Informatie

15.9: Video - Het niet-gefixeerde ruggenmerg - Biologie


15.9: Video - Het niet-gefixeerde ruggenmerg

Neuroanatomie Video Lab: Hersendissecties

Deze serie neuroanatomische "lessen" heeft twee hoofddoelen. De eerste is om kijkers toegang te geven tot menselijke hersenspecimens, iets wat op veel plaatsen ontbreekt. De tweede is om de anatomie te vereenvoudigen, veel details weg te laten en veel generalisaties te maken. De reden hiervoor is om de focus te houden op de lokalisatie van de ziekte van de patiënt in het zenuwstelsel. Studenten worden vaak overweldigd door buitensporige details, waardoor de correlatie tussen structuur en functie moeilijker wordt. De presentatievolgorde is in een logische volgorde voor een klas, maar elke video is ontworpen om op zichzelf te staan ​​en just-in-time te worden gebruikt om een ​​klinisch punt te maken.

De serie is ontstaan ​​tijdens het lesgeven met een neuroloog in Ghana en Kenia, waar het duidelijk was dat het anatomieonderwijs jarenlang gescheiden van de kliniek was niet behouden. Hier presenteer ik net genoeg anatomie om het probleem van de patiënt te lokaliseren. Deze video's kunnen voor of na een klinische casuspresentatie worden gebruikt. Excuses worden aangeboden voor een paar kleine fouten die niet konden worden gecorrigeerd vanwege de eenmalige opnamemogelijkheid en een niet-gescripte persoonlijke stijl. Het publiek voor deze video's kan verpleegkundigen, arts-assistenten, medische studenten, bewoners, registrars, huispersoneel of iedereen die geïnteresseerd is in de hersenen zijn.

Video's kunnen ook worden gebruikt in combinatie met de NeurologicExam-website → Alle video's hebben Engelse bijschriften om diegenen te helpen voor wie Engels niet hun moedertaal is of om de vele nieuwe termen te visualiseren.


Redactionele beoordelingen

Beoordeling

Deze atlas biedt een uitstekende, gedetailleerde kaart van het gehele ruggenmerg van zowel rat als muis. De microfoto's zijn uitstekend, de etikettering is duidelijk en de illustraties moeten dienen als uitstekende voorbeelden van hoe hoogwaardige kleuring en immunocytochemie eruit zouden moeten zien. Deze informatie was nog niet eerder beschikbaar in een atlas van het CZS en zal een uiterst nuttige bron zijn voor alle neurowetenschappers die geïnteresseerd zijn in dit deel van het zenuwstelsel en een 'must-have' voor laboratoria van het ruggenmerg.

Jacqueline C. Bresnahan, hoogleraar, afdeling neurologische chirurgie, centrum voor hersen- en ruggenmergletsel, Universiteit van Californië in San Francisco, VS

Het ruggenmerg is een gezaghebbend en gedetailleerd verslag van de ontwikkeling, organisatie en functie van het ruggenmerg. Het boek is geschreven door een reeks experts en bevat verhelderende hoofdstukken die de anatomie en de architectuur van het ruggenmerg op een duidelijke en logische manier behandelen. Aandacht voor speciale onderwerpen, zoals dwarslaesie en mictie, is ongekend en buitengewoon informatief. De uitgebreide atlas, samen met de diagrammen en de lijst met referenties, zullen van groot nut zijn voor de studenten van het zenuwstelsel, evenals voor de meest ervaren onderzoekers. Het is een uitstekend volume!"

Moses V. Chao, hoogleraar celbiologie, fysiologie en neurowetenschappen en psychiatrie, Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU School of Medicine, New York, VS

Beoordeling

Over de auteur

Charles Watson is een neurowetenschapper en arts in de volksgezondheid. Zijn kwalificaties omvatten een medische graad (MBBS) en twee onderzoeksdoctoraten (MD en DSc). Hij is emeritus hoogleraar aan de Curtin University en bekleedt adjunct-professorial onderzoeksposities aan de University of New South Wales, de University of Queensland en de University of Western Australia.
Hij heeft meer dan 100 gerefereerde tijdschriftartikelen en 40 boekhoofdstukken gepubliceerd, en is co-auteur van meer dan 25 boeken over de anatomie van de hersenen en het ruggenmerg. De Paxinos Watson-atlas van rattenhersenen is meer dan 80.000 keer geciteerd. Zijn huidige onderzoek is gericht op de vergelijkende anatomie van de hippocampus en de claustrum.
Hij ontving in 2012 de graad van doctor in de wetenschappen aan de Universiteit van Sydney en ontving in 2018 de Distinguished Achievement Award van de Australasian Society for Neuroscience.

Professor George Paxinos, AO (BA, MA, PhD, DSc) voltooide zijn BA aan de University of California in Berkeley, zijn PhD aan McGill University en bracht een postdoctoraal jaar door aan de Yale University. Hij is de auteur van bijna 50 boeken over de structuur van de hersenen van mensen en proefdieren, waaronder The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, nu in de 7e editie, die door Thomson ISI is gerangschikt als een van de 50 meest geciteerde items in de Web van de wetenschap. Dr. Paxinos maakte de weg vrij voor toekomstig neurowetenschappelijk onderzoek door als eerste een driedimensionaal (stereotaxisch) raamwerk te produceren voor het plaatsen van elektroden en injecties in de hersenen van proefdieren, dat nu als een internationale standaard wordt gebruikt. Hij was lid van het eerste International Consortium for Brain Mapping, een op de UCLA gebaseerd consortium dat de hoogste ranking kreeg en werd gefinancierd door het door het NIMH geleide Human Brain Project. Dr. Paxinos is geëerd met meer dan negen onderscheidingen gedurende zijn jaren van onderzoek, waaronder: The Warner Brown Memorial Prize (University of California at Berkeley, 1968), The Walter Burfitt Prize (1992), The Award for Excellence in Publishing in Medical Science (Assoc Amer Publishers, 1999), The Ramaciotti Medal for Excellence in Biomedical Research (2001), The Alexander von Humbolt Foundation Prize (Duitsland 2004), en meer. --Deze tekst verwijst naar de hardcover editie.


  • Redactioneel &rlm : &lrm Academic Press Edición Illustrated (12 november 2008)
  • Idioom &rlm : &lrm Engels
  • Pasta dura &rlm : &lrm 387 pagina's
  • ISBN-10 &rlm : &lrm 0123742471
  • ISBN-13 &rlm : &lrm 978-0123742476
  • Afmetingen &rlm : &lrm 21.84 x 2.79 x 27.94 cm

Críticas

Deze atlas biedt een uitstekende, gedetailleerde kaart van het gehele ruggenmerg van zowel rat als muis. De microfoto's zijn uitstekend, de etikettering is duidelijk en de illustraties moeten dienen als uitstekende voorbeelden van hoe hoogwaardige kleuring en immunocytochemie eruit zouden moeten zien. Deze informatie was nog niet eerder beschikbaar in een atlas van het CZS en zal een uiterst nuttige bron zijn voor alle neurowetenschappers die geïnteresseerd zijn in dit deel van het zenuwstelsel en een 'must-have' voor laboratoria van het ruggenmerg. --Jacqueline C. Bresnahan, professor, afdeling neurologische chirurgie, centrum voor hersen- en ruggenmergletsel, Universiteit van Californië in San Francisco, VS

Het ruggenmerg is een gezaghebbend en gedetailleerd verslag van de ontwikkeling, organisatie en functie van het ruggenmerg. Het boek is geschreven door een reeks experts en bevat verhelderende hoofdstukken die de anatomie en de architectuur van het ruggenmerg op een duidelijke en logische manier behandelen. Aandacht voor speciale onderwerpen, zoals dwarslaesie en mictie, is ongekend en buitengewoon informatief. De uitgebreide atlas, samen met de diagrammen en de lijst met referenties, zullen van groot nut zijn voor de studenten van het zenuwstelsel, evenals voor de meest ervaren onderzoekers. Het is een uitstekend nummer! --Moses V. Chao, hoogleraar celbiologie, fysiologie en neurowetenschappen en psychiatrie, programma voor moleculaire neurobiologie, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU School of Medicine, New York, VS

Biografie van de auteur

Charles Watson is een neurowetenschapper en arts in de volksgezondheid. Zijn kwalificaties omvatten een medische graad (MBBS) en twee onderzoeksdoctoraten (MD en DSc). Hij is emeritus hoogleraar aan de Curtin University en bekleedt adjunct-professorial onderzoeksposities aan de University of New South Wales, de University of Queensland en de University of Western Australia.
Hij heeft meer dan 100 gerefereerde tijdschriftartikelen en 40 boekhoofdstukken gepubliceerd, en is co-auteur van meer dan 25 boeken over de anatomie van de hersenen en het ruggenmerg. De Paxinos Watson-atlas van rattenhersenen is meer dan 80.000 keer geciteerd. Zijn huidige onderzoek is gericht op de vergelijkende anatomie van de hippocampus en de claustrum.
Hij ontving in 2012 de graad van doctor in de wetenschappen aan de Universiteit van Sydney en ontving in 2018 de Distinguished Achievement Award van de Australasian Society for Neuroscience.

