Informatie

Worden pseudogenen geteld als een subtype van lange niet-coderende RNA-genen?


Worden pseudogenen beschouwd als een subtype van de genen voor lange niet-coderende RNA's?

Ik kon het antwoord op deze vraag niet vinden in een zoekopdracht op internet.


Een opmerking over nomenclatuur in de moderne biologie

Zoals het er nu uitziet, lijkt deze vraag te veronderstellen dat er een juridische commissie, Académie française, of iets dergelijks, is die is gewijd aan het voortdurend bepalen van de wetenschappelijke nomenclatuur, en dat degenen in het veld deze gehoorzaam volgen. Hoewel organisaties zoals IUPAC - The International Union of Pure and Applied Chemistry - bestaan ​​voor standaardisatie, gaan ze erg langzaam en komen ze pas tevoorschijn als het stof is neergedaald (om zo te zeggen). Dus als ik een artikel over genen schrijf, kan ik ze classificeren zoals het bij mijn doel past. Misschien wil ik onderscheid maken tussen coderen of niet-coderen; of tussen structureel, informatief, regelgevend en rommel enz. enz. Niemand zal me in de gevangenis gooien als ze het niet eens zijn.

Is het wetenschappelijk om pseudogenen op deze manier te classificeren?

Hiermee bedoel ik doen de genen (want dat is wat we kunnen vergelijken) want lange niet-coderende RNA's (ncRNA's of lncRNA's) hebben voldoende algemene kenmerken die door pseudogenen worden gedeeld dat het nuttig zou zijn om pseudogenen op deze manier te subtyperen. In mijn mening, Nee. pseudogenen worden over het algemeen als niet-functioneel beschouwd - overblijfselen van onsuccesvolle of onvoltooide genduplicatie, of van reverse transcriptie van rijpe mRNA's in het kiemlijn-DNA. In veel gevallen worden ze niet eens getranscribeerd. Er is misschien geen enkele functie voor die genproducten die lncRNA's worden genoemd, maar in het algemeen worden ze getranscribeerd en men denkt dat ze functies hebben die te maken hebben met genregulatie. Er zijn geen structurele overeenkomsten met pseudogenen, dus alle genen hebben gemeen dat ze, nou ja, lang zijn, dus tegen dat idee zou ik zeggen: "Zo lang!"

Hoe kijken de genoomannotators hier tegenaan?

De mensen die de regels maken, de facto - en ze herzien naarmate de wetenschap vordert - zijn degenen die de sequentie van genomen annoteren. Ik heb geen algemeen overzicht van genomen gemaakt, en beperk me tot het genoom van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, waarmee ik vertrouwd ben. het onderscheidende Biotypen voor genen in de gegevens bij FlyBase zijn momenteel (2019) als volgt:

  • ncRNA (ook bekend als lncRNA)
  • eiwit codering
  • pseudogen
  • snRNA
  • tRNA
  • rRNA
  • snoRNA
  • pre miRNA

Ik vermoed dat dit standaard is bij de grote genoomdatabases, en dat is te zien pseudogen en ncRNA worden als aparte categorieën beschouwd.

Natuurlijk kan men tegen deze classificatie ingaan - waar zijn bijvoorbeeld de SINES en LINES en Drosophila-specifieke mobiele elementen? Maar dat illustreert slechts wat ik hierboven heb geschreven.


DUXAP8, een van pseudogen afgeleid lncRNA, bevordert de groei van pancreascarcinoomcellen door CDKN1A en KLF2 epigenetisch tot zwijgen te brengen

Recente studies benadrukken van pseudogenen afgeleide lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) als belangrijke regulatoren van kankerbiologie. Weinigen van hen zijn echter goed gekarakteriseerd bij alvleesklierkanker. Hier wilden we de associatie identificeren tussen van pseudogen afgeleid lncRNA DUXAP8 en groei van alvleesklierkankercellen.

Methoden:

We screenden op pseudogen-afgeleide lncRNA's geassocieerd met menselijke alvleesklierkanker door vergelijkende analyse van drie onafhankelijke datasets van GEO. Kwantitatieve real-time reverse transcriptie polymerase kettingreactie werd gebruikt om de relatieve expressie van DUXAP8 in alvleesklierkanker weefsels en cellen te beoordelen. Loss-of-function benaderingen werden gebruikt om de mogelijke functionele rollen van DUXAP8 in proliferatie van pancreaskankercellen en apoptose in vitro en in vivo te onderzoeken. RNA-immunoprecipitatie, chromosoom-immunoprecipitatie-assay en reddingsexperimenten werden uitgevoerd om de associatie van DUXAP8 met doeleiwitten en genen in pancreaskankercellen te analyseren.

Resultaten

Pancreaskankerweefsels hadden significant hogere DUXAP8-niveaus dan aangrenzende normale weefsels. Hoge DUXAP8-expressie was geassocieerd met een grotere tumorgrootte, een gevorderd pathologisch stadium en een kortere algehele overleving van patiënten met pancreaskanker. Bovendien remde het tot zwijgen brengen van DUXAP8-expressie door siRNA of shRNA de proliferatie van pancreaskankercellen en bevorderde het apoptose in vitro en in vivo. Mechanistische analyses gaven aan dat DUXAP8 de proliferatie van pc-cellen reguleert, deels door downregulatie van de expressie van tumorsuppressor CDKN1A en KLF2.

Conclusie

Onze resultaten suggereren dat tumorexpressie van van pseudogen afgeleid lncRNA DUXAP8 een belangrijke rol speelt bij de progressie van alvleesklierkanker. DUXAP8 kan dienen als een kandidaat-biomarker en een nieuw therapeutisch doelwit van pancreaskanker vertegenwoordigen.


Invoering

Colorectaal carcinoom (CRC) is een veelvoorkomend type kanker in Amerika en China en vormt dus een groot probleem voor de volksgezondheid 1, 2 . Het is verantwoordelijk voor meer dan 9% van alle incidentie van maligniteiten, met naar schatting 1,4 miljoen gevallen die zich in 2012 wereldwijd voordeden 3, 4 . Bovendien zal de wereldwijde last naar verwachting verder toenemen als gevolg van de groei en vergrijzing van de bevolking en de adoptie van verwesterd gedrag en levensstijl 3 . Colorectale carcinogenese is een gecompliceerd biologisch proces dat het gevolg is van de ontregeling van veel kankergerelateerde genen. Daarom is een beter begrip van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling en progressie van colorectale kanker essentieel om gerichte strategieën te ontwikkelen die de last van de ziekte kunnen verlichten.

