Informatie

Hoe een volledige genoomanalyse van Multidrug-resistente Mycobacterium tuberculosis te doen?


Ik ben op zoek naar tutorials en software die me kunnen helpen bij het bestuderen van volledige genoomsequentiegegevens en genoombrede associaties. Ik heb Matlab en Bioconductor R, dus alles wat met die pakketten te maken heeft, verdient de voorkeur.


Je hebt een fascinerend en heel belangrijk organisme uitgekozen om te bestuderen. Helaas zijn er heel veel stappen met veel softwarepakketten die je nodig hebt en elke volgende stap zal afhangen van wat je vindt, waardoor een bepaalde tutorial bijna zinloos is. Het spijt me te moeten zeggen dat ik denk dat niemand een heel projectvoorstel of workflow als antwoord zal dumpen. Ik zal je een antwoord geven om je op weg te helpen met je onderzoek.

Voorbeeld

Een uitstekend voorbeeld van een dergelijk onderzoek is Fellay et al., 2007 en je kunt hun materialen en methoden hier aanvullen.

Een inleiding tot dit soort onderzoek

Eerst moet je de sequenties van eiwitten vinden waarvan je denkt dat ze significant zijn. Er zijn een heleboel manieren om dit te doen, maar ik stel voor om op de schouders van reuzen te gaan staan ​​en de literatuur door te spitten (hoe dan ook, zoek een voorbeeld waar dit elders is gedaan). Als er niet veel is of voor een geheel nieuwe kijk op iets, kan dit antwoord helpen bij het vinden van eiwitten in de DNA-sequentie.

Sequentie-uitlijning met andere stammen is uw beste gok om mutaties te identificeren (en mogelijk een indicator van resistentie, wat ik denk dat u zoekt). Er is veel om uit te kiezen, maar BLAST is een goed hulpmiddel om mee te beginnen. Je moet je resistente soort vergelijken met niet-resistente soorten. Wees zeer voorzichtig bij het analyseren van de gegevens, niet elke mutatie zal significant zijn.


Tuberculose wordt veroorzaakt door een nauw verwante groep van pathogene soorten die de Mycobacterium tuberculosis complex. De stammen worden over het algemeen gekenmerkt door hun verschillende spoligotypepatronen en zijn gegroepeerd in zeven hoofdlijnen (1). Spoligotype-patronen worden getest op basis van herhaalde loci in het genoom en zijn uitgebreid bestudeerd in relatie tot stamlijn, geografische distributie, evolutie, virulentie en gevoeligheid voor geneesmiddelen. Van verschillende spoligotypen, waaronder nieuwe spoligotypen, is eerder aangetoond dat ze geassocieerd zijn met specifieke resistentiefenotypen (2𠄴). Recentelijk zijn genoomsequenties van representatieve leden van grote genotgroepen gerapporteerd (5𠄹). De beschikbaarheid van genoomsequenties van nieuwe spoligotypes zou een nieuwe mogelijkheid bieden om de genoomarchitectuur en diversiteit van deze stammen te begrijpen en zou inzicht verschaffen in hun fenotypische eigenschappen. In dit artikel beschrijven we de concept-genoomsequentie van een multiresistent (MDR) klinisch isolaat van Mycobacterium tuberculosis, OSDD105, behorend tot een nieuw spoligotype-patroon (777737777620000), nauw geclusterd met de Euro-Amerikaanse genogroep.

Het klinische isolaat OSDD105 werd verkregen uit de stamrepository die wordt onderhouden bij het National JALMA Institute of Leprosy and other Mycobacterial Diseases, Agra, en werd onderhouden als onderdeel van de Open Source Drug Discovery Open Access Repository. Er werd een spoligotyperingsanalyse uitgevoerd en de gevoeligheid voor geneesmiddelen werd geëvalueerd volgens standaardprotocollen (10�). Analyse onthulde dat de stam behoorde tot een nieuw spoligotype dat nauw clustert met het T2-spoligotype van de Euro-Amerikaanse afkomst, met een Spotclust (13)-waarschijnlijkheid van 0,99. Geneesmiddelgevoeligheidsanalyse onthulde dat het isolaat resistent is tegen streptomycine, rifampicine, isoniazide, ethambutol, cycloserine en pyrazinamide en gevoelig is voor ofloxacine, kanamycine, ethionamide, amikacine, capreomycine en para- aminosalicylaatnatrium (PAS). DNA werd geïsoleerd volgens standaardprotocollen. De onbewerkte sequentiegegevens werden gegenereerd na bibliotheekvoorbereiding op Ion Torrent PGM volgens protocollen aanbevolen door fabrikanten. Ontwerpgenomen werden geassembleerd de novo met behulp van CLC Genomics Workbench 6. De assemblage resulteerde in 181 contigs at N50 waarden van 40.206਋p en een totale assemblage van 4.267.020਋p. Verder werd geautomatiseerde genvoorspelling op de conceptgenomen uitgevoerd met behulp van de RAST-server (14). Analyse onthulde 4.760 genen, waaronder 48 RNA-genen.

Nucleotidesequentie toegangsnummers.


Invoering

Tuberculoseziekte (TB) is een chronische luchtweginfectie, veroorzaakt door: Mycobacterium tuberculosis. De Filippijnen is een land met een hoge belasting voor tbc, met alleen al in 2017 meer dan 300.000 gevallen en 25.000 sterfgevallen 1 . Recente bevindingen suggereren echter dat meer dan een miljoen Filippino's actief besmet zijn met de ziekte, waardoor de Filippijnse last op de tweede plaats komt na China 1 . Bovendien heeft het land een toenemende hiv-prevalentie en een hoge last voor multidrug-resistentie (MDR-TB, resistentie tegen behandelingen met isoniazide en rifampicine (RIF)) die ernstige uitdagingen vormen voor een effectieve bestrijding 1 . De Filippijnen hebben de TB-bestrijdingsstrategie "Directly Observed Treatment, Short Course" (TB-DOTS) van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) aangenomen. Er is erkend dat er een dringende behoefte is om meer gevallen op te sporen en te behandelen door een uitbreiding van GeneXpert (Cepheid, Sunnyvale, CA) faciliteiten voor betere toegang en voor gebruik als primair diagnostisch hulpmiddel 1 . Er is met name een kloof tussen degenen die naar verwachting MDR-TB zullen hebben (2% nieuwe gevallen, 21% herbehandelingsgevallen) en degenen die worden gedetecteerd en vervolgens worden behandeld. Bovendien laten de behandelingsresultaten van de behandelden slechte slaagpercentages zien, waardoor het land een risico loopt op de verdere verspreiding van MDR-TB en mogelijk extensief resistente stammen.

Ondanks dat tbc een serieus probleem is in de Filippijnen, zijn genomische gegevens voor lokale m. tuberculose stammen ontbreekt. Eerdere studies hebben 'oude' (lijn 1) en 'moderne' geslachten (2 en 4) geïdentificeerd als aanwezig in de populatie 2 met de leden van de EA12-Manilla-clade waarvan bekend is dat ze sterk geassocieerd zijn met de Filippijnse bevolking 3,4 . Er zijn meer isolaten nodig om de fylogeografische verdeling van m. tuberculose stammen in het land, en profiteer van nieuwe genomische hulpmiddelen die volledige genoomsequencing (WGS) mogelijk maken. WGS-gegevens kunnen worden gebruikt om de m. tuberculose voor resistentie tegen geneesmiddelen 5,6 , karakteriseren van de oude en moderne afstammingslijnen en verschillende virulentiestamtypes 7 , en vaststellen wie mogelijk aan wie heeft overgedragen en zo gerichte middelen toelaten aan hotspotgebieden om transmissie te verminderen 8 allemaal mogelijk gemaakt door vooruitgang in de gezondheidsinformatica 5 . Verder zullen WGS-mogelijkheden een revolutie teweegbrengen in de diagnose en het klinische patiëntenbeheer van tbc. Zo gebruikt Public Health England (VK) nu pathogene genetische karakterisering als een klinische standaard van zorg bij tbc-beheer, en een toenemend aantal landen wereldwijd probeert dit als onderdeel van klinische zorg over te nemen. Om effectief te zijn, moeten deze benaderingen echter worden toegepast in landen met een hoge tbc-last en worden gecoördineerd met gevestigde bestrijdingsprogramma's.

In de Filippijnen vindt elke vijfjaarlijks een landelijk onderzoek naar geneesmiddelresistentie (DRS) plaats (jaar 2007, 2012, 2017) en is er actief toezicht op MDR-TB, inclusief monitoring van resistentie tegen fluorochinolon en tweedelijnsinjectie bij tbc-patiënten, waarbij de volgorde van geneesmiddelresistentie loci. Dit omvat het karakteriseren van single nucleotide polymorphisms (SNP's) en indel-markers van geneesmiddelresistentie, vooral in genen die coderen voor geneesmiddel-targets of -converterende enzymen (bijv. katG, inhA, rpoB, pncA, embB, rrs, gyrA, gyrB genen). Er zijn beperkte sets van hoogfrequente markers opgenomen in diagnostische hulpmiddelen (bijv. Xpert MTB/RIF en lijnprobe-assays voor MDR-TB) voor identificatie in m. tuberculose DNA (geschatte genoomgrootte 4,4 Mb). Deze benaderingen gebruiken echter minder dan 1% van het genoom, en WGS-benaderingen die SNP's en andere variatie identificeren, bieden een veel grotere resolutie voor profilering m. tuberculose voor geneesmiddelresistentie, stamtypes en het opsporen van uitbraken, maar ook voor nieuwe mutaties en mechanismen door middel van genoombrede analyses 6,9 .

Tot op heden zijn er weinig WGS-onderzoeken uitgevoerd in de Filippijnen, en hier presenteren we de resultaten van het sequencen van 178 isolaten die onlangs zijn verzameld in de DRS van 2012. We onderzoeken de genomische diversiteit van de overheersende Manila-stam en ontwikkelen een moleculaire barcode voor surveillancetoepassingen. We laten zien dat de stamtypes en de meerderheid van de geïdentificeerde mutaties in geneesmiddelresistentie vergelijkbaar zijn met die gevonden in wereldwijde populaties, waardoor het gebruik van bestaande mutatiedatabases robuust is om resistentie te detecteren.


Resultaten

Pathogeen identificatie

Computertomografie (CT)-scans van de gemummificeerde overblijfselen van bisschop Peder Winstrup van Lund, Zweden onthulden een verkalkt granuloom van enkele millimeters (mm) in de ingeklapte rechterlong samen met twee

5 mm calcificaties in de rechter hilus (Fig. 1). Primaire tuberculose veroorzaakt parenchymale veranderingen en ipsilaterale hilaire lymfadenopathie die vaker voorkomt aan de rechterkant [15]. Na resolutie kan het een parenchymaal litteken achterlaten, een klein verkalkt granuloom (Ghon-focus) en verkalkte hilaire knooppunten, die samen een Ranke-complex worden genoemd. Bij beeldvorming suggereert dit complex een eerdere tuberculose-infectie, hoewel histoplasmose hetzelfde uiterlijk kan hebben [16]. Histoplasmose is echter zeer zeldzaam in Scandinavië en wordt vaker gezien in andere delen van de wereld (bijvoorbeeld Amerika) [17]. De beeldvormingsbevindingen werden daarom geacht het gevolg te zijn van eerdere primaire tuberculose. Een van de verkalkte hilarische knooppunten werd uit de overblijfselen gehaald tijdens video-geassisteerde thoracoscopische chirurgie, geleid door fluoroscopie. Het geëxtraheerde materiaal werd verder bemonsterd voor genetische analyse. DNA werd geëxtraheerd uit de knobbel en het bijbehorende longweefsel met behulp van protocollen die zijn geoptimaliseerd voor het herstel van oud, chemisch afgebroken, fragmentarisch genetisch materiaal [18]. De bibliotheek (LUND1) werd gesequenced tot een diepte van ongeveer 3,7 miljoen keer gelezen.

CT-beeld van Ranke-complex. CT-opname van de borst van Peder Winstrup in een licht gehoekt axiaal vlak, waarbij de korte pijl een klein verkalkt granuloom toont in de vermoedelijke bovenkwab van de ingeklapte rechterlong, en twee calcificaties van ongeveer 5 mm in de rechter hilus samen, wat wijst op een Ranke-complex en eerdere primaire tuberculose. De meer laterale van de twee hilaire calcificaties werd geëxtraheerd voor verdere analyse. Daarnaast zijn er verkalkingen in de dalende aorta die wijzen op atherosclerose (pijlpunt)

Uitlezingen met adapterclip en gefilterde basiskwaliteit werden taxonomisch weggegooid met MALT [19] tegen de volledige NCBI Nucleotide-database ("nt", april 2016). In dit proces kunnen 3.515.715 reads, of 95% van de metagenomische reads, worden toegewezen aan taxa in de database. Visuele analyse van het metagenomische profiel in MEGAN6 [20] onthulde dat de meeste van deze metingen, 2.833.403 of 81%, waren toegewezen aan Homo sapiens. Nog eens 1724 reads werden toegewezen aan de Mycobacterium tuberculosis complexe (MTBC) knoop. Belangrijk is dat er geen andere taxa in het geslacht zijn Mycobacterium werden geïdentificeerd, en het enige andere geïdentificeerde bacteriële taxon was Ralstonia solanacearum (Fig. 2a), een in de bodem levende plantpathogeen die vaak wordt geïdentificeerd in metagenomische profielen van archeologische monsters [22, 23] (aanvullend bestand 1).

