkende dissociatie van het tetrameer in zijn twee subeenheden is noodzakelijk voor de vorming van amyloïde fibril. Er werden experimenten uitgevoerd om het effect te bepalen van het binden van deze nauw op elkaar inwerkende subeenheden op de kinetische stabilisatie van het tetrameer. Een vastgebonden constructie (TTR-GSGGGTGGGSG-TTR)2 werd gegenereerd om het tetrameer te stabiliseren [Fig. 7(B)]. Het gekoppelde complex was zeer stabiel en ook structureel en functioneel vergelijkbaar met wildtype TTR. Bovendien werd gemeld dat ureum het gebonden dimeer niet kon denatureren, terwijl behandeling met guanidinehydrochloride het gebonden dimeer kon denatureren. De auteurs suggereren dat het gebonden complex kinetisch, in plaats van thermodynamisch, stabiel is. 71 Deze studie toonde ook aan dat het aanbinden van twee subeenheden de dissociatie van tetrameer drastisch kan verminderen.

Linker om domeinen binnen een eiwit te fuseren

In het zenuwstelsel van zoogdieren wordt snelle synaptische transmissie tussen zenuwcellen voornamelijk uitgevoerd door ionotrope glutamaatreceptoren (iGluR's), een klasse van transmembraaneiwitten die glutamaat-gated ionkanalen vormen. Ze zijn samengesteld uit verschillende kanaalvormende en ligandbindende domeinen, waarvan bekend is dat veel synthetische agonisten en antagonisten binden. 72-74 De S1- en S2-domeinen vormen het kernligandbindingsgebied van deze eiwitten. Hoewel S1 en S2 een ligandbindende kern vormen, worden ze gescheiden door drie membraanoverspannende segmenten. Daarom werden S1 en S2 covalent gekoppeld om een ​​ligandbindende kern te genereren (Fig. 8). Voor structurele studies van het ligandbindende domein was een Gly-Thr-dipeptidelinker voldoende om de S1- en S2-domeinen van de ligandbindende kern van de glutamaatreceptoren covalent te koppelen en de bindingsaffiniteit ervan voor verschillende agonisten na te bootsen. 94

Structurele details van de ligand bindende kern van glutamaatreceptoren (GluR's). (A) Cartoonrepresentatie van de domeinstructuur van glutamaatreceptor-ionkanalen (GluR's). De S1- en S2-domeinen zijn gekoppeld met behulp van een GT-peptide om een ​​ligandbindingskern te genereren voor structurele studies. (B) Lintweergave van de ligandbindende kern van GluR2, waarbij de C-terminal van S1 (groen) is gekoppeld aan S2 (magenta) met behulp van een GT-di-peptide (donkerblauw) in complex met glutaminezuur (rood) (PDB-code : 1FTJ). Zn 2+ ion wordt weergegeven als een oranje bol.

Selectiecriteria voor links

De selectie van een linkersequentie en lengte is afhankelijk van de constructie van functionele chimere eiwitten en daarom zal de optimale linkerlengte van geval tot geval variëren. nieuw linkerontwerp zal succesvol zijn als de plaats van interactie tussen de twee eiwitten ongeveer bekend is. Vaker wordt de bestaande kennis van de bekende homologe complexe structuren gebruikt om linkers van een geschikte lengte te ontwerpen die de natuurlijke interactie nabootsen. De werkelijke afstand tussen de plaats van de interactie en het nabijgelegen N- of C-uiteinde waaraan de bindingspartner kan worden gefuseerd, zal aanwijzingen geven voor de de novo ontwerp van een linker of een geschikte lengte. Vaak kunnen bindingsgebieden op het oppervlak van eiwitten in kaart worden gebracht met behulp van verschillende biofysische en/of mutatieanalyses 95 en op basis van deze details kunnen de lengte en samenstelling van de linker worden ontworpen. In sommige gevallen kan het koppelen van twee eiwitten met een linker waarvan wordt verondersteld dat deze een intramoleculaire interactie van een chimeer eiwit bevordert, niet voldoende zijn. In plaats daarvan kan het een intermoleculaire interactie vormen, vergelijkbaar met het geval van het fosfoproteïne (P459–507) en het nucleocapside-eiwit (N486–505). 84 Een vergelijkbare binding werd waargenomen in onze recente studies met CaM en het Neurogranin IQ-motiefpeptide, waarbij de bindingspartners zijn gekoppeld. We merkten dat het peptide en eiwit van de aangrenzende moleculen met elkaar in wisselwerking stonden (niet-gepubliceerde gegevens). Onze resultaten en de resultaten van anderen laten duidelijk zien dat als de lengte van de linker niet optimaal is, de gekoppelde partner een aangrenzend molecuul zal aangaan om zijn specificiteit en natuurlijke interacties (intermoleculaire interactie) te behouden. De linkers moeten dus een optimale lengte hebben om ofwel intramoleculaire ofwel intermoleculaire interacties te bevorderen.

In het algemeen waren de minimale en maximale lengtes van linkers die in de hier besproken onderzoeken werden gebruikt tussen 2 en 31 aminozuren (Tabel I), met een gebruikelijke linkerlengte van 5 tot 11 aminozuren voor structurele studies. De lengte van de linker hangt voornamelijk af van het systeem dat wordt bestudeerd en een vooraf begrip van het bindingsgebied kan helpen om de geschatte lengte van de linker te voorspellen. Behalve de lengte van de linker, moet ook de samenstelling worden geoptimaliseerd. Niet alle aminozuren zijn een perfecte keuze voor linkers, aangezien een zekere mate van flexibiliteit en hydrofiliciteit van de linker belangrijk zijn om de functies van de individuele domeinen te behouden en de gefuseerde eiwitten met elkaar te laten interageren. 4Gly heeft een lage voorkeur om een ​​-helix te vormen, dus het ontbreken van een zijketen maximaliseert de vrijheid van de ruggengraatconformatie. 96 Verder zijn Ser en Thr polaire residuen die liever een interactie aangaan met het oplosmiddel dan met de gefuseerde eiwitten. 4 Polypeptiden die rijk zijn aan Gly, Ser en Thr bieden dus speciale voordelen: (i) rotatievrijheid van de ruggengraat van het polypeptide, zodat de aangrenzende domeinen vrij kunnen bewegen ten opzichte van elkaar, 44 (ii) verbeterde oplosbaarheid, 26 en ( iii) resistentie tegen proteolyse. 97 De tweevlakshoeken van de ruggengraat van residuen in linkers zijn zeer variabel, dat wil zeggen dat ze in Ramachandran-plots een aanzienlijk groter gebied bezetten dan de -helices of β-sheets.

Onze literatuuranalyses laten zien dat verschillende samenstellingen van linkers zijn gebruikt voor structurele studies (tabel I). In het geval van MHC Klasse II-peptidecomplex werden twee verschillende soorten linkers (met en zonder trombinesplitsingsplaats) gebruikt, terwijl in het geval van MHC-peptide-TCR ternair complex peptidekoppeling werd bereikt via twee verschillende methoden (peptide gekoppeld aan ofwel MHC- ofwel TCR-molecuul) (Tabel I). In andere structurele studies werden linkers met een bijna gelijke samenstelling van Gly en Ser gebruikt, zoals voor het fosfoproteïne-nucleocapside-eiwitcomplex, het ribosomen-SRP-FtsY-complex en het Fat-domein van focale adhesiekinasecomplexen. Ter vergelijking: voor de gekoppelde complexen van het LIM-domein, PXR-LBD, peptide gebonden aan TCR-MHC, g3p-TolA, HIV-1 PR en TTR covalent dimeren, werden verschillende lengtes van Gly- en Ser-rijke linkers gebruikt, waarvoor meer dan 60% van de linker-aminozuren Gly waren. Voor structurele studies van CaM-CBD van calcineurinecomplex, integreerde de studie een 5-aminozurenlinker met alle Gly-residuen. Daarom zou een geschikte linker een combinatie van aminozuren met kleine zijketens kunnen omvatten, zoals Gly en Ser, met een algeheel hoger percentage Gly.

Naast het ontwerpen van linkers (lengte en aminozuursamenstelling), is het optimaliseren van de omstandigheden om de interacties tussen de gekoppelde partners te behouden belangrijk. In het algemeen veranderen de flexibele Gly-rijke linkers de eigenschappen van de eiwitten waaraan ze zijn gebonden niet, en laten ze toe dat de natuurlijke interactie behouden blijft. Geoptimaliseerde voorwaarden voor de interactie tussen de gekoppelde partners moeten dezelfde zijn als die zonder de linker. Dit moet worden bevestigd met behulp van niet-gekoppelde interactiepartners in verschillende in vitro methoden, zoals immunoprecipitatie of ITC/SPR-experimenten.


D7. Redox-chemie en eiwitvouwing - biologie

De productie van recombinante, disulfide-bevattende eiwitten vereist vaak oxidatieve vouwing in vitro. Hier laten we zien dat diseleniden, zoals selenoglutathion, oxidatieve eiwitvouwing door O2 katalyseren. Aanzienlijk lagere concentraties van een redoxbuffer bestaande uit selenoglutathion en de thiolvorm van glutathion kunnen bijgevolg worden gebruikt om dezelfde snelheid en opbrengst van vouwing te bereiken als een standaard glutathion-redoxbuffer. Verder breidt de lage pKa van selenolen het pH-bereik uit voor vouwing door selenoglutathion tot zure omstandigheden, waar glutathion inactief is. Het benutten van de katalytische kracht van diseleniden kan dus de weg vrijmaken voor een efficiëntere oxidatieve eiwitvouwing.

Virusachtige deeltjes als kwantitatieve sondes van membraaneiwitinteracties
  • Sharon Willis,
  • Candice Davidoff,
  • Justin Schilling,
  • Antony Wanless,
  • Benjamin J. Doranz, en
  • Joseph Rucker*

We demonstreren dat virusachtige deeltjes die conformationeel complexe membraaneiwitten ("lipodeeltjes") dragen, kunnen worden gebruikt als oplosbare sondes van membraaneiwitinteracties. Om het nut van deze benadering aan te tonen, gebruiken we lipodeeltjes om snel de relatieve kinetiek van membraaneiwitinteracties te differentiëren met behulp van optische biosensortechnologie. De techniek wordt toegepast op diverse membraaneiwitten, waaronder G-eiwit-gekoppelde receptoren, en gebruikt om de relatieve kinetiek van bijna alle commercieel beschikbare monoklonale antilichamen tegen chemokinereceptor CCR5 te rangschikken. Deze deeltjes dienen als veelzijdige sondes voor het screenen van ruwe en gezuiverde antilichaampreparaten op receptorspecificiteit, epitoopreactiviteit en relatieve bindingskinetiek.

Huidige onderwerpen
Het glycosylfosfatidylinositolanker: een complexe membraanverankerende structuur voor eiwitten

Gepositioneerd aan de C-terminus van veel eukaryote eiwitten, is het glycosylfosfatidylinositol (GPI) anker een posttranslationele modificatie die het gemodificeerde eiwit verankert in de buitenste bijsluiter van het celmembraan. Het GPI-anker is een complexe structuur die een fosfo-ethanolamine-linker, glycaankern en fosfolipide-staart omvat. GPI-verankerde eiwitten zijn structureel en functioneel divers en spelen een vitale rol in tal van biologische processen. Hoewel verschillende GPI-verankerde eiwitten zijn gekarakteriseerd, moeten de biologische functies van het GPI-anker nog worden opgehelderd op moleculair niveau. Deze review bespreekt de structurele diversiteit van het GPI-anker en zijn vermeende cellulaire functies, waaronder betrokkenheid bij verdeling van lipidenvlotten, signaaltransductie, targeting op het apicale membraan en pathogenese van prionziekten. We benadrukken specifiek studies waarin chemisch gesynthetiseerde GPI-ankers en analogen zijn gebruikt om de rollen van deze unieke posttranslationele modificatie te bestuderen.

Structurele en functionele diversiteit tussen leden van de menselijke HSPB-, HSPH-, HSPA- en DNAJ-chaperonfamilies
  • Michel J. Vos,
  • Jurre Hageman,
  • Serena Carra en
  • Harm H. Kampinga*

Heat shock-eiwitten (HSP's) werden oorspronkelijk geïdentificeerd als op stress reagerende eiwitten die nodig zijn om proteotoxische stress aan te pakken. Behalve dat ze stressbeschermend zijn en mogelijke doelwitten voor het vertragen van de progressie van eiwitvouwingsziekten, is ook aangetoond dat mutaties in chaperonnes ziekten veroorzaken (chaperonopathieën). Het werkingsmechanisme van de "klassieke", stress-induceerbare HSP's die dienen als moleculaire chaperonnes die de onomkeerbare aggregatie van door stress ontvouwen of ziektegerelateerde verkeerd gevouwen eiwitten voorkomen, begint naar voren te komen. Het menselijke genoom codeert echter voor verschillende leden voor elk van de verschillende HSP-families die niet stressgerelateerd zijn maar geconserveerde domeinen bevatten. Hier hebben we de bestaande literatuur over de verschillende leden van de menselijke HSPB (HSP27), HSPH (HSP110), HSPA (HSP70) en DNAJ (HSP40) families beoordeeld. Afgezien van structurele en functionele homologieën, zijn er verschillende verschillen tussen leden en families te vinden die niet alleen wijzen op verschillen in klantspecificiteit, maar ook een verschillende klantbehandeling en -verwerking lijken te dienen. Hoe substraatspecificiteit en klantverwerking wordt bepaald, is nog lang niet duidelijk.