In het afgelopen decennium is de betekenis van niet-eiwitcoderende functionele elementen in het menselijk genoom uit het water naar voren gekomen en geïdentificeerd als een belangrijke openbaring in de postgenomische biologie 5,6,7 . Onlangs werden tienduizenden pseudogenen en talrijke lange niet-coderende RNA-genen (lncRNA) geïdentificeerd 8, 9 . Kort gezegd, pseudogenen zijn de resultaten van gedupliceerde genen, die hun eiwitcoderende capaciteit hebben verloren door moleculaire gebeurtenissen zoals punt- of frameshift-mutaties 8 . Interessant is dat het duidelijk wordt dat veel pseudogenen worden getranscribeerd in lange niet-coderende RNA's, met bewezen biologische functies 10 . Ze spelen een overvloed aan rollen op meerdere niveaus (DNA, RNA of eiwit) in diverse pathologische processen, vooral bij carcinogenese 11, 12 . In de recent gerapporteerde studie van Ma H en collega's kan het pseudogen dat is afgeleid van lang niet-coderend RNA DUXAP8 de proliferatie van maagkankercellen en tumorigenese bevorderen door PLEKHO1-transcriptie epigenetisch tot zwijgen te brengen 13 . Bovendien bleek het door pseudogen tot expressie gebrachte lncRNA RSU1P2 significant opgereguleerd te zijn bij baarmoederhalskanker en functioneerde het als een oncogen in baarmoederhalskankercellen 14 . Daarom zijn door pseudogen tot expressie gebrachte lncRNA's gemarkeerd als sleutelfactoren in kankeronderzoek.

Van DUXAP10 is eerder gevonden dat het tot overexpressie wordt gebracht in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) en bevordert de proliferatie van NSCLC-cellen. De biologische functies en het onderstrepingsmechanisme van DUXAP10 bij de controle van CRC-tumorigenen zijn echter niet gedocumenteerd. Deze hebben ons ertoe aangezet om de rol van DUXAP10 in menselijke CRC 15 te onderzoeken. In de huidige studie hebben we onderzocht dat door pseudogen tot expressie gebracht lncRNA DUXAP10 afwijkend tot expressie werd gebracht in CRC en positief geassocieerd was met tumorgrootte, pathologisch stadium en lymfatische metastase. Bovendien onthulde functionele analyse dat DUXAP10 de groei van CRC-cellen zowel zou kunnen bevorderen in vitro en in vivo. Mechanismestudies gaven aan dat DUXAP10 een oncogeen pseudogen tot expressie gebracht lncRNA is dat tumorigenese bevordert door epigenetisch de expressie van p21 en PTEN tot zwijgen te brengen.


Invoering

Pseudogenen zijn genomische sequenties met een hoge sequentie-overeenkomst met functionele genen, maar waarvan wordt aangenomen dat ze "niet-functioneel" zijn [1]-[3]. Per definitie hebben pseudogenen die zijn afgeleid van eiwitcoderende genen hun eiwitcoderende capaciteit verloren als gevolg van schadelijke verstoringen (bijv. Voortijdige stopcodons of frameverschuivingsmutaties) in hun hypothetische open leesramen. Op basis van verschillende generatiemechanismen worden pseudogenen gescheiden in bewerkte pseudogenen (gegenereerd door retrotranspositie) en gedupliceerde pseudogenen (van genduplicatie). Deze scheiding is voornamelijk gebaseerd op onderzoek van sequentiekenmerken, met het ontbreken van introns als sterk bewijs voor retrotranspositie, terwijl oudere pseudogenen met uitgebreide structuurdegeneratie soms worden geclassificeerd als pseudogenefragmenten vanwege ambiguïteit. Het functionele gen met de "hoogste" sequentieovereenkomst met een pseudogen wordt vaak operationeel aangeduid als het oudergen, dat ook in de huidige studie wordt gebruikt.

Duizenden pseudogenen worden gevonden in het menselijk genoom, van sommigen is gesuggereerd dat ze kritische regulerende functies hebben [4]-[7]. Historisch gezien worden pseudogenen beschouwd als grotendeels transcriptioneel inactief omdat ze vermoedelijk ofwel een functionele promotor of ondersteunende regulerende elementen missen. Recente studies hebben echter aangetoond dat een aanzienlijk deel van de pseudogenen daadwerkelijk kan worden getranscribeerd naar stabiele RNA's [8]–[12]. Bovendien suggereren steeds meer bewijslijnen dat pseudogenen, via hun niet-coderende RNA-producten (ncRNA), kunnen een regulerende rol spelen bij het moduleren van de expressie van hun ouderlijke genen, evenals niet-ouderlijke genen [1], [3], [13]-[21]. Bijvoorbeeld, korte interfererende RNA's (siRNA's) afgeleid van pseudogenen, door hun complementaire interacties met mRNA's van de ouderlijke genen, bleken de ouderlijke genexpressie in muizeneicellen neerwaarts te reguleren door een Dicer-afhankelijk RNAi-proces [22], [23]. Onze recente analyse van miljoenen kleine RNA's uit meerdere rijstweefsels ondersteunt ook het idee dat hoge eukaryote pseudogenen endogene siRNA's (endo-siRNA's) kunnen produceren die meestal weefsel- en ontwikkelingsstadiumspecifiek zijn [24]. Bovendien delen veel van die pseudogen-afgeleide endo-siRNA's vergelijkbare kenmerken met plant-herhalings-geassocieerde siRNA's die RNA-gerichte DNA-methylatie en heterochromatine-vorming kunnen mediëren [24]. Of zoogdierlijke pseudogenen een vergelijkbare rol kunnen spelen bij het moduleren van epigenetische repressie op pseudogene loci (d.w.z. cis-effect) is nog niet onderzocht, hoewel trans-effecten zijn gesuggereerd. Bijvoorbeeld de 4 okt Van pseudogeen ncRNA werd aangetoond dat het epigenetische hermodelleringscomplexen naar de 4 okt oudergen [25].

Pseudogene transcripten die door andere mechanismen werken, zijn ook gerapporteerd [8], [14], [19], [20], [26]-[29], waaronder het optreden als antisense-transcripten [25], [30]. PTENP1, een pseudogen afgeleid van het tumorsuppressorgen PTEN, werd voor het eerst aangetoond dat het werkt als een competitieve lokvogel voor verschillende miRNA's die zich richten op PTEN-mRNA, waardoor de expressie van zijn ouderlijke PTEN gen [28]. De recente ontdekking van antisense ncRNA's van PTENP1 en hun rol bij het reguleren PTEN [31] geeft bovendien aan dat functionele interactie tussen pseudogenen en hun ouders complex en meerlagig kan zijn. Gezien het brede scala aan biologische functies die mogelijk worden uitgevoerd door ncRNA's [32]-[34], en de hoge sequentieovereenkomst tussen pseudogenen en hun eiwitcoderende paralogen, is het denkbaar dat pseudogen-afgeleide ncRNA's ook een verscheidenheid aan moleculaire en cellulaire effecten op normale celgroei, menselijke ziekten en kanker [12], [19], [35]-[37].