Professor George Paxinos, AO (BA, MA, PhD, DSc) voltooide zijn BA aan de University of California in Berkeley, zijn PhD aan McGill University en bracht een postdoctoraal jaar door aan de Yale University. Hij is de auteur van bijna 50 boeken over de structuur van de hersenen van mensen en proefdieren, waaronder The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, nu in de 7e editie, die door Thomson ISI is gerangschikt als een van de 50 meest geciteerde items in de Web van de wetenschap. Dr. Paxinos maakte de weg vrij voor toekomstig neurowetenschappelijk onderzoek door als eerste een driedimensionaal (stereotaxisch) raamwerk te produceren voor het plaatsen van elektroden en injecties in de hersenen van proefdieren, dat nu als een internationale standaard wordt gebruikt. Hij was lid van het eerste International Consortium for Brain Mapping, een op de UCLA gebaseerd consortium dat de hoogste ranking kreeg en werd gefinancierd door het door het NIMH geleide Human Brain Project. Dr. Paxinos is geëerd met meer dan negen onderscheidingen gedurende zijn jaren van onderzoek, waaronder: The Warner Brown Memorial Prize (University of California at Berkeley, 1968), The Walter Burfitt Prize (1992), The Award for Excellence in Publishing in Medical Science (Assoc Amer Publishers, 1999), The Ramaciotti Medal for Excellence in Biomedical Research (2001), The Alexander von Humbolt Foundation Prize (Duitsland 2004), en meer.


Postnataal muizenruggenmerg vertegenwoordigt een goed modelsysteem om myelinisatie van het centrale zenuwstelsel van zoogdieren te bestuderen in vivo als basis voor verder onderzoek naar demyeliniserende ziekten.

Transcriptionele veranderingen werden geanalyseerd in SJL/J-muizen op postnatale dag 0, 14, 49 en 231 (P0, P14, P49, P231) met behulp van Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0-arrays. Bovendien werden merkergensignaturen voor afstammingsstadia van astrocyten en oligodendrocyten gedefinieerd om hun genexpressie in meer detail te bestuderen. Bovendien werd immunohistochemie gebruikt om de overvloed aan veelgebruikte gliacelmarkers te kwantificeren.

6092 differentieel gereguleerde genen (DEG's) werden geïdentificeerd. De opwaarts gereguleerde DEG's op P14, P49 en P231 vergeleken met P0 vertoonden significant verrijkte associaties met genontologietermen zoals myelinisatie en lipide metabool transport en neerwaarts gereguleerde DEG's naar neurogenese en axonogenese. Expressiewaarden van markergensignaturen voor neurale stamcellen, oligodendrocytprecursorcellen en zich ontwikkelende astrocyten namen voortdurend af, terwijl myeliniserende oligodendrocyten en volwassen astrocytenmarkers een gestage toename vertoonden. Moleculaire bevindingen werden bevestigd door immunohistochemische waarnemingen.

De waargenomen transcriptionele veranderingen zijn een belangrijke referentie voor toekomstige analyse van degeneratieve en inflammatoire aandoeningen in het ruggenmerg.


Resultaten

Kv3.1b is gelokaliseerd in de knooppunten van Ranvier in het CNS

Het Kv3.1-gen geeft aanleiding tot twee verschillende kanaalsubeenheden, Kv3.1a en Kv3.1b, door alternatieve splicing (Luneau et al., 1991). Hun voorspelde eiwitsequenties divergeren alleen aan hun C-terminals. We hebben ons gericht op Kv3.1b omdat het veel overvloediger is dan Kv3.1a in de hersenen van volwassen ratten (Perney et al., 1992 Gan en Kaczmarek, 1998). Onze voorlopige onderzoeken onthulden dat cryosecties van niet-gefixeerd ruggenmerg sterkere Kv3.1b-kleuring hebben dan weefsels die zijn gefixeerd met 4% paraformaldehyde of Zamboni's fixeermiddel, en dat de grijze stof sterk gekleurd was. Om de knooppunten van Ranvier te lokaliseren, kleurden we transversale secties van niet-gefixeerd ruggenmerg van volwassen muizen met een konijnenantiserum tegen Kv3.1b of Kv3.2 en een monoklonaal muisantilichaam dat een sequentie herkent die gemeenschappelijk is voor alle Nav kanaal α subeenheden. Zwakke Kv3.2-kleuring werd gezien in de grijze stof van het ruggenmerg, maar niet in de witte stof (gegevens niet getoond). Zoals weergegeven in figuur 1A𠄿 , werden talrijke knooppunten gelabeld voor Kv3.1b in alle witte stofkanalen, maar het aandeel Kv3.1b-positieve knooppunten verschilde (Fig. 2EEN ). In de zijkolom (Fig. 1A,B ) en de ventrale funiculus (Fig. 1CD ), werden bijna alle knooppunten gecolabeld voor Nav en Kv3.1b-kanalen. In het corticospinale kanaal daarentegen (Fig. 1E,F ), werden relatief minder knooppunten gelabeld voor Kv3.1b. Wanneer waargenomen bij hoge vergroting, Kv3.1b en Nav kleuring van kanalen leek cirkelvormig, wat bevestigt dat ze tot expressie werden gebracht op knooppunten (Fig. 3 .).A𠄼 , inzetstukken). Bovendien kwam Kv3.1b-kleuring in langsdoorsneden precies overeen met die van Nav kanalen ( Afb. 3A𠄼 , dubbele pijlpunten). De kleuring voor Kv3.1b was specifiek omdat deze werd opgeheven door het antiserum vooraf te incuberen met het peptide (gegevens niet getoond). Verder werd er geen Kv3.1b-kleuring gevonden in Kv3.1-deficiënte muizen (Fig. 1 .).G,H ), die zowel Kv3.1a als Kv3.1b isovormen missen (Ozaita et al., 2002).

Lokalisatie van Kv3.1b in het ruggenmerg van volwassen muizen. Dwarsdoorsneden van niet-gefixeerd thoracaal ruggenmerg werden dubbel gelabeld met een konijn Kv3.1b antiserum [tetramethylrhodamine isothiocyanaat (TRITC)] en een “pan” monoklonaal antilichaam (FITC) tegen Nav kanalen (panNav). In de laterale (A, B) en ventrale (C, D) kolommen van het ruggenmerg, de meeste knooppunten waren dubbel gelabeld, maar in de dorsale kolom (dc) en vooral in het corticospinale kanaal (cst) (E, F), was slechts een subset van knooppunten Kv3.1b-positief. Let op de intense kleuring voor Kv3.1b in de dorsale hoorn (dh) en ventrale hoorn (vh) van het ruggenmerg. In Kv3.1-deficiënte (-/-) muis werd geen labeling waargenomen voor Kv3.1b (de ventrale kolom wordt getoond) (G, H). Schaalbalk, 20 μm.

Kv3.1b-labeling in het ruggenmerg van volwassen muizen, de oogzenuw en DRG. Longitudinale secties van de ventrale kolom (A𠄼) en rughoorn (G–I) van het ruggenmerg, evenals de oogzenuw (D𠄿) en DRG (J–L), dubbel gelabeld met een konijn Kv3.1b antiserum (TRITC) en een monoklonaal antilichaam (FITC) tegen Nav kanalen (panNav) zijn getoond. In A𠄼, Kv3.1b is exclusief gecolokaliseerd met Nav kanalen in de knooppunten (dubbele pijlpunten). De inzet toont een knoop in een dwarsdoorsnede. In D𠄿, waren enkele knooppunten Kv3.1b-positief. In G–I, Kv3.1b lijkt, althans gedeeltelijk, tot expressie te worden gebracht in het somatische membraan van neuronen, maar was niet gecolokaliseerd met Nav kanalen in de eerste segmenten (pijlen). In J–L, veel somata uitgedrukt Nav kanalen, maar weinigen gaven Kv3.1b weer. Pijlen geven initiële segmenten aan. Schaalbalken: (in C) A𠄼, 20 μm (in F) D𠄿, 20 μm (in l) G–I, 20 μm (in L) J–L, 20 μm (in C, inzet) A𠄼, inzetstukken, 5 μm.