Screening van sequentiegegevens van LUND1 toont behoud van gastheer- en pathogeen-DNA. een Kronaplots die de metagenomische samenstelling van de longknobbel weerspiegelen. De meeste sequentielezingen waren afgestemd op: Homo sapiens (N = 2.833.403), wat uitgebreide conservering van gastheer-DNA aantoont. Een klein deel van de uitlezingen was afgestemd op bacteriële organismen en 80% van deze uitlezingen werd toegewezen aan het MTBC-knooppunt (N = 1724). B Schadeplots gegenereerd door sequencing-uitlezingen die rechtstreeks zijn toegewezen aan een gereconstrueerd MTBC-vooroudergenoom [21], wat een patroon aantoont dat kenmerkend is voor oud DNA

Voorverwerkte uitlezingen werden toegewezen aan zowel het hg19 menselijke referentiegenoom als een gereconstrueerde MTBC-voorouder (TB-voorouder) [21] met behulp van BWA zoals geïmplementeerd in de Efficient Ancient Genome Reconstruction (EAGER) pijplijn [24]. Reads uitgelijnd met hg19 met directe mapping vormden een indrukwekkende 88% van de totale sequencing-gegevens (aanvullend bestand 2). Menselijke mitochondriale besmetting was extreem laag, geschat op slechts 1-3% met behulp van Schmutzi [25] (aanvullend bestand 3). Lezingen werden ook toegewezen aan de TB-voorouder (tabel 1). Na filtering van kaartkwaliteit en leesdeduplicatie, werden 1458 gelezen, of 0,045% van de totale sequencinggegevens, uitgelijnd met de referentie (tabel 1) en vertoonden cytosine-naar-thymine-schadepatronen die indicatief zijn voor authentiek oud DNA (Fig. 2b) [ 26, 27]. Kwalitatieve bewaring van het tuberculose-DNA was iets beter dan die van het menselijk DNA, omdat de schade bij laatstgenoemde groter was (Aanvullend bestand 2). Contaminatie op laboratoriumbasis, zoals gecontroleerd door negatieve controles tijdens de extractie- en bibliotheekvoorbereidingsprocessen, kan worden uitgesloten als de bron van dit DNA (aanvullend bestand 4).

Genomische verrijking en reconstructie

Vanwege het duidelijke maar weinig overvloedige MTBC-signaal, werd een uracil-DNA-glycosylase (UDG) -bibliotheek geconstrueerd om DNA-laesies veroorzaakt door hydrolytische deaminering van cytosineresiduen [28] te verwijderen en verrijkt met een in-oplossing capture [29, 30] ontworpen om doelgenoombrede gegevens die de volledige diversiteit van de MTBC vertegenwoordigen (zie de sectie "Methoden"). De capture-probes zijn gebaseerd op een gereconstrueerd TB-vooroudergenoom [21]. De verrijkte bibliotheek werd gesequenced met behulp van een gepaarde, 150-cyclus Illumina-sequencingkit om een ​​volledige fragmentlengteverdeling te verkrijgen (Fig. S1 in aanvullend bestand 3). De resulterende sequentiegegevens werden vervolgens uitgelijnd met het hypothetische TB-vooroudergenoom [21], en de mappingstatistieken werden vergeleken met die van de screeninggegevens om verrijking te beoordelen (tabel 1). Verrijking verhoogde het aandeel endogene MTBC-DNA-inhoud met drie ordes van grootte, van 0,045 tot 45,652%, en diepe sequencing leverde genoombrede gegevens op met een gemiddelde dekking van ongeveer 141,5-voudig. De toegewezen reads hebben een gemiddelde fragmentlengte van

We hebben de kwaliteit van het gereconstrueerde genoom verder geëvalueerd door het aantal heterozygote posities te kwantificeren (zie de sectie "Methoden"). Afgeleide allelen vertegenwoordigd door 10-90% van de metingen die een bepaalde positie bestrijken met vijf of meer metingen van dekking, werden geteld. Slechts 24 heterozygote sites werden geteld over alle variantposities in LUND1. Ter vergelijking: de andere hoge dekking (

125-voudig) oud genoom dat hier is opgenomen - body92 van Kay et al. [6] - bevatte 70 heterozygote posities.

Fylogenie en dating

Voorlopige fylogenetische analyse met behulp van naburig samenvoegen (Fig. S2 en S3 in aanvullend bestand 3), maximale waarschijnlijkheid (figuren S4 en S5 in aanvullend bestand 3) en maximale spaarzaamheidsbomen (figuren S6 en S7 in aanvullend bestand 3) gaven aan dat LUND1 groepen binnen de L4-stamdiversiteit van de MTBC, en meer specifiek binnen de L4.10/PGG3-sublijn. Deze sublijn werd onlangs door Stucki en collega's gedefinieerd als de clade die L4.7, L4.8 en L4.9 bevat [31] volgens de algemeen aanvaarde Coll-nomenclatuur [32]. Hierna hebben we twee datasets geconstrueerd om moleculaire datering van de volledige MTBC (aanvullend bestand 5) en L4 van de MTBC (aanvullend bestand 6) te ondersteunen.

De dataset die de bestaande diversiteit van de MTBC weerspiegelt, werd samengesteld zoals elders gerapporteerd [5], met zes oude genomen als kalibratiepunten. Deze omvatten LUND1 twee extra oude genomen, body80 en body92, gewonnen uit laat 18e en vroege 19e-eeuwse Hongaarse mummies [6] en drie door mensen geïsoleerde Mycobacterium pinnipedii stammen uit Peru [5], die alle beschikbare oude m. tuberculose genomen met voldoende dekking om SNP's met vertrouwen aan te roepen na stringente mapping met BWA [33] (zie de sectie "Methoden" Aanvullend bestand 5). Mycobacterium canettii werd gebruikt als een outgroup. Bij het genereren van een uitlijning van variantposities in deze dataset, hebben we repetitieve regio's en regio's die het risico lopen op cross-mapping met andere organismen zoals eerder gedaan [5] uitgesloten, evenals mogelijk geïmporteerde locaties van recombinatiegebeurtenissen, die werden geïdentificeerd met ClonalFrameML [34] ] (Extra bestand 7). We hebben ervoor gekozen om deze potentiële recombinante sites uit te sluiten ondanks: m. tuberculose algemeen erkend als een grotendeels klonaal organisme zonder recombinatie of horizontale genoverdracht, aangezien deze verschijnselen zijn gevonden in m. canettii [35, 36]. Slechts drieëntwintig variantsites gingen verloren van de volledige MTBC-uitlijning als potentiële import. We noemden in totaal 42.856 variabele posities in de dataset zoals uitgelijnd met het TB-vooroudergenoom. Nadat onvolledig weergegeven sites waren uitgesloten, werden 11.716 overgedragen voor downstream-analyse. Voorafgaand aan het uitvoeren van de Bayesiaanse moleculaire dateringsanalyse, hebben we de dataset beoordeeld op klokachtige structuur met TempEst (R 2 = 0.273 zie de sectie “Methoden” Fig. S8 in Aanvullend bestand 3).

Om de impact van het geselecteerde boom-voor- en klokmodel te onderzoeken, hebben we meerdere variaties van modellen gebruikt zoals beschikbaar voor gebruik in BEAST2 [37]. We gebruikten eerst zowel een strikt als een ontspannen klokmodel samen met een constant coalescentiemodel (CC+strict, CC+UCLD). We ontdekten dat er een minimaal verschil was tussen de afgeleide percentages die door de twee modellen werden geschat. Deze bevinding, naast de lage snelheidsvariantie die in alle modellen wordt geschat, suggereert dat er weinig snelheidsvariatie is tussen bekende takken van de MTBC. Toch bleek de ontspannen klok iets beter te presteren (tabel 2). Om te experimenteren met modellen die dynamische populaties mogelijk maakten, pasten we een Bayesiaanse skyline-coalescentie (SKY+UCLD) en geboorte-dood-horizon prior (BDSKY+UCLD) toe in combinatie met een ontspannen klokmodel. In het BDSKY+UCLD-model werd de boom geconditioneerd op de wortel. In een eerdere studie gebruikten Kühnert en collega's geboorte-dood-boomprioriteiten om twee moderne tuberculose-uitbraken te onderzoeken [38]. Voor zover wij weten, is deze studie de eerste die een geboorte-dood-boom gebruikt voordat de evolutionaire dynamiek van de MTBC wordt afgeleid, terwijl oude gegevens worden gebruikt voor tipkalibratie. Het BDSKY + UCLD-model had de hoogste marginale waarschijnlijkheidswaarde van alle modellen die op deze dataset waren toegepast (tabel 2).

Een gekalibreerde maximale clade credibility (MCC)-boom werd gegenereerd voor het BDSKY+UCLD-model, met 3258 jaar voor heden (BP) (95% hoogste posterieure dichtheid [95% HPD]-interval, 2190-4501 BP) als geschatte datum van opkomst voor de MTBC (Fig. 3a). Boomtopologie komt overeen met eerder gepresenteerde fylogenetische analyses van de volledige MTBC [3, 5, 39].Om de betekenis van onze oude tipkalibraties te testen, hebben we een datumrandomisatietest van dit model uitgevoerd waarin we de tipdatums tien keer willekeurig tussen de genomen in de dataset hebben geschud en de kloksnelheidsschattingen met de gerandomiseerde modellen vergeleken met die van de " true” BDSKY+UCLD-model voor de MTBC-dataset [40, 41]. Voor deze dataset veroorzaakte het schudden van de tip een extreem langzame convergentie. Hoewel slechts vier van de tien gerandomiseerde modellen een ESS van meer dan 200 bereikten voor de kloksnelheidsparameter, bereikten alle randomisaties een ESS van 100 of meer met gecombineerde ketenlengtes van meer dan 1.000.000.000 (aanvullend bestand 10). Datumrandomisaties worden geëvalueerd op basis van twee criteria van verschillende strengheid: (i) de schatting van de gemiddelde frequentie van de randomisatie valt niet binnen het 95% HPD-interval van het oorspronkelijke model, of (ii) het 95% HPD-interval van de randomisatie valt niet overlap met die van het oorspronkelijke model [40]. Alle randomisaties voor de MTBC-dataset voldeden aan de strengere criteria ii, wat aangeeft dat de tipkalibraties van de oude genomen onze resultaten stevig hebben geïnformeerd (aanvullend bestand 10 Fig. S9 in aanvullend bestand 3).

MTBC maximale clade geloofwaardigheid boom. Deze MCC-boom van gemiddelde hoogten werd gegenereerd op basis van het BDSKY + UCLD-model zoals toegepast op de volledige MTBC-gegevensset. Lineages zijn gelabeld aan de rechterkant. De oude genomen worden aangegeven met rode sterretjes en aan de zijkant gelabeld met hun monsternamen. De outgroup wordt gelabeld als "m. canettii.” De 95% HPD-intervallen van de hoogten van knooppunten die voorouderlijk zijn voor elke afstamming, worden aangegeven als (ondergrens-bovengrens) in jaren vóór heden. Voorouderlijke knooppunten worden gemarkeerd door een cirkel die is gekleurd om overeen te komen met het afstammingslabel. De tijdschaal wordt uitgedrukt als jaren vóór heden, met de meest recente tijd als 2010. De bijbehorende skyline-plot is te vinden in Fig. S10 in aanvullend bestand 3

De L4-dataset bevat LUND1 en de twee hierboven beschreven Hongaarse mummies [6] als kalibratiepunten. We selecteerden 149 moderne genomen die representatief zijn voor de bekende diversiteit van L4 uit eerder gepubliceerde datasets (Additional File 3) [3, 21, 31]. Een modern Lineage 2 (L2) genoom werd gebruikt als outgroup. Na de uitsluiting van sites zoals hierboven besproken (aanvullend bestand 8), omvatte een SNP-uitlijning van deze genomen met betrekking tot het gereconstrueerde TB-vooroudergenoom [21] in totaal 17.333 variantposities, exclusief posities die uniek zijn voor de L2-outgroup. Slechts vijftien variantsites gingen verloren door de uitlijning van de L4-dataset. Nadat sites die ontbraken in enige uitlijning in de dataset waren uitgesloten van stroomafwaartse analyse, bleven 10.009 SNP's over voor fylogenetische gevolgtrekking. In LUND1 werden in totaal 810 SNP's geïdentificeerd, waarvan 126 uniek waren voor dit genoom. Op deze afgeleide posities is vervolgens een SNP-effectanalyse [42] uitgevoerd (Aanvullend bestand 3 aanvullend bestand 9). We hebben ook de L4-dataset beoordeeld op klokachtige structuur met TempEst (R 2 = 0,113 zie de sectie “Methoden” Fig. S9 in Aanvullend bestand 3).

We hebben dezelfde modellen toegepast als hierboven beschreven voor de volledige MTBC-dataset, met de toevoeging van een geboorte-dood-horizonmodel dat is gebaseerd op de oorsprong van de wortel (BDSKY+UCLD+oorsprong). Alle gemiddelde boomhoogten liggen binnen 250 jaar van elkaar en de 95% HPD-intervallen overlappen elkaar grotendeels. De BDSKY+UCLD- en BDSKY+UCLD+origin-modellen tonen de hoogste marginale waarschijnlijkheidswaarden na opstapsteekproeven. We hebben het BDSKY + UCLD + origin-model gebruikt om te bepalen of de geschatte oorsprong van de L4-dataset overeenkwam met de schattingen van de boomhoogte voor de volledige MTBC-dataset. Intrigerend genoeg overlapt de geschatte oorsprongsparameter (Tabel 3), of de voorouder van de boomwortel, grotendeels met het 95% HPD-bereik voor MTBC-boomhoogte zoals te zien in Tabel 2.

