Informatie

Zijn er nadelen aan met HRP geconjugeerde PRIMAIRE antilichamen?


Ik moet een FLAG-gelabeld eiwit op een western blot detecteren en ik moet een antilichaam bestellen. Ik verwacht niet een enorme hoeveelheid van mijn eiwit te zien. Om de analysetijd tot een minimum te beperken, overweeg ik een HRP-geconjugeerde anti-FLAG. Zijn er nadelen aan (bijvoorbeeld gevoeligheid)? Ervaringen/problemen uit de eerste hand?


Je kunt direct gekoppelde antilichamen vergelijken met de klassieke indirecte primair-secundaire systemen:

Direct gekoppelde antilichamen

Voordelen:

  • snellere workflow omdat slechts één antilichaam wordt gebruikt
  • elimineert de kans op een kruisreagerend secundair antilichaam (eventueel minder achtergrond)
  • mogelijkheid om verschillend gelabelde antilichamen op dezelfde blot te gebruiken

nadelen:

  • lagere gevoeligheid omdat het signaal niet wordt versterkt
  • er zijn slechts enkele labels beschikbaar
  • direct gelabelde primaire antilichamen zijn meestal duur en je hebt er relatief veel van nodig
  • de labeling kan de immunoreactiviteit van het antilichaam beschadigen of verminderen

Indirecte primaire-secundaire antilichaamsystemen

Voordelen:

  • het secundaire antilichaam versterkt het signaal (wat vooral interessant is voor zwak tot expressie gebrachte eiwitten)
  • verschillend gelabelde secundaire antilichamen kunnen worden gebruikt op dezelfde primaire
  • primaire antilichamen van verschillende soorten kunnen tegelijkertijd worden gebruikt
  • één secundair antilichaam kan worden gebruikt met verschillende primaire antilichamen (bijvoorbeeld voor het eiwit van belang en de laadcontrole)
  • de labelingsreactie heeft geen invloed op het primaire antilichaam

nadelen:

  • kruisreactiviteit van het secundaire antilichaam kan leiden tot niet-specifieke banden
  • de methode duurt langer, omdat er meer stappen in het proces nodig zijn

Voor mij is het belangrijkste punt de hogere gevoeligheid van de indirecte methode, ter vergelijking zie deze afbeeldingen (van Life technologies):


DAB-kleuring

Inhoud

Gebruik voor gemakkelijke resultaten met DAB-kleuring een eenvoudige DAB-substraatkit of een complete DAB-kleuringskit, zoals streptavidine-biotine HRP/DAB-kits en HRP/DAB-kits met polymeermethode. Als alternatief kunt u de reagentia voor DAB-kleuring zelf samenstellen met behulp van biotine-geconjugeerde secundaire antilichamen, HRP-polymeer-geconjugeerde secundaire antilichamen en streptavidine-HRP-conjugaten.

Principes en toepassing van DAB-kleuring

DAB (3,3′-diaminobenzidine) is een derivaat van benzeen. Het wordt meestal gebruikt bij immunohistochemische (IHC) kleuring als een chromogeen. Het wordt ook gebruikt in ter plaatse hybridisatie (ISH) en soms in dot-blots en in western-blotting.

Bij DAB-kleuring wordt DAB geoxideerd door waterstofperoxide in een reactie die doorgaans wordt gekatalyseerd door mierikswortelperoxidase (HRP). Het geoxideerde DAB vormt een bruin neerslag, ter plaatse van de HRP, dat met lichtmicroscopie kan worden gevisualiseerd.

Het DAB-precipitaat is onoplosbaar in water, alcohol en andere organische oplosmiddelen die het meest worden gebruikt in het laboratorium (zoals xyleen en isopropanol). Dit zorgt voor een grote flexibiliteit bij de daaropvolgende behandeling van de weefselsectie, zoals bij de keuze van tegenkleuring en montagemedium. DAB-kleuring is ook hittebestendig, dus het kan worden gebruikt in IHC/ISH-experimenten met dubbele labeling, en is extreem stabiel - in feite zijn gekleurde objectglaasjes vaak jarenlang stabiel.

Bij gebruik in combinatie met een nikkel- of kobaltoplossing als DAB-versterker, wordt DAB-kleuring een intensere, zwarte kleur.

Koppeling van HRP en primaire antilichamen voor DAB-kleuring

In IHC zijn er drie hoofdmethoden om HRP te koppelen aan het primaire antilichaam dat voor kleuring wordt gebruikt. Deze hebben de volgende voor- en nadelen:

- Direct HRP-geconjugeerde primaire antilichamen
Minder versterking, en dus minder gevoelig dan de volgende methoden. Heel eenvoudig protocol. Vereiste voor HRP-conjugatie van primair antilichaam.

- Gebiotinyleerde secundaire antilichamen, gecombineerd met streptavidine-HRP in de ABC-methode (Avidin Biotin Complex)
Vereiste voor het blokkeren van endogeen biotine om achtergrondkleuring te voorkomen. Meest gebruikte methode in onderzoekslaboratoria.

- HRP-polymeer secundaire antilichamen
Korter protocol dan de ABC-methode. Zeer gevoelig met een lage achtergrond. Abcam gebruikt deze methode voor de validatie van antilichamen in IHC.

Jovicic N et al. gebruikten ab64259 HRP/DAB streptavidine-biotine ABC-methodekit om CD68 te kleuren in in paraffine ingebedde muizenlevercoupes. Bruine DAB-kleuring toont de aanwezigheid van CD68.