In deze studie hebben we het landschap van pseudogene transcriptie over een groot aantal menselijke weefsels en cellijnen onderzocht en zijn we begonnen met het onderzoeken van mogelijke functionele en cellulaire activiteiten van pseudogene ncRNA's vanuit verschillende perspectieven. We ontdekten dat een paar duizend menselijke pseudogenen werden getranscribeerd en dat hun transcriptie over het algemeen gecorreleerd was met verhoogde expressieniveaus en expressiediversiteit van hun ouderlijke genen. Sommige pseudogenen vertoonden daarentegen bewijs van siRNA-productie en -functie, mogelijk door te interfereren met ouderlijke genexpressie of door lokale epigenetische silencing te bemiddelen. Samengevat suggereren onze resultaten dat pseudogene transcriptie waarschijnlijk een belangrijk proces is dat nieuwe ncRNA-elementen heeft opgeleverd voor het moduleren van de transcriptionele fluctuatie van eiwitcoderende genen.


Resultaten

Identificatie van lncRNA die worden gereguleerd door TNFα

We veronderstelden dat NF-KB de expressie van lncRNA's reguleert, net zoals het de expressie van coderende genen en microRNA's reguleert (Boldin en Baltimore, 2012). Om te bepalen of NF-KB de expressie van lncRNA's reguleert, voerden we gepaarde-end directionele RNA-seq uit op wildtype (WT) MEF's vóór behandeling en na behandeling gedurende 1, 5, 6 en 24 uur met 20 ng / ml TNFa. Gemiddeld werden voor elke behandelingsconditie meer dan 20 miljoen reads toegewezen aan het muisgenoom (mm9-assemblage) (aanvullend bestand 1A). Eerst werden de uitlezingen toegewezen aan het mm9-referentiegenoom van de muis met behulp van TopHat (Trapnell et al., 2009). Met behulp van een intern gegenereerd script, werden door RefSeq en Ensemble geannoteerde transcripties verkregen in de vorm van RPKM (aflezingen per kilobase van exonmodel per miljoen) en die transcripten met ten minste een tweevoudige verandering in expressie en een gemiddelde RPKM > 1, als significant werden gedefinieerd. Op referentie gebaseerde de novo transcriptoomassemblage van in kaart gebrachte reads werd uitgevoerd met behulp van twee methoden. Raw reads werden in kaart gebracht met behulp van TopHat en de novo transcriptoomassemblage van toegewezen reads werd uitgevoerd met behulp van, Cufflinks (Trapnell et al., 2010) en de Schrift (Guttman et al., 2010) parallel. Met RefSeq en Ensemble geannoteerde transcripties werden gedownload van de UCSC-tabelbrowser, en deze geannoteerde transcripties werden gefilterd uit de Schrift en manchetknopen-geassembleerde transcriptomen om ongeveer 1500 nieuwe de novo isovormen op te leveren die worden uitgedrukt met een RPKM > 1. Omdat veel isovormen zijn toegewezen aan een enkele locus hebben we de lijst met nieuwe transcripten verder gefilterd door promotorregio's toe te passen zoals gedefinieerd door H3K4me3 via chromatine-immunoprecipitatie-sequencing (ChIP-Seq), wat 184 nieuwe loci opleverde. Om de kandidaat-transcripten verder te verfijnen, hebben we de onbewerkte reads geëxtraheerd die zijn toegewezen aan die 184 loci, een de novo transcript-assemblage verwerkt via Trinity (Grabherr et al., 2011) en de Coding Potential Calculator (CPC) -score van elk transcript bepaald (Kong et al., 2007) om 64 nieuwe de novo lncRNA's te identificeren (Figuur 1A, aanvullend bestand 1B).

TNFa reguleert de transcriptie van veel coderende en niet-coderende genen.

(EEN) Workflow voor strategie voor ontdekking van door NF-KB gereguleerde lncRNA's. (B) 3596 RefSeq-eiwitcoderende genen worden gereguleerd door TNFa. Waarden worden genormaliseerd naar het tijdstip van 0 uur. (C) 244 RefSeq-ncRNA's worden gereguleerd door TNFa. (NS) 64 de novo lncRNA's worden gereguleerd door TNFa. (E) De fractie van alle RefSeq-ncRNA's voor elke transcriptieklasse. (F) 54 pseudogene lncRNA's worden gereguleerd door TNFa.

Op deze manier werden in deze experimenten 3596 eiwitcoderende transcripten, 244 ncRNA's en 64 de novo lncRNA's gedetecteerd. Veel RefSeq-eiwitcoderende genen waarvan is aangetoond dat ze worden gereguleerd door NF-KB, werden geïnduceerd door TNFα, waaronder Gadd45b, Sod2, Nfkbia, Relb, Cdkn2a, en Il6. Bovendien toonden de RNA-seq-gegevens het verwachte oscillerende genexpressiepatroon van NF-KB-afhankelijke genexpressie, en met name het dynamische bereik door RNA-seq is groter dan eerder waargenomen met microarrays (Kawahara et al., 2011). Interessant is dat de 244 RefSeq-ncRNA's een vergelijkbaar expressiepatroon vertoonden als de eiwitcoderende genen, waarbij piekexpressie- of repressieniveaus werden waargenomen op 1, 5 en 24 uur na stimulatie. Een subset vertoonde ook maximale repressie na 6 uur in beide klassen. 84 ncRNA's waren ten minste twee keer opgereguleerd in vergelijking met onbehandeld op ten minste één tijdstip. Daarentegen werd de overgrote meerderheid (59 van de 64) van de novo lncRNA's voornamelijk onderdrukt na behandeling met TNFα (Figuur 1B-D, aanvullend bestand 1B-D). Een vergelijkbaar resultaat waarbij de meeste de novo lncRNA's na de behandeling omlaag werden gereguleerd, werd waargenomen als reactie op oestrogeen in borstkankercellen (Hah et al., 2011).

Vervolgens verdeelden we de RefSeq-ncRNA's door hun RefSeq-annotatie in vier klassen, pri-miRNA's (40%), RNaseP, SnoRNA, ScaRNA (19%), pseudogene lncRNA (22%) en geannoteerde lncRNA's (19%) (Figuur 1E) . Interessant genoeg werden slechts 11 van de 96 pri-miRNA's opgereguleerd met TNFa-behandeling. Daarentegen waren ongeveer 23 van de 45 huishoud-RNA's (RNaseP, scaRNA, snoRNA) en 37 van de 54 pseudogene lncRNA's opgereguleerd. Ten slotte werden 12 van de 48 geannoteerde lncRNA's opgereguleerd, wat een weerspiegeling is van wat we zien in de de novo lncRNA's. Om de pseudogene component van de lncRNA's verder te onderzoeken, hebben we een heatmap van pseudogene lncRNA gemaakt en hetzelfde oscillerende genexpressiepatroon waargenomen dat werd waargenomen in de eiwitcoderende genen (Figuur 1F en aanvullend bestand 1E). We hebben vastgesteld dat het pseudogen Rps15a-ps4 (hierna Lethe genoemd) de hoogste expressieveranderingen had van alle pseudogenen met een RPKM > 1. Bovendien zagen we dat Gapdh had zeven pseudogenen die werden geïdentificeerd als geïnduceerd door TNFα, maar we konden dit resultaat niet valideren met qRT-PCR.

