Informatie

Zoogdiercellen transfecteren met enkelstrengs DNA?


Agrobacteriën kunnen delen van hun DNA afleveren aan plantencellen als T-DNA, DNA overdragen. Dit DNA wordt geleverd als een enkele streng en kan worden geïntegreerd in het plantengenoom of kan worden omgezet in een dubbelstrengs molecuul door het T-DNA te primen om er een substraat voor een DNA-polymerase van te maken. Dit artikel beschrijft het proces, maar de natuur maakt het moeilijk om bij het artikel te komen, sorry.

Waar ik in geïnteresseerd ben, is de levering van DNA aan zoogdiercellen. Ik probeerde artikelen te vinden die enkelstrengs DNA in zoogdiercellen gebruikten, maar kon niet veel vinden. Misschien heb ik niet genoeg tijd besteed aan zoeken. Ik zag enkele suggesties dat enkelstrengs DNA apoptose zou kunnen veroorzaken, of dat enkelstrengs DNA zou kunnen worden gebruikt om DNA-herstelmechanismen te manipuleren om integratie in het genoom te veroorzaken.

Is er echter een manier om een ​​enkelstrengs DNA af te leveren en het in situ om te zetten in een dubbelstrengs plasmide? Je zou waarschijnlijk een RNA- of DNA-primer nodig hebben, maar ik zie niet in waarom je de primer niet vooraf zou kunnen binden en het hele complex zou leveren.


Enkelstrengs DNA gebruikt als een efficiënt nieuw vehikel voor transformatie van plantenprotoplasten

In verband met de vraag welke DNA-vorm (enkel- of dubbelstrengs) wordt overgedragen door Agrobacterium tumefaciens voor plantencellen, bestudeerden we het gedrag van enkelstrengs DNA, in vergelijking met dubbelstrengs DNA, wanneer het door middel van elektroporatie in plantenprotoplasten wordt geïntroduceerd. Hiertoe hebben we een construct gekloneerd met zowel een planten-NPTII-gen als een CAT-gen in de M13-vectoren tg130 en tg131. We ontdekten dat beide complementaire enkelstrengs moleculen aanleiding gaven tot substantiële CAT-activiteit in plantenprotoplasten, wat suggereert dat enkelstrengs DNA wordt omgezet in dubbelstrengs DNA door de plantencelreplicatiemachinerie. Onverwacht ontdekten we dat enkelstrengs DNA leidt tot een 3-10 maal hogere frequentie van stabiele transformatie (selectie op kanamycineresistentie) dan dubbelstrengs DNA. Deze resultaten geven aan dat het gebruik van enkelstrengs DNA kan worden overwogen in experimenten waarbij optimale transformatiefrequenties nodig zijn, bijv. met protoplasten vormen weerbarstige plantensoorten.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Transfectie en homologe recombinatie met enkelstrengs DNA-substraten in zoogdiercellen en nucleaire extracten

We hebben het vermogen van enkelstrengs DNA onderzocht om deel te nemen aan homologe recombinatiereacties in zoogdiercellen en nucleaire extracten die daarvan zijn afgeleid. We hebben een fragment van het neo-gen ingevoegd in de enkelstrengs DNA-faagvector M13 mp11. Het neo-fragment was afgeleid van een deletiederivaat van de prokaryote-eukaryote shuttle-vector pSV2neo. Het resulterende enkelstrengs DNA werd gemengd met een dubbelstrengs deletiederivaat van pSV2neo en getest op recombinatie in menselijke cellen, apencellen en kernextracten verkregen uit menselijke cellen. We waren in staat om recombinante moleculen te verkrijgen die wildtype neo-genen bevatten in alle drie de systemen. Onderzoek van de producten van recombinatie gaf aan dat ze het gevolg waren van correctie van de deletie in het dubbelstrengs DNA-substraat. We waren niet in staat om enige uitgebreide omzetting van enkelstrengs DNA in zijn dubbelstrengs tegenhanger te detecteren voordat het deelnam aan de recombinatiereactie. We hebben ook het vermogen van enkelstrengs DNA om transfectanten op te leveren getest. Toen een enkelstrengs DNA-derivaat van het herpes simplex-virus thymidinekinase (TK)-gen werd geïntroduceerd in L-M(TK-)-cellen van muizen, waren we in staat om TK+-kolonies te verkrijgen. Uit deze resultaten concluderen we dat enkelstrengs DNA kan deelnemen aan zowel transfectie als homologe recombinatiereacties in zoogdiercellen.


Referenties

McDole, K. et al. In toto beeldvorming en reconstructie van post-implantatie muisontwikkeling op eencellig niveau. Cel 175, 859–876 (2018).

McKenna, A. et al. Tracering van de afstamming van het hele organisme door combinatorische en cumulatieve genoombewerking. Wetenschap 353, aaf7907 (2016).

Perli, S.D., Cui, C.H. & Lu, T.K. Continue genetische opname met zelfgerichte CRISPR-Cas in menselijke cellen. Wetenschap 353, aag0511 (2016).

Kalhor, R., Mali, P. & Church, G. M. Snel evoluerende homing CRISPR-barcodes. nat. Methoden: 14, 195–200 (2017).

Frieda, K.L. et al. Synthetische opname en in situ uitlezing van afstammingsinformatie in afzonderlijke cellen. Natuur 541, 107–111 (2017).

Schmidt, S.T., Zimmerman, S.M., Wang, J., Kim, S.K. & Quake, S.R. Kwantitatieve analyse van het traceren van synthetische cellijnen met behulp van nuclease-barcodering. ACS-synth. Biol. 6, 936–942 (2017).

Sheth, R. U., Yim, S. S., Wu, F. L. & Wang, H. H. Multiplex opname van cellulaire gebeurtenissen in de loop van de tijd op biologische CRISPR-tape. Wetenschap 358, 1457–1461 (2017).

Tang, W. & Liu, D.R. Herschrijfbare analoge opname met meerdere gebeurtenissen in bacteriële en zoogdiercellen. Wetenschap 360, eaap8992 (2018).

Shipman, S.L., Nivala, J., Macklis, J.D. & Church, G.M. CRISPR–Cas-codering van een digitale film in het genoom van een populatie levende bacteriën. Natuur 547, 345–349 (2017).

Shipman, S.L., Nivala, J., Macklis, J.D. & Church, G.M. Moleculaire opnames door gerichte acquisitie van CRISPR-spacer. Wetenschap 353, aaf1175 (2016).

Kalhor, R. et al. Ontwikkelingsbarcodering van hele muis via homing CRISPR. Wetenschap 361, eaat9804 (2018).

Raj, B. et al. Gelijktijdige eencellige profilering van afstammingslijnen en celtypen in de hersenen van gewervelde dieren. nat. Biotechnologie. 36, 442–450 (2018).

Spanjaard, B. et al. Gelijktijdige tracering van de afstamming en identificatie van het celtype met behulp van CRISPR-Cas9-geïnduceerde genetische littekens. nat. Biotechnologie. 36, 469–473 (2018).

Sheth, R. U. & Wang, H. H. Op DNA gebaseerde geheugenapparaten voor het opnemen van cellulaire gebeurtenissen. nat. Rev. Genet. 19, 718–732 (2018).

Hwang, B. et al. Lineage tracing met behulp van een Cas9-deaminase-barcodesysteem gericht op endogene L1-elementen. nat. gemeenschappelijk 10, 1234 (2019).

Chan, M.M. et al. Moleculaire opname van embryogenese bij zoogdieren. Natuur 570, 77–82 (2019).

Bowling, S. et al. Een gemanipuleerde CRISPR-Cas9-muislijn voor gelijktijdige uitlezing van afstammingsgeschiedenissen en genexpressieprofielen in afzonderlijke cellen. Cel 181, 1410–1422 (2020).

Alemany, A., Florescu, M., Baron, C.S., Peterson-Maduro, J. & van Oudenaarden, A. Kloontracering van het hele organisme met behulp van single-cell sequencing. Natuur 556, 108–112 (2018).

Landau, N.R., Schatz, D.G., Rosa, M. & Baltimore, D. Verhoogde frequentie van N-regio-insertie in een pre-B-cellijn van muis geïnfecteerd met een terminale deoxynucleotidyltransferase retrovirale expressievector. Mol. Cel Biol. 7, 3237–3243 (1987).

Pryor, J.M. et al. Ribonucleotide-opname maakt reparatie van chromosoombreuken mogelijk door niet-homologe eindverbinding. Wetenschap 361, 1126–1129 (2018).

Wang, T., Wei, J.J., Sabatini, D.M. & Lander, E.S. Genetische schermen in menselijke cellen met behulp van het CRISPR-Cas9-systeem. Wetenschap 343, 80–84 (2013).

Jinek, M. et al. Een programmeerbare dual-RNA-geleide DNA-endonuclease in adaptieve bacteriële immuniteit. Wetenschap 337, 816–821 (2012).

Zuo, Z. & Liu, J. Cas9-gekatalyseerde DNA-splitsing genereert verspringende uiteinden: bewijs van moleculaire dynamica-simulaties. Wetenschap. Rep. 6, 37584 (2016).

Gisler, S. et al. Multiplexed Cas9-targeting onthult genomische locatie-effecten en op gRNA gebaseerde gespreide pauzes die de mutatie-efficiëntie beïnvloeden. nat. gemeenschappelijk 10, 1598 (2019).

Shannon, C.E. Een wiskundige theorie van communicatie. Bel Syst. Tech. J. 27, 379–423 (1948).

Motea, E.A. & Berdis, A.J. Terminale deoxynucleotidyltransferase: het verhaal van een misleide DNA-polymerase. Biochim. Biofysica. Acta 1804, 1151–1166 (2010).

Liu, M. et al. Genomische ontdekking van krachtige chromatine-isolatoren voor menselijke gentherapie. nat. Biotechnologie. 33, 198–203 (2015).

Semenza, G. L. Hypoxie-induceerbare factoren in fysiologie en geneeskunde. Cel 148, 399–408 (2012).

Rankin, E. B. & Giaccia, A. J. Hypoxische controle van metastase. Wetenschap 352, 175–180 (2016).

Ede, C., Chen, X., Lin, M.-Y. & Chen, Y. Y. Kwantitatieve analyses van kernpromotors maken nauwkeurige engineering van gereguleerde genexpressie in zoogdiercellen mogelijk. ACS-synth. Biol. 5, 395–404 (2016).

McKenna, A. & Gagnon, J. A. Opname-ontwikkeling met eencellige dynamische afstammingstracering. Ontwikkeling 146, dev169730 (2019).

Fu, Y., Sander, J.D., Reyon, D., Cascio, V.M. & Joung, J.K. Verbetering van de specificiteit van CRISPR-Cas-nuclease met behulp van afgeknotte gids-RNA's. nat. Biotechnologie. 32, 279–284 (2014).

Palluk, S. et al. De novo DNA-synthese met behulp van polymerase-nucleotide-conjugaten. nat. Biotechnologie. 36, 645–650 (2018).

Barthel, S., Palluk, S., Hillson, N.J., Keasling, J.D. & Arlow, D.H. Verbetering van de terminale deoxynucleotidyltransferase-activiteit op substraten met 3'-terminale structuren voor enzymatische de novo DNA-synthese. genen 11, 102 (2020).

Lee, H.H., Kalhor, R., Goela, N., Bolot, J. & Church, G.M. Terminator-vrije sjabloononafhankelijke enzymatische DNA-synthese voor digitale informatieopslag. nat. gemeenschappelijk 10, 2383 (2019).

Zamft, B.M. et al. Kation-afhankelijke DNA-polymerase-getrouwheidslandschappen meten door middel van diepe sequencing. PLoS ONE 7, e43876 (2012).

Marblestone, A.H. et al. Fysieke principes voor schaalbare neurale opname. Voorkant. Berekenen. neurosci. 7, 137 (2013).

Glaser, J.I. et al. Statistische analyse van moleculaire signaalregistratie. PLoS-computer. Biol. 9, e1003145 (2013).

Bhan, N.J. et al. Tijdelijke gegevens opnemen op DNA met een resolutie van minuten. Voordruk bij bioRxiv https://doi.org/10.1101/634790 (2019).

Mali, P. et al. RNA-geleide menselijke genoom-engineering via Cas9. Wetenschap 339, 823–826 (2013).

Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Programmeerbare bewerking van een doelwitbase in genomisch DNA zonder dubbelstrengs DNA-splitsing. Natuur 533, 420–424 (2016).

Yan, Q., Bartz, S., Mao, M., Li, L. & Kaelin, W.G. De hypoxie-induceerbare factor 2' N-terminale en C-terminale transactiveringsdomeinen werken samen om niertumorigenese in vivo te bevorderen. Mol. Cel Biol. 27, 2092–2102 (2007).

Campeau, E. et al. Een veelzijdig viraal systeem voor expressie en uitputting van eiwitten in zoogdiercellen. PLoS ONE 4, e6529 (2009).

Tsai, S.Q. et al. Dimere CRISPR RNA-geleide FokI-nucleasen voor zeer specifieke genoombewerking. nat. Biotechnologie. 32, 569–576 (2014).

Waldo, G.S., Standish, B.M., Berendzen, J. & Terwilliger, T.C. Snelle eiwitvouwtest met behulp van groen fluorescerend eiwit. nat. Biotechnologie. 17, 691–695 (1999).

Yang, B., Gathy, K.N. & Coleman, M.S. Mutatieanalyse van residuen in het nucleotide-bindende domein van humaan terminale deoxynucleotidyltransferase. J. Biol. Chem. 269, 11859–11868 (1994).

Repasky, J.A.E., Corbett, E., Boboila, C. & Schatz, D.G. Mutatieanalyse van terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde N-nucleotide-additie in V (D) J-recombinatie. J. Immunol. 172, 5478–5488 (2004).

Lee, M.E., DeLoache, W.C., Cervantes, B. & Dueber, J.E. Een zeer gekarakteriseerde gist-toolkit voor modulaire, meerdelige assemblage. ACS-synth. Biol. 4, 975–986 (2015).

Chen, S. et al. Genoombreed CRISPR-scherm in een muismodel van tumorgroei en metastase. Cel 160, 1246–1260 (2015).

Tanida-Miyake, E., Koike, M., Uchiyama, Y., Tanida, I. & Sato, M. Optimalisatie van mNeonGreen voor Homo sapiens verhoogt de fluorescerende intensiteit in zoogdiercellen. PLoS ONE 13, e0191108 (2018).

Kleinstiver, B.P. et al. Engineered CRISPR-Cas9-nucleasen met gewijzigde PAM-specificiteiten. Natuur 523, 481–485 (2015).

Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T. & Stamatakis, A. PEAR: een snelle en nauwkeurige Illumina Paired-End read mergeR. Bio-informatica 30, 614–620 (2013).


MiRNA Transfectie  

Efficiënte microRNA-transfectie

Xfect RNA-transfectiereagens biedt een hoge mate van transfectie-efficiëntie en levensvatbaarheid van de cellen voor zes verschillende populaire cellijnen (Figuur 5).

Figuur 5. Efficiënte transfectie van microRNA met behulp van het Xfect RNA-transfectiereagens. Een FAM-gelabelde microRNA-nabootser werd getransfecteerd in zes populaire cellijnen met behulp van het Xfect RNA-transfectiereagens volgens het protocol. 24 uur na transfectie werden cellen geoogst en transfectie-efficiëntie werd bepaald door flowcytometrie. De levensvatbaarheid van de cellen werd ook gemeten met behulp van Trypan Blue-kleuring. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drie onafhankelijke transfecties voor elke cellijn.


STRATEGISCHE PLANNING

Een knock-outstrategie kiezen

Om een ​​gen van belang uit te schakelen, moeten de nuclease Cas9 en een doelspecifiek gids-RNA aan de cel worden afgeleverd. Verschillende CRISPR-platforms zijn geschikt voor het genereren van knock-outs, waaronder "all-in-one" of één-plasmidesysteem (waarin Cas9 en het gids-RNA op dezelfde vector worden gecodeerd), twee-plasmidesystemen (waarin Cas9 en het gids-RNA worden gecodeerd op verschillende vectoren), en directe levering van ribonucleoproteïne. De assemblage en levering van ribonucleoproteïne zijn elders beschreven (Farboud et al., 2018), en dit protocol zal zich richten op op plasmiden gebaseerde knock-outstrategieën.