Alternatieven voor DAB-kleuring

Vergeleken met fluorescerende methoden die worden gebruikt voor IHC, is chromogene detectie, zoals DAB-kleuring, doorgaans gevoeliger vanwege de enzymatische amplificatie die wordt gebruikt bij DAB-kleuring en vergelijkbare methoden. Het is echter niet mogelijk om subcellulaire structuren op te lossen met behulp van DAB-kleuring in dezelfde mate als met fluorescentiemicroscopie.

Hoewel DAB overweldigend de meest populaire chromogeen is, zijn er alternatieven. Zie onze gids voor chromogenen en versterkers voor volledige details over verschillende chromogenen en hun voor- en nadelen.

Te vermijden valkuilen bij DAB-kleuring

Een nadeel van DAB is dat het langzaam reageert met waterstofperoxide, zelfs zonder de aanwezigheid van een peroxidase-enzym. Dit betekent dat als de DAB eenmaal is gecombineerd met waterstofperoxide, deze relatief snel moet worden gebruikt om te voorkomen dat er bruine neerslag in de oplossing ontstaat, wat zal bijdragen aan achtergrondkleuring. Gewoonlijk worden kits voor DAB-kleuring geleverd met geconcentreerd DAB-substraat en een afzonderlijke buffer met waterstofperoxide, die kort voor gebruik moet worden gecombineerd.

Houd er rekening mee dat DAB giftig is – het is vermoedelijk teratogeen en kankerverwekkend, dus het moet worden behandeld volgens goede laboratoriumpraktijken.

DAB-kleuringsprotocollen

Voor volledige protocollen voor immunokleuring met behulp van DAB, zie onze verzameling gevalideerde IHC-protocollen op basis van onze eigen ervaring met antilichaamvalidatie.

Veel DAB-kleuring maakt gebruik van vooraf voorbereide DAB-oplossingen, zoals in DAB-substraatkit ab64238. Het is ook mogelijk om DAB te bereiden met DAB-tablets. Tabletten worden over het algemeen gebruikt in plaats van DAB-poeder om gezondheids- en veiligheidsrisico's bij het bereiden van de DAB-oplossing te minimaliseren.

Of u nu tabletten of kant-en-klare oplossingen gebruikt, lees de instructies van de fabrikant voor de bereiding, aangezien deze kunnen variëren, bijvoorbeeld als waterstofperoxide al is inbegrepen of moet worden toegevoegd.

Zodra de DAB-oplossing is bereid met waterstofperoxide en nadat de coupes zijn gekleurd met HRP, hoeven de coupes gewoon een paar minuten met de DAB-oplossing te worden geïncubeerd, gevolgd door spoelen in een buffer, zoals PBS, of in water. DAB-kleuring wordt meestal gevolgd door tegenkleuring, uitdroging in een ethanolreeks en montage.

Om overmatige kleuring met DAB te voorkomen, is het het beste om het kleurproces onder een microscoop te volgen en de DAB te verwijderen wanneer een lichtbruine kleuring wordt gezien.


ELISA-indelingen

De eerste stap in een ELISA-experiment is de immobilisatie van het antigeen in een monster aan de wand van de putjes van een microtiterplaat. Dit kan worden bereikt door directe adsorptie aan het oppervlak van de plaat of door gebruik te maken van een "capture-antilichaam". Het capture-antilichaam moet specifiek zijn voor het doelantigeen en wordt voornamelijk gebruikt in een specifiek ELISA-type genaamd &ldquosandwich ELISA&rdquo. Na immobilisatie wordt een detectieantilichaam toegevoegd, dat bindt aan het geadsorbeerde antigeen, wat leidt tot de vorming van een antigeen-antilichaamcomplex. Het detectieantilichaam is ofwel direct geconjugeerd aan een enzym, zoals mierikswortelperoxidase (HRP), of verschaft een bindingsplaats voor een gelabeld secundair antilichaam. Over het algemeen kunnen ELISA's worden onderverdeeld in de vier hoofdcategorieën:


Zijn er nadelen aan HRP-geconjugeerde PRIMAIRE antilichamen - Biologie

Verschillende enzymen zijn gebruikt als detectieprobes in immunochemie vanwege hun hoge gevoeligheid, eenvoud en brede gebruikstoepassingen. De twee veel voorkomende enzymprobes die worden gebruikt in immunoassays en chemiluminescentie zijn mierikswortelperoxidase (HRP) en alkalische fosfatase (AP). Deze twee enzymen zijn gebruikt om biologische verbindingen te detecteren door middel van chemiluminescentie, chromogene of fluorescerende output.

Inleiding tot enzymprobes

Enzymen worden al tientallen jaren gebruikt als detectieprobes. Voor veel toepassingen is een verscheidenheid aan enzymen gebruikt om vreemd eiwit, antigeen of andere biologische agentia te detecteren nadat ze zijn geconjugeerd met een ander eiwit, gewoonlijk een antilichaam dat bindt aan het doelwit dat gewoonlijk een antigeen is. In het algemeen is een antilichaam gebonden aan een avidine-biotinecomplex. Dit wordt gevolgd door toevoeging van het specifieke enzym. Het complex wordt blootgesteld aan het vreemde eiwit of antigeen en er verschijnt een zichtbaar reactieproduct of er kan licht of fluorescentie worden uitgestoten. Dit signaal kan worden gedetecteerd door een scanmethode of spectrofotometrie.

Wat zijn de voordelen van het gebruik van enzymprobes?

Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van enzymprobes zoals HRP en AP om een ​​gericht eiwit te detecteren en ze omvatten het volgende:

Lange houdbaarheid: het enzym mierikswortelperoxidase en alkalische fosfatase zijn relatief stabiel wanneer ze op de juiste manier worden bewaard. Omdat deze enzymen lichtongevoelig zijn, worden ze niet beïnvloed door het licht dat wordt gegenereerd tijdens chemiluminescentie.