We selecteerden Refseq-genen met significante differentiële expressie in het tijdsverloop (FDR < 0, 05, SAMseq) en varieerden met ten minste twee keer, wat 3690 significante transcripten opleverde (aanvullend bestand 1F). We organiseerden hun patronen van tijdelijke expressie door middel van hiërarchische clustering op het gemiddelde (Figuur 1 - figuur supplement 1), en bepaalden welke lncRNA's geclusterd waren met bekende NF-KB-gereguleerde genen. Uit onze lijst hebben we ervoor gekozen om Cox2 Divergent, Gp96 Convergent, H2-T23/24AS, HoxA11AS, Lethe, Pbrm1 Convergent, Schrift 16.612 en Schrift 60.588 te valideren en verder te karakteriseren.

LncRNA's onderscheiden verschillende ontstekingsstimuli

Onze directionele RNA-Seq-gegevens met gepaarde uiteinden onthulden TNFa-regulatie van veel lncRNA-transcripten, waaronder divergente, antisense, convergente en intergene transcripten. Omdat de functionele relatie tussen genomische organisatie en expressie onbekend is, hebben we ervoor gekozen om de expressie van lncRNA's te valideren en verder te karakteriseren naast het dichtstbijzijnde eiwitcoderende gen onder een verscheidenheid aan verschillende stimuli door qRT-PCR. In onze subset van lncRNA's vonden we dat de meeste lncRNA's samen met hun eiwitcoderende gen worden gereguleerd. Dit is niet verrassend, aangezien we ervoor hebben gekozen om lncRNA's te valideren die dicht bij genen lagen die werden gereguleerd door TNFa. Een opmerkelijke uitzondering was Lethe. Hoewel de Lethe tot expressie wordt gebracht uit dezelfde streng als Gmeb1 en dicht bij het 3′-eindpunt van Gmeb1, qRT-PCR toonde aan dat Lethe specifiek werd geïnduceerd door TNFa en IL-1β, terwijl Gmeb1 expressie veranderde niet significant, wat bevestigt dat de Lethe geen uitbreiding is van de 3 'UTR van Gmeb1 (Figuur 2A).

LncRNA's maken onderscheid tussen verschillende stimuli en worden gereguleerd door NF-KB.

(EEN) Validatie van de expressie van lncRNA's naast het dichtstbijzijnde eiwitcoderende gen onder een verscheidenheid aan verschillende stimuli door qRT-PCR. Genomische organisatie wordt hieronder getoond. MEF's werden gedurende 0 en 6 uur behandeld met 20 ng/ml TNFa. Kwantitatieve Taqman real-time RT-PCR van de aangegeven RNA's is genormaliseerd naar Actine-niveaus (gemiddelde ± SD). (B) LncRNA's worden gereguleerd door RelA. qRT-PCR in WT en RelA−/− nestgenootcellen onder verschillende stimuli. MEF's werden gedurende 0 en 6 uur behandeld met 20 ng/ml TNFa. Kwantitatieve Taqman real-time RT-PCR van de aangegeven RNA's is genormaliseerd naar Actine-niveaus (gemiddelde ± SD). (C) Endogeen RelA wordt gerekruteerd voor de promotors van lncRNA's. MEF's werden gedurende 0 en 15 minuten behandeld met 20 ng/ml TNFa. ChIP met α-RelA-antilichamen werd uitgevoerd en RelA-percentageverrijking ten opzichte van invoer wordt getoond (gemiddelde ± SD, Nkfbia, p<0.0518 Gp96 convergent, p<0.007 Lethe, p<0,002). (NS) LncRNA's worden door de hele cel aangetroffen. Cellulaire fractionering werd uitgevoerd en de fractie gevonden in het chromatine, de kern en het cytoplasma wordt getoond. MEF's werden gedurende 6 uur behandeld met 20 ng/ml TNFa. Kwantitatieve Taqman real-time RT-PCR van de aangegeven RNA's wordt weergegeven (gemiddelde ± SD wordt weergegeven). (E) LncRNA's worden gevonden op het chromatine. MEF's werden gedurende 6 uur behandeld met 20 ng/ml TNFa. RNA-IP met α-H3-antilichamen werd uitgevoerd. RNA werd geïsoleerd en kwantitatieve Taqman real-time RT-PCR van de aangegeven RNA's wordt getoond (gemiddelde ± SD, Lethe p<0.004).

NF-KB-signalering kan worden gestart als reactie op veel verschillende stimuli, waaronder in reactie op pro-inflammatoire cytokines zoals TNFα en IL-1β, evenals in reactie op microbiële componenten via de TLR-familie (Hayden en Ghosh, 2012). Daarom hebben we onze lncRNA-kandidaten gevalideerd als reactie op TNFα, IL-1β en agonisten van Toll-achtige receptoren (TLR) 1, 2, 3, 4 of 7 (Figuur 2A-B). TLR's zijn patroonherkenningsreceptoren voor pathogene componenten van bacteriën, schimmels of virussen, en spelen een sleutelrol bij het beheersen van de aangeboren en adaptieve immuniteit (Kawai en Akira, 2010). We hebben inderdaad gevonden dat veel van de lncRNA's worden opgereguleerd als reactie op verschillende stimuli. Het meest opvallende is dat Cox2 Divergent wordt opgereguleerd als reactie op pro-inflammatoire cytokinen en TLR1-4-agonisten. Daarentegen wordt Gp96 Convergent alleen tot expressie gebracht in reactie op TNFa. H2-T32/24AS reageert alleen op TNFα- en TLR3-agonisten, terwijl HoxA11AS tot expressie wordt gebracht als reactie op TLR3-agonisten en in feite neerwaarts wordt gereguleerd door TNFa-stimulatie. Lethe wordt opgereguleerd als reactie op de pro-inflammatoire cytokinen TNFa en IL-1β, maar niet op TLR-agonisten, wat aangeeft dat het een functie kan hebben bij ontstekingen, maar niet bij de natuurlijke immuniteit. Pbrm1 Convergent wordt sterk opgereguleerd als reactie op IL-1β, en in mindere mate TNFα, en TLR4- en 7-agonisten. Deze resultaten tonen aan dat lncRNA's dynamisch en specifiek worden gereguleerd als reactie op verschillende stimuli, wat suggereert dat het patroon van lncRNA's kan dienen als een interne weergave van de blootstelling van een cel aan verschillende inflammatoire en pathogene signalen.