Versnelde publicaties
Lichtactivering van het LOV-eiwit Vivid genereert een snel wisselend dimeer

De schimmelfotoreceptor Vivid (VVD) speelt een belangrijke rol bij de aanpassing van blauwlichtreacties in Neurospora crassa. VVD, een FAD-bindend LOV-eiwit (licht, zuurstof, voltage), koppelt door licht geïnduceerde cysteïnyladductvorming aan de flavinering aan conformationele veranderingen in de N-terminale kap (Ncap) van het VVD PAS-domein. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC), evenwichts-ultracentrifugatie en statische en dynamische lichtverstrooiing tonen aan dat deze conformationele veranderingen een snel wisselend VVD-dimeer genereren, met een uitgebreide hydrodynamische straal. Een N-terminale β-turn met drie resten die twee verschillende conformaties aanneemt in een kristalstructuur van een VVD C71V-variant is essentieel voor dimerisatie in lichte toestand. Residusubstituties op een kritisch scharnier tussen de Ncap- en PAS-kern kunnen dimerisatie remmen of versterken, terwijl een Tyr naar Trp-substitutie op de Ncap-PAS-interface het dimeer in de lichttoestand stabiliseert. Verknoping door middel van gemanipuleerde disulfiden geeft aan dat het dimeer in de lichte toestand aanzienlijk verschilt van het dimeer in de donkere toestand dat wordt aangetroffen in VVD-kristalstructuren. Deze resultaten bevestigen de rol van Ncap conformationele veranderingen bij het bepalen van de fotische respons van N. crassa en geven aan dat LOV−LOV homo- of heterodimerisatie een mechanisme kan zijn voor het reguleren van door licht geactiveerde genexpressie.

Kwantitatieve en realtime detectie van afscheiding van chemische boodschappers van individuele bloedplaatjes

In dit onderzoek werden koolstofvezel-micro-elektrochemische methoden gebruikt om individuele exocytotische gebeurtenissen van secretie van serotonine en histamine uit gewassen konijnenbloedplaatjes te meten. De kwantitatieve afgifte van serotonine werd kwantitatief gekarakteriseerd met een δ-granule serotonineconcentratie van 0,6 M en een secretietijdsverloop van 7 ms. Bovendien beïnvloedt extracellulaire osmolariteit de kwantitatieve grootte, waardoor de kwantitatieve grootte toeneemt onder hypotone omstandigheden, vermoedelijk als gevolg van de instroom van cytosolische serotonine in het halo-gebied van de δ-korrels.

Lidwoord
Diverse regulering van SNF2h-chromatine-remodellering door niet-katalytische subeenheden
  • Xi Hij,
  • Hua Ying-fan,
  • Joseph D. Garlick, en
  • Robert E. Kingston*

Op SNF2h gebaseerde ATP-afhankelijke chromatine-remodelleringscomplexen verschillen in samenstelling, nucleaire lokalisatie en biologische functie. Dergelijke verschillen hebben geleid tot de hypothese dat SNF2h-complexen mechanistisch verschillen. Een voorstel is dat de complexen verschillende functionele interacties hebben met het naakte DNA naast het nucleosoom. We hebben een reeks sjablonen met gedefinieerde nucleosomale positie en verschillende hoeveelheden en plaatsing van aangrenzend DNA gebruikt om de relatieve activiteiten van SNF2h- en SNF2h-complexen te vergelijken. De complexen hACF, CHRAC, WICH en RSF vertoonden allemaal verschillen in functionele interacties met deze sjablonen, die we toeschrijven aan de verschillen in de niet-katalytische subeenheid. We suggereren dat het vermogen om aangrenzend DNA te detecteren een algemene eigenschap is van de bindingspartners van SNF2h en dat elke partner een duidelijke regulatie biedt die bijdraagt ​​aan een verschillende cellulaire functie.

Katalytische diversiteit van uitgebreide Hammerhead-ribozymen

Chimera's van de goed gekarakteriseerde minimale hamerhaai 16 en negen uitgebreide hamerhaaien afgeleid van natuurlijke viroïden en satelliet-RNA's werden geconstrueerd met als doel te beoordelen of hun zeer verschillende perifere tertiaire interacties hun katalytische eigenschappen moduleren. Voor elke chimera werden drie verschillende testen gebruikt om de splitsingssnelheid en de fractie van de hamerkop over de volledige lengte bij evenwicht te bepalen en daardoor de snelheidsconstanten voor elementaire splitsing (k2) en ligatie (k−2) af te leiden. De negen chimeren waren allemaal actiever dan minimale hamerhaaien en vertoonden een zeer breed scala aan katalytische eigenschappen, met waarden van k2 die 750-voudig varieerden en k−2 met een factor 100. Ten minste twee van de hamerhaaien vertoonden een veranderde afhankelijkheid van kobs van magnesiumconcentratie. Aangezien er veel minder katalytische diversiteit wordt waargenomen bij minimale hamerhaaien die de tertiaire interacties missen, is een mogelijke rol voor de verschillende tertiaire interactie het moduleren van de hamerkopsplitsingseigenschappen in viroïden. Verschillende hamerkopsplitsings- en ligatiesnelheden kunnen bijvoorbeeld de steady-state-concentraties van lineaire, circulaire en polymere genomen in geïnfecteerde cellen beïnvloeden.

Lokale RNA-conformiteitsdynamiek onthuld door toegankelijkheid van 2-aminopurine-oplosmiddel
  • Jeff D Ballin,
  • James P. Prevas,
  • Shashank Bharill,
  • Ignacy Gryczynski,
  • Zygmunt Gryczynski en
  • Gerald M. Wilson*

Het doven van acrylamide wordt veel gebruikt om de blootstelling aan oplosmiddelen van fluorescerende sondes in vitro te controleren. Hier hebben we het nut van deze techniek getest om lokale secundaire RNA-structuren te onderscheiden met behulp van de fluorescerende adenine-analoog 2-aminopurine (2-AP). Onder natieve omstandigheden werden de oplosmiddeltoegankelijkheid van de meeste 2-AP-gelabelde RNA-substraten slecht opgelost door klassieke modellen met één populatie. In plaats daarvan was een twee-staten quencher-toegankelijkheidsalgoritme vereist om acrylamide-afhankelijke veranderingen in 2-AP-fluorescentie in gestructureerd RNA te modelleren contexten. Door 2-AP-quenchingsparameters tussen gestructureerde en ongestructureerde RNA-substraten te vergelijken, konden de effecten van de lokale RNA-structuur op de blootstelling aan 2-AP-oplosmiddel worden onderscheiden van de effecten van de naaste buren of omgevingsinvloeden op de intrinsieke 2-AP-fotofysica. Met behulp van deze strategie bleek de fractionele toegankelijkheid van 2-AP voor acrylamide (fa) zeer gevoelig te zijn voor de lokale RNA-structuur. Base-gepaarde 2-AP vertoonde een relatief slechte toegankelijkheid, consistent met uitgebreide afscherming door aangrenzende basen. 2-AP in een uitstulping met een enkele base was uniform toegankelijk voor oplosmiddel, terwijl de fractionele toegankelijkheid van 2-AP in een hexanucleotide-lus niet te onderscheiden was van die van een ongestructureerd RNA. Deze onderzoeken leverden echter ook bewijs dat de fa-parameter de lokale conformationele dynamiek in base-gepaard RNA weerspiegelt. Verbeterde basenpaardynamiek bij verhoogde temperaturen ging gepaard met verhoogde fa-waarden, terwijl het beperken van de lokale RNA-ademhaling door het toevoegen van een C-G-basepaarklem of het positioneren van 2-AP in verlengde RNA-duplexen deze parameter aanzienlijk verminderde. Samen laten deze onderzoeken zien dat 2-AP-quenching-onderzoeken lokale structurele en dynamische kenmerken van RNA kunnen onthullen die verder gaan dan die kunnen worden gemeten met conventionele spectroscopische benaderingen.

Acetylering van H4 onderdrukt de repressieve effecten van de N-termini van histonen H3/H4 en vergemakkelijkt de vorming van positief opgerold DNA

We hebben de rol bestudeerd van de N-termini van histonen H3/H4 in de regulatie van de conformationele veranderingen die optreden in H3/H4 tijdens hun afzetting op DNA door NAP1 (nucleosoomassemblage-eiwit 1). Verwijdering van de N-termini verhoogde de rechtshandige conformatie van H3/H4 aanzienlijk, zoals getest door de verhoogde niveaus van positieve spiralen die op DNA werden gevormd. De osmolyten, TMAO, betaïne, sarcosine, alanine, glycine en proline in verschillende mate, vergemakkelijkten de vorming van positieve spiralen. Het denatureringsmiddel, ureum (0,6 M), blokkeerde de osmolyteffecten, waardoor een voorkeur voor H3/H4 negatieve spoelen vormde (de linkshandige conformatie). Geacetyleerd H3/H4 vormde ook hoge niveaus van positieve spoelen, en er wordt voorgesteld dat zowel de osmolyten als de acetylering de vorming van een a-helix in de N-termini bevorderen. Deze structurele verandering kan uiteindelijk een uniek kenmerk van transcriptie via nucleosomen verklaren, d.w.z. dat H2A/H2B de neiging heeft mobieler te zijn dan H3/H4. Door combinaties van H3 en H4 te gebruiken die ofwel geacetyleerd waren of de N-termini verwijderd waren, werd ook vastgesteld dat de N-terminus van H4 primair verantwoordelijk is voor het onderdrukken van de vorming van positieve spiralen. Aanvullende gradiëntanalyses geven aan dat NAP1 een evenwicht tot stand brengt met de H3/H4−DNA-complexen. Dit evenwicht vergemakkelijkt een histonverzadiging van het DNA, een unieke toestand die de rechtshandige conformatie bevordert. NAP1 volhardt in de binding van de complexen door interactie met de N-terminus van H3, wat een mechanisme kan zijn voor daaropvolgende hermodellering van het nucleosoom tijdens transcriptie en replicatie.

De NMR-structuur en dynamiek van de carboxypeptidase-remmer met twee domeinen onthullen flexibiliteit in zijn vrije vorm en stijfheid bij binding aan humaan carboxypeptidase B
  • David Pantoja-Uceda,
  • Joan L. Arolas,
  • Pascal Garcia,
  • Eva López-Hernández,
  • Daniel Padro,
  • Francesc X. Aviles* , en
  • Francisco J. Blanco*

De structuur van de tekencarboxypeptidase-remmer (TCI) en zijn ruggengraatdynamiek, vrij en in complex met humaan carboxypeptidase B, zijn bepaald met NMR-spectroscopie. Hoewel vrij TCI dezelfde algemene vouw heeft als die waargenomen in de kristalstructuren van zijn complexen met metallocarboxypeptidase typen A en B, zijn er structurele verschillen bij de linker tussen de twee domeinen. De linkerresiduen hebben een grotere flexibiliteit dan de bolvormige domeinen en de C-terminale residuen zijn zeer flexibel in vrij TCI. Na vorming van een complex met carboxypeptidase B, wordt TCI stijver, vooral op het niveau van de linker en op de C-terminus, die in de actieve plaatsgroef van het carboxypeptidase wordt ingebracht. Oplosmiddelwisselkoersen van de ruggengraatamideprotonen tonen ook een sterke vermindering van de lokale TCI-dynamiek en een stabilisatie van de structuur ervan bij complexvorming. De bevindingen zijn consistent met een herkenningsmechanisme dat voornamelijk het C-terminale domein omvat, dat zijn conformatie en die van de linker aanpast, waardoor complexe stabilisatie wordt vergemakkelijkt door verdere interacties tussen het N-terminale domein en een exosite van het carboxypeptidase. Dit aanpassingsvermogen stelt TCI in staat om zijn globale conformatie af te stemmen voor een juiste interactie met verschillende soorten carboxypeptidasen door een mechanisme van geïnduceerde pasvorm. Onze resultaten bieden nieuwe informatie over de structuur-functierelatie en stabiliteit van een molecuul met potentiële biomedische toepassingen in trombolytische therapie. Bovendien maakt de plasticiteit van TCI het een ideale basis voor het ontwikkelen van sterkere en/of meer specifieke remmers die gericht zijn op het moduleren van de activiteit van metallocarboxypeptidasen.

Microscopische omkeerbaarheid van eiwitvouwing in moleculaire dynamieksimulaties van het engrailed homeodomein

Het principe van microscopische omkeerbaarheid stelt dat bij evenwicht het aantal moleculen dat een toestand binnenkomt via een bepaald pad gelijk moet zijn aan het aantal moleculen dat de toestand verlaat via hetzelfde pad onder identieke omstandigheden of, in structurele termen, dat de conformaties langs de twee paden hetzelfde zijn. Er is enig indirect bewijs dat aangeeft dat eiwitvouwing zo'n proces is, maar er zijn weinig overtuigende bevindingen. In deze studie hebben we moleculaire dynamica-simulaties uitgevoerd van een ultrasnel ontvouwend en vouwend eiwit bij zijn smelttemperatuur om, atoom-voor-atoom, de paden te observeren die het eiwit volgde terwijl het zich ontvouwde en vouwde binnen een continu traject. In een totaal van 0,67 µs simulatie in water vonden we zes voorbijgaande denatureringsgebeurtenissen nabij de smelttemperatuur (323 en 330 K) en een extra hervouwingsgebeurtenis na een eerder geïdentificeerde ontvouwingsgebeurtenis bij een hoge temperatuur (373 K). In elk geval werden ontvouwende en hervouwende overgangstoestandensembles geïdentificeerd, en deze kwamen goed overeen met het experiment op basis van een vergelijking van S- en Φ-waarden. Op basis van verschillende structurele eigenschappen kwamen deze 13 ensembles van overgangstoestanden zeer goed overeen met elkaar en met vier eerder geïdentificeerde overgangstoestanden uit simulaties van denaturering bij hoge temperatuur. Dus niet alleen waren de ontvouwende en hervouwende overgangstoestanden onderdeel van hetzelfde ensemble, maar in vijf van de zeven gevallen was het pad dat het eiwit nam toen het zich ontvouwde bijna identiek aan het daaropvolgende hervouwingspad. Deze gebeurtenissen leveren overtuigend bewijs dat eiwitvouwing een microscopisch omkeerbaar proces is. In de andere twee gevallen leken de vouwende en ontvouwende overgangstoestanden opmerkelijk veel op elkaar, maar de paden wijken af.