De efficiëntie van elk CRISPR-systeem wordt beperkt door de werkzaamheid waarmee het in de doelcel kan worden geïntroduceerd en tot expressie kan worden gebracht. In de benadering met twee vectoren wordt een Cas9 tot expressie brengende plasmide eerst stabiel getransduceerd met behulp van lentivirussen in de doelcellijn. Na selectie voor Cas9-expressie kan deze lijn eenvoudig worden gebruikt om meerdere knock-outklonen te genereren door verschillende gids-RNA's uit te drukken. Constitutieve Cas9-expressie kan echter leiden tot hogere niveaus van off-target mutagenese, en sommige cellijnen hebben de neiging om viraal tot expressie gebrachte eiwitten tot zwijgen te brengen (Ellis, 2005). In de benadering met één vector kan het enkele Cas9/gRNA-plasmide in cellen worden geïntroduceerd via transfectie of transductie. De grootte van het provirus dat wordt gegenereerd uit de alles-in-één-vector ligt echter in de buurt van de lentivirale verpakkingslimiet, wat de daaropvolgende virale titers kan verlagen (Kumar, Keller, Makalou, & Sutton, 2001). Als een onderzoeker verschillende knockouts in dezelfde cellijn wil analyseren, raden we in het algemeen aan om de twee-vectorbenadering te gebruiken en een stabiele Cas9-expresserende cellijn te genereren. Als een onderzoeker een enkele knock-out wil analyseren en off-target effecten wil minimaliseren, dan kan tijdelijke transfectie van de all-in-one vector superieur zijn. Een aantal laboratoria heeft CRISPR-plasmiden ontwikkeld met handige resistentie tegen geneesmiddelen en fluorescerende markers. In dit protocol beschrijven we het gebruik van plasmiden die zijn gegenereerd en gevalideerd door ons eigen laboratorium en door het Vakoc-laboratorium in Cold Spring Harbor Laboratory, hoewel veel van de andere CRISPR-vectoren die beschikbaar zijn bij Addgene in hun plaats kunnen worden gebruikt.

Het aantal gRNA's dat in cellijnen wordt geïntroduceerd, is afhankelijk van de experimentele doelen van het project en eventuele unieke kenmerken van het gen van belang. Het gebruik van één gRNA is vaak voldoende om het doelgen in een deel van de cellen in een populatie uit te schakelen (Popp & Maquat, 2016). Zoals beschreven in het onderstaande commentaar, kunnen alternatieve splicing, stroomafwaartse translationele initiatie en de productie van functionele eiwitfragmenten het cellen echter af en toe mogelijk maken om enkele Cas9-geïnduceerde laesies te omzeilen (Lalonde et al., 2017 Sharpe & Cooper, 2017). Om de waarschijnlijkheid van het uitschakelen van een doelgen te maximaliseren, kan een strategie met twee gidsen worden gebruikt. In deze benadering worden twee gRNA's, gericht op twee verschillende exons, in de cellen geïntroduceerd. Deze dubbele snede kan worden hersteld door het genereren van twee onafhankelijke mutaties of de eliminatie van het DNA tussen de twee doellocaties. Het is belangrijk op te merken dat de introductie van meerdere gids-RNA's in een cel kan resulteren in een toename van off-target mutagenese. Het blijft dus cruciaal om knock-out-fenotypen te valideren door verschillende combinaties van gids-RNA's te gebruiken en door meerdere onafhankelijke klonen te analyseren door middel van western blotting, PCR en sequencing.

Bovendien is het bij het genereren van KO-cellijnen vaak handig om controlecellijnen te hebben voor stroomafwaartse experimentele vergelijkingen. Voor dit doel genereren we vaak eencellige klonale lijnen van cellen die gRNA's herbergen die gericht zijn op de veilige havenloci Rosa26 of AAVS1.

Gids voor RNA-klonen

Om te beginnen moeten gRNA's die gericht zijn op het gen van belang eerst worden gekloond in de gRNA-expressievector naar keuze.

1: ISOLATIE VAN PLASMID-DNA

Om in latere stappen van het protocol (Basic Protocol 1) in gRNA-sequenties te klonen, is het noodzakelijk om eerst voldoende hoeveelheden van de gRNA-plasmide-backbone te zuiveren (tabel 1). Deze plasmide-backbones kunnen worden verkregen bij Addgene.

Plasmide(n) Addgene nr. Doel
Eén-plasmide knock-out systemen
Lenti-Cas9-gRNA-GFP 124770 Coexpress Cas9, een gRNA en GFP
Lenti-Cas9-gRNA-TagBFP2 124774 Coexpress Cas9, een gRNA en TagBFP2
Twee-plasmide knock-outsystemen
LentiV_Cas9_puro 108100 Drukt Cas9 uit met puromycine-resistentie
LRG2.1 108098 Drukt een gRNA uit met GFP
LR Cherry2.1 108099 Drukt een gRNA uit met mCherry
Lenti_sgRNA_EFS_BFP 120577 Drukt een gRNA uit met eBFP
LRG2.1-mOranje 124772 Drukt een gRNA uit met mOrange
LRG2.1-CyOFP1 124771 Drukt een gRNA uit met CyOFP1
LRG2.1-TagBFP2 124773 Drukt een gRNA uit met TagBFP2

Materialen

  • Plasmide(n) van belang (Addgene)
  • Gepast Escherichia coli deformatie
  • LB + 100 µg/ml ampicillinemedium
  • 50% (v/v) glycerol
  • GeneJET Plasmid Maxiprep Kit (Thermo Fisher Scientific cat.nr. K0491)
  • NanoDrop-spectrofotometer of equivalent
  • Invriesbuisjes van 1,5 ml
  • Microcentrifugebuisjes van 1,5 ml

1. Verkrijg de gewenste plasmide(n) van Addgene.

2. Na ontvangst van de steekcultuur van E coli, ent de bacteriën een nacht bij 37°C in 2 ml LB + 100 µg/ml ampicillinemedium.

3. Bereid de volgende dag glycerolvoorraden voor door 500 µl van de bacteriecultuur te resuspenderen in 500 µl 50% glycerol en op te slaan in vriesbuizen van 1,5 ml bij -80°C. Breng bovendien 1 ml van de overnachtkweek over in 250 ml LB + 100 µg/ml ampicillinemedium en laat nog eens 12-18 uur groeien bij 37°C.

4. Isoleer de plasmiden van de E coli voorraad met behulp van de GeneJET Plasmid Maxiprep Kit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeer de DNA-concentratie en zuiverheid met behulp van een NanoDrop-spectrofotometer en bewaar aliquots van de plasmidedragende voorraad in microcentrifugebuizen van 1,5 ml bij -20 ° C voor later gebruik.

2: BEREIDING VAN BEVOEGDE STBL3 E COLI VOOR gRNA-klonen

De repetitieve sequenties in de lentivirale CRISPR-plasmiden kunnen onstabiel zijn wanneer de plasmiden worden vermeerderd in E coli. We raden daarom aan om de gekloonde plasmiden die in Basisprotocol 1 zijn geconstrueerd om te zetten in de recombinatie-deficiënte Stbl3-stam van E coli om vectorstabiliteit te maximaliseren (Al-Allaf, Tolmachov, Zambetti, Tchetchelnitski, & Mehmet, 2013). Hoewel het kopen van kant-en-klare competente Stbl3 erg duur is, genereren we onze eigen batches competente Stbl3-cellen met behulp van de Zymo Research Mix & Go Transformation Kit.

Materialen

  • One Shot™ Stbl3™ Chemisch bekwaam E coli (Invitrogen cat.nr. C737303)
  • Mix & Go E coli Transformatie Kit en Buffer Set (Zymo Research cat. no. T3001)

1. Bereid verse partijen competente Stbl3 E coli door de instructies van de Mix & Go Kit te volgen.

2. Bewaar aliquots van cellen bij -80°C voor later gebruik.

3: HANDLEIDING VERKRIJGEN RNA-OLIGONUCLEOTIDEN

Gids-RNA's worden gekloneerd in expressievectoren door BsmBI-digestie. Nadat een geschikte gids-RNA-sequentie van 20 bp is geïdentificeerd, moeten BsmBI-restrictiesequenties worden toegevoegd aan elke streng van de gRNA-sequentie, zoals hier wordt weergegeven:

"CACCG" en "AAAC" worden aan de oligo's toegevoegd om compatibiliteit te garanderen voor klonen met behulp van een BsmBI-digestie. De enkele C aan het 3'-uiteinde van de omgekeerde oligo is nodig om de sequentie te annealen met de extra G die aan de voorwaartse oligo is toegevoegd. Gids-RNA's zijn over het algemeen 25 bp lang nadat deze wijzigingen aan de sgRNA-sequentie zijn toegevoegd.

Synthetische oligo's van de ontworpen gidsen kunnen commercieel worden gekocht bij Integrated DNA Technologies (IDT https://www.idtdna.com) of een commerciële bron. Over het algemeen levert 25 nmol DNA-oligo's van IDT bereid met standaard ontzouting meer dan genoeg materiaal voor gRNA-klonering (zie Strategische planning voor richtlijnen voor gRNA-ontwerp). Hoewel we een lijst hebben gegeven van vectoren die gRNA tot expressie brengen die we gewoonlijk gebruiken in tabel 1, is een aantal andere gRNA-vectoren te vinden op Addgene, en voor deze plasmiden kan het gebruik van alternatieve restrictie-enzymen nodig zijn.

De gRNA-oligo's kunnen worden gekloond in ofwel de gRNA-vector (twee-vectorsysteem) of de "all-in-one" vector (één-vectorsysteem) door restrictiedigestie en ligatie. Als de twee-gRNA-benadering wordt gekozen, kan elk gRNA worden gekloond in een vector met verschillende fluorescerende markers om stroomafwaartse sortering van cellen mogelijk te maken die beide gRNA's herbergen. Het gRNA-kloneringsprotocol bestaat uit vijf algemene stappen: (1) linearisatie van de plasmide-backbone, (2) 5'-fosforylering en annealing van de oligonucleotiden, (3) ligatie van de geannealde oligonucleotiden in de gelineariseerde vector, (4) transformatie van de ligatieproduct in Stbl3-cellen, en (5) sequentieverificatie van het gRNA.

Materialen

  • gRNA-plasmide-backbone of alles-in-één vector (Support Protocol 1)
  • Bevoegde Stbl3-cellen (Ondersteuningsprotocol 2)
  • BsmBI restrictie endonuclease en NEB buffer 3.1 (NEB cat. no. R0580)
  • Nucleasevrij gedestilleerd, gedeïoniseerd water (ddH2O)
  • Alkalische fosfatase, kalfsdarm (CIP) voorraad (10.000 E/ml NEB cat. nr. M0290)
  • NucleoSpin® Gel en PCR-reiniging (Macherey-Nagel cat. nr. 740609.50)
  • 100 µM gRNA-oligo's (IDT of een andere fabrikant van DNA-synthese, zie Strategische Planning en Ondersteuning Protocol 3)
  • T4 polynucleotide kinase (NEB cat. nr. M0201)
  • T4 DNA-ligase en geschikte buffer (NEB cat. no. M2022)
  • LB + 100 µg/ml ampicilline-kweekplaten
  • LB + 100 µg/ml ampicillinemedium
  • 50% (v/v) glycerol
  • QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen cat.nr. 27106)
  • U6-sequencingprimer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' (IDT of andere DNA-provider)
  • Microcentrifugebuisjes van 1,5 ml
  • Warmte blok
  • DNA NanoDrop-spectrofotometer of equivalent
  • Dunwandige PCR-buisjes van 0,2 ml
  • Thermocycler
  • Invriesbuisjes van 1,5 ml
  • Aanvullende reagentia en apparatuur voor agarosegelelektroforese (Current Protocols-artikel: Voytas, 2001)
  • 8 µg gRNA-ruggengraat
  • 2 µl BsmBI-enzym
  • 5 µl NEB-buffer 3.1
  • Nuclease-vrij ddH2O tot 50 µl definitief.

2. Voeg na 3 uur digereren 1 µl 10.000 E/ml CIP-voorraadoplossing toe aan elke reactie en incubeer nog 1 uur bij 37°C.

3. Voer het digestiemengsel uit op een 1% agarosegel. Er moeten twee banden in acht worden genomen (banden rond 11 en 2 kb voor de alles-in-één vector en banden rond 7,5 en 2 kb voor de vectorruggengraat van het twee-plasmidesysteem). Gebruik de NucleoSpin® Gel en PCR Clean-up Kit om de grotere band uit te snijden en te verwijderen. Bepaal de DNA-concentratie van de geëxtraheerde vector met behulp van een NanoDrop-spectrofotometer en bewaar de gelineariseerde vector bij -20 ° C.

  • 1 µl voorwaartse oligo (100 µM)
  • 1 µl omgekeerde oligo (100 µM)
  • 1 µl 10× T4-ligasebuffer
  • 6,5 µl nucleasevrije ddH2O
  • 0,5 µl T4 PNK-enzym.

5. Plaats de reageerbuis in een thermocycler en voer het volgende programma uit:

30 minuten 37°C
5 minuten 95 °C
5 minuten 90°C
5 euro 80°C (aanloop 0,1°C/s)
30 euro 70°C (aanloop 0,1°C/s)
30 euro 60°C (aanloop 0,1°C/s)
1 minuut 50°C (aanloop 0,1°C/s)
2 minuten 40°C (aanloop 0,1°C/s)
2 minuten 30°C (aanloop 0,1°C/s)
Houd bij 4°C.

6. Nadat het PCR-programma is voltooid, verdun je de reactie 1:200 met nuclease-vrij ddH2O en bewaar bij -20 ° C.

  • X µl (25 ng) verteerde vector uit stap 3
  • Y µl ddH2O tot 10 µl totaal volume
  • 1 µl gefosforyleerde en gegloeide oligoduplex uit stap 6
  • 1 µl 10× T4-ligasebuffer
  • 1 µl T4-ligase.

8. Om de sgRNA-vectoren om te zetten in Stbl3 E coli cellen, voeg 5 µl van de ligatiereactie van stap 7 toe aan 50 µl Stbl3-cellen. Laat het mengsel 5 minuten op ijs rusten.

9. Plaat geschikte verdunningen van de Stbl3 E coli cellen op LB + 100 µg/ml ampicillineplaten en laat een nacht groeien bij 37°C.

10. Kies drie tot vijf kolonies per gRNA en laat een nacht bij 37°C groeien in 3 ml LB + 100 µg/ml ampicillinemedium.

11. Maak na een nacht groei 1 ml glycerolvoorraden van elk van de kolonies door de LB-kweek 1:1 te mengen met 50% glycerol en te bewaren bij -80°C.

12. Om de sequentie van het sgRNA-plasmide te verifiëren, genereert u een glycerolvoorraad (zie Support Protocol 1, stap 3), zuivert u de vectoren van de bacteriën in de vloeibare kweek met behulp van de QIAprep Spin Miniprep Kit en sequent u de plasmiden met de U6-primer .

De U6-primer zal sequencing initiëren in het promotorgebied stroomopwaarts van de locatie waar het sgRNA moet worden ingevoegd.

CRISPR-bezorging

  1. Transfectie van het all-in-one CRISPR-plasmide (Basic Protocol 5)
  2. Transfectie van een gRNA-plasmide in een cellijn die Cas9 tot expressie brengt (cellijngeneratie: basisprotocollen 2 en 3 transfectie: basisprotocol 5)
  3. Transductie van het alles-in-één CRISPR-plasmide (Basic Protocol 2 en 4)
  4. Transductie van een gRNA-plasmide in een cellijn die Cas9 tot expressie brengt (cellijngeneratie: basisprotocollen 2 en 3 transductie: basisprotocol 2 en 4).

Over het algemeen kan tijdelijke expressie van de CRISPR-componenten leiden tot minder off-target effecten, terwijl ook de on-target efficiëntie afneemt. Geschikte strategieën zullen afhangen van de specifieke experimentele doelen van de onderzoekers en het systeem of de systemen waarin ze werken. Hieronder beschrijven we verschillende protocollen voor transfectie en transductie om de CRISPR-plasmiden in de cellen van belang te introduceren.

2: TRANSFECTIE VAN CALCIUMFOSFAAT OM LENTIVIRUS TE PRODUCEREN

Alle lentivirussen die in dit protocol worden gebruikt (virale deeltjes die plasmiden bevatten die Cas9, een gids-RNA of de alles-in-één vector tot expressie brengen) worden gegenereerd in HEK293T-cellen via calciumfosfaattransfectie (Chang, Marran, Valentine, & Hannon, 2013). Dit transfectieprotocol omvat het gebruik van twee virale verpakkingsplasmiden (PsPAX2.0 en VSVG). Als de benadering met twee vectoren wordt gebruikt, moeten voor elke vector afzonderlijke lentivirale pools worden gegenereerd.

