Informatie

10.6: Opdracht - Welke heeft meer DNA? - Biologie


Vraag: Zouden een kiwi en een aardbei van ongeveer dezelfde grootte ook ongeveer dezelfde hoeveelheid DNA hebben?

Achtergrond: Je hebt geleerd dat DNA op chromosomen wordt gedragen. Alle zoogdieren zijn diploïde; niet alle planten zijn echter diploïde. De gewone aardbei is octoploïde (8N) en de gecultiveerde kiwi is hexaploïde (6N). Onderzoek het totale aantal chromosomen in de cellen van elk van deze vruchten en bedenk hoe dit zou kunnen overeenkomen met de hoeveelheid DNA in de celkernen van deze vruchten.

Hypothese: Stel een hypothese op of u een verschil in DNA-hoeveelheid zou kunnen detecteren bij aardbeien en kiwi's van vergelijkbare grootte. Welke vrucht zou volgens jou meer DNA opleveren?

Test je hypothese. Voer het DNA-extractie-experiment uit.

Noteer uw waarnemingen: Omdat u het DNA-volume niet kwantitatief meet, kunt u voor elke proef opnemen of de twee vruchten dezelfde of verschillende hoeveelheden DNA produceerden zoals waargenomen met het oog. Als de ene of de andere vrucht merkbaar meer DNA produceerde, noteer dit dan ook. Bepaal of uw waarnemingen consistent zijn met meerdere stukken van elke vrucht.

Analyseer uw gegevens: Heb je een duidelijk verschil opgemerkt in de hoeveelheid DNA die door elke vrucht wordt geproduceerd? Waren uw resultaten reproduceerbaar?

Een conclusie trekken: Kun je, gegeven wat je weet over het aantal chromosomen in elke vrucht, concluderen dat het aantal chromosomen noodzakelijkerwijs correleert met de hoeveelheid DNA? Kunt u eventuele nadelen van deze procedure identificeren? Als u toegang had tot een laboratorium, hoe zou u uw vergelijking dan standaardiseren en meer kwantitatief maken?

Om deze beoordeling te voltooien, moet u alle bovenstaande punten in een lab schrijven. Zorg ervoor dat u afbeeldingen opneemt van uw experiment dat aan de gang is. Zie hier de voorbeelden.

Basisvereisten (de opdracht wordt niet geaccepteerd of beoordeeld tenzij aan de volgende criteria is voldaan):

  • De opdracht is nagelezen en bevat geen grote spel- of grammaticale fouten
  • Opdracht bevat passende referenties.
  • Opdracht richt zich op de hierboven genoemde vereiste punten (hypothese, observaties/gegevens, analyse van gegevens, conclusie).

Rubriek

Welke heeft meer DNA?
Resultaat: DNA-structuur in verband brengen met het proces van DNA-replicatie
criteriaWaarderingenpunten
Hypothese gaat over hoe het DNA genetische informatie opslaat en de rol van complementaire basenparing bij DNA-opslag/replicatie.Hypothese is toetsbaar en gaat duidelijk over opslag en replicatie van genetische informatie.
5,0 punten
Hypothese is toetsbaar en behandelt de opslag en replicatie van genetische informatie met enige uitleg vereist.
4,0 punten
Hypothese is niet testbaar of gaat niet over opslag van genetische informatie en replicatie van DNA-basen.
0,0 punten
5 punten
Conclusiesecties gaan in op hoe DNA wordt gebruikt om genetische informatie op te slaan.Conclusie gaat in detail in op de opslag van genetische informatie en verwijst rechtstreeks en in detail naar experimentele bevindingen.
5,0 punten
Conclusie gaat in op opslag van genetische informatie op hoog niveau en vermeldt experimentele bevindingen.
4,0 punten
Conclusie gaat niet of onjuist in op de opslag van genetische informatie.
0,0 punten
5 punten
Totaal aantal punten: 10

DNA: typen, structuur en functie van DNA

Nucleïnezuren werden voor het eerst geïsoleerd door Friedrich Miescher (1869) uit puscellen.

Ze werden nucleïne genoemd. Hertwig (1884) stelde voor dat nucleïne de drager is van erfelijke eigenschappen. Vanwege hun zure aard werden ze nucleïnezuren en vervolgens nucleïnezuren genoemd (Altmann, 1899).

Fisher (1880s) ontdekte de aanwezigheid van purine- en pyrimidinebasen in nucleïnezuren. Levene (1910) ontdekte dat deoxyribose-nucleïnezuur zowel fosforzuur als deoxyribosesuiker bevat.

Hij karakteriseerde vier soorten nucleotiden die aanwezig zijn in DNA. In 1950 ontdekte Chargaff dat het purine- en pyrimidinegehalte van DNA gelijk was. Tegen die tijd had W.T. Astbury door middel van röntgendiffractie ontdekt dat DNA een polynucleotide is met nucleotiden die loodrecht op de lange as van het molecuul staan ​​en van elkaar gescheiden zijn door een afstand van 0,34 nm.

In 1953 kregen Wilkins en Franklin zeer fraaie röntgenfoto's van DNA. De foto's toonden aan dat DNA een helix was met een breedte van 2,0 nm. Eén draai van de helix was 3,4 nm met 10 lagen basen erin gestapeld. Watson en Crick (1953) werkten het eerste correcte dubbele helixmodel uit op basis van de röntgenfoto's van Wilkins en Franklin. Wilkins, Watson en Crick kregen daarvoor in 1962 de Nobelprijs.

Watson en Crick (1953) bouwden een 3D, moleculair DNA-model dat aan alle details van röntgenfoto's voldeed. Ze stelden voor dat DNA bestond uit een dubbele helix met twee ketens met suikerfosfaat aan de buitenkant en stikstofbasen aan de binnenkant.

De stikstofbasen van de twee ketens vormden complementaire paren met purine van de ene en pyrimidine van de andere die bij elkaar werden gehouden door waterstofbruggen (A-T, C-G). Complementaire basenparing tussen de twee polynucleotideketens wordt beschouwd als kenmerkend voor hun voorstel. Het is natuurlijk gebaseerd op de vroege bevinding van Chargaff dat A = T en С = G. Hun tweede grote voorstel was dat de twee ketens antiparallel zijn met 5’→ 3′ oriëntatie van de ene en У → 5’oriëntatie van de andere.

De twee kettingen zijn spiraalvormig gedraaid, net als een touwladder met stijve treden die in een spiraal zijn gedraaid. Elke draai van de spiraal bevat 10 nucleotiden. Dit dubbele helix- of duplexmodel van DNA met antiparallelle polynucleotideketens met complementaire basen heeft een impliciet mechanisme van replicatie en kopiëren.

Hier functioneren beide polynucleotideketens als matrijzen die twee dubbele helices vormen, elk met één ouderketen en één nieuwe maar complementaire streng. Het fenomeen wordt semi-conservatieve replicatie genoemd. In vitro synthese van DNA is uitgevoerd door Kornberg in 1959.

Soorten DNA:

Het door Watson en Crick voorgestelde DNA-duplexmodel is een rechtshandige spiraal en wordt B-DNA (Balanced DNA) genoemd. In het model liggen de basenparen bijna loodrecht op de as van de helix (Fig. 6.5 D). Een ander rechtshandig duplexmodel is A-DNA (Alternatief DNA). Hier heeft een enkele draai van de helix 11 basenparen.