Cholesterol bevindt zich in het midden van een meervoudig onverzadigd lipidemembraan

Eerder rapporteerden we neutronendiffractiestudies naar de diepte van cholesterol in fosfatidylcholine (PC) dubbellagen met variërende hoeveelheden acylketenonverzadiging [Harroun, T.A., et al. (2006) Biochemie 45, 1227-1233]. Het zwaartepunt van de 2,2,3,4,4,6-D6 gedeutereerde plaatsen op het sterollabel bleek 16 Å van het midden van de dubbellaag in 1-palmitoyl-2-oleoylfosfatidylcholine (16:0- 18:1PC), 1,2-dioleoylfosfatidylcholine (18:1-18:1PC) en 1-stearoyl-2-arachidonylfosfatidylcholine (18:0-20:4PC). Deze locatie plaatst de hydroxylgroep van cholesterol dicht bij het membraanoppervlak, wat een indicatie is van het molecuul in zijn algemeen begrepen "rechtopstaande" oriëntatie. Voor dipoly-onverzadigde 20:4-20:4PC-membranen werd het label, dus de hydroxylgroep, gesekwestreerd gevonden in het midden van de dubbellaag. We schreven de verandering in locatie toe aan het hoge niveau van wanorde van meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA) die onverenigbaar is met de nabijheid van de stijve steroïde-eenheid in zijn gebruikelijke rechtopstaande oriëntatie. Uit die studie was de onopgeloste vraag of het molecuul omgekeerd of plat lag ten opzichte van het membraanvlak, in het midden van de dubbellaag. We hebben die resultaten opgevolgd met aanvullende neutronenexperimenten waarbij gebruik werd gemaakt van [25,26,26,26,27,27-D7]cholesterol, een gedeutereerd analoog gelabeld in de staart. Deze diffractiemetingen tonen ondubbelzinnig aan dat cholesterol plat ligt in het midden van 20:4-20:4PC dubbellagen.

Karakterisering van een streptokokken-cholesterolafhankelijk cytolysine met een Lewis y- en b-specifiek lectinedomein
  • Stephen Farrand,
  • Eileen Hotze,
  • Paul Friese,
  • Susan K. Hollingshead,
  • David F. Smith,
  • Richard D. Cummings,
  • George L. Dale, en
  • Rodney K. Tweeten*

De cholesterolafhankelijke cytolysines (CDC's) zijn een grote familie van porievormende toxines die vaak duidelijke structurele veranderingen vertonen die hun porievormende activiteit wijzigen. Een oplosbare bloedplaatjesaggregatiefactor van Streptococcus mitis (Sm-hPAF) werd gekarakteriseerd en bleek een functionele CDC te zijn met een amino-terminaal fucose-bindend lectinedomein. Sm-hPAF, of lectinolysine (LLY), zoals hierin hernoemd, is het nauwst verwant aan CDC's van Streptococcus intermedius (ILY) en Streptococcus pneumoniae (pneumolysine of PLY). Het LLY-gen werd geïdentificeerd in stammen van S. mitis, S. pneumoniae en Streptococcus pseudopneumoniae. LLY induceert porie-afhankelijke veranderingen in de lichtverstrooiende eigenschappen van de bloedplaatjes die lijken op die veroorzaakt door bloedplaatjesaggregatie, maar induceert geen bloedplaatjesaggregatie. LLY-monomeren vormen het typische grote homooligomere membraanporiecomplex dat wordt waargenomen voor de CDC's. De porievormende activiteit van LLY op bloedplaatjes wordt gemoduleerd door het amino-terminale lectinedomein, een structuur die niet aanwezig is in andere CDC's. Glycan microarray analyse toonde aan dat het lectine domein specifiek is voor gedifucosyleerde glycanen binnen Lewis b (Leb) en Lewis y (Ley) antigenen. De glycan-bindingsplaats is afgesloten in het oplosbare monomeer van LLY, maar wordt blijkbaar blootgesteld na celbinding, aangezien het de LLY-poriënvormende activiteit significant verhoogt op een glycan-afhankelijke manier. Daarom vertegenwoordigt LLY een nieuwe klasse van CDC waarvan het porievormende mechanisme wordt gemoduleerd door een glycaanbindend domein.

Monooxygenase-activiteit van Octopus vulgaris Hemocyanine
  • Kenji Suzuki,
  • Chizu Shimokawa,
  • Chiyuki Morioka en
  • Shinobu Itoh*

Octopus vulgaris hemocyanine (Ov-Hc) en een van zijn minimale functionele eenheden (Ov-g) zijn gezuiverd en hun spectroscopische kenmerken en mono-oxygenase (fenolase) activiteit zijn in detail onderzocht. De oxyvormen van zowel Ov-Hc als Ov-g zijn stabiel in 0,5 M boraatbuffer (pH 9,0), zelfs in aanwezigheid van een hoge concentratie ureum bij 25 °C ∼90 en ∼75% van de (μ-η2: η2-peroxo)dicopper(II)-soorten van respectievelijk Ov-Hc en Ov-g bleven onveranderd na argon (Ar) begassing van de monsteroplossingen gedurende 1 uur. De katalytische activiteit van Ov-g in de oxygenatiereactie (multiturnover-reactie) van 4-methylfenol (p-cresol) tot 4-methyl-1,2-dihydroxybenzeen (4-methylcatechol) was hoger dan die van Ov-Hc, en zijn katalytische activiteit werd verder versneld door de toevoeging van ureum. Kinetische deuterium-isotoop-effectanalyse en Hammett-analyse met behulp van een reeks fenolderivaten onder anaërobe omstandigheden (single-turnover-reactie) hebben aangetoond dat de monooxygeneringsreactie van fenolen tot catecholen door de peroxo-soort oxyhemocyanine verloopt via een elektrofiel aromatisch substitutiemechanisme zoals in het geval van tyrosinase. Het effect van ureum op de redoxfuncties van oxyhemocyanine wordt besproken op basis van de spectroscopische analyse en reactiviteitsstudies.

Thermodynamische analyse van door denaturatiemiddel geïnduceerde ontvouwing van HodC69S-eiwit ondersteunt een driestatenmechanisme
  • Kristian Böhm,
  • Jessica Guddorf,
  • Alexander Albers,
  • Tadashi Kamiyama,
  • Susanne Fetzner en
  • H.-J. Hinz*

Thermodynamische stabiliteitsparameters en het evenwichtsontvouwingsmechanisme van His6HodC69S, een mutant van 1H-3-hydroxy-4-oxoquinaldine 2,4-dioxygenase (Hod) met een Cys naar Ser-uitwisseling op positie 69 en een N-terminale hexahistidine-tag (His6HodC69S) zijn afgeleid van isotherme ontvouwingsstudies met guanidinehydrochloride (GdnHCl) of ureum als denaturatiemiddelen. De conformationele veranderingen werden gevolgd door het volgen van veranderingen in circulair dichroïsme (CD), fluorescentie en dynamische lichtverstrooiing (DLS), en de resulterende overgangscurven werden geanalyseerd op basis van een sequentieel driestatenmodel N = I = D. De structurele veranderingen zijn gecorreleerd aan katalytische activiteit en de bijdrage aan de stabiliteit van de disulfidebinding tussen residuen C37 en C184 in het natieve eiwit is vastgesteld. Een prominent resultaat van de huidige studie is de bevinding dat, onafhankelijk van de methode die wordt gebruikt voor het denatureren van het eiwit, het ontvouwingsmechanisme altijd drie toestanden omvat die kunnen worden gekarakteriseerd door, binnen foutgrenzen, identieke sets van thermodynamische parameters. Schijnbare afwijkingen van ontvouwing in drie toestanden kunnen worden gerationaliseerd door het onvermogen van een spectroscopische sonde om duidelijk onderscheid te maken tussen inheemse, intermediaire en ongevouwen ensembles. Dit was het geval voor de CD-gecontroleerde ontvouwingscurve van ureum.

Identificatie van een minimale functionele linker in menselijke topoisomerase I door domeinuitwisseling met Cre-recombinase
  • Rikke Van Frøhlich ,
  • Sissel Juul,
  • Maria Bjerre Nielsen,
  • Maria Vinther,
  • Christoffel Veigaard,
  • Marianne Smedegaard Hede, en
  • Félicie Faucon Andersen*

Cellulaire vormen van type IB-topoisomerasen onderscheiden zich van hun virale tegenhangers en de tyrosinerecombinasen waarmee ze nauw verwant zijn doordat ze vrij uitgebreide N-terminale en linkerdomeinen hebben. De functies en noodzaak van deze domeinen zijn nog niet volledig ontrafeld.In deze studie vervangen we 86 aminozuren, waaronder het linkerdomein van het cellulaire type IB topoisomerase, humaan topoisomerase I, door vier, zes of acht aminozuren van het overeenkomstige korte lusgebied in Cre-recombinase. In vitro karakterisering van de resulterende chimeren, aangeduid als Cropos, onthult dat zes aminozuren van de Cre linker-lus de minimale lengte vormen van een functionele linker in humaan topoisomerase I.

Superieure verwijdering van hydantoïnelaesies ten opzichte van andere geoxideerde basen door het humaan DNA-glycosylase hNEIL1
  • Nirmala Krishnamurthy,
  • Xiaobei Zhao,
  • Cynthia J. Burrows, en
  • Sheila S. David*

Het DNA-glycosylase hNEIL1 initieert de base-excisiereparatie (BER) van een diverse reeks laesies, waaronder purines met open ring en verzadigde pyrimidinen. Hiervan hebben de hydantoïne-laesies, guanidinohydantoïne (Gh) en de twee diastereomeren van spiroiminodihydantoïne (Sp1 en Sp2), veel recente aandacht gekregen vanwege hun ongebruikelijke structuren, hoog mutageen potentieel en detectie in cellen. Om inzicht te krijgen in de rol van reparatie, werd de excisie-efficiëntie door hNEIL1 van deze hydantoïne-laesies ten opzichte van andere bekende substraten bepaald. Het meest opvallende is dat uit kwantitatief onderzoek van de substraatspecificiteit met hNEIL1 bleek dat de hydantoïnelaesies veel efficiënter (>100-voudig sneller) worden weggesneden dan de gerapporteerde standaardsubstraten thymineglycol (Tg) en 5-hydroxycytosine (5-OHC). Belangrijk is dat de glycosylase- en β,δ-lyase-reacties nauw aan elkaar zijn gekoppeld, zodat de snelheid van de lyase-activiteit de waargenomen substraatspecificiteit niet beïnvloedt. De activiteit van hNEIL1 wordt ook beïnvloed door de basenpaarpartner van de laesie, waarbij verwijdering van zowel Gh als Sp efficiënter is wanneer deze wordt gecombineerd met T, G of C dan wanneer deze wordt gecombineerd met A. De meest efficiënte verwijdering wordt met name waargenomen met de Gh of Sp gepaard in de onwaarschijnlijke fysiologische context met T inderdaad, dit kan een gevolg zijn van de onstabiele aard van basenparen met T. De gemakkelijke verwijdering via BER in promutagene basenparen die redelijkerwijs worden gevormd na replicatie (zoals Gh· G) kan een factor zijn die het mutagene profiel van deze laesies moduleert. Bovendien snijdt hNEIL1 Sp1 sneller uit dan Sp2, wat aangeeft dat het enzym onderscheid kan maken tussen de twee diastereomeren. Dit is de eerste keer dat is aangetoond dat een BER-glycosylase in staat is om bij voorkeur één diastereomeer van Sp. Dit kan een gevolg zijn van de architectuur van de actieve plaats van hNEIL1 en de structurele uniciteit van de Sp-laesie. Deze resultaten geven aan dat de hydantoïne-laesies de beste substraten zijn die tot nu toe zijn geïdentificeerd voor hNEIL1 en suggereren dat reparatie van deze laesies een kritische functie van het hNEIL1-enzym in vivo kan zijn.