LncRNA's worden direct gereguleerd door NF-KB

Vervolgens wilden we bepalen of de lncRNA's direct werden gereguleerd door NF-KB. Om deze vraag te beantwoorden, hebben we twee verschillende methoden gebruikt. Eerst hebben we qRT-PCR uitgevoerd in RelA−/− nestgenootcellen naast WT-cellen (Figuur 2-figuursupplement 1). Cox2 Divergent wordt drastisch opgereguleerd als reactie op pro-inflammatoire cytokines en TLR1-4-agonisten in WT en in nog grotere mate in RelA−/−-cellen die aangeven dat het niet direct wordt gereguleerd door NF-KB-component RelA. Bovendien laten HoxA11AS, H2-T23/24AS, Gp96 Convergent en Schrift 16.612 allemaal enige inductie zien in RelA−/−-cellen. Daarentegen is inductie van Lethe, Pbrm1 Convergent en de Schrift 60.588 grotendeels ingetrokken in RelA−/−-cellen, wat aangeeft dat RelA nodig is om deze lncRNA's te induceren (Figuur 2B). Ten tweede voerden we RelA-chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) uit in WT MEF's. Na TNFa-signalering bleek RelA te binden aan de promotors van Nfkbia, Gp96 Convergent en Lethe, maar werd niet gedetecteerd op de promotors van Cox2 Divergent of Pbrm1 Convergent, of Dll1, een negatieve controle (Figuur 2C). Deze resultaten geven aan dat Lethe en Gp96 Convergent direct transcriptionele doelen van RelA zijn, waarbij Lethe in het bijzonder afhankelijk is van RelA voor inductie.

Lethe lncRNA is grotendeels nucleair en op chromatine

Om te bepalen waar onze kandidaatgenen zich in de cel bevinden, voerden we gedurende 6 uur subcellulaire fractionering uit op cellen die waren gestimuleerd met TNFa. We vonden dat de subcellulaire distributie van TNFa-geïnduceerde lncRNA's op een transcript-specifieke manier varieert. Gapdh werd getest als een controle en bleek gelijkmatig verdeeld te zijn tussen de kern en het cytoplasma met weinig transcript op het chromatine. Evenzo waren Cox2 Divergent, Gp96 Convergent en H2-T23/24AS gelijkmatig verdeeld tussen kern en cytoplasma. HoxA11AS was meestal nucleair met enig transcript gevonden in het cytoplasma, maar niet op het chromatine. Interessant is dat Lethe, Pbrm1 Convergent, Schrift 16.612 en Schrift 60.588 voornamelijk op het chromatine werden gevonden, met een kleinere fractie in de kern. Deze resultaten geven aan dat Lethe, Pbrm1, Schrift 16.612 en Schrift 60.588 direct betrokken kunnen zijn bij genregulatie door interactie met het chromatine (Figuur 2D). Om verder te bepalen of het het ontluikende transcript of het verwerkte transcript is dat op het chromatine wordt gevonden, hebben we polyA-selectie uitgevoerd op onze subcellulaire fracties en de resultaten geanalyseerd met qRT-PCR. Interessant is dat gepolyadenyleerd Lethe-RNA nog steeds bij voorkeur wordt geassocieerd met chromatine in vergelijking met twee controle-mRNA's, Actine en Nfkbia (Figuur 2-figuursupplement 1), wat aangeeft dat Lethe van volledige lengte is geassocieerd met chromatine. Ten slotte hebben we H3-RNA-immunoprecipitatie (RIP) uitgevoerd om direct te testen of lncRNA's op het chromatine worden gevonden nadat cellen gedurende 6 uur met TNFa waren gestimuleerd. We ontdekten dat Lethe en Pbrm1 Convergent beide worden gevonden op het chromatine, terwijl Cox2 Divergent en Gp96 Convergent niet werden gedetecteerd, wat onze fractioneringsresultaten bevestigt (Figuur 2E). Resultaten uit figuur 2 zijn samengevat in tabel 1.

Classificatie van door TNF gereguleerde lncRNA's

TNFαIL-1βTLR1TLR2TLR3TLR4TLR5TLR7RelA-depH3-RIP
Cox2 Divergent++++++z.d.z.d.z.d.
Gp96 convergent+z.d.z.d.z.d.z.d.z.d.z.d.z.d.+z.d.
H2-T23/24AS+z.d.z.d.z.d.+z.d.z.d.z.d.
HoxA11AS+
Lethe++++
Pbrm1 convergent+++−/++
Schrift 16.612+++z.d.nt
Schrift 60.588z.d.nt

Deze resultaten tonen aan dat lncRNA's worden gereguleerd door diverse en specifieke stimuli. Bovendien worden lncRNA's direct gereguleerd door NF-KB. Ten slotte varieert de subcellulaire distributie van TNFa-geïnduceerde lncRNA's per transcript. n.d., niet detecteerbaar. n.t., niet getest.

Lethe is een pseudogen van Rps15a

Aangezien Lethe een Rps15a-pseudogen is, wilden we bepalen of er andere pseudogenen zijn die direct door TNFα worden gereguleerd. We hebben Taqman-probes verkregen tegen niet-repetitieve sequenties die uniek zijn voor elk pseudogenlid, en onderzochten Rps15a-pseudogene-familieleden evenals Rps15a om te bepalen of ze worden gereguleerd door TNFα (Figuur 3A, Figuur 3 - figuursupplement 1). qRT-PCR-analyse toonde aan dat: Nfkbia (een positieve controle) wordt dynamisch gereguleerd als reactie op TNFa, net als Lethe. Rps15a en Rps15a-ps6, een ander Rps15a-pseudogen lncRNA, worden beide getranscribeerd maar worden niet gereguleerd door TNFa (Figuur 3B).

Lethe is een pseudogen lncRNAs dat wordt gereguleerd door NF-KB, Glucocorticoid Receptor en bij veroudering.

(EEN) Genstructuur, homologie en Taqman-probe-ontwerp van Rps15a en pseudogene familieleden. (B) Lethe wordt geïnduceerd door TNFa, maar andere familieleden niet. MEF's werden gedurende 0 en 1,5 uur behandeld met 20 ng/ml TNFa. Kwantitatieve Taqman real-time RT-PCR van de aangegeven RNA's wordt getoond genormaliseerd naar Actine-niveaus (gemiddelde ± SD, p<0.012). (C) Genomische organisatie van Lethe met RNA-Seq-gegevens op tijdstip 0, 1,5, 6 en 24 uur na TNFa-behandeling. Lethe bevindt zich op muischromosoom 4 tussen Gmeb1 en Ythd2. Gmeb1 en Ythd2 worden niet geïnduceerd door TNFa-stimulatie. (NS) Lethe wordt geïnduceerd door behandeling met dexamethason, maar niet door andere nucleaire hormoonreceptoragonisten. MEF's werden behandeld met ofwel 10 nM vitamine D, 100 nM methyltrienolone, 100 nM estradiol of 1 uM dexamethason gedurende 0 en 6 uur. Kwantitatieve Taqman real-time RT-PCR van de aangegeven RNA's wordt getoond genormaliseerd naar Actine-niveaus (gemiddelde ± SD, p<0.003). (E) Lethe wordt naar beneden gereguleerd bij oude muizen. Lethe komt tot expressie in jonge milt van mannelijke en vrouwelijke muizen. Voor elk geslacht en tijdstip werden vijf muizen gebruikt. Kwantitatieve Taqman real-time RT-PCR van de aangegeven RNA's wordt getoond genormaliseerd naar Actine-niveaus (gemiddelde ± SD, Lethe p<0.001, Gmeb1 p<0.003). ANOVA-analyse werd uitgevoerd om de significantie te bepalen.