De basenparen liggen op 20° afstand van loodrecht op de as. C-DNA heeft 9 basenparen per spiraalwinding, terwijl in D-DNA het aantal slechts 8 basenparen is. Beide zijn rechtshandig. Z-DNA (Zigzag-DNA) is een linkshandige dubbele helix met zigzagruggengraat, afwisselende purine- en pyrimidinebasen, een enkele winding van 45 A lengte met 12 basenparen en een enkele groef.

B-DNA is meer gehydrateerd en wordt het vaakst aangetroffen in levende cellen. Het is een fysiologisch en biologisch actieve vorm. Het kan echter in andere vormen veranderen. Van rechtshandig DNA is bekend dat het tijdelijk in de linkshandige vorm verandert, althans voor een korte afstand. Dergelijke veranderingen kunnen veranderingen in genexpressie veroorzaken.

Circulaire en Lineair DNA:

In veel prokaryoten zijn de twee uiteinden van een DNA-duplex covalent gekoppeld om circulair DNA te vormen. Circulair DNA is naakt, dat wil zeggen zonder associatie met histon-eiwitten, hoewel polyaminen wel voorkomen. In lineair DNA zijn de twee uiteinden vrij. Het wordt gevonden in eukaryote kernen waar het wordt geassocieerd met histon-eiwitten.

Lineair DNA, zonder associatie met histon-eiwitten, komt ook voor in sommige prokaryoten, bijv. Mycoplasma. In semi-autonome celorganellen (mitochondria, plastiden) is DNA circulair, minder vaak lineair. Het is altijd naakt.

De regels van Chargaff:

Chargaff (1950) deed waarnemingen aan de basen en andere componenten van DNA. Deze observaties of generalisaties worden de basisequivalentieregel van Chargaff genoemd.

(i) Purine- en pyrimidine-basenparen zijn in gelijke hoeveelheid, dat wil zeggen, adenine + guanine = thymine + cytosine. [A + G] = [T + C], d.w.z. [A+G] / [T+C] = 1

(ii) De molaire hoeveelheid adenine is altijd gelijk aan de molaire hoeveelheid thymine. Evenzo wordt de molaire concentratie van guanine geëvenaard door de molaire concentratie van cytosine.

[A] = [T], d.w.z. [A] / [T] = 1 [G] = [C], d.w.z. [G] / [C] = 1

(iii) Suikerdeoxyribose en fosfaat komen in equimolaire verhoudingen voor.

(iv) A-T-basenparen zijn zelden gelijk aan С-G-basenparen.

(v) De verhouding van [A+T] / [G+C] is variabel maar constant voor een soort (Tabel 6.2). Het kan worden gebruikt om de bron van DNA te identificeren. De verhouding is laag in primitieve organismen en hoger in geavanceerde.

Tabel 6.2. Basissamenstelling van DNA uit verschillende bronnen:

Soort EEN G С t A+T/C+G
1. Man 30.4 19.0 19.9 30.1 1.55
2. Kalf 29.0 21.2 21.2 28.5 1.35
3. Tarwekiemen 28.1 21.8 22.7 27.4 1.25
4. Erwt 30.8 19.2 18.5 30.5 1.62
5. Euglena 22.6 27.7 25.8 24.4 0.88
6 Escherichia coli 24.7 26.0 25.7 23.6 0.93

Structuur van DNA:

DNA of deoxyribonucleïnezuur is een spiraalvormig gedraaid polydeoxyribonucleotide-macromolecuul met dubbele keten dat het genetische materiaal vormt van alle organismen, met uitzondering van rhinovirussen. In prokaryoten komt het voor in nucleoïde en plasmiden. Dit DNA is meestal circulair. In eukaryoten wordt het meeste DNA gevonden in chromatine van de kern.

Het is lineair. Kleinere hoeveelheden circulair, dubbelstrengs DNA worden gevonden in mitochondriën en plastiden (organel-DNA). Kleine DNA's komen voor in virussen, ф x 174 bacteriofaag heeft 5386 nucleotiden. Bacteriofaag lambda (Faag X) bezit 48502 basenparen (bp), terwijl het aantal basenparen in Escherichia coli 4,6 x 106 is. Een enkel genoom (haploïde set van 23 chromosomen) heeft ongeveer 3,3 x 109 bp bij mensen. Enkelstrengs DNA komt voor als genetisch materiaal in sommige virussen (bijv. faag ф x 174, coliphage fd, M13). DNA is het grootste macromolecuul met een diameter van 2 nm (20Å of 2 x 10 -9 m) en vaak 3 millimeter lang.

Het 15 is negatief geladen vanwege fosfaatgroepen. Het is een polymeer met lange keten van in het algemeen enkele honderdduizenden deoxyribonucleotiden. Een DNA-molecuul heeft twee onvertakte complementaire strengen. Ze zijn spiraalvormig opgerold. De twee spiraalstrengen van DNA worden gezamenlijk DNA-duplex genoemd (Fig. 6.5).

De twee strengen zijn niet op elkaar gewikkeld, maar de hele dubbele streng (DNA-duplex) is op zichzelf gewikkeld rond een gemeenschappelijke as als een touwtrap met stevige treden die in een spiraal zijn gedraaid. Door spiraalverdraaiing krijgt de DNA-duplex twee soorten afwisselende groeven, majeur (22 ) en mineur (12 Å).

In B-DNA heeft één winding van de spiraal ongeveer 10 nucleotiden op elke DNA-streng. Het beslaat een afstand van ongeveer 3,4 nm (34 of 3,4'21510 -9 m), zodat aangrenzende nucleotiden of hun basen worden gescheiden door een ruimte van ongeveer 0,34 nm (0,34'21510 -9 m of 3,4 ).

Een deoxyribonucleotide van DNA wordt gevormd door verknoping van drie chemicaliën orthofosforzuur (H3PO4), deoxyribosesuiker (C5H10O4) en een stikstofbase. In DNA komen vier soorten stikstofbasen voor. Ze behoren tot twee groepen, purines (9-ledige dubbele ringen met stikstof op 1,3,7 en 9 posities) en pyrimidinen (zesledige ringen met stikstof op 1 en 3 posities). DNA heeft twee soorten purines (adenine of A en guanine of G) en twee soorten pyrimidinen (cytosine of С en thymine of T).

Afhankelijk van het type stikstofbase heeft DNA vier soorten deoxyribonucleotiden: deoxyadenosine-5-monofosfaat (dAMP), deoxyguaninosine-5-monofosfaat (dGMP), deoxythymidine-5-monofosfaat (dTMP) en deoxy-cytidine-5-monofosfaat. (dCMP).

De ruggengraat van een DNA-keten of -streng is opgebouwd uit afwisselende deoxyribosesuiker- en fosforzuurgroepen. De fosfaatgroep is verbonden met koolstof 5'8242 van het suikerresidu van zijn eigen nucleotide en koolstof У van het suikerresidu van het volgende nucleotide door (3'8216-5'8217) fosfodiesterbindingen. -H van fosfaat en -OH van suiker worden geëlimineerd als H20 tijdens elke estervorming.