Een overbruggingswater verankert het gebonden 5-(3-aminopropyl)-2′-deoxyuridine-amine in de DNA-hoofdgroef in de buurt van het N+2 C·G-basenpaar: implicaties voor de vorming van interstrand 5'-GNC-3'-kruis- Links door Stikstof Mosterd ,
  • Feng Wang,
  • Feng Li,
  • Manjori Ganguly,
  • Luis A. Marky,
  • Barry Goud,
  • Martin Egli en
  • Michael P. Stone*

Plaatsspecifieke insertie van 5-(3-aminopropyl)-2′-deoxyuridine (Z3dU) en 7-deaza-dG in de Dickerson-Drew dodecamers 5′-d(C1G2C3G4A5A6T7T8C9Z10C11G12)-3′·5′-d(C13G14C15G16A17C24Z18T) -3′ (genaamd DDDZ10) en 5′-d(C1G2C3G4A5A6T7X8C9Z10C11G12)-3′·5′-d(C13G14C15G16A17A18T19X20C21Z22C23G24)-3′ (genaamd DDD2+Z10) (X = Z3dU-d) die ten grondslag liggen aan de vorming van N+2 DNA-crosslinks tussen de strengen door stikstofmosterd, bijv. melfalan en mechlorethamine. Analyse van de DDD2+Z10-duplex laat zien dat de gebonden kationen op basenparen A5·X20 en X8·A17 zich uitstrekken binnen de hoofdgroef in de 3′-richting, naar geconserveerde Mg2+-bindingsplaatsen die grenzen aan N+2 basenparen C3·Z22 en Z10·C15. Overbruggingswateren die zich tussen de gebonden aminen en ofwel Z10 of Z22 O6 bevinden, stabiliseren de gebonden kationen en maken interacties met de N + 2 basenparen mogelijk zonder DNA-buiging. Opname van 7-deaza-dG in de DDD2+Z10-duplex verzwakt maar elimineert elektrostatische interacties tussen gebonden aminen en Z10 O6 en Z22 O6 niet. De resultaten suggereren een mechanisme waarmee gebonden N7-dG aziridiniumionen, de actieve soort die betrokken zijn bij de vorming van 5'-GNC-3'-verknopingen tussen strengen door stikstofmosterd, de elektrostatica van de hoofdgroef modificeren en de aziridiniumionen positioneren in de buurt van de hoofdgroefrand van het N+2 C·G-basenpaar, waardoor verknoping tussen strengen wordt vergemakkelijkt.

Oplossing Röntgenverstrooiing onthult een nieuwe structuur van calmoduline gecomplexeerd met een bindend domeinpeptide van het HIV-1-matrixproteïne p17
  • Yoshinobu Izumi* ,
  • Hiroki Watanabe,
  • Noriko Watanabe,
  • Aki Aoyama,
  • Yuji Jinbo, en
  • Nobuhiro Hayashi

De oplossingsstructuren van complexen tussen met calcium verzadigd calmoduline (Ca2+/CaM) en een CaM-bindend domein van het HIV-1-matrixeiwit p17 zijn bepaald door röntgenverstrooiing onder een kleine hoek met gebruik van synchrotronstraling als een intense en stabiele Röntgenbron. We gebruikten drie synthetische peptiden van residuen 11−28, 26−47 en 11−47 van p17 om de diversiteit van CaM-bindende conformatie aan te tonen. Ca2+/CaM gecomplexeerd met resten 11-28 van p17 neemt een halterachtige structuur aan bij een molaire verhouding van 1:2, wat suggereert dat de twee peptiden respectievelijk aan elke lob van CaM binden. Ca2+/CaM gecomplexeerd met resten 26-47 van p17 in een molaire verhouding van 1:1 neemt een bolvormige structuur aan die vergelijkbaar is met de NMR-structuur van Ca2+/CaM gebonden aan M13, die een compacte bolvormige structuur aannam. In tegenstelling tot deze complexen bindt Ca2+/CaM direct aan beide CaM-bindingsplaatsen van residuen 11−47 van p17 in een molaire verhouding van 1:1, wat een nieuwe structuur induceert die verschilt van bekende structuren die eerder zijn gerapporteerd tussen Ca2+/CaM en peptide . Een tertiair structureel model van de nieuwe structuur werd geconstrueerd met behulp van de biopolymeermodule van Insight II 2000 op basis van de verstrooiingsgegevens. De twee domeinen van CaM blijven in wezen onveranderd na complexering. De scharnierbewegingen vinden echter plaats in een zeer flexibele linker van CaM, waarin de elektrostatische residuen 74Arg, 78Asp en 82Glu een interactie aangaan met N-terminale elektrostatische residuen van het peptide (residuen 12Glu, 15Arg en 18Lys). De zure resten in het N-terminale domein van CaM interageren met basische resten in een centraal deel van het peptide, waardoor het centrale deel de conformaties kan veranderen, terwijl een zure rest in het C-terminale domein een interactie aangaat met twee basische resten in de twee spiraalvormige plaatsen van het peptide. De algehele structuur van het complex neemt een uitgebreide structuur aan met een draaistraal van 20,5 en de interdomeinafstand van 34,2 . Het complex wordt dus voornamelijk gestabiliseerd door elektrostatische interacties. De hydrofobe pleisters van Ca2+/CaM zijn niet verantwoordelijk voor de binding met de hydrofobe resten in het peptide, wat suggereert dat CaM een rol speelt bij het afzonderen van de myristinezuurgroep van p17.

De trans-Golgi-eiwitten SCLIP en SCG10 werken samen met chromogranine A om neuro-endocriene secretie te reguleren
  • Nitish R. Mahapatra ,
  • Laurent Taupenot* ,
  • Maite Courel,
  • Sushil K. Mahata* , en
  • Daniel T. O'Connor*

Uitscheiding van eiwitten en peptiden uit eukaryote cellen vindt plaats via zowel constitutieve als gereguleerde routes. Gereguleerde secretie kan een samenspel zijn van eiwitten die momenteel onbekend zijn. Recente studies suggereren een belangrijke rol van chromogranine A (CHGA) in de gereguleerde secretoire route in neuro-endocriene cellen, maar het mechanisme waardoor CHGA de gereguleerde route binnengaat, of zelfs de vorming van de route veroorzaakt, blijft onduidelijk. In deze studie hebben we een transcriptoom / proteoom-brede benadering gebruikt om bindingspartners voor CHGA te ontdekken door gebruik te maken van een faagdisplay-cDNA-bibliotheekmethode. Verschillende eiwitten binnen of naast de uitscheidingsroute werden aanvankelijk gedetecteerd als bindingspartners van recombinant humaan CHGA. We hebben ons vervolgens gericht op het trans-Golgi-eiwit SCLIP (STMN3) en zijn stathmin-paraloog SCG10 (STMN2) voor functioneel onderzoek. Co-immunoprecipitatie-experimenten bevestigden de interactie van elk van deze twee eiwitten met CHGA in vitro. SCLIP en SCG10 werden in vivo gecolokaliseerd naar het Golgi-apparaat van chromaffinecellen en deelden de lokalisatie met CHGA terwijl het door het Golgi ging. Downregulatie van ofwel SCLIP of SCG10 door synthetische siRNA's maakte vrijwel een einde aan de secretie van chromaffinecellen van een getransfecteerde CHGA−EAP-chimeer (die CHGA tot expressie bracht, gefuseerd met een enzymatische reporter en verhandeld naar de gereguleerde route). SCLIP-siRNA verlaagde ook het niveau van secretie van endogeen CHGA en SCG2, evenals getransfecteerd menselijk groeihormoon, terwijl SCG10-siRNA het niveau van gereguleerde secretie van endogeen CHGB verlaagde. Bovendien blokkeerde een dominante negatieve mutant van SCG10 (Cys22, Cys24 → Ala22, Ala24) de secretie van de getransfecteerde CHGA−EAP-chimeer significant. Een afname van de drijvende dichtheid van chromaffinekorrels werd waargenomen na neerwaartse regulatie van SCG10 door siRNA, wat suggereert dat deze stathminen deelnemen aan de vorming of rijping van de korrels. We concluderen dat SCLIP en SCG10 interageren met CHGA, gedeeltelijke colokalisatie in het Golgi-apparaat delen en mogelijk nodig zijn voor typische zenderopslag en afgifte uit chromaffinecellen.

Moleculaire basis voor tetanustoxine-coreceptor-interacties

Tetanustoxine (TeNT) veroorzaakt spastische verlamming door de splitsing van vesikel-geassocieerd membraaneiwit-2 (VAMP-2) in neuronen op de interneuronale kruising van het centrale zenuwstelsel. Terwijl TeNT retrograde verkeert van perifere zenuwuiteinden naar de interneuronale junctie, is er een beperkt begrip van de neuronale receptoren die door tetanustoxine worden gebruikt voor de eerste toegang tot zenuwcellen. Eerdere studies impliceerden een co-receptor voor het binnendringen van tetanustoxine in neuronen: een ganglioside-bindende pocket en een sialinezuurbindende pocket en die GT1b bond aan elke pocket. In deze studie karakteriseerde een vaste-fase-assay de gangliosidebindingsspecificiteit en functionele eigenschappen van beide koolhydraatbindende pockets van TeNT. De ganglioside bindende pocket herkende de ganglioside suikerruggengraat, Gal-GalNAc, onafhankelijk van siaalzuur-(5) en siaalzuur-(7) en GM1a was een optimaal substraat voor deze pocket, terwijl de siaalzuur bindende pocket herkende siaalzuur-( 5) en siaalzuur-(7) met "b"-reeks gangliosiden die de voorkeur hebben ten opzichte van "a"-reeks gangliosiden. De binding met hoge affiniteit van gangliosiden aan TeNT HCR vereiste functionele ganglioside- en siaalzuurbindende pockets, die synergetische binding aan coreceptoren ondersteunden. Deze analyse biedt een model voor hoe tetanustoxine coreceptoren gebruikt voor binding met hoge affiniteit aan neuronen.

Inzichten in het mechanisme van oxidatieve deaminatie gekatalyseerd door DOPA-decarboxylase
  • Mariarita Bertoldi* ,
  • Barbara Cellini,
  • Riccardo Montioli en
  • Carla Borri Voltattorni

De ongebruikelijke zuurstofverbruikende oxidatieve deamineringsreactie gekatalyseerd door het pyridoxal 5'-fosfaat (PLP) enzym DOPA decarboxylase (DDC) werd hier onderzocht. Zowel de wildtype als de Y332F DDC-variant is in staat om een ​​dergelijke oxidatie tot respectievelijk aromatische aminen of aromatische l-aminozuren uit te voeren zonder de hulp van enige cofactor die verband houdt met zuurstofchemie. Oxidatieve deaminering produceert, in equivalente hoeveelheden, een carbonylverbinding en ammoniak, vergezeld van dizuurstofverbruik in een molaire verhouding van 1:2 ten opzichte van de producten. Kinetische studies in de pre-steady of in de steady state, samen met HPLC-analyses van reactiemengsels onder verschillende experimentele omstandigheden, onthulden dat een ketimine zich ophoopt tijdens de lineaire fase van productvorming. Deze soort is reactief omdat het weer wordt omgezet in PLP wanneer het substraat wordt geconsumeerd. Snel mengende chemische quench-onderzoeken leveren bewijs dat ketimine inderdaad een tussenproduct is dat tijdens de eerste katalytische cyclus wordt gevormd. Bovendien worden superoxide-anion en waterstofperoxide beide gegenereerd tijdens de katalytische cycli. Op basis hiervan wordt een mechanisme van oxidatieve deaminering voorgesteld dat consistent is met de huidige gegevens. Bovendien stellen de katalytische eigenschappen van de T246A DDC-mutant samen met die eerder verkregen met de H192Q-mutant ons in staat om voor te stellen dat de Thr246-His192-dyade zou kunnen fungeren als een algemene basis bij het bevorderen van de eerste stap van de oxidatieve deaminering van aromatische aminen.

Thermodynamica van het dimeer (Decamer-overgang van verminderd menselijk en plantaardig 2-Cys-peroxiredoxine)
  • Sergio Barranco-Medina,
  • Sergej Kakorin,
  • Juan José Lázaro, en
  • Karl-Josef Dietz*

Isotherme titratiecalorimetrie (ITC) is een krachtige techniek voor het onderzoeken van zelf-associatieprocessen van eiwitcomplexen en er werd verwacht dat het kwantitatieve gegevens over peroxiredoxine-oligomerisatie zou onthullen door de thermodynamische parameters van dimeer-dimeerinteractie direct te meten. Recombinante klassieke 2-cysteïne peroxoredoxines van Homo sapiens, Arabidopsis thaliana en Pisum sativum evenals een carboxy-terminaal afgeknotte variant werden onderworpen aan ITC-analyse door stapsgewijze injectie in het reactievat onder verschillende redox-omstandigheden. De directe meting van het decamer-dimeer evenwicht van gereduceerd peroxiredoxine onthulde een kritische concentratie in het zeer lage micromolaire bereik. De gegevens suggereren een coöperatieve assemblage boven deze kritische overgangsconcentratie waar een kern assemblage vergemakkelijkt. De nogal abrupte overgang geeft aan dat assemblageprocessen niet plaatsvinden onder de kritische overgangsconcentratie, terwijl oligomerisatie daarboven efficiënt wordt geactiveerd. De grootte van de gemeten enthalpie bevestigde de endotherme aard van de peroxiredoxine-oligomerisatie. Heterocomplexen tussen peroxiredoxine-polypeptiden van verschillende soorten werden niet gevormd. We concluderen dat een functionele beperking de dimeer-decameer-overgang behield met sterk vergelijkbare kritische overgangsconcentraties ondanks opkomende sequentievariatie tijdens de evolutie.