Materialen

  • HEK293T-cellen (ATCC CRL-3216)
  • CRISPR-plasmide-DNA ("alles-in-één"-plasmide of gRNA/Cas9-plasmiden van Basisprotocol 1)
  • psPAX2.0-plasmide (Addgene-plasmide nr. 12260)
  • VSVG-plasmide (Addgene-plasmide nr. 12259)
  • 2 M CaCl2
  • Oplossing B (2× HEPES-gebufferde zoutoplossing zie recept).
  • 100 mM chloroquine (Cayman Chemical cat. no. 14194)
  • DMEM medium aangevuld met 10% FBS, 1% Pen/Strep en glutamine (Life Technologies cat. no. 11995-073)
  • 10 cm weefselkweekplaten met voorkeurscultuurmedium voor DMEM/10% FBS met 1% Pen/Strep en glutamine HEK293T-cellen
  • Polystyreenbuizen van 5 ml
  • 0,45 µM-filter

1. Splits vóór transductie HEK293T op een plaat van 10 cm om cellen te verkrijgen die 70-80% confluent zijn op het moment van transfectie.

  1. 20 µg CRISPR-plasmide-DNA
  2. 25 µg psPAX2.0-plasmide
  3. 4 µg VSVG-plasmide
  4. ddH2O zoals vereist voor een totaal volume van 500 µl
  5. 62,5 µl 2 M CaCl2

3. Pipetteer 500 µl oplossing B in een apart buisje.

4. Gebruik een pipet om bellen in oplossing B te blazen terwijl u oplossing A druppelsgewijs aan oplossing B toevoegt.

Bellen helpen de gelijkmatige vorming van neerslagmiddelen, wat een cruciale stap is bij het bepalen van het succes van een transfectie.

5. Incubeer dit mengsel 15 min kamertemperatuur.

6. Voeg tijdens de incubatie 2,5 µl 100 mM chloroquine toe aan de 10 cm plaat met HEK293T-cellen uit stap 1.

7. Nadat de incubatie van 15 minuten is voltooid, voegt u het transfectiemengsel druppelsgewijs toe rond de plaat van 10 cm en plaatst u de plaat vervolgens terug in een weefselkweekincubator bij 37°C.

8. Vervang 8-14 uur na transfectie het medium op de HEK293T-cellen door vers 10% FBS DMEM-medium.

9. Begin 24 uur na transfectie met het verzamelen van virus. Om het virus te oogsten, verzamelt u al het oude medium op de HEK293T-cellen met behulp van een spuit. Scheid celresten van viraal supernatant met behulp van een 0,45-µM filter en bewaar het supernatant bij −80 ° C of voeg het onmiddellijk toe aan een ontvangende cellijn. Doorgaans kan virus drie keer worden verzameld binnen de 24- tot 72-uurs venster na transfectie. Om meerdere oogsten uit te voeren, voegt u een gelijk volume van het medium terug aan de cellen en herhaalt u het verzamelprotocol de volgende dag. Het protocol kan indien nodig ook worden opgeschaald (naar platen van 15 cm) of naar beneden (naar platen met 6 of 12 putjes).

Verschillende van de CRISPR-plasmiden die in dit protocol worden beschreven, bevatten een fluorescerende marker en kunnen gemakkelijk worden getitreerd. Om de virale titer te bepalen, voegt u toenemende hoeveelheden virus toe aan een ontvangende cellijn met behulp van het hieronder vermelde transductieprotocol. Kwantificeer drie dagen na transductie de fractie fluorescerende cellen voor elk volume virus om het aantal infectieuze deeltjes per microliter oplossing te bepalen. Titratie is echter vaak niet nodig, omdat het bovenstaande transfectieprotocol zeer efficiënt is. Als titratie vereist is voor een niet-fluorescerend viraal plasmide, kan in plaats daarvan een qPCR-kit worden gebruikt (Clontech cat. nr. 631235).

3: EEN CAS9-UITDRUKKENDE CELLIJN GENEREREN

Bij gebruik van het twee-vectorsysteem moet eerst een stabiele cellijn worden gegenereerd die Cas9 tot expressie brengt. De cellijn kan vervolgens worden hergebruikt in meerdere knock-out-experimenten. Als alternatief bieden een aantal leveranciers Cas9 tot expressie brengende cellijnen, waarvan sommige induceerbare Cas9-expressie hebben (https://www.genecopoeia.com).

Materialen

  • Cas9 lentivirale supernatant van lentivirus gegenereerd met behulp van het calciumfosfaattransfectieprotocol (Basic Protocol 2)
  • Ontvangende zoogdiercellijn
  • Polybreen (Santa Cruz Biotechnologie cat.nr. sc-134220)
  • Geschikt selectief middel voor het gebruikte plasmide
  • Aanvullende reagentia en apparatuur voor celkweek en trypsinisatie (Current Protocols-artikel: Phelan, 1996)

1. Trypsinize de doelcellen en plaat ze zodat ze ∼50% confluent zijn.

2. Meng supernatant van de lentivirale cultuur in cellen 1: 1: voeg bijvoorbeeld 5 ml virale supernatant toe aan 5 ml celcultuur.

3. Voeg polybreen toe tot 8 µg/ml finale.

4. Verander medium 24 uur na transductie.

5. Selecteer 48 uur na transductie voor Cas9-expressie.

Het Cas9-lentivirale plasmide dat het meest wordt gebruikt in ons laboratorium (Addgene-plasmide nr. 108100) herbergt een puromycine-resistentiemarker, en we selecteren op Cas9 tot expressie brengende cellen met behulp van 1-4 µg/ml puromycine (Thermo Fisher Scientific cat. no. A11138- 03). In sommige cellijnen kan voldoende Cas9-expressie worden gegenereerd door een enkele transductieronde gevolgd door 3-5 dagen selectie. In andere cellijnen (met name die welke virale transgenen tot zwijgen brengen), vereist optimale Cas9-expressie meerdere ronden van lentivirale transductie gevolgd door 1-2 weken van medicijnselectie. Cas9-expressie kan in de populatie worden gecontroleerd met behulp van qPCR, western blot-analyse of door transductie met een gids-RNA met bekende biologische activiteit.

4: GIDS-RNA'S OF ALL-IN-ONE VECTOR TRANSDUCEREN NAAR ONTVANGENDE CELLEN

Guide RNA of all-in-one vectoren kunnen permanent in een ontvangende cellijn worden ingebracht door het hieronder beschreven transductieprotocol.

Materialen

  • Ontvangende zoogdiercellijn (gebruik cellijn van Basisprotocol 3 voor twee-vectorsysteem)
  • Supernatant met lentivirussen die gekloonde gRNA-vector of alles-in-één vector dragen (Basic Protocol 2)
  • Polybreen (Santa Cruz Biotechnologie cat.nr. sc-134220)
  • 6-well kweekplaten
  • Aanvullende reagentia en apparatuur voor celkweek en trypsinisatie (Current Protocols-artikel: Phelan, 1996)

1. Trypsiniseer de doelcellen en plaats ze in platen met 6 putjes zodat ze ∼50% confluent zijn.

Gewoonlijk is het plateren van één putje meer dan het aantal transductiereacties voldoende. De extra put kan worden gebruikt als een niet-getransduceerde controle bij het bewaken van de transductie-efficiëntie.

2. Meng lentiviraal supernatant in kweekmedium in 1:1 (of met behulp van een geschikte hoeveelheid bepaald door titratie).

3. Voeg polybreen toe tot 8 µg/ml finale.

4. Verander medium 24 uur na transductie.

5. Monitor de transductie-efficiëntie op basis van de fluorescerende marker die aanwezig is op de gRNA of alles-in-één vector met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

5: GIDS-RNA'S OF DE ALL-IN-ONE VECTOR TRANSFECTEREN NAAR ONTVANGENDE CELLEN

Gids-RNA's of alles-in-één-vectoren kunnen tijdelijk in een ontvangende cellijn worden geïntroduceerd door middel van verschillende transfectiemethoden. We hebben gevonden dat transfectie-efficiëntie sterk kan variëren voor verschillende methoden met verschillende ontvangende cellijnen. Over het algemeen vinden we dat Lipofectamine 3000 waarschijnlijk de hoogste transfectiesnelheden produceert met de minste hoeveelheid optimalisatie die nodig is. In specifieke omstandigheden kunnen andere reagentia (Lipofectamine 2000, TransIT-LT1, enz.) echter superieure resultaten opleveren. Over het algemeen raden we aan om te beginnen met Lipofectamine 3000 en indien nodig andere reagentia te testen.

Om CRISPR-plasmiden met Lipofectamine 3000 te introduceren, gebruiken we het volgende protocol (enigszins gewijzigd van het protocol van de fabrikant).

Materialen

  • Ontvangende zoogdiercellijn (gebruik de cellijn van Basisprotocol 3 voor het twee-vectorsysteem)
  • Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific cat.nr. L3000001)
  • P3000-reagens (meegeleverd met Lipofectamine 3000)
  • Opti-MEM gereduceerde serummedia (Thermo Fisher Scientific cat. nr. 31985088)
  • Gekloonde gRNA-vector of alles-in-één vector
  • Pen/Streepvrij medium
  • Polystyreenbuizen van 5 ml
  • Celcultuurmaterialen
  • Weefselkweekplaten met 6 putjes
  • Fluorescentie microscoop

1. Plaat de doelcellijn zo dat deze de volgende dag voor 60-80% samenvloeit in een plaat met 6 putjes.

2. Warm transfectiereagentia op tot kamertemperatuur.

3. Voeg 7,5 µl Lipofectamine 3000-reagens toe aan 125 µl Opti-MEM-medium (genaamd “buisje A”).

4. Voeg 5 µg plasmide-DNA (gRNA of all-in-one vector) en 10 µl P3000-reagens toe aan 125 µl medium (genaamd “buisje B”).

5. Meng de inhoud van buis A en buis B en incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.

6. Verander het medium op de ontvangende plaat in Pen/Strep-free medium.

7. Voeg het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de ontvangende cellen.

8. Verander het medium 24 uur na transfectie.

9. Bevestig de transfectie-efficiëntie door de fluorescerende marker onder een fluorescentiemicroscoop te beoordelen. Hoewel hogere transfectie-efficiënties een eenvoudigere knock-outverrijking door FACS mogelijk maken, kunt u zelfs met lage transfectiesnelheden doorgaan met het protocol.

Klonale uitbreiding van knock-outcellijnen

Er kunnen meerdere benaderingen worden gebruikt om potentiële knock-out klonaal afgeleide populaties te isoleren.

6: EENCELL UITBREIDING DOOR VERDUNNING PLATING

Na introductie van de gRNA('s) door transductie of transfectie, moeten afzonderlijke cellen worden geïsoleerd om klonale lijnen te genereren die kunnen worden geverifieerd als volledige knock-outs. Twee veelgebruikte methoden hiervoor zijn verdunningsklonen en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) van afzonderlijke cellen (Alternate Protocol 1). Hoewel beide benaderingen enkelvoudige cel-afgeleide klonen kunnen opleveren, is FACS-sortering vaak effectiever gezien het vermogen om specifiek dubbel-positieve cellen te isoleren. Klonen met verdunning is echter goedkoper en kan minder cellulaire stress veroorzaken dan sorteren.

Materialen

  • Geschikt celkweekmedium
  • Standaard celkweekplaten:
    • 10 cm platen (VWR: cat.nr. 25382-701)
    • Platenbodemplaten met 96 putjes (VWR: cat.nr. 29442-056)
    • Aanvullende reagentia en apparatuur voor celkweek en trypsinisatie (Current Protocols-artikel: Phelan, 1996)

    1. Oogst de getransduceerde cellen door trypsinisatie.

    2. Tel de cellen en verdun tot een concentratie van 20 cellen per 100 µl.

    3. Pipetteer met een meerkanaalspipet 200 µl van de verdunde cellen in de eerste rij van een plaat met 96 putjes.

    4. Pipetteer 100 µl van het geschikte kweekmedium in alle resterende putjes in de plaat.

    5. Neem 100 µl van de eerste rij van de plaat met cellen en meng deze met de 100 µl geschikt medium in de rij eronder. Dit zal resulteren in een tweevoudige verdunning van de celconcentratie voor de tweede rij.

    6. Herhaal dit proces langs de rijen van de plaat, wat resulteert in een reeks van tweevoudige verdunning langs de rijen. Dit zal ertoe leiden dat een deel van de putjes een enkele cel bevat.

    7. Controleer met microscopie op putjes die een enkele cel bevatten die enkel- of dubbel-positief zijn voor de gRNA-marker(s). Dit kan onmiddellijk na verdunning of 12-24 uur later, nadat de cellen zijn neergeslagen, worden gedaan. Omcirkel deze putten.

    8. Putjes met enkele cellen moeten worden uitgebreid: laat de cellen groeien om microkolonies te vormen (∼50-100 cellen). Splits de microkolonie in een nieuw putje van een plaat met 96 putjes. Zodra dat putje in de buurt van samenvloeiing is, splitsen naar een putje van een plaat met 48 putjes. Ga door met het uitbreiden van de lijn totdat een voldoende aantal cellen kan worden geoogst voor de hieronder beschreven validatieassays.

    1: EENCELL ISOLATIE EN UITBREIDING PER FACS

    FACS kan op meerdere manieren worden gebruikt om afzonderlijke cellen te isoleren. Bij gebruik van de twee-gRNA-benadering kan FACS worden gebruikt om cellen te isoleren die beide gRNA's uitdrukken door op beide fluorescerende markers te sorteren. Afhankelijk van uw systeemkeuze en de opstelling in uw FACS-faciliteit, zijn er verschillende benaderingen hiervoor, die hieronder worden vermeld.

    1. Dubbel-positieve enkele cellen kunnen direct door FACS worden gesorteerd en worden uitgeplaat in platen met 96 putjes.

    2. Bulkpopulaties van dubbel-positieve cellen kunnen worden geïsoleerd door FACS en uitgeplaat in platen met 96 putjes door verdunningsplaten, zoals beschreven in Basisprotocol 6.

    1. Plaat 100-200 cellen van het FACS-gesorteerde monster van dubbel-positieve cellen op een plaat van 10 cm.
    2. Gebruik een microscoop om geïsoleerde microkolonies te identificeren die beginnen te groeien.

    Gebruik klooncilinders (Chemglass cat. nr. CLS-1777-02) om de afzonderlijke microkolonies te isoleren en te trypsiniseren, en verplaats ze vervolgens naar een plaat met 96 putjes of 48 putjes voor klonale expansie.

    Klonen kunnen worden uitgebreid door ze op steeds grotere platen te plateren totdat er voldoende cellen zijn om te bevriezen en DNA- en eiwitlysaten te nemen voor knock-outverificatie.

    Validatie van Gene Knockout

    De hoeksteen van elke strategie om te verifiëren dat een van belang zijnd eiwit is geablateerd, is het aantonen van de afwezigheid ervan door Western-blot-analyse.Enkele western-blots kunnen echter misleidend zijn en het karakteriseren van de precieze veranderingen veroorzaakt door CRISPR op DNA-niveau kan aanvullende nuttige informatie opleveren. De opties voor knock-outvalidatie verschillen ook enigszins, afhankelijk van of de benadering met één of twee gidsen werd gebruikt. In het bijzonder, als een gen het doelwit was van twee onafhankelijke gids-RNA's, kan een op PCR gebaseerde screeningstrategie worden toegepast om snel de knock-outstatus van tientallen potentiële klonen te beoordelen. Als alternatief kan de aanwezigheid van indel-mutaties op elke snijplaats worden geverifieerd, hoewel dit een grotere uitdaging wordt als de resulterende mutaties heterozygoot zijn. Geen enkele techniek is perfect, en we raden onderzoekers aan een combinatie van de hieronder beschreven methoden toe te passen om de CRISPR-geïnduceerde laesies te karakteriseren en geldige knock-out-klonen te identificeren. Figuren 2 en 3 tonen representatieve resultaten van verschillende validatie-experimenten om de knock-out van het MELK-kinase uit kankercellijnen te bevestigen (Giuliano, Lin, Smith, Palladino, & Sheltzer, 2018 Lin, Giuliano, Sayles, & Sheltzer, 2017).

    4: GENOMISCH DNA-EXTRACTIE UIT POTENTILE KNOCK-OUTCELLEN

    Om gen-knock-out door PCR (Basic Protocol 7), mutatiesequencing (Basic Protocol 8) of TOPO-klonering (Basic Protocol 9) te bevestigen, moet eerst genomisch DNA worden bereid uit controle- en potentiële knock-outcellijnen.