Fosfaatgroep geeft zuurgraad aan de nucleïnezuren omdat ten minste één van zijn zijgroepen vrij is om te dissociëren. Stikstofbasen staan ​​haaks op de lengteas van DNA-ketens. Ze zijn verbonden met koolstofatoom 1 van de suikers door N-glycosidebindingen. Pyrimidine (C of T) is aan deoxyribose gehecht door zijn N-atoom op positie 1 terwijl een purine (A of G) dit doet door N-atoom op positie 9.

De twee DNA-ketens zijn antiparallel, dat wil zeggen, ze lopen parallel maar in tegengestelde richtingen. In de ene ketting is de richting 5’→ У en in de andere is dit 3′ →5′ (Fig. 6.5). De twee ketens worden bij elkaar gehouden door waterstofbruggen tussen hun basen. Adenine (A), een purine van de ene keten, ligt precies tegenover thymine (T), een pyramidine van de andere keten. Evenzo ligt cytosine (C, een pyrimidine) tegenover guanine (G een purine). Dit maakt een soort slot- en sleutelarrangement mogelijk tussen grote purine en kleine pyrimidine.

Het wordt versterkt door het verschijnen van waterstofbruggen tussen de twee. Tussen cytosine en guanine (C = G) treden drie waterstofbruggen op op de posities 1’-1’, 2’8242-6’8242 en 6’8242-2’8242. Er zijn twee van dergelijke waterstofbruggen tussen adenine en thymine (A=T) die worden gevormd op de posities 1'-3'8242 en 6'8242-4'8242. Waterstofbindingen ontstaan ​​tussen waterstof van de ene base en zuurstof of stikstof van de andere base. Aangezien er specifieke en verschillende stikstofbasen voorkomen op de twee DNA-ketens, zijn de laatste complementair.

Dus de sequentie van bijvoorbeeld AAGCTCAG van één keten zou een complementaire sequentie van TTCGAGTC op de andere keten hebben. Met andere woorden, de twee DNA-ketens zijn niet identiek, maar complementair aan elkaar. Het is vanwege een specifieke basenparing met een purine die tegenover een pyrimidine ligt. Dit maakt de twee ketens 2 nm dik.

Een purine-purine basenpaar maakt het dikker, terwijl een pyrimidine-pyrimidine basenpaar het smaller maakt dan 2 nm. Verder zijn A en С of G en T niet paren omdat ze er niet in slagen om waterstofbruggen ertussen te vormen. 5'8242-uiteinde van elke keten draagt ​​een fosfaatradicaal, terwijl het 3'8242-uiteinde een suikerresidu bezit (З’-ОН).

Opvallende kenmerken van В-model van DNA van Watson en Crick:

1. DNA is het grootste biomolecuul in de cel.

2. DNA is negatief geladen en rechtsdraaiend.

3. Moleculaire configuratie van DNA is 3D.

4. DNA heeft twee polynucleotideketens.

5. De twee DNA-ketens hebben een antiparallelle polariteit, 5'8242 —> 3'8242 in de ene en 3'8242 —> 5'8242 in de andere.

6. De ruggengraat van elke polynucleotideketen is gemaakt van afwisselende suikerfosfaatgroepen. De stikstofbasen projecteren naar binnen.

7. Stikstofbasen van twee polynucleotideketens vormen complementaire paren, A tegenover T en С tegenover G.

8. Een grote purine staat altijd tegenover een kleine pyrimidine. Dit genereert een uniforme afstand tussen twee strengen helix.

9. Adenine (A) van één polynucleotideketen wordt door twee waterstofbruggen aan thymine (T) van de tegenoverliggende keten gehouden. Cytosine (C) van de ene keten wordt op dezelfde manier vastgehouden aan guanine van de andere keten door drie waterstofbruggen.

10. De dubbele ketting is spiraalvormig opgerold. De coiling is rechtshandig. Deze wikkeling produceert afwisselend kleine en grote groeven.

11. De spoed van de helix is ​​3,4 nm (34 A) met ongeveer 10 basenparen in elke winding. De gemiddelde afstand tussen twee aangrenzende basenparen bedraagt ​​ongeveer 0,34 nm (0,34 x 10 -9 m of 3,4 A).

12. Vlakken van aangrenzende basenparen worden op elkaar gestapeld. Samen met waterstofbinding verleent de stapeling stabiliteit aan de spiraalvormige structuur.

13. DNA is zuur. Voor zijn verdichting heeft het basiseiwitten (histon) nodig. De histon-eiwitten zijn sterk geladen en bezetten de belangrijkste groeven van het DNA onder een hoek van 30° met de helix-as.

Sense en Antisense strengen:

Beide DNA-strengen nemen niet deel aan het beheersen van erfelijkheid en metabolisme. Slechts één van hen doet dat. De DNA-streng die fungeert als matrijs voor RNA-synthese staat bekend als matrijsstreng, minus (-) streng of antisense streng.

De complementaire streng wordt non-template streng genoemd, plus (+) streng, sense en coderende streng. De laatste naam wordt gegeven omdat volgens afspraak de genetische code van DNA wordt geschreven volgens de volgorde ervan.

DNA Non-template, Sense (+) of coderingsstreng

DNA-sjabloon, antisense of niet-coderende of (-) streng

RNA wordt getranscribeerd op 3'8217→5'8242 (-) streng (sjabloon/antistreng) van DNA in 5 → 3 richting.

De term antisense wordt ook in bredere zin gebruikt voor elke sequentie of streng van DNA (of RNA) die complementair is aan mRNA.

Denaturatie en renaturatie:

De H-bindingen tussen stikstofbasen van twee DNA-strengen kunnen breken door hoge temperatuur (82-90°C) of lage of hoge pH, zodat de twee strengen van elkaar scheiden. Het wordt denaturatie of smelten genoemd. Aangezien A-T-basenpaar slechts 2H-bindingen heeft, kan het gebied dat rijk is aan A-T-basenparen gemakkelijk denatureren (smelten). Deze gebieden worden laagsmeltende gebieden genoemd omdat ze bij relatief lage temperatuur denatureren. Het gebied dat rijk is aan G-C-basenparen (het zogenaamde hoogsmeltende gebied) is relatief stabieler en dichter omdat drie waterstofbruggen de G-C-basen verbinden.

Deze gebieden hebben een hoge smelttemperatuur (Tm). Bij het smelten neemt de viscositeit van DNA af. Het gedenatureerde DNA heeft de neiging om opnieuw te associëren, d.w.z. de DNA-strengen die gescheiden zijn door smelten bij 82-90°C kunnen opnieuw associëren en duplex vormen bij afkoelen tot temperatuur bij 65°C. Het wordt renaturatie of annealing genoemd.

Gedenatureerde of gescheiden DNA-strengen absorberen meer lichtenergie dan de intacte dubbele DNA-streng. De verhoogde absorptie van lichtenergie door gescheiden of gedenatureerde DNA-strengen wordt hyperchromatisch effect genoemd. Het effect wordt gebruikt om te weten of DNA enkel- of dubbelstrengs is.

