Informatie

Kun je malariaparasieten in speeksel vinden?


Kun je plasmodiumparasieten (malaria) vinden in speeksel onder de microscoop van iemand die besmet is? Of zit het alleen in het bloed?


Nee.
Hoewel malaria wordt overgedragen via de speeksel van een vrouw Anopheles mug, het blijft in de bloedbaan en gaat niet over in het speeksel van de mens (anders zou het waarschijnlijk rechtstreeks via de mens worden overgedragen). Zodra de parasieten naar de lever reizen, infecteert en barst het hepatocyten na (aseksueel) reproduceren. De burst-cellen infecteren vervolgens de bloedbaan via rode bloedcellen, waar de parasieten zich verder voortplanten en uiteindelijk hun gastheercel barsten, wat leidt tot een vicieuze cirkel. Dit hele proces heeft alleen te maken met de bloedbaan, aangezien de parasieten in rode bloedcellen leven.

Er zijn echter bepaalde markers in het speeksel die kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van malaria op te sporen. PfHRP2, of Plasmodium falciparum histadine-rijk eiwit 2. Dit geldt alleen voor mensen die besmet zijn met het type parasiet P. falciparumhet is echter dit type parasiet dat de oorzaak is van de overgrote meerderheid van sterfgevallen en complicaties tijdens malaria-infectie. Het bereik van PfHRP2-waarden in het speeksel van malaria-positieve patiënten varieerden van 17 tot 1167 pg/ml in één onderzoek.

Referenties:


Nieuwe op speeksel gebaseerde test detecteert malaria voordat de symptomen verschijnen

Een eenvoudig te gebruiken speekseltest om te screenen op de parasiet die malaria veroorzaakt, is ontwikkeld door een team van onderzoekers onder leiding van een wetenschapper van de Universiteit van Florida.

De niet-invasieve "spuugtest" zou een belangrijk hulpmiddel kunnen zijn bij het uitroeien van malaria, waaraan elke twee minuten een kind sterft, zegt UF-onderzoeker infectieziekten Rhoel Dinglasan. Het onderzoek naar de test is vandaag gepubliceerd in Science Translational Medicine.

Momenteel testen clinici op malaria met behulp van een bloedtest, maar de test heeft nadelen die de effectiviteit ervan verminderen. De test vereist huidprikken die vaak belastend zijn voor kinderen en hun ouders. Bloedonderzoeken zijn vaak minder betrouwbaar omdat subklinische infecties met de parasieten die malaria veroorzaken door dergelijke tests gemist kunnen worden, waardoor sommige patiënten malaria kregen, hoewel ze dachten dat ze malariavrij waren. De tests vereisen ook een infrastructuur, zoals mobiele klinieken en opgeleid personeel, en kunnen leiden tot accidentele blootstelling aan bloed voor zowel patiënten als kliniekmedewerkers.

Daarentegen hoeft de speekseltest alleen in een buisje te worden gespuugd, en de test kan buiten een klinische omgeving worden toegediend, idealiter in scholen of gemeenschapscentra, zegt Dinglasan. Vroege detectie kan leiden tot vroege behandeling en het voorkomen van ziekte en verdere overdracht van malaria.

"Wat als we een kind kunnen identificeren voordat ze ziek worden omdat er iets in hun speeksel zit", zegt Dinglasan. "Als we ze eerder bereiken, kunnen ze worden genezen voordat ze de ziekte krijgen."

Een basisschoolleerling van de derde graad uit het Mfou-district van Kameroen in Centraal-Afrika deponeert speeksel in een buis die deel uitmaakt van een nieuwe test die malaria kan detecteren voordat de symptomen optreden. (Foto geleverd door Rhoel Dinglasan.)

Vroege, subklinische detectie van malaria is cruciaal voor de uitroeiing van malaria, omdat personen die de parasiet dragen zonder symptomen te vertonen, het reservoir zijn dat leidt tot infectie van muggen en overdracht van de ziekte. Het detecteren van de aanwezigheid van de parasiet voordat de symptomen verschijnen, kan levens redden, omdat malaria vaak pas enkele dagen nadat de parasiet is ontdekt, uitbreekt.

De speekseltest detecteert een nieuwe biomarker voor Plasmodium falciparum-parasieten. In sommige delen van de wereld hebben de parasieten een mutatie gekregen en worden ze daarom niet meer gedetecteerd door de op bloed gebaseerde tests, zegt Dinglasan. Maar de speekseltest detecteert een essentieel eiwit dat de parasiet nodig heeft om te overleven, wat het probleem van mutatie zou moeten voorkomen en de test op lange termijn effectief moet houden. De diagnostische test detecteert vrouwelijke parasieten die circuleren in een geïnfecteerde mens die asymptomatisch is maar de parasiet draagt ​​en waarschijnlijk binnen een week malaria krijgt. Het voordeel van het detecteren van vrouwtjes ten opzichte van mannetjes is dat er vier keer zoveel vrouwelijke parasieten zijn als mannetjes in een geïnfecteerde mens.

Dinglasan begon in 2014 aan de test te werken met financiering van de Bill & Melinda Gates Foundation, terwijl hij nog aan de Johns Hopkins University was, die de test in licentie heeft gegeven. Het onderzoeksteam bestaat uit 24 wetenschappers en de studie werd uitgevoerd met meer dan 300 kinderen in Kameroen, Zambia en Sierra Leone.

Malaria doodt elk jaar ongeveer 500.000 kinderen, meestal onder de 5 jaar in Sub-Sahara Afrika.

"We proberen de overdracht van malaria te begrijpen door te werken met mensen die nog niet ziek zijn, want dat zijn de mensen die we missen in de kliniek", zegt Dinglasan. “Malaria is als een grote ijsberg die we altijd bovenaan, boven de waterlijn, hebben weggeknipt. Maar het is de onderkant van de ijsberg, dit reservoir voor transmissie, dat we niet begrijpen omdat het een populatie is die we tot nu toe niet konden zien.

"Deze test brengt ons onder die waterlijn, zodat we kunnen zien hoe groot het reservoir is", zegt Dinglasan.