Verband tussen Kv3.1b-expressie en knoopdiameter in de dorsale en ventrale funiculus van het ruggenmerg van volwassen muizen. Het aantal knopen en Kv3.1b-positieve knopen worden weergegeven in functie van het bereik van de knoopdiameter voor de dorsale (C) en ventrale (NS) funiculus. In B, wordt het percentage Kv3.1b-positieve knooppunten in het hele ruggenmerg weergegeven in de functie van het knoopdiameterbereik. Merk op dat bijna alle grote knooppunten (ϡ.8 μm) Kv3.1b-positief zijn, terwijl 7�% van de kleine knooppunten (ρ.8 μm) Kv3.1b-negatief zijn, en dat Kv3.1b meer vertegenwoordigd is in kleine knopen van de ventrale funiculus dan in de dorsale funiculus. Gegevens werden verkregen van twee muizen en worden weergegeven als gemiddelden ± SD N = 1394.

We vermoedden dat de reden voor de variatie in knoopkleuring de variatie in de samenstelling van axonen in verschillende traktaten was. In het bijzonder leek de grootte van gemyeliniseerde axonen te correleren met Kv3.1b-knoopkleuring. De CST bevat veel kleine gemyeliniseerde axonen (Hildebrand, 1972 Murray en Blakemore, 1980 Chung en Coggeshall, 1987), terwijl de ventrale en laterale funiculi veel grote gemyeliniseerde axonen bevatten. Om dit probleem aan te pakken, hebben we secties van optische zenuwen van muizen en ratten, die voornamelijk kleine gemyeliniseerde vezels bevatten, immunologisch gekleurd (Matheson, 1970), en ontdekten dat 14% van de knooppunten was gelabeld voor Kv3.1b. De knopen die gekleurd waren, leken een grotere diameter te hebben dan de niet-gelabelde knopen (Fig. 3 .).D𠄿 ). Om te bevestigen dat Kv3.1b-expressie gerelateerd is aan de diameter van de vezels, werd een kwantitatieve studie uitgevoerd en het aantal knooppunten en Kv3.1b-positieve knooppunten ten opzichte van het diameterbereik van de knooppunten werd gemeten. We ontdekten dat bijna elke knoop met een diameter van ϡ.8 mm Kv3.1b-positief was, terwijl 54 tot 93% van de knopen met een diameter van ρ.8 mm Kv3.1b-positief waren (Fig. 2B ). Deze gegevens ondersteunen een verband tussen de axonale diameter en de knooplokalisatie van Kv3.1b. Omdat kleine knopen in de ventrale funiculus echter vaker Kv3.1b-positief zijn dan die in de dorsale funiculus (Fig. 3C,D ), blijkt dat ook andere factoren de expressie van Kv3.1b beïnvloeden.

Omdat knooppunten en beginsegmenten beide ankyrine G en Na . hebbenv kanalen, hebben we bepaald of Kv3.1b tot expressie werd gebracht in initiële axonale segmenten door longitudinale secties van het ruggenmerg en secties van dorsale wortelganglia te labelen. Hoewel de grijze stof intens gelabeld was (waarschijnlijk overeenkomend met oppervlaktekleuring van somata en presynaptische terminals) (Sekirnjak et al., 1997), werden initiële segmenten niet gekleurd (Fig. 3G–I ). De sensorische neuronen in de dorsale ganglia hadden daarentegen weinig Kv3.1b-kleuring, dit kan te maken hebben met de afwezigheid van synapsen op hun cellichamen (Fig. 3J–L ). Net als in het ruggenmerg waren de eerste segmenten van sensorische neuronen Kv3.1b-negatief.

Lokalisatie van Kv3.1b en Kv3.2 in de PNS

We onderzochten de lokalisatie van Kv3.1b en Kv3.2 in geplaagde vezels van ischiaszenuwen van volwassen muizen. PNS-knooppunten waren Kv3.2-negatief (gegevens niet getoond), en slechts 23% van de knooppunten bracht Kv3.1b tot expressie (Fig. 4A,B ) was de labeling zelfs in deze knooppunten minder intens dan die in het CZS. Toen het mogelijk was om enkele vezels te volgen, zagen we dat alle knooppunten gekleurd of ongekleurd waren, wat suggereert dat Kv3.1b tot expressie werd gebracht in een specifieke subset van vezels, misschien gerelateerd aan hun functie. Om dit punt op te helderen, kleurden we geplaagde vezels van zowel de dorsale als de ventrale wortels, maar vonden Kv3.1-positieve knooppunten in vezels met zowel kleine als grote diameter van de dorsale en ventrale wortels (gegevens niet getoond). We onderzochten ook de ontwikkeling van Kv3.1b-expressie in de dorsale en ventrale wortels. Op P4 en P8 werd geen nodale kleuring waargenomen, sommige clusters werden waargenomen op P12 en veel meer op P15 en P21 (gegevens niet getoond). Deze waarnemingen sluiten de mogelijkheid uit dat PNS-knooppunten tijdens de ontwikkeling de expressie van Kv3.1 verliezen. De functionele betekenis van Kv3.1b-positieve PNS-knooppunten moet dus nog worden vastgesteld.

Er zijn maar weinig PNS-knooppunten die Kv3.1b uitdrukken. Niet-gefixeerde geplaagde vezels van de heupzenuw van volwassen muizen werden dubbel gelabeld met een Kv3.1b-antiserum van konijnen (TRITC,EEN) en een monoklonaal antilichaam tegen Nav kanalen (FITC, B). Eén Kv3.1b-positieve knoop is aangegeven (dubbele pijlpunten) twee andere knooppunten zijn Kv3.1b-negatief. Schaalbalk, 10 μm.

Omdat motorische en sensorische neuronen gemyeliniseerde vezels hebben met zowel CNS- als PNS-myeline, onderzochten we secties van de ventrale wortelingangszone, de overgangszone tussen CNS en PNS-myeline voor motorvezels. Secties gecolabeld voor Kv3.1b en Kv1.2 laten zien dat Kv3.1b-positieve knopen worden gevonden in het ruggenmerg maar niet in de wortels, terwijl Kv1.2-positieve juxtaparanodes op beide plaatsen werden gevonden (Fig. 5A𠄼 ). De sterke nodale labeling van Kv3.1b in motoraxonen lijkt dus af te hangen van een bepaald aspect van de CZS-omgeving, vermoedelijk gerelateerd aan oligodendrocyten of astrocyten.

Differentiële lokalisatie van Kv3.1b en Kv1.2 in CNS-axonen. Dit zijn afbeeldingen van langsdoorsneden van de ventrale kolom (vc) van niet-gefixeerd lumbale ruggenmerg van volwassen muizen. In het ruggenmerg is de smalle band van nodale Kv3.1b-kleuring (TRITC EEN) wordt geflankeerd door twee bredere regio's van juxtaparanodale Kv1.2-kleuring (FITC B). C, Samenvoegen. Let op het relatieve gebrek aan labeling voor Kv3.1b in de PNS-knooppunten (dubbele pijlpunten) van de ventrale wortel (vr). Schaalbalk, 10 μm.

