Informatie

SS1_2018_Lecture_09 - Biologie


De dubbele DNA-helix en zijn replicatie

De omvang van het probleem

In deze module bespreken we de replicatie van DNA - een van de belangrijkste vereisten voor een levend systeem om te regenereren en de volgende generatie te creëren. Laten we eerst kort de omvang van het probleem beschouwen aan de hand van een literaire analogie.

Het menselijk genoom bestaat uit ruwweg 6,5 miljard basenparen DNA als men kijkt naar het volledige diploïde genoom (d.w.z. als je het DNA meetelt dat van beide ouders is geërfd). Zes komma vijf miljard ziet er als volgt uit: 6.500.000.000. Dat is een groot aantal. Om een ​​beter idee te krijgen van wat dat getal betekent, stel je voor dat ons DNA een reeks schriftelijke instructies is om een ​​van ons te construeren. Naar analogie kunnen we het dan vergelijken met een ander geschreven document. Voor dit voorbeeld beginnen we met het beschouwen van Tolstoj's Oorlog en vrede, een roman die veel mensen kennen vanwege zijn omvangrijke karakter. Gegevens van Wikipedia schatten dat: Oorlog en vrede bevat ongeveer 560.000 woorden. Een tweede geschreven werk dat velen kennen, zijn de zeven delen van J.K. Rowling's Harry Potter. Dit werk checkt in op ~ 1.080.000 woorden (Referentiestatistieken op Wikipedia). Als we aannemen dat de lengte van het gemiddelde Engelse woord vijf tekens is, zijn de twee literaire werken respectievelijk 2,8 miljoen en 5,4 miljoen tekens lang. Daarom hebben zelfs alle zeven delen van "Harry Potter" meer dan 1000x minder karakters dan onze eigen genomen. Het aantal karakters in deze romans ligt echter veel dichter bij het aantal nucleotiden in een typisch bacterieel genoom.

Stel je nu eens voor dat je een machine of mechanisch proces (geen elektronisch proces) ontwikkelt dat verantwoordelijk is voor het lezen en kopiëren van deze boeken. Of stel je voor dat je deze teksten kopieert. Hoe snel zou je het kunnen doen? Hoeveel fouten maak je waarschijnlijk? Verwacht u een afweging tussen de snelheid waarmee u kunt kopiëren en de nauwkeurigheid? Wat voor soort middelen heeft dit proces nodig? Hoeveel energie is er nodig? Stel je nu voor dat je iets 1000x groter kopieert! Oh, en voor de goede orde, je denkbeeldige mechanische apparaat moet zijn werk doen op tekst die ~ 25 "breed is (d.w.z. 0,0000000025 meter breed). Ter vergelijking: een typisch tienpunts lettertype is ~0.00025 meter breed, ongeveer 100.000x groter dan met de breedte van een DNA-basenpaar.

Met dat in gedachten is het vermeldenswaard dat een menselijke cel ongeveer 24 uur nodig heeft om te delen (DNA-replicatie moet daarom iets sneller zijn). Een gezond E coli cel kan slechts 20 minuten nodig hebben om te delen (inclusief het repliceren van het ~ 4,5 miljoen basenpaargenoom). Zowel de mens als de bacterie doen dit, terwijl ze doorgaans zo weinig fouten maken dat de volgende generatie levensvatbaar en herkenbaar blijft. Dat zou nogal verbazingwekkend moeten lijken! Bedenk nu dat het menselijk lichaam naar schatting bestaat uit ~10 biljoen cellen (10.000.000.000.000.000) en dat het tussen de twee en tien keer zoveel microbiële bewoners kan hebben, en dat is heel wat celdeling om rekening mee te houden.

Ontwerp uitdaging

Als de cel zich wil vermenigvuldigen - het uiteindelijke doel - moet er een kopie van het DNA worden gemaakt. Dus een duidelijke probleemstelling/vraag is "hoe kan de cel zijn DNA effectief kopiëren?" Gezien de bovenstaande analogie, zijn hier enkele relevante deelvragen: Wat zijn de chemische en fysische eigenschappen waardoor DNA kan worden gekopieerd? Met welke getrouwheid moet het DNA gekopieerd worden? Met welke snelheid moet het gekopieerd worden? Waar komt de energie vandaan voor deze taak en hoeveel is er nodig? Waar komen de "grondstoffen" vandaan? Hoe koppelen de bij dit proces betrokken moleculaire machines de assemblage van grondstoffen aan de energie die nodig is om een ​​nieuw DNA-molecuul te bouwen? De lijst kan natuurlijk doorgaan.

In de volgende discussie en in de lezing zullen we geïnteresseerd zijn om te beginnen te onderzoeken hoe het proces van DNA-replicatie wordt bereikt, terwijl we enkele van de drijvende vragen in gedachten houden. Probeer bij het doornemen van het lees- en collegemateriaal constant op de hoogte te zijn van deze en andere vragen die met dit proces te maken hebben. Gebruik deze vragen als richtlijnen om uw gedachten te ordenen en probeer overeenkomsten te vinden tussen de 'feiten' waarvan u denkt dat u ze zou moeten weten en de drijvende vragen.