De steroïde bindende domeinachtige I (SBDLI) van de Sigma-1-receptorbindingsplaats onderzoeken met behulp van N-gesubstitueerde fotoaffiniteitslabels
  • Dominique Fontanilla,
  • Abdol R. Hajipour,
  • Arindam Pal,
  • Uyen B. Chu,
  • Marty Arbabian en
  • Arnold E. Ruoho*

Radioactief gejodeerde fotoactiveerbare fotosondes kunnen waardevolle inzichten verschaffen met betrekking tot de eiwitstructuur. Eerder werk in ons laboratorium toonde aan dat het cocaïnederivaat en fotoprobe 3-[125I]iodo-4-azidococaine ([125I]IACoc) zich bindt aan de sigma-1-receptor met een 2-3 orden van grootte hogere affiniteit dan cocaïne [Kahoun, JR (1992) Proc. nat. Acad. Wetenschap. U.S.A. 89, 1393-1397]. Met behulp van deze fotosonde hebben we aangetoond dat de invoegplaats voor [125I]IACoc Asp188 is [Chen, Y. (2007) Biochemistry 46, 3532-3542], die zich in het voorgestelde steroïde bindende domeinachtige II (SBDLII) gebied (amino zuren 176-194) [Pal, A. (2007) Mol. Pharmacol. 72, 921-933]. Een extra fotosonde op basis van de sigma-1-receptorligand fenpropimorf, 1-N-(2-3-[125I]iodofenyl)propaan ([125I]IAF), bleek een peptide te labelen in zowel het SBDLII- als het steroïdbindende domein. zoals I (SBDLI) (aminozuren 91−109) [Pal, A. (2007) Mol. Pharmacol. 72, 921-933]. In dit rapport beschrijven we twee nieuwe strategisch gepositioneerde dragervrije, radioactief gejodeerde fotoaffiniteitslabels die speciaal zijn ontworpen om het vermeende "stikstof-interagerende gebied" van sigma-1-receptorliganden te onderzoeken. Deze twee nieuwe fotosondes zijn (−)-methyl-3-(benzoyloxy)-8-2-(4-azido-3-[125I]joodbenzeen)-1-ethyl-8-azabicyclo[3.2.1]octaan-2-carboxylaat ([125I]-N-IACoc) en N-propyl-N-(4-azido-3-joodfenylethyl)-3-(4-fluorfenyl)propylamine ([125I]IAC44). Naast het rapporteren van hun bindingsaffiniteiten voor de sigma-1- en sigma-2-receptoren, laten we zien dat beide fotoaffiniteitslabels specifiek en covalent de zuivere sigma-1-receptor van cavia's (26,1 kDa) derivatiseerden [Ramachandran, S. (2007) Protein Expression zuiver. 51, 283-292]. Splitsing van de fotogelabelde sigma-1-receptor met behulp van Endo Lys C en cyanogeenbromide (CNBr) onthulde dat het [125I]-N-IACoc-label zich voornamelijk bevond in de N-terminus en SBDLI-bevattende peptiden van de sigma-1-receptor, terwijl [125I]IAC44 werd gevonden in peptidefragmenten die consistent waren met het labelen van zowel SBDLI als SBDLII.

De rol van geconserveerde aspartaten in de ArsA ATPase
  • Hiranmoy Bhattacharjee* ,
  • Ranginee Choudhury en
  • Barry P. Rosen

De ArsA ATPase is de katalytische subeenheid van de arseniet-translocerende ArsAB-pomp die verantwoordelijk is voor resistentie tegen arsenicalen en antimonialen in Escherichia coli. ATPase-activiteit wordt geactiveerd door arseniet of antimoniet. ArsA is samengesteld uit twee homologe helften Al en A2, die elk een nucleotide-bindend domein bevatten, en een enkel metalloïde bindend of activeringsdomein bevindt zich op het grensvlak van de twee helften van het eiwit. Het metalloïde bindende domein is verbonden met de twee nucleotide bindende domeinen via twee DTAPTGH-sequenties, één in Al en de andere in A2. Er wordt voorgesteld dat de DTAPTGH-sequenties betrokken zijn bij informatiecommunicatie tussen het metaal en de katalytische sites. De rol van Asp142 in de A1 D142TAPTGH-sequentie en Asp447 in de A2 D447TAPTGH-sequentie werd onderzocht na het individueel veranderen van de aspartaten in alanine, asparagine en glutamaat door plaatsgerichte mutagenese. Asp142-mutanten waren in verschillende mate gevoelig voor As(III), terwijl de Asp447-mutanten hetzelfde resistentiefenotype vertoonden als het wildtype. Elk veranderd eiwit vertoonde verschillende niveaus van zowel basale als metalloïd-gestimuleerde activiteit, wat aangeeft dat noch Asp142 noch Asp447 essentieel is voor katalyse. Biochemische karakterisering van de gewijzigde eiwitten impliceert dat Asp142 betrokken is bij Mg2+-binding en ook een rol speelt bij signaaltransductie tussen de katalytische en activeringsdomeinen. Daarentegen is Asp447 lang niet zo kritisch voor Mg2+-binding als Asp142, maar lijkt het in communicatie te staan ​​tussen de metaal- en katalytische plaatsen. Alles bij elkaar genomen geven de resultaten aan dat Asp142 en Asp447, gelokaliseerd op de A1- en A2-helften van het eiwit, verschillende rollen hebben in ArsA-katalyse, in overeenstemming met ons voorstel dat deze twee helften functioneel niet-equivalent zijn.

De regulerende β-subeenheid van fosforylasekinase interageert met glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase
  • Igor G. Boulatnikov,
  • Owen W. Nadeau,
  • Patrick J Daniels,
  • Jessica M. Sage ,
  • Marina D. Jeyasingham,
  • Maria T. Villar,
  • Antonio Artigues, en
  • Gerald M. Carlson*

Skeletspierfosforylasekinase (PhK) is een (αβγδ)4 hetero-oligomeer enzymcomplex dat glycogeenfosforylase b (GPb) fosforyleert en activeert in een Ca2+-afhankelijke reactie die spiercontractie koppelt aan glycogeenafbraak. GPb is het enige bekende in vivo substraat van PhK, maar gezien de grote omvang en meerdere subeenheden van het PhK-complex, hebben we spierextracten gescreend op andere potentiële doelwitten. Extracten van P/J (controle) en I/lnJ (PhK-deficiënte) muizen werden geïncubeerd met [γ-32P]ATP met of zonder Ca2+ en vergeleken om mogelijke substraten te identificeren.Kandidaat-doelen werden opgelost door tweedimensionale polyacrylamidegelelektroforese en gefosforyleerd glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) werd geïdentificeerd door matrix-geassisteerde laserdesorptie-ionisatiemassaspectroscopie. In vitro-onderzoeken hebben aangetoond dat GAPDH een Ca2+-afhankelijk substraat van PhK is, hoewel de fosforyleringssnelheid erg laag is. GAPDH bindt echter stevig aan PhK en remt bij lage concentraties (IC50 ∼ 0,45 M) PhK's omzetting van GPb. Wanneer GPb werd vervangen door een kort synthetisch peptidesubstraat, was de remming verwaarloosbaar, wat suggereert dat GAPDH voornamelijk kan remmen door binding aan het PhK-complex op een locus die verschilt van zijn actieve plaats op de γ-subeenheid. Om dit idee te testen, werd het PhK−GAPDH-complex geïncubeerd met een chemische crosslinker en werd een dimeer gevormd tussen de regulerende β-subeenheid van PhK en GAPDH. Deze interactie werd bevestigd door het feit dat een subcomplex van PhK dat de β-subeenheid mist, met name een αγδ-subcomplex, niet in staat was GAPDH te fosforyleren, hoewel het katalytisch actief is ten opzichte van GPb. Bovendien had GAPDH geen effect op de omzetting van GPb door het αγδ-subcomplex. De hierin beschreven interacties tussen de a-subeenheid van PhK en GAPDH verschaffen een mogelijk mechanisme voor de directe koppeling van glycogenolyse en glycolyse in skeletspieren.

Onderzoek naar het energielandschap van antilichaam-antigeencomplexen: eiwitdynamiek, flexibiliteit en moleculaire herkenning
  • Megan C. Thielges ,
  • Jörg Zimmermann,
  • Wayne Yu,
  • Masayuki Oda en
  • Floyd E. Romesberg*

De productie van antilichamen die selectief binden aan vrijwel elke vreemde verbinding is het kenmerk van het immuunsysteem. Hoewel er veel bekend is over hoe sequentiediversiteit bijdraagt ​​aan deze opmerkelijke prestatie van moleculaire herkenning, is er weinig bekend over hoe sequentiediversiteit de antilichaamdynamiek beïnvloedt, wat naar verwachting ook zal bijdragen aan moleculaire herkenning. Voor dit doel hebben we een panel van antilichamen onderzocht die werden opgewekt tegen het chromofore antigeen fluoresceïne. Op basis van isotherme titratiecalorimetrie hebben we zes antilichamen geselecteerd die fluoresceïne binden met diverse bindende entropieën, wat wijst op verschillende bijdragen van dynamiek aan moleculaire herkenning. Sequentiebepaling onthulde dat twee paren antilichamen homologe zware ketens gebruiken die zijn afgeleid van gemeenschappelijke kiembaangenen, terwijl de andere twee zware ketens en alle zes de lichte ketens afkomstig zijn van verschillende kiemlijngenen en niet homoloog zijn. Interessant is dat meer dan de helft van alle somatische mutaties die zijn verkregen tijdens affiniteitsrijping onder de zes antilichamen zich bevinden op posities die waarschijnlijk niet rechtstreeks in contact komen met fluoresceïne. Om de dynamiek van de antilichaam-fluoresceïnecomplexen te kwantificeren en te vergelijken, werden drie-puls foton-echo piekverschuiving en transiënte roosterspectroscopie gebruikt. Alle antilichamen vertoonden bewegingen op drie verschillende tijdschalen, ultrasnelle bewegingen op de <100 fs-tijdschaal, diffuse bewegingen op de picoseconde-tijdschaal en bewegingen die optreden op tijdschalen langer dan nanoseconden en dus statisch lijken. De exacte frequentie van de picoseconde tijdschaalbeweging en de relatieve bijdrage van de verschillende bewegingen variëren echter aanzienlijk tussen de antilichaam-chromofoorcomplexen, wat een hoge mate van dynamische diversiteit onthult. Met behulp van een hiërarchisch model relateren we de gegevens aan kenmerken van de energielandschappen van de antilichamen en hun flexibiliteit in termen van elasticiteit en plasticiteit. Al met al geven de gegevens een consistent beeld van antilichaamflexibiliteit, die interessant lijkt te zijn gecorreleerd met bindingsentropie, evenals met kiemlijngengebruik en de mutaties die tijdens affiniteitsrijping worden geïntroduceerd. De gegevens bieden ook een graadmeter voor de dynamische diversiteit van het antilichaamrepertoire en suggereren dat deze diversiteit zou kunnen bijdragen aan moleculaire herkenning door de herkenning van het breedste scala aan vreemde moleculen te vergemakkelijken.

Fosforylering van eiwitfosfatase 2Cζ door c-Jun NH2-Terminal Kinase op Ser 92 verzwakt zijn fosfatase-activiteit
  • Kenjiro Awano,
  • Kazutaka Amano,
  • Yuko Nagaura,
  • Shin-ichiro Kanno,
  • Seishi Echigo,
  • Shinri Tamura* , en
  • Takayasu Kobayashi*

De familie van eiwitfosfatase 2C (PP2C) vertegenwoordigt een van de vier belangrijkste eiwit-Ser/Thr-fosfatase-activiteiten in zoogdiercellen en bevat ten minste 13 verschillende genproducten. Hoewel PP2C-familieleden een verscheidenheid aan cellulaire functies reguleren, zijn de mechanismen voor de regulatie van hun activiteiten grotendeels onbekend. Hier laten we zien dat PP2Cζ, een PP2C-familielid dat is verrijkt in testiculaire kiemcellen, wordt gefosforyleerd door c-Jun NH2-terminale kinase (JNK) maar niet door p38 in vitro. Massaspectrometrie en mutatieanalyses toonden aan dat fosforylering optreedt bij Ser92, Thr202 en Thr205 van PP2Cζ. Fosforylering van deze Ser- en Thr-residuen van PP2Cζ ectopisch tot expressie gebracht in 293-cellen werd versterkt door osmotische stress en werd verzwakt door een JNK-remmer maar niet door p38- of MEK-remmers. Fosforylering van PP2Cζ door TAK1-geactiveerde JNK onderdrukte de fosfatase-activiteit in cellen, en alaninemutatie op Ser92 maar niet op Thr202 of Thr205 onderdrukte deze remming. Samengevat suggereren deze resultaten dat specifieke fosforylering van PP2Cζ op Ser92 door stress-geactiveerde JNK zijn fosfatase-activiteit in cellen verzwakt.