DNA-duplex bezit gebieden waar de sequentie van nucleotiden hetzelfde is, maar tegengesteld in de twee strengen. Deze sequenties worden herkend door restrictie-endonucleasen en worden gebruikt bij genetische manipulatie. Gegeven onderstaande sequentie van basen in één streng (3'8242 → 5'8242) is GAATTC. Het is hetzelfde in de andere streng wanneer gelezen in de richting 5'8242 → 3'8242. Het is vergelijkbaar met palindroomwoorden met dezelfde woorden in zowel voorwaartse als achterwaartse richting, bijvoorbeeld NITIN, MALAYALAM.

Het is het DNA met meerdere kopieën van identieke sequenties van stikstofbasen. Het aantal kopieën van dezelfde basensequentie varieert van enkele tot miljoenen. DNA met een enkele kopie van basensequenties wordt uniek DNA genoemd. Het is gemaakt van functionele genen. rRNA-genen worden echter meerdere keren herhaald. Repetitief DNA kan in tandem voorkomen of worden afgewisseld met unieke sequenties.

Het is van twee soorten, zeer repetitief en matig repetitief. Zeer repetitief DNA bestaat uit korte sequenties van minder dan 10 basenparen die miljoenen keren worden herhaald. Ze komen voor in pre-entromere regio's, heterochromatische regio's van Y-chromosomen en satellietregio's. Matig repetitief dna bestaat uit een paar honderd basenparen die minstens 1000 keer worden herhaald. Het komt voor in telomeren, centromeren en transposons.

Tandem herhaalde sequenties zijn bijzonder vatbaar voor verkeerde uitlijning tijdens chromosoomparing, en dus heeft de grootte van tandemclusters de neiging om zeer polymorf te zijn, met grote variaties tussen individuen. Kleinere clusters van dergelijke sequenties kunnen worden gebruikt om individuele genomen te karakteriseren in de techniek van "DNA-finger-printing".

Het is dat deel van repetitief DNA dat lange repetitieve nucleotidesequenties in tandem heeft dat een afzonderlijke fractie vormt bij ultracentrifugatie met dichtheid. Afhankelijk van het aantal basenparen dat betrokken is bij herhalingsgebieden, bestaat satelliet-DNA uit twee typen, microsatellietsequenties (1-6 bp herhalingseenheden geflankeerd door geconserveerde sequenties) en minisatellietsequenties (11-60 bp geflankeerd door geconserveerde restrictieplaatsen). Deze laatste zijn hypervariabel en specifiek voor elk individu. Ze worden gebruikt voor DNA-matching of vingerafdrukken, zoals voor het eerst werd ontdekt door Jeffreys et al (1985).

De rangschikking van stikstofbasen van DNA (en het product mRNA) bepaalt de volgorde van aminozuurgroepen in polypeptiden of eiwitten gevormd over ribosomen. Eén aminozuur wordt gespecificeerd door de sequentie van drie aangrenzende stikstofbasen. Dit laatste wordt codon genoemd. Het DNA-segment dat de synthese van het volledige polypeptide bepaalt, staat bekend als cistron.

Bij prokaryoten heeft een cistron een continue coderende sequentie van begin tot eind. In eukaryoten bevat een cistron niet-coderende gebieden die geen deel van het genproduct produceren. Ze worden intronen genoemd. Introns zijn vaak variabel. De coderende delen staan ​​bekend als exons. Cistrons met introns worden gesplitste genen genoemd.

Coderend en niet-coderend DNA:

Afhankelijk van het vermogen om functionele of niet-functionele producten te vormen, heeft DNA twee soorten segmenten, coderend en niet-coderend. Bij eukaryoten is een groter deel van het DNA niet-coderend omdat het geen functioneel product vormt. Ze hebben vaak herhaalde sequenties of repetitief DNA. De meeste van hen hebben vaste posities.

Sommigen kunnen van de ene plaats naar de andere gaan. De mobiele sequenties worden springgenen of transposons genoemd. Bij prokaryoten is de hoeveelheid niet-coderend of niet-functioneel DNA klein. Coderend DNA bestaat uit coderende DNA-sequenties. Dit zijn twee typen: eiwitcoderende sequenties die coderen voor alle eiwitten behalve histon en niet-eiwitcoderende sequenties voor tRNA, rRNA en histonen.

Functies van DNA:

1. Genetische informatie (genetische blauwdruk):

DNA is het genetische materiaal dat alle erfelijke informatie bevat. De genetische informatie is gecodeerd in de rangschikking van de stikstofbasen.

DNA heeft de unieke eigenschap van replicatie of productie van carbonkopieën (autokatalytische functie). Dit is essentieel voor de overdracht van genetische informatie van de ene cel naar de dochters en van de ene generatie naar de volgende.

DNA komt voor in chromosomen. Dit is essentieel voor een eerlijke verdeling van DNA tijdens celdeling.

Tijdens meiose geeft kruising aanleiding tot een nieuwe combinatie van genen die recombinaties worden genoemd.

Veranderingen in de volgorde van stikstofbasen door toevoeging, deletie of verkeerde replicatie geven aanleiding tot mutaties. Mutaties zijn de bron van alle variaties en evolutie.

DNA geeft aanleiding tot RNA's door het proces van transcriptie. Het is heterokatalytische activiteit van DNA.

7. Cellulair metabolisme:

Het regelt de metabolische reacties van de cellen met behulp van specifieke RNA's, synthese van specifieke eiwitten, enzymen en hormonen.

Door differentieel functioneren van sommige specifieke DNA-gebieden of genen, worden verschillende delen van de organismen gedifferentieerd in vorm, grootte en functies.

DNA regelt de ontwikkeling van een organisme door de werking van een interne genetische klok, al dan niet met behulp van extrinsieke informatie.

10. DNA-vingerafdrukken:

Hypervariabele microsatelliet-DNA-sequenties van elk individu zijn verschillend. Ze worden gebruikt bij het identificeren van individuen en het ontcijferen van hun relaties. Het mechanisme wordt DNA-vingerafdrukken genoemd.

Defecte erfelijkheid kan worden verholpen door de juiste genen op te nemen in plaats van defecte genen.

Overmatige beschikbaarheid van anti-mRNA of antisense RNA's zal niet toestaan ​​dat de pathogene genen zich uiten. Door deze techniek is het falen van dotteren gecontroleerd. Een modificatie van deze techniek is RNA-interferentie (RNAi).


Inhoud

DNA-barcoderingstechnieken werden ontwikkeld op basis van vroeg DNA-sequencingwerk op microbiële gemeenschappen met behulp van het 5S-rRNA-gen. [9] In 2003 werden specifieke methoden en terminologie van moderne DNA-barcodering voorgesteld als een gestandaardiseerde methode voor het identificeren van soorten, evenals voor het mogelijk toewijzen van onbekende sequenties aan hogere taxa zoals orden en phyla, in een paper van Paul D.N. Hebert et al. van de Universiteit van Guelph, Ontario, Canada. [10] Hebert en zijn collega's demonstreerden het nut van het cytochroom C oxidase I (COI) gen, voor het eerst gebruikt door Folmer et al. in 1994, met behulp van hun gepubliceerde DNA-primers als een hulpmiddel voor fylogenetische analyses op soortniveau [10] als een geschikt onderscheidingsinstrument tussen metazoan ongewervelde dieren. [11] Het "Folmer-gebied" van het COI-gen wordt vaak gebruikt om onderscheid te maken tussen taxa op basis van de variatiepatronen op DNA-niveau. Het relatieve gemak van het ophalen van de sequentie en de variabiliteit vermengd met het behoud tussen soorten, zijn enkele van de voordelen van COI. Door de profielen "barcodes" te noemen, hebben Hebert et al. overwogen om een ​​COI-databank te ontwikkelen die als basis zou kunnen dienen voor een "wereldwijd bio-identificatiesysteem".