De dubbele DNA-helix

Om wat extra context te bouwen hebben we ook een beetje empirisch bepaalde kennis nodig. Misschien is een van de bekendste en meest populaire kenmerken van de erfelijke vorm van het DNA-molecuul dat het een dubbele spiraalvormige tertiaire structuur heeft. De waardering hiervan dateert uit de jaren vijftig. Het verhaal van deze ontdekking is op grote schaal verteld - en de details vallen buiten het bestek van deze tekst. In het kort, Francis Crick en James Watson worden gecrediteerd met het bepalen van de structuur van DNA. Rosalind Franklin wordt nu ook algemeen gecrediteerd voor het genereren van kritische röntgendiffractiegegevens die Watson en Crick in staat stelden om de puzzel van het DNA-molecuul samen te leggen.

Modellen van de structuur van DNA onthulden dat het molecuul bestaat uit twee strengen van covalent gekoppelde nucleotiden die om elkaar heen zijn gedraaid om een ​​rechtshandige helix te vormen. In elke streng zijn nucleotiden covalent verbonden met twee andere nucleotiden (behalve aan de uiteinden van een lineaire streng) via fosfodiesterbindingen die de suikers verbinden via de 5'- en 3'-hydroxylgroepen (paneel b in figuur 1). Bedenk dat de labels 5' en 3' verwijzen naar de koolstofatomen op het suikermolecuul. Deze suiker- en fosfaatketens vormen een aaneengesloten reeks covalente schakels die vaak de "ruggengraat" van de structuur worden genoemd. In een lineair molecuul heeft elke streng twee vrije uiteinden. Een daarvan wordt het 5'-uiteinde genoemd omdat de niet-gekoppelde functionele groep die typisch betrokken is bij het verbinden van nucleotiden het fosfaat is dat aan het 5'-koolstofatoom is gekoppeld. Het andere uiteinde van de streng wordt het 3'-uiteinde genoemd omdat de niet-gekoppelde functionele groep die typisch betrokken is bij het verbinden van nucleotiden de hydroxylgroep is die is gekoppeld aan het 3'-koolstofatoom van de suiker. Omdat de twee uiteinden van de streng niet symmetrisch zijn, is het gemakkelijk om een ​​richting in de streng aan te wijzen of te beschrijven - men kan bijvoorbeeld zeggen dat ze van het 5'-uiteinde naar het 3'-uiteinde lezen om aan te geven dat ze "lopen" langs de streng vanaf het 5'-uiteinde en bewegend naar het 3'-uiteinde. Deze richting (5' naar 3') is trouwens de conventie die door de meeste biologen wordt gebruikt. Men kan in de tegenovergestelde richting (3' naar 5') lezen, mits dit expliciet wordt gemaakt. De twee strengen van covalent gekoppelde nucleotiden blijken anti-parallel naar elkaar in de dubbele helix; dat wil zeggen, de oriëntatie/richting van de ene streng is tegengesteld aan die van de andere streng (paneel b in figuur 1). De ruggengraat bevindt zich structureel aan de "buitenkant" van de dubbele helix, waardoor een band van negatieve ladingen op het oppervlak ontstaat. Daarentegen stapelen de stikstofbasen van elk van de antiparallelle strengen zich op aan de binnenkant van de structuur en staan ​​tegenover elkaar op een manier die waterstofbindingen tussen unieke purine / pyrimidine-paren (A-koppeling met T en G-koppeling met C) mogelijk maakt. Van deze specifieke paren wordt gezegd dat ze complementair op elkaar en dus worden de tegenovergestelde strengen van een dubbele helix vaak naar elkaar verwezen als complementaire strengen.

Complementaire strengen bevatten overbodige informatie. Vanwege de strikte chemische koppeling, als je de volgorde van één streng kent, weet je verplicht de streng van zijn complement. Neem bijvoorbeeld de rij 5′- C A T A T G G G A T G - 3′. Merk op hoe de sequentie wordt geannoteerd met de oriëntatie (aangegeven door 5'- en 3'-labels). Het complement van deze sequentie - geschreven volgens de 5' naar 3' conventie is: 5′- C A T C C C A T A T G - 3′. Als je niet overtuigd bent, schrijf dan deze twee reeksen tegenover elkaar in je aantekeningen en zorg ervoor dat je ze als antiparallelle strengen schrijft. Merk op dat het draaien van de twee complementaire strengen om elkaar resulteert in de vorming van structurele kenmerken die de grote en kleine groeven worden genoemd en die belangrijker zullen worden wanneer we de binding van eiwitten aan DNA bespreken (paneel c in figuur 1).

De meeste BIS2A-instructeurs verwachten dat je de belangrijkste structurele kenmerken in de onderstaande afbeelding herkent en dat je zelf een basisfiguur van de structuur van DNA kunt maken.