Goede gevoeligheid: wanneer de chemische reactie plaatsvindt, kan de resulterende signaaloutput relatief eenvoudig worden gedetecteerd, waardoor zelfs zeer lage niveaus van doeleiwit of antigeen kunnen worden geïdentificeerd. Daarnaast zijn er ook andere methoden om de signalen te versterken zodat de test gevoeliger is. Ten slotte resulteert dit vanwege de hoge omzet van de enzymen ook in meer enzymbinding aan het eiwit en kan de signaalemissie voor lange tijd worden verwijderd.

Veelzijdig systeem. Tegenwoordig zijn er veel substraten met eigenschappen van chemiluminescentie, chromogenese of fluorescentie, waardoor het enzymsysteem zeer veelzijdig en gebruiksvriendelijk is.

Sondes beschikbaar. Het andere kenmerk van alkalische fosfatase en HRP is dat beide sondes gemakkelijk verkrijgbaar zijn en niet buitensporig duur.

Verbeterde chemiluminescentie (ECL)

Van HRP is bekend dat het de oxidatie van luminol tot 3-aminoftalaat katalyseert via verschillende tussenproducten. Tijdens deze reactie wordt licht van lage intensiteit gegenereerd bij 428 nm. Wanneer echter bepaalde chemicaliën worden toegevoegd, kan de emissie van licht met een factor 1000 worden verbeterd, waardoor het licht veel gemakkelijker te detecteren is door spectrofotometers. Daarnaast kunnen de chemicaliën ook de gevoeligheid van de reactie verhogen. Deze verhoogde generatie van licht staat bekend als verbeterde chemiluminescentie. Tegenwoordig zijn er verschillende soorten versterkers die kunnen worden gebruikt bij de HRP-reactie. De meeste van deze versterkers zijn gemodificeerde fenolen (voornamelijk joodfenol). Verbeterde chemiluminescentie wordt nu in veel laboratoria gebruikt om picogrammen van nucleïnezuren in Northern en Southern blots te detecteren. brede waaier van golflengte. Aan de andere kant hebben de gekleurde precipitaten bij gebruik van chromogene substraten alleen in het zichtbare bereik een beperkte lichtemissie.

Wat zijn enkele nadelen van het gebruik van AP en HRP?

1. Behoefte aan een substraat. Bij gebruik van AP en HRP heeft men wel een substraat nodig om het vreemde eiwit of antigeen te detecteren en het gebruikte substraat kan een reactie induceren die lichtgevoelig kan zijn.

2. Grootte-interferentie: In het algemeen zijn alkalische fosfatase en HRP grote enzymen en daarom kan de grootte interfereren met de biochemische functie van het eiwit waaraan ze zijn gehecht.

3. Achtergrondsignalen: Omdat de enzymen die worden gebruikt om doeleiwitten te detecteren ook in de cellen van het lichaam worden aangetroffen, kan dit ook resulteren in een niet-specifiek achtergrondsignaal, tenzij men voorzorgsmaatregelen neemt om de endogene enzymen te remmen.

Veelvoorkomende enzymprobe-reporters en chromogene substraten

Zowel AP als HRP worden gebruikt als testreporters omdat ze door te reageren met het substraat chemiluminescente of gekleurde fluorescerende signalen produceren die kunnen worden gemeten en gekwantificeerd.

Het substraat kan een vaste stof (precipiterend) of oplosbaar zijn.

Enzymprobes hebben veel laboratoriumtoepassingen, vooral omdat ze veelzijdig zijn en kunnen worden geconjugeerd aan een verscheidenheid aan substraten. Zowel AP als HRP kunnen worden gebruikt om eiwitten of antigenen te detecteren via een indirecte of directe antilichaamdetectietest, waarbij het enzym wordt geconjugeerd aan het primaire antilichaam dat vervolgens bindt aan het doelantigeen of een secundair antilichaam dat hecht aan het primaire antilichaam. Zowel AP als HRP kunnen worden geconjugeerd met avidine of biotine voor gebruik in avidine-biotine-signaalversterkingssystemen.

Mierikswortelperoxidase

Het enzym mierikswortelperoxidase (HRP) wordt vaak aangetroffen in de wortels van de mierikswortelplant. Dit metallo-enzym met verschillende isovormen wordt veel gebruikt in een verscheidenheid aan biochemische toepassingen. In wezen katalyseren de enzymen de oxidatie van waterstofperoxide tot water en zuurstofgas.

Substraten voor HRP

Wanneer HRP wordt gebruikt in biochemische reacties, wordt de aanwezigheid ervan meestal zichtbaar gemaakt door een substraat dat, wanneer het wordt geoxideerd door HRP met behulp van het oxidatiemiddel waterstofperoxide, een klassieke kleurverandering produceert die wordt gedetecteerd door spectrofotometermethoden

Er zijn verschillende substraten voor HRP ontwikkeld en deze vallen in twee basisgroepen:

HRP katalyseert de omzetting van chromogeen substraat TMB, DAB, ABTS in gekleurde bijproducten

Produceer licht wanneer erop wordt ingewerkt door luminol of chemiluminescent substraat.