Een gekalibreerde MCC-boom (Fig. 4) werd gegenereerd op basis van het BDSKY + UCLD-model voor de L4-dataset. Dit model leverde een geschatte opkomstdatum voor L4 op van 1445 BP (95% HPD, 929-2084 BP). De boom weerspiegelt de tien-sublineage-topologie gepresenteerd door Stucki en collega's [31], met LUND1-groepering met de L4.10/PGG3-sublineage. Door de relatief lage R 2-waarde voor de relatie tussen bemonsteringstijd en wortel-tot-puntafstand zoals berekend met TempEst, hebben we ook een datumrandomisatietest van het L4 BDSKY + UCLD-model uitgevoerd, waarbij we de bemonsteringsdatums willekeurig tussen alle genomen hebben geschud [40, 41 ]. We hebben tien randomisaties uitgevoerd en de resulterende kloksnelheidsschattingen vergeleken met die van het BDSKY + UCLD-model met de echte bemonsteringsdatums (tabel 3). Negen van de tien randomisaties voldeden aan het strengere criterium ii en vertoonden geen overlap tussen hun 95% HPD-intervallen en die van het origineel (aanvullend bestand 11 Fig. S12 in aanvullend bestand 3). Alle tien randomisaties voldeden aan criterium i (d.w.z. leverden een gemiddelde snelheidsschatting op die buiten het 95% HPD-interval van de snelheid van het model viel met behulp van echte temporele waarden).

L4 maximale clade geloofwaardigheidsboom. Deze MCC-boom van gemiddelde hoogten werd gegenereerd op basis van het BDSKY + UCLD-model zoals toegepast op de L4-dataset. Sublineages zijn gelabeld aan de rechterkant. De oude genomen worden aangegeven met rode sterretjes en gelabeld met hun monsternaam. De Lineage 2-outgroup, vertegenwoordigd door L2_N0020, is aan de zijkant gelabeld. Het 95% HPD-interval voor knooppunthoogte wordt weergegeven voor voorouderlijke knooppunten van elke sublijn als (ondergrens-bovengrens) in jaren vóór heden. Voorouderlijke knooppunten worden gemarkeerd door een cirkel die gekleurd is om overeen te komen met het sublijnlabel. De tijdschaal wordt uitgedrukt als jaren vóór heden, met de meest recente tijd als 2010. De bijbehorende skyline-plot is te vinden in Fig. S13 in aanvullend bestand 3


Een genoombrede analyse van multiresistente en extensief resistente stammen van Mycobacterium tuberculosis Peking genotype

Het Peking-genotype van Mycobacterium tuberculosis (MTB) is een van de meest succesvolle MTB-lijnen die zich in de wereld heeft verspreid. In China is het aantal multiresistente (MDR) tuberculose aanzienlijk hoger dan het wereldwijde gemiddelde, en de genotypestammen in Peking nemen het grootste deel van de MDR-stammen in beslag. Om de genetische basis te bestuderen van de epidemiologische bevindingen dat het Beijing-genotype vaak in verband wordt gebracht met tuberculose-uitbraken en resistentie tegen geneesmiddelen, hebben we de genoomsequenties bepaald van vier klinische isolaten: twee extensief geneesmiddelresistente (XDR1219, XDR1221) en twee multiresistente (WX1, WX3 ), met behulp van sequencing van het hele genoom. Een groot aantal individuele en gedeelde SNP's van de vier Peking-stammen werden geïdentificeerd. Onze isolaten herbergden bijna alle klassieke geneesmiddelresistentie-geassocieerde mutaties. De mutaties die verantwoordelijk zijn voor geneesmiddelresistentie in de twee XDR-stammen waren consistent met de klinische kwantitatieve geneesmiddelresistentieniveaus. COG-analyse onthulde dat Peking-stammen significant hogere abundanties hebben van de mutaties die verantwoordelijk zijn voor celwand/membraan/envelopbiogenese (COG M), secundaire metabolieten biosynthese, transport en katabolisme (COG Q), lipidentransport en metabolisme (COG I) en afweermechanismen (COG V). De gedeelde gemuteerde genen van de vier bestudeerde Peking-stammen waren significant oververtegenwoordigd in drie DNA-herstelroutes. Onze analyses bevorderen het begrip van het genoompolymorfisme van de Peking-familiestammen en bieden de moleculair genetische basis voor hun brede verspreidingscapaciteit en medicijnresistentie.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Analyse van de gehele genoomsequentie van multiresistente Mycobacterium tuberculosis Peking isoleert van een uitbraak in Thailand

De Mycobacterium tuberculosis De familie van Peking wordt vaak geassocieerd met multidrugresistentie en grote uitbraken. Conventionele genotyperingsstudie van een gemeenschapsuitbraak van multiresistente tuberculose (MDR-TB) die plaatsvond in de provincie Kanchanaburi, Thailand, werd uitgevoerd. Uit de studie bleek dat de uitbraak klonaal was en dat de stam werd geïdentificeerd als een lid van de familie van Peking. Hoewel de isolaten van de uitbraak identieke spoligotypering en mycobacteriële afgewisselde repetitieve eenheden-variabel aantal tandem herhalingen patronen vertoonden, werd een discrepantie met betrekking tot ethambutol-resistentie waargenomen. Diepgaande karakterisering van de isolaten door middel van volledige genoomsequencing van de eerste en de laatste drie isolaten uit onze kweekcollectie toonde aan dat ze behoorden tot de belangrijkste genetische groep 1, single nucleotide polymorphism (SNP) clustergroep 2, sequentietype 10. Vergeleken met de M. tuberculose H37Rv-referentiegenoom, 1242 SNP's werden vaak gevonden in alle isolaten. De genomen van deze isolaten bleken klonaal en zeer stabiel te zijn over een periode van 5 jaar en in elk van de laatste drie isolaten werden twee of drie unieke SNP's geïdentificeerd. Genen waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met geneesmiddelresistentie en hun promotorregio's, indien van toepassing, werden geanalyseerd. De aanwezigheid van lage of geen fitnesskostenmutaties voor resistentie tegen geneesmiddelen en een extra L731P SNP in de rpoB gen werd waargenomen in alle isolaten. Deze bevindingen kunnen de succesvolle overdracht van deze MDR-TB-stam verklaren.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Hoe maak je een volledige genoomanalyse van Multidrug-resistente Mycobacterium tuberculosis - Biologie?

Multiresistente tuberculose (MDR-tbc), pre-extensief resistente tuberculose (pre-XDR-tbc) en extensief resistente tuberculose (XDR-tbc) compliceren de ziektebestrijding. We analyseerden sequentiegegevens van het hele genoom voor 579 fenotypisch resistente geneesmiddelen M. tuberculose isolaten (28% van de beschikbare MDR/pre-XDR en alle kweekbare XDR TB-isolaten verzameld in Thailand gedurende 2014-2017). De meeste isolaten waren van lijn 2 (n = 482 83,2%). Clusteranalyse onthulde dat 281/579 isolaten (48,5%) 89 clusters vormden, waaronder 205 MDR TB, 46 pre-XDR TB, 19 XDR TB en 11 poly-resistente TB isolaten op basis van genotypische geneesmiddelresistentie. Leden van de meeste clusters hadden dezelfde subset van met geneesmiddelresistentie geassocieerde mutaties, die potentiële primaire resistentie bij MDR-tbc (n = 176/205 85,9%), pre-XDR-tbc (n = 29/46 63,0%) en XDR-tbc ( n = 14/19 73,7%). Dertien belangrijke clades waren significant geassocieerd met geografie (p<0.001). Clusters van klonale oorsprong dragen in hoge mate bij aan de hoge prevalentie van resistente tuberculose in Thailand.

Tuberculose (TB), veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis, is een groot mondiaal probleem voor de volksgezondheid. Zuidoost-Azië draagt ​​met name (44%) bij aan wereldwijde tbc-gevallen. Thailand staat in de top 30 van landen voor de incidentie van resistente (DR) tuberculose (1). DR TB, inclusief rifampicine-resistente TB en stammen met extra resistentie tegen isoniazide (multiresistente [MDR] TB), blijft een grote uitdaging voor de bestrijding van TB. In 2018 werden wereldwijd ≈500.000 nieuwe gevallen van rifampicineresistente tbc gemeld, waarvan 78% MDR-tbc was (1). Zorgwekkender is extensief medicijnresistente (XDR) TB, die verder resistentie vertoont tegen 1 fluorochinolon en 1 injecteerbaar tweedelijnsgeneesmiddel. Het gemiddelde aandeel van wereldwijde MDR-tbc-gevallen met XDR-tbc is 6,2% (1). In Thailand is het aantal gerapporteerde gevallen van MDR-tbc, ondanks de afnemende incidentie van tbc, in de periode 2014-2018 bijna verdubbeld (1) sommige zijn waarschijnlijk XDR TB. Behandeling voor patiënten met DR TB is langdurig en duur, en de resultaten zijn slecht.

Whole-genome sequencing (WGS) van M. tuberculose geeft inzicht in medicijnresistentie, waarbij mechanismen bijna uitsluitend betrekking hebben op mutaties (meestal single-nucleotide polymorphisms [SNPs], maar ook insertie/deleties) in genen die coderen voor medicijntargets of medicijnconverterende enzymen. WGS-gegevens kunnen ook inzicht geven in de transmissie en de datering van clusters (2), waarbij stammen met bijna identieke genetische varianten waarschijnlijk deel uitmaken van een transmissieketen (3). Analyse van M. tuberculose WGS-gegevens van isolaten in heel Thailand kunnen de broodnodige inzichten bieden in MDR/XDR TB-transmissie. Eerdere studies van DR TB hebben genotyperingstechnieken gebruikt (bijv. Spoligotypering, mycobacteriële afgewisselde repetitieve eenheid-variabele-nummer tandem-herhaling en restrictiefragmentlengtepolymorfisme) (4,5), maar deze methoden hebben een beperkte resolutie voor het afleiden van transmissie omdat ze <1% van de . onderzoeken M. tuberculose genoom. Een recente WGS-analyse onthulde mogelijke klonale overdracht van 4 MDR-TB-isolaten in de provincie Kanchanaburi (6). De omvang van MDR-tbc- en XDR-tbc-clusters in Thailand is echter onbekend. Ons doel was om de clusteringspatronen en risicofactoren van mogelijke MDR TB, pre-XDR TB en XDR TB transmissieclusters in Thailand te onderzoeken met behulp van WGS-gegevens.

Methoden:

Studiepopulatie en omgeving

In 2014-2017 waren er in totaal 2.071 M. tuberculose door kweek bevestigde gevallen van MDR-tbc, pre-XDR-tbc en XDR-tbc werden vermeld in de laboratoriumgegevens van het National Tuberculosis Reference Laboratory (NTRL Ministry of Public Health) en Siriraj Hospital, Mahidol University, Thailand. Deze 2 laboratoria bestrijken 230 ziekenhuizen die de meeste DR-tbc-gevallen in Thailand behandelen (bijlage 1 tabellen 1, 2) (7). We hebben willekeurig 547 . geselecteerd M. tuberculose isolaten van MDR-tbc en pre-XDR-tbc-gevallen in 6 regio's en 71 van de 77 provincies op nationaal niveau. We hebben ook alle opvraagbare (n = 32) XDR-tbc-isolaten opgenomen (bijlage 1 tabel 3). Voor 11 gevallen werden paren isolaten gebruikt die op verschillende tijdstippen waren verzameld als interne controles voor SNP-afstanden. In elk controlepaar namen we het isolaat op met de meeste mutaties die verband houden met geneesmiddelresistentie of het chronologisch eerdere isolaat in de bestudeerde populatie (n = 579). We haalden demografische gegevens uit laboratoriumrecords. Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door het Centre for Ethics in Human Research, Khon Kaen University (goedkeuringsnr. HE601249).

Fenotypische gevoeligheidstests voor geneesmiddelen

We hebben fenotypische drug-susceptibility testing (DST) uitgevoerd met behulp van de standaard agar proportionele methode in Lowenstein-Jensen medium (8). Gebruikte geneesmiddelconcentraties waren 0,2 g/ml voor isoniazide 40,0 g/ml voor rifampicine, ethionamide, capreomycine en cycloserine 2,0 g/ml voor ethambutol, ofloxacine en levofloxacine 4,0 g/ml voor streptomycine 30,0 g/ml en 0,5 μg/ml voor kan ml voor para-aminosalicylzuur. We gebruikten M. tuberculose H37Rv als de gevoelige referentiestam.