Figuur 1. DNA heeft (a) een dubbele helixstructuur en (b) fosfodiesterbindingen. De (c) grote en kleine groeven zijn bindingsplaatsen voor DNA-bindende eiwitten tijdens processen zoals transcriptie (het creëren van RNA uit een DNA-matrijs) en replicatie.

Rond dezelfde tijd werden drie hypothesen voor de wijzen van DNA-replicatie overwogen. De modellen voor replicatie stonden bekend als: het conservatieve model, het semi-conservatieve model en het dispersieve model.

1. Conservatief: het conservatieve model van replicatie postuleerde dat elk volledig dubbelstrengs molecuul zou kunnen fungeren als een sjabloon voor de synthese van een volledig nieuw dubbelstrengs molecuul. Dat wil zeggen, als men na replicatie een chemische tag op het matrijs-DNA-molecuul zou plaatsen, zou geen van die tag op de nieuwe kopie worden gevonden.
2. Semi-conservatief: deze hypothese stelde dat elke afzonderlijke streng van een DNA-molecuul zou kunnen dienen als een sjabloon voor een nieuwe streng waarmee het nu zou associëren. in dit geval, als een chemisch label op een dubbelstrengs DNA-molecuul zou worden geplaatst, zou één streng op elk van de kopieën het label behouden.
3. Dispersief: Dit model stelde voor dat een gekopieerde dubbele helix een stukgewijze combinatie zou zijn van continue segmenten van "oude" en "nieuwe" strengen. Als een chemisch label op een DNA-molecuul zou worden geplaatst dat werd gekopieerd met behulp van een dispersief mechanisme, zou men afzonderlijke segmenten van de resulterende kopie vinden die op beide strengen waren gelabeld, gescheiden door volledig ongelabelde delen.

Meselson en Stahl losten het probleem in 1958 op toen ze de resultaten rapporteerden van een nu beroemd experiment (beschrijven op Wikipedia) waaruit bleek dat DNA-replicatie semi-conservatief is (Figuur 2), waarbij elke streng wordt gebruikt als een sjabloon voor de creatie van de nieuwe streng. Kijk voor meer informatie over dit experiment naar The Meselson-Stahl Experiment.

Figuur 2. DNA heeft een antiparallelle dubbele helixstructuur, de nucleotidebasen zijn met waterstof aan elkaar gebonden en elke streng vult de andere aan. DNA wordt op een semi-conservatieve manier gerepliceerd, elke streng wordt gebruikt als sjabloon voor de nieuw gemaakte streng.

DNA-replicatie

Nadat enkele structurele basiskenmerken en de noodzaak van een semi-conservatief mechanisme zijn vastgesteld, is het belangrijk om te beginnen met het begrijpen van een deel van wat er bekend is over het proces en om na te denken over welke vragen men zou willen beantwoorden als ze beter willen begrijpen wat er aan de hand is. Aan.

Omdat DNA-replicatie een proces is, kunnen we de rubriek energieverhaal gebruiken om erover na te denken. Bedenk dat de rubriek energieverhaal er is om ons te helpen systematisch na te denken over processen (hoe dingen van A naar B gaan). In dit geval is het proces in kwestie het starten met één dubbelstrengs DNA-molecuul en eindigen met twee dubbelstrengs moleculen. We zullen dus verschillende vragen stellen: Hoe ziet het systeem eruit aan het begin (materie en energie) van replicatie? Hoe worden materie en energie in het systeem overgedragen en wat katalyseert de overdrachten? Hoe ziet het systeem er aan het einde van het proces uit? We kunnen ook vragen stellen over specifieke gebeurtenissen die MOETEN gebeuren tijdens het proces. Omdat DNA bijvoorbeeld een lang molecuul is en soms circulair is, kunnen we fundamentele vragen stellen zoals: waar begint het proces van replicatie? Waar eindigt het? We kunnen ook praktische vragen stellen over het proces, zoals, wat gebeurt er als een dubbelstrengige structuur wordt afgewikkeld?

We bespreken enkele van deze belangrijke vragen in de tekst en in de klas en moedigen u aan hetzelfde te doen.

Vereisten voor DNA-replicatie

Laten we beginnen met het opsommen van enkele functionele basisvereisten voor DNA-replicatie die we kunnen afleiden door gewoon na te denken over het proces dat moet plaatsvinden en/of vereist is om de replicatie te laten plaatsvinden. Dus, wat hebben we nodig?

• We weten dat DNA is samengesteld uit nucleotiden. Als we een nieuwe streng gaan maken, hebben we een bron van nucleotiden nodig.
• We kunnen hieruit afleiden dat het bouwen van een nieuwe DNA-streng een energiebron vereist - we moeten proberen deze te vinden.
• We kunnen hieruit afleiden dat er een proces moet zijn om een ​​plaats te vinden om replicatie te starten.
• We kunnen hieruit afleiden dat er een of meer enzymen zullen zijn die het proces van replicatie helpen katalyseren.
• We kunnen ook afleiden dat, aangezien dit een biochemisch proces is, er fouten zullen worden gemaakt.