Ontwikkelingsuitdrukking van Kv3.1b

Ankyrin G is de eerste moleculaire component die gelokaliseerd wordt in de ontwikkeling van CZS-knooppunten Nav kanalen, L1, neurofascin en βIV-spectrine worden later gerekruteerd (Jenkins en Bennett, 2001). Om te bepalen wanneer Kv3.1b gelokaliseerd wordt in knooppunten, hebben we transversale secties van het thoracale ruggenmerg van ratten op P4, P8, P12 en P21 immunologisch gekleurd. Op P4 waren er clusters van Nav kanalen in de ventrale en laterale kolommen (Fig. 6B ), maar geen Kv3.1b-kleuring in de witte stof of zelfs de grijze stof (Fig. 6EEN ). Op P8 was er een zwakke Kv3.1b-kleuring in de grijze stof en clusters van Kv3.1b in een minderheid van knooppunten in de ventrale kolom (Fig. 6CD ). In langsdoorsneden van de ventrale kolom leek Kv3.1b selectief te zijn gelokaliseerd op 'grote' knopen (korte knopen in plaats van in langgerekte knopen Rasband et al., 1999a). Op P12 nam het aantal, evenals de kleurintensiteit van Kv3.1b-positieve knooppunten aanzienlijk toe (Fig. 6E,F ), en in langsdoorsneden verschenen Kv3.1b-clusters meestal in korte, volwassen lijkende knooppunten (Fig. 7EEN ). Op P21 is de verdeling van Kv3.1b-positieve knooppunten (Fig. 6G,H ) leek vergelijkbaar met die bij volwassen ratten.

Vertraagde verschijning van Kv3.1b op CNS-knooppunten. Dit zijn afbeeldingen die worden weergegeven als negatieven (de knooppunten zijn donker) van transversale secties van niet-gefixeerd thoracaal ruggenmerg van P4 (A, B) P8 (C, D), P12 (E, F), en P21 (G, H) ratten. De ventrale kolom (vc) wordt getoond, evenals de ventrale hoorn (vh) in A𠄿. Op P4, Nav kanalen, maar niet Kv3.1b-kanalen waren geclusterd. Kv3.1b clusters waren aanwezig door P8, en hun aantal, evenals dat van Nav kanalen, verhoogd van P4 naar P21. Op P21 werden knooppunten gelabeld voor zowel Nav kanalen en Kv3.1b. Schaalbalken: (in B) A, B, 20 μm (in H) B–H, 20 μm.

Kv3.1b verschijnt vóór Kv1.2 in gemyeliniseerde vezels van het CZS. Dit zijn longitudinale doorsneden van de ventrale kolom van niet-gefixeerde ventrale lumbale ruggengraat van de rat op P12 (EEN), P15 (B), en P21 (C). Op P12 en P15 was nodale Kv3.1b-kleuring vaak niet geassocieerd met juxtaparanodale Kv1.2-kleuring, terwijl op P21 de meeste knooppunten werden geflankeerd door juxtaparanodale Kv1.2-labeling. Schaalbalken, 10 μm.

We hebben de mogelijkheid overwogen dat Kv3.1b gelijktijdig zou kunnen clusteren met Kv1.1/Kv1.2-subeenheden. Kv1.1 en Kv1.2 zijn de laatste kanalen die worden gescheiden in het ontwikkelen van CNS (Rasband et al., 1999b), op ongeveer P8 in het ruggenmerg (Wang et al., 1995), en hun clustering in het juxtaparanodale gebied hangt af op de vorming van normale myeline-omhulsels, met name intacte septaatachtige verbindingen (Baba et al., 1999 Mathis et al., 2001 Arroyo et al., 2002). Longitudinale secties door de ventrale kolommen van lumbale ruggenmerg van P4-, P8-, P12-, P15- en P21-ratten waren dubbel gelabeld voor Kv3.1b en Kv1.2. Er werd geen kleuring voor Kv1.2 waargenomen op P4 in het ruggenmerg en er werden weinig clusters van Kv1.2 waargenomen op P8 (gegevens niet getoond). Op P12 hadden de meeste Kv3.1b-positieve knooppunten geen bijbehorende Kv1.2-kleuring (Fig. 7 .).EEN ). Op P15 nam het aandeel Kv3.1b-positieve knooppunten geassocieerd met Kv1.2-kleuring toe, en tegen P21 werden alle Kv3.1b-positieve knooppunten geflankeerd door juxtaparanodale Kv1.2-kleuring (Fig. 7B,C ). Samen laten deze resultaten zien dat ionkanaalclustering in gemyeliniseerde vezels de volgorde volgt: Nav kanalen, dan Kv3.1b-subeenheden, dan Kv1.2-subeenheden.

Is nodale clustering van Kv3.1b afhankelijk van myelinisatie?

Om deze vraag te beantwoorden, hebben we de lokalisatie van Kv3.1b bestudeerd in md ratten, die typisch sterven bij ongeveer P21 door ernstige dysmyelinisatie geassocieerd met celdood van oligodendrocyten (Grinspan et al., 1998). Zelfs op deze leeftijd zijn er maar weinig axonen gemyeliniseerd in het ruggenmerg. axonale segmenten zijn omhuld door enkele wikkels van oligodendrocytprocessen, die kunnen worden gedetecteerd door hun expressie van MAG, of zijn volledig verstoken van omhulling (Dentinger et al., 1982 Rosenbluth, 1987 Arroyo et al., 2002). Niettemin bevatten hun ruggenmerg normale aantallen knoopachtige clusters van Nav kanalen en ankyrine G, zelfs in regio's zonder oligodendrocyten (Arroyo et al., 2002). Zoals getoond in Figuur 8, Kv3.1b en Nav kanalen werden gecolokaliseerd in het ruggenmerg van P21 md ratten (A𠄼) en hun op leeftijd afgestemde WT nestgenoten (D𠄿). Dubbele labeling voor MAG toonde aan dat sommige knoopachtige clusters van Kv3.1b werden geflankeerd door MAG-omhulde segmenten, maar veel werden gevonden in niet-omhulde axonale segmenten (Fig. 8G ). Daarentegen was de lokalisatie van de Kv1.2-subeenheden sterk veranderd in md ratten: Kv1.2-subeenheden grensden aan de knoopachtige clusters van Kv3.1b (Fig. 8H ) in plaats van geconcentreerd te zijn in de juxtaparanodale gebieden zoals bij WT-ratten (Fig. 8l ). Deze resultaten laten zien dat knooppuntachtige clusters van Kv3.1b zich op dezelfde manier gedragen als clusters van Nav kanalen in md ratten (Arroyo et al., 2002): beide worden gevormd tijdens de ontwikkeling en worden op zijn minst tijdelijk gehandhaafd, zelfs in de afwezigheid van myeline-omhulsels.

Knooppuntachtige clusters van Kv3.1b in md ratten. Longitudinale doorsneden door de ventrale funiculus van niet-gefixeerd lumbale ruggenmerg van P21 md ratten en hun WT mannelijke nestgenoten waren dubbel gelabeld met een konijn Kv3.1b antiserum (TRITC) en een monoklonaal antilichaam (FITC) tegen Nav kanalen (pan Nav A𠄿), MAG (G), of Kv1.2 (HOI). In A𠄿, merk op dat in beide md en WT-ratten, knoopachtige clusters Kv3.1b gecolokaliseerd met Nav kanalen (dubbele pijlen). In G, merk op dat veel knooppuntachtige clusters van Kv3.1b (pijlpunten) werden gevonden in regio's zonder MAG-positieve oligodendrocytprocessen. De sterretjes markeren oligodendrocytkernen. In HOI, merk op dat de lokalisatie van Kv1.2 (pijlen) is gewijzigd in md ratten, grenzend aan de knoopachtige clusters van Kv3.1b (dubbele pijlen). Schaalbalken: (in C) A𠄼, 10 μm (in F) D𠄿, 10 μm G, 10 μm H, 10 μm l, 10 μm.