Enzym label

2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur] (ABTS)

o-fenyleendiamine dihydrochloride (OPD)

HRP als enzymreporter voor sondes

Mierikswortelperoxidase (HRP) heeft het vermogen om de overdracht van twee elektronen van een substraat naar waterstofperoxide te katalyseren om water en een geoxideerd substraat te genereren. HRP wordt vaak gebruikt in conjugaten om de aanwezigheid van een eiwitdoelwit te detecteren. Wanneer HRP bijvoorbeeld aan een antilichaam is geconjugeerd, kan het worden gebruikt om sporen van een specifiek eiwit in een western blot te detecteren. Het antilichaam verschaft de specificiteit om het antigeen van belang te lokaliseren en de HRP in aanwezigheid van een substraat genereert een detecteerbaar signaal. HRP wordt gebruikt in immunohistochemie en ELISA omdat het gekleurde verbindingen genereert. Voor detectie van een antigeen- of eiwitmolecuul zijn HRP-substraten zo ontworpen dat ze bij oxidatie een chemiluminescerend, chromogeen of fluorescerend signaal zullen genereren.

Voordelen van het gebruik van HRP

Kleine maat: Het molecuulgewicht van HRP is 40.000, wat relatief klein is in vergelijking met veel andere enzymconjugaten. De kleine omvang is ook een voordeel omdat het een effectievere penetratie in de monstercellen mogelijk maakt en de kans op interferentie met de geconjugeerde eiwitfunctie vermindert. Bovendien heeft HRP vier lysinemoleculen, die elk kunnen worden geconjugeerd, wat de efficiëntie van de verknoping met het te testen antigeen of eiwit verder verbetert.

Hoge omzet: Het andere belangrijke kenmerk van HRP is dat het een hoge omloopsnelheid heeft en dit resulteert in een efficiënte reactie, waarbij in korte tijd een overvloed aan reactantproducten wordt geproduceerd bij een normale pH. Studies tonen aan dat HRP gebonden aan IgG veel efficiënter is dan alkalische fosfatase vanwege de constante conjugaatvorming vanwege de hogere specifieke enzymatische activiteit (dwz er is meer HRP/mol antilichaam).

Minder sterische hinder: Verdere HRP-conjugaten hebben een verhoogde immunologische reactiviteit vanwege hun kleine omvang, wat resulteert in minder sterische hinder en effectievere signalen.

Stal: Het belangrijkste kenmerk van HRP-conjugaten is dat ze lange tijd stabiel zijn bij neutrale pH.

Kosten: Over het algemeen is HRP goedkoper dan AP.

Nadelen van HRP als enzym in chemiluminescentie

1. Het eerste kleine nadeel van het gebruik van HRP is dat het kan resulteren in niet-specifieke kleuring die kan optreden door de endogene peroxidase-activiteit die in bepaalde weefsels of cellen wordt aangetroffen. Wanneer dunne bevroren secties van weefsels worden gemaakt, onthullen ze vaak een milde tot matige hoeveelheid endogene peroxidase-activiteit. Om dit probleem op te lossen zijn er echter commerciële peroxidaseremmers beschikbaar die de endogene peroxidase-activiteit in de weefsels kunnen verminderen of volledig elimineren.

2. Een ander klein minpunt van HRP houdt verband met de gevoeligheid voor afbraak. Sommige micro-organismen en sommige antibiotica kunnen de afbraak van HRP versterken. Een krachtige remmer van HRP is natriumazide, maar om dit probleem te omzeilen, kan men 0,01% thimerosal gebruiken. Het is echter belangrijk om te weten dat de activiteit van HRP ook kan worden geremd door sulfiden, cyaniden en aziden.

3. Een laatste negatief punt van HRP is dat er berichten zijn dat sommige reactieproducten van HRP-substraten het potentieel hebben om mutageen of kankerverwekkend te zijn. Tot nu toe zijn er slechts enkele meldingen bij kleine dieren. Als dit echter een probleem is, moet men andere substraten zoals AP gebruiken.

Gebruik van alkalische fosfatase bij chemiluminescentie

Alkalische fosfatase (AP) bevat vijf cysteïneresten, één magnesiumatoom en twee zinkatomen die nodig zijn voor zijn enzymatische functie. Het enzym is optimaal actief bij een alkalische pH. Alkalische fosfatase speelt in wezen een rol bij de defosforylering van verbindingen. Het enzym wordt veel aangetroffen in het lichaam en zelfs in bacteriën. Alkalische fosfatase is hittebestendig en wordt in verschillende isovormen in het lichaam aangetroffen. Vanwege de hoge concentratie in de lever en botten wordt het vaak gebruikt als biomarker om de aanwezigheid van leverbeschadiging of zelfs botaandoeningen zoals osteomalacie te bepalen.

Alkalische fosfatasen zijn een familie van enzymen die fosfaten uit eiwitten en nucleotiden kunnen hydrolyseren. Deze familieklasse functioneert het best bij alkalische pH (rond 9) en wordt geactiveerd door tweewaardige kationen zoals calcium en geremd door cyanide, cysteïne, anorganisch fosfaat, arsenaat en tweewaardige chelaatvormers zoals EDTA.

Bij de mens zijn de twee overheersende vormen van alkalische fosfatase de ene die wordt verspreid in de organen en de andere die alleen in het maagdarmkanaal wordt aangetroffen. De twee subtypes van alkalische fosfatasen worden verschillend beïnvloed door hitte en chemische remmers. Er is vastgesteld dat levamisol in de substraatbuffer de activiteit van endogeen weefsel AP zal onderdrukken. Aan de andere kant wordt intestinale AP geremd door 20% azijnzuur, gevolgd door kaliumboorhydride. Bij het gebruik van AP is het dus belangrijk om de bron van het enzym te kennen.

In de meeste laboratoria zijn alkalische fosfataseconjugaten van kalfsdarm ideaal in toepassingen waar hoge endogene peroxidaseniveaus het gebruik van HRP-conjugaten contra-indiceren, zoals bij cryostaatcoupes waar peroxidaseremmers niet effectief zijn.