Analyse van hele genoomsequenties

We gebruikten meerdere lussen van M. tuberculose kolonies voor genomische DNA-extractie (met de cetyl-trimethyl-ammoniumbromide-natriumchloride-methode) (9). WGS-gegevens voor 590 M. tuberculose isolaten werden geproduceerd door NovogeneAIT (//en.novogene.com) met behulp van het HiSeq (Illumina, https://www.illumina.com) platform dat 150-bp gepaarde-end-uitlezingen genereert. We hebben de kwaliteit van sequentielezingen gecontroleerd met FastQC-versie 0.11.7 (10). We hebben hoogwaardige metingen van elk isolaat in kaart gebracht op het H37Rv-referentiegenoom (GenBank-toegangsnummer NC_000962.3) met behulp van BWA-MEM-versie 0.7.12 (Li H, unpub. data, https://arxiv.org/abs/1303.3997 ). De gemiddelde diepte van de sequencingdekking was hoog (341,01 ± 61,98). We gebruikten SAMtools versie 0.1.19 (11) en GATK-versie 3.4.0 (12) om SNP's en invoegingen/verwijderingen aan te roepen. We hebben varianten gefilterd op basis van een minimale dekkingsdiepte van 10 keer en Q20 minimale base-call kwaliteitsscore, en de intersectieset van GATK- en SAMtools-varianten werd behouden. We gebruikten de online tool TB-Profiler versie 2.8.6 (13,14) om resistentie tegen geneesmiddelen af ​​te leiden en M. tuberculose afstammingslidmaatschap op basis van SNP's uit de WGS-gegevens. De WGS-gegevens zijn beschikbaar in het ENA Sequence Read Archive (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home) (toegangsnummers PRJNA598981 en PRJNA613706).

Fylogenetische analyse

We hebben een fylogenetische boom geconstrueerd op basis van 26.541 zeer betrouwbare SNP's onder 590 isolaten met behulp van de maximum-waarschijnlijkheidsmethode met het geselecteerde algemene tijdomkeerbare met gamma-distributiemodel, geïmplementeerd in MEGA-versie 10.1 (15). We hebben de 130 SNP's waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met DR TB die in deze studie zijn gevonden, uitgesloten om ervoor te zorgen dat ze de fylogenetische analyse niet zouden beïnvloeden. We hebben een bootstrap-consensusboom afgeleid uit 1.000 replica's. We produceerden het fylogenetische boombeeld met behulp van iTOL (16).

Gegevensanalyse

Isolaten die monofyletische groepen vormden waarin veel of alle paren van elkaar verschilden met <. 25 SNP's werden in dezelfde clade geplaatst. Clusters omvatten isolaten die verschillen met 0-11 SNP's. We beschouwden leden van een enkele cluster als mogelijk afstammend van een enkele kloon door recente overdracht. Minder recent overgedragen isolaten binnen een clade verschilden met 12-25 SNP's. We berekenden het clusteringspercentage als (aantal clustering isolaten/totaal aantal isolaten) × 100. We onderscheiden isolaten met verworven DR TB van mogelijke primaire DR TB (MDR TB, pre-XDR TB en XDR TB) isolaten op basis van verwerving van extra resistentie-geassocieerde mutaties, met name die geassocieerd met resistentie tegen fluoroquinolonen, kanamycine of capreomycine, geneesmiddelen die worden gebruikt voor DR TB-classificatie. Voor clusters die isolaten met verschillende soorten DR TB bevatten (zoals MDR TB en XDR TB), gebruikten we de verwerving van aanvullende geneesmiddelresistentie SNP's en co-voorouderlijke relaties om onderscheid te maken tussen 2 patronen van verworven resistentie: chronologisch (voorouderlijke stam had minder mutaties, minder type DR, of beide) of niet-chronologisch (voorouderlijke stam had meer mutaties, sterker type DR, of beide). Hoewel XDR TB en pre-XDR TB kunnen worden beschouwd als subsets van MDR TB, hebben we alle 3 als afzonderlijke categorieën behandeld in onze analyses.

We analyseerden alle gegevens met behulp van R statistische softwareversie 3.6.1 (https://www.r-project.org) en beschouwden p-waarden <0.05 als statistisch significant. We analyseerden associaties tussen clades/clusters en geografie met behulp van χ 2 tests en visualiseerden ze met het R-pakket vcd versie 1.4–8. We berekenden odds ratio's (OR's) met 95% CI's met behulp van het R-pakket epiR-versie 1.0-4. We hebben factoren getest die verband houden met het clusteren van isolaten met behulp van de Student t-test (numerieke gegevens), χ 2-test of Fisher exact-test (categorische gegevens), indien van toepassing. We construeerden grafieken met behulp van het R-pakket ggplot2 versie 3.2.1 en bouwden phylo-maps met behulp van het pakket phytools versie 0.7-20.

Resultaten

Studiepopulatie en kenmerken

Figuur 1. Geografische en afstammingsverdeling van 579 resistente geneesmiddelen Mycobacterium tuberculosis isolaten in Thailand, 2014-2017. A) Geografische spreiding van MDR TB, pre-XDR TB en XDR TB. B) Afstammingsverdeling van resistente .

De meeste (466 80,5%) van de 579 door kweek bevestigde DR-tbc-gevallen in de onderzochte populatie waren MDR-tbc, gevolgd door 81 pre-XDR-tbc (14,0%) (bijlage 1 tabel 2). We hebben alle beschikbare XDR-tbc-isolaten (n = 32) opgenomen, die 5,5% van onze monsters uitmaken, maar slechts 1,5% van de door kweek bevestigde 2.071 DR-tbc-isolaten die in de periode 2014-2017 nationaal zijn verzameld. De centrale en noordoostelijke regio's van Thailand hadden de hoogste percentages DR TB (Figuur 1).De 3 provincies met het hoogste aantal DR-tbc-gevallen waren Bangkok (n = 85 14,7%), Kanchanaburi (n = 51 8,8%) en Chonburi (n = 37 6,4%) (Figuur 1 Bijlage 1 Tabel 3). De meeste patiënten waren man (n = 419 73,1%) en de gemiddelde leeftijd was 43,5 (±14,7) jaar (bijlage 1 tabel 4).

Fylogenetische analyse

Figuur 2. Fylogenetische boom voor de 590 geneesmiddelresistente Mycobaterium tuberculoseisolaten uit Thailand, 2014-2017. Van binnen naar buiten: op cultuur gebaseerde fenotypische geneesmiddelgevoeligheidstest, op hele genoomsequencing gebaseerd geneesmiddelresistentieprofiel (DR TB, MDR.

Meeste van de M. tuberculose isolaten behoorden tot de Oost-Aziatische lijn (lijn 2) (n = 482 83,2%), gevolgd door de Indo-Oceanische lijn (lijn 1) (n = 67 11,6%), de Euro-Amerikaanse lijn (lijn 4) (n = 29 5,0%), en de Oost-Afrikaans-Indische afstamming (afstamming 3) (n = 1 0,2%) (Figuur 2 Bijlage 1 Tabel 5). Lineage 2.2.1 (n = 413 71,3%) was de belangrijkste sublineage onder MDR, pre-XDR en XDR TB.

Clustering en mogelijke transmissieclusters

Figuur 3. Geografische spreiding van 13 belangrijke clades van resistente tuberculose in Thailand. A) De 13 clades zijn gemarkeerd in de buitenste cirkel. Schaalbalk geeft de genetische afstand aan die evenredig is aan de.

De fylogenetische boom (Figuur 2) vertoonde een enorme diversiteit onder de DR TB-isolaten uit Thailand. Veel isolaten waren verschillend en verschilden van alle andere met een gemiddelde ± SD van 657 ± 626 SNP's. De meeste isolaten (n = 319 55,1%) waren gegroepeerd in 13 clades, elk bestaande uit 5-86 isolaten (Figuur 3 Bijlage 2 Figuur 1). De clades 1, 6, 11 en 13 bestonden elk uit een enkele kleine cluster van nauw verwante isolaten. De overige clades omvatten > 1 mogelijke clusters (bijlage 2, figuur 2). De isolaten die in elke clade waren gegroepeerd, waren significant geassocieerd met een bepaalde geografische regio (p<0,001 bijlage 2, figuur 3, paneel A). Clade 1 (Figuur 3, paneel B) werd alleen gevonden in de provincie Trat en clade 13 overheerste in Kanchanaburi (Figuur 3, paneel N).

Figuur 4. Alle clusters van DR TB-isolaten uit Thailand. A) In de buitenste cirkel zijn in totaal 89 clusters gemarkeerd. Schaalbalk geeft de genetische afstand aan die evenredig is aan het totaal.

In totaal bevatten 89 clusters 281 isolaten (48,5%) (bijlage 1 tabel 6). Zestig clusters (isolaten die 11 SNP's verschillen), met 2-34 isolaten, vielen binnen de belangrijkste clades. Elders in de boom kwamen nog 29 kleinere clusters voor. De meeste isolaten binnen een cluster deelden geografische links (Figuur 4, panelen A–F Bijlage 1 Tabel 6). De percentages MDR-tbc, pre-XDR-tbc en XDR-tbc-isolaten (gebaseerd op fenotypische zomertijd) die in clusters vielen, waren 46,1% (215/466) voor MDR-tbc, 49,4% (40/81) voor pre-XDR-tbc, en 81,3% (26/32) voor XDR TB (bijlage 1 tabel 6). Paarsgewijze SNP-afstanden binnen en tussen elk van de 89 clusters worden samengevat weergegeven (bijlage 1 tabel 7).

Sommige clusters omvatten isolaten met verschillende soorten DR-TB. Negentien van de 89 clusters (C2, C7, C10, C16, C22, C36, C37, C40, C43, C49, C59, C60, C63, C70, C72, C76, C80, C83 en C89) hadden een chronologisch patroon gebaseerd over de progressieve toename van het aantal DR-mutaties van de basis tot de uiteinden in de fylogenie (bijlage 1 tabel 8). Het patroon van DR-mutatieveranderingen was niet-chronologisch in clusters C21, C23, C32, C35, C41, C55, C71 en C75. Van de 281 clustering isolaten werd 81,9% geclassificeerd als mogelijke primaire DR TB (n = 230), inclusief MDR TB (n = 176/205 85,9%), pre-XDR TB (n = 29/46 63,0%) en XDR TB (n = 14/19 73,7%). Daarnaast identificeerden we 10 fenotypische MDR-isolaten en 1 fenotypisch pre-XDR TB-isolaat als mogelijke voorbeelden van primaire isoniazideresistentie (n = 11) op basis van genotypische DR. Andere clustering isolaten (n = 51/281, 18,1%) vertoonden verworven DR TB (MDR TB [n = 29/205 14,1%], pre-XDR TB [n = 17/46 37,0%] en XDR TB [n = 5/19 26,3%]) (Tabel 1).

Onder geclusterde isolaten was er enige discrepantie tussen fenotypische DST-bevindingen (MDR TB [n = 215], pre-XDR TB [n = 40] en XDR TB [n = 26]) en genotypische DST-resultaten (poly-DR TB [ n = 11], MDR TB [n = 205], pre-XDR TB [n = 46] en XDR TB [n = 19]) (bijlage 1 tabel 8). We identificeerden 11 isolaten van fenotypisch MDR TB genotypisch als poly-DR TB (resistent tegen >1 geneesmiddel maar niet tegen zowel isoniazide als rifampicine). We identificeerden 66 MDR TB, 9 pre-XDR TB en 10 XDR TB clusters op basis van fenotypische DST (Bijlage 1 Tabel 9 Bijlage 2 Afbeelding 4, panelen A–F). De meeste clusters van pre-XDR tbc en XDR tbc hadden ziekenhuisgebaseerde koppelingen (bijlage 1 tabel 9). Alle fenotypische DR TB-clusters en resistentietypes, gestratificeerd per provincie, worden weergegeven (bijlage 1 tabel 10).

Factoren die verband houden met mogelijke DR TB-transmissieclusters

TB-patiënten van wie clustering isolaten werden verkregen hadden een gemiddelde leeftijd van ≈42 jaar. Isolaten die binnen clusters vallen, waren significant geassocieerd met geografische regio's (p = 0,001 Bijlage 2 Afbeelding 3, paneel B). Patiënten met tbc die in westelijke provincies woonden, hadden een hoger risico om binnen mogelijke DR tbc-overdrachtsclusters te zijn dan die elders (OR 2,44, 95% BI 1,53-3,89 tabel 2). Afstamming 2.2.1 (versus andere afstammingen) was geassocieerd met een hoger risico op mogelijke DR TB-transmissieclusters (OR 3,59, 95% BI 2,42-5,32). Lijn 1 had het laagste risico om vertegenwoordigd te zijn in DR TB-transmissieclusters (OR 0,03, 95% CI 0,01-0,11). Clustering isolaten hadden geneesmiddelresistentie-mutaties zoals: katG S315T, rpoB S450L, en embB G406D (Tabel 2).

Discussie

MDR-tbc en XDR-tbc zijn ernstige wereldwijde problemen, maar weinig studies hebben zich gericht op de overdracht ervan met een landelijke resolutie. Thailand heeft een hoge last van MDR-tbc en een toenemend aantal gevallen van MDR-tbc (1). We hebben in de periode 2014-2017 579 DR TB-isolaten in 71 provincies ingekocht. Bijna de helft hiervan bevond zich in mogelijke transmissieclusters, meestal met M. tuberculose afstamming 2.2.1. In totaal 89 clusters, de meeste verdeeld over 13 grote clades, droegen bij aan multiklonale uitbraken van MDR-tbc in specifieke regio's in Thailand. Bangkok, Kanchanaburi en Chonburi waren de provincies met de hoogste percentages MDR-tbc, pre-XDR-tbc en XDR-tbc-clusters (d.w.z. groepen isolaten die verschillen met < 11 SNP's). We hebben 2 criteria gebruikt om SNP-grenswaarden te selecteren. Ten eerste werd de < 11 SNP-verschilgrenswaarde voor een cluster rechtstreeks afgeleid van het maximale aantal verschillen tussen de 11 gepaarde isolaten die als interne controle werden gebruikt. Ten tweede gebruikten we een SNP-grenswaarde die overeenkwam met, of strenger was dan die in eerdere onderzoeken (1720). Onze 11-SNP-grenswaarde was proportioneel 0,0004 van de 26.541 SNP's in onze totale set. Dit aandeel kwam overeen met dat in een eerder onderzoek (21), en strenger dan die in andere onderzoeken (18,20). Een <12-SNP-grenswaarde is eerder voorgesteld als de bovengrens voor mogelijke clustertransmissiegebeurtenissen (2).