Kv3.1b wordt geassocieerd met ankyrine G in hersenmembranen

De colokalisatie van Kv3.1b, Nav kanalen en ankyrine G in CZS-knooppunten suggereerden dat Kv3.1b direct of indirect kan interageren met ankyrine G. De nodale isovormen van ankyrine G interageren met verschillende nodale eiwitten zoals Nav kanaal α en β subeenheden, neurofascin en neuraal-gliaal-gerelateerde CAM (NrCAM) (Malhotra et al., 2000 Bennett en Chen, 2001). Om het expressieniveau van Kv3.1b en Kv3.2 in de hersenen, het ruggenmerg, de oogzenuw en de heupzenuw te bepalen, hebben we een Western-blot-analyse van deze weefsels uitgevoerd (Fig. 9). De hersenen en het ruggenmerg van ratten brachten meer Kv3.1b tot expressie dan de oogzenuw Kv3.1b kon niet worden gedetecteerd in de heupzenuw van de rat. De bovenstaande gegevens komen overeen met de bevinding dat CZS-knooppunten robuustere Kv3.1b-expressie hebben dan PNS-knooppunten. Het anti-Kv3.1b-antiserum herkende een diffuse band van �� kDa, significant groter dan de 66 kDa verwacht voor het Kv3.1b-polypeptide verkregen door translatie van het Kv3.1b-cDNA (Luneau et al., 1991), maar in goede overeenstemming met de resultaten van Weiser et al. (1995) op membranen van rattenhersenen. Deze band is vrijwel zeker Kv3.1b, omdat het afwezig is in hersenmembranen van Kv3.1b-deficiënte muizen (Fig. 9EEN ). Kv3.2 werd ook gedetecteerd in hersenmembranen, en in mindere mate in het ruggenmerg, met een molecuulgewichtbereik van 75� kDa (Fig. 9B ). Kv3.2 werd echter niet gedetecteerd in optische en heupzenuwen, in overeenstemming met de immunokleuring. We hebben geen veranderingen gedetecteerd in Kv3.2-kleuring in Kv3.1-deficiënte muisruggenmerg of hersenen in het bijzonder, knooppunten waren niet Kv3.2-positief (gegevens niet getoond). Bovendien hebben we geen wijzigingen in de etikettering gedetecteerd voor contactine, Caspr, Kv1.1, ankyrine G of Nav kanalen (gegevens niet getoond), wat suggereert dat de afwezigheid van Kv3.1 de organisatie van deze axonale eiwitten in gemyeliniseerde vezels niet verandert.

Distributie en interactie met ankyrine G van Kv3.1b- en Kv3.2-subeenheden. A, B, Membraaneiwitten (100 μg) van Kv3.1-deficiënte muizenhersenen en rattenhersenen, ruggenmerg, oogzenuw en heupzenuw werden gefractioneerd in SDS-gel en onderworpen aan immunoblotting voor Kv3.1b (EEN) en Kv3.2 (B). Kv3.1b kwam tot expressie in rattenhersenen en ruggenmerg, en in mindere mate in de oogzenuw. Er werd geen band waargenomen in Kv3.1-deficiënte muizen. Kv3.2 werd gedetecteerd in de hersenen van muizen en ratten en in mindere mate in het ruggenmerg van de rat. C, Hersenen en ruggenmergmembranen (200 μg) werden afzonderlijk geïmmunoprecipiteerd voor Kv3.1b of Kv3.2 en vervolgens geïmmunoblot voor Kv3.1b. Merk op dat Kv3.1b co-immunoprecipiteert met Kv3.2 in de hersenen, maar niet in het ruggenmerg. D, E, Membranen van hersenen en ruggenmerg (200 μg) werden geïmmunoprecipiteerd met anti-ankyrine G (Ank-G), konijnen-anti-Kv3.1b, konijnen-anti-Kv3.2 of muizen-anti-Kv1.2-antilichamen, en vervolgens immunoblotting voor Kv3.1b (NS) of ankyrine G (E). Hersenmembraan (BM) werd gebruikt als een positieve controle. Kv3.1b co-immunoprecipitaten met ankyrine G en Kv3.2, maar niet Kv1.2 (NS). Een laagmoleculaire isovorm van ankyrine G werd naar beneden getrokken met Kv3.1b, maar niet met Kv3.2 of Kv1.2 (E). Molecuulgewichtsmarkeringen worden rechts weergegeven in kilodalton.

Omdat subeenheden van de spanningsafhankelijke K + -kanalen heteromere kanalen kunnen vormen met leden van hun eigen familie (Kv1, Kv2, Kv3 en Kv4), hebben we Kv3.2 geïmmunoprecipiteerd om te bepalen of Kv3.1b- en Kv3.2-subeenheden zouden kunnen interageren. Toen Kv3.2 werd neergeslagen, trok het meer Kv3.1b naar beneden in de hersenen dan in het ruggenmerg (Fig. 9C ), in overeenstemming met het relatieve gebrek aan Kv3.2 in het ruggenmerg. Deze resultaten geven aan dat Kv3.1b specifiek heteromere kanalen zou kunnen vormen met Kv3.2 in het CZS, maar als ze dat doen, is het niet op knooppunten.

Om te bepalen of ankyrine G interageert met Kv3.1b, werden CNS-membranen geïncubeerd met antisera tegen ankyrine G of Kv3.1b, en de immunoprecipitaten werden onderzocht op dezelfde eiwitten. We gebruikten immunoprecipitaten voor Kv3.2 als een positieve controle en immunoprecipitaten voor Kv1.2 als een negatieve controle. Toen ankyrine G uit hersenmembranen werd geprecipiteerd, trok het Kv3.1b naar beneden (Fig. 9 .).NS ). Kv3.1b trok echter geen isovormen met een hoog molecuulgewicht van ankyrine G naar beneden, maar een isovorm van ankyrine G van � kDa (Fig. 9E ). Noch Kv3.2, noch Kv1.2 co-immunoprecipiteerde deze isovorm van ankyrine G (Fig. 9E ). Omdat ankyrine G gevoelig is voor proteolyse (Davis en Bennett, 1984), zou deze isovorm kunnen corresponderen met een afbraakproduct van de hoogmoleculaire nodale isovormen van ankyrine G. Als alternatief zou dit resultaat erop kunnen wijzen dat een isovorm van ankyrine G dat is niet gelokaliseerd op knooppunten interageert met Kv3.1b, omdat zowel ankyrin G als Kv3.1b aanwezig zijn in grijze stof.

Neemt Kv3.1b deel aan AP-repolarisatie in CNS-knooppunten?

Om deze vraag te beantwoorden, hebben we de effecten getest van 4-AP, een krachtige blokker van Kv3.1b (Grissmer et al., 1994), op de CAP's die zijn geregistreerd van de heupzenuw, de ventrale funiculus van het ruggenmerg en de oogzenuw van volwassen ratten. 4-AP verhoogde de duur van de CAP's van heupzenuwen enigszins (Fig. 10EEN ), maar verbreedden de CAP's die werden geregistreerd van de ventrale funiculus van het ruggenmerg en de oogzenuw (Fig. 10).EEN ). Het gebrek aan effect van 4-AP in het PNS kan te wijten zijn aan de zwakke expressie van Kv3.1b in de heupzenuw, maar 4-AP had invloed op de oogzenuw, waarin weinig knooppunten Kv3.1b-positief waren. Om deze discrepantie op te lossen, hebben we CAP's opgenomen van de oogzenuwen van Kv3.1-deficiënte en op leeftijd afgestemde WT-muizen. CAP's geregistreerd van WT- en Kv3.1-deficiënte muizen hadden vergelijkbare aanvang, pieken en duur (Fig. 10B ). The recruitment and refractory period of the fibers were also similar (data not shown). Moreover, 4-AP broadened the CAPs from both the WT and the mutant mice ( Fig. 10B ). These results suggest that the effects of 4-AP in the optic nerve axons are not mediated by Kv3.1 another nodal K + channel subunit could mediate these effects.

Effects of 4-AP on the CAPs of rat sciatic nerves, spinal cord ventral funiculi and optic nerves, as well as WT and Kv3.1-deficient mouse optic nerves. EEN, 4-AP (500 μ m ) increased slightly the duration of the CAPs from rat sciatic nerves (top traces, N = 2), but prolonged greatly the CAPs from the ventral funiculus (middle traces, N = 5) and optic nerve (bottom traces, N = 6).B, In WT (N = 2) and Kv3.1-deficient mice (N = 2), the characteristics of the optic nerve CAPs were identical, and 4-AP had similar effects.


Beoordeling

"This atlas provides an excellent, detailed map of the entire spinal cord of both rat and mouse. The photomicrographs are outstanding, the labelling is clear and the illustrations should serve as outstanding examples of what high quality staining and immunocytochemistry should look like. This information has not been available in any atlas of the CNS before, and will be an extremely useful resource for all neuroscientist interested in this part of the nervous system and a 'must-have' for spinal cord labs." --Jacqueline C. Bresnahan, Professor, Department of Neurological Surgery, Brain and Spinal Injury Center, University of California at San Francisco, USA

"The Spinal Cord is an authoritative and detailed account of the development, organization and function of the spinal cord. Written by a series of experts, the book contains enlightening chapters that cover the anatomy and the architecture of the spinal cord in a clear and logical fashion. Attention to special topics, such as spinal cord injury and micturition, is unprecedented and unusually informative. The comprehensive atlas, along with the diagrams and list of references, will be of considerable use to the students of the nervous system, as well as the most senior of investigators. It is an excellent volume!" --Moses V. Chao, Professor of Cell Biology, Physiology and Neuroscience and Psychiatry, Molecular Neurobiology Program, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU School of Medicine, New York, USA

Over de auteur

Charles Watson is a neuroscientist and public health physician. His qualifications included a medical degree (MBBS) and two research doctorates (MD and DSc). He is Professor Emeritus at Curtin University, and holds adjunct professorial research positions at the University of New South Wales, the University of Queensland, and the University of Western Australia.
He has published over 100 refereed journal articles and 40 book chapters, and has co-authored over 25 books on brain and spinal cord anatomy. The Paxinos Watson rat brain atlas has been cited over 80,000 times. His current research is focused on the comparative anatomy of the hippocampus and the claustrum.
He was awarded the degree of Doctor of Science by the University of Sydney in 2012 and received the Distinguished Achievement Award of the Australasian Society for Neuroscience in 2018.