Enzym label

Combinatie van nitroblauwtetrazoliumchloride

(NBT) en 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (BCIP)

p-nitrofenylfosfaat (PNPP)

Voordelen van Calf Intestinal AP

In tegenstelling tot HRP is het molecuulgewicht van kalverdarm-AP ongeveer 3,5 keer zo hoog, ofwel 140.000. Enkele voordelen van het gebruik van Calf AP zijn de volgende:

De reactiesnelheden zijn lineair en gemakkelijk te meten

De gevoeligheid van de reactie kan worden verhoogd door de reactie gedurende een lange periode te laten plaatsvinden

In tegenstelling tot HRP wordt de activiteit van kalverdarm-AP niet veranderd door blootstelling aan antibiotica en andere middelen zoals thimerosal of natriumazide. Dit betekent dat het enzym voor een bepaalde tijd kan worden bewaard, zelfs in een niet-steriele omgeving.

Ten slotte, aangezien de niet-intestinale AP-activiteit kan worden onderdrukt door levamisol, kunnen antilichamen die met dit enzym zijn gelabeld, worden gebruikt als biologische markers in een aantal verschillende celtypen.

Gebruik van alkalische fosfatase in het laboratorium

Alkalische fosfatase heeft veel toepassingen in het laboratorium voor moleculaire biologie.

Het verwijderen van fosfaatgroepen. Omdat DNA normaal gesproken fosfaatgroepen bevat aan het 5-terminale uiteinde, voorkomt het verwijderen van deze eindfosfaten dat het DNA een spiraal vormt. Dit houdt het DNA-molecuul dus lineair tijdens de voorbereidingsfase. Verdere verwijdering van de fosfaatgroepen door alkalische fosfatase maakt ook radiolabeling mogelijk en dit maakt het mogelijk om de aanwezigheid van gelabeld DNA in experimenten te meten.

Enzymimmunoassays: Alkalische fosfatase wordt nu veel gebruikt als label voor enzymimmunoassays.

Immunohistochemische kleuring is een techniek van onschatbare waarde voor het detecteren van specifieke antigenen in cellen en weefsels. Om de immunohistochemische kleuring uit te voeren, moet eerst de weefselsectie van paraffine worden ontdaan en vervolgens worden gerehydrateerd voordat deze wordt geweekt met het primaire antilichaam. Enzym-geconjugeerde secundaire antilichamen worden vervolgens op de sectie aangebracht en de specifieke kleuring kan worden gevisualiseerd zodra het enzymspecifieke substraat is toegevoegd. Soms kan er weinig of geen kleuring worden waargenomen, en in dergelijke gevallen kan het nodig zijn om het antigeen te ontmaskeren door enzymdigestie.

Omdat veel gedifferentieerde cellen hoge concentraties alkalische fosfatase op het celoppervlak bevatten, kan kleuring met alkalische fosfatase worden gebruikt om de aanwezigheid of herhaling van bepaalde vormen van kanker te detecteren.

Alkalische fosfatase wordt ook aangetroffen in botten en de lever en meting van de concentratie in het bloed kan een ziekteproces aan het licht brengen.

Over het algemeen kunnen zowel alkalische fosfatase als HRP-conjugaten worden gebruikt om chemiluminescente resultaten te verkrijgen in westerse of andere immunoblot-tests, immunochemie of ELISA. HRP is een heembevattend enzym dat de oxidatie van luminol katalyseert, wat resulteert in een lichtemissie van lage intensiteit van 428. Deze lichtemissie kan met een factor 100 worden verhoogd door bepaalde chemicaliën toe te voegen. Alkalische fosfatase defosforyleert eiwitten, nucleotiden en alkaloïden in een alkalische omgeving. De alkalische fosfatase wordt gewoonlijk afgeleid van de kalfsdarm en gebruikt in immunoassay resulteert in een chromogene detectie. Wanneer het AP-substraat wordt toegevoegd, resulteert het conjugaat in een kleurverandering die zichtbaar kan zijn bij 405 en gemakkelijk kan worden gekwantificeerd.


Avidine-Biotine Technisch Handboek

Ons 48 pagina's tellende Avidin-Biotin Technical Handbook brengt alles samen wat nodig is om eiwitten te biotinyleren, te zuiveren of te detecteren. Aanbevolen producten zijn onder meer biotinylerings- en zuiveringskits voor eiwit op het celoppervlak, labeling van antilichamen en nieuwe fotoreactieve biotinyleringsreagentia. Dit handboek bevat tientallen referenties samen met protocollen, tips voor het oplossen van problemen, selectiegidsen en een volledige lijst van beschikbare tools.

Kom meer te weten

Selecteer producten

Nadelen van het gebruik van het Avidine-biotinesysteem

Hoewel het Avidine-biotinesysteem eenvoudig in te stellen en te gebruiken is, kent het wel bepaalde beperkingen. Omdat elk gebiotinyleerd molecuul aan elk biotine-bindend eiwit zal binden, moeten deze reagentia worden gebruikt in combinatie met andere detectiesondesystemen (d.w.z. primaire-secundaire antilichamen) voor multiplex-experimenten.

Omdat biotine een biologisch molecuul is, kan endogeen biotine ook achtergrond- en specificiteitsproblemen veroorzaken bij het uitvoeren van tests met bepaalde biotinerijke weefsels en extracten (d.w.z. hersenen, lever, melk, eieren, maïs). Dit geldt ook voor monsters die endogene biotine-bindende eiwitten bevatten, zoals eieren (bron van Avidine) of bacteriën zoals Streptomyces avidini (bron van streptavidine).