    Materialen

    • Potentiële knock-outcellen
    • DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen cat.nr. 69506)
    • Celcultuurmaterialen
    • Weefselkweekplaten met 6 putjes
    • Buisjes van 15 ml
    • Microcentrifugebuisje van 1,5 ml
    • NanoDrop-spectrofotometer of equivalent

    1. Plaat ∼ 300.000 cellen in één putje van een plaat met 6 putjes voor elke vermeende knock-outkloon.

    Als het aantal klonen dat moet worden gescreend groot is en het uitplaten van 300.000 cellen per kloon niet optimaal is, kunnen cellen worden uitgeplaat in platen met kleinere putjes en kunnen QuickExtract-kits worden gebruikt in plaats van DNeasy-kits. Voor hoogwaardig genomisch DNA en schone sequencingresultaten in latere stappen raden we echter aan om ∼300.000 cellen te plateren.

    2. Volg de volgende dag het protocol van de fabrikant van de DNeasy Blood & Tissue Kit om het genomische DNA te isoleren.

    3. Kwantificeer de concentratie en zuiverheid van het DNA met een NanoDrop-spectrofotometer. Een DNA-opbrengst van ∼1 µg is ideaal.

    7: GENOMISCH VERWIJDERING EN CUT-SITE PCR

    Om te screenen op genomische knock-outs, ontwerpt u twee sets PCR-primers: een die de vermeende deletie overspant en een die een van beide cut-sites overspant. De primers moeten een sequentie herkennen die ∼100-200 bp van de CRISPR-cut-site verwijderd is, aangezien grotere sequenties moeilijker te amplificeren zijn. Geschikte primers kunnen worden ontworpen met behulp van NIH Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) en besteld bij IDT (https://www.idtdna.com).

    Materialen

    • Genomisch DNA (Ondersteuningsprotocol 4)
    • Inleidingen
    • Taq 2× Master Mix (NEB cat.nr. M0270)
    • Nucleasevrij gedestilleerd, gedeïoniseerd water (ddH2O)
    • Thermocycler
    • Dunwandige PCR-buisjes van 0,2 ml
    • Aanvullende reagentia en apparatuur voor agarosegelelektroforese (Current Protocols-artikel: Voytas, 2001)

    1. Stel voor elk genomisch DNA-monster één reactie in met primers die een enkele knipplaats amplificeren en een andere reactie met primers die de deletie overspannen. Stel als controles een PCR-reactie in met genomisch DNA van een wildtype populatie en een PCR-reactie met genomisch DNA van een gemengde populatie die is getransduceerd/getransfecteerd met de twee gidsen. Volg de instructies van de fabrikant om PCR uit te voeren met de Taq 2× Master Mix.

    2. Nadat de PCR-reacties zijn voltooid, voert u de PCR-producten uit op een 2% agarosegel.

    Als het DNA-gebied tussen de cut-sites zou worden verwijderd, dan zou een PCR-product worden verwacht in de reacties met deletie-primers en niet in de reacties met de cut-site-primers. De aanwezigheid van een reactieproduct in de primerbaan op de cut-site geeft aan dat niet alle kopieën van het tussenliggende genetische materiaal zijn uitgesneden.

    8: KARAKTERISERING VAN CRISPR-GENDUCEERDE MUTATIES DOOR SEQUENTIE

    Als de onderzoeker kiest voor de single-guide knockout-benadering, dan is het aantonen van de aanwezigheid van een indel-mutatie op de RNA-cut-site van de gids een sterk bewijs dat het beoogde gen is uitgeschakeld. (Merk op dat deze aanpak ook geschikt is als twee gRNA's worden gebruikt maar er geen volledige deleties worden gedetecteerd.) Cut-site-analyse kan worden uitgevoerd door PCR-versterking van het gebied waarop het gids-RNA is gericht en vervolgens het amplicon te onderwerpen aan Sanger-sequencing. In het geval dat de laesie heterozygoot blijkt te zijn, kan TOPO-klonering worden toegepast op de sequentie van individuele allelen die in de kloon worden gevonden.

    Voor deze benadering, isoleer eerst genomisch DNA van elke vermeende knock-out kloon en ontwerp PCR-primers om een ​​gebied van ∼200 tot 400 bp rond de snijplaats te versterken, zoals hierboven beschreven. Voer vervolgens PCR uit en volg de volgorde van het amplicon:

    Materialen

    • Genomisch DNA (Ondersteuningsprotocol 4)
    • Inleidingen
    • 2× Taq Master Mix (NEB cat.nr. M0270)
    • NucleoSpin® Gel en PCR Clean-up (Macherey-Nagel cat. no. 740609.50)
    • Nucleasevrij water
    • Apparatuur voor gelelektroforese
    • Thermocycler
    • Dunwandige PCR-buisjes van 0,2 ml
    • Microcentrifugebuisje van 1,5 ml
    • Aanvullende reagentia en apparatuur voor agarosegelelektroforese (Current Protocols-artikel: Voytas, 2001)

    1. Om een ​​PCR-reactie in te stellen, volgt u het protocol van de fabrikant voor PCR-richtlijnen en thermocycler-instellingen voor de 2× Taq-mastermix. Stel als controle een PCR-reactie in met behulp van het genomische DNA van een wildtype populatie.

    2. Voer het PCR-product uit op een gel van 2%. Controleer of er een band van de juiste maat aanwezig is.

    3. Isoleer de PCR-fragmenten uit het mengsel met behulp van de NucleoSpin®-gel en PCR-opruiming.

    4. Stel Sanger-sequencingreacties in volgens de richtlijnen van de sequencing-faciliteit. De voorwaartse en achterwaartse primers die voor PCR worden gebruikt, kunnen ook worden toegepast voor sequencing.

    5. Vergelijk sequenties tussen de wild-type populatie en elke kloon met behulp van standaard chromatogramanalysesoftware. Indels moet worden waargenomen op of nabij de nuclease-gerichte site.

    9: HETEROZYGOUS MUTATIES KENMERKEN DOOR TOPO-KLONING EN SEQUENTIE

    Als Sanger-sequencing onthult dat de door CRISPR geïnduceerde laesie heterozygoot is (zoals blijkt uit de aanwezigheid van overlappende basen in het chromatogram Figuur 3C), kunnen de allelen worden gedeconvolueerd door TOPO-klonering en sequencing. Eerst worden de individuele allelen gekloond in de TOPO-vector en omgezet in E coli. Vervolgens worden enkele kolonies uitgekozen en worden de plasmiden opnieuw geïsoleerd door miniprep en vervolgens afzonderlijk gesequenced. Op deze manier kunnen onderzoekers de aanwezigheid van indel-mutaties in elk allel in een gerichte cellijn bevestigen.

    Merk op dat de Taq-polymerase die in dit protocol voor PCR wordt gebruikt, een adenine-overhang achterlaat aan het 3'-uiteinde van het PCR-product. Als gevolg hiervan moet de TOPO TA-kit (Thermo Fisher Scientific cat. nr. 450071), waarin de vector een T-overhang bevat, worden gebruikt voor TOPO-klonering van deze amplicons. Als voor PCR een ander polymerase met proefleesactiviteit wordt gebruikt, moet in plaats daarvan de TOPO-kit met stompe uiteinden (cat.nr. 450159) worden gebruikt.

    Materialen

    • PCR-producten van cut-site PCR-reacties (Basic Protocol 8)
    • TOPO™ TA Cloning™ Kit voor Sequencing, zonder competente cellen (cat.nr. 450071)
    • Bevoegde Stbl3 E coli cellen (Ondersteuningsprotocol 2)
    • Nucleasevrij water
    • LB + 50 µg/ml kanamycinekweekplaten
    • LB + 50 µg/ml kanamycine medium
    • QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen cat.nr. 27106)
    • Dunwandige PCR-buisjes van 0,2 ml
    • Thermocycler

    1. Ligeer de producten van cut-site PCR in TOPO-plasmiden volgens de richtlijnen van de fabrikant.

    2. Voeg 2-3 µl van het ligatieproduct toe aan een hoeveelheid Stbl3 E coli cellen. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten op ijs en plaats vervolgens de E coli cellen op LB + kanamycine platen. Laat de platen 's nachts groeien bij 37 ° C.

    3. Pluk de volgende dag 15 kolonies van de platen en kweek ze elk in 2 ml LB + kanamycinemedium.

    4. Isoleer de plasmiden van de E coli cellen met behulp van de QIAprep Spin Miniprep Kit.

    5. Stel Sanger-sequencingreacties in volgens de richtlijnen van de sequencing-faciliteit. De forward primer of M13 forward primer uit de TOPO-kloneringskit kan worden gebruikt om de plasmiden te sequensen. Zet ook een sequencing-reactie op met behulp van het PCR-product uit de wildtype-populatie.

    6. Analyseer de resulterende allelen met behulp van standaard chromatogramanalysesoftware. Indels moet worden waargenomen op of nabij de nuclease-gerichte plaats.


    RESULTATEN EN DISCUSSIE

    Het type I-D CRISPR-Cas-systeem is samengesteld uit Cas-effectoreiwitten met een nucleasemodule

    Componenten van Cas-effector-eiwitten en de crRNA-sequentie van Microcystis aeruginosa werden geëvalueerd met behulp van BLAST. De 7,6 kb type I-D CRISPR–Cas locus van M. aeruginosa stam PCC9808 bestaat uit acht cas genen (cas1dcas7d, cas10d) gevolgd door een array van 36 repeat-spacer-eenheden (Figuur 1A en B). Het HD-domein (47) dat functioneert bij DNA-splitsing in CRISPR type I-A, B, C, E en F (13, 21, 26, 48-50) ontbreekt in Cas3d. In plaats daarvan herbergt Cas10d, dat tot het Cas10-superfamilie-eiwit behoort, een HD-achtig nucleasedomein in zijn N-terminale gebied (Figuur 1C en Aanvullende Figuur S1). Cas10 - een kenmerkend eiwit van CRISPR type III-systemen ( 51, 52) - functioneert bij DNA- en RNA-afbraak (53-55). Onlangs stelde een evolutionair model van CRISPR-systemen voor dat de oorsprong van cas10 is als een voorouderlijke factor in het prokaryotische immuunsysteem (52). In dit model is de voorouderlijke cas10 genlocus is geëvolueerd tot een voorouderlijk Klasse1-systeem, waarbij dit voorouderlijke Klasse1-systeem verder is onderverdeeld in type I- en type III-systemen. Gedurende deze periode, oprichting van cas3 en verlies van cas10 opgetreden in het typische type I-systeem ( 52). Daarom is CRISPR type I-D een uniek systeem dat zowel type I- als type III-signatuurgenen bezit, hoewel dit subtype werd toegewezen als type I.

    DNA-splitsingsactiviteit van CRISPR type I-D. (EEN) CRISPR type ID-structuur. Boven: CRISPR type I-D locus in Microcystis aerginosa. Onder (links): schematische organisatie van type I-D CRISPR-Cas-subeenheden en volwassen crRNA (zwarte lijn), Onder (rechterkant): schematische organisatie van type I-E CRISPR-Cas-subeenheden en volwassen crRNA (zwarte lijn). PAM voor type I-D of type I-E wordt aangegeven als een rood vak. (B) Structuur van pre-mature en volwassen crRNA's inclusief repeat en spacer. Boven: pre-mature crRNA-sequentie. Onder: voorspelde rijpe crRNA-sequentie. De potentiële stamlussequentie die door Cas6d wordt herkend, werd onderstreept. (C) Uitlijning van de aminozuursequentie van het HD-domein in Cas3 en Cas10d. Meerdere uitlijningen werden gegenereerd door ClustalX met behulp van de Cas3 HD-domeinen van verschillende bacteriën en een Cas10d HD-domein van M. aeruginosa. Aminozuren werden gekleurd als standaard kleurinstelling van het CLUSTAL-programma als blauw: hydrofobe aminozuren (A, I, L, M, F, W, V, C) rood: positief geladen aminozuren (K, R) magenta: negatief geladen aminozuren (E, D) groen: polaire aminozuren (N, Q, S, T) oranje: glycine geel: proline cyaan: aromatische aminozuren (H, Y). Sterretjes geven aminozuren aan die in alle eiwitsequenties worden aangetroffen. De meervoudige uitlijning van volledige Cas10d-eiwitsequenties wordt getoond in aanvullende figuur S1. (D-F) Detectie van ssDNA-nuclease-activiteit door in vitro test. M13mp18 enkelstrengs DNA werd als substraat gebruikt. (NS) Tijdsverloopstudie van ssDNA-nuclease-activiteit van Cas10d. Ctrl: controlereactie zonder Cas-eiwitten, Cas10d: reactie met Cas10d-eiwit, Cas3d: reactie met Cas3d-eiwit, rode pijlen onverteerd DNA. (E) Afhankelijkheid van ssDNA-nuclease-activiteit van Cas10d-concentraties. (F) Effect van indicaties op Cas10d ssDNA-nuclease-activiteit. ssDNA-nucleasetest werd uitgevoerd met 25 mM EDTA of verschillende concentraties van indicaties (Mg2+, Ni2+, Co2+). (G) Detectie van dsDNA-nuclease-activiteit door in vitro assay gelineariseerd DNA werd als substraat gebruikt. Ctrl: controlereactie zonder Cas-eiwitten, Cas10d: reactie met Cas10d-eiwit, Cas3d: reactie met Cas3d-eiwit, rode pijlen onverteerd DNA.

    DNA-splitsingsactiviteit van CRISPR type I-D. (EEN) CRISPR type ID-structuur. Boven: CRISPR type I-D locus in Microcystis aerginosa. Onder (links): schematische organisatie van type I-D CRISPR-Cas-subeenheden en volwassen crRNA (zwarte lijn), Onder (rechterkant): schematische organisatie van type I-E CRISPR-Cas-subeenheden en volwassen crRNA (zwarte lijn). PAM voor type I-D of type I-E wordt aangegeven als een rood vak. (B) Structuur van pre-mature en volwassen crRNA's inclusief repeat en spacer. Boven: pre-mature crRNA-sequentie. Onder: voorspelde rijpe crRNA-sequentie. De potentiële stamlussequentie die door Cas6d wordt herkend, werd onderstreept. (C) Uitlijning van de aminozuursequentie van het HD-domein in Cas3 en Cas10d. Meerdere uitlijningen werden gegenereerd door ClustalX met behulp van de Cas3 HD-domeinen van verschillende bacteriën en een Cas10d HD-domein van M. aeruginosa. Aminozuren werden gekleurd als standaard kleurinstelling van het CLUSTAL-programma als blauw: hydrofobe aminozuren (A, I, L, M, F, W, V, C) rood: positief geladen aminozuren (K, R) magenta: negatief geladen aminozuren (E, D) groen: polaire aminozuren (N, Q, S, T) oranje: glycine geel: proline cyaan: aromatische aminozuren (H, Y). Sterretjes geven aminozuren aan die in alle eiwitsequenties worden aangetroffen. De meervoudige uitlijning van volledige Cas10d-eiwitsequenties wordt getoond in aanvullende figuur S1. (D-F) Detectie van ssDNA-nuclease-activiteit door in vitro test. M13mp18 enkelstrengs DNA werd als substraat gebruikt. (NS) Tijdsverloopstudie van ssDNA-nuclease-activiteit van Cas10d. Ctrl: controlereactie zonder Cas-eiwitten, Cas10d: reactie met Cas10d-eiwit, Cas3d: reactie met Cas3d-eiwit, rode pijlen onverteerd DNA. (E) Afhankelijkheid van ssDNA-nuclease-activiteit van Cas10d-concentraties. (F) Effect van indicaties op Cas10d ssDNA-nuclease-activiteit. ssDNA-nucleasetest werd uitgevoerd met 25 mM EDTA of verschillende concentraties van indicaties (Mg2+, Ni2+, Co2+). (G) Detectie van dsDNA-nuclease-activiteit door in vitro assay gelineariseerd DNA werd als substraat gebruikt. Ctrl: controlereactie zonder Cas-eiwitten, Cas10d: reactie met Cas10d-eiwit, Cas3d: reactie met Cas3d-eiwit, rode pijlen onverteerd DNA.