Professor George Paxinos, AO (BA, MA, PhD, DSc) completed his BA at The University of California at Berkeley, his PhD at McGill University, and spent a postdoctoral year at Yale University. He is the author of almost 50 books on the structure of the brain of humans and experimental animals, including The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, now in its 7th Edition, which is ranked by Thomson ISI as one of the 50 most cited items in the Web of Science. Dr. Paxinos paved the way for future neuroscience research by being the first to produce a three-dimensional (stereotaxic) framework for placement of electrodes and injections in the brain of experimental animals, which is now used as an international standard. He was a member of the first International Consortium for Brain Mapping, a UCLA based consortium that received the top ranking and was funded by the NIMH led Human Brain Project. Dr. Paxinos has been honored with more than nine distinguished awards throughout his years of research, including: The Warner Brown Memorial Prize (University of California at Berkeley, 1968), The Walter Burfitt Prize (1992), The Award for Excellence in Publishing in Medical Science (Assoc Amer Publishers, 1999), The Ramaciotti Medal for Excellence in Biomedical Research (2001), The Alexander von Humbolt Foundation Prize (Germany 2004), and more.


MATERIALEN EN METHODES

Dieren. Twenty-nine adult female cats (8 intact and 21 spinal cord-transected) were used in the present experiments (Table1). Cats that had undergone complete low-thoracic spinal cord transection were maintained for 3–25 months.

Summary of postoperative training status and tissue analysis procedures

Spinal cord transection. During all surgical procedures, sodium pentobarbital (35 mg/kg, i.p.) was administered to each cat after pretreatment with atropine sulfate (0.9 mg/kg, s.c.) and acepromazine maleate (10 mg/kg, i.m.). Supplemental doses of the anesthetic were administered as needed during surgery to maintain a low level of arousal.

The spinal cords of the cats were transected completely as described previously (Roy et al., 1992). Briefly, a skin incision was made on the back to expose the vertebral processes between T10 and L1. A partial laminectomy was performed to expose the spinal cord between T11 and T13. Fine scissors were used to open the dura and to transect the bulk of the spinal cord. Fine forceps and miniature cotton balls were used to complete the transection while preserving the ventral artery. The completeness of the transection was easily verified as the spinal cord retracted at both ends, leaving a 3–5 mm space. Gelfoam was inserted between the two ends the area was thoroughly flushed with saline and the muscle and skin above the lesion site were closed with sutures. Postspinalization management of the spinal cats was performed as described previously (Roy et al., 1992). After all surgical procedures, the animals were placed in a warm incubator and allowed 1 d of recovery before they were returned to their cages.

Antibiotics were administered twice daily to each animal for 1 week after surgery. The cats were housed in spacious cages, two to four cats per cage. After spinal cord transection, the cage floors were covered with shredded newspaper, and the bladders and colons of the cats were expressed daily. Dry kibble and water were given ad libitum, and wet food was given once daily. All procedures were performed in accordance with the following guidelines: care and use of laboratory animals prepared by the Institute of Laboratory Animal Resources for the National Institutes of Health, the American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care, and the Chancellor's Animal Research Committee at the University of California, Los Angeles.

Implantation of electromyographic electrodes. Approximately 2 months before spinal cord transection, electromyographic (EMG) wires were implanted into selected flexor and extensor muscles of the hindlimbs of some cats (soleus, medial gastrocnemius, tibialis anterior, semitendinosus, vastus lateralis, gluteus medius, and iliopsoas) as described by Pierotti et al. (1989). EMG and video recordings during treadmill locomotion were initiated after 1 week of recovery and continued for the full duration of the study. EMG activity during stepping and standing was recorded periodically in animals that had undergone multiple training paradigms i.e., some cats were trained to stand and then to step and vice versa. All data presented were taken during the last training mode as shown in Table 1.

Hindlimb training and testing procedures. The training and testing procedures have been described in detail previously (de Leon et al., 1998a,b). Briefly, a cloth harness was fitted over the shoulders, between the forelimbs, and around the upper trunk. The forelimbs of the cats rested on a platform raised ∼2.5 cm above the training surface during all training and testing procedures. After spinalization, training of bipedal hindlimb stepping or standing was performed for 30 min/d, 5 d/week (for details, see de Leon et al., 1998a,b). Stepping ability during a locomotor test was measured by counting the number of plantar steps, i.e., the number of full weight-bearing steps executed on the soles of the paws in the two hindlimbs at a speed of 0.4 m/sec during a 45 sec trial. Full weight-bearing steps occurring on the dorsum of the paw were not included in the plantar step number. To train full weight-bearing bilateral hindlimb standing, the hindpaws were placed on the plantar surfaces, and the skin around the knee or ankle was patted lightly or pinched to elicit extensor reflexes. These stimuli were not used to maintain standing but were delivered when necessary to reinstate standing when the hindlimbs collapsed to a sitting, non-weight-bearing position. To train unilateral standing, weight bearing was allowed in only one hindlimb (trained limb) while the other limb (nontrained limb) was held above the training surface (de Leon et al., 1998b). The trainers held the tail only to provide lateral support during standing. To maintain lateral stability during unilateral standing, it was necessary to shift the weight of the hindquarters onto the trained limb. Typically, the trainers held the paw of the nontrained limb and moved it posteriorly and dorsally to near the base of the tail, resulting in the hindquarters leaning toward the weight-bearing limb. To evaluate standing ability after spinalization, weight bearing in one or both hindlimbs was initiated using the same stimuli that were used during training. After a weight-bearing posture was attained, the initiating stimuli were avoided, allowing the hindlimbs to stand until they collapsed to a sitting, non-weight-bearing position. Several bouts of standing were initiated to ensure a consistent performance.

EMG and kinematic data during stepping were recorded as described by de Leon et al. (1994). Briefly, raw EMG signals were amplified and recorded on a frequency modulation (FM) tape recorder (XR-510 TEAC Corp., Montebello, CA), and a camera and videocassette recorder (WV D5100 camera and AG1280P recorder Panasonic, Cypress, CA) were used to record the video signals. A Society of Motion Picture and TV Engineers time code generator (F30, Fast Forward Video, Irvine, CA) was used to synchronize video frames with the EMG signals recorded on FM tape. The EMG signals from each muscle during 10–45 sec bouts of stepping or standing were sampled into an Amiga computer at 2 kHz (de Leon et al., 1998a,b, 1999).

Tissue processing. Both intact (N = 4) and spinal cord-transected (N = 14) cats (except those used for immunoblot analysis) were perfused intracardially with 4% formaldehyde in 0.12 m phosphate buffer. The entire spinal cord, including the transection site, was removed, post-fixed in the fixative solution for 2 hr, and washed with 0.12 m phosphate buffer (four times, 30 min each). The cords then were transferred to 30% sucrose for 2 d, embedded on OCT-Tissue Tek (Miles, Elkhart, IN), and frozen on dry ice. Tissues were stored at −70°C until analysis.

Transverse sections (30 μm thick) of fixed spinal cords (L5–L7) were cut using a cryostat and collected free-floating in PBS. After washing in PBS, adjacent sections were processed for immunohistochemistry,ter plaatse hybridization, or histochemical staining. The tissue sections used to compare the experimental groups were processed simultaneously. To minimize tissue damage that may occur with tissue handling, we processed free-floating sections using a netwell setup (75 μm mesh Costar, Cambridge, MA). Spinal cord sections in netwells were transferred sequentially to netwell trays containing appropriate solutions. Incubation with cRNA probes, antibodies, and ribonuclease A (Sigma, St. Louis, MO) and color reactions were performed in 24-well plates.