Lethe is 697 bp lang niet-gesplitst lncRNA, en zijn locus op chromosoom vier ligt ongeveer 500 bp stroomafwaarts van Gmeb1 en 8 kb stroomopwaarts van Ythdf2 op de min-streng (Figuur 3C). Lethe wordt dramatisch geïnduceerd na TNFa-stimulatie na 1,5 uur en 24 uur en onderdrukt na 6 uur, in een expressiepatroon dat kenmerkend is voor andere NF-KB-gereguleerde transcripten. Belangrijk is dat de expressie van de twee naburige mRNA-genen niet werd veranderd door TNFa-stimulatie (Figuur 3C), wat aangeeft dat Lethe onafhankelijk wordt gereguleerd.

Lethe wordt geïnduceerd door de glucocorticoïde receptor

Het is bekend dat glucocorticoïdreceptor (GR) en NF-KB veel doelwitgensites delen (Rao et al., 2011). Daarom hebben we getest of Lethe kon worden geïnduceerd na stimulatie met een aantal nucleaire hormoonagonisten, waaronder de GR-agonist, dexamethason. We ontdekten dat Lethe wordt opgereguleerd als reactie op ontstekingsremmend middel, dexamethason, maar niet als reactie op andere onderzochte nucleaire hormoonreceptoragonisten, waaronder vitamine D (vitamine D-receptor), methyltrienolon (androgeenreceptor) en estradiol (oestrogeenreceptor) (Figuur 3D). Lethe is dus een pseudogeen lncRNA dat wordt geïnduceerd door zowel ontstekingsstimuli als een ontstekingsremmend middel.

Lethe wordt gedownreguleerd bij oude muizen

Recent werk heeft aangetoond dat het transcriptiefactorbindingsmotief dat het sterkst geassocieerd is met veroudering NF-KB is (Adler et al., 2007). Om te bepalen of Lethe tot expressie wordt gebracht in oud weefsel als gevolg van constante NF-KB-signalering, hebben we een panel van weefsels getest, waaronder lever, long, nier, huid, milt, cortex (hersenen) en skeletspier. Lethe komt tot expressie in mannelijke en vrouwelijke milt, maar is niet detecteerbaar in andere weefsels. Interessant is dat Lethe wordt gedownreguleerd met de leeftijd: respectievelijk 20-voudig en 160-voudig bij mannen en vrouwen (Figuur 3E). Geen van beide Nfkbia noch Gmeb1 expressie verandert met leeftijd of geslacht.

Lethe remt NF-KB-activiteit

We veronderstelden dat Lethe in trans werkt om de NF-KB-functie te reguleren. Daarom hebben we functieverlies-experimenten uitgevoerd en de expressie van canonieke NF-KB-leden gemeten. We gebruikten chemisch gemodificeerde chimere antisense-oligonucleotiden (ASO) waarvan is aangetoond dat ze effectief zijn in het uitschakelen van de expressie van nucleaire ncRNA's (Ideue et al., 2009). ASO-blokkade remde de TNFα-inductie van Lethe en we volgden de inductie van twee NF-KB-doelgenen door qRT-PCR. Nfkbia niveau was significant hoger dan door TNFα gestimuleerde ASO-controle in een van de twee geteste ASO's, terwijl Nfkb2 werd significant geïnduceerd voor beide geteste ASO's (Figuur 4A). Dit resultaat geeft aan dat Lethe kan werken als een repressor van NF-KB-activiteit.

Lethe Bindt aan RelA en remt RelA-bezetting van DNA.

(EEN) Verhoogde expressie van NF-KB-gereguleerde genen in Lethe-knockdown-cellen. Kwantitatieve Taqman real-time RT-PCR van de aangegeven RNA's wordt getoond genormaliseerd naar Actine-niveaus (gemiddelde ± SD, p<0.05 wordt getoond) (B) Lethe remt door TNFa geïnduceerde reportergenexpressie. RLU van 3x-KB reporteractiviteit en mutante reporteractiviteit (gemiddelde ± SD, p<0.05 wordt getoond) in CMV_Lethe getransfecteerde 293T-cellen. Reporterconstructies zijn hierboven schematisch weergegeven. (C) Endogene RelA-rekrutering naar de promotors van doelgenen wordt verminderd in aanwezigheid van Lethe. 293T die CMV_GFP of CMV_Lethe tot expressie brengt, werden gedurende 15 minuten behandeld met 20 ng/ml TNFa. ChIP met α-RelA-antilichamen werd uitgevoerd en RelA-percentageverrijking ten opzichte van invoer wordt getoond (gemiddelde ± SD Il6, p<0.033 Sod2, p<0,001 Il8, p<0.003 Nfkbia, p<0.015). (NS) Lethe bindt aan RelA. MEF's werden gedurende 6 uur behandeld met 20 ng/ml TNFa. RNA-IP met α-RelA-antilichamen werd uitgevoerd. RNA werd geïsoleerd en kwantitatieve Taqman real-time RT-PCR van de aangegeven RNA's wordt getoond (gemiddelde ± SD, p<0.020). (E) Lethe-expressie blokkeert DNA-binding van het RelA-homodimeer aan zijn doelwit. NF-KB EMSA van GFP of Lethe transfecteerde 293T nucleaire extracten behandeld met 20 ng/ml TNFa gedurende 15 minuten. Extracts were pretreated with unlabeled NF-κB (specific) or CREB (nonspecific competitor), or α-RelA antibodies for 15 min prior to incubation with probe. (F) Model for Lethe regulation of gene expression. Upon addition of TNFα or dexamthasone, Lethe is transcribed. Lethe can then bind to RelA–RelA homodimers and block binding to other NF-κB response elements, inhibiting NF-κB.

Conversely, we overexpressed Lethe or GFP in the presence of an NF-κB luciferase reporter gene after TNFα stimulation. Lethe expression, but not GFP expression, repressed NF-κB reporter gene activity. Additionally, Lethe can increase the repression NF-κB luciferase reporter gene expression in a dose dependent manner. To determine if Lethe’s effect on reporter gene activity was specific to NF-κB mediated reporter gene expression, we mutated the κB binding sites out of the reporter plasmid. As expected, the repression was no longer observed, indicating that Lethe requires NF-κB to repress reporter gene expression (Figure 4B).