    Er is gemeld dat Cas3 zelf het vermogen heeft om enkelstrengs DNA niet-specifiek af te breken (20, 39). Daarom hebben we, om de nucleasefunctie van Cas10d te bevestigen, uitgevoerd: in vitro nuclease-assays. Voor deze test werden Cas10d- en Cas3d-eiwitten eerst tot expressie gebracht en gezuiverd uit menselijke HEK293T-cellen (aanvullende figuur S2A en B) en geïdentificeerd door LC-MS/MS-analyse (aanvullende figuur S2C) voor gebruik in verdere tests. Het Cas10d-eiwit, maar niet het Cas3d-eiwit, was in staat om M13mp18-ssDNA's te splitsen in aanwezigheid van Mg 2+-, Ni 2+- en Co 2+-ionen (Figuur 1D), wat suggereert dat Cas10d werkt als een nuclease in het type I-D-systeem.

    Cas10d-concentratie-afhankelijke nuclease-activiteit werd ook gedetecteerd (Figuur 1E). Reacties zonder metaalionen of met EDTA resulteerden in geen splitsing van ssDNA's, wat een belangrijke rol suggereert van tweewaardige kationen in Cas10d-gemedieerde ssDNA-splitsing (Figuur 1F). Vervolgens onderzochten we het effect van verschillende divalente kationen op de ssDNA-splitsingsactiviteit in het concentratiebereik dat door Mulepati en Bailey werd gebruikt (39) en ontdekten dat de aanwezigheid van Mg2+- of Co2+- of Ni2+-ionen de ssDNA-splitsingsactiviteit van Cas10d (Figuur 1F). Kijkend naar dubbelstrengs DNA (dsDNA) nuclease-activiteit, splitsten noch Cas10d noch Cas3d dsDNA in aanwezigheid van ATP-, Mg2+-, Co2+- en Ni2+-ionen (Figuur 1G). Deze resultaten gaven aan dat Cas10d een nuclease-activiteit heeft die specifiek is voor ssDNA, niet voor dsDNA. Hoewel E coli en Streptococcus thermophilus Van type I-E Cas3-eiwitten is ook gemeld dat ze ssDNA-nuclease-activiteit hebben, de vereisten voor divalente kationen verschilden van die van type I-D Cas10d (EcCas3 Cu 2+ of Ni 2+, StCas3 Mg 2+) (20, 39). Deze verschillen kunnen de activiteit van genoombewerking in menselijke cellen beïnvloeden, afhankelijk van de fysiologische concentratie van elk tweewaardig kation in menselijke kernen. Onze resultaten suggereren dat Cas10d in het type I-D-systeem unieke kenmerken heeft als een nuclease die verschilt van andere bekende Cas3-eiwitten.

    We hebben vervolgens onderzocht of Cas10d-eiwit ATPase-activiteit heeft door Cas10d met ATP te incuberen omdat we ontdekten dat Cas10d mogelijke ATP-bindende motieven heeft (aanvullende figuur S1). De hoeveelheid fosfaat die vrijkomt uit de ATP nam toe na incubatie met Cas10d en ook in aanwezigheid van ssDNA, maar niet van dsDNA (Figuur 2A), wat aangeeft dat Cas10d een ssDNA-gestimuleerde ATPase-activiteit heeft. Een tijdsverloopstudie gaf aan dat het vrijgemaakte fosfaat zich ophoopte met de reactietijd in aanwezigheid van Cas10d (Figuur 2B). De reactiesnelheid werd berekend op basis van de helling van de geschatte rechte lijn, resulterend in 1,22 min –1 bij 2 mM ATP, wat lager was dan de reactiesnelheid van StCas3 (38 min –1 bij 0,5 mM ATP) (20) , wat suggereert dat de ATPase-activiteit van Cas10d zwakker is dan die van StCas3. Omdat Cas3d-eiwit ATP-bindende domeinmotieven bevat, hebben we onderzocht of Cas3d ook ATPase-activiteit heeft. De resultaten gaven aan dat Cas3d-eiwit zwakke ATPase-activiteit vertoont (Figuur 2A). De resultaten gecombineerd met onze eerdere studie (37) suggereren dat zowel Cas10d als Cas3d samenwerken voor doel-DNA-splitsing in het type I-D-systeem.

    ATPase- en helicase-activiteit van Cas10d en Cas3d. (EEN) Afhankelijkheid van ATPase-activiteit van Cas10d (links) en Cas3d (rechts) op de concentratie van ssDNA of dsDNA. Verschillende hoeveelheden ssDNA (M13mp18) of dsDNA (pNEB193) werden gemengd met 700 nM Cas10d in aanwezigheid van Co 2+, Ni 2+ en ATP, en reageerden gedurende 2 uur bij 37 °C alvorens het vrijgekomen fosfaat te meten ATP. Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). (B) Tijdsverloopstudie van ATPase-activiteit van Cas10d. De reactie werd uitgevoerd met 700 nM Cas10d en 3 nM ssDNA bij 37 ° C in dezelfde buffer die werd gebruikt in (A). De reactiesnelheid berekend uit de helling van het tijdsverloop is 1,22 min –1. De experimenten werden drie keer onafhankelijk van elkaar herhaald. Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). (C) Helicase-assay voor Cas3d en Cas10d. Gedeeltelijke duplex-DNA's gelabeld met ATTO532 werden in dit experiment als een dsDNA gebruikt. ATTO532-gelabelde oligo (100 nt) werd gebruikt als een ssDNA. Cas10d of Cas3d of beide werden gedurende 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd met DNA's met of zonder ATP. De producten werden gescheiden door niet-denaturerende gelelektroforese en zichtbaar gemaakt door Typhoon FLA9500 (Cytiva). De experimenten werden drie keer onafhankelijk van elkaar herhaald.

    ATPase- en helicase-activiteit van Cas10d en Cas3d. (EEN) Afhankelijkheid van ATPase-activiteit van Cas10d (links) en Cas3d (rechts) op concentratie van ssDNA of dsDNA.Verschillende hoeveelheden ssDNA (M13mp18) of dsDNA (pNEB193) werden gemengd met 700 nM Cas10d in aanwezigheid van Co 2+, Ni 2+ en ATP, en reageerden gedurende 2 uur bij 37 °C alvorens het vrijgekomen fosfaat te meten ATP. Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). (B) Tijdsverloopstudie van ATPase-activiteit van Cas10d. De reactie werd uitgevoerd met 700 nM Cas10d en 3 nM ssDNA bij 37 ° C in dezelfde buffer die werd gebruikt in (A). De reactiesnelheid berekend uit de helling van het tijdsverloop is 1,22 min –1. De experimenten werden drie keer onafhankelijk van elkaar herhaald. Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). (C) Helicase-assay voor Cas3d en Cas10d. Gedeeltelijke duplex-DNA's gelabeld met ATTO532 werden in dit experiment als een dsDNA gebruikt. ATTO532-gelabelde oligo (100 nt) werd gebruikt als een ssDNA. Cas10d of Cas3d of beide werden gedurende 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd met DNA's met of zonder ATP. De producten werden gescheiden door niet-denaturerende gelelektroforese en zichtbaar gemaakt door Typhoon FLA9500 (Cytiva). De experimenten werden drie keer onafhankelijk van elkaar herhaald.

    Om te testen of het Cas10-eiwit helicase-activiteit heeft, hebben we de helicase-assay uitgevoerd met gedeeltelijk duplex-DNA als substraat. De reactie werd uitgevoerd in dezelfde buffer die werd gebruikt in de StCas3-helicase-assay die is gerapporteerd in Sinkunas et al. (20) DNA-strengscheiding door Cas10d-helicase-activiteit werd echter niet gedetecteerd (Figuur 2C). Het Cas3d-eiwit en de combinatie van Cas10d en Cas3d werden ook onderzocht op helicase-activiteit, maar er werd geen helicase-activiteit gedetecteerd, ongeacht de aanwezigheid of afwezigheid van ATP (Figuur 2C). Deze resultaten suggereren dat Cas10d en Cas3d in het type ID-systeem onder deze omstandigheden geen helicase-activiteit hebben.

    De bovenstaande resultaten suggereren unieke kenmerken van Cas10d in het type I-D-systeem bij DNA-splitsing in vergelijking met andere type I-subtypen. De typische cas8 gen - de gemeenschappelijke effector in CRISPR type I-A, B, C, E en F (36, 51, 52) - ontbreekt in de CRISPR-Cas type I-D locus van M. aeruginosa, ook het voorspellen van verschillende mechanismen van Cascade-complexstabiliteit en DNA-splitsingsactiviteit van type I-D in cellen in vergelijking met andere type I-subtypen (Figuur 1A).

    Type I-D CRISPR–Cas is biologisch actief in menselijke cellen als hulpmiddel voor het bewerken van het genoom

    Om eiwitexpressie in heterogene gastheercellen en complexe vorming van type I-D Cas-eiwitten te bevestigen, werden Cas-expressievectoren (Figuur 3A en Aanvullende Figuur S4B) voor zoogdiercellen geconstrueerd en getransfecteerd in HEK293T-cellen. Complexe vorming van Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d en Cas10d met crRNA in menselijke cellen werd aangetoond door pull-down-assay (Figuur 3B en Aanvullende Figuur S4A). De resultaten laten ook zien dat de afwezigheid van Cas10d de binding van Cas3d aan het Cascade-complex destabiliseerde. Directe interactie van Cas3d en andere Cas-eiwitten werd ook onderzocht (aanvullende figuren S4 en S5). Cas3d interageerde direct met Cas10d maar niet met andere Cas-eiwitten. De interacties waren onafhankelijk van de expressie van crRNA. De resultaten suggereren dat Cas10d nodig is om Cas3d te rekruteren in het Cascade-complex in het type ID-systeem. In een ander type I-systeem is gemeld dat Cas8 interageert met Cas5 / Cas7 / crRNA en Cas3-eiwit rekruteert in het Cascade-complex. Aan de andere kant bevat het type I-D-systeem geen cas8. Onze resultaten suggereren dat Cas10d een vergelijkbare rol speelt als Cas8 in het type ID-systeem, d.w.z. rekrutering van Cas3d-eiwit en vorming van Cascade-complex.

    Co-immunoprecipitatietest van type I-D Cas-eiwitten. (EEN) Schematische illustratie van vectoren die worden gebruikt voor de expressie van elk Cas-eiwit. De vijf soorten vectoren (Flag-NLS-Cas7d, Myc-bpNLS-Cas5d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-Cas6d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-Cas3d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-Cas10d-bpNLS- 6xHis) en gRNA (niet-doelwit-gRNA of AAVS 70-107, aanvullende tabel S2) werden getransfecteerd in menselijke HEK293T-cellen. (B) Co-immunoprecipitatie-assay met behulp van cellysaten werd uitgevoerd met de in de figuren beschreven antilichamen. Experimenten werden drie keer onafhankelijk van elkaar herhaald. L, lysaat van niet-getransfecteerd monster, NC, vijf soorten vectoren werden geïntroduceerd zonder gRNA, NT, vijf soorten vectoren werden geïntroduceerd met niet-doelwit-gRNA. AAVS70-07 vijf soorten vectoren werden geïntroduceerd met AAVS GTC70-107 gRNA.

    Co-immunoprecipitatietest van type I-D Cas-eiwitten. (EEN) Schematische illustratie van vectoren die worden gebruikt voor de expressie van elk Cas-eiwit. De vijf soorten vectoren (Flag-NLS-Cas7d, Myc-bpNLS-Cas5d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-Cas6d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-Cas3d-bpNLS-6xHis, Myc-bpNLS-Cas10d-bpNLS- 6xHis) en gRNA (niet-doelwit-gRNA of AAVS 70-107, aanvullende tabel S2) werden getransfecteerd in menselijke HEK293T-cellen. (B) Co-immunoprecipitatie-assay met behulp van cellysaten werd uitgevoerd met de in de figuren beschreven antilichamen. Experimenten werden drie keer onafhankelijk herhaald. L, lysaat van niet-getransfecteerd monster, NC, vijf soorten vectoren werden geïntroduceerd zonder gRNA, NT, vijf soorten vectoren werden geïntroduceerd met niet-doelwit-gRNA. AAVS70-07 vijf soorten vectoren werden geïntroduceerd met AAVS GTC70-107 gRNA.

    Genoombewerkingsactiviteit van het type I-D CRISPR-Cas-complex werd vervolgens geëvalueerd met behulp van het luciferase enkelstrengs annealing (SSA) recombinatiesysteem met behulp van NanoLuc-luciferase (56). We ontwikkelden een NanoLUxxUC-systeem van het gesplitste type dat uit twee vectoren bestaat: pCAG-nLuxxUC_Block1 en pCAG-nLUxxUC Block2 (aanvullende figuren S10 en S13). Elke vector bevat een deel van de NanoLuc genen die een homologe arm van 300 bp bevatten en de menselijke AAVS1 of EMX1 genfragmenten die de type I-D-doelplaats bevatten die respectievelijk volgt of gevolgd wordt door de homologe arm (aanvullende figuur S13 doel-DNA-fragmenten vermeld in aanvullende tabel S3). In dit systeem kunnen DSB's op doelwitplaatsen die door het type I-D-systeem worden geïnduceerd, worden gerepareerd via homologie-afhankelijke reparatie (HDR) of de enkelstrengige annealing (SSA) -route, die recombinatie tussen homologie-armen induceert. Deze recombinatie herstelt een functionele NanoLuc gen, wat resulteert in de emissie van luminescentie. We vergeleken de Nanoluc/Fluc-verhouding van het geteste crRNA met die van niet-doelwit crRNA en evalueerden de activiteit van genoombewerking. Een schematische illustratie van het crRNA-selectieproces wordt getoond in aanvullende figuur S10.

    Er is gemeld dat de sequentie 5′-GTT-3′ wordt gebruikt voor CRISPR type I-D PAM in Synechocystis sp. PCC6803 ( 32). Wij traden op E coli negatieve screening met behulp van een PAM-bibliotheek met de ccdB expressiesysteem, en identificeerde dat het type I-D van M. aeruginosa alleen herkend 5′-GTH-3′ (H = A, C of T) PAM in E coli cellen (37). We onderzochten vervolgens of GTT actief is als de PAM in zoogdiercellen en analyseerden ook de activiteit van GTC- en GTA PAM's (Figuur 4A, crRNA's van aanvullende tabel S6 vermeld in aanvullende tabellen S2 en S6). De type I-D crRNA's werden gescreend door luc reporter assay, waarin HEK293T-cellen gelijktijdig met type I-D werden getransfecteerd cas genen en crRNA en activiteiten gedetecteerd 48 uur na transfectie (Figuur 4A en aanvullende tabel S6). De gegevens gaven aan dat expressie van type I-D Cas-eiwitten leidde tot een opmerkelijk hogere genoombewerkingsactiviteit, en dat type I-D CRISPR-Cas de voorkeur geeft aan GTT en GTC PAM boven GTA PAM in zoogdiercellen.

    Detectie van type I-D CRISPR-Cas-gemedieerde genoombewerking door luc reporter-assay. (EEN) De Cas-expressievectoren en luc-reportervectoren die de doelsequentie herbergen, werden getransfecteerd in HEK293T-cellen en een endonuclease-splitsingsassay produceerde luminescentie. De grafieken tonen de selectie van gRNA's voor: AAVS en hEMX1 genen in het type I-D-systeem met behulp van de luc-reportertest. Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). *P < 0,05, **P < 0,01 en ***P < 0.005 wordt bepaald door Student's t testen. (B) Effect op het HD-domein van Cas10d. De luc-reportertest werd uitgevoerd met behulp van de AAVS GTC_70–107 (+), AAVS GTC_159-196 (+), en niet-doelwit-gRNA's. Witte balken: luc-reportertest van het type I-D-systeem met het wildtype Cas10d, zwarte balken: luc-reportertest van het type I-D-systeem met het HD-gemuteerde dCas10d (H177A). Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). Sterretjes geven statistisch significante verschillen aan bepaald door Student's t testen. *P < 0,05. (Onderste paneel) De expressieniveaus van Cas10 en dCas10d (H177A) gedetecteerd door de antilichamen voor de tags gefuseerd met de N- (Myc) of C- (His) terminus. Voor dit experiment werden pEFs-Myc-bpNLS-Cas10d of dCas10d (H177A)-bpNLS-6xHis en pEFs-SV40NLS HA-Cas3d, Strept-Cas5d, Myc-Cas6d of FLAG-Cas7d gebruikt voor transfectie. (C) Effect van gRNA-vorm op genoombewerkingsactiviteit van het type I-D-systeem. Witte balken: luc-reportertest van het type ID-systeem met crRNA met een repeat-spacer-repeat-structuur (premature crRNA) zwarte balken: luc reporter-assay van het type ID-systeem met crRNA met een spacer-repeat-structuur (mature crRNA) . Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). *P < 0.05 wordt bepaald door Student's t testen.