Fylogenetische analyse identificeerde 13 belangrijke clades, elk geassocieerd met een bepaalde regio ('s). Paarsgewijze SNP-verschillen tussen isolaten binnen clades varieerden van <11 tot ≈25, wat wijst op een reeks divergentietijden van een gemeenschappelijke voorouder (bijlage 2, figuur 2). Op basis van de transmissietijdschattingen (0,5 SNP/genoom/jaar) voor M. tuberculose (2), zijn sommige van deze belangrijke clades misschien 20-40 jaar geleden in Thailand begonnen te circuleren, andere meer recentelijk. Isolaten die 12-25 SNP's verschillen, deelden niettemin vaak geografische links. Bijvoorbeeld, 17 van de 21 (81%) isolaten in clade 7 (Figuur 3, paneel H), die paarsgewijze verschillen hadden die wijzen op een relatief niet-recente gemeenschappelijke voorouder, bevonden zich in naburige provincies van Zuid-Thailand. Clades 1, 6, 11 en 13 bestonden elk uit isolaten die bij zeer weinig SNP's verschilden, wat ons het vertrouwen gaf dat dit waarschijnlijke voorbeelden waren van recente overdracht. Toch kwamen isolaten in clade 6 vaak voor in verschillende provincies.

De grootste en meest recente clade was clade 13 (Figuur 3, paneel N), bestaande uit 62 gevallen (46 MDR TB, 11 pre-XDR TB en 5 XDR TB op basis van fenotypische DST) gevonden in de westelijke regio, vooral in Kanchanaburi. Deze bevinding suggereert dat klonen van pre-XDR TB en XDR TB kunnen voortkomen uit recente MDR TB-voorouders. We hebben een eerder bericht bevestigd (22) dat er een grote MDR-tbc-uitbraak was in Kanchanaburi. Bovendien is clade 13 de zus van clade 12, die bestaat uit stammen die zich zowel in centraal (vooral Bangkok) als in het noordoosten van Thailand verspreiden en die minder recent overgedragen stammen bevatten. Daarom was de clade voor de uitbraak van MDR-tbc in Kanchanaburi afgeleid van een minder recent overgedragen clade elders in Thailand.

We identificeerden 89 clusters (isolaten in elk verschillend met < 11 SNP's) van DR TB in Thailand. De geclusterde isolaten vertoonden een sterke associatie met de geografische regio. De grootste cluster (C89), binnen clade 13 in Kanchanaburi, omvatte 34 isolaten (27 MDR TB en 7 pre-XDR TB op basis van fenotypische DST). In Zuid-Afrika toonde WGS-analyse van een groot XDR-tbc-cohort (>400 gevallen) uit een enkele provincie aan dat slechts 30% van de deelnemers duidelijke epidemiologische banden had (persoon-persoon of ziekenhuisband): 70% van de transmissiegebeurtenissen kan het gevolg zijn van toevallige contact tussen onbekenden van elkaar (23). Een andere studie in Zuid-Afrika toonde aan dat 19% van de XDR-tbc-patiënten die uit het ziekenhuis werden ontslagen, secundaire XDR-tbc-gevallen in de gemeenschap veroorzaakte (24). Hier vonden we 9 clusters van pre-XDR TB (de grootste met 7 isolaten) en 10 clusters (de grootste met 4 isolaten) van XDR TB in Thailand (Bijlage 1 Tabel 9 Bijlage 2 Figuur 4).

Om de omvang van de DR-tbc-uitbraak in Thailand weer te geven, hebben we het aandeel isolaten berekend dat in de 89 DR-tbc-clusters valt (tabel 1). In sommige clusters vertoonden isolaten verschillende soorten DR TB geassocieerd met chronologie, wat de progressie van DR-mutaties in de fylogenie onthulde, van de voorouder naar de toppen van de boom (bijlage 1 tabel 8). Op basis van analyse van mutatie-acquisitie binnen deze fylogenie, zagen we voorbeelden van mogelijke primaire resistentie in 85,9% van de MDR-tbc, 63,0% van de pre-XDR-tbc en 73,7% van de gevallen van XDR-tbc. Acht clusters omvatten isolaten met verschillende soorten DR en meer resistentie-geassocieerde mutaties in de voorouderlijke stam dan in zijn nakomelingen. Deze situatie kan worden verklaard door de verschillende duur van de latentiefase die optreedt na transmissiegebeurtenissen, wat leidt tot het ontstaan ​​van minder lastige DR-tbc-gevallen (zoals MDR-tbc) later dan de meer lastige gevallen (zoals XDR-tbc) (25). Omdat niet alle gevallen uit de mogelijke transmissieketen konden worden opgenomen, kan er sprake zijn van niet-gedetecteerde primaire resistentie. Gegevens van alle DR-tbc-gevallen in de gemeenschap en informatie over de behandelingsgeschiedenis en bekende blootstelling zijn nodig om de omvang van primaire DR-tbc nauwkeurig en volledig in te schatten. Het aandeel primaire DR-tbc-gevallen zou hoger kunnen zijn omdat we aantallen MDR-tbc-gevallen hebben gerapporteerd, exclusief pre-XDR-tbc en XDR-tbc (die elk als een afzonderlijke subset werden gerapporteerd). Bovendien zijn sommige indexgevallen mogelijk niet opgenomen in de geselecteerde populatie.

Eerder gerapporteerde factoren die bijdragen aan de overdracht van MDR-tbc zijn onder meer het gebruik van illegale drugs (26) vertraagde tbc-diagnose en ouder zijn dan 45 jaar (18) en single zijn, een laag inkomen hebben, vaak last hebben van stress en andere ziekten, en geen medische verzekering hebben (27). Lineage 2 overheerste in eerdere onderzoeken naar de overdracht van MDR-tbc (18,26,28). We ontdekten dat infectie met lijn 2.2.1 de sterkste voorspeller (3,6-voudig) is van DR TB-clusters, terwijl infectie met lijn 1 het laagste risico had. Wonen in de westelijke regio van Thailand verhoogde het risico op DR TB-clusters met een factor 2,4. De westelijke regio, die dicht bij de grens met Myanmar ligt, verschilt van andere regio's van het land in termen van zowel etniciteit als economische ontwikkeling. Deze verschillen kunnen het verhoogde risico daar verklaren (29). Voorheen hadden clustering isolaten meer kans op mutaties van rpoB S450L (18,30), katG S315T, of de inhA promotor (31). We vonden ook een patroon van met geneesmiddelresistentie geassocieerde mutaties (katG S315T, rpoB S450L, embB G406D, rpsL K43R, ethA 639-640del, en folC S150G) in clusters.

De DR-tbc-situatie in Thailand is een grote zorg en vereist dringende implementatie van controlemaatregelen, zoals actieve opsporing van gevallen om de transmissieketen te verstoren en gerichte interventie en contactopsporing in hotspotregio's. Het sterftecijfer en de behandelingskosten van XDR-tbc zijn erg hoog (32) daarom moeten deze DR-typen de prioriteit hebben voor interventie. De grote omvang van sommige clusters weerspiegelt mogelijk hun hoge overdraagbaarheid (33) dus het volgen van clade 13 in Kanchanaburi zou een prioriteit moeten zijn. Naast de 13 grote clades werden in veel provincies verschillende kleine clusters van DR TB gevonden. Het potentieel voor uitbreiding van deze kleine clusters is onbekend. Hier hebben we ook de hotspotprovincies geïdentificeerd om te helpen bij het prioriteren van locaties voor interventie.

Wereldwijd zijn er maar weinig onderzoeken op landelijke schaal die gebruik hebben gemaakt van WGS-analyse van MDR-tbc, pre-XDR-tbc en XDR-tbc (26,30,3436). Oudere studies hebben botte genotyperingsinstrumenten gebruikt (bijv. IS6110 restrictiefragmentlengtepolymorfisme, spoligotypering en mycobacteriële afgewisseld repetitieve eenheid-variabele-nummer tandem-herhaling) met beperkte of handige steekproefgroottes. DR-tbc-onderzoeken met WGS in Saoedi-Arabië en Portugal hebben transmissieclusters van MDR-tbc aan het licht gebracht, maar ze hadden kleine steekproeven en leverden beperkte gegevens over epidemiologische verbanden (36,37). Als we uit onze bevindingen extrapoleren, kunnen primair-resistente tbc-stammen de belangrijkste bijdragen leveren aan het huidige wereldwijde probleem van hoge MDR-tbc- en XDR-tbc-prevalentie.

De belangrijkste beperkingen van ons onderzoek waren dat het retrospectief was in plaats van prospectief, het ontbrak aan sociaaleconomische gegevens voor analyse en het ontbrak aan fijnmazige gegevens over epidemiologische verbanden: mogelijke transmissieclusters werden alleen verondersteld op basis van de genetische afstanden tussen isolaten en het ziekenhuis en de provincie van elke patiënt. residentie. Bovendien kan een nauwkeurige schatting van het exacte tijdstip van de mogelijke transmissie niet worden gemaakt: clusters die jaren geleden zijn ontstaan, kunnen zich blijven verspreiden. We misten ook informatie over de behandelings- en blootstellingsgeschiedenis en over de volledige populatie om alle indexgevallen te identificeren om onderscheid te maken tussen primaire en verworven DR TB. Bovendien kan de prevalentie en clustering van MDR-tbc-, pre-XDR-tbc- en XDR-tbc-isolaten in sommige provincies worden onderschat vanwege de lage dekking van de zomertijd voor de eerstelijnsgeneesmiddelen onder tbc-gevallen (1).

Concluderend hebben we het nut van WGS voor de epidemiologie van DR TB aangetoond. We hebben aangetoond dat bijna de helft van de gevallen van MDR TB, pre-XDR TB en XDR TB in Thailand veroorzaakt kunnen worden door transmissieclusters. Twee derde van pre-XDR tbc en driekwart van MDR tbc en XDR tbc clustering isolaten waren mogelijke voorbeelden van primaire resistentie. Deze resultaten geven aan dat de opkomst van MDR-tbc, pre-XDR-tbc en XDR-tbc-gevallen in Thailand mogelijk afkomstig is van een smalle basis van voorouderlijke stammen. De hoge prevalentie van MDR/XDR-tbc in Thailand kan het gevolg zijn van multiklonale uitbraken. Mensen die in de westelijke regio van Thailand woonden, hadden een 2,4-voudig verhoogd risico op DR-tbc-clusters, en afstamming 2.2.1 gaf een 3,6-voudig verhoogd risico op het vormen van DR-tbc-clusters in vergelijking met andere geslachten.

De heer Nonghanphithak is een PhD-student in het Medical Microbiology Program, Faculteit der Geneeskunde, Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand. Zijn onderzoeksinteresse gaat uit naar de moleculaire epidemiologie en voorspelling van geneesmiddelresistentie bij tuberculose met behulp van sequencing-technieken van het hele genoom.

Dankbetuigingen

We danken het Research and Diagnostic Center for Emerging and Infectious Diseases (RCEID), Khon Kaen University, voor de ondersteuning van laboratoria en onderzoeksfaciliteiten.

Dit werk werd ondersteund door de National Research Council of Thailand and Health System Research Institute (HSRI) (grant nos. 60-057 en 62-003 aan K.F.). DN wordt gefinancierd door de Faculteit der Geneeskunde, Khon Kaen University. TGC wordt gefinancierd door de Medical Research Council UK (subsidienummers MR/M01360X/1, MR/N010469/1, MR/R025576/1 en MR/R020973/1) en Biotechnology and Biological Sciences Research Council UK (BB/R013063/ 1). A.C. wordt gefinancierd door de Medical Research Council en de National Science and Technology Development Agency (MRC/NSTDA) (grant no. P-18-50228).

Dit werk is opgedragen aan wijlen HKH Prinses Galyanivadhana, de patrones van het Drug-Resistant Tuberculosis Fund.