Nieuwe diagnostische test voor malaria gebruikt speeksel, geen bloed

Sub-Sahara Afrika draagt ​​de last van de malariagevallen in de wereld. Krediet: Franco Volpato/Shutterstock.com

Zal dit de instructie worden die we ontvangen bij het betreden van klinieken, scholen, apothekers en toegangspoorten over de hele wereld?

Een van de belangrijkste factoren die de voortdurende overdracht van malaria mogelijk maken, zijn personen die vrij zijn van symptomen, maar de malariaparasiet in hun bloed dragen. De aantallen parasieten in het bloed zijn echter zo laag dat ze met de huidige diagnostische tests niet kunnen worden opgespoord. Aangezien deze personen niet ziek zijn en geen kliniek bezoeken, is de ware omvang van dit parasietenreservoir in de menselijke populatie onbekend.

Globalisering maakt de situatie nog ingewikkelder. Personen met asymptomatische infecties kunnen nu ongewild malariaparasieten over de grens met zich meedragen, in vliegtuigen, schepen en vrachtwagens. Aangezien individuen die de malariaparasiet bij zich dragen vaak landen die malariavrij zijn binnenkomen en verlaten, bestaat er altijd het risico dat muggen deze geïnfecteerde individuen bijten, de parasiet oppikken en lokale overdracht van de ziekte veroorzaken.

Als de parasiet in het bloed zit en niet kan worden gedetecteerd, is er dan hoop dat we de wereldwijde malaria binnen de komende 10 jaar met meer dan 90 procent kunnen verminderen? Mijn collega's en ik van het UF Emerging Pathogens Institute hebben onlangs een nieuwe test ontwikkeld die het bewijs van de malariaparasiet kan detecteren met behulp van speeksel in plaats van bloed.

Je vijfde verjaardag halen

Elke twee minuten sterft er een kind onder de 5 jaar aan malaria. Elk jaar vallen er meer dan 400.000 sterfgevallen als gevolg van malaria, een ziekte die wordt veroorzaakt door een parasiet die wordt verspreid door muggen en die al millennia samen met de menselijke samenleving is geëvolueerd.

Aangezien een groot deel van de ziektelast zich voordoet in Afrika bezuiden de Sahara, is het iets dat degenen onder ons in ontwikkelde landen zelden horen en zich zelden zorgen maken. Maar meer dan een derde van de wereldbevolking loopt het risico besmet te raken.

Sinds 2007 is de wereld verwikkeld in een verheven streven om deze ziekte voorgoed uit te bannen, zo niet uit te roeien. Eliminatie is lokale of regionale uitroeiing houdt in dat de ziekte wereldwijd wordt uitgeroeid. Als malarioloog en vectorbioloog die bijna twee decennia in deze discipline werkte, had ik het geluk om deel uit te maken van de 'denktank' die de basis vormde voor de wereldwijde routekaart voor de uitroeiing van malaria.

Ik werk in ziekte-endemische landen in Afrika bezuiden de Sahara en heb de dagelijkse tol van ouders gezien als ze hun kinderen, hun kleine babymeisje of -jongen, zien bezwijken aan deze ziekte. Ik herinner me een bijzonder ontroerend incident niet zo lang geleden, toen ik met een klein meisje aan het praten was buiten een kliniek in Kameroen. Ze was even oud als mijn eigen 5-jarige dochter en de clinici behandelden haar broer voor malaria.

Hoe malaria zich verspreidt van de mug, die de parasiet draagt, naar de mens naar de mug en de overdrachtscyclus voortzet. Krediet: solar22/Shutterstock.com

Terwijl ik luisterde naar haar geanimeerde poging om in 'Amerikaans Engels' tegen me te praten, werd ik plotseling overweldigd. Het was een krachtige herinnering aan waarom de rest van de wereld de vreselijke tol die deze ziekte van de allerjongsten eist, niet kan negeren. Dit onder vele herinneringen versterkte mijn overtuiging om in een of andere vorm te blijven bijdragen aan de uitroeiing van malaria.

Ondanks de gezamenlijke wereldwijde inspanning die heeft geleid tot een aanzienlijke daling van het aantal sterfgevallen van 2 miljoen tot minder dan een half miljoen per jaar, blijft de overdracht van de parasiet over.

Vroege opsporing, vroege behandeling, geen malaria

Een innovatief diagnostisch hulpmiddel kan nu kinderen identificeren die besmet zijn met malariaparasieten, maar die nog niet ziek zijn. Door vroege detectie kunnen gezondheidswerkers nu vroegtijdige behandeling bieden en de symptomatische waterval naar malaria in wezen voorkomen.

De huidige diagnostische tests voor malaria hebben een probleem. Dat probleem is bloed. Elke alleenstaande ouder die zijn kind naar een zorgverlener heeft gebracht, weet wat een hels gehuil een naald of een scherp lancet zal opleveren. Voor sommige volwassenen veroorzaakt het geven van bloed als kind een levenslang trauma.

Maar waarom moet het bloed zijn? Door de fundamentele biologie van de parasiet in zijn menselijke gastheer te begrijpen en met een beetje serendipiteit werd het me duidelijk dat er niet-invasieve opties bestaan ​​om de parasiet op te sporen.

Na een routinematige schoonmaak van zes maanden bij de tandarts, waarbij de mondhygiënist me per ongeluk beet, realiseerde ik me dat de barrière tussen bloed en speeksel misschien laag is, vooral als je een tandvleesaandoening hebt die gingivitis wordt genoemd (vaak in landen met een slechte algehele gezondheid). zorg). Was het mogelijk, vroeg ik me af, dat de parasiet een molecuul uitscheidt dat we in speeksel kunnen detecteren? Het blijkt dat dit inderdaad het geval was.

Mijn team en ik in Florida hebben een mobiel prototype ontwikkeld van de geconceptualiseerde snelle test (vijf tot twintig minuten), die we beschrijven in Science Translational Medicine. Ons apparaat gebruikt slechts 10 microliter – 1/478ste van het volume van een theelepel – speeksel om een ​​nieuw eiwit genaamd PSSP17 te detecteren dat wordt uitgescheiden door de parasiet. We hebben het getest met speeksel van 5- tot 15-jarige kinderen in Kameroen, Zambia en Sierra Leone die vrij zijn van malariasymptomen.