Regulering van van eNOS afgeleid superoxide door endogene methylarginines
  • Lawrence J. Druhan,
  • Scott P. Forbes,
  • Arthur J. Pope,
  • Chun-An Chen,
  • Jay L. Zweier, en
  • Arturo J. Cardounel*

De endogene methylarginines, asymmetrische dimethylarginine (ADMA) en NG-monomethyl-l-arginine (L-NMMA) reguleren de productie van stikstofmonoxide (NO) uit endotheliaal NO-synthase (eNOS). Onder omstandigheden van uitputting van tetrahydrobiopterine (BH4) genereert eNOS ook •O2−, maar de effecten van methylarginines op de van eNOS afgeleide •O2−-generatie zijn slecht begrepen. Daarom hebben we met behulp van elektron paramagnetische resonantie spin trapping technieken de dosisafhankelijke effecten van ADMA en L-NMMA op •O2− productie van eNOS gemeten onder omstandigheden van BH4 uitputting. In afwezigheid van BH4 verhoogde ADMA dosisafhankelijk de van NOS afgeleide •O2−-generatie, met een maximale toename van 151% bij 100 μM ADMA. L-NMMA verhoogde ook dosisafhankelijk NOS-afgeleide •O2−, maar in mindere mate, wat een toename van 102% aantoont bij 100 M L-NMMA. Bovendien verhoogde het natieve substraat l-arginine ook de van eNOS afgeleide •O2−, wat een vergelijkbare mate van verbetering vertoonde als die waargenomen met ADMA. Metingen van NADPH-consumptie van eNOS toonden aan dat binding van l-arginine of methylarginines de snelheid van NADPH-oxidatie verhoogde. Spectrofotometrische studies suggereren, net als voor l-arginine en L-NMMA, dat de binding van ADMA het eNOS-heem naar de high-spin-toestand verschuift, wat wijst op een positievere heem-redoxpotentiaal, waardoor een verbeterde elektronenoverdracht van het reductase naar de oxygenaseplaats mogelijk wordt. . Deze resultaten tonen aan dat de methylarginines de balans van NO- en •O2−-generatie van eNOS grondig kunnen verschuiven. Deze waarnemingen hebben belangrijke implicaties met betrekking tot het therapeutische gebruik van l-arginine en de methylarginine-NOS-remmers bij de behandeling van ziekten.

TATA-bindende eiwitherkenning en buiging van een consensuspromotor zijn afhankelijk van eiwitsoorten
  • JoDell E. Whittington,
  • Roberto F. Delgadillo ,
  • Torrissa J. Attebury ,
  • Laura K. Parkhurst,
  • Margaret A. Daugherty, en
  • Lawrence J. Parkhurst*

De structuur en het gedrag van menselijke TBP van volledige lengte die de adenovirus major late promoter (AdMLP) bindt, zijn gekarakteriseerd met behulp van biofysische methoden. Het menselijke eiwit induceert een buiging van 97° in DNAAdMLP. De functionele gegevens met hoge resolutie bieden een kwantitatieve energetische en kinetische beschrijving van de gedeeltelijke reactiesequentie, aangezien natief humaan TBP snel bindt aan een consensuspromotor met hoge affiniteit. De reactie verloopt met opeenvolgende vorming van drie gebonden soorten, die allemaal sterk gebogen DNA hebben, waarbij de samenloop van binding en buiging wordt aangetoond door zowel fluorescentie als anisotropie gestopte stroom. Deze resultaten stellen de afhankelijkheid van de eiwitsoort vast van de TBP-DNAAdMLP-structuur en het herkenningsmechanisme. Bovendien is aangetoond dat de sterke correlatie tussen de DNA-buighoek en transcriptie-efficiëntie die eerder is aangetoond voor gist-TBP zich uitstrekt tot menselijke TBP. De heterologe NH2-terminale domeinen zijn de schijnbare bron van de soortspecifieke verschillen. Samen met eerdere studies stelt het huidige werk vast dat de functie en structuur van TBPwt-DNATATA zowel afhankelijk zijn van de TATA-boxsequentie als van de TBP-soort.

Sre1, een ijzer-gemoduleerd GATA DNA-bindend eiwit van ijzeropname-genen in het schimmelpathogeen Histoplasma capsulatum
  • Lily Y. Chao,
  • Michael A. Marletta* , en
  • Jasper Rine*

De pathogene schimmel Histoplasma capsulatum heeft ijzer nodig om te overleven tijdens macrofaaginfectie. Omdat ijzer in hoge concentraties giftig is, is de opname van ijzer in pathogene organismen, waaronder H. capsulatum, een sterk gereguleerd proces. Als reactie op een teveel aan ijzer onderdrukt H. capsulatum de transcriptie van genen die betrokken zijn bij de opname van ijzer. We rapporteren hier dat SRE1, een gen dat codeert voor een GATA-type eiwit, bond aan promotorsequenties van genen die betrokken zijn bij de biosynthese van siderofoor. Sre1 had sequentieovereenkomst met de schimmelnegatieve regulatoren van siderofoorbiosynthese. Expressie van SRE1 was verminderd onder ijzerverhongerende omstandigheden, wat zijn rol als negatieve regulator van genen die betrokken zijn bij ijzeropname onderstreept. Sre1p bond specifiek DNA dat de 5'-(G/A)ATC(T/A)GATAA-3'-sequentie bevatte, en die binding was zowel ijzer- als zinkafhankelijk. Metaalanalyse gaf aan dat een substoichiometrische hoeveelheid ijzer, voornamelijk Fe3+, aan het gezuiverde eiwit was gebonden. Ongeveer 0,5-1 equiv Fe3+ per monomeer was nodig voor volledige DNA-bindende activiteit. Mutaties in de geconserveerde cysteïneresten in het cysteïnerijke gebied leidden tot een afname van gebonden ijzer. Het verlies van ijzer leidde tot een ∼2,5-voudige afname van de DNA-bindingsaffiniteit, wat aangeeft dat ijzer direct betrokken was bij SRE1-regulatie van ijzeropnamegenen.

RNA-bindingsspecificiteit van Drosophila spierblind
  • Emily S. Goers,
  • Rodger B. Voelker ,
  • Devika P. Gates, en
  • J. Andrew Berglund*

Leden van de spierblinde familie van RNA-bindende eiwitten die worden aangetroffen in Drosophila en zoogdieren zijn belangrijke spelers in zowel de myotone dystrofie van de menselijke ziekte als de regulatie van alternatieve splicing. Onlangs is aangetoond dat het spierblinde eiwit van zoogdieren, MBNL1, interessante RNA-bindende eigenschappen heeft met zowel endogene als ziektegerelateerde RNA-doelen. Hier rapporteren we de karakterisering van RNA-bindende eigenschappen van het Drosophila spierblinde eiwit Mbl. Mutagenese van dubbelstrengs CUG-herhalingen toonde aan dat Mbl pyrimidine-pyrimidine-mismatches vereist voor binding en dat de identiteit en locatie van de C-G- en G-C-basenparen binnen de herhalingen essentieel zijn voor Mbl-binding. Systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) werd gebruikt om RNA-sequenties te identificeren die Mbl binden met een veel hogere affiniteit dan CUG-herhalingen. De door SELEX geïdentificeerde RNA-sequenties zijn gestructureerd en bevatten een consensussequentie van vijf nucleotiden van 5'-AGUCU-3'. RNase-footprinting van een van de SELEX-RNA-sequenties met Mbl toonde aan dat Mbl zowel dubbelstrengs als enkelstrengs regio's van het RNA bindt. Drie guanosines vertonen de sterkste voetafdruk in de aanwezigheid van Mbl-mutatie van een van deze drie guanosines en elimineert Mbl-binding. Er werd ook gevonden dat Mbl specifiek een menselijk MBNL1-RNA-doelwit bond, wat het behoud van spierblinde eiwitten aantoont bij het herkennen van RNA-doelen. Onze resultaten laten zien dat Mbl complexe secundaire RNA-structuren herkent.

Isotopengevoelige vertakking en kinetische isotopeneffecten in de reactie van gedeutereerde arachidonzuren met menselijke 12- en 15-lipoxygenases
  • Cyrillus Jacquot,
  • Aaron T. Wecksler,
  • Chris M. McGinley,
  • Erika N. Segraves,
  • Theodore R. Holman* , en
  • Wilfred A. van der Donk*

Lipoxygenasen (LO's) katalyseren lipideperoxidatie en zijn betrokken bij een aantal menselijke ziekten die verband houden met oxidatieve stress en ontsteking. Deze enzymen hebben ook veel aandacht getrokken vanwege grote kinetische isotoopeffecten (30−80) voor de snelheidsbeperkende waterstofabstractie met linolzuur (LA) als substraat. Hierin rapporteren we kinetische isotoopeffecten (KIE's) in de reacties van drie menselijke LO's (bloedplaatjes 12-hLO, reticulocyt 15-hLO-1 en epitheliaal 15-hLO-2) met arachidonzuur (AA). Verrassend genoeg waren de waargenomen KIE's met AA veel kleiner dan de eerder gerapporteerde waarden met LA. Onderzoek naar de oorsprong van de kleinere KIE's leidde tot de ontdekking van isotoopgevoelige vertakkingen van de reactieroutes. Analyse van productdistributie toonde een inversie in de regioselectiviteit van 15-hLO-1 aan, waarbij waterstofabstractie van C13 de belangrijkste route was met niet-gelabeld AA, maar abstractie van C10 overheerste wanneer de methyleengroep op positie 13 werd gedeutereerd. Kleinere maar duidelijke veranderingen in regioselectiviteit werden ook waargenomen voor 12-hLO en 15-hLO-2.

Een tweede geconserveerd GAF-domein cysteïne is vereist voor de blauw/groene fotoreversibiliteit van cyanobacteriochroom Tlr0924 van Thermosynechococcus elongatus
  • Nathan C. Rockwell,
  • Stephanie Lane Njuguna,
  • Laurel Roberts,
  • Elenor Castillo,
  • Victoria L. Parson,
  • Zonneschijn Dwojak,
  • J. Clark Lagarias* , en
  • Susan C. Spiller*

Fytochromen zijn veel voorkomende rode/verrode fotoreceptoren die gebruikmaken van een lineaire tetrapyrrool (biline) chromofoor die covalent is gebonden in een geknoopt PAS-GAF-domeinpaar. Cyanobacteriën bevatten ook meer verre verwanten van fytochromen die deze knoop missen, zoals de fytochroom-gerelateerde cyanobacteriochromen die betrokken zijn bij het functioneren als blauw/groene schakelbare fotoreceptoren. In deze studie karakteriseren we de cyanobacteriochroom Tlr0924 van de thermofiele cyanobacterie Thermosynechococcus elongatus. Tlr0924 van volledige lengte vertoont blauw / groene fotoconversie over een breed temperatuurbereik, inclusief fysiologisch relevante temperaturen voor dit organisme. Spectroscopische karakterisering van Tlr0924 toont aan dat zijn groenabsorberende toestand in evenwicht is met een labiele, spectraal verschillende blauwabsorberende soort. De fotochemisch gegenereerde blauwabsorberende toestand is in evenwicht met een andere soort die bij langere golflengten absorbeert, wat een totaal van 4 toestanden oplevert. Cys499 is essentieel voor dit gedrag, omdat mutagenese van dit residu resulteert in roodabsorberende mutante biliproteïnen. Karakterisering van het C499D-mutante eiwit door absorptie en CD-spectroscopie ondersteunt de conclusie dat zijn bilinechromofoor een vergelijkbare conformatie aanneemt als de roodlichtabsorberende Pr-vorm van fytochroom. We stellen een model fotocyclus voor waarin Z/E-foto-isomerisatie van de 15/16-binding de vorming van een omkeerbare thioetherbinding tussen Cys499 en C10 van de chromofoor moduleert, wat de basis vormt voor de blauw/groene omschakeling van cyanobacteriochromen.


Coördinatie van grensvlakmetaal in gemanipuleerde eiwit- en peptidesamenstellingen

Engineered peptide steigers die assembleren als reactie op metaalcoördinatie.

Ontwerp van metaal-gemedieerde eiwitsamenstellingen met nieuwe structurele/chemische eigenschappen.

Toepassingen van coördinatiechemie om supramoleculaire eiwitassemblage te controleren.

Metaalionen worden vaak aangetroffen in natuurlijke eiwit-eiwitinterfaces, waar ze quaternaire of supramoleculaire eiwitstructuren stabiliseren, tijdelijke eiwit-eiwitinteracties bemiddelen en als katalytische centra dienen. Parallel aan deze natuurlijke rollen, wordt de coördinatiechemie van metaalionen in toenemende mate gebruikt op creatieve manieren voor het ontwerpen en controleren van de assemblage van functionele supramoleculaire peptide- en eiwitarchitecturen. Hier geven we een kort overzicht van deze opkomende tak van metalloproteïne/peptide-engineering en belichten we enkele geselecteerde voorbeelden uit de recente literatuur die de diversiteit en het toekomstige potentieel van benaderingen die worden ontwikkeld het beste weergeven.


D7. Redox-chemie en eiwitvouwing - biologie

4′-fosfopantetheinyltransferasen (PPTase) modificeren post-translationeel dragereiwitten met een fosfopantetheïnegroep, een essentiële reactie in alle drie de domeinen van het leven. In het bacteriegeslacht Mycobacteria activeert het Sfp-type PPTase routes die nodig zijn voor de biosynthese van celwandcomponenten en virulentiefactoren van kleine moleculen. We hebben de röntgenkristalstructuren opgelost en biochemisch de Sfp-type PPTasen van twee van de meest voorkomende Mycobacteriële pathogenen, PptT van M. tuberculosis en MuPPT van M. ulcerans, gekarakteriseerd. Structurele analyses onthullen significante verschillen in cofactorbinding en samenstelling van de actieve plaats in vergelijking met eerder gekarakteriseerde Sfp-type PPTasen. Functionele analyses, waaronder de werkzaamheid van Sfp-type PPTase-specifieke remmers, suggereren ook dat de Mycobacteriële Sfp-type PPTases kunnen dienen als therapeutische doelen tegen Mycobacteriële infecties.