Mycobacterium tuberculosis-sequencing van het hele genoom biedt inzicht in de Manilla-stam en mutaties in geneesmiddelresistentie in de Filippijnen

De Filippijnen hebben een hoge incidentie van tuberculoseziekte (TB), met een toenemende prevalentie van multiresistente Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB)-stammen die de bestrijding ervan bemoeilijken. Hoewel men denkt dat de M. tuberculosis "Manila" oude lijn 1 stamtype wijdverbreid is in het land, met bewijs van export naar anderen, is er weinig bekend over de genetische diversiteit van circulerende stammen. Door middel van whole genome sequencing (WGS) 178 isolaten van de Filippijnen National Drug Resistance Survey, ontdekten we dat de meerderheid (143/178 80,3%) behoorde tot de lijn 1 Manilla-clade, waarbij de minderheid behoorde tot lijn 4 (Europees-Amerikaanse n = 33 ) en 2 (Oost-Aziatische n = 2). Een groot deel bleek multiresistent te zijn (34/178 19,1%), vastgesteld door zeer overeenstemmende laboratoriumtests op geneesmiddelgevoeligheid en in silico-voorspellingsmethoden. Sommige MDR-TB-isolaten hadden bijna identieke genomische variatie, wat potentieel bewijs van overdracht oplevert. Door de Filippijnse isolaten binnen een fylogenie van wereldwijde M. tuberculosis (n > 17.000) te plaatsen, hebben we vastgesteld dat ze genetisch vergelijkbaar zijn met die welke buiten het land zijn waargenomen, waaronder een clade van Manilla-achtige stamtypes in Thailand. Een analyse van de fylogenie onthulde een reeks

200 SNP's die specifiek zijn voor het Manilla-stamtype en een subset kunnen worden gebruikt binnen een moleculaire streepjescode. Achtenzestig mutaties waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met resistentie tegen geneesmiddelen tegen tuberculose, werden geïdentificeerd in de Filippijnse stammen, en ze zijn allemaal waargenomen bij andere populaties. Terwijl negen vermeende streptomycine resistentie verlenende markers in gid (8) en rrs (1) genen nieuw lijken te zijn en functionele consequenties hebben. Over het algemeen biedt deze studie een belangrijke basiskarakterisering van de genetische diversiteit van M. tuberculosis voor de Filippijnen, en zal een leemte in wereldwijde datasets opvullen en helpen bij de ontwikkeling van een landelijke database voor epidemiologische studies en klinische besluitvorming. Door een moleculaire streepjescode vast te stellen voor het detecteren van Manilla-stammen, zal het verder helpen bij het ontwerpen van diagnostische hulpmiddelen voor ziektebestrijdingsactiviteiten.

Belangenconflict verklaring

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Figuren

de 178 m . tuberculose…

de 178 m . tuberculose isoleert: ( EEN ) Kaart van de Filipijnen…


Hoe maak je een volledige genoomanalyse van Multidrug-resistente Mycobacterium tuberculosis - Biologie?

Multiresistente (MDR) en extensief resistente (XDR) tuberculose (tbc) is een opkomende bedreiging voor de tbc-bestrijding in Oekraïne, een land met de op twee na hoogste XDR-tbc-last ter wereld. We hebben sequentiebepaling van het hele genoom van een gemaksmonster gebruikt om bacteriële genetische en patiëntgerelateerde factoren te identificeren die in dit land verband houden met MDR/XDR-tbc. MDR/XDR TB was geassocieerd met 3 verschillende Mycobacterium tuberculosis complexe lineage 2 (Beijing) clades, Europa/Rusland W148-uitbraak, Centraal-Azië-uitbraak en Oekraïne-uitbraak, die 68,9% van alle MDR/XDR-tbc-stammen uit Zuid-Oekraïne omvatte. MDR/XDR tbc was ook geassocieerd met eerdere behandeling voor tbc en stedelijk verblijf. Bij de implementatie van nieuwe tbc-beheerstrategieën in Oekraïne moet rekening worden gehouden met de verspreiding van uitbraakstammen in Peking met een brede resistentie tegen geneesmiddelen, in combinatie met beperkingen in het aanbod van geneesmiddelen en beperkte beschikbaarheid van fenotypische gevoeligheidstesten voor geneesmiddelen.

Elk jaar vormen ongeveer een half miljoen nieuwe gevallen van multiresistente (MDR) tuberculose (tbc) een uitdaging voor de wereldwijde gezondheid (1,2). MDR-tbc wordt veroorzaakt door: Mycobacterium tuberculosis complexe (MTBC) stammen, resistent tegen ten minste isoniazide en rifampicine (3). In Europa is Oekraïne een hotspot van resistente tuberculose, met 6.564 laboratoriumbevestigde MDR- en rifampicineresistente gevallen (2) en de op twee na hoogste last van extensief resistente (XDR) tbc (1.097 door laboratoriumonderzoek bevestigde gevallen) wereldwijd in 2017 (2). XDR-tbc is een gecompliceerde vorm van MDR-tbc met extra resistentie tegen > 1 tweedelijns injecteerbaar antimicrobieel geneesmiddel en een fluorochinolon (1). De behandeling van XDR-tbc kan tot 2 jaar duren (4), en de behandeling van een enkel geval van XDR-tbc is naar verluidt meer dan € 100.000 (5,6), hoewel de slagingspercentages van behandelingen ≈30% blijven in de Europese regio van de Wereldgezondheidsorganisatie (40 gerapporteerde landen) (7). Verbetering van MDR/XDR-preventie, diagnose en behandeling van tbc is een van de kernactiviteiten van de WHO en de European Respiratory Society om tbc uit te bannen (6).

Naast tekortkomingen in de diagnose en behandeling van tbc, kunnen bacteriële genetische factoren een rol spelen in het epidemiologische succes van bepaalde MDR-stammen, met name van lijn 2 (Beijing) in Eurazië (811). Peking MDR-uitbraakstammen bleken fitnessverhogende mutaties te krijgen (d.w.z. mutaties die de in vitro groeisnelheid verhogen) die kunnen leiden tot hogere virulentie en verhoogde overdraagbaarheid, waardoor de MDR-tbc-epidemie in Oost-Europa wordt bevorderd (810). In overeenstemming met deze aanname voorspellen recente computermodellen dat in veel landen met een hoge tbc-incidentie, overdracht van persoon op persoon, maar niet behandelingsgerelateerde acquisitie, verantwoordelijk is voor bijna alle (95,9%) incidentele gevallen van MDR-tbc (12). Whole-genome sequencing (WGS) in combinatie met een voorspelling van moleculaire resistentie tegen geneesmiddelen heeft inzicht gegeven in MTBC-transmissienetwerken en de overdraagbaarheid van MDR/XDR MTBC-stammen (810,1315). We hebben een op WGS gebaseerde moleculaire epidemiologische benadering toegepast om moleculaire resistentiepatronen, dominante stamtypes en patiëntgerelateerde factoren geassocieerd met MDR/XDR TB te identificeren in een gemakssteekproef uit Zuid-Oekraïne.

Methoden:

Studiepopulatie

MTBC-isolaten werden verzameld in januari-juni 2015 in het klinische laboratorium van het Odessa Regional TB Hospital (nu Odessa Regional Center for Socially Significant Diseases Odessa, Oekraïne), waar de meeste klinische MTBC-culturen uit de regio routinematig worden geïsoleerd en geanalyseerd. We voltooiden subkweek en WGS op een subset van kweekisolaten die tijdens de onderzoeksperiode in het klinische laboratorium waren verkregen. De bemonsteringsstrategie was gericht op het opnemen van een vergelijkbaar deel van MDR/XDR TB-isolaten en niet-MDR (polyresistente en pangevoelige) stammen. We hebben monsters opgenomen op basis van routinematige fenotypische rifampicine- en isoniazidegevoeligheidstests die isolaten categoriseerden als MDR- of niet-MDR-tbc-stammen, anders was de opname onbevooroordeeld en werden isolaten direct uit de klinische pijplijn opgenomen wanneer menselijke en technische middelen beschikbaar waren. Isolaten van zowel nieuwe gevallen als herbehandelingsgevallen kwamen in aanmerking voor opname. herbehandelingsgevallen omvatten terugval, herinfectie, falen van de behandeling of onderbroken behandelingsepisode. In overeenstemming met het klinische protocol in het laboratorium werden alle MTBC-culturen die niet in ons onderzoek waren opgenomen, geautoclaveerd en weggegooid.

Figuur 1. Locaties waar Mycobacterium tuberculosis complexe (MTBC) DNA-monsters werden verzameld in de regio's Odessa en Vinnytsia. Gele stippen geven locaties aan van patiënten die zijn geïnfecteerd met een MTBC-lijn 2 Oekraïne-uitbraakstam. Groente.

Ons onderzoek vond voornamelijk plaats in de regio Odessa, die de hoogste tbc-last had (3.039 gevallen) in Oekraïne, de op een na hoogste MDR-tbc-last (30,5% voor nieuwe gevallen en 46,9% voor herbehandeling) en de incidentie van tbc tweemaal zo hoog als de het gemiddelde van het land (127,9 gevallen/100.000 inwoners) in 2017 (16). In totaal hebben we 186 MTBC-isolaten opgenomen, elk verkregen van 1 patiënt waarvan de meeste in de regio Odessa woonden (95,2%). De rest van de monsters (4,8%) waren afkomstig uit de aangrenzende administratieve regio Vinnytsia (Figuur 1). Opname van deze monsters ondersteunde het onderzoek naar epidemiologische verbanden tussen beide regio's. De analyse is dus gericht op de verschillen tussen 103 niet-MDR- en 74 MDR/XDR MTBC-stammen, allemaal geïsoleerd uit Zuid-Oekraïne. Patiëntkenmerken die werden beoordeeld op associatie met MDR/XDR-tbc waren leeftijd, geslacht, woonplaats, hiv-status en gevalsdefinitie.

Contacttracering van patiënten die besmet zijn met een uitbraakstam in Oekraïne

We voerden een retrospectieve beoordeling uit van epidemiologische contacttracering voor patiënten die besmet waren met een uitbraak in Oekraïne via patiëntendossiers. Omdat Oekraïne geen middelen heeft voor het opsporen van contacten en tbc wordt gestigmatiseerd, verwachtten we dat de journaalinformatie weinig contacten zou opleveren. Om te helpen bij het identificeren van contactpersonen, hebben we artsen geïnterviewd die zorg verlenen aan de patiënten met een uitbraak van tbc in Oekraïne. We hebben de vertrouwelijkheid van gegevens gehandhaafd in overeenstemming met regionale ethische goedkeuringen in Oekraïne en Umea, Zweden (N 2012-292-31M). We hebben onmiddellijk informatie over nosocomiale overdracht van uitbraakstammen in Oekraïne gedeeld met de administratie van het regionale TB-ziekenhuis van Odessa om maatregelen voor infectiebeheersing te ondersteunen.

Fenotypische karakterisering van geneesmiddelresistentie en DNA-isolatie

We hebben primaire isolatie- en geneesmiddelgevoeligheidstests uitgevoerd van MTBC-stammen met behulp van een klinisch diagnostisch protocol voor tbc in Oekraïne. In het kort hebben we sputummonsters behandeld met de N-acetyl-L-cysteïne-NaOH (NALC) -methode voor decontaminatie en deze verder verwerkt voor Ziehl-Neelsen-kleuring met behulp van GeneXpert-MTB/RIF (Cepheid, https://www.cepheid. com), gevolgd door inoculatie op Löwenstein-Jensen (LJ) medium en BACTEC MGIT960-buizen (Becton Dickinson, https://www.bd.com) voor kweekbevestiging en vervolgens voor fenotypische gevoeligheidstests voor geneesmiddelen. We gebruikten de volgende geneesmiddelconcentraties (mg/L, per medium): isoniazide, LJ 0.2, MGIT960 0.1 rifampicine, LJ 40.0, MGIT960 1.0 ethambutol, LJ 2.0, MGIT960 5.0 pyrazinamide, MGIT960 100,0 en streptomycine, LJ 4.0, MGIT960 1.0. Individuele reagentia waren niet altijd beschikbaar voor routinematige gevoeligheidstests voor geneesmiddelen, en resistentieprofielen in dit manuscript zijn gebaseerd op moleculaire markers (bijlage 1 tabel 1, https://wwwnc.cdc.gov/EID/article/26/3/19- 0525-App1.xlsx). We hebben mycobacterieel DNA geëxtraheerd uit LJ-culturen zoals eerder beschreven (17) gebruikmakend van cetyltrimethylammoniumbromide.

Gehele genoomsequencing

We hebben WGS voltooid met behulp van Illumina-technologie (MiSeq, NextSeq 500 en Nextera XT bibliotheekvoorbereidingskit Illumina, https://www.illumina.com) volgens de instructies van de fabrikant. We hebben onbewerkte leesgegevens (FASTQ-bestanden) toegewezen aan de M. tuberculose H37Rv-genoom (GenBank-toegangsnr. NC_000962.3) met behulp van maximale exacte overeenkomsten van Burrows-Wheeler Aligner (18) en verfijnde mappings met het softwarepakket Genome Analysis Toolkit (19). We hebben varianten gedetecteerd, waaronder single-nucleotide polymorphisms (SNP's) en inserties en deleties (indels), met Samtools mpileup (20). Voor een aaneengeschakelde sequentie-uitlijning, de basis voor de fylogenetische reconstructie, hebben we alleen SNP's overwogen met minimale drempels van 4 reads in zowel voorwaartse als achterwaartse oriëntatie, 4 reads die de SNP aanroepen met een Phred-score > 20, en 75% SNP-frequentie. We hebben opeenvolgende SNP's uitgesloten voor de fylogenetische reconstructie die wordt gedetecteerd binnen < 12 bp, die kan voorkomen als kunstmatige varianten rond indels en die de genetische afstand van individuele isolaten zou vergroten. We combineerden alle resterende SNP-posities die een duidelijke basisaanroep hadden voor alle stammen en kwamen overeen met de drempelniveaus in > 95% van alle stammen in één FASTA-uitlijning, waarbij repetitieve regio's en resistentie-geassocieerde genen verder werden uitgesloten.