De speekseltest werkt in principe net als andere op bloed gebaseerde malaria-sneldiagnostische tests met een teststrip in een plastic cassette, vergelijkbaar met een zwangerschapstest. Het is belangrijk op te merken dat de draagbare speekseltest bijna net zo gevoelig is als een moleculaire diagnostische test, die alleen verkrijgbaar is in een laboratorium.

Aangezien de commerciële release in de komende drie jaar wordt verwacht, zijn er diepgaande discussies over het potentiële nut van deze innovatie als commercieel product. Met een speekseltest over een paar jaar, hoeveel meer kinderen kunnen nu hun vijfde verjaardag vieren?

Dit artikel is opnieuw gepubliceerd vanuit The Conversation onder een Creative Commons-licentie. Lees het originele artikel.


Spittest detecteert aanwezigheid van malaria-veroorzakende parasieten

De niet-invasieve "spuugtest" zou een belangrijk hulpmiddel kunnen zijn bij het uitroeien van malaria, waaraan elke twee minuten een kind sterft, zegt UF-onderzoeker infectieziekten Rhoel Dinglasan.

Momenteel testen clinici op malaria met behulp van een bloedtest, maar de test heeft nadelen die de effectiviteit ervan verminderen. De test vereist huidprikken die vaak belastend zijn voor kinderen en hun ouders. Bloedonderzoeken zijn vaak minder betrouwbaar omdat subklinische infecties met de parasieten die malaria veroorzaken door dergelijke tests gemist kunnen worden, waardoor sommige patiënten malaria kregen, hoewel ze dachten dat ze malariavrij waren. De tests vereisen ook een infrastructuur, zoals mobiele klinieken en opgeleid personeel, en kunnen leiden tot accidentele blootstelling aan bloed voor zowel patiënten als kliniekmedewerkers.

Daarentegen hoeft de speekseltest alleen in een buisje te worden gespuugd, en de test kan buiten een klinische omgeving worden toegediend, idealiter in scholen of gemeenschapscentra, zegt Dinglasan. Vroege detectie kan leiden tot vroege behandeling en het voorkomen van ziekte en verdere overdracht van malaria.

"Wat als we een kind kunnen identificeren voordat ze ziek worden omdat er iets in hun speeksel zit", zegt Dinglasan. "Als we ze eerder bereiken, kunnen ze worden genezen voordat ze de ziekte krijgen."

Vroege, subklinische detectie van malaria is cruciaal voor de uitroeiing van malaria, omdat personen die de parasiet dragen zonder symptomen te vertonen, het reservoir zijn dat leidt tot infectie van muggen en overdracht van de ziekte. Het detecteren van de aanwezigheid van de parasiet voordat de symptomen verschijnen, kan levens redden, omdat malaria vaak pas enkele dagen nadat de parasiet kan worden gedetecteerd uitbreekt.

De speekseltest detecteert een nieuwe biomarker voor Plasmodium falciparum parasieten. In sommige delen van de wereld hebben de parasieten een mutatie gekregen en worden ze daarom niet meer gedetecteerd door de op bloed gebaseerde tests, zegt Dinglasan. Maar de speekseltest detecteert een essentieel eiwit dat de parasiet nodig heeft om te overleven, wat het probleem van mutatie zou moeten voorkomen en de test op lange termijn effectief moet houden.

De diagnostische test detecteert vrouwelijke parasieten die circuleren in een geïnfecteerde mens die asymptomatisch is maar de parasiet draagt ​​en waarschijnlijk binnen een week malaria krijgt. Het voordeel van het detecteren van vrouwtjes ten opzichte van mannetjes is dat er vier keer zoveel vrouwelijke parasieten zijn als mannetjes in een geïnfecteerde mens.

Videokrediet: Universiteit van Florida

Dinglasan begon in 2014 aan de test te werken met financiering van de Bill & Melinda Gates Foundation, terwijl hij nog aan de Johns Hopkins University was, die de test in licentie heeft gegeven. Het onderzoeksteam bestaat uit 24 wetenschappers en de studie werd uitgevoerd met meer dan 300 kinderen in Kameroen, Zambia en Sierra Leone.

Malaria doodt elk jaar ongeveer 500.000 kinderen, meestal onder de 5 jaar in Sub-Sahara Afrika.

"We proberen de overdracht van malaria te begrijpen door te werken met mensen die nog niet ziek zijn, want dat zijn de mensen die we missen in de kliniek", zegt Dinglasan. “Malaria is als een grote ijsberg die we altijd bovenaan, boven de waterlijn, hebben weggeknipt. Maar het is de onderkant van de ijsberg, dit reservoir voor transmissie, dat we niet begrijpen omdat het een populatie is die we tot nu toe niet konden zien.

"Deze test brengt ons onder die waterlijn, zodat we kunnen zien hoe groot het reservoir is", zegt Dinglasan.

Dit artikel is opnieuw gepubliceerd op basis van materiaal van de Universiteit van Florida. Opmerking: materiaal is mogelijk bewerkt voor lengte en inhoud. Voor meer informatie kunt u contact opnemen met de genoemde bron.


DISCUSSIE

Er is een onvervulde behoefte aan gevoelige diagnostische PON-tests die subklinisch dragerschap van kunnen identificeren Plasmodium aseksuele parasieten en gametocyten in menselijke populaties in klinische, haven-, school- of thuisomgevingen. Een dergelijke behoefte is meer uitgesproken in de context van de eliminatie en uitroeiing van malaria, vooral omdat landen die de eliminatiefase ingaan, geconfronteerd zullen worden met de uitdaging om dragerschap van parasieten met een lage dichtheid op te sporen te midden van een afname van de infectieprevalentie. Hoewel er een hernieuwde aandacht is voor het verbeteren van de huidige op bloed gebaseerde tests die PfHRP2 detecteren, omdat zowel gametocyten als aseksuelen PfHRP2 hebben, en gezien het feit dat hoogstens slechts 2% van de totale parasietbiomassa gametocyten zijn (27), is het moeilijk voor te stellen hoe PfHRP2 een geschikte biomarker zou zijn voor gametocyten. De gegevens die het resultaat zijn van vijf rondes van RDT-profileringstests die zijn uitgevoerd door de WHO in samenwerking met FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics), suggereren dat slechts een handvol bestaande op bloed gebaseerde RDT's 200 aseksuele parasieten/μl bloed kan detecteren. We hebben echter gevonden dat de ondergrens van LM-detecteerbare subklinische drager varieert van 1 tot 10 gametocyten/μl bloed. Op basis van onze onderzoeken onder kinderen op scholen kan subklinische dragerschap optreden bij lage aantallen of (minder vaak) de volledige afwezigheid van aseksuele stadia, vaker voorkomend bij gemengde gametocyten/aseksuele infecties, met dichtheden die 10 keer lager zijn dan de ondergrens getest in de WHO-FIND-studie. Het belangrijkste probleem van de circulatie van HRP2-deletieparasieten in Afrika bezuiden de Sahara, dat het nut van HRP2 als biomarker voor malariadetectie effectief beperkt, kan niet worden genegeerd (12).