Bemonstering en bewaring Bewerken

Barcoding kan worden gedaan op basis van weefsel van een doelspecimen, van een mengsel van organismen (bulkmonster) of van DNA dat aanwezig is in omgevingsmonsters (bijvoorbeeld water of bodem). De methoden voor bemonstering, bewaring of analyse verschillen tussen die verschillende soorten monsters.

Om een ​​weefselmonster van het doelmonster te voorzien van een streepjescode, is waarschijnlijk een klein stukje huid, een schaal, een poot of antenne voldoende (afhankelijk van de grootte van het monster). Om contaminatie te voorkomen, is het noodzakelijk om gebruikte gereedschappen tussen monsters te steriliseren. Het wordt aanbevolen om twee monsters van één exemplaar te verzamelen, één om te archiveren en één voor het barcodeproces. Het bewaren van monsters is cruciaal om het probleem van DNA-degradatie op te lossen.

Een bulkmonster is een soort milieumonster dat verschillende organismen bevat uit de taxonomische groep die wordt bestudeerd. Het verschil tussen bulkmonsters (in de hier gebruikte zin) en andere omgevingsmonsters is dat het bulkmonster meestal een grote hoeveelheid DNA van goede kwaliteit levert. [12] Voorbeelden van bulkmonsters zijn onder meer aquatische macro-invertebraten die zijn verzameld met een kick-net of insectenmonsters die zijn verzameld met een Malaise-val. Gefilterde of op grootte gefractioneerde watermonsters die hele organismen zoals eencellige eukaryoten bevatten, worden soms ook gedefinieerd als bulkmonsters. Dergelijke monsters kunnen worden verzameld met dezelfde technieken die worden gebruikt om traditionele monsters te verkrijgen voor op morfologie gebaseerde identificatie.

De milieu-DNA-methode (eDNA) is een niet-invasieve benadering voor het detecteren en identificeren van soorten uit celafval of extracellulair DNA dat aanwezig is in omgevingsmonsters (bijv. water of bodem) door middel van streepjescodes of metabarcodering. De benadering is gebaseerd op het feit dat elk levend organisme DNA in de omgeving achterlaat, en dit omgevings-DNA kan zelfs worden gedetecteerd voor organismen met een zeer lage abundantie. Voor veldbemonstering is het meest cruciale onderdeel dus het gebruik van DNA-vrij materiaal en gereedschap op elke bemonsteringsplaats of monster om besmetting te voorkomen, als het DNA van het (de) doelorganisme(n) waarschijnlijk in kleine hoeveelheden aanwezig is. Aan de andere kant bevat een eDNA-monster altijd het DNA van hele cel, levende micro-organismen, die vaak in grote hoeveelheden aanwezig zijn. Daarom worden in de natuurlijke omgeving genomen monsters van micro-organismen ook wel eDNA-monsters genoemd, maar besmetting is in dit verband minder problematisch vanwege de grote hoeveelheid doelorganismen. De eDNA-methode wordt toegepast op de meeste monstertypes, zoals water, sediment, grond, dierlijke uitwerpselen, maaginhoud of bloed van b.v. bloedzuigers. [13]

DNA-extractie, amplificatie en sequencing Bewerken

DNA-barcodering vereist dat DNA in het monster wordt geëxtraheerd. Er bestaan ​​verschillende DNA-extractiemethoden en factoren zoals kosten, tijd, monstertype en opbrengst beïnvloeden de selectie van de optimale methode.

Wanneer DNA van organismale of eDNA-monsters wordt geamplificeerd met behulp van polymerasekettingreactie (PCR), kan de reactie negatief worden beïnvloed door remmermoleculen in het monster. [14] Het verwijderen van deze remmers is cruciaal om ervoor te zorgen dat DNA van hoge kwaliteit beschikbaar is voor latere analyse.

Amplificatie van het geëxtraheerde DNA is een vereiste stap in DNA-barcodering. Gewoonlijk wordt slechts een klein fragment van het totale DNA-materiaal gesequenced (meestal 400-800 basenparen) [15] om de DNA-barcode te verkrijgen. Amplificatie van eDNA-materiaal is meestal gericht op kleinere fragmentgroottes (<200 basenparen), omdat eDNA eerder gefragmenteerd is dan DNA-materiaal uit andere bronnen. Sommige onderzoeken beweren echter dat er geen verband bestaat tussen de grootte van het amplicon en de detectiesnelheid van eDNA. [16] [17]

Wanneer het DNA-barcodemarkergebied is geamplificeerd, is de volgende stap om het markergebied te sequensen met behulp van DNA-sequencingmethoden. [18] Er zijn veel verschillende sequencingplatforms beschikbaar en de technische ontwikkeling gaat snel.

Marker selectie Bewerken

Markers die worden gebruikt voor DNA-barcodering worden barcodes genoemd. Om soorten succesvol te karakteriseren op basis van DNA-barcodes, is selectie van informatieve DNA-regio's cruciaal. Een goede DNA-barcode moet een lage intraspecifieke en een hoge interspecifieke variabiliteit hebben [10] en geconserveerde flankerende plaatsen hebben voor het ontwikkelen van universele PCR-primers voor brede taxonomische toepassing. Het doel is om primers te ontwerpen die de meeste of alle soorten in de bestudeerde groep organismen kunnen detecteren en onderscheiden (hoge taxonomische resolutie). De lengte van de streepjescodesequentie moet kort genoeg zijn om te worden gebruikt met de huidige bemonsteringsbron, DNA-extractie, amplificatie en sequentiemethoden. [19]

Idealiter zou één gensequentie worden gebruikt voor alle taxonomische groepen, van virussen tot planten en dieren. Een dergelijk gengebied is echter nog niet gevonden, dus worden verschillende barcodes gebruikt voor verschillende groepen organismen, [20] of afhankelijk van de onderzoeksvraag.