    Detectie van type I-D CRISPR-Cas-gemedieerde genoombewerking door luc reporter-assay. (EEN) De Cas-expressievectoren en luc-reportervectoren die de doelsequentie herbergen, werden getransfecteerd in HEK293T-cellen en een endonuclease-splitsingsassay produceerde luminescentie. De grafieken tonen de selectie van gRNA's voor: AAVS en hEMX1 genen in het type I-D-systeem met behulp van de luc-reportertest. Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). *P < 0,05, **P < 0,01 en ***P < 0.005 wordt bepaald door Student's t testen. (B) Effect op het HD-domein van Cas10d. De luc-reportertest werd uitgevoerd met behulp van de AAVS GTC_70–107 (+), AAVS GTC_159-196 (+), en niet-doelwit-gRNA's. Witte balken: luc-reportertest van het type I-D-systeem met het wildtype Cas10d, zwarte balken: luc-reportertest van het type I-D-systeem met het HD-gemuteerde dCas10d (H177A). Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). Sterretjes geven statistisch significante verschillen aan bepaald door Student's t testen. *P < 0,05. (Onderste paneel) De expressieniveaus van Cas10 en dCas10d (H177A) gedetecteerd door de antilichamen voor de tags gefuseerd met de N- (Myc) of C- (His) terminus. Voor dit experiment werden pEFs-Myc-bpNLS-Cas10d of dCas10d (H177A)-bpNLS-6xHis en pEFs-SV40NLS HA-Cas3d, Strept-Cas5d, Myc-Cas6d of FLAG-Cas7d gebruikt voor transfectie. (C) Effect van gRNA-vorm op genoombewerkingsactiviteit van het type I-D-systeem. Witte balken: luc-reportertest van het type ID-systeem met crRNA met een repeat-spacer-repeat-structuur (premature crRNA) zwarte balken: luc reporter-assay van het type ID-systeem met crRNA met een spacer-repeat-structuur (mature crRNA) . Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). *P < 0.05 wordt bepaald door Student's t testen.

    Wildtype Cas10d en Cas10d met een mutatie in het HD-achtige domein [Cas10d (H177A)] werden vervolgens getest in de luciferasereportertest met behulp van gRNA's AAVS GTC_70-107(+) en AAVS GTC_159-196(+) (Figuur 4B en aanvullende tabel S2). De resultaten gaven aan dat Cas10d inderdaad een nuclease-activiteit bezit in het ZvH-achtige domein die kan worden gebruikt voor genoombewerking in menselijke cellen. Echter, in vitro ssDNA-nuclease-assay gaf aan dat gezuiverd Cas10d (H177A) nog steeds ssDNA-nuclease-activiteit handhaaft (aanvullende figuur S3). Dit resultaat suggereert dat het H177-residu in Cas10d belangrijk is voor dsDNA-nuclease-activiteit in menselijke cellen, maar niet noodzakelijk voor ssDNA-nuclease-activiteit in vitro. Onlangs heeft Lin et al. (34) hebben ook de effecten gerapporteerd van ZvH-domeinmutaties op de nuclease-activiteit van de Sulfolobus islandicus type ID-systeem in vitro. Ze toonden aan dat het gereconstrueerde type I-D Cas-complex [SiCas5, SiCas7, verwerkt crRNA van S. islandicus en kleine subeenheden (SS), SiCas10 die ZvH-domeinmutaties draagt ​​die zijn gezuiverd uit E coli] slaagde er niet in dsDNA te splitsen, maar kon complementair ssDNA splitsen in vitro. Hoewel het type I-D-systeem van M. aeruginosa en dat van S. islandicus vertoont verschillende kenmerken, bijvoorbeeld, SiCas10/SS alleen bindt niet aan ssDNA, en SiCas7 in een ruggengraatcomplex katalyseert ssDNA-splitsing, Cas10d speelt de belangrijkste rol in de DNA-splitsingsfunctie op het doel-DNA. Verdere studies zullen nodig zijn om de mechanismen van DNA-splitsing door type I-D-systemen in meer detail te begrijpen.

    Cas6 staat bekend als een endoribonuclease en splitst herhaalde sequenties van het pre-mature crRNA op specifieke posities die het van herhaling afgeleide 3'-handvat van het volwassen crRNA vasthouden (5-7, 32). In type I-E was verwerking van de crRNA-sequentie door Cas6e vereist voor genoombewerkingsactiviteit in cellen (24). Daarentegen heeft het verwerkte rijpe crRNA in type I-B activiteit in cellen (57). Om te testen of het verwerkte crRNA in type I-D-systeem genoombewerkingsactiviteit heeft, hebben we de luc-reportertest uitgevoerd met behulp van pre-mature crRNA en de voorspelde volwassen crRNA-sequenties (Figuur 4C). We voorspelden volwassen crRNA-sequenties op basis van Shao et al. (6) en de stabiliteit van de secundaire structuur werd geanalyseerd met behulp van de RNAfold-webserver. De meest stabiele structuur werd voorspeld als een volwassen crRNA. De luc-reportertest gaf aan dat genoombewerkingsactiviteit van type I-D de expressie van pre-mature crRNA vereiste in plaats van verwerkt volwassen crRNA (Figuur 4C). Verwerking van pre-crRNA in zijn volwassen vorm kan belangrijk zijn voor de crRNA-interactie met Cascade en functionele genoombewerkingsactiviteit van type I-D in cellen, zoals in het type I-E-systeem.

    We evalueerden ook het effect van mutaties in de ATP-bindende domeinmotieven van Cas3d en Cas10d op genoombewerkingsactiviteit met behulp van de luc-reportertest. De mutaties schaften de genoombewerkingsactiviteit van het type I-D-systeem af (aanvullende figuur S6). Deze resultaten geven aan dat ATPase-activiteit van zowel Cas3d- als Cas10d-eiwitten nodig zijn voor genoombewerking in menselijke cellen. Deze resultaten suggereren ook dat het type I-D-systeem een ​​uniek mechanisme heeft in vergelijking met andere bekende CRISPR-Cas-systemen waarin alleen Cas3-eiwit ATPase-activiteit heeft. Cas3d- en Cas10d-mutante eiwitten vormden het complex met andere Cas-eiwitten (aanvullende figuur S7), wat aangeeft dat de afgeschafte genoombewerkingsactiviteit niet te wijten was aan het falen van complexvorming.

    We evalueerden ook de effecten van de positie en het aantal nucleaire lokalisatiesignalen (NLS) met behulp van twee soorten NLS: monopartite-NLS (SV40NLS) en bipartite-NLS (bpNLS). bpNLS functioneerde even effectief aan zowel de N-terminus als C-terminus van Cas3d, Cas5d, Cas6d en Cas10d als SV40NLS deed aan de N-terminus (aanvullende figuur S8A-C). Integendeel, bpNLS-6xHis gehecht aan het C-uiteinde van Cas7d verstoorde de genoombewerkingsactiviteit van type I-D (aanvullende figuur S9), hoewel het sterk tot expressie werd gebracht in de kern (aanvullende figuur S8C). We veronderstelden dat de functie van Cas7d werd beïnvloed door 6xHis te fuseren. Om deze hypothese te testen, hebben we de luc-reporter-assay uitgevoerd met Cas7d gefuseerd met 6xHis aan N-terminus of C-terminus. Het resultaat gaf aan dat de genoombewerkingsactiviteit van type I-D was afgenomen toen Cas7d fuseerde met 6xHis-tag (aanvullende figuur S9). Positief geladen 6xHis kan de Cas7d-functie van RNA-binding of Cascade-vorming beïnvloeden.

    Effect van aantal en posities van mismatches tussen spacers en doel-DNA, en de Cas7d-mutaties op genoombewerkingsactiviteit van type I-D

    Vervolgens hebben we het mismatch-effect van spacer-sequentie op genoombewerkingsactiviteit onderzocht met behulp van de luc-reportertest (Figuur 5 en Aanvullende Figuur S11). De 23 nucleotiden net naast de PAM, met uitzondering van de nucleotiden op 1-, 6-, 12- en 18-nt stroomafwaarts van PAM, werden geïdentificeerd als belangrijk voor genoombewerkingsactiviteit, maar een enkele mismatch op 24-, 25- , 30- of 35-nt vertoonden geen effect op de bewerkingsactiviteit van het genoom (Figuur 5A en B). Eerdere studies hebben aangetoond dat elke 6e nucleotide van de protospacer niet betrokken is bij basenparing met de doel-DNA-streng in het Cascade-complex in het type IE-systeem (17, 58), omdat elke 6e nucleotide bindt met het duimdomein van Cas7-subeenheden in het Cascade-complex (18, 59-61). Het voor de hand liggende verschil tussen type ID en type IE was het effect van een mismatch bij 1-nt, waarbij de DNA-splitsingsactiviteit in het type IE-systeem duidelijk verminderd is (24), wat suggereert dat de modus en/of positie van RNA-Cas7-binding kan verschillen tussen de twee systemen. In het type I-E-systeem functioneren de grote subeenheid Cas8 (Cse1 in het type I-E) en twee kleine Cas11-subeenheden om de gehele R-lus te stabiliseren (14). Het structurele verschil in Cascade tussen type I-D en type I-E kan het mismatch-effect van elk systeem beïnvloeden. We analyseerden verder het effect van mismatch-nummer en positie in de gRNA-sequentie. Introductie van twee mismatches binnen het gebied dat wordt bestreken door nucleotiden 1-28 verminderde duidelijk de activiteit van genoombewerking, behalve de combinatie van mismatches op positie 24-nt en 25-nt, maar binnen nucleotideposities 29-nt tot 35-nt hadden twee mismatches minder van een reducerend effect op genoombewerkingsactiviteit (Figuur 5C). Aan de andere kant heeft de introductie van drie mismatches de activiteit van het bewerken van het genoom volledig afgeschaft (Figuur 5D). Deze bevindingen benadrukken belangrijke aspecten van de specifieke interactie tussen protospacer en doel-DNA's, en het daaropvolgende DNA-splitsingsmechanisme van het type I-D CRISPR-Cas-systeem.

    Detectie van off-target effecten van type I-D CRISPR-Cas-gemedieerde genoombewerking. (EEN) Schematische illustratie van gRNA en doel-DNA heteroduplex. (B–D) Evaluatie van off-target effecten in het type I-D gRNA. De kritische nucleotiden in AAVS GTC_70-107(+) gRNA-sequentie voor genoombewerkingsactiviteit van type I-D-systeem werd geëvalueerd met behulp van de luc-reportertest in menselijke HEK293T-cellen. De gRNA's zijn ontworpen om een ​​enkele mismatch te bevatten (B) of twee (C) of drie (NS) mismatch nucleotiden. De nucleotiden die zijn aangegeven met blauwe pijlen in (A), de nucleotiden op 6-, 12-, 18- en 24-nt-posities, hebben een zwakke invloed op de genoombewerkingsactiviteit van type I-D. Het eerste nucleotide (rode pijl) direct PAM-aangrenzend heeft ook een zwak effect op de genoombewerkingsactiviteit van het type I-D-systeem. NT: niet-doelwit, PC: positieve controle met niet-gemuteerd gRNA. Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). *P < 0,05, **P < 0,01 en ***P < 0.005 wordt bepaald door Student's t tests en statistisch significante verschillen in vergelijking met NT.

    Detectie van off-target effecten van type I-D CRISPR-Cas-gemedieerde genoombewerking. (EEN) Schematische illustratie van gRNA en doel-DNA heteroduplex. (B–D) Evaluatie van off-target effecten in het type I-D gRNA. De kritische nucleotiden in AAVS GTC_70-107(+) gRNA-sequentie voor genoombewerkingsactiviteit van type I-D-systeem werd geëvalueerd met behulp van de luc-reportertest in menselijke HEK293T-cellen. De gRNA's zijn ontworpen om een ​​enkele mismatch te bevatten (B) of twee (C) of drie (NS) mismatch nucleotiden. De nucleotiden die zijn aangegeven met blauwe pijlen in (A), de nucleotiden op 6-, 12-, 18- en 24-nt-posities, hebben een zwakke invloed op de genoombewerkingsactiviteit van type I-D. Het eerste nucleotide (rode pijl) direct PAM-aangrenzend heeft ook een zwak effect op de genoombewerkingsactiviteit van het type I-D-systeem. NT: niet-doelwit, PC: positieve controle met niet-gemuteerd gRNA. Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). *P < 0,05, **P < 0,01 en ***P < 0.005 wordt bepaald door Student's t tests en statistisch significante verschillen in vergelijking met NT.

    We hebben ons vervolgens gericht op interacties tussen crRNA, doel-DNA en het type I-D Cas-effectoreiwit, met name het Cas7d-eiwit dat bindt aan crRNA en een spiraalvormige ruggengraat vormt in het Type I-E Cascade-complex (14, 58). MD-simulaties van type I-E Cas7e, type I-F Cas7f en type I-D Cas7d-modellen, waaronder cRNA en DNA, werden voor het eerst uitgevoerd (Figuur 6A-C en aanvullende films S1-S3). Onderzoek van de kristalstructuur samen met biochemische analyses suggereerde dat K45 en R46 in Cas7e en Q326 en K327 in Cas7f belangrijk zijn bij het vormen van het complex met Cascade en het doel-DNA (14, 43). Vergelijking van deze modellen suggereerde dat de drie aminozuurresiduen (K67, R68 en K69) in α-helische regio's zijn belangrijk voor de interactie tussen Cas7d, crRNA en het doel-DNA (Figuur 6A-C). Om de rol van deze aminozuren in complexvorming te evalueren, ontwierpen we 12 soorten mutant Cas7d [Cas7d (K58A), Cas7d (R62A), Cas7d (K67A), Cas7d (R68A), Cas7d (K69A), Cas7d (R75A), Cas7d (E148Q), Cas7d (K67S/R68Q), Cas7d (K67A/R68A), Cas7d (F66K/K67S/R68Q), Cas7d(F66R/K67A/R68M/K69R), Cas7d (K67S/R68Q/K69Q)] (Figuur 6D) en onderzocht vervolgens de effecten van deze mutaties op genoombewerkingsactiviteit van type ID. De luc-reportertest gaf aan dat Cas7d (K58A) geen invloed had op de genoombewerkingsactiviteit, maar andere soorten mutaties schaften de activiteit af, wat suggereert dat deze aminozuurresiduen in Cas7d belangrijk zijn voor genoombewerking met behulp van het type ID CRISPR-Cas-systeem (Figuur 6E en F ). Om het mechanisme te onderzoeken dat ten grondslag ligt aan het verlies van activiteit in Cas7d-mutanten, hebben we co-immunoprecipitatie-assays uitgevoerd met Cas7d-mutanten en andere type I-D CRISPR-Cas-eiwitten met of zonder crRNA. De resultaten gaven aan dat het onderliggende mechanisme van activiteitsverlies verschilde afhankelijk van de gebruikte Cas7d-mutant (aanvullende figuur S12). Cas7d (K67A), Cas7d (E148Q), Cas7d (F66K/K67S/R68Q) hadden geen invloed op de binding van Cas7d aan het complex. Dit suggereert dat het verlies van genome editing-activiteit werd veroorzaakt door andere factoren dan complexe vorming. Aan de andere kant veroorzaakten andere Cas7d-mutanten de afname van Cas7d-eiwit gebonden aan het complex, wat suggereert dat de complexvorming in deze mutanten was aangetast. Xue et al. (62) gaf ook aan dat sommige Cas7d-mutaties het verlies van binding aan dsDNA veroorzaakten in vitro, en dat dit niet te wijten was aan defecten in complexvorming. Verdere studies zullen nodig zijn om de mechanismen die ten grondslag liggen aan het verlies van activiteit in deze Cas7d-mutanten op te helderen.

    Effect van Cas7d-mutaties op type I-D CRISPR-Cas-gemedieerde genoombewerking. (A–C) Momentopname van het MD-simulatietraject van de cascade van Type I-E (EEN), Typ I-F (B), en Type ID (C) systeem. Een ondoorzichtig lint, doorschijnend rood lint met bal-en-stok en doorschijnend blauw lint tonen respectievelijk een van de Cas7e (A), Cas7f (B) of Cas7d (C) moleculen, crRNA en DNA. De bal-en-stok geeft de crRNA-ruggengraat aan. De essentiële residuen die interageren met crRNA, d.w.z. K45, R46 en R49 van Cas7e (A), Q326 en K327 van Cas7f (B), en K67, R68 en K69 van Cas7d (C), worden weergegeven door ruimtevullende modellen. (D) Cas7d-aminozuursequenties en de mutaties die in dit experiment zijn geïntroduceerd. (E, F) Luc-reportertest van enkele mutanten (E) en dubbele, drievoudige en viervoudige mutanten (F). Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). *P < 0.05 wordt bepaald door Student's t testen.