Het potentiële nut van niet-invasieve benaderingen voor het nemen van biovloeistoffen voor snelle malariadiagnose is nog niet volledig onderzocht. Orale vloeistof biedt een aantrekkelijke optie, gezien het inherent lagere infectierisico (afwezigheid van scherpe voorwerpen tijdens verzameling), culturele acceptatie (in tegenstelling tot mogelijke culturele bloedtaboes) en ruime monsterhoeveelheid tijdens een enkele verzameling (in tegenstelling tot 5 tot 10 μl van bloed afgenomen uit vingerprikken). In onze studie werden 2 tot 5 ml speekselverzamelingen snel uitgevoerd en konden deze door elke proefpersoon onafhankelijk worden uitgevoerd, zelfs voor de 5-jarige kinderen. Anekdotisch beschouwden de kinderen de verzameling als een leuke 'spuugwedstrijd', in tegenstelling tot de perceptie van het verzamelen van vingerprikmonsters. Recente pogingen om eiwitten van malariaparasieten in speeksel te identificeren, zijn echter niet succesvol geweest. Een proteomische analyse van speeksel van symptomatische individuen onthulde slechts drie eiwitten die ondubbelzinnige eiwittoewijzingen bereikten aan P. falciparum: porfobilinogeendeaminase (PF3D7_1209600) en twee isovormen van heat shock protein 70, PfHSP70/PfHSP70-2 (PF3D7_0818900 en PF3D7_0917900) (28). De twee HSP70-eiwitten, PF3D7_0818900 en PF3D7_0917900, met Mascot-ionenscores van respectievelijk 219 en 160, werden ook geïdentificeerd in onze gepoolde speekselmonsters toen we een in-gel-digestie gebruikten gevolgd door LC-MS/MS-benadering. Hoewel eerder was beschreven dat ze aanwezig waren in speeksel, vanwege de hoge mate van conservering van de sequentie met humaan heatshock 70-kDa-eiwit 1A/1B (P17066 | HSP76_HUMAN), hebben we ze uitgesloten van onze definitieve eiwitlijst. PfHRP2 is eerder gedetecteerd in het speeksel van malariapatiënten in Ghana (29) en de Filippijnen (30) door een gevoelige sandwich-ELISA-methode (enzym-linked immunosorbent assay), maar voor zover ons bekend is HRP2 niet adequaat gemeten bij personen met subklinische infectie. PfHRP2 is een notoir moeilijk te identificeren eiwit door MS en vereist uitgebreide monsterverrijking. We hebben onze monstervoorbereiding en LC-MS/MS-analysemethodologie getraind en geoptimaliseerd met behulp van in vitro gekweekte, volwassen stadium V-gametocyten (23), en realiseerde zich daarbij dat de eerdere pogingen om lectine-uitputtingsmethoden te gebruiken (28) waren niet nodig. Deze uitputtingsmethoden hebben mogelijk geleid tot monsterverlies in tegenstelling tot verrijking van parasieteiwit. Onze analyse van speeksel van kinderen met subklinische infectie resulteerde in een 13-voudige toename van het parasieteiwitrepertoire van deze biovloeistof. Gezien onze ervaring met PfHRP2 en speekselproteomics, verwachten we niet de gemakkelijke MS/MS-detectie van PfHRP2 in deze biovloeistof. We ontdekten eerder dat ELISA effectiever was in het kwantificeren van dit eiwit.

We hebben PSSP17 (PF3D7_1218800) geselecteerd als onze kandidaat-vrouwspecifieke gametocytmarker in deze proof-of-concept-studie. De reden voor deze selectie was (i) PSSP17 werd ontdekt in gepoold speeksel en individuele speekselmonsters en (ii) PSSP17 werd gekarakteriseerd als een vrouwelijk specifiek gametocyt-eiwit (23), daarom vermoedelijk overvloediger in biovloeistof gezien de vrouwelijke tot mannelijke gametocytverhouding van 4:1. LC-MRM biedt een aantrekkelijke strategie voor het profileren van monsters zonder de vereiste van een hoge monsterconcentratie en lage monstercomplexiteit, die traditionele MS-benaderingen gewoonlijk belemmert (31). MRM is noch een PON-test, noch een potentiële populatiebrede screeningsbenadering, maar LC-MRM stelde ons in staat om de overvloed aan een kandidaat-eiwitbiomarker te schatten (32) en om de potentiële detectie ervan te evalueren door middel van op antilichamen gebaseerde benaderingen (33), die gewoonlijk worden gebruikt als detectiemethode voor op laterale flow gebaseerde tests zoals malaria-RDT's. We merkten ook een onverwachte retentietijdverschuiving van 0,16 min op voor PSSP17 in ons LC-MRM-onderzoek, alleen aanwezig in de natuurlijk geïnfecteerde speekselmonsters van kinderen in Kameroen en Zambia. Er zijn twee waarschijnlijke mogelijkheden die verantwoordelijk zijn voor deze minimale verschuiving, die niet werd waargenomen bij het gebruik van "normaal" naïef menselijk speeksel verrijkt met gekweekte stadium V-gametocyten. Ten eerste is het moeilijk om de biologie van kinderen in malaria-endemische gebieden te recapituleren, waaronder systemische aandoeningen als gevolg van hemoglobinopathieën, ernstige bloedarmoede en andere maagaandoeningen als gevolg van ondervoeding. Dergelijke omstandigheden kunnen leiden tot verhogingen van galzuren, ijzerconcentraties en andere speekselmatrixstoringen die de retentietijd kunnen beïnvloeden (34). We hebben echter met succes de aanwezigheid van gametocyten in een subset van deze kinderen door qPCR bevestigd, wanneer alleen de LC-MRM-analyse positief dragerschap aangaf, wat de aanwezigheid van stadium V-gametocyten in het bloed aantoont. Verder hebben we de LFIA gebruikt om orthogonaal aan te tonen dat eiwit aanwezig was in het speeksel van deze kinderen. De echte LOD, gevoeligheid en specificiteit voor de PON-test op basis van de PSSP17-marker in speeksel zijn nog niet bepaald en vormen de focus van de volgende fase in de preklinische beoordeling en veldvalidatie van deze niet-invasieve RDT met behulp van absolute kwantitatieve proteomische analyses.