Chemische structuur van HNS-Desthiobiotin. Let op de gewijzigde ringstructuur aan de rechterkant (native biotine heeft een dubbele ringstructuur die past in de bindingsplaats van Avidine, Streptavidine of NeutrAvidin).

Voor zuiveringstoepassingen is de sterkte van de bindingsinteractie tussen biotine en Avidine een factor die het nut ervan beperkt. Dit komt omdat er zware omstandigheden nodig zijn om de Avidine-biotine-bindingen te verbreken (d.w.z. om te dissociëren en te elueren), en deze kunnen doeleiwitten denatureren. Om deze beperking te overwinnen, zijn gemodificeerde versies van Avidine-harsen en gemodificeerde vormen van biotine-labelingreagentia in de handel verkrijgbaar die de interactie gemakkelijk omkeerbaar maken. Deze omvatten monomere Avidine, splitsbare disulfidebiotinereagentia en iminobiotine- en desthiobiotinederivaten (zie de bespreking van eiwitisolatie en -verrijking hieronder).

Kom meer te weten

Selecteer producten


Chromogene detectie versus fluorescentiedetectie

  • Eenvoudiger multiplexen: Meer kleuren en smallere emissiespectra dan chromogene kleurstoffen.
  • Betere doelco-lokalisatie: Fluorescerende kleurstoffen maken afzonderlijke identificatie van co-gelokaliseerde doelen mogelijk.
  • Hoger dynamisch bereik: Gemakkelijker om zeldzame en veel voorkomende doelen op dezelfde dia te visualiseren.
  • Minder stappen: Geen stap voor substraattoevoeging.
  • Lagere gevoeligheid: Enzym-geconjugeerde antilichamen kunnen worden geamplificeerd via indirecte detectie om de gevoeligheid te verhogen (zie hieronder)
  • Gevoelig voor fotobleken: Blootstelling aan licht kan het fluorescerende signaal na verloop van tijd verminderen.
  • Grotere gevoeligheid: Signaalversterking via indirecte chromogene detectie (zie hieronder) verhoogt de signaalsterkte.
  • Langdurig signaal: Chromogene vlekken zijn beter bestand tegen fotobleken dan fluorochromen.
  • Moeilijke doel-co-lokalisatie: Moeilijk om gemengde kleuren van een enkele kleur te onderscheiden wanneer doelen co-lokaliseren.
  • Smaller dynamisch bereik: Moeilijk om zeldzame en veel voorkomende doelen op dezelfde dia te visualiseren.
  • Moeilijk multiplexen: Minder kleuren en bredere emissiespectra dan fluorescerende kleurstoffen.

Fluorescerende detectie

Hoe werkt fluorescentiedetectie? Fluorescerende detectie vereist een met fluorochroom geconjugeerd antilichaam om licht uit te zenden wanneer het wordt gestimuleerd met licht met een kortere golflengte.

Kan ik een geconjugeerd primair antilichaam gebruiken in mijn IF-experiment? Bij de indirecte detectiemethode kunnen meerdere secundaire antilichamen binden aan een enkel primair antilichaam. Vanwege het vermogen om het signaal te versterken, is indirecte detectie vaak de voorkeursmethode voor IHC/IF-experimenten. Het kleuren van weefselantigeen met een primair geconjugeerd antilichaam wordt alleen aanbevolen voor zeer overvloedige weefselantigenen waarbij signaalamplificatie niet nodig is.

Kan ik multiplex IHC uitvoeren met behulp van fluorescentiedetectie? Het grote aantal beschikbare fluorochromen maakt de gelijktijdige detectie van meerdere doelen mogelijk vanwege hun vermogen om licht op unieke golflengten uit te zenden. Fluorochromen moeten zorgvuldig worden gekozen in multiplex-experimenten om spectrale overlap te minimaliseren. Bovendien moeten multiplex fluorescerende experimenten worden ontworpen om kruisreactiviteit te beperken. Door primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten te kiezen, kunnen problemen met betrekking tot kruisreactiviteit grotendeels worden genegeerd. In dit geval zullen soortspecifieke secundaire antilichamen slechts één primair antilichaam herkennen.

Voorbeeld van IHC-detectie door immunofluorescentie (IF):

CD31/PECAM-1 in muizenembryo. CD31-kleuring met behulp van Goat Anti-Mouse CD31/PECAM 1 Antigen Affinity-purified Polyclonal Antibody (Catalogus # AF3628).

GFAP in rattenneuronen. GFAP (groen) en Neurofilament Heavy (rood) kleuring met behulp van Rabbit Anti-Rat GFAP Polyclonal Antibody (Catalogus # NB300-141) en Chicken Anti-Rat NF-H Polyclonal Antibody (Catalogus # NB300-217).

Chromogene detectie:

Hoe werkt chromogene detectie? Antigeenexpressie wordt gevisualiseerd in chromogene detectie wanneer een oplosbaar substraat door een enzym wordt omgezet in een onoplosbaar gekleurd product dat wordt afgezet op de plaats van antigeenexpressie. De enzymen mierikswortelperoxidase (HRP) en alkalische fosfatase worden vaak gebruikt bij chromogene detectie en functie door 3,3'-diaminobenzidine (DAB) en 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) om te zetten in respectievelijk bruine en rode eindproducten.

Moet ik DAB, AEC of een ander chromogeen gebruiken? DAB is populairder dan AEC vanwege de lange levensduur en weerstand tegen vervaging bij blootstelling aan licht. Bij multiplexen wordt aanbevolen om chromogenen met tegengestelde kleuren te kiezen om spectrale overlap te beperken.