    Effect van Cas7d-mutaties op type I-D CRISPR-Cas-gemedieerde genoombewerking. (A–C) Momentopname van het MD-simulatietraject van de cascade van Type I-E (EEN), Typ I-F (B), en Type I-D (C) systeem. Een ondoorzichtig lint, doorschijnend rood lint met bal-en-stok en doorschijnend blauw lint tonen respectievelijk een van de Cas7e (A), Cas7f (B) of Cas7d (C) moleculen, crRNA en DNA. De bal-en-stok geeft de crRNA-ruggengraat aan. De essentiële residuen die interageren met crRNA, d.w.z. K45, R46 en R49 van Cas7e (A), Q326 en K327 van Cas7f (B), en K67, R68 en K69 van Cas7d (C), worden weergegeven door ruimtevullende modellen. (D) Cas7d-aminozuursequenties en de mutaties die in dit experiment zijn geïntroduceerd. (E, F) Luc-reportertest van enkele mutanten (E) en dubbele, drievoudige en viervoudige mutanten (F). Gegevens zijn gemiddelden ± S.E. van onafhankelijke experimenten (N = 3). *P < 0.05 wordt bepaald door Student's t testen.

    Deze resultaten benadrukken belangrijke aspecten van de interactie in type I-D Cas7d, crRNA en het doel-DNA, maar verdere studies, waaronder structurele analyse van het type I-D Cas-complex, zijn nodig om de fijnere details van het systeem te begrijpen.

    Gerichte mutagenese door type I-D CRISPR-Cas-systeem in HEK293-cellen

    Vervolgens richtten we ons op een intern genomisch DNA-gebied dat overeenkomt met het type I-D crRNA-doelwit om de type I-D-geïnduceerde mutagenese bij zoogdieren te detecteren. We construeerden enkele expressievectoren voor elk cas gen, een vector die een drievoudige genexpressiecassette bevat die is verbonden via een 2A-zelfsplitsingspeptidesequentie (2A), en een vector die een vijfvoudige genexpressiecassette bevat die is verbonden via 2A (aanvullende figuren S8A en S12). Van al deze configuraties, transfectie met de single cas genexpressievectoren leverden de hoogste Cas-eiwitexpressieniveaus op in menselijke cellen (aanvullende figuur S8D). De expressie van Cas5 was nogal slecht, maar dit kon worden opgelost door tot expressie te brengen vanuit het pCAG-plasmide met behulp van de CAG promotor, wat een sterke synthetische promotor is (63) (aanvullende figuur S8E). Een tweede ronde van codonoptimalisatie zou ook een optie zijn om Cas5-expressie te verbeteren, zoals gerapporteerd door Pickar-Oliver et al. ( 27).

    Na een recent onderzoek naar genoombewerking met CRISPR-Cas type I-E (23, 24), speculeerden we dat verwijdering op lange afstand zou kunnen worden geïntroduceerd in de buurt van de type I-D-doellocatie. Om dit te onderzoeken, hebben we doelen geselecteerd hEMX1 GTT_998-1036 (–) voor de mens EMX1 gen en AAVS GTC_70–107(+) voor de AAVS gen op basis van de luciferase SSA-assay (Figuur 4A en B). Met behulp van verschillende primersets die 3-15 kbp flankeren rond de AAVS en hEMX1 doelsites en ook meer dan 19 kbp rond de AAVS doelwitplaats (Figuur 7A en B), werden DNA-fragmenten met PCR geamplificeerd van totaal DNA van HEK293T-cellen die waren getransfecteerd met de type I-D CRISPR-Cas-componenten. Sequentiebepaling onthulde dat type I-D CRISPR-Cas lange-afstandsdeleties introduceerde variërend van 2, 5 kb tot meer dan 19 kb op doellocaties (Figuur 7A-C aanvullende tabellen S7 en S8). AAVS GTC_70-107(+) gemuteerde sequenties hadden een aantal specifieke kenmerken: de grootte van grote deleties op lange afstand was niet willekeurig, maar vertoonde enkele beperkingen in het geval van het doelwit AAVS GTC_70-107(+) als verwijderingen van 5,2-5,5 kb en 17-18 kb, met enkele kleine uitzonderingen, werden meestal bidirectionele deleties gedetecteerd (Figuur 7A-C Aanvullende tabellen S7 en S8). Deze kenmerken verschilden van die na mutatie door type I-E (23, 24) en type II effectoren zoals Cas9 (1, 2) en Cas12a (3). Microhomologie en inserties werden ook waargenomen op mutatieplaatsen (Figuur 7A-C aanvullende tabellen S7 en S8). De mutatiesnelheden voor deletie over lange afstand in de gekloonde DNA-fragmenten waren 55,0% en 57,1% met hEMX1 GTT_998–1036 (–) en AAVS GTC_70-107(+), respectievelijk. Bovendien varieerde de mutatiedistributie in gekloonde PCR-producten tussen doelwitmutaties door: hEMX1 998-1036 (–) vertoonde een laag mozaïek, terwijl mutaties door AAVS GTC_70-107 (+) vertoonde meer gevarieerde gemuteerde sequenties (Figuur 7A-C en aanvullende tabel S7). De gedetailleerde sequenties van PCR-fragmenten die zijn afgeleid van lange deletiemutaties zijn vermeld in aanvullende tabel S9.

    Type I-D CRISPR-Cas bemiddelt genoombewerking in menselijke cellen. (A, B) Detectie van deletiemutaties op lange afstand in de EMX1 en AAVS genen geïnduceerd door het type I-D CRISPR-Cas. Boven: genstructuur en verschillende primersets om de mutatie te versterken (pijlen). De primer zet voor hEMX1 gen versterken respectievelijk 14.915 bp (Primer set 1) en 9.109 bp (Primer set 2). De primer zet voor AAVS locus amplify 19031 bp (Primer set 1), 16624 bp (Primer set 2), 12659 bp (Primer set 3), 10482 bp (Primer set 4), 9246 bp (Primer set 5), 8359 bp (Primer set 6), 7077 bp (Primer set 7), 4764 bp (Primer set 8), 3594 bp (Primer set 9), respectievelijk. Onder (links): De met PCR geamplificeerde fragmenten werden gescheiden op agarosegels. Ctrl geeft de monsters aan die zijn gecotransfecteerd met type I-D Cas-expressievectoren met niet-doelgRNA-vector. Getallen komen overeen met de primersets die worden weergegeven met de genstructuren. Onder (rechts) De grote deletiemutaties geanalyseerd door de Sanger-sequencing van het gekloonde DNA van de type I-D Cas-geïnfecteerde cellen. Stippellijnen geven de verwijderings-/reparatieknooppunten aan. De nucleotide-afstanden van de PAM werden aangegeven op de sequentie. De grootte van de schrappingen wordt tussen haakjes weergegeven. De sequenties die zijn onderstreept met een oranje balk geven de microhomologie aan die in kruispunten wordt gevonden. (C) Langeafstandsverwijderingspatroon geïnduceerd door AAVS GTC_70–107 (+). Blauwe balk: verwijdering in de 5' stroomopwaarts van de PAM, rode balk: verwijdering in de 3' stroomafwaarts van de PAM. De x-as geeft de afstand aan vanaf de PAM-site (kbp). Het stroomopwaartse gebied werd aangeduid als (–), het stroomafwaartse gebied werd aangeduid als (+). De verdeling van langere deletiemutaties wordt getoond in aanvullende figuur S4C. (NS) Heteroduplex mobiliteitstest van de mutatie in de hEMX1 gen geïnduceerd door type I-D CRISPR-Cas. Meerdere heteroduplexpieken (rode pijlen) werden gedetecteerd in PCR-amplicons van de HEK293T-cellen die waren geïnfecteerd met type I-D CRISPR-Cas dat zich richt op hEMX1 gen [EMX1 998-1036 (–)]. blauwe pijl Wild-type piek. EV: de cellen geïnfecteerd met lege vector. M: interne markeringen. (E) Mutatiesequenties in HEK293T-cellen getransfecteerd met type I-D CRISPR-Cas die gericht zijn op hEMX gen. WT: wildtype sequenties. Twee gRNA's voor CRISPR type I-D [EMX1_943–981(+) en 998–1036(–)] werden afzonderlijk geïnfecteerd met HEK293T-cellen. gRNA-doelsequenties worden aangegeven in groene vakken en PAM wordt aangegeven in roze vakken. De sequentiefrequenties in de gekloonde PCR-producten worden rechts van de sequentie aangegeven. (F) Analyse van off-target effect van type I-D in menselijke cellen. Off-target-sites werden geselecteerd op basis van het mismatch-nummer (off-target-1, -2 en -3 voor AAVS GTC_70-107) en lange deleties werden onderzocht door lange PCR-analyse. De verwachte afmetingen van het geamplificeerde fragment werden bovenaan de gels aangegeven.

    Type I-D CRISPR-Cas bemiddelt genoombewerking in menselijke cellen. (A, B) Detectie van deletiemutaties op lange afstand in de EMX1 en AAVS genen geïnduceerd door het type I-D CRISPR-Cas. Boven: genstructuur en verschillende primersets om de mutatie te versterken (pijlen). De primer zet voor hEMX1 gen versterken respectievelijk 14.915 bp (Primer set 1) en 9.109 bp (Primer set 2). De primer zet voor AAVS locus amplify 19031 bp (Primer set 1), 16624 bp (Primer set 2), 12659 bp (Primer set 3), 10482 bp (Primer set 4), 9246 bp (Primer set 5), 8359 bp (Primer set 6), 7077 bp (Primer set 7), 4764 bp (Primer set 8), 3594 bp (Primer set 9), respectievelijk. Onder (links): De met PCR geamplificeerde fragmenten werden gescheiden op agarosegels. Ctrl geeft de monsters aan die zijn gecotransfecteerd met type I-D Cas-expressievectoren met niet-doelgRNA-vector. Getallen komen overeen met de primersets die worden weergegeven met de genstructuren. Onder (rechts) De grote deletiemutaties geanalyseerd door de Sanger-sequencing van het gekloonde DNA van de type I-D Cas-geïnfecteerde cellen. Stippellijnen geven de verwijderings-/reparatieknooppunten aan. De nucleotide-afstanden van de PAM werden aangegeven op de sequentie. De grootte van de schrappingen wordt tussen haakjes weergegeven. De sequenties die zijn onderstreept met een oranje balk geven de microhomologie aan die in kruispunten wordt gevonden. (C) Langeafstandsverwijderingspatroon geïnduceerd door AAVS GTC_70–107 (+). Blauwe balk: verwijdering in de 5' stroomopwaarts van de PAM, rode balk: verwijdering in de 3' stroomafwaarts van de PAM. De x-as geeft de afstand aan vanaf de PAM-site (kbp). Het stroomopwaartse gebied werd aangeduid als (–), het stroomafwaartse gebied werd aangeduid als (+). De verdeling van langere deletiemutaties wordt getoond in aanvullende figuur S4C. (NS) Heteroduplex mobiliteitstest van de mutatie in de hEMX1 gen geïnduceerd door type I-D CRISPR-Cas. Meerdere heteroduplexpieken (rode pijlen) werden gedetecteerd in PCR-amplicons van de HEK293T-cellen die waren geïnfecteerd met type I-D CRISPR-Cas dat zich richt op hEMX1 gen [EMX1 998-1036 (–)]. blauwe pijl Wild-type piek. EV: de cellen geïnfecteerd met lege vector. M: interne markeringen. (E) Mutatiesequenties in HEK293T-cellen getransfecteerd met type I-D CRISPR-Cas die gericht zijn op hEMX gen. WT: wildtype sequenties. Twee gRNA's voor CRISPR type I-D [EMX1_943–981(+) en 998–1036(–)] werden afzonderlijk geïnfecteerd met HEK293T-cellen. gRNA-doelsequenties worden aangegeven in groene vakken en PAM wordt aangegeven in roze vakken. De sequentiefrequenties in de gekloonde PCR-producten worden rechts van de sequentie aangegeven. (F) Analyse van off-target effect van type I-D in menselijke cellen. Off-target-sites werden geselecteerd op basis van het mismatch-nummer (off-target-1, -2 en -3 voor AAVS GTC_70-107) en lange deleties werden onderzocht door lange PCR-analyse. De verwachte afmetingen van het geamplificeerde fragment werden bovenaan de gels aangegeven.

    De luciferase SSA-assay, met een kort (300-500 bp) fragment dat twee homologe regio's van het luciferase-gen omspant, toonde duidelijk de genoombewerkingsactiviteit van type ID CRISPR-Cas, dus vroegen we vervolgens of, net als Cas9 en Cas12a, het type Het ID-systeem kan ook kleine wijzigingen aanbrengen op de doelsite. Om dit te testen, werd het doelgebied van 300-500 bp PCR-geamplificeerd en geanalyseerd door HMA. Typische meervoudige heteroduplex HMA-pieken werden gedetecteerd in PCR-amplicons van HEK293FT-cellen die waren getransfecteerd met type I-D CRISPR-Cas met hEMX1 GTT_998-1036 (–) gRNA (Figuur 7D). Sequentieanalyse van gekloonde PCR-producten van HEK293FT-cellen getransfecteerd met gRNA's hEMX1 GTT_943–981 (+) en hEMX1 GTT_998-1036 (–) toonde aan dat gRNA in combinatie met type I-D CRISPR-Cas-eiwitten dubbelstrengs breuken (DSB's) en kleine indels op de doellocatie kon introduceren met mutatiesnelheden van 19,6% [hEMX1 GTT_943–981 (+)] en 12,5% [hEMX1 GTT_998-1036 (–)] in de gekloonde DNA's (Figuur 7E).

    Onlangs heeft Dolan et al. (23) en Morisaka et al. (24) meldde dat het type I-E CRISPR-Cas3-systeem grote deleties veroorzaakte. Morisaka et al. (24) onderzochten de mutaties met een efficiëntie van 16,1% voor de EMX1 gen en 4,6% voor de CCR5 gen in HET293T-cellen, terwijl SpyCas9-gemedieerde indels 23,4% waren voor EMX1 en 23,7% voor CCR5. Dolan et al. (23) toonde de mutatie-efficiëntie van 13% voor de GFP gen in hESC-cellen. Beide onderzoeken gaven aan dat type I-E CRISPR-Cas3 lange-afstandsdeleties induceerde door een lang stuk van het doelgebied, meestal stroomopwaarts van de PAM/doelplaats, zonder gedefinieerde eindpunten. Morisaka et al. (24) meldde dat 86,3% en 81,6% van de verwijderingen meer dan 10 kb bedroegen voor de EMX1 en CCR5 genen, respectievelijk, en de deletiegrootte was tot 78 kb. In de studie van Dolan et al. ( 23), waren de meeste deleties geconcentreerd binnen 30 kb en varieerden de deleties van een paar honderd bp tot 100 kb. Aan de andere kant produceerde het type I-D verschillende bewerkingsresultaten in vergelijking met het type I-E-systeem, het type I-D kan zowel kleine indels als bidirectionele deleties op lange afstand induceren.

    Sommige onderzoeken hebben gemeld dat door CRISPR-Cas9 geïnduceerde mutaties buiten het frame resulteren in de productie van afwijkend mRNA of eiwit (64, 65). Het vermogen om lange-afstandsdeleties te induceren is nuttig om een ​​gen van belang uit te schakelen door het hele gebied dat het gen herbergt te verwijderen. Het kan ook nuttig zijn om deleties te induceren in niet-coderende gebieden zoals promotors, UTR's, introns en repetitieve sequenties. Morisaka et al. (24) gaf aan dat het type I-E-systeem exon-skipping efficiënter kan induceren dan het CRISPR-Cas9-systeem. Het is te verwachten dat hiervoor ook het type I-D systeem wordt gebruikt. Verdere ontwikkeling om de mutaties te beheersen en de efficiëntie te verhogen, zou de toepasbaarheid van deze technologie moeten vergroten. De engineering van Cas-eiwitten of het fuseren van functionele eiwitten, en de toepassing van anti-Cas-eiwit zullen bijdragen aan de ontwikkeling van deze technologie.