Nucleotide structuur beoordeling

Denk aan enkele fundamentele structurele kenmerken van de nucleotide-bouwstenen van DNA. De nucleotiden beginnen als nucleotidetrifosfaten. Een nucleotide bestaat uit een stikstofbase, deoxyribose (suiker met vijf koolstofatomen) en een fosfaatgroep. Het nucleotide wordt genoemd naar zijn stikstofbase, purines zoals adenine (A) en guanine (G), of pyrimidinen zoals cytosine (C) en thymine (T). Denk aan de onderstaande structuren. Merk op dat het nucleotide Adenosinetrifosfaat (ATP) een voorloper is van het deoxyribonucleotide (dATP) dat in DNA is opgenomen.

figuur 3. Elk nucleotide bestaat uit een suiker (ribose of deoxyribose, afhankelijk van of het respectievelijk RNA of DNA bouwt), een fosfaatgroep en een stikstofbase. De purines hebben een dubbele ringstructuur met een zesledige ring gefuseerd met een vijfledige ring. Pyrimidinen zijn kleiner van formaat; ze hebben een enkele zesledige ringstructuur. De koolstofatomen van de suiker met vijf koolstofatomen zijn genummerd 1', 2', 3', 4' en 5' (1' wordt gelezen als "één priemgetal"). Het fosfaatresidu is gehecht aan de hydroxylgroep van het 5'-koolstofatoom van één suiker van één nucleotide en de hydroxylgroep van het 3'-koolstofatoom van de suiker van het volgende nucleotide, waardoor een 5'-3'-fosfodiesterbinding wordt gevormd.

Initiatie van replicatie

Waar langs het DNA begint de replicatiemachinerie de DNA-replicatie?

Met miljoenen, zo niet miljarden nucleotiden om te kopiëren, hoe weet de DNA-polymerase waar te beginnen? Het is niet verrassend dat dit proces niet willekeurig blijkt te zijn. Er zijn specifieke nucleotidesequenties genaamd oorsprong van replicatie langs de lengte van het DNA waarop de replicatie begint. Zodra deze site is geïdentificeerd, is er echter een probleem. De dubbele DNA-helix wordt bij elkaar gehouden door base-stacking-interacties en waterstofbruggen. Als elke streng afzonderlijk moet worden gelezen en gekopieerd, moet er een mechanisme zijn dat ervoor zorgt dat de twee strengen van elkaar worden gescheiden. Energetisch is dit een endergonisch proces. Waar komt de energie vandaan en hoe wordt deze reactie gekatalyseerd? Basisredenering zou op dit punt moeten leiden tot de hypothese dat er waarschijnlijk een eiwitkatalysator bij betrokken is, en dat dit enzym ofwel nieuwe bindingen creëert die energetisch gunstiger (exergoon) zijn dan de bindingen die het verbreekt EN/OF het in staat is om het gebruik te koppelen van een externe energiebron om de strengen te helpen dissociëren.

Het blijkt dat de details van dit proces en de betrokken eiwitten verschillen, afhankelijk van het specifieke organisme in kwestie, en veel van de details op moleculair niveau moeten nog volledig worden begrepen. Er zijn echter enkele gemeenschappelijke kenmerken bij de replicatie van eukaryoten, bacteriën en archaea, en een van deze kenmerken is dat meerdere verschillende soorten eiwitten betrokken zijn bij het repliceren van DNA. Ten eerste hebben eiwitten die in het algemeen "initiatoren" worden genoemd het vermogen om DNA te binden op of zeer dichtbij de oorsprong van replicatie. De interactie van de initiator-eiwitten met het DNA helpt de dubbele helix te destabiliseren en helpt ook om andere eiwitten te rekruteren, waaronder een enzym dat een DNA wordt genoemd.helicase naar het DNA. In dit geval lijkt de energie die nodig is om de dubbele DNA-helix te destabiliseren te komen van de vorming van nieuwe associaties tussen DNA en de initiator-eiwitten en de eiwitten zelf. De DNA-helicase is een eiwit met meerdere subeenheden dat belangrijk is in het replicatieproces omdat het de exergonische hydrolyse van ATP koppelt aan het afwikkelen van de dubbele DNA-helix. Extra eiwitten moeten worden gerekruteerd voor het initiatiecomplex (de verzameling eiwitten die betrokken zijn bij het initiëren van transcriptie). Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, aanvullende enzymen genaamd primaseen DNA-polymerase. Terwijl de initiators kort na het begin van de replicatie verloren gaan, werken de rest van de eiwitten samen om het proces van DNA-replicatie uit te voeren. Dit complex van enzymen functioneert op Y-vormige structuren in het DNA genaamd replicatievorken (Figuur 4). Voor elke replicatiegebeurtenis kunnen bij elke replicatieoorsprong twee replicatievorken worden gevormd, die zich in beide richtingen uitstrekken. Er zijn meerdere oorsprongen van replicatie te vinden op eukaryote chromosomen en sommige archaea, terwijl het genoom van de bacterie, E coli, lijkt één oorsprong van replicatie te coderen.