Fylogenetische reconstructie

We hebben bomen met maximale waarschijnlijkheid berekend met FastTree versie 2.1.9 (21) met behulp van een algemeen in de tijd omkeerbaar nucleotidesubstitutiemodel en 1.000 herbemonsteringen. De consensusboom was geroot met de midpoint root-optie in FigTree versie 1.4 (//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree). We hebben cladogrammen van uitbraakstammen en het aantal branchespecifieke mutaties verkregen door maximale spaarzaamheid met behulp van BioNumerics versie 7.6 (Applied Maths, https://www.applied-maths.com).

We hebben fylogenetische lijnen afgeleid van specifieke SNP's op basis van Coll et al. (22) en Merker et al. (8). Als proxy voor TB-gevallen die verband houden met directe transmissiegebeurtenissen, hebben we een maximale paarsgewijze genetische afstand tussen > 2 MTBC-isolaten van 5 SNP's overwogen, voorgesteld door Walker et al. als een strikte drempel die gevallen identificeerde die verband houden met overdracht door huishoudens (23).

Genotypische voorspelling van geneesmiddelresistentie

We hebben polymorfismen geëxtraheerd uit 37 geneesmiddelresistentie- en bacteriële fitness-geassocieerde genomische doelen (bijlage 1 tabel 1). We hebben bekende en nieuw geïdentificeerde fylogenetische, niet-resistentie-gerelateerde varianten uitgesloten (8,24,25) uit de genotypische voorspelling van geneesmiddelresistentie (bijlage 1 tabel 3).

Resistentiegenotypen werden als volgt gedefinieerd: voor wildtype allelen (H37Rv-referentiesequentie) voor alle met resistentie geassocieerde doelwitten hebben we antimicrobiële gevoeligheid afgeleid (genotypisch wildtype, gWT). We hebben isolaten met onbekende mutaties geclassificeerd als genotypisch niet-wildtype (niet-WT) zonder verdere classificatie. We beschouwden isolaten met bekende resistentie-medierende mutaties als resistent tegen het respectieve antimicrobiële geneesmiddel (bijlage 1 tabel 1). Met behulp van genotypische resistentievoorspellingen hebben we de isolaten geclassificeerd als XDR (bekende mutaties die resistentie mediëren tegen isoniazide, rifampicine, > 1 tweedelijns injecteerbaar geneesmiddel en een fluoroquinolon), MDR (isoniazide- en rifampicineresistentie maar niet XDR) en niet-MDR ( ofwel pangevoelig of enige resistentie maar niet MDR).

Statistische analyse

We hebben een associatieplot gemaakt in R-versie 3.3 (https://www.r-project.org) met behulp van het vcd-pakket versie 1.4. De onderliggende aanname is dat het aandeel MDR/XDR MTBC-stammen binnen 1 groep overeenkomt met het aandeel van deze groep onder alle geanalyseerde isolaten (d.w.z. het resistentieniveau is onafhankelijk van de fylogenetische groeperingen). We hebben Pearson-residuen berekend om de afwijking van de onafhankelijkheid van elke cel te meten, waarden van + 2 vertegenwoordigen een significante afwijking bij α = 0,05 en waarden van + 4 afwijking bij α = 0,001 (26). We hebben een boxplot gemaakt van paarsgewijze genomische afstanden van MTBC-stammen van gedefinieerde stamgroepen met R-versie 3.3 met behulp van de ggplot2-pakketversie 2.2 (bijlage 2, figuur 1).

We analyseerden factoren die verband houden met MDR/XDR TB door middel van logistische regressie (univariate en multivariate model) met behulp van de glm-functie in R versie 3.3.1 (27). We hebben het variabele MTBC-genotype uitgesloten van multivariate analyse omdat het aantal cellen 0 omvatte. We vergeleken gemiddelden van paarsgewijze SNP-afstanden met 1-way variantieanalyse (ANOVA) en Bonferroni meervoudige vergelijkingstests.

Resultaten

Studiepopulatie

Tijdens de onderzoeksperiode identificeerde de TB-service 1.026 patiënten met > 1 kweekpositief monster in de regio Odessa. Van deze kweken werden 330 isolaten geïdentificeerd als MDR.

Onze studie omvatte 16,17% (169/1.026) van de geïdentificeerde positieve culturen. MDR/XDR-tbc-monsters vormden 21,82% (72/330) van alle MDR/XDR-tbc-positieve culturen die tijdens de onderzoeksperiode werden geïdentificeerd. De overige 97 isolaten waren fenotypisch niet-MDR MTBC-stammen (50 pangevoelige en 47 monoresistente of polyresistente stammen). Daarnaast hebben we willekeurig 6 pangevoelige en 2 MDR/XDR MTBC-isolaten verzameld en geanalyseerd van tbc-patiënten geregistreerd in de aangrenzende regio van Vinnytsia (Vinnytsia Regional TB Hospital, Vinnytsia).

Na het voltooien van WGS hebben we 4,8% (9/186) van de MTBC-isolaten uit de analyse gehaald vanwege discrepanties tussen fenotypische gevoeligheidstests voor geneesmiddelen en de toegepaste op genoom gebaseerde voorspelling van resistentie tegen geneesmiddelen. Daarom hebben we 177 MTBC klinische isolaten in de analyse opgenomen.

MDR/XDR MTBC Beijing Outbreak Clades

Figuur 2. Fylogenie met maximale waarschijnlijkheid gebaseerd op 10.339 SNP's, en gebruik makend van een algemeen tijdomkeerbaar substitutiemodel voor 177 klinische MDR/XDR en niet-MDR Mycobacterium tuberculosis complexe isolaten uit het zuiden van Oekraïne. Takken zijn kleurgecodeerd volgens de.

We hebben in totaal 177 klinische isolaten geclassificeerd op basis van WGS-gegevens van 10.339 variabele posities, volgens een recent voorgestelde SNP-barcode (22). Verder hebben we 89 van de isolaten (50,3%) geclassificeerd als Peking-genotype (afstamming 2.2.1) en de resterende 88 (49,7%) als Euro-Amerikaanse afstamming 4. We hebben afstamming 4-stammen gedifferentieerd naar de volgende genotypen en subafstammingen: 8/ 88 (9,1%) Ghana (stam 4,1) 32/88 (36,4%) H37Rv-achtig (stam 4,7 en 4,8) 16/88 (18,2%) Haarlem (stam 4.1.2 en 4.1.2.1) 21/88 (23,9% ) LAM (lijnen 4.3.3, 4.3.4.1 en 4.3.4.2) en 11/88 (12,5%) Ural (lijn 4.2.1) (Figuur 2).

Binnen Peking-stam 2.2.1 identificeerden we 3 nauw verwante subgroepen die een lagere genetische diversiteit vertoonden in vergelijking met andere stam 2.2.1, gebaseerd op paarsgewijze SNP-afstanden binnen de groep tussen twee stammen. Twee van die subgroepen werden eerder gerapporteerd in andere instellingen (8) we identificeerden ze door clade-specifieke SNP's en noemden ze Centraal-Azië-uitbraak en Europa/Rusland W148-uitbraak. De derde subgroep, Oekraïne-uitbraak genaamd, was niet eerder beschreven. Deze clades in Peking vertoonden een lagere mediane paarsgewijze SNP-afstand van 25 (interkwartielafstand [IQR] 20,0–32,5) voor een uitbraak in Centraal-Azië, 39 (IQR 25,0–48,0) voor de W148-uitbraak in Europa/Rusland en 14 (IQR 11,5–18,0) voor Uitbraak in Oekraïne, in tegenstelling tot een afstand van 122 (IQR 170,8-139,0) voor andere Peking-stammen (p<0,05, one-way ANOVA, Bonferroni multiple-vergelijkingstest) (bijlage 2, figuur 1).

Toen we een strikte drempel van 0-5 SNP's in overweging namen, zoals eerder voorgesteld voor MTBC-stammen geïsoleerd uit huishoudelijke contacten (23), kon slechts 9,0% van alle patiënten (16/177) worden gekoppeld aan 7 vermeende transmissienetwerken van elk 2-4 patiënten. We vonden deze netwerken of moleculaire clusters bij de 3 uitbraken in Beijing (3 transmissiegebeurtenissen) en andere Beijing-stammen (1 transmissiegebeurtenis), en ook bij Euro-Amerikaanse stammen (lijnen 4.1 en 4.8 3 transmissiegebeurtenissen) (bijlage 1 tabel 1).

Beoordeling van contacttracering voor gevallen van uitbraak in Peking, Oekraïne

Epidemiologische verbanden tussen geclusterde patiënten werden gedeeltelijk bevestigd door retrospectieve beoordeling van contacttracering van patiënten die besmet waren met de Oekraïne-uitbraakstam van 18 gevallen, 7 waren nieuw en 11 herbehandeling (Figuur 1 Bijlage 1 Tabel 4 Bijlage 2 Figuur 2). Oekraïne-uitbraakgevallen werden op verschillende plaatsen geregistreerd (Figuur 1) 3 patiënten hadden contact via een psychiatrisch ziekenhuis (patiëntisolaat odir-1606, met paarsgewijze SNP-afstand van 8 odir-1746, SNP-afstand 10 odir-1747, met afstand van 12) en 2 gevallen (odir-5192 en odir-1636, SNP-afstand 3) hadden nauw contact via hun directe omgeving (Bijlage 1 Tabel 4 Bijlage 2 Figuur 2). Het buurtcontact was ook opgespoord door de strikte SNP-drempel toe te passen. Drie andere patiënt-patiënten hadden een nauw familiaal MDR-tbc-contact, maar bacterieel DNA was niet beschikbaar voor deze gevallen. Er kon geen duidelijk verband worden vastgesteld tussen 13 van de 18 gevallen van uitbraak in Oekraïne.

Patiëntfactoren die verband houden met MDR/XDR-tbc

Om bepaalde demografische en behandelingsgerelateerde factoren die verband houden met MDR/XDR-tbc in Zuid-Oekraïne vast te stellen, hebben we verder logistische regressieanalyse gebruikt (tabel 1). Na multivariate analyse, 3 factoren: eerdere tbc-behandeling (OR 3,5, 95% BI 1,0-12,8 p = 0,04), wonen in een stad (OR 6,0, 95% BI niet van toepassing p = 0,005) en infectie met een uitbraakstam in Peking (OR 7,4, 95% BI 1,8–29,9 p < 0,001) — waren significant geassocieerd met MDR/XDR TB. Multivariate analyse omvatte de aanvullende variabelen leeftijd, geslacht, hiv-status en MTBC-genotype.

Overgedragen en verworven resistentie tegen geneesmiddelen bij uitbraakstammen in Peking

Figuur 3. Associatieplot waarin verwachte en waargenomen aantallen MDR/XDR- en niet-MDR-stammen uit verschillende fylogenetische groepen worden vergeleken. De kleuren en balkhoogtes weerspiegelen de Pearson-residuen, de breedte van de dozen is.

In overeenstemming met de resultaten van de fylogenetische en logistische regressieanalyse, waren uitbraakstammen in Peking de belangrijkste dragers van MDR/XDR TB. De uitbraakstammen in Europa/Rusland W148, Centraal-Azië en Oekraïne waren goed voor 29,9% van het cohort, maar droegen bij aan meer dan twee derde (68,9%) van alle gevallen van MDR/XDR-tbc (Figuur 3 Bijlage 1 Tabel 2). De 3 uitbraakstammen in Peking hadden allemaal een hoge mate van eerstelijnsgeneesmiddelresistentie tegen isoniazide (93%–100%), rifampicine (93%–100%), streptomycine (93%–100%), ethambutol (86%–100%). ) en pyrazinamide (75%-100%) (Tabel 2). Daarentegen waren de eerstelijns resistentiepercentages bij alle andere stammen in Peking en niet-Beijing verminderd (8%-33% voor individuele geneesmiddelen). Evenzo waren de resistentiepercentages tegen tweedelijnsgeneesmiddelen bij de 3 uitbraakstammen hoog (ofloxacine 14%–44%, kanamycine 14%–50% en prothionamide 57%–100%) in vergelijking met andere Peking (ofloxacine 11%, kanamycine 17). %, en prothionamide 11%) en niet-Beijing (ofloxacine 3%, kanamycine 8% en prothionamide 15%) stammen (Tabel 2).

Een associatiegrafiek bevestigde de resultaten van de logistische regressieanalyse die aantoonde dat MDR/XDR-tbc onder patiënten in Zuid-Oekraïne duidelijk verband houdt met de 3 uitbraakgroepen in Peking en dat de resistentie tegen geneesmiddelen niet gelijk verdeeld is over de MTBC-stammen, zoals men zou verwachten van willekeurig falen van de behandeling (dwz verworven resistentie) (Figuur 3).De uitbraakstam in Oekraïne, die 10,2% van het totale cohort uitmaakt, werd bijvoorbeeld geassocieerd met 24,3% van alle MDR/XDR-tbc-gevallen. Daarentegen werden niet-Beijing-stammen, die 49,7% van het cohort uitmaakten, geassocieerd met slechts 17,6% van alle MDR/XDR-gevallen.

Figuur 4. Maximale spaarzaamheid fylogenieën van 3 Mycobacterium tuberculosis complexe Peking clades in Oekraïne: Europa/Rusland W148-uitbraak (A), Oekraïne-uitbraak (B) en Centraal-Aziatische uitbraak (C). Mutaties die resistentie tegen verschillende antibiotica mediëren.