The TNFα inducible repression of NF-κB luciferase reporter gene expression indicates that Lethe may affect the ability of RelA to bind to target promoters. To test this possibility, 293T cells were transfected with Lethe and ChIP was performed with RelA antibodies or IgG. In response to TNFα, Lethe expression significantly decreased RelA occupancy of several NF-κB target genes including Il6, Sod2, Il8, en Nfkbia (Figure 4C). Immunoblot analysis confirmed that that Lethe does not lower RelA protein level (Figure 4C). These results indicate that Lethe acts to inhibit NF-κB binding to the chromatin.

Lethe Binds to RelA and inhibits RelA occupancy of DNA

We reasoned that Lethe may bind RelA directly. RelA-RIP retrieved Lethe, but not Gapdh in MEFs stimulated with TNFα for 6 hr. Interestingly, other lncRNAs, Cox2 Divergent and Gp96 Convergent did not bind to RelA (Figure 4D). To further explore the relationship between Lethe and RelA, NF-κB DNA binding was assessed by electro mobility shift assays (EMSA). 293T cells were transfected with either CMV_GFP or CMV_Lethe. 48 hours post transfection cells were stimulated with TNFα for 15 min before nuclear lysates were prepared. As expected, TNF-stimulated extracts contained NF-κB activity, which are shifted by radiolabelled NF-κB probes, specifically competed away by cold NF-κB probes, and supershifted by anti-RelA antibody. Notably Lethe expression blocks DNA binding of the RelA homodimer, but not other isoforms (Figure 4E). These results indicate that Lethe may act as an inhibitor of NF-κB by binding directly to the RelA homodimer, and blocking RelA’s ability to bind DNA (Figure 4F).


Dankbetuigingen

F.A.C. is supported by a Special Research Fund (BOF) scholarship of Ghent University (BOF.DOC.2017.0026.01). RC is supported by the Fonds Wetenschappelijk Onderzoek (11Y6218N). T.-W.C. is supported by grants from the Ministry of Science and Technology, Taiwan (MOST-109-2311-B-009 −002). A.U. is supported by research funding from the National Health and Medical Research Council (Australia) and the Leukemia & Lymphoma Society, the Leukemia Foundation and the Snowdome Foundation. GA is supported by a postgraduate scholarship from the Translational Cancer Research Network. M.R.W. and N.P.D. acknowledge support from the National Collaborative Research Infrastructure Strategy program, administered by Bioplatforms Australia. We thank N. Yigit, A. Barr, S. Pathak, L. Way and A. Mai for their contributions in library preparation and A. Yunghans, E. Jaeger and A. Moshrefi for their assistance in library organization and sequencing/tracking/data management. This project was funded by the European Union’s Horizon 2020 Research and Innovation Programme under grant agreements 668858 and 826121 to P.M., P.S. and J. Koster and the Concerted Research Action of Ghent University (BOF/GOA 01G00819) to P.M. and K.B.


4 Discussion

In this study, we identified one up-regulated lncRNA, RACGAP1P, in the breast cancer tissue using LncRNA Expression Microarray, and its high expression was positively correlated with lymph node metastasis, distance metastasis, TNM stage, and shorter survival time. Further experiments showed that the overexpression of RACGAP1P could enhance mitochondrial fission by up-regulating its parental gene RACGAP1 via competitively binding to miR-345-5p and thus increase the invasive ability of breast cancer cells. The results revealed the regulatory mechanism of RACGAP1P in the invasion and metastasis of breast cancer (Fig. 7).

LncRNAs have emerged to exhibit important biological function in cancer development and progression, involving in tumor cell proliferation [ [30] ], metabolism [ [31] ], migration, invasion [ [32] ], and even non-coding RNA transfer [ [33, 34] ]. A previous study showed that overexpression of lncRNA RACGAP1P enhanced cell proliferation and migration, thus promoting hepatocellular carcinoma early recurrence [ [18] ]. Our results demonstrated that the up-regulation of RACGAP1P was a commonly oncogenic event in breast cancer, which is correlated with lymph node metastasis, distance metastasis, TNM stage, and poor prognosis of breast cancer patients. Accordingly, functional experiments in vivo en in vitro confirmed that RACGAP1P promoted breast cancer cell migration, invasion, and metastasis, but had no significant effect on breast cancer cell proliferation. Consistently, we did not observe statistically significant relevance between RACGAP1P and tumor size in 102 breast cancer patients. As for the different effects on cell proliferation in hepatocellular carcinoma and breast cancer, we speculate that it may be due to the heterogeneity of breast cancer. Further investigation in cell biological behaviors involving RACGAP1P is needed.

Mitochondrial fission has been recognized as an important metastatic driver as the fragmentation of mitochondria helps the distribution of mitochondria by subcellular trafficking to the leading edge of migrating direction where energy is highly demanded to form lamellipodia during the process of migration and subsequent invasion [ [35] ]. Mitochondrial fragmentation is mainly regulated by the dynamin 1-like protein (Drp1). Overexpression or enhanced activation of Drp1 mediates the mitochondrial fission in metastatic breast cancer [ [25] ], pancreatic cancer [ [9] ], and glioblastoma cells [ [36] ]. Drp1 activity is mainly regulated by post-translational modifications, phosphorylation at serine (Ser) 616 residue site [ [37] ]. Moreover, several studies also showed that lncRNAs might play roles in mitochondrial function [ [38-40] ]. In this study, we found that the overexpression of RACGAP1P led to increased phosphorylation of Drp1-S616 and promoted mitochondrial fission. While mitochondrial fission inhibitor Mdivi-1 could diminish the invasive ability of RACGAP1P overexpression cells. Collectively, RACGAP1P promoted mitochondrial fission, which is required for breast cancer cell invasion via Drp1 activity enhancement.

Accumulating evidence suggests that RNA crosstalk plays a vital role in gene regulatory networks, and is implicated in cancer [ [41] ]. Pseudogenes are relicts of parental genes that lost the function of encoding for full-length functional proteins during the evolutionary process [ [42] ]. Considering the homolog of pseudogenes with parental genes, pseudogenes have defined roles in regulating the expression of the parental genes through sequestering common miRNAs and releasing expression inhibition [ [43] ]. According to the NCBI database, RACGAP1P is the pseudogene of RACGAP1. Notably, RACGAP1P co-expressed with RACGAP1 in breast cancer. Further experiments showed that RACGAP1P could regulate RACGAP1 expression by endogenously competitive binding with miR-345-5p. Previous studies demonstrated that RACGAP1 was a cancer-promoting gene overexpressed in various cancers [ [44-46] ]. Importantly, RACGAP1 was identified as a metastatic driver in uterine carcinosarcoma [ [47] ]. Besides, RACGAP1 was also considered as a poor prognosis marker in high-risk early breast cancer [ [48] ]. Consistent with these findings, we found that RACGAP1 could induce breast cancer cell invasion.