Let op: mogelijke discussie

Waarom zouden verschillende organismen verschillende aantallen replicatieoorsprongen hebben? Wat zou het voordeel kunnen zijn om er meer dan één te hebben? Is er een nadeel aan het hebben van meer dan één?

Let op: mogelijke discussie

Gegeven wat er moet gebeuren bij de oorsprong van replicatie, kunt u logica gebruiken om enkele potentiële kenmerken af ​​te leiden en ter discussie te stellen die de oorsprong van replicatie onderscheiden van andere segmenten van DNA?

Figuur 4. Aan de oorsprong van replicatie vormt zich een replicatiebel. De replicatiebel bestaat uit twee replicatievorken, die elk in tegengestelde richting langs het DNA reizen. Het is duidelijk dat de replicatievorken alle enzymen bevatten die nodig zijn om replicatie te laten plaatsvindenze zijn alleen niet expliciet in de figuur getekend om ruimte te bieden om de relaties tussen de sjabloon en nieuwe DNA-strengen te illustreren.
Naamsvermelding: BIS2A team originele afbeelding

Verlenging van replicatie

Het opensmelten van de dubbele DNA-helix en het samenstellen van het DNA-replicatiecomplex is slechts de eerste stap in het replicatieproces. Nu moet het proces van het maken van een nieuwe streng beginnen. Hier stuiten we op extra uitdagingen. Het eerste voor de hand liggende probleem is om te bepalen welke van de twee strengen moet worden gekopieerd bij een replicatievork (d.w.z. welke streng zal dienen als een sjabloon voor semi-conservatieve synthese? Zijn beide strengen even haalbare alternatieven?). Er is ook het probleem om het proces van de nieuwe strengsynthese daadwerkelijk op gang te brengen. Kan het DNA-polymerase zelf de nieuwe streng initiëren? Het antwoord op de laatste vraag, en enkele van de grondgedachten en consequenties, zullen later worden besproken. Het belangrijkste idee om op dit punt op te merken is dat experimenteel is vastgesteld dat DNA-polymerase GEEN strengsynthese op zichzelf kan initiëren. In plaats daarvan vereist DNA-polymerase een kort stuk dubbelstrengs structuur gevolgd door enkelstrengs matrijs. De creatie van een korte oligonucleotide wordt uitgevoerd door het enzym primase. Dit eiwit creëert een korte polymeer van RNA (geen DNA) genaamd a inleiding (deze worden weergegeven door korte groene lijnen in de figuren hierboven en hieronder) die door DNA-polymerase kunnen worden gebruikt om een ​​nieuwe groeiende streng te vormen.

Tijdens het proces van strengverlenging, DNA-polymerase polymeriseert een nieuwe covalent gekoppelde streng van DNA-nucleotiden (in bacteriën kan dit specifieke enzym DNA-polymerase III worden genoemd; in eukaryoten is de polymerasenomenclatuur complexer en wordt de rol van verschillende polymerase-eiwitten niet volledig begrepen). Het blijkt dat een van de strengen exclusief de voorkeur heeft boven de andere om als sjabloon te dienen. DNA-polymerase zal de matrijsstreng "lezen" van 3' naar 5' en een nieuwe streng synthetiseren in de 5'- naar 3'-richting. Hypothesen om deze universele waarneming te verklaren zijn meestal gebaseerd op de energetische aspecten die samenhangen met de toevoeging van een nieuw nucleotide en argumenten die verband houden met DNA-reparatie die we binnenkort zullen beschrijven. Laten we daarom kort de reactie bekijken die de toevoeging van een enkele nucleotide omvat. De primer verschaft een belangrijk 3'-hydroxyl waarop de synthese kan beginnen. Het volgende deoxyribonucleotide-trifosfaat komt de bindingsplaats van het DNA-polymerase binnen en wordt, zoals weergegeven in figuur 5 hieronder, door het polymerase zodanig georiënteerd dat een hydrolyse van het 5'-trifosfaat kan optreden, waarbij pyrofosfaat vrijkomt en deze exergonische reactie wordt gekoppeld aan de synthese van een fosfodiesterbinding tussen het 5'-fosfaat van het binnenkomende nucleotide en de 3'-hydroxylgroep van de primer. Dit proces kan worden herhaald totdat desoxyribonucleotide-trifosfaten opraken of het replicatiecomplex van het DNA valt. In feite voegt DNA-polymerase de fosfaatgroep (5') van het binnenkomende nucleotide toe aan de bestaande hydroxylgroep (3') van het eerder toegevoegde nucleotide.