Transcriptieprogramma voor hitte-schokrespons maakt hoogwaardige en hoogwaardige recombinante eiwitproductie mogelijk in Escherichia coli
  • Xin Zhang,
  • Yu Liu,
  • Joseph C. Genereux,
  • Chandler Nolan,
  • Meha Singh en
  • Jeffery W. Kelly*

De biosynthese van oplosbare, correct gevouwen recombinante eiwitten in grote hoeveelheden uit Escherichia coli is wenselijk voor academisch onderzoek en industriële eiwitproductie. De basale E. coli-eiwithomeostase (proteostase) netwerkcapaciteit is vaak onvoldoende om tot overexpressie gebrachte eiwitten efficiënt te vouwen. Hierin laten we zien dat een transcriptioneel geherprogrammeerd E. coli proteostase-netwerk in het algemeen superieur is voor het produceren van oplosbare, gevouwen en functionele recombinante eiwitten. Herprogrammering wordt bereikt door overexpressie van een negatieve feedback-deficiënte warmte-shock respons transcriptiefactor voor en tijdens overexpressie van het eiwit van belang. Het voordeel van transcriptionele herprogrammering versus het eenvoudig tot overexpressie brengen van geselecteerde proteostase-netwerkcomponenten (bijv. chaperonnes en co-chaperones, die eerder zijn onderzocht) is dat een groot aantal proteostase-netwerkcomponenten worden opgereguleerd met hun geëvolueerde stoichiometrie, waardoor de systeemmogelijkheden van de proteostase-netwerk die momenteel onvolledig worden begrepen. Transcriptionele proteostase-netwerkherprogrammering gemedieerd door op stress reagerende signalering in afwezigheid van stress zou ook nuttig moeten zijn voor eiwitproductie in andere cellen.

Functionele en structurele karakterisering van 2-amino-4-fenylthiazol-remmers van het HIV-1 nucleocapside-eiwit met antivirale activiteit
  • Mattia Mori,
  • Alessandro Nucci,
  • Maria Chiara Dasso Lang,
  • Nicolaas Humbert,
  • Christian Boudier,
  • François Debaene,
  • Sarah Sanglier-Cianferani,
  • Marjorie Catala,
  • Patricia Schult Dietrich,
  • Ursula Dietrich,
  • Carine Tisne,
  • Yves Mely* , en
  • Maurizio Botta*

Het nucleocapside-eiwit (NC) is een sterk geconserveerd eiwit in diverse HIV-1-subtypen dat een centrale rol speelt bij virusreplicatie, voornamelijk door interactie met geconserveerde nucleïnezuursequenties. NC wordt beschouwd als een zeer winstgevend medicijndoelwit om meerdere stappen in de HIV-1-levenscyclus te remmen met slechts één verbinding, een unieke eigenschap die door geen van de andere antiretrovirale klassen wordt getoond. De meeste NC-remmers die tot nu toe zijn ontwikkeld, werken echter via een niet-specifiek en potentieel toxisch mechanisme (zinkejectie) en worden voornamelijk onderzocht als lokale microbiciden. In een poging om specifieke NC-remmers te leveren die strijden om de binding van nucleïnezuren aan NC, hebben we hier moleculaire modellering, organische synthese, biofysische studies, NMR-spectroscopie en antivirale testen gecombineerd om een ​​efficiënte NC-remmer te ontwerpen, synthetiseren en karakteriseren die is begiftigd met antivirale activiteit in vitro, een gewenste eigenschap voor de ontwikkeling van efficiënte antiretrovirale loodverbindingen.

Genetisch coderen van een elektrofiel aminozuur voor eiwitstapeling en covalente binding aan inheemse receptoren
  • Xiao Hua Chen,
  • Zheng Xiang,
  • Ying S.Hu,
  • Vanessa K. Lacey,
  • Hu Cang, en
  • Lei Wang*

Covalente bindingen kunnen binnen en tussen eiwitten worden gegenereerd door een onnatuurlijk aminozuur (Uaa) dat reageert met een natuurlijk residu door middel van bioreactiviteit met nabijheid. Tot nu toe zijn Uaas ontwikkeld om voornamelijk te reageren met cysteïne in eiwitten. Hier hebben we genetisch een elektrofiele Uaa gecodeerd die in staat is om te reageren met histidine en lysine, waardoor de diversiteit van doeleiwitten en de reikwijdte van de door nabijheid mogelijk gemaakte eiwitverknopingstechnologie wordt uitgebreid. Naast efficiënte inter- en intramoleculaire verknoping van eiwitten, maakt deze Uaa directe nieten van een eiwit-a-helix op een recombinante manier en covalente binding van natieve membraanreceptoren in levende cellen mogelijk. De doeldiversiteit, recombinant stapling en covalente targeting van endogene eiwitten mogelijk gemaakt door deze veelzijdige Uaa zou waardevol moeten blijken bij het ontwikkelen van nieuwe onderzoeksinstrumenten, biologische diagnostiek en therapieën door covalente eiwitbindingen te benutten voor specificiteit, onomkeerbaarheid en stabiliteit.

Ontworpen BH3-peptiden met hoge affiniteit en specificiteit voor het targeten van Mcl-1 in cellen
  • Glenna Wink Foight,
  • Jeremy A. Ryan,
  • Stefano V. Gullá,
  • Anthony Letai, en
  • Amy E. Keating*

Mcl-1 wordt tot overexpressie gebracht in veel kankers en kan resistentie verlenen tegen celdoodsignalering bij refractaire ziekte. Moleculen die specifiek Mcl-1 remmen, hebben potentieel voor het diagnosticeren en verstoren van Mcl-1-afhankelijke celoverleving. We selecteerden drie peptiden uit een gist-oppervlakte-displaybibliotheek die een matige specificiteit en affiniteit vertoonde voor binding aan Mcl-1 ten opzichte van Bfl-1, Bcl-xL, Bcl-2 en Bcl-w. Specificiteit voor Mcl-1 werd verbeterd door het introduceren van threonine op peptidepositie 2e. Het meest specifieke peptide, MS1, bond Mcl-1 met een 40-voudige of grotere specificiteit ten opzichte van vier andere menselijke Bcl-2-paralogen. In BH3-profileringsassays veroorzaakte MS1 depolarisatie in verschillende menselijke Mcl-1-afhankelijke cellijnen met EC50-waarden van ∼3 M, in tegenstelling tot EC50-waarden van >100 μM voor Bcl-2-, Bcl-xL- of Bfl-1-afhankelijk cel lijnen. MS1 is in deze test ten minste 30 keer krachtiger dan het eerder gebruikte Mcl-1-targetingreagens NoxaA BH3. Deze peptiden kunnen worden gebruikt om Mcl-1-afhankelijkheid in cellen te detecteren en aanknopingspunten te bieden voor het ontwikkelen van therapeutische middelen voor Mcl-1-targeting.

Orthogonale controle van antibacteriële activiteit met licht
  • Willem A. Velema,
  • Jan Pieter van der Berg,
  • Wiktor Szymanski,
  • Arnold J.M. Driessen, en
  • Ben L. Feringa*

De selectie van één enkele bacteriestam uit een mengsel van micro-organismen is van cruciaal belang in het gezondheidszorg- en microbiologisch onderzoek. Nieuwe benaderingen die de selectie van bacteriën extern kunnen controleren, zijn een waardevolle aanvulling op de microbiologische toolbox. In deze proof-of-concept worden twee complementaire antibiotica beschermd met fotosplitsbare groepen die orthogonaal kunnen worden aangesproken met verschillende golflengten van licht. Dit zorgt voor de door licht getriggerde selectie van een enkele bacteriestam uit een mengsel van meerdere stammen, door de juiste golflengte te kiezen. Verdere verbetering in de richting van aanvullende orthogonaal adresseerbare antibiotica zou uiteindelijk kunnen leiden tot een nieuwe methodologie voor bacteriële selectie in complexe populaties.

Differentiële effecten op allelselectieve silencing van mutant huntingtine door twee stereo-isomeren van α,β-beperkt nucleïnezuur
  • Michael E. Østergaard,
  • Beatrice Gerland,
  • Jean Marc Escudier,
  • Eric E. Swayze, en
  • Punit P. Seth*

We beschrijven de effecten van het introduceren van twee epimeren van ,β-beperkt nucleïnezuur (CNA) op de activiteit en het allelselectiviteitsprofiel van RNase H actieve antisense-oligonucleotiden (ASO's) gericht op een enkelvoudig nucleotide polymorfisme (SNP) voor de behandeling van de ZvH. ziekte (HD). ASO's gemodificeerd met beide isomeren van α,β-CNA in het gap-gebied vertoonden goede activiteit ten opzichte van het mutante allel, maar één isomeer vertoonde verbeterde selectiviteit ten opzichte van het wildtype allel. Analyse van de menselijke RNase H-splitsingspatronen van α,β-CNA-gemodificeerde ASO's versus gematcht en niet-overeenkomend RNA onthulde dat beide isomeren RNase H-splitsing ondersteunen op de RNA-streng tegenover de plaats van opname in de ASO - een ongebruikelijke waarneming voor een neutrale koppeling oligonucleotide modificatie. Interessant is dat ASO's gemodificeerd met (R)- en (S)-5′-hydroxyethyl-DNA (respectievelijk RHE en SHE) gevormd door gedeeltelijke hydrolyse van het dioxafosforinaanringsysteem in α,β-CNA ook goede activiteit vertoonden ten opzichte van het mutante allel, maar een verbeterd selectiviteitsprofiel werd waargenomen voor de RHE-gemodificeerde ASO. Onze waarnemingen ondersteunen verder de profilering van neutrale en 5'-gemodificeerde nucleïnezuuranalogen als hulpmiddelen voor gen-uitschakelingstoepassingen.

Enzymatische synthese van polybroomdioxinen uit het mariene milieu

Polygehalogeneerde dibenzo-p-dioxinen behoren tot de meest giftige moleculen die de mens kent. Naast antropogene bronnen herbergen ongewervelde zeedieren ook polybroomdibenzo-p-dioxinen van nog onbekende biogene oorsprong. Hier rapporteren we dat de bmp-genlocus in mariene bacteriën, een recent gekarakteriseerde bron van polybroomdifenylethers, ook dibenzo-p-dioxinen kan synthetiseren door verschillende fenolische initiatormoleculen te gebruiken. Onze bevindingen diversifiëren ook de structurele klassen van difenylethers die toegankelijk zijn via de bmp-biosyntheseroute. Dit rapport legt de biochemische basis van een waarschijnlijke biogenetische oorsprong van dibenzo-p-dioxinen die aanwezig zijn in het mariene metaboloom en vergroot het toxiciteitspotentieel van mariene afgeleide polygehalogeneerde natuurlijke producten aanzienlijk.

Nitroreductase-activeerbare morfolino-oligonucleotiden voor: in vivo Gen-uitschakeling

Fosforodiamidaat-morfolino-oligonucleotiden worden veel gebruikt om de genfunctie in hele organismen te onderzoeken, en door licht activeerbare derivaten kunnen ruimtelijke en temporele verschillen in genactiviteit aan het licht brengen. We beschrijven hier een nieuwe klasse van gekooide morfolino-oligonucleotiden die kunnen worden geactiveerd door het bacteriële nitroreductase NfsB. We karakteriseren de activeringskinetiek van deze reagentia in vitro en demonstreren hun werkzaamheid in zebravisembryo's die NfsB alomtegenwoordig of in gedefinieerde celpopulaties tot expressie brengen. In combinatie met transgene organismen zullen dergelijke door enzymen geactiveerde antisense-tools gen-uitschakeling mogelijk maken in specifieke celtypen, inclusief weefsels die niet vatbaar zijn voor optische targeting.

Chemical Reporter voor het visualiseren van metabole overspraak tussen koolhydraatmetabolisme en eiwitmodificatie

Metabolische chemische reporters zijn grotendeels gebruikt om posttranslationele modificaties te bestuderen. Over het algemeen werd aangenomen dat deze reporters één biosynthetische route binnengingen, wat resulteerde in het labelen van één type modificatie. Omdat ze echter door cellen worden gemetaboliseerd voordat ze aan eiwitten worden toegevoegd, bieden metabole chemische verslaggevers mogelijk een unieke kans om te lezen over zowel interessante wijzigingen als het cellulaire metabolisme. We rapporteren hier de ontwikkeling van een metabolische chemische reporter 1-deoxy-N-pentynylglucosamine (1-deoxy-GlcNAlk). Dit kleine molecuul kan niet worden opgenomen in glycanen, maar de behandeling van zoogdiercellen resulteert in het labelen van een verscheidenheid aan eiwitten en maakt hun visualisatie en identificatie mogelijk. Concurrentie van deze labeling met natriumacetaat en een acetyltransferaseremmer suggereert dat 1-deoxy-GlcNAlk de eiwitacetyleringsroute kan binnengaan. Deze resultaten tonen aan dat metabolische chemische reporters het potentieel hebben om overspraak tussen metabole routes in levende cellen te isoleren en mogelijk te ontdekken.

Transformatie van humaan cathelicidine LL-37 in selectieve, stabiele en krachtige antimicrobiële verbindingen
  • Guangshun Wang* ,
  • Mark L. Hanke,
  • Biswajit Mishra,
  • Tamara Lushnikova,
  • Cortney E. Heim,
  • Vinai Chittezham Thomas,
  • Kenneth W. Bayles, en
  • Tammy Kielian

Deze brief rapporteert een familie van nieuwe antimicrobiële verbindingen die zijn verkregen door screening van peptidebibliotheken te combineren met op structuur gebaseerd ontwerp. Bibliotheekscreening leidde tot de identificatie van een humaan LL-37-peptide dat resistent is tegen chymotrypsine. Deze d-aminozuurbevattende peptidematrijs was actief tegen Escherichia coli maar niet tegen methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA). Het bezit een unieke niet-klassieke amfipathische structuur met hydrofobe defecten. Door de hydrofobe defecten te herstellen, kreeg het peptide (17BIPHE2) activiteit tegen de ESKAPE-pathogenen, waaronder Enterococcus faecium, S. aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa en Enterobacter-soorten. In vitro zou 17BIPHE2 bacteriële membranen kunnen verstoren en aan DNA kunnen binden. In vivo voorkwam het peptide de vorming van stafylokokkenbiofilm in een muismodel van katheter-geassocieerde infectie. Ondertussen versterkte het de aangeboren immuunrespons om de infectie verder te bestrijden. Omdat deze peptiden krachtig, celselectief en stabiel zijn voor verschillende proteasen, kunnen ze worden gebruikt om een ​​of meer ESKAPE-pathogenen te bestrijden.