Een grote kracht van onze studie is dat alle LC-MRM-analyses werden uitgevoerd op geblindeerde monsters, waarbij de LM- en qPCR-gegevens onbekend waren. Bovendien hebben we, door willekeurige steekproeven met gepaarde datasets (qPCR en LC-MRM) te selecteren, de vertekening verminderd die anders een onevenredig grote invloed zou hebben op hoe goed de snelle laterale stroomtest presteerde. Door deze benadering te volgen, konden individuele monsters opnieuw worden gecontroleerd met bijpassende orthogonale metingen om de detectielimieten van de LFIA te beoordelen. Een beperking van deze studie is dat we vertrouwen op: pfs25 qPCR-assays om de dichtheid van gametocyten in bloed te schatten, wat een andere biovloeistof is dan die gebruikt in de LFIA. Het afnemen van vingerprikbloed (100 l) van personen met een zeer lage gametocytendichtheid (A042 en A081) kan ertoe leiden dat de amplificatie niet kan worden geamplificeerd. pfs25, vermoedelijk vanwege de relatief lage kans om een ​​gametocyt te bemonsteren, detecteerde onze laterale flow-test PSSP17 in 10 μl speeksel van deze twee kinderen. We verwachten dat aanvullende ontwikkeling nodig is waar we onze bekende standaardconcentraties van PSSP17 (detecteerbaar door laterale stroom) en hun correlatie met gametocytendichtheden kunnen benutten. Omdat ons veronderstelde mechanisme echter afhankelijk is van een uitgescheiden PSSP17-marker, zullen dergelijke studies axenisch kweekmedium moeten gebruiken, in tegenstelling tot seriële verdunningen van gezuiverde, gametocyt-geïnfecteerde rode bloedcellen. Een andere belangrijke overweging is de mogelijke tijdelijke relatie tussen de detectie van PSSP17 in speeksel met de aanwezigheid van gametocyten en trofozoïeten in het bloed. Net als de bekende stabiele aanwezigheid van HRP2 in bloed, wat een infectie vertegenwoordigt die wordt geklaard, kan PSSP17 in speeksel achterblijven, ook al zijn gametocyten in het bloed geklaard. Dit kan een verklaring zijn voor de geconstateerde discrepanties tussen moleculaire detectie van gametocyten/aseksuelen in bloed en het positieve LFIA-signaal dat wijst op de aanwezigheid van PSSP17 in speeksel. Een bijzonder provocerende gedachte zou echter zijn dat rijpe gametocyten die zich in capillaire bedden vastzetten - of zelfs gametocyten ontwikkelen, afgezonderd in het beenmerg - PSSP17 kunnen afscheiden, wat resulteert in het niet detecteren van gametocyten door microscopie of PCR. Om de bruikbaarheid van de LFIA-test voor epidemiologische landschapsarchitectuur te beoordelen, zal verdere evaluatie moeten worden uitgevoerd in gebieden waar de overdracht van malaria zo drastisch is verminderd dat deze laag en onstabiel is.

Een van de beperkingen die we opmerkten tijdens de progressieve ontwikkeling van de LFIA was dat, afhankelijk van het lot-/batchnummer van de chromatografische strip, het detectie-antilichaam (mAb 27C9.B5-EuChelate-deeltjesconjugaat) gedeeltelijk kan worden opgesloten in het membraan van het laadkussen. koppel. Dit leidt tot een vermindering van een positief signaal in de testlijn, een controlelijn of beide. Deze variabiliteit in de vervaardiging van de laterale stroomstrip zelf maakte de interpretatie van de aanwezigheid/afwezigheid van PSSP17 voor een bepaald speekselmonster niet noodzakelijk ongeldig. In ons onderzoek moet een test als positief worden beschouwd als zowel de test- als de controlelijn een positief signaal hebben (ongeacht de intensiteit). De prototypetest is in zijn huidige vorm niet kwantitatief, dus variatie in signaalintensiteit heeft geen impliciete betekenis (geen correlatie met parasitemie). Een positief signaal op een gevalideerde diagnostische test, hoewel zwak, zou nog steeds dezelfde reactie (behandeling) veroorzaken. We verwachten dat dit potentiële probleem kan worden opgelost tijdens de ontwikkeling en optimalisatie van een commerciële testkit met behulp van deze technologie.

Het potentieel van het gebruik van dezelfde snelle test voor detectie Plasmodium vivax subklinische gametocytemische dragerschap, die gelijktijdig is met aseksuele parasitaire infectie, dwingt tot verder onderzoek. De vivax-ortholoog van PSSP17 deelt >80% sequentie-identiteit op aminozuurniveau. Een enkele niet-invasieve PON RDT voor beide menselijke malariaparasieten zou de door de WHO aanbevolen reactie op de ernstige bezorgdheid over de volksgezondheid van de toegenomen rapportage van pfhrp2/pfhrp3 deletiemutanten in sub-Sahara Afrika en Zuid-Amerika (12). Hoewel onze analyses van speeksel van 34 symptomatische individuen wijzen op een mogelijk gebruik van het prototype LFIA bij de klinische behandeling van malaria, is onze primaire beoogde toepassing implementatie voor epidemiologische studies die noodzakelijkerwijs verder gaan dan de grenzen van een klinische setting. Nogmaals, door ons te richten op een gametocytenstadium-eiwit, hopen we individuen te identificeren met subklinische infectie met co-circulerende aseksuele bloedstadia en mug-infectieuze gametocyten, die op hun beurt kunnen helpen transmissie-hotspots nauwkeuriger in kaart te brengen in regio's met heterogene malaria-overdracht. Onze identificatie van andere van parasieten afgeleide antigenen in het speeksel, zoals PF3D7_0507800 en PF3D7_0906100, die beide worden gedeeld tussen gametocyten en aseksuele stadia, kan de weg banen naar een geoptimaliseerde, zeer gevoelige op speeksel gebaseerde RDT voor zowel onderzoek als klinische instellingen. Als we dit idee nog een stap verder brengen, stellen we voor dat het combineren van een dergelijke diagnose met "stamp out" -interventies zoals een vaccin dat de overdracht van malaria blokkeert, een meer gerichte immunisatiestrategie mogelijk zou maken die de kosten van dergelijke campagnes zou kunnen verlagen.