Correcte basenparing, of selectie van het juiste nucleotide dat bij elke stap moet worden toegevoegd, wordt bewerkstelligd door structurele beperkingen die worden gevoeld door het DNA-polymerase en de energetisch gunstige waterstofbindingen gevormd tussen complementaire nucleotiden. Het proces wordt energetisch aangedreven door de hydrolyse van het binnenkomende 5'-trifosfaat en de energetisch gunstige interacties gevormd door de inter-nucleotide-interacties in de groeiende dubbele helix (basenstapeling en complementaire basenparing waterstofbruggen). Merk op dat de energetische eigenschappen van het toevoegen van nucleotiden technisch gezien niet uitsluiten dat een streng groeit in de 3'-naar 5'-richting. Het belangrijkste verschil in dit schema is dat de energiebron voor synthese zou moeten komen van een nucleotide dat al in de groeiende streng in plaats van het nieuwe binnenkomende nucleotide (wat een belangrijk selectief nadeel zou kunnen zijn, wordt kort besproken). Nadat de elongatie is begonnen, komt een ander DNA-polymerase (in bacteriën wordt dit meestal DNA-polymerase I genoemd) binnen om de RNA-primer te verwijderen en het resterende stukje ontbrekend DNA te synthetiseren.

Zoals in de klas meer in detail zal worden besproken, induceert de beweging van de replicatievork het opwinden van het DNA in beide replicatierichtingen. Een ander ATP-consumerend enzym genaamd topoisomerase helpt deze stress te verlichten.

Figuur 5. DNA-polymerase katalyseert de toevoeging van de 5'-fosfaatgroep van een binnenkomend nucleotide aan de 3'-hydroxylgroep van het vorige nucleotide. Dit proces creëert een fosfodiesterbinding tussen de nucleotiden terwijl de fosfoanhydridebinding in het nucleotide wordt gehydrolyseerd.
Bron: http://bio1151.nicerweb.com/Locked/m...h16/elong.html

Let op: mogelijke discussie

Maak een energieverhaal voor de toevoeging van een nucleotide aan een polymeer zoals weergegeven in de bovenstaande afbeelding. Dit zal een expliciet leerdoel zijn van sommige van uw BIS2A-instructeurs.

Leading en lagging strand

De discussie hierboven over strengverlenging beschrijft het proces van synthese van nieuwe strengen als die streng toevallig wordt gesynthetiseerd in dezelfde richting als de replicatievork langs het DNA beweegt of lijkt te bewegen. Deze streng kan continu worden gesynthetiseerd en wordt de genoemd belangrijke bundel. Beide strengen van de originele dubbele DNA-helix moeten echter worden gekopieerd. Aangezien de DNA-polymerase alleen DNA kan synthetiseren in een 5'- naar 3'-richting, moet de polymerisatie van de streng tegenover de leidende streng plaatsvinden in de tegenovergestelde richting waarin helicase, of voor de replicatievork, zich voortbeweegt. Deze streng heet de achterblijvende streng, en vanwege geometrische beperkingen, moet worden gesynthetiseerd via een reeks RNA-priming- en DNA-synthesegebeurtenissen in korte segmenten genaamd Okazaki-fragmenten. Zoals opgemerkt, vereist de initiatie van de synthese van elk Okazaki-fragment een primase om een ​​RNA-primer te synthetiseren, en elk van deze RNA-primers moet uiteindelijk worden verwijderd en vervangen door DNA-nucleotiden door een ander DNA-polymerase. De covalente bindingen tussen elk van de Okazaki-fragmenten kunnen niet worden gemaakt door de DNA-polymerase en moeten daarom worden gevormd door nog een ander enzym genaamd DNAligase. De geometrie van lagging strand synthese is moeilijk te visualiseren en zal in de klas worden behandeld.

Figuur 6. De lagging strand wordt in meerdere segmenten gemaakt. Een replicatievork toont de leidende en achterblijvende streng. Een replicatieballon toont de leidende en achterblijvende strengen.
BIS2A Team originele afbeelding

Beëindiging van replicatie

Telomeren en telomerase

De uiteinden van replicatie in circulaire bacteriële chromosomen leveren weinig praktische problemen op. De uiteinden van lineaire eukaryote chromosomen vormen echter een specifiek probleem voor DNA-replicatie. Omdat DNA-polymerase nucleotiden in slechts één richting (5' naar 3') kan toevoegen, zorgt de leidende streng voor continue synthese totdat het einde van het chromosoom is bereikt; als het replicatiecomplex echter aan het einde van de achterblijvende streng arriveert, is er geen plaats voor de primase om te "landen" en een RNA-primer te synthetiseren zodat de synthese van het ontbrekende achterblijvende streng-DNA-fragment aan het einde van het chromosoom kan worden gestart door het DNA-polymerase. Zonder een of ander mechanisme om deze leemte op te vullen, zal dit chromosomale uiteinde ongepaard blijven en verloren gaan voor nucleasen. Na verloop van tijd, en meerdere rondes van replicatie, zou dit ertoe leiden dat de uiteinden van lineaire chromosomen steeds korter worden, wat uiteindelijk het vermogen van het organisme om te overleven in gevaar brengt. Deze uiteinden van de lineaire chromosomen staan ​​bekend als: telomeren, en bijna alle eukaryote soorten hebben zich herhalende sequenties ontwikkeld die niet coderen voor een specifiek gen. Als gevolg hiervan fungeren deze "niet-coderende" telomeren als replicatiebuffers en worden ze bij elke ronde van DNA-replicatie ingekort in plaats van kritische genen. Bij mensen wordt bijvoorbeeld een sequentie van zes basenparen, TTAGGG, 100 tot 1000 keer herhaald aan het einde van de meeste chromosomen. Naast het optreden als een potentiële buffer, is de ontdekking van het enzym telomerase geholpen bij het begrijpen van hoe chromosoomuiteinden worden onderhouden. Telomerase is een enzym dat bestaat uit eiwitten en RNA. Telomerase hecht zich aan het uiteinde van het chromosoom door complementaire basenparing tussen de RNA-component van telomerase en de DNA-template. Het RNA wordt gebruikt als een complementaire streng voor de korte verlenging van zijn complement. Dit proces kan vele malen worden herhaald. Zodra de lagging strand-template voldoende lang is door telomerase, zal primase een primer creëren gevolgd door DNA-polymerase die nu nucleotiden kan toevoegen die complementair zijn aan de uiteinden van de chromosomen. Zo worden de uiteinden van de chromosomen gerepliceerd.