The lesion sites from each cat were evaluated for completeness of the transection by histological analysis of 20 μm sagittal sections (thawed on slides) with luxol blue (myelin) and cresyl violet (neurons and glia) stains (Kluver and Barrera, 1953).

Immunohistochemie. Sections were processed for immunohistochemistry using an avidin–biotin complex (ABC)-peroxidase system (ABC Elite Vector Laboratories, Burlingame, CA) as described previously (Esclapez et al., 1994 Tillakaratne et al., 2000). Sections from spinal cord segments L5–L7 from control and spinal cats were incubated in 1:3000 or 1:4000 dilutions of K2 polyclonal antibody, which mainly recognizes GAD67 (Kaufman et al., 1991). The monoclonal antibody GAD6, which specifically recognizes GAD65, was used at a 1:100 dilution (Chan and Gottlieb, 1988 Erlander et al., 1991). To optimize cell body staining, we did not use detergents in the procedure. The sections were first rinsed in 0.02 m m potassium PBS (KPBS in m m : 16.5 K2HPO4, 3.5 KH2PO4, and 150 NaCl) for 30 min and then incubated with 3% normal serum (NS) diluted in KPBS for 1 hr (blocking step), followed by incubation with the antibody diluted in 1% NS for 16–20 hr at room temperature. Normal goat serum and normal horse serum (Vector Laboratories) were used for GAD67 and GAD65, respectievelijk. Sections were rinsed three times, followed by two 10 min washes in KPBS. Sections then were incubated with the biotinylated secondary antibody (1:200 in 1% NS) for 1 hr. Sections were washed and incubated in avidin–biotin complex (A and B reagents at 1:100 in KPBS) for 1 hr. The sections were washed and reacted with the DAB and H2O2 (Sigma). Color development was monitored and ranged from 10 to 13 min. The time of the color development within an experiment was held constant. The sections were washed and mounted on superfrost slides (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), air-dried, and coverslipped with cytoseal (Stephens Scientific). Washings after primary, secondary, and ABC immunohistochemistry and color development were performed as described above.

ter plaatse hybridization. Antisense and sense cRNA GAD67 probes were transcribed from subclones 13 and 16 of feline BamHI-linearized GAD67 cDNA using Sp6 RNA polymerase and digoxigenin-11-UTP (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) (Kaufman et al., 1986 Wuenschell et al., 1986 Tillakaratne et al., 2000). Digoxigenin-labeled RNA probes were partially digested with alkali to fragments 150–500 bases long, and their concentrations were measured as described previously (Esclapez et al., 1993, 1994Tillakaratne et al., 2000). Sections were hybridized with digoxigenin-labeled cRNA (0.2 ng/ml) for ∼16 hr at 50°C and washed as described previously (Esclapez et al., 1993, Tillakaratne et al., 2000). The hybrids were detected immunologically by incubation with alkaline phosphatase-conjugated digoxigenin antibody (Roche Molecular Biochemicals) followed by nitroblue tetrazolium chloride–5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate color development.

Immunoblots. L5 and L6 segments of unfixed spinal cords (four intact, four nontrained, and three step-trained spinal cord-transected cats whose spinal cords were transected 12 months earlier see Table 1) were cut into lengths of ∼3–4 mm and sonicated in homogenization buffer (100 mg tissue/ml Tillakaratne et al., 2000). The homogenization buffer consisted of 60 m m phosphate buffer, pH 7.4, 1 m m phenylmethylsulfonyl fluoride, and 0.5% Triton X-100. The homogenates were centrifuged for 15 min at 100,000 × G using a TL100 ultracentrifuge (Beckman Instruments, Palo Alto, CA), and the total protein in the supernatants was measured by the Bradford assay (Bio-Rad, Hercules, CA). For immunoblot analyses, proteins (30 μg) were separated by SDS-PAGE.

Ten 50-μm-thick L6 spinal cord transverse sections were pooled to make the protein homogenates for slot blot quantification. Spinal cord homogenates were loaded into the wells of a slot blot apparatus (Schleicher & Schuell, Keene, NH). After blotting onto nitrocellulose membranes, we detected GAD67 and β-tubulin proteins by enhanced chemiluminescence (ECL Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL). We determined the dilutions of the primary and secondary antibodies that yielded consistent quantitative results. Blots were incubated overnight at 4°C with K2 (anti-GAD67 at 1:3000) or anti-β tubulin at 1:3000 (Chemicon, Temecula, CA) after blocking for 1 hr at room temperature with 10% nonfat milk in PBS containing 0.1% Tween 20 (PBST). After washing with PBST, the blots were incubated with the appropriate secondary antibody (1:2000) for 1 hr at room temperature. Antibody dilutions were made in PBST containing 5% nonfat milk. Washing between incubations consisted of three quick rinses, one 15 min rinse, and four 5 min rinses in PBST. Signals were visualized by ECL and exposure to x-ray film. The films then were scanned using an image analysis system (C-Imaging Compix Inc., Cranberry Township, PA) to determine the optical density of the protein bands. This protocol gives a linear standard curve using bacterially produced GAD67. Using total protein concentrations that were in the linear range of ECL detection (50–15 μg), we compared GAD67 levels after correcting for differences in loading and transfer by normalizing to β-tubulin in the same blots (Tillakaratne et al., 2000). It was possible to use the same blots two or three times with the same limits of immunodetection.

Microscopic analysis. The uniformity of tissue processing is a critical factor when analyzing the staining patterns and intensity between animals. Thus, primary fixation, post-fixation, and tissue processing were similar for the spinal cord sections prepared for immunohistochemistry or for ter plaatse hybridization. The cat cerebellum was used as a positive control for immunohistochemistry and for ter plaatse hybridization. The specificity of the GAD immunostaining was confirmed by the presence of GAD-immunoreactive neurons and punctate structures in the cerebellar cortex (Esclapez et al., 1993, 1994). Specificity also was confirmed by the lack of staining in tissue sections that had been incubated without the primary antibody or with the sense cRNA probe. Spinal cord transverse sections of the L5–L7 segments of intact and spinal cord-transected cats to be compared were run concurrently either for immunohistochemistry or forter plaatse hybridization. The time of color development within an experiment was held constant. Adjacent spinal cord sections processed for GAD67 and GAD65 were examined for the differential immunostaining reported for GAD67 but not for GAD65 after spinal cord transection (Tillakaratne et al., 2000). Cresyl violet and luxol blue staining of sections was used to evaluate the number and size of neurons.

Spinal cord sections of control and spinally transected cats, processed concurrently, were used for qualitative and semiquantitative analyses. Images to be compared were acquired with a Zeiss (Thornwood, NY) Axiophot microscope equipped with a Sony-3 CCD color camera under identical conditions (magnification, light levels, and other microscopic settings), and saved as tagged image file format files. The images were analyzed by C-Imaging software (Compix). Work files were customized for each measurement. Threshold values were set to discriminate the signal from the background. The identified objects were viewed as a green binary overlay displayed over the original image. Measurements included the staining intensity of GAD67 immunoreactivity in the lateral ventral horn of individual neurons in lamina IX and of GAD67 mRNA in individual neurons of medial and lateral laminas V and VI and the medial and lateral ventral horns. Regions of interest (ROIs subregions or individual neurons) for optical density measurements were outlined manually on the saved images. Pixels outside the ROIs were removed using the qualify feature. We added the edit option on the work file to erase, redraw, or individually remove obvious background spots before the final data acquisition. The zoom and roam feature was used on the image on display for detailed examination. The customized work files were saved and loaded to collect data from the saved images and the data were copied to Excel spreadsheets (Microsoft, Redmond, WA) and analyzed statistically. The cross-sectional areas of individual neurons were measured, and the optical density of staining was measured as the total object area. The total object area then was calculated with respect to the area of the ROI.