Antisporozoiet vuurvaste fenotypes

Er zijn drie verschillende locaties binnen de mug beschikbaar voor het richten op de sporozoïeten. Ten eerste kan hun ontwikkeling in oöcysten worden belemmerd. De ontdekking van parasietgenen die nodig zijn voor de ontwikkeling van sporozoïeten, kan een aantal specifieke doelen bieden om deze fase te verstoren. Een recente studie door Matuschewki en collega's (2002) identificeerde maar liefst 30 eiwitten die specifiek tot expressie worden gebracht in de ontwikkeling van sporozoïeten en deze zouden potentiële doelwitten kunnen zijn. De methoden voor het inactiveren van een van deze doelwitten moeten nog worden uitgewerkt, maar specifieke antilichamen, kleine peptide-agonisten, medicijnen en misschien zelfs RNAi kunnen interfereren met deze ontwikkelingsgereguleerde genen.

Sporozoïeten zijn potentieel kwetsbaar wanneer ze zich in de speekselklieren bevinden. Promoters van genen die specifiek tot expressie worden gebracht in de klieren kunnen worden gebruikt om de expressie van een effectormolecuul aan te sturen die de parasieten zou uitschakelen en zou voorkomen dat ze worden uitgescheiden of hun besmettelijkheid voor de gewervelde gastheer zou opheffen.

Het aantrekkelijkste doelwit wordt gevormd door de sporozoïeten die zich een weg banen door de hemolymfe van de oöcysten naar de speekselklieren. Deze benadering biedt de mogelijkheid om de sporozoiet te baden in een oplossing (hemolymfe) die een effectormolecuul bevat. Bovendien heeft de mug een aantal genen die eiwitten tot expressie brengen, zoals vitellogeninines en lipoforines die in het vetlichaam worden gemaakt en vervolgens naar de hemolymfe worden getransporteerd (Raikhel et al., 2002 van Heusden et al., 1998). De promotors en andere controlesequenties van deze genen sturen de expressie van grote hoeveelheden van de overeenkomstige eiwitten en daarom zijn deze sequenties goede kandidaten voor het doneren van de controlegedeelten van synthetische effectorgenen.

Verschillende effectorstrategieën en -moleculen zijn onlangs beoordeeld door Nirmala en James (2003). Ze beschreven vijf categorieën van benaderingen, gebaseerd op het doel van de actie. Effectormoleculen kunnen een interactie aangaan met liganden op het oppervlak van de parasiet, of hun overeenkomstige receptoren op muggenweefsels. Ze kunnen de activiteit blokkeren van door parasieten tot expressie gebrachte eiwitten die belangrijk zijn voor de invasie van weefsels, of het kunnen toxines zijn die parasieten vernietigen. Ten slotte kunnen componenten van het immuunsysteem worden gereguleerd en tot expressie worden gebracht in de vector om de parasiet uit te schakelen. Een lijst van benaderingen die zijn toegepast op speekselklieren is weergegeven in tabel 1.

Potentiële antisporozoïet-effectormechanismen *

Effectorstrategie (doel) . Molecuul. Doel parasiet. Referenties .
Parasitaire liganden N2 scFv Plasmodium gallinaceumCapurro et al., 2000
Weefselherkenning (receptoren) Lectines, mAbs Plasmodium gallinaceumBarreau et al., 1995
SM1-peptide Plasmodium bergheiIto et al., 2002
Immuunrespons-effectoren verdedigingen Plasmodium gallinaceumShahbuddin et al., 1998
Effectorstrategie (doel) . Molecuul. Doel parasiet. Referenties .
Parasitaire liganden N2 scFv Plasmodium gallinaceumCapurro et al., 2000
Weefselherkenning (receptoren) Lectines, mAbs Plasmodium gallinaceumBarreau et al., 1995
SM1-peptide Plasmodium bergheiIto et al., 2002
Immuunrespons-effectoren verdedigingen Plasmodium gallinaceumShahbuddin et al., 1998

Aangepast van Nirmala en James (2003).

Effectormoleculen die zich richten op speekselklierreceptoren waren enkele van de eersten die werden getest op transmissieblokkering. Koolhydraatgroepen waren betrokken bij herkenning van parasietreceptoren toen werd aangetoond dat P. gallinaceum sporozoïeten konden de speekselklieren niet binnendringen Aedes aegypti behandeld met lectines (Barreau et al., 1995). Plasmodium berghei aantallen zijn verminderd bij muggen die zijn behandeld met een peptide, SM1, dat bindt aan Een. stephensimiddendarm en speekselklieren (Ito et al., 2002). Transgene muggen die SM1 tot expressie brengen, hebben minder oöcysten en daarmee ook minder sporozoïeten in vergelijking met controles. Het is intrigerend dat SM1 zowel het apicale oppervlak van de middendarm als het basale oppervlak van de distale lobben van de speekselklieren bindt, wat de aanwezigheid van vergelijkbare receptoren op deze organen suggereert.