Voor dieren, de meest gebruikte streepjescode is mitochondriaal cytochroom C-oxidase I (COI) plaats. [21] Andere mitochondriale genen, zoals Cytb, 12S of 18S worden ook gebruikt. Mitochondriale genen hebben de voorkeur boven nucleaire genen vanwege hun gebrek aan introns, hun haploïde wijze van overerving en hun beperkte recombinatie. [21] [22] Bovendien heeft elke cel verschillende mitochondriën (tot enkele duizenden) en elk van hen bevat verschillende circulaire DNA-moleculen. Mitochondriën kunnen daarom een ​​overvloedige bron van DNA bieden, zelfs wanneer het monsterweefsel beperkt is. [20]

In plantenmitochondriale genen zijn echter niet geschikt voor DNA-barcodering omdat ze lage mutatiesnelheden vertonen. [23] Er zijn enkele kandidaatgenen gevonden in het chloroplastgenoom, waarvan het meest veelbelovend het maturase K-gen is (matK) alleen of in combinatie met andere genen. Multi-locus markers zoals ribosomale interne getranscribeerde spacers (ITS DNA) samen met matK, rbcL, trnH of andere genen zijn ook gebruikt voor de identificatie van soorten. [20] Het beste onderscheid tussen plantensoorten is bereikt bij het gebruik van twee of meer chloroplast-barcodes. [24]

Voor bacteriën, kan de kleine subeenheid van het ribosomaal RNA (16S)-gen worden gebruikt voor verschillende taxa, omdat het sterk geconserveerd is. [25] Sommige studies suggereren: COI, [26] type II chaperonine (cpn60) [27] of β-subeenheid van RNA-polymerase (rpoB) [28] zou ook kunnen dienen als bacteriële DNA-barcodes.

Barcodering schimmels is uitdagender en er kan meer dan één primercombinatie nodig zijn. [29] De COI marker presteert goed in bepaalde schimmelgroepen [30] maar niet even goed in andere. [31] Daarom worden aanvullende markers gebruikt, zoals ITS rDNA en de grote subeenheid van nucleair ribosomaal RNA (LSU). [32]

Binnen de groep van protisten, zijn verschillende streepjescodes voorgesteld, zoals de D1-D2- of D2-D3-regio's van 28S-rDNA, V4-subregio van 18S-rRNA-gen, ITS-rDNA en COI. Bovendien kunnen enkele specifieke streepjescodes worden gebruikt voor fotosynthetische protisten, bijvoorbeeld de grote subeenheid van het ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase-oxygenase-gen (rbcL) en het chloroplastische 23S rRNA-gen. [20]

Markers die zijn gebruikt voor DNA-barcodering in verschillende organismegroepen, gewijzigd van Purty en Chatterjee. [20]
Organisme groep Markergen/locus
Dieren COI, [33] Cytb, [34] 12S, [35] 16S [36]
Planten matK, [37] rbcL, [38] psbA-trnH, [39] ZIJN [40]
bacteriën COI, [26] rpoB, [28] 16S, [41] cpn60, [27] tuf, [42] RIF, [43] gnd [44]
schimmels ZIJN, [2] [45] TEF1α, [46] [47] RPB1 (LSU), RPB2 (LSU), 18S (SSU) [32]
protisten ZIJN, [48] COI, [49] rbcL, [50] 18S, [51] 28S [50]

Reference libraries are used for the taxonomic identification, also called annotation, of sequences obtained from barcoding or metabarcoding. These databases contain the DNA barcodes assigned to previously identified taxa. Most reference libraries do not cover all species within an organism group, and new entries are continually created. In the case of macro- and many microorganisms (such as algae), these reference libraries require detailed documentation (sampling location and date, person who collected it, image, etc.) and authoritative taxonomic identification of the voucher specimen, as well as submission of sequences in a particular format. However, such standards are fulfilled for only a small number of species. The process also requires the storage of voucher specimens in museum collections, herbaria and other collaborating institutions. Both taxonomically comprehensive coverage and content quality are important for identification accuracy. [52] In the microbial world, there is no DNA information for most species names, and many DNA sequences cannot be assigned to any Linnaean binomial. [53] Several reference databases exist depending on the organism group and the genetic marker used. There are smaller, national databases (e.g. FinBOL), and large consortia like the International Barcode of Life Project (iBOL). [54]

Launched in 2007, the Barcode of Life Data System (BOLD) [55] is one of the biggest databases, containing more than 450 000 BINs (Barcode Index Numbers) in 2019. It is a freely accessible repository for the specimen and sequence records for barcode studies, and it is also a workbench aiding the management, quality assurance and analysis of barcode data. The database mainly contains BIN records for animals based on the COI genetic marker.

The UNITE database [56] was launched in 2003 and is a reference database for the molecular identification of fungal species with the internal transcribed spacer (ITS) genetic marker region. This database is based on the concept of species hypotheses: you choose the % at which you want to work, and the sequences are sorted in comparison to sequences obtained from voucher specimens identified by experts.

Diat.barcode [57] database was first published under the name R-syst::diatom [58] in 2016 starting with data from two sources: the Thonon culture collection (TCC) in the hydrobiological station of the French National Institute for Agricultural Research (INRA), and from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) nucleotide database. Diat.barcode provides data for two genetic markers, rbcL (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase) and 18S (18S ribosomal RNA). The database also involves additional, trait information of species, like morphological characteristics (biovolume, size dimensions, etc.), life-forms (mobility, colony-type, etc.) or ecological features (pollution sensitivity, etc.).

Bioinformatic analysis Edit

In order to obtain well structured, clean and interpretable data, raw sequencing data must be processed using bioinformatic analysis. The FASTQ file with the sequencing data contains two types of information: the sequences detected in the sample (FASTA file) and a quality file with quality scores (PHRED scores) associated with each nucleotide of each DNA sequence. The PHRED scores indicate the probability with which the associated nucleotide has been correctly scored.

PHRED quality score and the associated certainty level
10 90%
20 99%
30 99.9%
40 99.99%
50 99.999%

In general, the PHRED score decreases towards the end of each DNA sequence. Thus some bioinformatics pipelines simply cut the end of the sequences at a defined threshold.

Some sequencing technologies, like MiSeq, use paired-end sequencing during which sequencing is performed from both directions producing better quality. The overlapping sequences are then aligned into contigs and merged. Usually, several samples are pooled in one run, and each sample is characterized by a short DNA fragment, the tag. In a demultiplexing step, sequences are sorted using these tags to reassemble the separate samples. Before further analysis, tags and other adapters are removed from the barcoding sequence DNA fragment. During trimming, the bad quality sequences (low PHRED scores), or sequences that are much shorter or longer than the targeted DNA barcode, are removed. The following dereplication step is the process where all of the quality-filtered sequences are collapsed into a set of unique reads (individual sequence units ISUs) with the information of their abundance in the samples. After that, chimeras (i.e. compound sequences formed from pieces of mixed origin) are detected and removed. Finally, the sequences are clustered into OTUs (Operational Taxonomic Units), using one of many clustering strategies. The most frequently used bioinformatic software include Mothur, [59] Uparse, [60] Qiime, [61] Galaxy, [62] Obitools, [63] JAMP, [64] Barque, [65] and DADA2. [66]

Comparing the abundance of reads, i.e. sequences, between different samples is still a challenge because both the total number of reads in a sample as well as the relative amount of reads for a species can vary between samples, methods, or other variables. For comparison, one may then reduce the number of reads of each sample to the minimal number of reads of the samples to be compared – a process called rarefaction. Another way is to use the relative abundance of reads. [67]

Species identification and taxonomic assignment Edit

The taxonomic assignment of the OTUs to species is achieved by matching of sequences to reference libraries. The Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) is commonly used to identify regions of similarity between sequences by comparing sequence reads from the sample to sequences in reference databases. [68] If the reference database contains sequences of the relevant species, then the sample sequences can be identified to species level. If a sequence cannot be matched to an existing reference library entry, DNA barcoding can be used to create a new entry.