Kan ik multiplex IHC uitvoeren met chromogene detectie? Hoewel visualisatie van meerdere antigenen mogelijk is door chromogene detectie, kan de afzetting van twee kleuren op co-gelokaliseerde eiwitten de resultaten vertroebelen. Daarom wordt aanbevolen om alleen te multiplexen wanneer de antigenen beperkt zijn tot unieke cellulaire locaties. Dit maakt het gemakkelijker om elk doel te differentiëren.

Overleven bij menselijke rectale kanker. Survivine-kleuring met behulp van Rabbit Anti-Human Survivin Antigen Affinity-purified Polyclonal Antibody (Catalogus # NB500-201).

Stella/Dppa3 in ovariumweefsel van de muis. Duidelijke kleuring onderscheidt zich ontwikkelende muis-eicellen van eierstokweefsel met behulp van Goat Anti-Mouse Stella/Dppa3 polyklonaal antilichaam (catalogus # AF2566).


  • Inactivering van HRP.
  • Instabiliteit van de binding die HRP aan het antilichaam verbindt.
  • Microbiële aanval.
  • Denaturatie van het antilichaam.
  • Het prestatieverlies neemt toe met toenemende temperatuur en met toenemende verdunning van de conjugaten.

De geconjugeerde stabilisator/verdunner is een gepatenteerd reagenssysteem met meerdere componenten dat antilichaam-HRP-conjugaten beschermt tegen alle bovengenoemde negatieve factoren, waardoor de best mogelijke prestaties worden gegarandeerd bij experimenten die bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. Bovendien elimineert het vermogen om HRP-conjugaten op te slaan in werkende verdunningen verspilling en verbetert de consistentie van experiment tot experiment.

Naast de gepatenteerde enzymstabilisatoren bevat het antimicrobiële middelen en blokkers om de signaal-naar-achtergrond in immunoassay-toepassingen te verbeteren.


Soorten ELISA-test

ELISA bestaat hoofdzakelijk uit vier typen, namelijk directe, sandwich-, indirecte en competitieve ELISA.

Directe ELISA

Het omvat de volgende stappen:

  1. Voeg eerst het gebufferde eiwitmonster toe aan de putjes van de microtiterplaat.
  2. Voeg vervolgens oppervlakteblokkerende of niet-reagerende eiwitten zoals BSA (Bovine Serum Albumin), Caseïne enz. toe om het bodemoppervlak te blokkeren om de extra ruimte te bedekken en om valse binding of valse signalering te voorkomen.
  3. Voeg specifieke primaire antilichamen toe die zijn geconjugeerd met de enzymen, die direct aan het gewenste eiwit of antigeen zullen blijven plakken.
  4. Laat vervolgens de wasbuffer overstromen om de ongebonden eiwitten te verwijderen.
  5. Voeg substraat toe aan het bovenstaande complex, dat verder zal reageren met de enzymen en significante signalen zal produceren in de vorm van kleurverandering.

Indirecte ELISA

Het omvat de volgende stappen:

  1. Voeg eerst een buffereiwitmonster toe aan de putjes van de microtiterplaat.
  2. Voeg vervolgens oppervlakteblokkerende of niet-reagerende eiwitten zoals BSA (Bovine Serum Albumin), Caseïne enz. toe om het bodemoppervlak te blokkeren om de extra ruimte te bedekken en om valse binding of valse signalering te voorkomen.
  3. Voeg specifieke primaire antilichamen toe die zullen binden aan het eiwit van belang.
  4. Voeg vervolgens de wasbuffer toe om de ongebonden eiwitten te verwijderen.
  5. Voeg secundair antilichaam toe dat is geconjugeerd met enzymen, die zullen binden aan het antigeen-antilichaamcomplex.
  6. Voeg opnieuw wasbuffer toe om de ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.
  7. Voeg substraat toe aan het bovenstaande complex, dat verder zal reageren met de enzymen en significante signalen zal produceren in de vorm van kleurverandering.

Broodje ELISA

Het omvat de volgende stappen:

  1. Bij deze techniek voegt u het antiserum toe aan de putjes van de microtiterplaat.
  2. Daarna zullen de antistoffen die in het antiserum aanwezig zijn zich aan het putoppervlak hechten.
  3. Voeg vervolgens de testantigenen toe, die later worden gekoppeld aan de homologe antilichamen.
  4. Voeg enzymen toe met het label specifieke antilichamen, die uiteindelijk zullen binden met de antigenen die zijn gekoppeld aan de antilichamen die aan het putoppervlak zijn gehecht. Deze reactie resulteert in de vorming van een antilichaam-antigeen-antilichaamcomplex, dat lijkt op een sandwich.
  5. Add the enzyme-substrate to the above complex, after which it will react with the enzymes and degrade the substrate molecules by the enzymatic activity.

Competitive ELISA

It includes the following steps:

  1. Firstly, coat the bottom of the well that will capture the antibody.
  2. Then, add surface blocking proteins with BSA or detergents.
  3. Mix the sample with enzyme-conjugated proteins.
  4. After that, add the mixture to the well-containing antibodies that are adhered to its surface.
  5. Wash the wells with washing buffer to remove unbound proteins.
  6. Add substrate to the above complex, which will react with the enzymes and indicate the presence of protein or antigen in the given sample by giving a significant colour.

Qualitative Measure of ELISA

For the qualitative measure or to detect the presence of antigens or antibodies, the enzymen are used. It is very much clear from the name itself that the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay makes the use of an enzyme system. In the ELISA method, the most commonly used enzymes are as follows:

  1. HRP: It stands for Horseradish peroxidase. HRP uses the following substrates viz. OPD, TMB, ABTS etc.
    • OPD gives Amber colour to the solution.
    • TMB gives Blauw colour to the solution.
    • ABTS gives a groente colour to the solution.
  2. AP: It stands for Alkaline phosphatase. AP makes the use for PNPP substrate that gives a geel colour to the solution.