Stammen van de 3 uitbraken vertoonden clade-specifieke geneesmiddelresistentie-gerelateerde mutaties, voornamelijk voor eerstelijnsgeneesmiddelen (Figuur 4). Alle uitbraakstammen in Oekraïne hadden identieke mutaties die resistentie tegen isoniazide mediëren (katG S315T, inhA −15c/t), prothionamide (inhA −15c/t), rifampicine (rpoB S450L), streptomycine (rpsL K88R) en ethambutol (embA −12 c/t en embB Y334H), wat suggereert dat patiënten voornamelijk zijn geïnfecteerd met een stam die al resistent is tegen ten minste deze 5 geneesmiddelen. Aan de andere kant zijn mutaties in de pncA gen dat pyrazinamide-resistentie verleent, was divers, wat wijst op individuele en recentere verwerving van resistentie tegen geneesmiddelen onder selectieve druk (bijv. falende behandelingsregimes) (Figuur 4). Soortgelijke patronen kunnen worden waargenomen voor de andere 2 uitbraken: gedeelde eerstelijnsresistentie die mutaties mediëren unieke mutaties die resistentie tegen kanamycine mediëren (eis −8 del c, −10 g/a, −12 c/t, −14 c/t, −15 c/g, −35 g/a, −37 g/t) kruisresistentie tegen alle injecteerbare geneesmiddelen (rrs 1401 a/g) en resistentie tegen de fluoroquinolonen (gyrA A90V, S91P, D94G, D94N, D94Y, D94A) (Afbeelding 4 Bijlage 1 Tabel 1). We hebben geen bekende resistentiemarker voor cycloserine en linezolid geïdentificeerd (bijlage 1 tabel 2).

Stammen van de 3 uitbraakclades kregen vermeende compenserende mutaties, bijv rpoB of rpoC eerder gesuggereerd om het groeitekort van rifampicine-resistente stammen te verminderen (10,11). Deze mutaties treden ofwel gezamenlijk op, ofwel na de rifampicineresistentie-medierende mutatie in de rpoB rifampicine resistentie bepalende regio (Figuur 4).

Discussie

Deze studie toont aan dat MDR/XDR-tbc-patiënten in Zuid-Oekraïne voornamelijk zijn geïnfecteerd met stammen die behoren tot 3 verschillende uitbraakgroepen van MTBC in Peking. Het feit dat stammen die tot 2 van deze uitbraken behoren, zijn geïsoleerd bij patiënten elders in de wereld, wijst op langdurige overdracht en prevalentie van deze stamtypen op een bredere geografische schaal (d.w.z. Oost-Europa en Centraal-Azië). Elke subgroep van een uitbraak herbergde specifieke combinaties van mutaties die geneesmiddelresistentie mediëren, een waarschijnlijk resultaat van klonale expansie van een geneesmiddelresistente gemeenschappelijke voorouder die aanleiding gaf tot bijna identieke klonen die afzonderlijk aanvullende geneesmiddelresistentie-medierende mutaties verwierven.

Gezien de gemiddelde paarsgewijze afstanden tussen de uitbraakclades (14 SNP's voor de uitbraak in Oekraïne, 25 voor de uitbraak in Centraal-Azië en 39 voor de uitbraak in Europa/Rusland) en een voorgestelde kortetermijnmutatiesnelheid voor MTBC-stammen van ≈ 0,5 SNP's/genoom/jaar (23), schatten we dat elke uitbraakvoorloper 20-40 jaar geleden is ontstaan. De W148 Europa/Rusland uitbraak clade en de Centraal Azië uitbraak clade zijn eerder beschreven in voormalige Sovjet-Unie gebieden (8,10). De Oekraïne-uitbraakclade is niet gevonden in andere omgevingen en is mogelijk geografisch beperkt tot Oekraïne.

Gevangenisstraf is besproken als de belangrijkste oorzaak van MDR/XDR-tbc-transmissie in Oekraïne (2830). Slechts 1 van de patiënten met een uitbraak in Oekraïne was eerder in de gevangenis gezet. Het onderzoek naar het traceren van contacten geeft aan dat transmissie door huishoudens/buurten en nosocomiale wijzen voor de verspreiding van MDR/XDR-uitbraakstammen is. Het feit dat 25 van de 53 uitbraakstammen (bijlage 1 tabel 1) zijn geïsoleerd uit nieuwe tbc-gevallen in onze studie, suggereert grotere transmissienetwerken in de gemeenschap. Vanwege beperkingen van de controle op het traceren van contacten, is het echter mogelijk dat we enkele contacten over het hoofd hebben gezien die verband houden met gevangenissen in Oekraïne.

De resistentieprofielen van de uitbraakstammen geven aan dat tbc-behandelingsregimes inclusief isoniazide, rifampicine, pyrazinamide, ethambutol, kanamycine, amikacine, capreomycine, levofloxacine, moxifloxacine, ethionamide, prothionamide, para-aminosalicylzuur, linezolid en cycloserine (31) zijn niet voldoende om patiënten die met deze stammen zijn geïnfecteerd effectief te behandelen. De implementatie van snelle Xpert MTB/RIF-diagnostiek (Cepheid) in de regio Odessa heeft inderdaad niet geleid tot aanzienlijk betere behandelresultaten voor MDR-tbc (32). De falende standaard MDR-tbc-regimes die 2-3 actieve en 2-3 niet-actieve geneesmiddelen bevatten, worden nog steeds gebruikt in plaats van een gepersonaliseerde, door het laboratorium bevestigde behandeling (30). Een reden hiervoor is een gebrek aan universele toegang tot nieuwe of hergebruikte anti-tbc-medicijnen zoals bedaquiline, delamanid en meropenem, en beperkte financiering van palliatieve tbc-zorg die zou moeten worden gebruikt als er minder dan 4 actieve geneesmiddelen beschikbaar zijn (31).

Studies in Zuid-Afrika en Argentinië tonen aan dat ontoereikende behandelingsregimes de drijfveer zijn voor klonale expansie van bepaalde soorten stammen en verdere verwerving van resistentie tegen geneesmiddelen (13,33), wat ook geldt voor de uitbreiding van de 3 gedetecteerde clades van Peking-uitbraak in het zuiden van Oekraïne. In feite zijn de waargenomen mutatieprofielen van de uitbraakstammen met identieke eerstelijnsgeneesmiddelresistentie-medierende mutaties en individuele mutaties die tweedelijnsgeneesmiddelresistentie verlenen, kenmerkend voor een verworven MDR MTBC-infectie (primaire resistentie), gevolgd door verdere resistentieontwikkeling onder suboptimale behandelingsregimes (secundaire resistentie) tijdens een recentere infectie of behandelingsregime. De hoge prevalentie van isoniazideresistentie op hoog niveau, gemedieerd door: katG S315T, en ook het brede spectrum van mutaties die resistentie tegen pyrazinamide veroorzaken, voegen Oekraïne toe aan de lijst van landen waar het onlangs voorgestelde standaard korte MDR-tbc-regime nauwelijks enig effect zal hebben (34,35).

De belangrijkste beperking van ons onderzoek is dat slechts 21,81% van alle MDR-isolaten die tijdens de onderzoeksperiode zijn geregistreerd, binnen de routinepraktijk konden worden hersteld vanwege de beperkte technische en personele middelen. Dit tekort kan mogelijk enige onzekerheid met zich meebrengen met betrekking tot de ware proporties van de uitbraakclades. Verder laten we zien dat MDR/XDR tbc-patiënten in Zuid-Oekraïne voornamelijk geïnfecteerd zijn met 3 verschillende MTBC-epidemieën in Peking. Inwoners van Zuidoost-Oekraïne liepen echter inderdaad een hoger risico op primaire MDR-tbc (36,37). Deze bevinding kan verband houden met de circulatie van de uitbraakstammen in Peking die we beschrijven, maar we kunnen onze resultaten niet extrapoleren naar het hele land waarvan is aangetoond dat het een asymmetrische verdeling van MDR-tbc heeft (37). Ten slotte is het lage aantal genetisch voorspelde en bevestigde transmissiegebeurtenissen in onze studie waarschijnlijk te wijten aan de korte bemonsteringsperiode.

Concluderend tonen we aan dat verschillende MDR-uitbraakklonen in combinatie met falende regimes de belangrijkste drijfveren zijn geweest van de MDR/XDR-tbc-epidemie in Oekraïne, in plaats van een slechte therapietrouw. Geïndividualiseerde behandelingsschema's op basis van laboratoriumbevestigde resistentieprofielen zijn de sleutel tot het in bedwang houden van MDR/XDR-tbc in deze instellingen. Toegang tot nieuwe geneesmiddelen zoals bedaquiline en delamanid moet worden ondersteund, maar strikt gecontroleerd, omdat het waarschijnlijk is dat er resistentie ontstaat (38).

Dr. Merker is een assistent-professor in de groep van moleculaire en experimentele mycobacteriologie aan het Research Center Borstel, Borstel, Duitsland. Zijn onderzoek is gericht op de evolutie van resistentie tegen geneesmiddelen, M. tuberculose populatiegenetica, en de toepassing van next-generation sequencing-technieken voor moleculaire resistentie-assays.


De opkomst van multiresistente (MDR) stammen voor tuberculose (tbc) leidt tot een van de grootste wereldwijde volksgezondheidsproblemen. In 2012 was de incidentie van tbc in Peru 95 gevallen/100.000 inwoners, waarvan 3,9% nieuwe gevallen van MDR-tbc (1), en van deze MDR-tbc-gevallen kwam 79% uit Lima (2). Momenteel is er geen genomische informatie over een MDR-stam uit Peru. Het verkrijgen van deze informatie is dus een belangrijke stap om de biologie van de ziekteverwekker te begrijpen en de behandeling van tbc te verbeteren (3). Hier rapporteren we genomische kenmerken van een multiresistente stam van Mycobacterium tuberculosis, INS-MDR, van een patiënt met actieve tuberculose uit Peru.

De totstandkoming van de afstamming van deze stam was gebaseerd op 24 mycobacteriële afgewisselde repetitieve unit-variable number of tandem repeat (MIRU-VNTR) loci (4) en op single-nucleotide polymorphisms (SNP's) gebaseerd op fylogenie (5). De genoomsequencing van INS-MDR werd uitgevoerd met behulp van een Illumina HiSeq 2000-sequencer met een dekking van 1.331×. De resulterende reads met gepaarde uiteinden werden geassembleerd met BWA v 0.5.9-r16 (6), met behulp van het H37Rv-genoom (NC000962.3) als referentie. De genomische sequentie werd geannoteerd met de RAST-server (7), Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAAP) en Clusters of Orthologous Groups (COG) (8) databases. Er werd een vergelijkende analyse uitgevoerd tussen INS-MDR en KZN 1435, een MDR-stam uit Zuid-Afrika (9), met behulp van SNPsFinder (10) om de verschillen in intergene coderende regio's en genontologieclassificaties (COG) te identificeren.

Er is vastgesteld dat INS-MDR tot de LAM-lijn behoort. We verkregen 58.157.302 reads met gepaarde uiteinden die, na de assemblage, resulteerden in 22 contigs die ongeveer 99,98% omvatten in vergelijking met het H37Rv-genoom. INS-MDR is 4.383.671਋p lang, met een gemiddeld GC-gehalte van 65,6%.

In totaal werden 805 polymorfismen met betrekking tot H37Rv waargenomen, waarvan 703 in de coderende regio's die als volgt in COG-categorieën waren ingedeeld: biosynthese, transport en katabolisme van secundaire metabolieten (N = 38) lipidentransport en metabolisme (N = 41) replicatie, recombinatie en reparatie (N = 32) energieproductie en -conversie (N = 35) aminozuurtransport en metabolisme (N = 30) koolhydraattransport en metabolisme (N = 27) celmotiliteit (N = 21) celwand/membraan/envelopbiogenese (M) (N = 23) co-enzym transport en metabolisme (N = 22) signaaltransductiemechanismen (N = 22) anorganisch ionentransport en metabolisme (N = 22) transcriptie (N = 20) translatie, ribosomale structuur en biogenese (N = 16) posttranslationele modificatie en eiwitomzetting (N = 13) nucleotide transport en metabolisme (N = 11) afweermechanismen (N = 5) celcycluscontrole, celdeling en chromosoomverdeling (N = 9) en RNA-verwerking en -modificatie (N = 2).

We identificeerden een mutatie op de rpoB gen (D516V) gerelateerd aan resistentie tegen rifampicine (11), mutaties op de katG (S315T) en kasA genen (G269S) gerelateerd aan resistentie tegen isoniazide (12, 13), en een mutatie op de pncA gen (Q10R) gerelateerd aan pyrazinamideresistentie (14). Ook vonden we mutaties op de gyrA gen (E21Q, S95T, G247S, G668D) en een mutatie op de embB gen (Y319S) die geen resistentie geven (15,�).

Vergelijking van de KZN 1435- en INS-MDR-stammen toonde aan dat, ondanks de verschillen in geografische oorsprong en de hoge incidentie van tbc in Zuid-Afrika (1), de stammen vergelijkbare proporties van SNP's hebben, wat een hoge mate van behoud van de genoomstructuur laat zien. Deze resultaten suggereren dat de uitbraak van resistente tuberculose in Lima een klonale uitbreiding van dezelfde stam kan zijn, maar er is meer genomische informatie vereist.