In some cases, due to the incompleteness of reference databases, identification can only be achieved at higher taxonomic levels, such as assignment to a family or class. In some organism groups such as bacteria, taxonomic assignment to species level is often not possible. In such cases, a sample may be assigned to a particular operational taxonomic unit (OTU).

Applications of DNA barcoding include identification of new species, safety assessment of food, identification and assessment of cryptic species, detection of alien species, identification of endangered and threatened species, [69] linking egg and larval stages to adult species, securing intellectual property rights for bioresources, framing global management plans for conservation strategies and elucidate feeding niches. [70] DNA barcode markers can be applied to address basic questions in systematics, ecology, evolutionary biology and conservation, including community assembly, species interaction networks, taxonomic discovery, and assessing priority areas for environmental protection.

Identification of species Edit

Specific short DNA sequences or markers from a standardized region of the genome can provide a DNA barcode for identifying species. [71] Molecular methods are especially useful when traditional methods are not applicable. DNA barcoding has great applicability in identification of larvae for which there are generally few diagnostic characters available, and in association of different life stages (e.g. larval and adult) in many animals. [72] Identification of species listed in the Convention of the International Trade of Endangered Species (CITES) appendixes using barcoding techniques is used in monitoring of illegal trade. [73]

Detection of invasive species Edit

Alien species can be detected via barcoding. [74] [75] Barcoding can be suitable for detection of species in e.g. border control, where rapid and accurate morphological identification is often not possible due to similarities between different species, lack of sufficient diagnostic characteristics [74] and/or lack of taxonomic expertise. Barcoding and metabarcoding can also be used to screen ecosystems for invasive species, and to distinguish between an invasive species and native, morphologically similar, species. [76]

Delimiting cryptic species Edit

DNA barcoding enables the identification and recognition of cryptic species. [77] The results of DNA barcoding analyses depend however upon the choice of analytical methods, so the process of delimiting cryptic species using DNA barcodes can be as subjective as any other form of taxonomy. Hebert et al. (2004) concluded that the butterfly Astraptes fulgerator in north-western Costa Rica actually consists of 10 different species. [78] These results, however, were subsequently challenged by Brower (2006), who pointed out numerous serious flaws in the analysis, and concluded that the original data could support no more than the possibility of three to seven cryptic taxa rather than ten cryptic species. [79] Smith et al. (2007) used cytochrome C oxidase I DNA barcodes for species identification of the 20 morphospecies of Belvosia parasitoid flies (Diptera: Tachinidae) reared from caterpillars (Lepidoptera) in Area de Conservación Guanacaste (ACG), northwestern Costa Rica. These authors discovered that barcoding raises the species count to 32, by revealing that each of the three parasitoid species, previously considered as generalists, actually are arrays of highly host-specific cryptic species. [80] For 15 morphospecies of polychaetes within the deep Antarctic benthos studied through DNA barcoding, cryptic diversity was found in 50% of the cases. Furthermore, 10 previously overlooked morphospecies were detected, increasing the total species richness in the sample by 233%. [81]

Diet analysis and food web application Edit

DNA barcoding and metabarcoding can be useful in diet analysis studies, [82] and is typically used if prey specimens cannot be identified based on morphological characters. [83] [84] There is a range of sampling approaches in diet analysis: DNA metabarcoding can be conducted on stomach contents, [85] feces, [84] [86] saliva [87] or whole body analysis. [69] [88] In fecal samples or highly digested stomach contents, it is often not possible to distinguish tissue from single species, and therefore metabarcoding can be applied instead. [84] [89] Feces or saliva represent non-invasive sampling approaches, while whole body analysis often means that the individual needs to be killed first. For smaller organisms, sequencing for stomach content is then often done by sequencing the entire animal.

Barcoding for food safety Edit

DNA barcoding represents an essential tool to evaluate the quality of food products. The purpose is to guarantee food traceability, to minimize food piracy, and to valuate local and typical agro-food production. Another purpose is to safeguard public health for example, metabarcoding offers the possibility to identify groupers causing Ciguatera fish poisoning from meal remnants, [90] or to separate poisonous mushrooms from edible ones (Ref).

Biomonitoring and ecological assessment Edit

DNA barcoding can be used to assess the presence of endangered species for conservation efforts (Ref), or the presence of indicator species reflective to specific ecological conditions (Ref), for example excess nutrients or low oxygen levels.

Potentials Edit

Traditional bioassessment methods are well established internationally, and serve biomonitoring well, as for example for aquatic bioassessment within the EU Directives WFD and MSFD. However, DNA barcoding could improve traditional methods for the following reasons DNA barcoding (i) can increase taxonomic resolution and harmonize the identification of taxa which are difficult to identify or lack experts, (ii) can more accurately/precisely relate environmental factors to specific taxa (iii) can increase comparability among regions, (iv) allows for the inclusion of early life stages and fragmented specimens, (v) allows delimitation of cryptic/rare species (vi) allows for development of new indices e.g. rare/cryptic species which may be sensitive/tolerant to stressors, (vii) increases the number of samples which can be processed and reduces processing time resulting in increased knowledge of species ecology, (viii) is a non-invasive way of monitoring when using eDNA methods. [91]

Time and cost Edit

DNA barcoding is faster than traditional morphological methods all the way from training through to taxonomic assignment. It takes less time to gain expertise in DNA methods than becoming an expert in taxonomy. In addition, the DNA barcoding workflow (i.e. from sample to result) is generally quicker than traditional morphological workflow and allows the processing of more samples.

Taxonomic resolution Edit

DNA barcoding allows the resolution of taxa from higher (e.g. family) to lower (e.g. species) taxonomic levels, that are otherwise too difficult to identify using traditional morphological methods, like e.g. identification via microscopy. For example, Chironomidae (the non-biting midge) are widely distributed in both terrestrial and freshwater ecosystems. Their richness and abundance make them important for ecological processes and networks, and they are one of many invertebrate groups used in biomonitoring. Invertebrate samples can contain as many as 100 species of chironomids which often make up as much as 50% of a sample. Despite this, they are usually not identified below the family level because of the taxonomic expertise and time required. [92] This may result in different chironomid species with different ecological preferences grouped together, resulting in inaccurate assessment of water quality.

DNA barcoding provides the opportunity to resolve taxa, and directly relate stressor effects to specific taxa such as individual chironomid species. For example, Beermann et al. (2018) DNA barcoded Chironomidae to investigate their response to multiple stressors reduced flow, increased fine-sediment and increased salinity. [93] After barcoding, it was found that the chironomid sample consisted of 183 Operational Taxonomic Units (OTUs), i.e. barcodes (sequences) that are often equivalent to morphological species. These 183 OTUs displayed 15 response types rather than the previously reported [94] two response types recorded when all chironomids were grouped together in the same multiple stressor study. A similar trend was discovered in a study by Macher et al. (2016) which discovered cryptic diversity within the New Zealand mayfly species Deleatidium sp. This study found different response patterns of 12 molecular distinct OTUs to stressors which may change the consensus that this mayfly is sensitive to pollution. [95]

Shortcomings Edit

Despite the advantages offered by DNA barcoding, it has also been suggested that DNA barcoding is best used as a complement to traditional morphological methods. [91] This recommendation is based on multiple perceived challenges.