    Het significante verschil tussen het type I-E CRISPR-Cas3-systeem en ons type I-D-systeem is dat CRISPR-Cas3 alleen unidirectionele lange verwijdering induceert, maar het type I-D-systeem induceert bidirectionele verwijdering op lange afstand en ook kleine indels. Kleine indels kunnen het resultaat zijn van lage helicase-activiteit in het type I-D-systeem. Het vermogen om kleine indels te induceren kan worden toegepast voor mutagenese, zoals die wordt uitgevoerd met CRISPR-Cas9 of Cas12a. Hoewel deze studie heeft aangetoond dat het type ID-systeem een ​​grote verscheidenheid aan mutaties in het doelwit kan introduceren, is het moeilijk om de mutatie-efficiëntie nauwkeurig te berekenen van type ID, dat diverse en complexe mutatieprofielen vertoont met bidirectionele deleties op lange afstand en korte indels. Om de mutatie-efficiëntie die wordt gemedieerd door het type ID-systeem diepgaand te karakteriseren en te vergelijken met die van andere hulpmiddelen, moet een nieuwe, op sequencing gebaseerde benadering van de volgende generatie worden vastgesteld om de verscheidenheid aan beide bidirectionele verwijderingen op lange afstand te detecteren en te analyseren en korte indels.

    We analyseerden ook of off-target mutaties optraden in genoom-bewerkte monsters door middel van lange-afstands-PCR-analyse.Omdat potentiële off-target-sites met minder dan 8 mismatches niet werden gevonden voor AAVS GTC_70-107, evalueerden we drie potentiële sites met 9 en 10 mismatches (aanvullende tabel S10) met langeafstands-PCR. Het resultaat toonde aan dat off-target mutaties niet werden geïnduceerd door het type I-D-systeem (Figuur 7F). Dit kan worden toegeschreven aan de herkenning van langere doelsequenties door type I-D dan Cas9. Hoewel verdere off-target mutatieanalyse nodig is, suggereren de resultaten dat het type ID-systeem een ​​nuttig genoombewerkingssysteem is met hoge specificiteit, en verdere engineering van crRNA zou de specificiteit van het type ID-systeem kunnen verhogen.


    Wat is DNA-transfectie?

    DNA-transfectie is het proces waarbij DNA wordt opgenomen door eukaryote cellen. Terwijl de toepassing van bacteriële transformatie typisch is voor overexpressie van genen in een poging om grote hoeveelheden eiwitten te produceren die kunnen worden gezuiverd en bestudeerd, wordt DNA-transfectie typisch gebruikt voor het bestuderen van het effect van genexpressie in een cellulaire context. Bij DNA-transfectie kan DNA dat in de cel wordt ingebracht ofwel tot expressie worden gebracht op een extrachromosomaal plasmide (transiënte transfectie genoemd) of geïntegreerd worden in het cellulaire genoom (stabiele transfectie genoemd). Transiënte transfectie is gunstig voor een hoog expressieniveau, vanwege de aanwezigheid van meerdere kopieën van de gencassette en snelle analyse (binnen 24 tot 96 uur). Stabiele transfectie is voordelig voor langetermijnstudies van genexpressie in de cellulaire context. Transfectiemethoden zijn ontworpen om afstotende krachten te overwinnen die de levering van DNA- of RNA-moleculen (waarin de ruggengraat negatief geladen is) door het celmembraan (dat ook negatieve ladingen bevat) belemmeren. Transfectiemethoden omvatten doorgaans het mengen van nucleïnezuren met positief geladen reagentia die de negatieve ladingen van de DNA- of RNA-ruggengraat neutraliseren. Het mengsel is samengesteld uit complexen die gemakkelijker het celmembraan passeren. Fysische methoden zoals elektroporatie en deeltjesbombardement kunnen ook worden gebruikt voor transfectie.


    Discussie

    Eerder toonden we een gerichte gencorrectie van de mutant E coli β-galactosidase-gen met een enkele puntmutatie door het chimere RNA-DNA-oligonucleotide en rapporteerde een frequentie van ongeveer 0,1% door in vitro reactie met behulp van nucleaire extracten en ongeveer 1% door transiënte transfectie.25 Met hetzelfde systeem hebben we onderzocht of een enkelstrengs oligonucleotide de DNA-sequentie kan veranderen en de werkzaamheid ervan vergeleken met het chimere RNA-DNA-oligonucleotide, in de in vitro reactie met kernextracten evenals in het episoom en chromosoom van zoogdiercellen. Verrassend genoeg ontdekten we dat relatief korte oligodeoxynucleotiden gencorrectie in zoogdiercellen veroorzaakten in dezelfde mate als het chimere RNA-DNA-oligonucleotide. Gencorrectiefrequentie van de in vitro reactie was ongeveer 0,05% en was niet afhankelijk van de lengte of polariteit van het oligonucleotide. In tegenstelling tot in vitro reactie was de frequentie van episoomgencorrectie sterk afhankelijk van de lengte en polariteit van het oligonucleotide en varieerde van 0,5% tot 1% in CHO-K1-cellen. Gencorrectie vereiste een optimale lengte met een homologie van 45 nucleotiden die de hoogste frequentie vertoonden. Bovendien vertoonde een antisense-oligonucleotide een 1000-voudig hogere frequentie van gencorrectie dan een sense-oligonucleotide. Chromosomale gencorrectie toonde een vergelijkbare afhankelijkheid van de lengte en polariteit van oligonucleotide voor het episoom, zij het met een lagere frequentie, ongeveer 0,1% in CHO-K1-cellen. ODN's veroorzaakten dus een sequentiespecifieke, lengteafhankelijke en strengspecifieke gencorrectie in episoom en chromosoom van zoogdiercellen.

    Gencorrectiefrequenties van episomaal DNA waren veel hoger dan die waargenomen in nucleaire extracten. Dit resultaat gaf aan dat sommige eiwitten kunnen worden uitgesloten of geïnactiveerd tijdens de bereiding van nucleaire extracten. De frequentie van episomale gencorrectie was hoger dan die van chromosomaal. Verschillen kunnen worden veroorzaakt door de chromatinestructuur, die de toegankelijkheid van het chromosomale doel-DNA kan beperken. Het kan zijn dat chromosomale recombinatie anders is dan episomaal, waarvan is aangetoond dat het plaatsvindt door een niet-conservatief enkelstrengs annealing-mechanisme.282930 Correctie van een enkel plasmide tussen meerdere kopieën van niet-gecorrigeerde plasmiden die aanwezig zijn in getransfecteerde cellen kan resulteren in het herstel van β -galactosidase-activiteit (blauwe cellen), resulterend in een schijnbaar hoge frequentie van episomale targeting.

    De eerste stap voor gencorrectie zou een koppeling van ODN met de homologe DNA-sequentie door recombinatie inhouden, wat een goed startpunt zou zijn voor het mechanisme-onderzoek. Om genherstelactiviteit met een dergelijke formatie te correleren, hebben we de D-lusvorming uitgevoerd onder vergelijkbare omstandigheden waar we genherstelactiviteit hebben gemeten. We ontdekten dat nucleaire eiwitten een vergelijkbare mate van de vorming van de D-lus katalyseerden tussen sense of antisense ODN en het homologe superhelische DNA. Dit resultaat suggereert een koppeling van ODN met beide strengen van het homologe superhelische DNA en is in overeenstemming met de vergelijkbare in vitro gencorrectiefrequentie vertoond door beide ODN's. In alle gevallen vertoonden deoxyoligonucleotiden echter een hogere frequentie van gencorrectie dan RNA-oligonucleotiden met een identieke sequentie. De herstelactiviteit van de mismatch was minder efficiënt in de RNA-DNA-duplex dan in de DNA-DNA-duplex.3132 We33 en anderen3435 vonden ook dat een correctie van een enkele base in het doel-DNA bij voorkeur wordt aangestuurd door de DNA-bevattende streng, maar niet door de RNA-bevattende streng van het chimere RNA-DNA-oligonucleotide. Daarom kan de hogere frequentie van gencorrectie die wordt vertoond door het deoxyoligonucleotide in vergelijking met het ribo-oligonucleotide worden toegeschreven aan de DNA-herstelactiviteit. Vergelijking van reparatiemechanismen door chimeer RNA-DNA-oligonucleotide en enkelstrengs ODN zal elders worden gepresenteerd.

    In tegenstelling tot in vitro reactie met nucleaire extracten, de episomale of chromosomale gencorrectie was sterk afhankelijk van de lengte en polariteit van ODN. D-lusvorming door nucleaire extracten toonde ook geen merkbare verschillen tussen antisense en sense ODN van verschillende lengtes, wat wijst op een goede correlatie tussen recombinatie en in vitro gen correctie activiteit. Omdat ODN's vrij stabiel lijken te zijn en als monomeer van volledige lengte in zoogdiercellen bleven, is het niet waarschijnlijk dat de verhoogde gencorrectiefrequentie die in langere ODN wordt gevonden, wordt veroorzaakt door de stabiliteit van ODN. Daarom suggereert de optimale lengte van ODN die wordt gevonden in episoom en chromosoom dat andere factoren, zoals de grootte en structuur van een tijdelijk open chromatine, een rol kunnen spelen bij het initiëren van recombinatie.

    Voor de episoom- en chromosoomdoelen vertoonden twee ODN's met dezelfde lengte maar tegengestelde polariteit een drastisch verschil in gencorrectiefrequentie, wat voor het eerst het potentiële effect van transcriptie op genherstel door korte ODN onthult. Transcriptie is in verband gebracht met preferentieel herstel van de getranscribeerde streng en met het stimuleren van recombinatie.36373839 De preferentiële werking van de antisense ODN kan te wijten zijn aan strengscheiding tijdens transcriptie, waardoor het chromatine wordt geopend, waardoor de niet-getranscribeerde streng beter toegankelijk is, terwijl de getranscribeerde streng streng kan worden ingenomen door het RNA-polymerase en accessoire-eiwitten. De andere mogelijkheid is dat beide oligonucleotiden een gelijke capaciteit voor heteroduplexvorming hebben, maar slechts één oriëntatie zal resulteren in DNA-sequentiecorrectie, vanwege de strengspecificiteit van het mismatch-reparatiesysteem.40 In dit geval zou het sense-oligonucleotide een heteroduplex kunnen maken met de getranscribeerde streng, maar wordt uitgesneden en geëlimineerd door het DNA-reparatiesysteem, dat de voorkeur geeft aan de residente streng boven de binnenvallende streng, wat resulteert in geen gencorrectie.41 We zijn van plan in de toekomst het mechanisme van het transcriptiegebonden genherstelproces voort te zetten. Omdat antisense-oligonucleotiden mogelijk kunnen hybridiseren met het mRNA en de eiwitproductie kunnen remmen, is het mogelijk dat de frequentie van antisense-oligonucleotiden hoger zou kunnen zijn dan die gemeten in dit onderzoek. Bij transformatie van gist door ODN, beïnvloedde de sense-streng het doelwit 50- tot 100-voudig meer dan het antisense-oligonucleotide21, onafhankelijk van de transcriptiesnelheid van het gen. Op dit moment is het niet duidelijk waarom er zo'n verschil bestaat tussen gist- en zoogdiercellen.

    Chan et al3 toonde aan dat een bifunctionele ODN, die een triple helix-domein en een donorfragment van 40 tot 44 nucleotiden homoloog aan het doel-DNA bevat, met uitzondering van één mismatch, een puntmutatie corrigeerde. In hun onderzoek vertoonden de sense en antisense ODN een vergelijkbare frequentie, die lager was dan de bifunctionele ODN. Hier ontdekten we dat de gencorrectiefrequentie van de enkelstrengs ODN sterk afhankelijk was van de polariteit. Verschillen tussen deze twee onderzoeken kunnen voortkomen uit de verschillende shuttlesystemen en -assays. Bijvoorbeeld de supF gen dat in het bifunctionele oligonucleotide werd gebruikt, werd niet getranscribeerd, terwijl het β-galactosidase-gen dat in deze studie werd gebruikt, werd getranscribeerd in zoogdiercellen. We ontdekten ook dat noch de lengte noch polariteit van ODN de frequentie van gencorrectie in de merkbaar beïnvloedde in vitro reactie, waarbij het β-galactosidase-gen niet werd getranscribeerd. Verder, Chan et al gemeten frequentie door transformatie van het gerepliceerde episomale DNA in zoogdiercellen in bacteriën, terwijl we de frequentie hebben gemeten door directe detectie van het gecorrigeerde β-galactosidase-gen dat tot expressie wordt gebracht in zoogdiercellen. Het is mogelijk dat deze factoren bijdragen aan de gevonden verschillen tussen de twee onderzoeken.

    Deze studie rapporteert twee verrassende bevindingen. Ten eerste zijn korte enkelstrengs oligonucleotiden in staat tot gencorrectie die vergelijkbaar is met de correcties die worden verkregen met chimere RNA-DNA-oligonucleotiden in hetzelfde systeem. Ten tweede is er een opvallend verschil in genherstelactiviteit gemeten door de in vitro reactie met nucleaire extracten en in vivo assays, waaronder tijdelijke transfectie en chromosomale targeting. Terwijl dit artikel werd beoordeeld, heeft Gamper et al42 rapporteerde dat enkelstrengs ODN punt- en frameshift-mutaties corrigeerde door incubatie van HuH7-celextracten met het plasmide dat codeert voor antibioticaresistentie in E coli. Hun resultaten zijn in overeenstemming met onze bevindingen dat korte enkelstrengs oligonucleotiden in staat zijn: in vitro gencorrectie, verkregen door gebruik te maken van verschillende shuttle vector en bacteriële uitleessystemen. We hebben echter gencorrectie verder vergeleken tussen in vitro reactie en in vivo testen, omdat onze shuttle-vector tot expressie wordt gebracht in zowel zoogdier- als bacteriële cellen. In tegenstelling tot in vitro reactie met nucleaire extracten, episomale of chromosomale gencorrectie was sterk afhankelijk van de lengte en polariteit van ODN. Daarom vereist de strategie voor genherstel door enkelstrengs ODN in zoogdiercellen de uitgebreide in vivo testen die in deze studie worden gepresenteerd naast de in vitro reactie. Met deze bevinding kan een relatief korte deoxyoligonucleotide worden overwogen om een ​​sequentiespecifieke verandering in de doelsequentie in zoogdiercellen aan te brengen, met een vergelijkbare frequentie als het chimere RNA-DNA-oligonucleotide.


    DNA-transfectieprotocol

    Een voorbeeldprotocol wordt hier vermeld voor transfectie-experimenten die worden uitgevoerd in platen met 6 putjes. Om transfectie-experimenten in andere celcultuurplaten uit te voeren, vermenigvuldigt u eenvoudig de voorgestelde hoeveelheden met het relatieve oppervlak van uw plaat. GenScript raadt het gebruik van Lipofectamine 2000 aan voor alle transfecties. Het produceert consequent een hoge transfectie-efficiëntie en een hoge eiwitoverexpressie.

    • Aanhangende cellen: Een dag voor transfectie, plaat 0,25-1 x 106 cellen in 2 ml groeimedium zonder antibiotica per putje, zodat ze 90-95% confluent zullen zijn op het moment van transfectie.
    • Suspensiecellen: Op de dag van transfectie net voor het bereiden van complexen, plaat 1,0-3,5 x106 cellen in 2 ml groeimedium zonder antibiotica per putje.
    • Voor elk transfectiemonster, bereid DNA-Lipofectamine 2000-complexen als volgt voor:
      • Verdun DNA in 250 ul Opti-MEM I Reduced Serum Medium zonder serum (of ander medium zonder serum). Meng voorzichtig.
      • Meng Lipofectamine 2000 voorzichtig voor gebruik en verdun vervolgens de juiste hoeveelheid in 250 μl Opti-MEM I Medium (of ander medium zonder serum). Meng voorzichtig en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      • Combineer na 5 minuten incubatie het verdunde DNA met het verdunde Lipofectamine 2000 (totaal volume is 500 l). Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om de DNA-Lipofectamine 2000-complexen te laten vormen.

      Voeg de 500 ul DNA-Lipofectamine 2000-complexen toe aan elk putje dat cellen en medium bevat. Meng voorzichtig door de plaat heen en weer te schudden.
      Incubeer de cellen bij 37°C in een CO2 incubator gedurende 24-72 uur totdat ze klaar zijn om te testen op transgenexpressie. Het is niet nodig om de complexen te verwijderen of het medium te veranderen, maar het groeimedium kan na 4-6 uur worden vervangen zonder verlies van transfectie-activiteit.


      Bekijk de video: Havo 5. DNA. Basisstof 5 Mutaties (Januari- 2022).