Figuur 7. De uiteinden van lineaire chromosomen worden in stand gehouden door de werking van het telomerase-enzym.

Telomerase is niet actief in volwassen lichaamscellen. Volwassen lichaamscellen die celdeling ondergaan, blijven hun telomeren verkorten. Dit betekent in wezen dat telomeerverkorting wordt geassocieerd met veroudering. In 2010 ontdekten wetenschappers dat telomerase sommige leeftijdsgerelateerde aandoeningen bij muizen kan omkeren, en dit kan potentieel hebben in de regeneratieve geneeskunde.1 In deze onderzoeken werden telomerase-deficiënte muizen gebruikt; deze muizen hebben weefselatrofie, stamceldepletie, falen van het orgaansysteem en verminderde reacties op weefselbeschadiging. Telomerase-reactivering bij deze muizen veroorzaakte verlenging van telomeren, verminderde DNA-schade, omgekeerde neurodegeneratie en verbeterde werking van de teelballen, milt en darmen. Reactivering van telomeren kan dus potentieel hebben voor de behandeling van leeftijdsgerelateerde ziekten bij mensen.

Verschillen in DNA-replicatiesnelheden tussen bacteriën en eukaryoten

DNA-replicatie is buitengewoon goed bestudeerd in bacteriën, voornamelijk vanwege de kleine omvang van het genoom en het grote aantal beschikbare varianten. E coli heeft 4,6 miljoen basenparen in een enkel cirkelvormig chromosoom, en alles wordt in ongeveer 42 minuten gerepliceerd, beginnend bij een enkele oorsprong van replicatie en in beide richtingen rond het chromosoom. Dit betekent dat er ongeveer 1000 nucleotiden per seconde worden toegevoegd. Het proces is veel sneller dan bij eukaryoten. Tabel 1 vat de verschillen tussen bacteriële en eukaryote replicaties samen.

tafel 1. Verschillen tussen prokaryote en eukaryote replicatie

Verschillen tussen prokaryote en eukaryote replicatie
EigendomprokaryotenEukaryoten
Oorsprong van replicatieEnkelMeerdere
Polymerisatiesnelheid per polymerase1000 nucleotiden/s50 tot 100 nucleotiden/s
ChromosoomstructuurCirculaireLineair
telomeraseNiet aanwezigCadeau

Link naar externe bron

Klik door een tutorial over DNA-replicatie.

Replicatie ontwerp uitdaging: proeflezen

Wanneer de cel begint met het repliceren van het DNA, doet hij dit als reactie op omgevingssignalen die de cel vertellen dat het tijd is om te delen. Het ideale doel van DNA-replicatie is om twee identieke kopieën van de dubbelstrengs DNA-matrijs te produceren en dit in een hoeveelheid tijd die geen onnodig hoge evolutionaire selectieve kosten met zich meebrengt. Dit is een ontmoedigende taak als je bedenkt dat er ~ 6.500.000.000 basenparen in het menselijk genoom en ~ 4.500.000 basenparen in het genoom van een typische E coli stam en dat Nature heeft bepaald dat de cellen zich binnen respectievelijk 24 uur en 20 minuten moeten vermenigvuldigen. In beide gevallen moeten er veel individuele biochemische reacties plaatsvinden.

Hoewel idealiter replicatie met perfecte getrouwheid zou gebeuren, is DNA-replicatie, net als alle andere biochemische processen, onvolmaakt - basen kunnen worden weggelaten, extra basen kunnen worden toegevoegd of basen kunnen worden toegevoegd die niet goed basenpaar vormen. In veel organismen worden veel van de fouten die optreden tijdens DNA-replicatie onmiddellijk gecorrigeerd door DNA-polymerase zelf via een mechanisme dat bekend staat als proeflezen. In proeflezen, de DNA-polymerase "leest" elke nieuw toegevoegde base door de aanwezigheid of afwezigheid van kleine structurele anomalieën te detecteren voordat de volgende base aan de groeiende streng wordt toegevoegd. Daarbij kan een correctie worden aangebracht.