A great many of studies demonstrated RACGAP1 could enhance the phosphorylation level of Erk and activate Rho/Erk signaling [ [18, 49, 50] ]. Interestingly, the MAPK signal pathway was reported to be involved in mitochondrial fission that Erk1/2 could phosphorylate Drp1 on Ser616 [ [9] ]. Combined with our results, we speculate that RACGAP1P could promote mitochondrial fission through RACGAP1/Erk /Drp1 signaling axis.


Nuclear Factor κB Signaling and Its Related Non-coding RNAs in Cancer Therapy

Xiaomin Liu , . Zhongliang Ma , in Molecular Therapy - Nucleic Acids , 2020

Other ncRNAs and NF-κB Signal Transduction

lncRNA has been found to play a vital part in pathological and physiological processes, containing tumor formation and metastasis. Different lncRNAs have different molecular mechanisms that play different biological functions. 81 The activation of NF-κB is also related with lncRNA.

Tumor-associated NF-κB activation and lncRNA overexpression are most directly related to the inhibition of IκB, which acts as a negative regulator of NF-κB signaling. Liu et al. 82 found that NKILA (NF-κB interacting lncRNA) binds to NF-κB, which is upregulated by inflammatory factors in breast cancer. NKILA inhibits activation of the NF-κB signaling pathway by masking the location of phosphorylation of IκB for IKK phosphorylation suppression. Further studies revealed that there are two hairpin structures, A and B, at 300–500 nt of NKILA. Hairpin A binds to the DNA-binding region of NF-κB, and hairpin B binds to S51-R73 of p65, preventing IκBα detachment that forming a stable NKILA/NF-κB/IκBα complex. Yang et al. 83 found that FTH1P3 (long non-protein coding RNA ferritin heavy chain 1 pseudogene 3) regulated metastasis and invasion through SP1 (specificity protein 1)/NF-κB (p65) in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). The mechanism of lncRNAs has been studied. A deeper understanding of the molecular mechanisms and biological functions of lncRNA will help to find new effective anticancer strategies in tumorigenesis.

miRNAs and lncRNAs have been demonstrated to play an irreplaceable role in the NF-κB signaling pathway. In addition, other types of ncRNAs, such as circRNA and piRNA, are also involved in the regulation of tumor-associated signaling pathways. Studies have shown that miR-7 sponge circRNA (ciRS-7) has more than 70 conserved miR-7 binding sites, which can effectively sponge miR-7 and suppress the inhibition of miR-7 target genes, promoting the correlation of gene expression and activating NF-κB signaling pathways. 84 , 85 There are few reports on piRNA in cancer. Leng et al. 86 found that piR-DQ590027, miR-377, and miR-153 in glioma-conditioned endothelial cells (GECs) had lower expression. piR-DQ590027 bound to MIR17HG. FOXR2 was a downstream target of miR-377 and miR-153. This study proved that the piR-DQ590027/MIR17HG/miR-153(miR-377)/FOXR2 pathway plays a crucial role in regulating the permeability of glioma-conditioned normal blood-brain barrier (BBB). Another study has shown that piR-021285 can induce the methylation of genes in breast cancer. 87 The roles of these ncRNAs in tumors remain to be further explored.


Discussie

Recently, pseudogenes have emerged as new players in tumour biology 5,10 . However, a crucial question remains unclear: does pseudogene expression, as a whole, represent a biologically meaningful dimension that can characterize tumour heterogeneity and provide clinical applications? Here, we performed a Pan-Cancer analysis of pseudogene expression for what is, to our knowledge, the largest number of cancer patient samples (

3,000) in one such analysis. Utilizing TCGA patient cohorts with a sufficient sample size, we show the predictive power of pseudogene expression in classifying established tumour types and the high concordance of tumour subtypes based on pseudogene expression with other molecular subtypes as well as clinically established biomarkers (such as ER and PR status in breast cancer). It should be emphasized that a large number of tumour lineage-specific pseudogenes identified through between-disease comparisons 10 do not imply our findings through the within-disease analyses. Because many tumour lineage- or cancer-specific pseudogenes could arise from tissue-related rather than tumorigenesis-related effects, they may or may not have the power to differentiate tumour subtypes.

Strikingly, our analysis reveals an unexpected prognostic power of pseudogene expression in kidney cancer: pseudogene expression subtypes not only correlate with patient survival but also confer additional prognostic powers for a group of patients whose survival times cannot be well predicted based on conventional clinical variables. This finding implies a novel prognostic strategy that incorporates both the risk scores defined by the clinical-variable model and the tumour subtypes revealed by pseudogene expression (subtype 1 and subtype 2): among medium-risk patients, patients of subtype 2 may benefit from earlier, more aggressive therapies. Interestingly, although the tumour subtypes defined by other molecular data (for example, mRNA and miRNA) show high concordance with the pseudogene expression subtypes based on the whole patient cohort, they do not confer additional prognostic power based on the medium-risk patient subset. These aggregate results provide a strong rationale for further investigation of the clinical utility of pseudogene expression, which has been understudied in the field. Since TCGA patient samples were collected for the purpose of comprehensive molecular profiling and were collected from different institutions, this practice might introduce some bias. In addition, the resulting clinical annotation of patient samples and related records may not be as rigorous and complete as those obtained from standard clinical trials. Therefore, further efforts should be made to validate the clinical utility of pseudogene expression in a more formal clinical setting (for example, clinical trials).

Although our study primarily focused on the biomedical significance and clinical relevance of pseudogene expression as a whole (that is, the subtypes that collectively represent the information of many pseudogenes), an intriguing question is how individual pseudogenes are functionally involved in tumorigenesis. This is a challenging but exciting topic since pseudogenes may affect their WT-coding genes or unrelated genes through multiple mechanisms such as microRNA decoys and antisense transcripts. From a systems biology point of view, the informative behaviour of pseudogenes may originate from a role such as ‘regulator.’ Our preliminary analysis here revealed some candidates of potential interest. Further efforts are required to elucidate how these pseudogenes functionally contribute to tumour initiation and development and how they are regulated through the complex gene regulatory network.


Auteurs informatie

Voorkeuren

CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences, Lazarettgasse 14, AKH BT 25.3, 1090, Vienna, Austria

Aleksandra E. Kornienko, Philipp M. Guenzl, Robert Kralovics, Florian M. Pauler & Denise P. Barlow

Present Address: Institute of Science and Technology Austria, Lab Building East, Am Campus 1, A-3400, Klosterneuburg, Austria

Department of Internal Medicine I, Division of Hematology and Blood Coagulation, Medical University of Vienna, Vienna, Austria


Bekijk de video: Pseudogenes. What Are Pseudogenes. Junk DNA (Januari- 2022).