GAD67-positive neurons in medial lamina IX were captured at 250× at identical illumination. For the optical density measurements, individual neurons (a total of 120 neurons per cat) were outlined manually. The optical density of staining was measured as the total object area inside the outlined area (ROI). The mean GAD67 immunostaining in lamina IX in control and experimental animals (except in the unilaterally stand-trained cats) was calculated using 120 lamina IX neurons from each animal. The distribution and analysis of GAD67 immunostaining in unilaterally stand-trained cats were determined from 25 sequential transverse sections (30 μm thick, each taken at ∼120 μm) of the L5–L7 spinal segments processed for GAD67. We first compared the total object area in all of the GAD67 neurons in the contralateral and ipsilateral lamina IX region. For detailed analysis, individual GAD67-positive neurons in lamina IX of 25 sections were captured at 500× at identical illumination. The amount of GAD67 staining in individual neurons on the ipsilateral and contralateral sides (a total of 464 neurons) was measured as described above. The mean immunoreactivity per neuron between the trained and nontrained sides was compared usingt testen. The number of positively stained cells was divided into four groups using the labeling intensity values (strongest, 1.00–0.80 strong, 0.79–0.60 medium, 0.59–0.40 and low, <0.39). These values were used to add pseudocolors to neurons in the three-dimensional (3-D) representation of the GAD67 staining (see Fig. 5 also see below). We used the χ 2 test to determine whether the frequencies of cells in each intensity range were significantly different between the contralateral and ipsilateral sides (see Fig.5).

The amount of GAD67 mRNA levels in individual neurons in the medial and lateral areas of laminas V and VI and the ventral horn (from eight sections) were measured as described above. Differences in the mean immunoreactivity per neuron among the four groups were compared using the mixed model (see below). Positively stained cells were subdivided into two groups using the labeling intensity values (high, ≥0.3 and low, <0.3). We used the χ 2 test to determine whether the frequencies of cells in the intensity ranges were significantly different among the four groups (see Fig. 9).

3-D reconstruction of GAD67-immunoreactive neurons. Sequential (1:4 series) transverse spinal cord sections (30 μm thick) of the L5–L7 segments of the unilaterally stand-trained cats were processed for GAD67(1:3000, K2 antibody), GAD65 (1:100, GAD6), or cresyl violet staining. The spinal cord sections with GAD67 staining were analyzed at 31× magnification to capture the entire right or left half of the spinal cord. Overlapping images of these sections were used in Figure 4.

To make a 3-D reconstruction, we used 6 of the 25 spinal cord sections processed for immunohistochemistry (see above). The actual positions of the GAD67-positive neurons in each section were copied to separate transparencies. A digitizing program was used to incorporate x, ja, en z coordinates of the GAD67-positive neurons. The position of these neurons and the corresponding optical density and size measurements then were used to construct a 3-D image of the GAD67 immunostaining with the 3-D-Studio Max program (Kinetix).

Statistical analyses. Computer-based resampling (“bootstrap”) software (version 4.0.2 Resampling Stats, Arlington, VA) and a mixed model were used to determine differences in group means (intact vs spinal, intact vs trained, and trained vs nontrained) as described previously (Efron and Tibshirani, 1993 de Leon et al., 1998a,b). A mixed model was used to study the differences in GAD67 staining among the experimental groups. The model used was: Yijg =l + βG, waarYijg is the Jth measurement of GAD67 staining for subject l in group G,l is the intercept for subject l, and βG is the effect of group G (Efron and Tibshirani, 1993 Tillakaratne et al., 2000). The significance level was set at P < 0.05.


Evidence that 4S RNA is axonally transported in normal and regenerating rat sciatic nerves

Studies in regenerating goldfish optic nerves indicate that RNA may be axonally transported during optic nerve regeneration 14, 18, 19 . The present study was performed to determine if the axonal migration of RNA could be demonstrated during regeneration of the rat sciatic nerve.

Rats, which had only the left sciatic nerve crushed 10 days earlier, were injected bilaterally with [ 3 H]uridine into the spinal cord at segmental levels L5 and L6, thus labeling ventral horn cells giving rise to the sciatic nerve. Six, 14 and 20 days later rats were sacrificed by cardiac perfusion of saline followed by 10% formaldehyde. Formaldehyde-precipitable radioactivity, identified as [ 3 H]RNA, was 4–5 times greater in the regenerating sciatic nerve compared to the normal nerve and moved without impediment beyond the point of the crush into the regenerating portion of the nerve.

The axonal migration of free unincorporated labeled RNA precursors was also demonstrated, raising the possibility that the distribution of [ 3 H]RNA along the sciatic nerve might be entirely extra-axonal i.e., free [ 3 H]uridine is taken up by Schwann cells from the axon where it is incorporated into [ 3 H]RNA. This interpretation of the data would also result in the appearance of a proximodistal distribution of RNA associated radioactivity. To determine whether any sciatic nerve [ 3 H]RNA was due to axonal transport, rats which had only the left sciatic nerve crushed 10 days earlier were injected bilaterally with [ 3 H]uridine into the spinal cord. Fourteen days after injection, rats were sacrificed and radioactivity present in the nerve was confirmed as RNA by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Radioactivity in the various RNA species 14 days after intraspinal injection showed the following distribution: 28 + 18S RNA — normal39.3%±2.1 regenerating45.4%±1.6 4S RNA — normal43.0%±1.3 regenerating46.8%±2.7. Similar characterization of sciatic nerve RNA 1 or 3 days following the intravenous administration of [ 3 H]uridine gave the following distribution: 28 + 18S RNA — normal72.4%±3.0 regenerating75.0%±3.6 4S RNA — normal7.7%±1.3 regenerating10.7%±0.8.

The intraspinal injection of [ 3 H]uridine would label Schwann cell RNA and, in addition, any species of intra-axonal RNA, while intravenous injections would label Schwann cell RNA and not axonal RNA. If 4S RNA is in the axon, one would predict relatively more labeled 4S RNA following intraspinal injections than following intravenous injections. The data demonstrate an enrichment of 4S RNA in both normal and regenerating rat sciatic nerve following the intraspinal but not following the intravenous injection of labeled precursor. Therefore, we suggest that 4S RNA migrates axonally in both normal and regenerating sciatic nerves of rats.


Why Does Cauda Equina Syndrome Affect Everyone Differently?

nieuwe Lαrα
Global Moderator


Posts: 7,350
Post Likes Received: 3,097
Date Joined: August 2013
Injury: CES
Date Injured: March 2011

Post by Lαrα on Jan 25, 2014 4:53:45 GMT -8

Hey Guys..I know that when i first was given the news that I had Cauda Equina Syndrome I had no understanding of why this affected me in the way it does.
I can remember asking my physio to explain to me why some parts of my lower extremities had sensation more that others and why some muscles were weaker than others. why is my bladder, bowel and sexual function affected?

She explained a little but to be honest, not in a way that made enough sense to me. I searched for more understanding. from questioning and researching, gradually my understanding built up but i am always looking for more understanding and clarification.

So why does Cauda Equina Syndrome affect each of us differently?

Cauda Equina Syndrome commonly causes weakness and sensory loss to the lower limbs, the 'saddle area' and significantly affects the bladder, bowel and sexual function.

The symptoms and signs vary depending on the rate and extent of the compression, the size of the spinal canal, and the number of nerve roots involved. Because the sacral roots lie closest to the midline in the cauda equina, they bear the most damage.

A large central disc herniation, for example, would cause significant damage and symptoms including severe pain which is often worse at night.

The diagram below shows the "horse tail" that is often referred to in Cauda Equina Syndrome.This is in reference to spinal nerves within the vertebral canal. After the spinal cord tapers out, the spinal nerves continue as dangling nerve roots called cauda equina.

You will see on the diagram an aqua blue arrow that is pointing to a line that runs across the spinal nerves. This is representing an area that is compressed across the nerves. There is a black faint line above the arrow, this is showing the area the disc would be. It is situated in between L3/L4 vertebrae. Therefor the nerves below that are affected are those at the point of compression. As you can see several nerve roots are affected.

A factor in severity of longterm symptoms will depend on several factors. As many of us are aware, in the case of Cauda Equina Syndrome early intervention is crucial at the onset of symptoms.

Take a look at the illustration below..It shows which nerve roots affect the lower extremities. It will also explain why for many of us different muscles are affected more than others and why altered sensation differs in different areas.

For myself. my damage was at the point of L4/L5 disc so at the areas shown below on L3 are unaffected for me.
Sensation is affected everywhere except the for the 'strip' down the front of my legs where it is relevantly normal. My left leg is weaker then my right leg which will indicate that the nerves to this leg had more significant compression.

This video, although graphic, explains very clearly what happens at the point of compression and why we are affected differently. its a must watch!

Butiki
Advanced Member



Bekijk de video: Anatomie van het ruggenmerg (Januari- 2022).