Als de polymerase detecteert dat een nieuw toegevoegde base correct is gepaard met de base in de matrijsstreng, wordt het volgende nucleotide toegevoegd. Als er echter een verkeerd nucleotide aan het groeiende polymeer wordt toegevoegd, zal de verkeerd gevormde dubbele helix ervoor zorgen dat het DNA-polymerase afslaat, en de nieuw gemaakte streng zal worden uitgeworpen van de polymerisatieplaats op de polymerase en zal een exonucleaseplaats binnengaan. Op deze plaats kan DNA-polymerase de laatste paar nucleotiden afsplitsen die aan het polymeer zijn toegevoegd. Nadat de verkeerde nucleotiden zijn verwijderd, worden er weer nieuwe toegevoegd. Deze mogelijkheid tot proeflezen brengt enkele nadelen met zich mee: het gebruik van een foutcorrigerende/nauwkeuriger polymerase vereist tijd (de wisselwerking is snelheid van replicatie) en energie (altijd een belangrijke kostenpost). Hoe langzamer je gaat, hoe nauwkeuriger je kunt zijn. Als u echter te langzaam gaat, kan dit ervoor zorgen dat u niet zo snel repliceert als uw concurrentie, dus het bepalen van de balans is de sleutel.

Fouten die niet worden gecorrigeerd door proeflezen worden wat bekend staat als mutaties.

Figuur 1. Proeflezen door DNA-polymerase corrigeert fouten tijdens replicatie.

Voorgestelde discussie

Waarom zou DNA-replicatie snel moeten zijn? Overweeg de omgeving waarin het DNA zich bevindt en vergelijk dat met de structuur van DNA terwijl het wordt gerepliceerd.

Voorgestelde discussie

Wat zijn de voor- en nadelen van de proefleescapaciteiten van DNA-polymerase?

Replicatiefouten en DNA-reparatie

Hoewel DNA-replicatie doorgaans een zeer nauwkeurig proces is en het proeflezen van DNA-polymerasen helpt om het foutenpercentage laag te houden, komen er nog steeds fouten voor. Naast replicatiefouten kan er ook milieuschade optreden aan het DNA. Such uncorrected errors of replication or environmental DNA damage may lead to serious consequences. Therefore, Nature has evolved several mechanisms for repairing damaged or incorrectly synthesized DNA.

Mismatch repair

Some errors are not corrected during replication but are instead corrected after replication is completed; this type of repair is known as a mismatch repair. Specific enzymes recognize the incorrectly added nucleotide and excise it, replacing it with the correct base. But, how do mismatch repair enzymes recognize which of the two bases is the incorrect one?

In E coli, after replication, the nitrogenous base adenine acquires a methyl group; this means that directly after replication the parental DNA strand will have methyl groups, whereas the newly synthesized strand lacks them. Thus, mismatch repair enzymes are able to scan the DNA and remove the wrongly incorporated bases from the newly synthesized, non-methylated strand by using the methylated strand as the "correct" template from which to incorporate a new nucleotide. In eukaryotes, the mechanism is not as well understood, but it is believed to involve recognition of unsealed nicks in the new strand, as well as a short-term, continuing association of some of the replication proteins with the new daughter strand after replication has completed.

Figuur 2. In mismatch repair, the incorrectly added base is detected after replication. The mismatch repair proteins detect this base and remove it from the newly synthesized strand by nuclease action. The gap is now filled with the correctly paired base.

Nucleotide excision repair

Nucleotide excision repair enzymes replace incorrect bases by making a cut on both the 3' and 5' ends of the incorrect base. The entire segment of DNA is removed and replaced with correctly paired nucleotides by the action of a DNA polymerase. Once the bases are filled in, the remaining gap is sealed with a phosphodiester linkage catalyzed by the enzyme DNA ligase. This repair mechanism is often employed when UV exposure causes the formation of pyrimidine dimers.

Figuur 3. Nucleotide excision repairs thymine dimers. When exposed to UV, thymines lying adjacent to each other can form thymine dimers. In normal cells, they are excised and replaced.

Consequences of errors in replication, transcription, and translation

Iets belangrijks om over na te denken:

Cells have evolved a variety of ways to make sure DNA errors are both detected and corrected. We have already discussed several of them. But why did so many different mechanisms evolve? From proofreading by the various DNA-dependent DNA polymerases, to the complex repair systems. Such mechanisms did not evolve for errors in transcription or translation. If you are familiar with the processes of transcription and/or translation, think about what the consequences would be of an error in transcription. Would such an error affect the offspring? Zou het dodelijk zijn voor de cel? What about errors in translation? Stel dezelfde vragen over het vertaalproces. What would happen if the wrong amino acid is accidentally put into the growing polypeptide during translation? How do these contrast with DNA replication? If you are not familiar with transcription or translation, don't fret. We'll learn those soon and return to this question again.


Bekijk de video: Cell Biology: Introduction Genetics. Lecturio (Januari- 2022).