Physical parameters Edit

It is not completely straightforward to connect DNA barcodes with ecological preferences of the barcoded taxon in question, as is needed if barcoding is to be used for biomonitoring. For example, detecting target DNA in aquatic systems depends on the concentration of DNA molecules at a site, which in turn can be affected by many factors. The presence of DNA molecules also depends on dispersion at a site, e.g. direction or strength of currents. It is not really known how DNA moves around in streams and lakes, which makes sampling difficult. Another factor might be the behavior of the target species, e.g. fish can have seasonal changes of movements, crayfish or mussels will release DNA in larger amounts just at certain times of their life (moulting, spawning). For DNA in soil, even less is known about distribution, quantity or quality. The major limitation of the barcoding method is that it relies on barcode reference libraries for the taxonomic identification of the sequences. The taxonomic identification is accurate only if a reliable reference is available. However, most databases are still incomplete, especially for smaller organisms e.g. fungi, phytoplankton, nematoda etc. In addition, current databases contain misidentifications, spelling mistakes and other errors. There is massive curation and completion effort around the databases for all organisms necessary, involving large barcoding projects (for example the iBOL project for the Barcode of Life Data Systems (BOLD) reference database). [96] [97] However, completion and curation are difficult and time-consuming. Without vouchered specimens, there can be no certainty about whether the sequence used as a reference is correct. DNA sequence databases like GenBank contain many sequences that are not tied to vouchered specimens (for example, herbarium specimens, cultured cell lines, or sometimes images). This is problematic in the face of taxonomic issues such as whether several species should be split or combined, or whether past identifications were sound. Reusing sequences, not tied to vouchered specimens, of initially misidentified organism may support incorrect conclusions and must be avoided. [98] Therefore, best practice for DNA barcoding is to sequence vouchered specimens. [99] [100] For many taxa, it can be however difficult to obtain reference specimens, for example with specimens that are difficult to catch, available specimens are poorly conserved, or adequate taxonomic expertise is lacking. [98] Importantly, DNA barcodes can also be used to create interim taxonomy, in which case OTUs can be used as substitutes for traditional Latin binomials – thus significantly reducing dependency on fully populated reference databases. [101]

Technological bias Edit

DNA barcoding also carries methodological bias, from sampling to bioinformatics data analysis. Beside the risk of contamination of the DNA sample by PCR inhibitors, primer bias is one of the major sources of errors in DNA barcoding. [102] [103] The isolation of an efficient DNA marker and the design of primers is a complex process and considerable effort has been made to develop primers for DNA barcoding in different taxonomic groups. [104] However, primers will often bind preferentially to some sequences, leading to differential primer efficiency and specificity and unrepresentative communities’ assessment and richness inflation. [105] Thus, the composition of the sample's communities sequences is mainly altered at the PCR step. Besides, PCR replication is often required, but leads to an exponential increase in the risk of contamination. Several studies have highlighted the possibility to use mitochondria-enriched samples [106] [107] or PCR-free approaches to avoid these biases, but as of today, the DNA metabarcoding technique is still based on the sequencing of amplicons. [104] Other bias enter the picture during the sequencing and during the bioinformatic processing of the sequences, like the creation of chimeras.

Lack of standardization Edit

Even as DNA barcoding is more widely used and applied, there is no agreement concerning the methods for DNA preservation or extraction, the choices of DNA markers and primers set, or PCR protocols. The parameters of bioinformatics pipelines (for example OTU clustering, taxonomic assignment algorithms or thresholds etc.) are at the origin of much debate among DNA barcoding users. [104] Sequencing technologies are also rapidly evolving, together with the tools for the analysis of the massive amounts of DNA data generated, and standardization of the methods is urgently needed to enable collaboration and data sharing at greater spatial and time-scale. This standardisation of barcoding methods at the European scale is part of the objectives of the European COST Action DNAqua-net [108] and is also addressed by CEN (the European Committee for Standardization). [109]

Another criticism of DNA barcoding is its limited efficiency for accurate discrimination below species level (for example, to distinguish between varieties), for hybrid detection, and that it can be affected by evolutionary rates (Ref needed).

Mismatches between conventional (morphological) and barcode based identification Edit

It is important to know that taxa lists derived by conventional (morphological) identification are not, and maybe never will be, directly comparable to taxa lists derived from barcode based identification because of several reasons. The most important cause is probably the incompleteness and lack of accuracy of the molecular reference databases preventing a correct taxonomic assignment of eDNA sequences. Taxa not present in reference databases will not be found by eDNA, and sequences linked to a wrong name will lead to incorrect identification. [91] Other known causes are a different sampling scale and size between a traditional and a molecular sample, the possible analysis of dead organisms, which can happen in different ways for both methods depending on organism group, and the specific selection of identification in either method, i.e. varying taxonomical expertise or possibility to identify certain organism groups, respectively primer bias leading also to a potential biased analysis of taxa. [91]

Estimates of richness/diversity Edit

DNA Barcoding can result in an over or underestimate of species richness and diversity. Some studies suggest that artifacts (identification of species not present in a community) are a major cause of inflated biodiversity. [110] [111] The most problematic issue are taxa represented by low numbers of sequencing reads. These reads are usually removed during the data filtering process, since different studies suggest that most of these low-frequency reads may be artifacts. [112] However, real rare taxa may exist among these low-abundance reads. [113] Rare sequences can reflect unique lineages in communities which make them informative and valuable sequences. Thus, there is a strong need for more robust bioinformatics algorithms that allow the differentiation between informative reads and artifacts. Complete reference libraries would also allow a better testing of bioinformatics algorithms, by permitting a better filtering of artifacts (i.e. the removal of sequences lacking a counterpart among extant species) and therefore, it would be possible obtain a more accurate species assignment. [114] Cryptic diversity can also result in inflated biodiversity as one morphological species may actually split into many distinct molecular sequences. [91]

Metabarcoding is defined as the barcoding of DNA or eDNA (environmental DNA) that allows for simultaneous identification of many taxa within the same (environmental) sample, however often within the same organism group. The main difference between the approaches is that metabarcoding, in contrast to barcoding, does not focus on one specific organism, but instead aims to determine species composition within a sample.

Methodology Edit

The metabarcoding procedure, like general barcoding, covers the steps of DNA extraction, PCR amplification, sequencing and data analysis. A barcode consists of a short variable gene region (for example, see different markers/barcodes) which is useful for taxonomic assignment flanked by highly conserved gene regions which can be used for primer design. [12] Different genes are used depending if the aim is to barcode single species or metabarcoding several species. In the latter case, a more universal gene is used. Metabarcoding does not use single species DNA/RNA as a starting point, but DNA/RNA from several different organisms derived from one environmental or bulk sample.

Applications Edit

Metabarcoding has the potential to complement biodiversity measures, and even replace them in some instances, especially as the technology advances and procedures gradually become cheaper, more optimized and widespread. [115] [116]


Bekijk de video: HEREDITAS Materi Genetik DNA,RNA,Gen dan Kromosom Biologi Kelas XII #biologiasik (Januari- 2022).