Antilichaamfragmenten met enkele keten (scFv) die zijn samengesteld uit gefuseerde variabele regio's van zware en lichte ketens kunnen de specificiteit van een antilichaam behouden en tot expressie worden gebracht als het product van een enkel gen. Een scFv die CSP bindt, N2scFv, verminderde met 99% het aantal P. gallinaceum sporozoïeten in speekselklieren (Capurro et al., 2000). Deze onderzoeken tonen aan dat liganden van parasieten goede doelen zijn voor effectormoleculen. Furthermore, it is anticipated that targeting the parasite will impose less of a genetic load on the transgenic mosquito than will interfering with surface molecules on mosquito tissues.

Immune system interactions with sporozoites could provide the basis of an effector strategy. Both exogenously and endogenously derived immune peptides have been evaluated for their effects on malaria parasites. Defensins isolated from Aeschna cyanea en Phormia terranovae reduced the number of viable P. gallinaceum oocysts and sporozoites by 50% when injected into Ae. aegyptisch(Shahabuddin et al., 1998). Natural immune responses of mosquitoes to infection are also being studied as possible effector mechanisms for transmission blocking. Microarray analyses coupled with the sequence of the Een. gambiae genome have provided the first comprehensive look at immune responses in parasite-infected mosquitoes(Dimopoulos et al., 2003 Holt et al.,2002), and there are possibilities of modulating responses that will affect sporozoite development.

The development of antisporozoite effector genes is ongoing work. Combining these genes with others that target ookinetes and prevent oocyst formation should permit producing a multigenic phenotype of `no sporozoites' in the salivary glands. Furthermore, the use of multiple effector genes maybe necessary to prevent the selection of resistance to any one mechanism. This could prevent the breakdown of a control strategy based on a genetics approach. In addition, a balance among fitness effects, effectiveness of the molecule, ease of engineering of the phenotypes and mechanism for spreading the phenotypes through a population will dictate the practicality of any one strategy. Ultimately, saving lives will be the most important measure of these approaches.


Parasites on the Clock—How Malaria Races against Mosquito Reproduction

Malaria sporozoites, the infectious form of the malaria parasite that is injected into people by mosquitoes.

Malaria sporozoites, the infectious form of the malaria parasite that is injected into people by mosquitoes.

Malaria, which kills more than 420,000 people worldwide each year, is caused by a tiny parasite that infects human livers and red blood cells. Without the Anopheles mosquitoes that carry the malaria parasites (such as Plasmodium falciparum) in their guts and salivary glands, the disease would have no way of spreading. By studying the interactions between the parasites and their mosquito vectors, scientists hope to find new ways of preventing malaria transmission. In een nieuw artikel gepubliceerd in Cel, NIAID-supported researchers examine how the mosquito’s reproductive cycle and the steroid hormones associated with it, influence the development of the malaria parasites inside the mosquito’s gut.

From the moment a mosquito takes a blood meal containing malaria parasites, the parasites are in a race against time. In the wild, a female mosquito normally lives no more than two or three weeks. If the mosquito dies, the malaria parasites die with it. This puts the parasite on a tight schedule: it needs enough time inside the mosquito’s gut to complete several stages of its life cycle. After ten to fourteen days, thousands of tiny sporozoites migrate into the mosquito’s saliva glands, ready to be injected into another human during the mosquito’s next meal.

The parasites can speed up their development by leeching off the mosquito’s internal nutrients. This gives them a better chance of being transmitted to a new host before the mosquito lays its eggs and dies. However, scientists suspected that this might cause the mosquito to lay fewer eggs—and, consequently, leave fewer mosquitoes in the future to transport malaria parasites.

To investigate this paradox, the researchers examined the interactions between the mosquito and the parasite. They studied mosquitoes without fully functioning ovaries, tracked steroid hormone levels in female mosquitos, and dissected mosquito midguts and salivary glands to observe the parasites within. They found that disrupting a mosquito steroid hormone called 20E, which is partially responsible for regulating the mosquito’s egg production, also affects the parasites. When the female is not actively preparing to lay eggs, the parasites draw on their insect vector’s stored nutrients in order to grow faster. However, when the female mosquito is preparing to lay eggs, the parasites switch gears: they grow more slowly, but are more abundant.

Surprisingly, this process does not affect the number of eggs that the mosquito lays. The researchers suggest that the malaria parasite has evolved to only use nutrients that the mosquito does not need for egg production. Thus, the parasites are able to increase the likelihood that they will reach a new human host, while also ensuring that their own descendants will have a healthy population of mosquitoes to transport them when the time comes. This interaction between the parasites and their vectors should be taken into account when developing methods of malaria control, the researchers say: Using mosquito suppression systems that decrease female mosquito fertility or disrupt mosquitoes’ ability to digest their blood meals may not stop the spread of malaria and may even lead to an increase in malaria cases.


New method can diagnose malaria from a single drop of blood or saliva

Washington, November 28 (ANI): A team of researchers including an Indian origin has developed a new and sensitive method that makes it possible to diagnose malaria from a single drop of blood or saliva. With the development of this method, the researchers hope to go one step further in identifying and treating all patients suffering from malaria. Malaria is a life-threatening disease that strikes more than 200 million people every year - mainly in Africa, Asia and Latin America. The disease is caused by the Plasmodium parasite, which is spread by infected mosquito bites. Today, malaria can be prevented and successfully treated, but more than half a million people nevertheless die every year from the disease. Large-scale monitoring and treatment programmes during the past decade have reduced the distribution of the disease, and the frequency of actual epidemics has fallen. However, the number of malaria patients with relatively low infection counts has increased, and the need for more sensitive methods to diagnose the disease has thus increased dramatically. To meet this need, researchers at Aarhus University have developed a new method that can diagnose malaria infections with very high sensitivity. The method is based on measuring the activity of an enzyme called topoisomerase I from the Plasmodium parasite. The researchers have developed a technology called REEAD (Rolling Circle-Enhanced Enzyme Activity Detection) - which makes it possible to diagnose malaria from a single drop of blood or saliva. This method is much more time-effective and cost-effective than current diagnostic methods, and can be performed by personnel who have no specialised training. It can therefore be used in low-resource areas without the use of expensive equipment, clean water or electricity. The ongoing fight against malaria is complicated by increasing problems with resistant Plasmodium parasites. In addition, several Plasmodium species (P. vivax and P. knowlesi) cannot be detected with the usual quick-test methods. The new REEAD-based method distinguishes itself from other quick-test methods because it can measure whether a given Plasmodium infection is resistant to drugs. The newly developed technology is also the only quick-test method that makes it possible to diagnose the less common malaria parasites (P. ovale, P. knowlesi and P. malariae) in addition to the most common Plasmodium parasites (P. falciparum and P. vivax). The unique sensitivity, combined with its ability to detect infection in very small samples of blood or saliva, makes the method suitable for large-scale screening projects. This is of great importance in areas where the disease is close to being eradicated, and where it is therefore essential to identify and treat all patients infected with one of the above-mentioned parasites - even those who do not show symptoms of the disease. "This combination of molecular biologists, doctors, engineers and statisticians has been important for our success in developing the new method," said Associate Professor Birgitta Knudsen, who is the driving force behind the project. In addition to her group, which is affiliated with the Interdisciplinary Nanoscience Centre (iNANO) and the Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, researchers from both Denmark (Department of Pathology and Department of Clinical Medicine, Aarhus University Hospital) and abroad (Duke University, University of Rome, University of St Andrews and University of Lyon) contributed to this project. The research team behind the new method for diagnosing malaria include Charlotte Harmsen, Pia W. Jensen, Magnus Stougaard, Emil L. Kristoffersen, Rikke Frohlich, Eskild Petersen, Amit Roy, Christine J. F. Nielsen, Birgitta R. Knudsen, Rodrigo Labouriau and Megan Yi-Ping Ho. (ANI)