Therefore, in ELISA, positive and negative results are made based on the colour change. If the solution remains colourless even by the addition of substrate, then it results in negative ELISA. If the colour of the solution changes from colourless, then it will indicate the presence of analyte or protein of interest.

Quantitative Measure of ELISA

For the quantitative measure of ELISA, there are some key points that we have to remember, like:

  • Steekproef: The sample is added either in duplicates or triplicates. Suppose, we have 40 samples, then the sample is added twice, and if we have 20 samples, then it is added thrice. Therefore, the addition of a sample depends upon the number of samples we have. Triplicates of a sample are considered to be better than the duplicates because it reduces the chances of error in the result.
  • Standaard: To prepare standard of the given sample, the sample is diluted in a series of 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, and 32.
  • Positive control: Positive control is the known concentration of the sample.
  • Blank samples: It contains everything as protein.
  • Standard-curve: The standard curve is prepared by diluting the concentrated samples to find the unknown concentration of the protein by plotting a graph between adsorption and concentration.

Advantages of ELISA Test

  1. ELISA is the qualitative en quantitative assay, i.e. it not only detects the presence of the analyte but also detects the concentration or quantity of the analyte.
  2. It can screen a large number of samples in a single take.
  3. ELISA can be easily automated.

Disadvantages of ELISA Test

  1. ELISA does not give any information about the biochemical properties of the analyte such as molecular weight, distribution among the living organisms etc.
  2. To know the molecular weight and more information about the analyte, a technique like Western blotting is generally employed.
  3. ELISA is a very sensitive method to perform, which requires more precautions while experimenting.

Therefore, the ELISA has both advantages along with some disadvantages. Inspite of this, it is an advantageous technique in medical science and research.


HRP-conjugated Beta Tubulin Monoclonal antibody

HeLa cells were subjected to SDS PAGE followed by western blot with HRP-66240 (beta Tubulin antibody) at dilution of 1:50000 incubated at room temperature for 1.5 hours.

HeLa cells were subjected to SDS PAGE followed by western blot with HRP-66240 (beta Tubulin antibody) at dilution of 1:50000 incubated at room temperature for 1.5 hours.

Proteintech Guarantee

The Proteintech guarantee covers Proteintech antibodies in any species and any application, including those not listed on the datasheet. If the antibody doesn’t perform, you can receive a hassle-free refund or credit note.

Tested Applications

Recommended dilution

SollicitatieDilution
Western Blot (WB)WB : 1:20000-1:100000
Sample-dependent, check data in validation data gallery

Product Information

HRP-66240 targets Beta Tubulin in WB applications and shows reactivity with human, mouse, rat, nematode, pig, zebrafish samples.

Tested Reactivity human, mouse, rat, nematode, pig, zebrafish
Host / Isotype Mouse / IgG2a
Class Monoclonal
Type Antibody
Immunogen Beta Tubulin fusion protein Ag0117
Voor-en achternaam tubulin, beta 3
Calculated molecular weight 450 aa, 50 kDa
Observed molecular weight 50-55 kDa
GenBank accession numberBC000748
Gene symbol TUBB3
Gene ID (NCBI) 10381
Conjugate HRP Fluorescent Dye
Formulier Liquid
Purification Method Protein A purification
Opslagbuffer PBS with 50% Glycerol, 0.05% Proclin300, 0.5% BSA, pH 7.3.
Storage ConditionsStore at -20°C. Avoid exposure to light. Stable for one year after shipment. Aliquoting is unnecessary for -20 o C storage.

Background Information

There are five tubulins in human cells: alpha, beta, gamma, delta, and epsilon. Tubulins are conserved across species. They form heterodimers, which multimerize to form a microtubule filament. An alpha and beta tubulin heterodimer is the basic structural unit of microtubules. The alpha and beta tubulins (+/- 55 kDa MW) are homologous but are not identical. Beta tubulins have been widely used as loading control.

What is the molecular weight of beta-tubulin? Are there any isoforms of beta-tubulin?

The molecular weight of tubulin is 50-52 kDa. Humans have eight beta-tubulin isotypes, encoded by different genes, that differ in their C-terminal sequences. They have different tissue expression profiles and can rise to microtubules of different properties (PMID: 20191564).

How to use beta-tubulin as a loading control

Beta-tubulin is one of the most commonly used references as a loading control for cell lysates in western blotting. It is abundantly expressed across various tissues and developmental stages and highly conserved across species. However, since some variability has been observed in the expression levels of commonly used housekeeping genes (PMID: 15627964), it is recommended that more than one loading control antibody is used while developing new assays. More information can be found here: https://www.ptglab.com/news/blog/loading-control-antibodies-for-western-blotting/.

What drugs can influence beta-tubulin and organization of microtubules?

Many drugs that affect microtubule dynamics target beta-tubulin, mainly by interfering with the GTP hydrolysis (PMID: 21381049). Paclitaxel (Taxol) is used to stabilize microtubules by slowing down their depolymerization, while colchicine and vinca alkaloids (vinblastine) destabilize microtubules. They are used in research and also in the clinic as anti-cancer agents.

Is beta-tubulin post-translationally modified?

Yes, tubulins are subject to extensive post-translational modifications (PTMs) that affect the organization of microtubules and their dynamics. The most common modifications include polyglutamylation, polyglycylation, polyamination, glycososylation, glycation, phosphorylation, and acetylation (PMID: 24801181 and 25468068).


Bekijk de video: Afweerreactie antistoffen u0026 antigenen - Afweer #1 - Cactuss Biologie (Januari- 2022).