Hoeveel antimicrobiële peptidemoleculen doden een bacterie? De zaak van PMAP-23
  • Daniela Roversi,
  • Vincenzo Luca,
  • Simone Aurel,
  • Yoonkyung-park,
  • Maria Luisa Mangoni en
  • Lorenzo Stella*

Antimicrobiële peptiden (AMP's) doden bacteriën voornamelijk door verstoring van hun membranen en zijn veelbelovende verbindingen om resistentie tegen geneesmiddelen te bestrijden. Modellen van het mechanisme van door AMP's geïnduceerde membraanverstoring werden ontwikkeld op basis van experimenten in liposomen, maar hun relevantie voor het doden van bacteriën staat ter discussie. We bepaalden de associatie van een analoog van het AMP PMAP-23 met Escherichia coli-cellen, onder dezelfde experimentele omstandigheden die werden gebruikt om bactericide activiteit te meten. Doden vond alleen plaats wanneer gebonden peptiden de bacteriële membranen volledig verzadigden (106-107 gebonden peptiden per cel), wat aangeeft dat het "tapijt" -model voor de verstoring van kunstmatige dubbellagen representatief is voor wat er in echte bacteriën gebeurt. Deze bevinding ondersteunt de opvatting dat, althans voor dit peptide, een microbicide mechanisme in vivo alleen mogelijk is bij micromolaire totale peptideconcentraties. We toonden ook aan dat, ondanks hun eenvoud, liposomen een betrouwbaar model vertegenwoordigen om de verdeling van AMP's in bacteriële membranen te karakteriseren.

Bio-geïnspireerde strategie voor de ribosomale synthese van via thioether overbrugde macrocyclische peptiden in bacteriën

Geïnspireerd door de biosynthetische logica van natuurlijke producten van lanthipeptide, werd een nieuwe methodologie ontwikkeld om de ribosomale synthese van macrocyclische peptiden te sturen die worden beperkt door een intramoleculaire thioetherbinding. Als eerste stap werd een robuuste en veelzijdige strategie geïmplementeerd om de cyclisatie van ribosomaal afgeleide peptidesequenties mogelijk te maken via een chemoselectieve reactie tussen een genetisch gecodeerd cysteïne en een cysteïne-reactief onnatuurlijk aminozuur (O-(2-broomethyl)-tyrosine). Combinatie van deze benadering met door inteïne gekatalyseerde eiwitsplitsing leverde een efficiënte route op om de spontane, post-translationele vorming van structureel diverse macrocyclische peptiden in bacteriële cellen te bereiken. De huidige peptidecyclisatiestrategie bleek ook geschikt te zijn voor integratie met gesplitste inteïne-gemedieerde circulaire ligatie, resulterend in de intracellulaire synthese van conformationeel beperkte peptiden met een bicyclische architectuur.

Lidwoord
Nucleofiele 1,4-toevoegingen voor ontdekking van natuurlijke producten
  • Courtney L. Cox,
  • Jonathan I. Tietz,
  • Karol Sokolowski,
  • Joel O. Melby,
  • James R. Doroghazi, en
  • Douglas A. Mitchell*

Natuurlijke producten blijven een belangrijke bron van kandidaat-geneesmiddelen, maar de moeilijkheden die inherent zijn aan traditionele isolatie, in combinatie met onaanvaardbaar hoge percentages van herontdekking van verbindingen, beperken het tempo van de detectie van natuurlijke producten. Hier beschrijven we een op reactiviteit gebaseerde screeningmethode om snel geëxporteerde bacteriële metabolieten te identificeren die gedehydrateerde aminozuren bevatten (d.w.z. carbonyl- of imine-geactiveerde alkenen), een veelvoorkomend motief in verschillende klassen van natuurlijke producten. Onze strategie omvat het gebruik van een in de handel verkrijgbare thiol, dithiothreitol, voor de covalente labeling van geactiveerde alkenen door nucleofiele 1,4-additie. Modificatie is gemakkelijk te onderscheiden door massaspectra van gereageerde en ongereageerde celoppervlakextracten te vergelijken. In combinatie met bio-informatische analyse van vermeende genclusters van natuurlijke producten, kan gerichte screening en isolatie worden uitgevoerd op een geprioriteerde lijst van stammen. Bovendien worden bekende verbindingen gemakkelijk gederepliceerd, waardoor overbodige isolatie en karakterisering effectief wordt geëlimineerd. Als bewijs van het principe werd deze labelingsmethode gebruikt om bekende natuurlijke producten te identificeren die behoren tot de klassen thiopeptide, lanthipeptide en linaridine. Verder hebben we, na screening van een panel van slechts 23 actinomyceten, een nieuw thiopeptide-antibioticum, cyclothiazomycine C.

Structuren van kibdelomycine gebonden aan Staphylococcus aureus GyrB en ParE toonden een nieuwe U-vormige bindingsmodus
  • juni Lu* ,
  • Sangita Patel,
  • Nandini Sharma,
  • Stephen M. Soisson,
  • Ryuta Kishii,
  • Masaya Takei,
  • Yasumichi Fukuda,
  • Kevin J. Lumb, en
  • Sheo B. Singh*

Bacteriële resistentie tegen antibiotica blijft een serieuze uitdaging vormen naarmate het ontdekkingspercentage voor nieuwe antibiotica afneemt. Kibdelomycine is een van de zeldzame, nieuwe, natuurlijke antibiotica die onlangs zijn ontdekt en die de bacteriële DNA-synthese-enzymen gyrase en topoisomerase IV remt. Het is een breedspectrum, grampositief antibioticum zonder kruisresistentie tegen bekende gyraseremmers, waaronder klinisch effectieve chinolonen. Om het werkingsmechanisme, de bindingsmodus en het ontbreken van kruisresistentie te begrijpen, hebben we kibdelomycine en novobiocine samen gekristalliseerd met de N-terminale domeinen van Staphylococcus aureus gyrase B (24 kDa) en topo IV (ParE, 24 en 43 kDa ). Kibdelomycine vertoont een unieke "dual-arm", U-vormige bindingsmodus in beide kristalstructuren. De pyrrolamide-eenheid in het onderste deel van kibdelomycine dringt diep door in de zak van de ATP-bindingsplaats, terwijl de isopropyl-tetraminezuur- en suikergroep van het bovenste deel grondig polaire interacties aangaan met een oppervlaktepleister van het eiwit. Het isoproramic acid (1,3-dioxopyrrolidine) en een tetrahydropyranacetaatgroep (Sugar A) maken polair contact met een oppervlakte bestaande uit helix α4 en de flexibele lus die de helices α3 en α4 verbindt. De twee armen zijn met elkaar verbonden door een stijve decaline-linker die van del Waals contact maakt met de eiwitruggengraat. Deze "tweearmige", U-vormige, multicontact-bindingsmodus van kibdelomycine is uniek en duidelijk verschillend van de bindingsmodi van andere bekende gyraseremmers (bijv. coumarines en chinolonen), wat het gebrek aan kruisresistentie en lage frequentie van resistentie verklaart . De kristalstructuren die in dit artikel worden vermeld, moeten het ontwerp en de ontdekking van analogen met betere eigenschappen en een antibacterieel spectrum mogelijk maken.

Veranderingen in energie/redoxmetabolisme geïnduceerd door mitochondriale en omgevingstoxines: een specifieke rol voor glucose-6-fosfaatdehydrogenase en de pentosefosfaatroute bij paraquattoxiciteit
  • Shulei Lei,
  • Laura Zavala-Flores,
  • Aracely Garcia-Garcia,
  • Renu Nandakumar,
  • Yuting Huang,
  • Nandakumar Madayiputhiya,
  • Robert C. Stanton,
  • Eric D. Dodds,
  • Robert Powers* , en
  • Rodrigo Franco*

De ziekte van Parkinson (PD) is een multifactoriële aandoening met een complexe etiologie, waaronder genetische risicofactoren, blootstelling aan omgevingsfactoren en veroudering. Hoewel energiefalen en oxidatieve stress grotendeels in verband zijn gebracht met het verlies van dopaminerge cellen bij PD en de toxiciteit die wordt veroorzaakt door mitochondriale/omgevingstoxines, is er zeer weinig bekend over de veranderingen in het energiemetabolisme die verband houden met mitochondriale disfunctie en hun oorzakelijke rol bij de voortgang van celdood . In deze studie onderzochten we de veranderingen in het energie/redox-metaboloom in dopaminerge cellen die zijn blootgesteld aan milieu-/mitochondriale toxines (paraquat, rotenon, 1-methyl-4-fenylpyridinium [MPP+] en 6-hydroxydopamine [6-OHDA]) om gemeenschappelijke en/of verschillende mechanismen van toxiciteit te identificeren. Een gecombineerde metabolomics-benadering met behulp van nucleaire magnetische resonantie (NMR) en directe-infusie-elektrospray-ionisatiemassaspectrometrie (DI-ESI-MS) werd gebruikt om unieke metabole profielveranderingen als reactie op deze neurotoxinen te identificeren. Blootstelling aan paraquat veroorzaakte de meest ingrijpende veranderingen in het metaboloom van de pentosefosfaatroute (PPP). 13C-glucosefluxanalyse bevestigde dat PPP-metabolieten zoals glucose-6-fosfaat, fructose-6-fosfaat, glucono-1,5-lacton en erythrose-4-fosfaat werden verhoogd door paraquatbehandeling, wat gepaard ging met remming van glycolyse en de TCA-cyclus. Proteomische analyse vond ook een toename in de expressie van glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD), dat reducerende equivalenten levert door nicotinamide-adenine-dinucleotidefosfaat (NADPH) -niveaus te regenereren. Overexpressie van G6PD verhoogde selectief de paraquat-toxiciteit, terwijl de remming ervan met 6-aminonicotinamide door paraquat geïnduceerde oxidatieve stress en celdood remde. Deze resultaten suggereren dat paraquat de PPP "kaapt" om NADPH-reducerende equivalenten te verhogen en paraquat-redoxcycli, oxidatieve stress en celdood te stimuleren. Onze studie toont duidelijk aan dat veranderingen in het energiemetabolisme, die specifiek zijn voor verschillende mitochondriale / omgevingstoxines, geen omstanders zijn van energiefalen, maar ook significant bijdragen aan de voortgang van celdood.

Mia40 is geoptimaliseerd voor functie bij mitochondriaal oxidatief eiwitvouwen en importeren

Mia40 katalyseert oxidatieve eiwitvouwing in mitochondriën. Het bevat een unieke katalytische CPC-dithiol geflankeerd door een hydrofobe groef, en in tegenstelling tot andere oxidoreductasen vormt het langlevende gemengde disulfiden met substraten. We laten zien dat deze onderscheidende eigenschap niet afkomstig is van bepaalde eigenschappen van mitochondriale substraten, noch van het CPC-motief van Mia40. De katalytische cysteïnes van Mia40 vertonen een ongewoon lage chemische reactiviteit, zoals uitgedrukt in conventionele pK-waarden en reductiepotentialen.De stabiliteit van het gemengde disulfidetussenproduct is energetisch gekoppeld aan hydrofobe interacties tussen Mia40 en het substraat. Op basis van deze eigenschappen stellen we een mechanisme voor voor Mia40, waarbij de hydrofobe bindingsplaats wordt gebruikt om een ​​substraatthiol te selecteren voor het vormen van het aanvankelijke gemengde disulfide. De lange levensduur wordt gebruikt om gedeeltelijk gevouwen eiwitten in de mitochondriën vast te houden en om vouwing te richten op de vorming van de natieve disulfidebindingen.


Abstract

Het gebruik van zijketens als katalytische cofactoren voor eiwit-gemedieerde redoxchemie roept belangrijke mechanistische problemen op over hoe deze aminozuren op een gecontroleerde manier worden geactiveerd in de richting van radicale chemie. nieuw eiwitontwerp is gebruikt om de structurele basis te onderzoeken voor de creatie en het onderhoud van een tryptofanylradicaal in een eiwitmaquette met drie helixbundels. Hier rapporteren we de gedetailleerde structurele analyse van het eiwit door multidimensionale NMR-methoden. Een interessant kenmerk van de structuur is een schijnbare π-kation-interactie waarbij de enige tryptofaan en een lysinezijketen betrokken zijn. Functionele berekeningen van hybride dichtheid ondersteunen het idee dat deze interactie het reductiepotentieel van het W°/WH-redoxpaar verhoogt en de redoxkenmerken van het eiwit helpt verklaren. Dit modeleiwitsysteem biedt daarom een ​​krachtig model voor het onderzoeken van de structurele basis voor gecontroleerde radicale chemie in eiwit.


Bekijk de video: Bovenbouw Vertering Taak 1a Eiwitten en aminozuren (Januari- 2022).