Vector Biology

José M.C. Ribeiro, M.D., Ph.D., of Laboratory of Malaria and Vector Research, Vector Biology Section, directs a research program that explores the biochemical and pharmacological properties found in the salivary glands of blood-feeding insects and ticks. Dr. Ribeiro and his team have deciphered the genetic makeup of substances found in sand fly saliva and discovered several novel anti-clotting, anti-platelet, and vasodilatory agents that help the sand fly evade the mammalian host’s immune system when feeding.

Scientists in his lab seek to improve the understanding of how blood-feeding behavior in insects and ticks evolved and, at the same time, identify new compounds in the saliva of these insects and ticks that can be used to help develop treatments or vaccines.


Potential Malaria Drug Stops Parasite Early

Malaria parasites may be stopped in their tracks by a promising new group of compounds, suggests a new study in mice. The compounds may someday yield a new dual-action drug that targets both malaria parasites living in the blood and those hibernating in the liver, the researchers say.

Scientists have known malaria parasites first enter the liver, where they must develop before heading out into the bloodstream to wreak havoc (causing malaria symptoms).

But until now, most anti-malaria drugs have targeted the bloodstream stage, with many of these becoming less effective as the parasites evolve resistance to them, and the few that target the liver stage have notable side effects, according to the researchers.

In the new study, the international team of scientists discovered that compounds called imidazolopiperazines appear to kill the parasites as they develop in the livers of mice.

However, "we have no data on whether the compounds will work on dormant [parasites] in humans," said Elizabeth Winzeler, a researcher at The Scripps Research Institute in La Jolla, Calif., and lead author of the new study. "At this point and we can only infer from animal models."

The researchers posted their data online, including which compounds were active against the liver-stage parasites and which were not, so that interested scientists can use the information. "Hopefully this will be the starting point for new antimalarial drugs," Winzeler said.

A recurring problem

Malaria is caused by a parasite and transmitted through the saliva of a mosquito. De soorten Plasmodium falciparum en Plasmodium vivax cause the most malaria infections in humans, with P. falciparum, prevalent in sub-Saharan Africa, being the deadliest.

When a malaria-carrying mosquito bites a person, immature forms of the parasite find their way through the bloodstream to the liver. There, they incubate and multiply before reentering the bloodstream to infect red blood cells. In the bloodstream, the parasites grow and multiply until the blood cells burst, pouring toxins into the bloodstream and causing a range of symptoms, including fever, chills and convulsions. Serious cases can lead to kidney failure, coma and death. In 2009, malaria killed nearly 800,000 people, mostly among children in Africa, according to the World Health Organization.

&ldquoAlmost all of the drugs that have been effective against malaria have been rendered useless due to the evolution of resistances,&rdquo said Greg Crowther, a malaria researcher at the University of Washington, who was not involved in the current study. There is one class of antimalarial medications remains effective, &ldquobut there are already whispers of resistance starting to evolve with these therapies,&rdquo Crowther said. ['Superdrug' Could Fight HIV & Malaria]

In temperate regions such as the U.S., P. vivax poses an additional problem for people apparently cured of the disease: reinfection. After the parasitesenter the liver, they can lie dormant for months or even years before waking up to repopulate the blood. This is one reason why a drug that targets the liver stage of the parasite would be especially useful.

To find new drugs that fight both the blood and liver stages of malaria, Winzeler and her colleagues screened 5,697 compounds known to be effective against P. falciparum in the blood. They removed parasites from the livers of mice and added them to human liver cells in dishes, and tested their compounds to see which could stop the parasites' development.

They found that about 20 percent of the compounds worked, with imidazolopiperazines being the most effective. The researchers then created imidazolopiperazine derivatives that were suitable for animal testing. When they infected mice with malaria parasites, and treated them with these compounds at the same time, the mice did not develop malaria symptoms, even after several weeks.

"Compounds of the [imidazolopiperazine] class appear to actually kill the parasite," Winzeler said.

The next big push forward

Winzeler noted that she and her colleagues still have to figure out how the compounds kill the liver-stage parasites, and how effective they are in humans.

Crowther says that the research is but a "single step on a fairly long path" toward eliminating P. vivax the dormant parasites in the liver. Even so, the study seems like the next big push forward in the malaria research field, he said, adding that many researchers have been talking about focusing on the non-blood stages of malaria.

"Malaria is a really tricky, ubiquitous disease, and as many of the leaders in the field are telling us, it's going to take a multi-pronged effort to get it under control and eradicated," Crowther said. "Bed nets, vaccines, new drugs that target different parasite stages &mdash all of these things are going to be helpful in containing malaria."

The study was published online today (Nov. 17) in the journal Science. The research was partly funded by the pharmaceutical company Novartis.


Bekijk de video: Паразиты. Фрагмент фильма - победителя Канн-2019 (November 2021).